/ DIVISIN DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

/ Hidrlisis de acetamida por un bicuitivo de Bacillus sphaericus y Methanosarcina mazei

TESIS

PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRA EN BIOTECNOLOGIA

PRESENTA

/ Q. ZENIA MARA GUTIRREZ TMTOR

/ Comit Tutorial: Dr. Oscar Monroy Hermosillo M.en B.E. Florina Ramrez Vives

Jurado: Dra. Gabriela Moeller Chvez M. en B. Luis Torres Bustillos

Mxico, D.F. a 13 de Diciembre de 1W. 1

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOCOGICAS Y DE LA SALUD Posgrado en Biotecnologia

Diciembre 13, 1999.

M. en BE. FLORINA RAMIREZ VIVES P R E S E N T E .

.I _y Por medio de este conducto, la Comisin del Posgrado en Biotecnologa, le agradece su participacin como Secretaria en el examen de grado de Maestra de la alumna ZENIA MARiA GUTIRREZ TINTOR, quien defendi y expuso la tesis Hidrlisis de acetamida por un bicultivo de Bacillus sphaericus y Methanosarcina mazei. a los 13 das del mes de diciembre de mil novecientos noventa y nueve.

As mismo, le agradece su participacin como Tutora durante el desarrollo de la misma

Sin ms por el momento, aprovecho la ocasin para enviarle un cordial saludo

A T E N T A M E N T E . CAW ~ T A AL TIEMPO'^

DR~JAVIER BARRIOS GONZLEZ COORDINADOR

UNIDAD IZTAPALAPA

Av Michoacan y La Purisima Col Vicentina Mexico, D F 09340 Tels (5) 723-63-51 (5) 72449 99 Fax (5) 724-47-12 e-rnail psgbt@xanum uam mx internet http //v ww iztapalapa uam mxiiztapala www/division cbsibiotecnoiolinicio htrn

RESUMEN

En este trabajo se presentan las pruebas realizadas para estudiar la interaccin de.una

bacteria aerobia (Bacillus spbuericus) y UM bacteria anaerobia estricta (del gnero

Methmosurcinu), dentro de un reactor continuo. Se us como sustrato la acetamida que es un compuesto xenobitico txico, frecuentemente desechado en las aguas residuales de

varios tipos de industrias qumicas.

En primer lugar, en una cintica en lote a diferentes concentraciones de acetato pero igual

volumen de inculo, se determinaron las constantes de velocidad mxima de formacin de

metano (v,,& y de constante de saturacin (Is) para Mefhmosarcinu muzei, cuyos valores

corresponden a 0.046 mmolCH&.h y 124 mgACn respectivamente.

Despus se hicieron cultivos en lote con B. sphuericus comparando dos especies de

bacterias metanognicas (Mefhanosurcinu burkeri y Mefhanosurcinu muzei) y diferentes

concentraciones de oxgeno disuelto, manteniendo constantes la concentracin de biomasa

del bacilo y la de acetamida (20 mM). Los mejores resultados se obtuvieron cuando hubo

un 90 % de desaparicin de la acetamida y formacin de metano (30 % de la produccin

mxima esperada) con la combinacin de B. sphuericus y M. muzei.

Luego se hizo un cultivo de lote alimentado varindose la concentracin de acetamida

(Am) en diferentes volmenes de medio. Los resultados muestran que con los volmenes

de recambio usados, el oxgeno disuelto disponible permita el aumento de B. sphuericus.

Esto es, el acetato producido por la hidrlisis de acetamida es consumido principalmente

por el mismo bacilo para producir biomasa, quedando una baja concentracin de acetato

residual (< 2 mM) para la metanognesis, la cual no se vio favorecida.

Postenormente se trabaj con el bicultivo de Bacillus sphuericus y Methosarcinu rnuzei

en un cultivo continuo a diferentes tasas de dilucin 1, 0.6 y 0.5 d, variando el sustrato a 1.5, 2 y 3 gAm/L. Los resultados indican que no hay metanognesis debido a una concentracin residual de acetato muy pequea (lOOmg/L), ya que solo se alcanzaron eficiencias del 40 %.

Se concluye que no hay metanognesis bajo estas condiciones, ya que el acetato es

consumido a mayor velocidad por B. sphuericus. Adems de que el bicultivo no forma un

conglomerado activo, debido a queM. mazei pudo estar inhibida por el oxgeno.

(2:

r -1 4

Descripcin de la tesis.

Esta tesis consta de siete captulos, al principio de cada captulo se hace una breve

introduccin o resumen, se plantean los objetivos particulares para cada uno de ellos y al

final se presentan las conclusiones particulares. Adems consta de un ndice general, uno de

figuras y otro de tablas.

En el primer captulo se hace una descripcin de la digestin anaerobia en reactores UASB,

las caractersticas ms importantes de Bacillus sphuericus y de Methanosarcina sp, as

como de las caractersiicas de la acetamida. Asimismo se presentan algunos trabajos en

donde se muestran las caractersticas de los conglomerados de reactores bajo condiciones

anaerobias.

En el segundo captulo se describen los mtodos experimentales usados tanto para los

experimentos en lote como para los ensayos en continuo y las tcnicas de anlisis entre las

que destaca la de acetamida que fue desarrollada en el transcurso de esta tesis.

En el capitulo tres se muestran los resultados experimentales de las constantes cinticas

para Methanosarcina mazei.

En el captulo cuatro se muestran los datos cinticos en lote del bicultivo Bacillus

sphaericus y Methanosarcina sp bajo condiciones controladas de oxgeno.

El quinto captulo muestra la informacin obtenida de un cultivo de lote alimentado, a

partir del cual se inici el cultivo continuo. Este ltimo experimento fue el objetivo

principal de este trabajo de tesis, es decir, observar la interaccin entre una aerbica y otra

bacteria anaerobia para producir metano a partir de acetamida.

En el sexto captulo se dan las conclusiones generales a las que se llegaron, adems de una

serie de recomendaciones para proyectos posteriores. Finalmente, se incluye toda la

bibliografia consultada durante el trabajo.

ii

Indice

ndice General . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resumen. i

Indice General. . . . . . . . . . . . . . . . . iii Indice de figuras. . . . . . . . . . . . . . . . . vi

Indice de tablas. . . . . . . . . . . . . . . . . VJII Abreviaturas. . . . . . . . . . . . . . . . . . ir

...

/c.D 1 . Introduccin ! I/ .*Y

1.1. Justificacin de la tesis. . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2. Objetivo general. . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.3. Hiptesis. . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.4. Digestin anaerobia . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.4.1. Hidrlisis y acidognesis . . . . . . . .

1.4.2. Acetognesis . . . . . . . . . . . . . . .

1.4.3. Metanognesis . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.5. Modelo estructural de un consorcio granular anaerbico . . . . . 6

1.5.1. Consorcios aerobios dentro de la digestin anaerobia . . . . .

4

4

- . . . . .,

9

1.6. caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de los microorganismos

involucrados en la degradacin de acetamida en reactores anaerobios. . 1 1 1.6.1, Gnero Methanosarcina. . . . . . . . . . . . . , . 1 1 1.6.1.1, Methanosarcina barkeri., . . . . . . . . . . .12 1.6.1.2. Methanosarcina mazei. . . . . . . . . . . . 12

1.6.2. Bacillus sphaericus . . . . . . . . . . . . . . 14

1.7. Reactor anaerobio UASB. . . . . . . . . . . . . . 15

2. Materiales y mtodos

2.1. Introduccin. . . . . . . .

2.2. Inculo. . . . . . . . .

2.3. Medio de cultivo. . . . . . . 2.4. Mtodos analticos

. . . 1 7

. . . . 1 8

. . . . 18

iii

Inice

2.4.1. Medicin de acetamida . . . . . . . . . . . .

2.4.2. Medicin de acetato . . . . . . . . . . . . .

2.4.3. Medicin de amonio . . . . . . . . . . . . .

2.4.4. Medicin de metano . . . . . . . . . . . . .

2.4.5. Medicin de biomasa . . . . . . . . . . . . .

2.4.6. Peso seco . . . . . . 2.4.7. Medicin de oxgeno disuelto . . . . . . . . . . .

2.4.8. Medicin de pH . . . . . . . . . . . . . . . .

2.5. Reactivos . 3 . Determinacin de las.'constantes cinticas para M . mmei

SI 3.1. Resumen . . . . . . . . . 3.2. Objetivo particular . . 3.3. Diseo experimental . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

3.4. Resultados y discusin . . . . . . . . . . . .

3.5. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . .

4 . Degradacin de acetamida por bicultivos de bacterias metanognicas y B . sphuericus en lote

4.1. Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.2. Objetivos particulares . . . . . . . . . . . . . .

4.3. Diseo experimental . . . . . . . . . . . . . . .

4.4. Resultados y discusin . . . . . . . . . . . . . . r' I(

' . . 2 1 4.5. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . .

5 . Degradacin de acetamida por un bicultivo Bacillus sphuericus y

Methunosmcinu mazei

5.1. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.2. Objetivos particulares . . . . . . . . . . . . . .

5.3.1. Reactor de lote alimentado . . . . . . . . . . .

5.3.2. Reactor en continuo . . . . . . . . . . . . .

5.3. Diseo experimental

5.4. Resultados

5.4.1, Reactor de lote alimentado . . . . . . . . . . .

. 19

. 19

.20

.20

21

21

21

22

. 22

.23

.24

.24

.24

.27

28

29

29

30

.36

. 3 7

. 3 8

38

.39

. 4 1

iv

Indice

5.4.2. Reactor en continuo

5.4.2. I . Hidrlisis de acetamida . . . . . . . . . . . 4 3

5.4.2.2. Cuantificacin de la biomasa en el lecho del

reactor continuo . . . . . . . . . 4 9

5.4.2.3. Microscopa electrnica . . . . . . . . . . .50

5.5. Discusin . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56

5.6. Conclusiones

5.6. I . Reactor de lote alimentado . . . . . . . . . . . . .58

5.6.2. Reactor de cultivo continuo . . . . . . . . . . . . .59

6. Conclusiones y rec0,mendaciones . . . . . . . . . . . . . 60

PI 7. Bibliografa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63 .ri

I.? .I'

V

Indice

ndice de figuras

1.1. Modelo conceptual de Guiot et al. (1992) para la distribucin microbiana dominante de un lodo granular anaerbico.

3.1. Produccin de metano por Methunosurcinu mazei a travs del tiempo usando diferentes concentraciones de acetato.

3.2. Efecto de diferentes concentraciones de acetato en la velocidad de formacin de metano para Methunosurcinu mazei.

3.3. Linearizacin de los datos por la ecuacin de Linerwaver-Burk para Methunosurcinu mazei a diferentes concentraciones de acetato de sodio.

4.1. Vista de los bioensayos en los que fueron inoculados los bicultivos para medir la ,'?, ,."i produccin de metano.

4.2. Cultivo de B. sphuericus con 20 mM de Am(+); productos formados Ac(& y NI&+(+).

4.3. Bicultivo de M. mazei con B. sphuericus en la proporcin 12 de oxgeno disuelto. 4.4. Bicultivo de M. burkeri con B. sphuericus en la proporcin 12 de oxgeno disuelto. 4.5. Bicultivo deM. mazei con B. sphuericus en la proporcin 17 de oxgeno disuelto. 4.6. Bicultivo de M. burkeri con B. sphuericus en la proporcin 17 de oxgeno disuelto. 4.7. Bicultivo de M. mazei con B. sphuericus en la proporcin 28 de oxgeno disuelto. 4.8. Bicultivo de M. burkeri con B. sphuericus en la proporcin 28 de oxgeno disuelto. 5.1. Reactor de lote alimentado.

5.2. Reactor continuo inoculado con Bacillus sphuericus y Methunosurcinu mazei. 5.3. Comportamiento del reactor de lote alimentado, el cual muestra la desaparicin de

'' '7 ' ..i/ acetamida (e), la formacin de acetato (& y la aparicin de metano (*).

5.4. Comportamiento de la acetamida a la entrada (e), a la salida (m), del acetato a la entrada (u, a la salida (0) y la deteccin de metano (*) a las diferentes cargas volumtricas en el reactor continuo.

5.5. Observaciones en el microscopio de contraste de fases (1OOx) de una muestra del lecho de Iodos del reactor continuo. En el cuadro izquierdo (a) se ve una gran acumulacin de biomasa, alcanzando a diferenciar al bacilo. En el cuadro derecho

(b) se observa claramente al bacilo formando una especie de red, que concuerda

justo donde se ve el pigmento.

V i

Indice

5.6. Espectro de infrarrojo del pigmento colorido obtenido en el reactor en continuo usando

como fuente de carbono el acetato de sodio.

5.7. Reactor continuo con alimentacin de medio de Balch sin reductores, usando como

sustrato cido actico.

5.8. Vista del lecho del reactor al inicio del experimento en continuo.

5.9. Vista del lecho del reactor continuo al final de la etapa experimental.

5.10. Imagen panormica en MEB (8Kv; 9Opm) de un flculo obtenido del reactor continuo, en donde se observa la predominancia y algunas aglomeraciones de B. sphuericus.

5.11. Imgenes de MEB (8Kv; 30pm) del flculo obtenido del reactor. Las figuras muestran una amplificacin de la parte superior izquierda de la Figura 5.10. En la

superior se observan algunas aglomeraciones de B. sphericus, as como una pequea aglomeracin de M. mazei. En la imagen inferior se aprecia un cmulo de M mazei y la predominancia de B. sphaericus.

5.12. Imgenes de MEB de un flculo obtenido del reactor. La figura superior (8Kv; 90pm)

muestran otra toma panormica del mismo grnulo en donde se ve la predominancia

de B. sphuericus. La imagen inferior (8Kv; 30pm) es una amplificacin en la que se observa el bicultivo, as como la presencia de filamentos largos.

5.13. Imagen de MEB (8Kv; 900pm) del flculo obtenido del reactor, la cual muestra una

serie de filamentos que est presente en otra fraccin del grnulo, lo que sugiere que

es parte de los exopolmeros formados por ambas bacterias.

5.14. Imagen de MEB (8Kv; 30pm) de un flculo del reactor, en donde se ve la formacin

de una red de B. sphericus y en la parte superior derecha un bacilo mucho ms grande que el resto de la poblacin y lo reportado en la literatura.

5.15. Imgenes de MEB del flculo del reactor. En la imagen superior (8Kv; 30pm) se contempla el bicultivo en donde el B. sphericus est recubriendo las aglomeraciones formadas por parte deM. mazei. En la imagen inferior (SKv; 9 0 ~ m )

se observan otras aglomeraciones del bicultivo.

5.16. Imagen de MEB (10Kv; 30pm) de un flculo del reactor, en donde se contempla el

bicultivo, resaltando la presencia de Mefhanosurcinu mazei.

vii

Indice

5.17. Eficiencia de hidrlisis de acetamida con respecto a la carga volumtrica. (*): DQO

y (A): %Am 5.18. Eficiencia de remocin de acetato en funcin de la concentracin de acetamida

residual.

ndice de tablas

1.1. Reacciones realizadas durante la metanogenesis.

1.2. Caractersticas fisiolgicas y taxonmicas de las especies de Mefhanosarcina

1.3, Algunos valores de constantes cinticas para Methanosarcina barkeri.

I .4. Velocidades especficas de crecimiento (p,) de Bacillus sphaericus.

1.5. Caractersticas fisiolgicas y taxonmicas de Bacillus sphaericus.

2.1. Preparacin del medio de cultivo.

3 .1 . Velocidades iniciales de formacin de metano y tiempo de la fase lag realizada por

Methanosarcina rnuzei para las diferentes concentraciones de acetato. 3.2. Constantes cinticas para algunas cepas de Mefhanosarcina.

4.1. Proporciones en volumen de medios usados en los bioensayos.

4.2. Degradacin de acetamida por bicultivo de Bucilius sphuericus y Methanosarcina .p a temperatura de 35C; pH de 7.0 y Ami=20mM.

4.3. Constantes cinticas para B. sphaericus y de M. muzei

5.1. Diferentes concentraciones de acetamida en la alimentacin del reactor de lote

alimentado.

5.2. Diseo experimental para el crecimiento de B. sphaericus y M. mazei en un cultivo continuo.

5.3 . Hidrlisis de acetamida y formacin de productos medidos por etapa en el reactor.

5.4. Resultados de la estimacin de biomasa dentro del reactor para las bacterias, durante la

alimentacin con acetamida y acetato. 5.5. Comparacin de las actividades especficas de M. muzei bajo diferentes condiciones.

viii

I Glosario

A Ac ADN

Am ATCC Au Bd Bv C C2 CH4 DSM DQO

L P

F420

F430

F390-A F390-G G KS

h K

MEB rl NCIB NCTC

OD rARN SPP SST ssv TRH UASB VmeX vlv Y

4

Abreviaturas

Adenina Acetato cido desoxiribonucleico Actividad especfica Acetamida American Type Culture Collection Smbolo qumico del oro Pares de bases Carga volumtrica Citosina Smbolo qumico del carbono Metano Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Demanda Qumica de Oxgeno Factor sensible a 420 nm Factor sensible a 430 nm Factor sensible a 390 nm unido a adenina Factor sensible a 390 nm unido a guanina Guanina Constante de saturacin Velocidad mxima de crecimiento Microscopa electrnica de barrido Eficiencia National Collection of Industrial Bacteria National Collection o f Type Cultures Amonio Concentracin de oxgeno disuelto cido ribonucleico ribosomal Especies Slidos Suspendidos Totales Slidos Suspendidos Voltiles Tiempo de residencia hidrulico Upflow Anaerobic Sludge Blanket Velocidad mxima de formacin de metano Relacin volumen a volumen determinados Constante de rendimiento celular

ix

Captulo 1

Introduccin

1 . -.- - I__-- Introduccin

1.1. Justificacin de la tesis

La acetamida es uno de los principales contaminantes producido en las industrias textil,

farmacutica y de pinturas (Moretti et al. 1978). La toxicidad de la acetamida adems de ser

altamente irritante, es un agente cancergeno y mutagenic0 en ratas (Merck, 1994;

DiGeronimo et al. 1967). Sin embargo, Gomiak et al. (1994) indican que la acetamida

actu como antdoto en ratas que ingirieron Palicourea marcgravii, vegetal que en sus

hojas contiene cido monofluoroactico, el cual es el principio activo txico de la planta. Es

un compuesto muy estable a condiciones ambientales por no encontrarse libre en la

naturaleza se dice que es xenobitico. Los valores de la energa libre de Gibbs (AGO)

calculados por Mavrovotiniotis (1991), ecuacin 1.1 ; indican la estabilidad de la acetamida. I

i-!, , , ..I

bCH,COOH + NHlCI- AGO = +29.2kcal/mol HCIIH,O CH ,CONH (Ecuacin 1.1 .)

La degradacin biolgica de la acetamida puede llevarse a cabo por bacterias de varios

gneros, como por ejemplo Bacillus, Pseudomonas y Acetobacter, entre otras (Toerien,

1967; Ramrez, 1995 y 1996; Guyot etal. 1994 y 1995).

Torres el al. (1992), Guyot et al. (1994 y 1995) y Ramrez et al. (1998), demostraron que la

degradacin de la acetamida se lleva a cabo en condiciones anaerobias por un consorcio

microbiano mixto debido a la interaccin de una bacteria aerbica y una bacteria

metanognica.

En esta tesis se estudia la interaccin entre Bacillus sphaericus y Methanosarcina mazei,

para degradar acetamida hasta metano.

1, ._,*

1.2. Objetivo general

k Estudiar en bicultivo la interaccin de UM bacteria metanognica (del gnero

Methanosurcina) con UM aerobia estricta (Bacillus sphaericus) en la degradacin de un compuesto no metanizable, la acetamida. Se revis la interaccin del bicultivo con dos

cepas metanognicas para estudiar la diferencia como por ejemplo la sensibilidad al

oxgeno en pequeos paquetes de clulas (tetradas) y conglomerados grandes.

2

Infroduccin

1.3. Hiptesis

> Es posible sostener el crecimiento de Bacillus sphuericus y de una Mefhunosurcinu en bicultivo con acetamida. En este proceso Bacillus sphuericus hidrolizar el sustrato a

amonio y acetato; luego las dos competirn bajo condiciones controladas, por el acetato,

la bacteria aerobia para producir biomasa y la bacteria anaerobia para producir metano.

1.4. Digestin anaerobia

Zitomer et al. (1997) comentan la amplitud de condiciones que implica el trmino

anaerobio, ya que para los zoologistas y paleontlogos stas condiciones se dan a

concentraciones menores de 0.8 mgO& mientras que para los microbilogos este debe ser

menor a 0.08 mgOz/L presentando un espectro infinito de posibilidades.

De acuerdo a Toerien y Hattingh (1969) la digestin anaerobia es un proceso que ocurre en

la naturaleza y puede ser definido como una serie de transformaciones biolgicas en las

cuales la materia orgnica, en ausencia de oxgeno, es convertida a metano y bixido de

carbono. En el ltimo paso los microorganismos metanognicos utilizan sustratos simples

como el Hz/COz, formiato, metanol, metilaminas, acetato y CO.

En la tabla 1.1. se muestran algunas reacciones realizadas durante la metanognesis

(Zehnder, 1988). En ella se muestra al COZ como aceptor final de electrones, el cual es

reducido a metano y en donde el Hz es el donador de electrones. Tambin se muestran otras tres reacciones, UM a partir de formiato y las restantes a partir de acetato, observndose que

todas ellas son termodinmicamente espontneas.

Tabla 1. I . Reacciones realizadas durante la metanognesis. Ecuacion AG(KJ/reaccinl Referencia

4H, + CO, -+ CH, + 2H,O - 130.7 Madigan ef al. (1998) 4HCOO- + 4H+ + CH, i 3C0, i 2H,O Thauer ( 1998) CH,COO- i H -+ CH, + CO, - 36 Daniels (1993) CH,COO- + H,O -+ CH, + HCO; - 3 1 Daniels (1993)

- 144.5

Lawrence y McCarty (1967) propusieron dividir el proceso en tres etapas y es McInerney y

Bryant (1981) quienes proponen el modelo segn el cual las complejas relaciones

3

microbianas que se llevan a cabo para degradar la materia orgnica son la hidrlisis y

acidognesis, la acetognesis y la metanognesis.

1.4.1. Aidrlisis y rcidognesis

La primera etapa es la hidrlisis de los polmeros complejos, polmeros naturales o

macromolculas, tales como polisacridos protenas y grasas, a unidades ms simples o

monomricas. en^ este paso intervienen por ejemplo las bacterias celulolticas y otras hidrolticas anaerobias estrictas o facultativas.

Autores como Hattingh: et a1.(1967), Kotz et al. (1968) y Thiel et al. (1968) han

establecido y medido la presencia de varias enzimas extracelulares como las celobiasas, las

proteasas y las amilasas en digestores anaerobios. Las enzimas extracelulares degradan

molculas orgnicas complejas a unidades ms pequeas, en donde los resultados indicaron

que las actividades enzimticas estuvieron correlacionadas de manera significativa con

algn parmetro tanto qumico como biolgico.

Los productos finales de las poblaciones de bacterias en esta etapa son cidos grasos

saturados (valrico), cidos grasos voltiles (propinico, butrico y actico), lactato, etanol,

formiato y bixido de carbono. McCarty et al. (1963) concluyeron que el cido actico es el

ms abundante y adems el intermediario ms importante. La produccin de cidos en esta

etapa tiende a disminuir el pH y a provocar la inhibicin de la digestin anaerobia (Ramrez, 1992).

Rivera et al. (1993) proponen un ejemplo de hidrlisis y fermentacin a partir de la glucosa

como se muestra en la ecuacin 1.4.1.

,TI: *. -i

":

C,H,,O, -+ CH,CH,OH + CH,CH,COO' + CH,(CH,),COO- + H, i CO, Ecuacin 1.4.1

1.4.2. Acetognesis

El segundo paso es la oxidacin de los cidos grasos voltiles (AGV) obtenidos en la acidognesis, como los cidos propinico, butrico, succnico, alcoholes los cuales son

transformados a cido actiqo, hidrgeno y COZ por un grupo de bacterias acetognicas

4

Iniroduccin

productoras obligadas de hidrgeno (OHPA por sus siglas en ingls). Las reacciones que

realizan son inhibidas por el hidrgeno que producen, por lo que es necesario que ste no se acumule en el medio, por lo que tienen una estrecha relacin con bacterias que remueven el

hidrgeno (hidrogenofilicas). De manera concertada, la etapa que se conoce como

acetognesis es cuando los homoacetgenos producen acetato a partir del HZ y COZ y las

bacterias oxidadoras (sintrofas) de cidos grasos continan la fermentacin hasta acetato.

Es importante sealar que todo el hidrgeno producido en las etapas fermentativa y acetognica debe ser consumido de inmediato por las bacterias homoacetognicas, por las

metanognicas hidrogenofilicas o por las sulfatoreductoras, para poder mantener un balance

energtico favorable para llevar a cabo las reacciones acetognicas a partir de los

compuestos de la primera etapa (Madigan et al. 1998).

Las ecuaciones 1.4.2. a y b indican las reacciones llevadas a cabo en la etapa acetognica

(a) y homoacetognica (b) propuestas por Rivera et al. (1993).

CH,CH,OH i CH,CH,COO- iCH,(CH,),COO- -+ CH,CH,O- + H, i H ecuacin 1.4.2. (a) ecuacin 1.4.2. 0) H, + CO, + CH,CH,O-

1.4.3. Metanognesis

Esta es la ltima etapa de la digestin anaerobia, en donde el sustrato principal es el acetato.

A partir de ste, las bacterias metanognicas acetoclsticas llevan a cabo la produccin de

metano por el rompimiento del acetato en los grupos metilo y carboxlo del acetato. Por

otro lado, bacterias metanognicas hidrogenofilicas usan los electrones del Hz para reducir

al COZ y producir metano.

McCarty et al. (1 963) junto con otros investigadores han concluido que aproximadamente

el 70 % del metano, en reactores, se origina a partir de acetato, mientras que el otro 30 %

del metano tiene su origen de la reduccin del bixido de carbono por el hidrgeno.

Desde la dcada de los cincuenta han habido investigadores que han propuesto las vas de

formacin de metano, involucrando un acarreador de carbono hipottico o a travs de un intermediario. Por ejemplo, Blaylock y Stadtman (1964) mostraron que el grupo metilo de

5

Inroduccion

la metilcobalamina serva como precursor de metano en extractos libres de clulas de

Methanowcinu burkeri. Recientemente Thauer (1998) public un trabajo en el cual explica la bioqumica de la metanognesis propuesta hasta hoy en da.

Las ecuaciones 1.4.3. a y b indican las reacciones llevadas a cabo en las etapas acetoclstica

(a) e hidrogenotrofa (b) propuestas por Rivera et al. (1993).

CH,CH,O- + CH, i C 0 , H, i CO, + CH, i CO,

ecuacin 1.4.3. (a)

ecuacin 1.4.3. (b)

.-.* 1.5. Modelo estructural de un consorcio granular anaerbico

Guiot et al. (1992) propusieron un modelo de la organizacin de poblaciones en los granos

anaerbicos estructurado en multicapas. En l, las asociaciones de bacterias sintrficas,

incluyendo a las consumidoras de hidrgeno, deben estar localizadas en una capa externa

en donde predominan las acidognicas y en el centro se sitan a las metanognicas

acetoclsticas.

La teora de Guiot et al. (1992) se debi a observaciones bajo el microscopio electrnico,

de granos fragmentados; as mismo como del anlisis de actividades especficas de granos

gastados gradualmente y por los cambios en la actividad especfica metablica con el

tamao de distribucin y extensin del grano (ver figura 1.1 .).

Los granos pueden ser de 1 2 milmetros de dimetro y pueden acumularse en el reactor

en grandes cantidades, con una apariencia bien definida. Es posible que esto sea debido a la

velocidad ascendente en los reactores UASB la cual crea una presin constante de seleccin

para los organismos, los cuales pueden ser adheridos a otros o formar granos con buena

sedimentacin (lo que se conoce como auto-inmovilizacin). La configuracin granular

presenta varias ventajas desde el punto de vista de la ingeniera de reactores como por

ejemplo, los microorganismos por lo general estn densamente empacados; no hay espacio

perdido en los soportes inertes; la esfericidad provee un mximo en la relacin

microorganismo y espacio; aunque la enorme densidad granular es equivalente a la

densidad de cada clula bacteriana, estos muestran excelentes propiedades de

sedimentacin por su gran tamao (Hulshoff Pol et al; 1986).

Pi

,r -,, '. .*

6

m

Introduccin

Bacterias Fermentativas (Facultativas)

Acetognicas

Mefanognicas

Fig& 1.1. Modelo concephial de Guiot el al. (1992) para la distribuci6n microbiana dominante de un lodo granular anaerbico.

El proceso llevado a cabo en reactores tipo UASB se basa en la idea de que al interaccionar

o mantenerse muy cercanos los microorganismos presentes, efectan unilisminucin de la

actividad de degradacin y posteriormente una desintegracin del lodo granular. Este tipo

de asociaciones sintrficas aparecen como colonias mixtas en lugar de microcolonias

separadas. Las relaciones sintrficas en los flculos o granos no son solamente de

importancia para la transferencia de hidrgeno entre especies sino tambin para otras inter

especies que transfieren otros sustratos (Rivera et al. 1993)

UM hiptesis del modelo estructural propuesto es que la degradacin anaerbica completa

de la materia orgnica a bixido de carbono y metano, requiere de la accin simultnea de

varios grupos metablicos, por lo que la agregacin de microorganismos anaerbicos

dentro de un grano optimizara la cooperacin entre los organismos partcipes. Esto es, por

la reducida distancia de difusin para la transferencia de metabolitos adems de

incrementar de manera estrecha la asociacin celular. La termodinmica del proceso, la

cual es controlada por la presin parcial de hidrgeno, no debera suceder a menos que el

hidrgeno producido sea consumido por las bacterias hidrogenotrofas (Boone y Bryant,

1980).

La formacin de granos con aguas residuales de carbohidratos complejos incluye una

amplia variedad de tipos morfolgicos bacterianos (Guiot et al. 1992), en donde los grupos

~

I d

Inirciuccin

trficos aseguran los pasos exitosos de conversin desde el sustrato inicial hasta los

productos finales. Algunos autores han sostenido que estos grupos trficos estn

completamente distribuidos a travs del espacio granular y una organizacin interna no es

obvia. Bochem et al. (1982) describieron la apariencia estratificada de granos termfilos

alimentados con acetato.

Beeftink y Staugaard (1986) encontraron una baja densidad celular en el centro del grano

producido por la inactivacin y autlisis de las clulas internas debido a la deficiencia de

sustrato provocada por las limitaciones de difusin, en un reactor acidificado y alimentado

con glucosa. Esto demostr que las morfologas activas en la zona para acidognicas est

limitada por la profundidad, en cambio sostienen la idea de un espacio interno a los granos

en una zona activa solo para microorganismos acidotrficos.

Un estudio realizado por Zitomer et al. (1997) en presencia de oxgeno demostr que no se

formaron granos y que los procesos aerbicos y metanognicos no ocurren de manera

secuencial. Observ que los cultivos que recibieron oxgeno suficiente para oxidar

aproximadamente el 30% del DQO presentaron de 10 a 18 horas de fase lug, la cual es

significativa en la produccin de metano, adems demostr que las bacterias metanognicas

no pueden sobrevivir al incrementarse el oxgeno disuelto sino que, slo bajo algunas

condiciones pueden producir metano al mismo tiempo que se utiliza el oxgeno.

Rivera et al. (1993) propusieron que para entender el proceso de granulacin del lodo

anaerobio es importante conocer tres factores que juegan un papel decisivo en la

agrupacin bacteriana inicial:

1.

2.

3.

La naturaleza del grano, incluyendo su porosidad, estructura y dimensin de poro, carga superficial, densidad de las partculas (en caso de reactores de lecho fluidizado y

expandido), rea superficial especfica y tensin superficial.

Factores ambientales como pH, temperatura, fuerza inica, composicin y

concentracin de los compuestos orgnicos en la solucin y rgimen de flujo.

Las propiedades de los microorganismos involucrados tales como las caractersticas de superficie incluidos la hidrofobicidad y movilidad electrofortica, la fisiologa

bacteriana (la produccin de polimeros extracelulares) y la morfologa bacteriana.

8

Introduccion

Tambin, Rivera et al. (1993) indicaron las ventajas de la formacin de agregados

bacterianos, las que a continuacin se enlistan.

1. Las poblaciones de microorganismos sintrficos establecidas como asociaciones

multicelulares bajo condiciones fisiolgicas favorables tienden a formar granos o

fl6culos.

2. La interaccin de microorganismos sintrficos dentro de un agregado trae como consecuencia la simbiosis.

3. Se favorece el crecimiento en el interior de un grano, a diferencia del crecimiento de

clulas suspendidas .:libremente, debido a que pueden aumentar la asimilacin de

I-"? _".I/ nutrientes.

4. La granulacin protege a las clulas de los protomarios depredadores, por ejemplo de

los ciliados anaerbicos.

5. La distancia de difusin para intermediarios de fermentacin es mnima en los granos;

lo cual produce una mayor eficiencia que conserva cada fraccin de energa disponible

en un sistema de degradacin compleja.

6 . Se forma un microambiente ms favorable dentro del agregado en el que el

metabolismo an es posible, a pesar de que fuera del grano existan condiciones

desfavorables para el crecimiento (como por ejemplo los valores extremos de pH y la

presencia de oxgeno)

I ,, .**$

"*

1.5.1. Consorcios aerobios dentro de la digestin anaerobia

Toetien er al. (1969) hicieron una notable referencia acerca del descubrimiento de las

bacterias metanognicas adems de su aislamiento. Las bacterias metanognicas estn

aparentemente muy esparcidas en I& naturaleza y pueden ser encontradas en el suelo

ordinario de jardn, lodo negro, en el rumen de animales herbvoros, pantanos, lagunas,

lagos y en los procesos de tratamiento de aguas de alcantarillado.

9

Introduccin

De manera frecuente no se concibe que la metanognesis y la respiracin aerbica sucedan

en el mismo cultivo, debido a que se utiliza el oxgeno en las reacciones biolgicas

aerbicas, pero es potencialmente txico para los microorganismos metanognicos. Sin

embargo, bajo condiciones limitadas de oxgeno la biotransformacin puede ser efectuada

por una mezcla de cultivos (Zitomer et al. 1997).

Toerien et al. (1967) aislaron UM gran variedad de bacterias aerbicas y anaerbicas

facultativas de Iodos, bajo tratamiento por digestin anaerobia. Ellos concluyeron que el

grupo de bacterias anaerbicas del tipo acidognicas formaban parte muy importante y

constante de la poblacin total del reactor. Adems, encontraron que ambos grupos estaban

correlacionados de maneia significativa con parmetros qumicos tales como pH, contenido

de cidos grasos voltiles, alcalinidad y actividad enzimtica de la va glucoltica y del

ciclo de los cidos tricarboxlicos.

En los sistemas aireados, la supervivencia de los metanognicos se atribuye a la formacin

de micronichos anaerobios exentos de oxgeno (Field et al. 1995). Los microorganismos

facultativos en la superficie de las partculas de los Iodos granulares consumen el oxgeno

antes de que ste se difunda en las regiones internas (Kato et al. 1993). Este efecto de

desplazamiento de oxgeno puede explicar el desprendimiento de metano de los tanques de

aireacin de Iodos activados (Wable et al. 1994) o la presencia de bacterias metanognicas

en Iodos activados aerbicos (Lens et al. 1995) o al exitoso arranque de los procesos

metanognicos inoculados con Iodos aerbicos (Wu et al. 1987). Zitomer y Shout (1997) en un experimento con limitaciones de oxgeno alcanzaron la

mayor remocin de DQO del efluente y una recuperacin ms rpida de pH despus de una

alta carga de carbohidratos en diferentes sistemas anaerobios estrictos. La velocidad de

remocin de la DQO es esencial en sistemas anaerobios y no es afectada en modo adverso

por una limitada aireacin e incluso se incrementa bajo ciertas condiciones. Otros posibles

beneficios de sistemas metanognicos con oxgeno incluyen la degradacin de diversos

compuestos orgnicos especficos y mezclas que proceden de secuencias reductivas y

oxidativas de reacciones biolgicas y degradacin de compuestos orgnicos especficos a

travs del cometabolismo de las reacciones metanotrficas.

Los sistemas limitados de aireacin deberan ser usados en el futuro combinando los

beneficios de los tratamientos anaerbicos y aerbicos, tales como la baja produccin de

.*/I

I-.* ' 1'1 . .a

10

Introduccin

biomasa de los sistemas anaerbicos y la rpida recuperacin de altas cargas de los sistemas

aerbicos; para la mineralizacin de compuestos orgnicos especficos (xenobiticos y

recalcitrantes) o mezclas que se transforman a travs de una combinacin de pasos

oxidativos y reductivos.

1.6. Caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de los microorganismos involucrados

en la degradacin de acetamida en reactores anaerobios

Las especies responsables de la degradacin de acetamida en reactores anaerobios que se

manipularon bajo copdiciones de aireacin controladas, son Bacillus spbaericus,

Metbanosarcina harkeri y Metbanosarcinu nrazei, por lo que es conveniente hacer una

breve revisin de las caractersticas de estos microorganismos.

1 c-1 .." I

I

I 1.6.1. Gnero Methanosarcina

Los microorganismos metanognicos son reconocidos como arqueobacterias debido a un

anlisis genealgico molecular basado en el conocimiento de la secuencia del segmento

16s de su cido ribonucleico ribosomal (16s rRNA), junto con los anlisis qumicos de su

pared celular los cuales indican que no contienen murena y su membrana citoplasmtica

I

I

4 est constituida principalmente por Ipidos poliisoprenoides (Balch et al, 1979). Adems,

las bacterias metanognicas se diferencian por contener coenzimas como la F ~ z o , la cual se

degrada ai contacto con el oxgeno formando, de manera paralela, los derivados F39a-A y

F ~ ~ o - G , perdindose un parmetro caracterstico de estas bacterias: la fluorescencia (Rivera,

et al 1993). De acuerdo a Konig y Stetter (1 989) las bacterias anaerobias metanognicas

pertenecen al Reino de las Arqueobacterias y son representantes de la tercera lnea

descendiente en la evolucin de la vida, definicin basada en la comparacin secuencia1 del

cido ribonucleico ribosomal (rARN).

De manera particular la clase de las arqueobacterias metanognicas a la que pertenecen las

bacterias de nuestro inters, M. barkeri y M. mazei son clulas capaces de formar metano como producto metablico final predominante. Los sustratos que utilizan ms comnmente

son la mezcla Hz/CO~ y la de Hzhetanol; al formiato, al acetato, al metano1 y a las

metilaminas. Son anaerobias estrictas; producen epifluorescencia azul-verdosa cuando son

I -., ?' 1: .. ".,,

,

11

Introduccian

expuestos a la longitud de onda de 420 nm. Las clulas poseen coenzima M, F420, F430 y metanoptenna (Boone y Mah, 1989). Las especies son del orden Mefhunomicrobiules, de la

familia Mefhunosurci?iuceue y del gnero Methunosurcinu.

1.6.1.1. Methanosarcina barkeri

De acuerdo a Boone y Mah (1989) son cuerpos cocoides que aparecen en agregados

irregulares de 1.5 a 2 micrmetros de tamao. Contienen membrana isoprenoide CZS como

principal Ipido neutral, adems son cepas que no son disueltas o destruidas por dodecil

sulfonato de sodio (ver Tabla 1.2.).

Su metabolismo productor de energa involucra la formacin de metano; los sustratos

usados pueden ser la mezcla HzKOZ, el metanol, la metilamina, la dimetilamina, la

tnmetilamina, el acetato y el monxido de carbono. El grupo metilo del metanol o el

acetato son reducidos a metano sin oxidacin intermedia a COZ. No pueden fermentar los carbohidratos, aminocidos, formiato, etanol, propionato y butirato.

Utilizan como fuente de nitrgeno al amoniaco, incluso pueden fijar el nitrgeno molecular

y como fuente de azuce usa sulfuros. El crecimiento y formacin de metano es ms rpido en un medio con HzKOZ o metanol que con acetato. La composicin molar de los pares de

bases (Bd) guanina y citosina (WC) del ADN es de 39 a 44 %. Su hbitat se encuentra en

los fangos de aguas Frescas y marinas, rumen de rumiantes, lagunas con desechos animales

y en lodo residual de digestores anaerobios. Los diversos tipos de cepas comerciales son en

primer lugar la MS que corresponde a DSM 800 y ATCC 43569; en segundo lugar la cepa

227 (utilizada en este trabajo) que corresponde a la DSM 1538 y a la ATCC 43567; por ltimo, la B S que es equivalente a la DSM 131 1 (Boone y Mah, 1989).

(-1 .I

f-?

/ .. $

1.6.1.2. Methanosarcim mazei

Son colonias de color blanco amarillento a amarillento bronce en tubos rodados (ver Tabla

1 2 ), con apariencia granular cuando el cultivo es joven (

Introduccin

composicin molar de los pares de bases de C t C en ADN es de 42%. Utiliza metilaminas, rnetanol, H2/C02 y acetato corno sustratos catablicos.

Su hbitat se encuentra en las pilas de hojas en descomposicin, suelos de jardn, digestores

de Iodos residuales y slidos urbanos, barro negro y heces de animales herbvoros. Los

diversos tipos de cepa comerciales son la S-6 (utilizada en este trabajo) que corresponde a

la DSM 2953 y a la ATCC 43572; la cepa 2-558 es equivalente al biotipo 3 y a la DSM 2244. Para la LYC se encuentra como ATCC 43573 y por ltimo para MC3 se encuentra

como DSM 2907. Algunos valores de constantes cinticas para Melhunosurcinu burkeri encontrados en la

literatura se muestrm: en la Tabla 1.3. Para la cepa Methunosurcinu mmei no se

encontraron valores de las constantes cinticas.

Tabla 1.2. Caractersticas fisiolgicas y taxonmicas de las especies de Mefhanosarcina.

Morfologa Cocos' largos y Cocos irregulares Prueba Methanosarcina barkeri Methanosarcina mazei

Pequeos agregados2 Dimensiones 1.5 a 2.0 pm I.Oa3.0fim

Positiva Negativa Motilidad Negativa Negativa

PH 5-7' 5.5 a 8.52

Gram

Temperatura de crecimiento 35 a 422 "C 20-452

Introduccin

1.6.2. Bacillus sphamkus

Es UM bacteria aerobia perteneciente al gnero Bacillus, el cual a su vez forma parte del

grupo con endosporas de la familia Bacillaceae.

Este gnero fue caracterizado por Cohn (Krieg, 1984). encontrando que en general son

clulas que forman bastones rectos, junto con endosporas muy resistentes bajo condiciones

adversas y no ms de una por clula. Son bacterias Gram positivas, flageladas, aerobias o

anaerobias facultativas. El oxgeno es el aceptor final de electrones el cual puede ser reemplazado por otros compuestos en algunas especies. La morfologa y tamao de las

colonias son muy variables, adems algunas pueden producir pigmentos en ciertos medios.

La mayora de las especies tienen una unin cruzada con cido tipo meso-diaminopimlico en su pared celular y los fosfolpidos que predominan son fosfatidiletanolamina y

fosfatidilglicerol.

De acuerdo a Meyer y Neide (Kreig, 1984), Bacillus sphaericus crece en agar con una

variedad de nutrientes en colonias compactas, amontonadas o extendidas sobre la

superficie. Algunas cepas no comunes producen colonias con pigmentos rosas. La

composicin molar de los pares de bases de G+C en el ADN que se ha registrado para 68 cepas es de 34 a 40%. Esta bacteria crece en una gran variedad de sustratos de los cuales se

aprecia un mayor consumo de cido pinvico, biotripticasa, gelatina, actico, acetamida,

propionamida, isobutiramida, casaminocidos y extracto de levadura (Ramrez, 1995). Se

han aislado de suelos, sedimentos marinos y de agua fresca, leche, alimentos anticidos y

Iodos anaerobios. El tipo de cepa comercial es la ATCC 14577 que corresponde a la DSM

28, NCIB 9370 y NCTC 10338.

En la tabla I .4. se muestra la velocidad de crecimiento en diferentes condiciones (Ramrez,

1995). Un parmetro importante es el valor de K, que se determin a una concentracin de

oxgeno del 20% cuyo valor es de 0.330%.

(.- "1.

_I

I ..,P

Tabla 1.4. Velocidades especficas de crecimiento (p) de Bacillus sphaencus. Patametro medido Veirsidad especfica @')

Cloruro de sodio 0.107 0.095

Oxgeno O. 126

Temperatura 0.110

Extracto de levadura y peptona de casena

pH 0.220 RMirez, 1995

14

-1, ."i

I

I

inir0a"uccin

Otras caractersticas fisiolgicas y taxonmicas de Bacillus sp se observan en la tabla 1.5,

de la que resalta, por ejemplo, que tiene motilidad debido a los flagelos peritricos que posee y presenta una respuesta positiva de la citocromo oxidasa, ya que contiene citocromo b.

Tabla 1.5. Caractersticas fisiolgicas y taxonmicas de Bacillus sphaencus Prueba Respuesta

Morfologa Bastones rectos Dimensiones 1 a 2.5-5pm

Gram Positiva Motilidad Positiva Esporas Redondas, resistentes a

30 minutos de pasteurizacin

20 a 40C Oxgeno 5 a 50% Catalasa Positiva

Citocromo oxidasa Positiva Y&-C 34

.'. pH 5 a 8.5 Temperatura de crecimiento

Ramirci 1995

.I

1.7. Reactor rnrerobio UASB

El proceso de digestion anaerobia es una buena alternativa para el tratamiento de aguas

residuales debido a las ventajas que presenta con relacin a los sistemas aerobios: poca

formacin de biomasa, degradacin de desechos con la formacin de una fuente alterna de

energa como es el metano y que representa un proceso econmico (Ramrez, 1993).

La necesidad de mejorar la eficiencia en la digestin anaerobia ha dado lugar al desarrollo

de diversos reactores. Los ejemplos ms significativos de tipo de reactores son los filtros

anaerobios, los de pelcula fija de flujo descendente, el lecho anaerobio expandido y el

lecho fluidizado (Kato, 1994). Uno de los ms importantes es el reactor anaerobio de lecho

de Iodos y flujo ascendente (UASB por sus siglas en ingles) desarrollado por Lettinga et al. (1980).

El reactor UASB opera con flujo ascendente a travs de un lecho de Iodos de la columna permitiendo que los microorganismos presentes en I floculen y sedimenten en el fondo del

reactor. El aspecto fundamental de los reactores UASB lo constituyen los Iodos granulares

indispensables para su correcto funcionamiento. La caracterstica de stos, es contar con

15

1 Introduccih

una elevada actividad metanognica y a su capacidad de sedimentacin lo que les permite 1

tener un alto grado de retencin en el reactor, logrndose por lo tanto, separar el tiempo de I

I residencia hidrulica del tiempo de retencin celular (Ramrez, 1993). D Otra de las ventajas que presenta este tipo de tecnologa en el tratamiento de aguas

b residuales es por las altas cargas orgnicas (del orden de 10 kgDQO/m3d), el tamao del contenedor ocupa menos espacio respecto a los reactores aerbicos. b

b

1

1

16

-L 1 C -

Materiales v Mtodos

,.Captulo 2

Materiales y metodologas generarles

2.1. Introduccin

En este trabajo se observa que un compuesto txico, como la acetamida, es capaz de ser degradado por un bicultivo de bacterias aerobias y anaerobias que cohabitan en un mismo

sistema. Para ello se desarrollaron experimentos en lote para evaluar las condiciones con las cuales debera operarse el bicultivo en continuo. Las decisiones se hicieron mediante el

seguimiento de ciertos parmetros analticos, los cuales son el principal tema de discusin

de este captulo y de los cuales se muestra a continuacin su procedimiento.

Maleriaies Y Mtodos

2.2. Inculo

Bacillus spherlcus se aisl y caracteriz por Ramirez (1993 y 1996). A partir de una alicuota .de sta se llevaron a cabo propagaciones de cultivo de manera previa en medio de

Balch y acetamida (1 a) como fuente de carbono. Cada experimento se realiz con la cepa inicial a pH 7 y a la temperatura de 35C hasta tener un crecimiento en la etapa

exponencial (aproximadamente 30 horas). Meihnosarcina mazei cepa S-6 y Methanosarcina barkeri cepa 227 se obtuvieron de la coleccin ATCC. Previo a cada experimento se propagaron en medio anaerobio de Balch et

al. (1979) con reductores, c o n una concentracin de 5 g k de acetato y 1 g/L de extracto de

levadura y peptona resp&tivamente. El crecimiento se sigui de acuerdo a la produccin de

metano.

2.3. Medio de cultivo

El medio de alimentacin durante este trabajo fue hecho bajo condiciones estriles

utilizando como medio de cultivo el propuesto por Balch el al. (1979) (vase Tabla 2.1.),

pero sin los agentes reductores. El sustrato fue acetamida. Se mezclaron todos los

componentes en un matraz aforado de un litro, por ultimo se medi el pH sin ajustarlo a

7.0, solo se verific si se encontraba cercano a la neutralidad y se esterilizaba a 1 2 1 T

durante 15 minutos

,r ' ~ 3 ) 'I, . _ , Tabla 2.1. Preparacin del medio de cultivo.

18

Materiales y Mtodos

2.4. Mtodos analticos

2.4.1. Medicin de acetamida.

La medicin de este compuesto se hizo a travs de cromatografia de gases con un equipo

Varian Star 3400 CX, con detector de ionizacin de flama (FID). Las condiciones de operacin del equipo fueron: temperaturas controladas de la columna 120C; del inyector

200C y del detector 220OC. Se utiliz helio como gas acarreador a travs de una columna

capilar AT-1000 de 25 m de longitud y 0.25 mm de dimetro interno. El procedimiento que se sigui fue recolectar 1 mL de muestra respectiva para cada tiempo, se acidificaba con la

adicin de 50 pL de cido frmico concentrado, seguida por una centrifugacin a 128OOxg

durante 15 minutos y se inyectaban 2 pL al equipo (o se juntaban lotes semanales

guardndolos bajo refrigeracin a 4C). La cuantificacin se hizo a travs de una curva

patrn de acetamida a diferentes concentraciones en el intervalo de 1 a 20 mM.

[Am] = 42178x + I2663 con r2 = 0.9946 donde [Am]=concentracin de acetamida (mmoMmlL) y

x = la respuesta leda del equipo (rea bajo la curva).

2.4.2. Medicin de acetato.

Este compuesto fue medido en un cromatgrafo de gases HP 5890 a travs de un detector tipo FiD. Las condiciones de operacin del equipo fueron la temperatura controlada de columna a 130C, temperatura del inyector 200C y del detector 220OC. Se utiliz nitrgeno

como gas acarreador a travs de una columna capilar AT-1000 (ALTECH) de 10 m de longitud y 0.53 mm de dimetro interno, El procedimiento fue el siguiente; se recolecta 1 mL de muestra que se acidifica con SO pL de cido clorhdrico al 50% v/v e

inmediatamente se centrifuga a 1280Oxg durante 15 minutos y se inyectan 0.2 pL en el equipo (o se juntaban lotes s e d e s guardndolos bajo refrigeracin a 4OC). La cuantificacin se hizo a travs de una curva patrn de acetato a diferentes concentraciones

en el intervalo de 1 a 20 mM

19

Materiales y Mtodos

[Ac] = 3.3.104~ - 0.9319 con = 0.9845

donde [Ac]=concentracin de acetato (mmolAclL) y

x = la respuesta leda del equipo (rea bajo la curva)

2.4.3. Medicin de amonio.

La medida de amonio se realiz con el uso de un electrodo selectivo, que emplea una

membrana hidrofbica de gas permeable, intercambiadora de iones, que separa la muestra

problema de la solucin interna de cloruro de amonio del electrodo (Surez, 1998) Este

mtodo es aplicable a concentraciones de 0.03 a 1400 mg de N - W + / L (APHA 1989) El procedimiento es el siguiente. a 10 mL de muestra se adiciona O 5 mL de NaOH 10 N y se afora a 50 mL con agua desionizada La mezcla se coloca en un vaso de precipitados de 50 mi junto con un agitador magntico, se introduce el electrodo a una inclinacin de 45'

(Surez, 1998) y se mide el tiempo durante 3 minutos, obtindose una respuesta estable del

potencial de reduccin La cuantificacin se realiza a travs de una curva patrn de cloruro

de amonio (",&I) a diferentes concentraciones en el intervalo de 50 a 500 mg/L

I

(7

I

[A":] = 1.99.10-*x + 0.6975 con rz = 0.9845 donde [NH4+]=concentracin de amonio ( m a ) y

x = la respuesta leda del equipo (mv).

2.4.4. Medicin de metano.

El metano se midi mediante un cromatgrafo de gases OW-MAC serie 550 con detector de conductividad trmica (TCD). Las condiciones del equipo fueron: temperaturas controlada de columna 14OoC, del inyector 17OOC y del detector 190C. Se utiliz una

columna empacada de Carbosphere 80/100 de 3 m de largo y de dimetro interno de 1/8 de pulgada utilizando helio como gas acarreador. El procedimiento fue recolectar I mL de muestra bajo condiciones estriles de la fase gaseosa e inyectar O. 1 mL (las muestras de los

bioensayos se llevaban tal cual al equipo y las muestras del reactor una vez tomadas, se

20

Materiales v Mtodos

protegan mediante un septo). La cuantificacin se hizo a travs de una curva patrn de acuerdo al ensayo: 1.5 a 20 m m o l C W y de O a 100% de metano.

[CH,] = 4 6 5 5 ~ - 126 con rz = 0.9985

donde [CH.+concentracin de metano (mmolCH4) y

x = la respuesta leda del equipo (rea bajo la curva).

2.4.5. Medicin de biotnasa.

En estudios realizados por Rarnrez (1997) se encontr una relacin de la absorbancia de

Bacillus sphaerrcus en crecimiento exponencial en funcin de la cantidad de biomasa como

peso seco. Se us un espectrofotmetro Bausch & Lomb a una longitud de onda de 600 nm.

El procedimiento seguido fue. tomar 5 mL de muestra en un tubo de ensaye y medir

directamente la absorbancia usando como blanco una alicuota de 5 mL de medio de Balch

(1979) sin reductores y estriles en un tubo Hungate sellado

if- -1, * .

2.4.6. Peso seco

La cuantificacin de peso seco se hiz a travs de la ecuacin obtenida a partir de una curva

patrn de absorbancia producida por B. sphaericus en fase exponencial en funcin al peso seco medido i' -:

~ = 4 6 5 5 ~ - 1 2 6 con rz = 0.9845

donde ,y = concentracin en peso seco (mgcel) y

x = la respuesta leda del equipo (absorbancia).

2.4.7. Medicin de oxgeno disudto

La medicin del oxgeno disuelto se realiz mediante el uso de un electrodo de referencia,

calibrndolo con una solucin de sulfito de sodio al 2 % p/v (O mg/L) y el segundo punto es

una exposicin al aire (100 mglL). El procedimiento fue tomar una alcuota suficiente para

Materiales y Mdiodos

cubrir la zona de deteccin de la sonda y que la lectura se estabilizara por ai menos durante

15 segundos.

2.4.8. Medicin del valor de pH.

La medicin de este parmetro se realiz mediante el uso de un electrodo de referencia,

calibrndolo con soluciones de amortiguador de fosfatos para trabajar en el intervalo de

pH=7 El procedimiento fue tomar una alcuota suficiente para cubrir la zona de deteccin de la sonda y que la lectura se estabilizara por al menos durante 15 segundos.

(i.".)

2.5. Reactivos

Las sustancias utilizadas durante todo el experimento para preparacin de medio fueron

grado reactivo analtico. Respecto a los equipos de cromatografia, las curvas patrn de

referencia se hicieron con reactivos calidad cromatografica, al igual que los gases

requeridos en cada uno de los equipos usados. Se utiliz agua destilada para la preparacin

del medio de alimentacin.

22

.Captulo 3

Determinacin de las constantes cinticas

de M. mazei

3.1. Resumen

En la literatura se encuentran valores de las constantes cinticas de algunas bacterias metanognnicas, pero no las de Methanosarcina mmei en particular. En este captulo se describen los experimentos que se hicieron, en donde se vari la concentracin de acetato

para encontrar las constantes cinticas de crecimiento y de consumo de sustrato de M

mazei. Se encontr que la velocidad mxima de formacin de metano (v-) es de 0.046 mmolCH&h y la constante de afinidad (Ks) es de 124 mgAc/.

3.2. Objetivo particular

> Calalar las constantes cinticas de M. mazei mediante experimentos para medir la cintica de consumo de sustrato.

3.3. Dmedo experimental

En fraocos serolgicos de 60 mL que contenan 20 mL de medio de Balch et al. (1979), en los d e s se aadi acetato en distintas concentraciones (2.4; 4.7; 12; 16 y 24 mM) usando

como i n h l o 2 mL de un cultivo deM. mazei en fase de crecimiento exponencial. Los parmeros que se midieron para evaluar el desarrollo de este experimento fueron las concentraciones de metano a travs del tiempo y de acetato al inicio y al final del experimento. Los bioensayos se hicieron por duplicado.

f-!,

3.4. Resultados y discusin

En la Figura 3.1 se presenta la produccin de metano en funcin del tiempo para cada UM de las concentraciones de acetato usadas de acuerdo al diseio experimental. En esta se observa como aumenta la produccin de metano respecto ai incremento de sustrato

adicionado.

20

$ 15 2

E E 10 5

O

O 10 20 30 40 5c Tiempo (das)

Figura 3.1. PrOQecin de metano por Methanosatvim nvaei a traves del tiempo usando difmntes COllOCOtCBaOneS . deaCcEat0.

24

Result&

La produccin de metano comienza despus de una fase lag muy grande debido

probablemente a la baja concentracin de extracto de levadura y p e p t ~ ~ en el medio; se

puede ver tambin que a bajas concentraciones de acetato la fase lag se duplica. La Figura 3.1 sugiere trabajar solo con la parte de crecimiento exponencial para determinar los valores de las constantes cinticas deseadas. Los resuitados se muestran en la Tabla 3.1 en

donde la fase exponencial o de crecimiento est representada por la pendiente obtenida por un ajuste de lnea recta. Adems se muestran los tiempos de inicio de la fase exponencial de la produccin de metano para cada una de las diferentes concentraciones de acetato. Se

observa que entre mayor sea la concentracin de sustrato en el medio menor es la fase lag

de formacin de metano. La tercer columna muestra el balance de materia. La cantidad mxima de metano esperada (terica) se calcul basndose en la concentracin inicial de acetato. La cantidad de metano experimental se calcul a partir de la mxima produccin de metano.

0

Tabla 3.1. Tiempo de retardo y Velocidades de formacin de metano por MethanosarciM muzei. Ai,(&) Ac.(m&) %qCb k(mmoKW-4 ?

2.4 144 100 21 0.5866 0.8667 4.1 282 100 21 0.8052 0.9531 12 720 100 13 0.8666 0.9526 16 %O 91 13 1.0171 0.9885 24 1440 74 13 1.0292 0.9278

A partir de las velocidades de formacin de metano en funcin de la concentracin de

acetato se construye la ecuacin de Monod, (Figura 3.2.). 0 L *

O 5 10 15 af 25 30 Aceiato (rmaVL))

Figura 3.2. Efecto de la cmcenhu 'n de Ac en la velocidad de formacibi de CH, por M. mmei.

25

La tendencia muestra que a mayor concentracin del sustrato mayor es la velocidad de metanognesis. La gdca de Linerwaver-Burk, es decir, el inverso de la velocidad de produccin de metano en funcin del inverso de la concentracin de sustrato, (figura 3.3.) nos proporciona la velocidad mxima de produccin de metano y la constante de

saturacin.

O 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1/s (UMmI)

Figura 3.3. Ecuacin de Linerwaver-Burk para evaiuar la formacin de metano por M mazei.

en donde: m es la pendiente y

b es la ordenada al origen.

Los valores de las constantes cinti- obtenidas se comparan en la Tabla 3.2. con algunos datos obtenidos de la literahira. No fue posible medir el rendimiento celular cc) para M

26

Resultados

muzei debido a dificultades en la manipulacin del equipo, por la pequea cantidad de

clulas suspendidas en cada unidad experimental.

TABLA 3.2. Constantes cinticas paraalgunas cepas de Methanosarcina. Parmetro Methanosarcina Methanosarcina Methanosarcina

hix Of') 0.046 mmoikh" 0.023 0.0125 mazei barkeri'(227) SPP2

K, (mgAc/L) 124 300 180

Y (gccgAc) n.d. 0.0267:0.0533b 0.035

I. Zehnder, 1988; 2, Jeien et al. 1992; a, es velocidad mxima de formacin de metano; b, es M barkeri spp; n.4 no determinado.

I *-I ' J

Con respecto al valor de K, este se encuentra por debajo de los reportados por Zehnder (1988) y Jetten et al. (1992) para otras especies; lo cual indica que M. muzei presenta una

mayor afinidad por el sustrato, respecto a las comparadas.

I

I

3.5. Conclusiones

En los valores cinticos de M. maze! calculados experimentalmente se observa que la velocidad mxima de formacin de metano es favorable para la metanobacteria, en

condiciones reducidas; aunque, la constante de rendimiento celular es muy pequea

respecto a las otras Methanosarcina spp.

27

Resuliados

Captulo 4 Degradacin de acetamida por bicultivos de bacterias

metanognicas y B. sphaericus en lote

4.1. Resumen

Los experimentos que se muestran en este captulo fueron el soporte principal de la

hiptesis propuesta, debido a que en la literatura se encuentra informacin acerca de la

coexistencia de poblaciones de bacterias aerobias estrictas y anaerobias estrictas. Sin

embargo, no hay informacin de dos cepas puras cultivadas conjuntamente (bicultivos), en

los que se hubieran encontrado las condiciones adecuadas para coexistir. En este captulo se

hizo una serie de experimentos, en los cuales se variaron la concentracin del inculo

anaerobio (Methanosmcina bmkeri y Methanosarcina mazei) en un medio con concentraciones limitadas de oxgeno disuelto manteniendo constante a Bacillus

sphaericus Los resultados muestran que la mejor eficiencia de degradacin (del 95%), con

una produccin esperada de metano del 30% fue con la combinacin de B. sphaericus y M. mazei.

P . -.

Resulrcdos

4.2. Objetivos particulares

> Hacer pruebas de bicultivos en lote para observar el comportamiento y establecer las condiciones adecuadas de coexistencia.

> Estudiar en cultivos por lote la degradacin de acetamida hasta metano por Bacillus sjhaericus con Methamsarcina mazei o con Methmwsarcina barkeri y comparar los resultados.

4.3. Dwo expenmenial

El experimento consisti6 en comparar el comportamiento de los cultivos M. burkeri y B. qhaericus con M. m e i y B. sphaericus. Se reaiiion en frascos serolgicos de 60 mL (figura 4.1), en los cuales se vari el

volumen de inculo de Methunosurcina (5, 10, 15 y 20 mL) manteniendo constante el volumen de inculo de Bacillus (2 mL) (tabla 4. I), con una concentracin de acetamida de

20mM.

f-I

- d l

Figura 4.1. Vista de los bioensayos m loa que fucnm imaitados los bicultivoa para medir la promicci6ndemeiano.

29

Tabla4.1.RoporcK> ' llc8 de medio e irdailo usada en los bioensayos. Proporci6n ia6culo .crobio I 12% 17% 28% 1oo.k Vdumen de in6culo rdio (mL) 1 2 2 2 2 Volumen de in6culo iiiaerobio (mL) Volumen de medio d i o

15 10 5 O 3 8 13 18

Los experimentos se trabajaron bajo condiciones limitadas de oxgeno y cada bioensayo se realiz por duplicado. Los parmetros que se midieron para evaluar esta Sene de

experimentos fueron acetamida, acetato, metano y amonio a travs del tiempo. Adems, la

concentracin del oxgeno disuelto y pH se midieron al inicio y final del experimento.

4.4. bu l i ado e y discusi6n

Los resultados cualitativos de la cintica con los bicultivos fueron los siguientes. Al inicio, cuando se realizaron las inocuiacioncs, el bioensayo no present color ni turbidez en el medio. Sin embargo, a partir del segundo da aparece una turbidez blanca muy semejante

entre los bioensayos, debida al crecimiento de B. sphaericus, misma que despus de 15 das desaparece y se advierte la formacin de diminutos flculos (4mm de dimetro) de color

negro.

La proporcin 1Wh (6 11 mgOD/L) corresponde solamente a B. sphaericus en medio Balch sin reductores y se tomar como blanco. En la Figura 4.2 se observa como disminuye

en 2 das la concentracin de acetamida, se incrementa la concentracin de amonio a una similar de la acetamida hidrolizada indicando que ste no es utilizado como fuente de nitrgeno por B. qhaericus. Adems, el no detectar la presencia de metano indica que no puede producirlo a partir de acetamida, pero s hidrolimla y consumir el acetato formado.

'-1 .#

CJ

O IO P 30 40 50 Tiempo (diir)

Figura 4.2. Cultivo de B. sphaencus con 20 mM de Am (e); productos formados Ac CU y NI%+ (+).

30

A partir de las siguientes relaciones del biailtivo hablamos ya de cultivos mixtos, es decir, se mezclaron las diferentes proporciones variando las dos especies diferentes de Methammwcirn.

En la proporcin 12% 0.92 @D/L (ver Figuras 4.3 y 4.4), se ve que la hidrlisis de la acetamida es a los seis y ocho das, pero con mayor eficiencia en Mehanarorcina mazei (W?) que en MethaMEsmcim burkeri (72%). Tambin la concentracin de metano fue

mayor para M. m m i siendo de casi 25% mientras que para M. barkeri es de 15% del esperado. La aparicin de amonio se presenta en ambas series alcanzando una concentracin final de 16 y 17 mM respectivamente.

El acetato residual se observa con mayor abundancia en M. barked (1 3 mM) que para M. .e mwei (4 mM) debido probablemente a que M. barken es ms sensible a la presencia de

oxgeno en el medio y por lo tanto no lo consume (Boone y Mah, 1989).

O 10 20 30 40 50 Tiempo (das)

Figura 4.3. Bicultivo de M. mazei con B. sphericus en la proporcin 12% de oxgeno disuelto. Los smbolos indican: Am (6). Ac (ru, eH4 (8) y NH4+ (+).

Figura 4.4. Bmltivo de M. barken can B. sphaericur en la proporcin 12% de oxgeno disuelto. Los simboios indican: Am (*), Ac (ru, cffi (*)y NI&+ (+).

31

En la proporcin del 170%~ 1.22 mg0DL (Figuras 4.5. y 4.6.), la degradacin de

acetamida para M. muzei es a los 3 das con una eficiencia del 81%; Para M. barkeri es de 10 das con una eficiencia del 92%. La produccin de metano no fue buena, siendo menor al IO?! del esperado en ambas Mehmosarcina. Respecto al acetato se observa en las

grcas que permanece casi constante y alrededor de 5 d, en ambos bicultivos.

Figura 4.5. Bicultivo de M. mazei con E. sphaerimr en la proporcin 17% de oxgeno disuelto. Los smbolos indican: Am (e), Ac u), CH, (8) y NI%+ (+). T

1 O 10 20 30 40 50

Tiempo (das)

Figura 4.6. Bicultivo de M. barken' con B. sphaerimr en la proporcin 17% de oxgeno disuelto. Los smbolos indican: Am (e), Ac u), CH, (8) y".++ (+).

En la proporcin 28% 4.22 @D/L (Figuras 4.7. y 4.8.) la hidrlisis de acetamida es lenta (despus de los 8 das); Aunque con una eficiencia del 95o/e para M. mazei y del 75% parah. hkeri. En estos experimentos se ve al inicio la acumulacin de acetam, el cual es consumido a los 8 das y empieza la aparicin de metano, siendo la mayor produccin para M. nrazei (30??) que paraM. bark+ (20%).

32

Resultados

temperatura de 35C; Microorganismo Proporci6n TO Tr (4 q Am T o Am,.(mM) A h . (mM) Fase lag de CH, (d) CI.(o/~ del total esperada) ,+fin (mM) I0Dli.r (mdL)

p H i - r

pH de 7.0 y Am,= 20mM. M. mazei M. barkeri B. sphaericus

12 17 28 12 17 28 1 O0 6 3 8 8 10 10 2 91 81 95 72 92 7s 93

3.83 3.81 3.71 4.92 1.67 4.92 1.39 3.71 2.97 4.12 13.39 7.49 1.91 1.51 27 20 6 41 24 6 23 8 30 16 10 20 0.00 16 17 18 17 17 19 10

0.92-0 1.22-0 4.22-0 0.92-0 1.22-0 4.22-0 6.11-0 7.4-8.2 7.4-1.9 7.1-7.9 7.4-8.0 7.4-7.8 7.1-7.8 7.0-7.1

34

Resultados

estos mximos, pero se observa que todos son despus de los 20 das de haber iniciado el

experimento, es decir cuando el oxgeno est totalmente consumido.

De acuerdo a las mediciones iniciales de oxgeno disuelto, se observa una disminucin del

valor conforme aumenta el volumen de inculo anaerobio. El valor final de este parmetro

al final del experimento fue de cero mglL, por lo que se procedi hacer otro experimento

para medir el oxgeno disuelto a travs del tiempo y saber en qu momento se consume.

Este ensayo se llev a cabo bajo las siguientes condiciones. En un matraz se puso un

volumen de 200 mL de medio aerobio el cual se inocul con el 20 'YO v/v de Bacillus

sphaericus se sell y se registr el oxgeno disuelto que al inicio fue de 6 m a , a las dos horas fue de 4 m e , peco a las 12 y 24 horas el electrodo siempre registr un valor de cero.

Se recuerda que el tiempo de duplicacin de esta bacteria es de 6 horas, es decir, es el

tiempo en el que utiliza el oxgeno para su proliferacin por lo que se acepta este valor

como cierto

Acerca de los valores de pH se observa que al inicio es de 7.2 20.2 y al final para el blanco

no hay mucha variacin permaneciendo en el valor de 7. Sin embargo, la tendencia que se

observa, es que hay un incremento menor a una unidad de pH conforme se disminuye el

volumen de medio aerobio.

De acuerdo a la evidencia mostrada y comparando las constantes cinticas de M. mazei obtenidas en el captulo 3 y los de B. sphaericus (tabla 4.3.) se decidi trabajar con una proporcin 1: 10 del bicultivo B. sphaericus y M. mazei respectivamente.

(-1 '.__.I'

TABLA 4.3. Constantes cinticas para B. sphaericus y deM m e i . Parmetro Bacillus sphericus ' Meihanosarcina mazei

h i m a . @') 0.0042 0.046' (mmolCHdLh)

K. (wm 37 124 Y (gcegAc) 0.018

1, Ramrcz et u/. 1998; a, es velocidad mxima dc formacin de metano.

35

Resultados

4.5. Conclusiones

Los resultados de los bicultivos en lote muestran que el consorcio formado con M. maze1 present mayor conversin de acetamida a metano, menor tiempo de retardo

y menor concentracin de acetamida residual que el formado con M. burkeri; tanto en la acumulacin de metano como en la hidrlisis de acetamida, indicando que la

cepa de M. mmei puede adaptarse mejor a estas condiciones de cultivo. Sin

embargo, la cantidad de acetato residual al final del experimento es similar en todos

los cultivos al del cultivo puro de Bacillus sphericus, por lo que la produccin de

metano presente en los bioensayus pudiera originarse de una hidrlisis celular del

bacilo debido al.cambio en la turbidez del medio despus de I S das de haber

iniciado el experimento. Esto es, al estar reducido el medio sin oxgeno, esta

bacteria aerobia decrece. Para poder estar seguros de lo anterior se sugiere hacer un

conteo de clulas viables de B U C I I ~ S sphaericus ai inicio y al final de futuros

experimentos

36

7. . I

Resuliados

,Captulo 5 Degradacin de acetamida por un bicultivo de Bacillus

sphaericus y Methanosarcina mazei

"i

(\ _., 5.1. Introduccin Los estudios de reactores en lote son tiles debido a que el experimentador logra apreciar

aigunos puntos importantes acerca de los cultivos en estudio antes de inicial ir un reactor en continuo. Por ejemplo, un factor importante es el no cambiar las condiciones de operacin encomadas en los estudios anteriores para poderlos aplicar en los estudios. en continuo En este captulo se indicar el diseo experimental y los resultados obtenidos trabajando en un

reactor por lote alimentado as como los resultados de un reactor en continuo para degradar amtamida hasta metano. Durante el experimento se debieron cuidar varios aspectos tales

como el efecto de la adicin sucesiva de Mefhunosarcina al lecho de Iodos que se estaba

formando. Este proceso se hizo en etapas debido a que es muy dificil proliferar estas

bacterias en volmenes mayores a un litro bajo condiciones anaetobias.

5.2. Objetivos particulares

b Evaluar la concentracin de metano en un reactor de lote alimentado y de un reactor en

continuo.

b Observar el proceso de hidrlisis de la acetamida a diferentes tasas de dilucin en

ambos reactores. k Evaluar por medio,:del microscopio electrnico de bamido el lecho formado por

Merhanaiarcim mazei y Bacillus sphaericus en el reactor continuo. ri , >,

5.3. D d o experimental

5.3.1. Reactor de lote alimentado

El reactor de lote alimentado consisti en una botella serolgica de un litro de capacidad

que contena 750 mL de medio (ver Figura 5.1 .), los cuales se encontraban en condiciones

estriles. La botella en su tapa de msca se encontraba horadada e insertado un tapn de hule y el cual a su vez contena en la parte superior un tubo Hungate que tambin tenia su tapa de rosca horadada y su septo por el cual se tomaron las muestras bajo condiciones anaerobias y estriles. El inculo consisti en 100 mL de Bacillus sphaericus (27 mg de biomasa) y 200 mL de Methu?wsurcina maaei (90 mg de biomasa), los cuales se encontraban en crecimiento en fase exponencial y 450 mL de medio de Balch sin reductores (aerobio), adems se desplaz el oxgeno del aire en la fase vaca con N2/C@.

Fm 5.1. Reactor de lote alimentado.

38

Resuirados

Etapa I n m r v OxgemDisuelto do2 do2 do1 do2

Volumen de medio d i o (mL) 500 100 500 500 Acetami&(g/L) 2.0 1.5 1.0 2.0

Se hizo un moniioreo a iravs del tiempo y en el momento de que la acetamida casi haba sido hihliizada por compleio, el reactor fue realimentado con cuatro diferentes concentraciones y volmenes de medio aerobio (ver Tabla 5.1), d e s p i d o el oxgeno por la mezcla de gases

N&G. Los recambios se hacan en la cmara anaerobia quitando la tapa del frasco

5.3.2. Reactor continuo

El trabajo experimental consisti en montar y arrancar un reactor continuo a escala

laboratorio con una capacidad de 180 mL (ver Figura 5.2).

Figura 5.2. Reactor continuo mmlado con Bacillus sphwricus y Methamwrcina nnuei,

Este reactor en condiciones estriles se inocul con 25 mL de Bacilius +rims (17.5 mg de biomasa), 75 mL de Metham>scacina inmei (60 mg de biomasa), dentro de la cmara anaerobia pam evitar el contacto del aire con el cultivo; El resto del reactor se llen con medio de Bdch sin resarzUnna y sulfur0 de sodio. Para llevar la biomasa a una alta

39

Resultados

concentracin, el reactor permaneci en lote durante 72 h y posteriormente fue alimentado

en continuo a diferentes concentraciones de acetamida como sustrato principal variando el

tiempo de residencia hidrulico, hasta tenerlo en fase de estado estacionario, como se

observa en la Tabla 5.2. La etapa final de alimentacin se hizo con acetato para estudiar el

comportamiento del bicultivo con este compuesto. El estado estacionario se consider cuando se tenan al menos valores constantes en la acetamida de salida, despus de haber

transcumdo cinco veces el tiempo de residencia hidrulica.

Tabla 5.2. Diseo experimental para el crecimiento de B. sphaericus y M. rnazei en un cultivo continuo. :

(- *I, ,\. .,I

* Ac; 1, cambio por " g a volum6tnCe; 2, Rinoculacin deM m e .

Las etapas marcadas son diferenciadas por cambio en el TRH o de concentracin en la

carga de alimentacin, as como de una adicin de la bacteria anaerobia (60 mg) para tener

una mayor concentracin de biomasa y es precisamente la ltima etapa en dnde se hace un

cambio de la fuente de carbono, es decir se utiliz acetato por acetamida

Los parmetros que fueron monitoreados en el transcurso del experimento son. la

concentracin de metano, la hidrlisis de acetamida, la produccin de acetato, la medicin

de amonio, del pH y de la biomasa en el efluente, los slidos totales, fijos y voltiles al

final del experimento; as como tambin una observacin en el microscopio electrnico de

barrido W B ) de una pequea muestra de los flculos formados dentro del reactor. La produccin de metano se mide por desplazamiento de una solucin saturada de cloruro de

sodio a pH de 2. Tambin se efectu UM cuantificacin de la biomasa, tanto aerobia como anaerobia, a travs de diversos puntos del reactor como son en la entrada, en el lecho de

Iodos y en la salida de la columna al final de la alimentacin con acetamida.

La metodologa seguida para el tratamiento de la muestra para microscopa fue la propuesta

por Seplveda et al. (1998):

1 mL de Iodos se centrifuga a 750xg durante 3 minutos. Despus se decanta el sobrenadante y se adiciona una solucin de glutaraldehdo al 6% en amortiguador de fosfatos (0.02 M y

pH de 7.2) durante al menos 12 horas.

(""I I

40

Resultados

Transcurrido el tiempo se retira la solucin de glutaraldehdo y se hacen de 5 a 7 lavados

por intervalos de 10 a 15 min cada uno usando el amortiguador de fosfatos.

Enseguida se procede a fijar con osmio al 2% en amortiguador de fosfatos durante 2 3 horas (tener MUCHA PRECAUCION con la manipulacin de este reactivo USAR

GUANTES Y TRABAJAR BAJO LA CAMPANA DE EXTRACCIN). Inmediatamente

transcurrido el tiempo se retira la solucin y se hacen entre 3 a 5 lavados con amortiguador

de fosfatos.

Una vez que la muestra ya tiene un color negro se procede a realizar una deshidratacin y

desecacin en fro, esto es, mediante UM serie de soluciones porcentuales de etanol desde el

30 al 100 % v/v con 3 lavados de 10 a 15 minutos cada una y siempre en fro. Terminado

este proceso se hace la deshidratacin con el equipo desecador a punto critico, en donde el

COZ lquido desplazar el etanol y residuos de agua. La muestra se somete a una

temperatura de 36.1OC y a una presin de 1070 Ib/pl* para que pase a fase gaseosa el

bixido de carbono. A partir de este momento la muestra es altamente higroscpica por lo

que las condiciones de trabajo sern en un desecador.

Se monta la muestra en un soporte de aluminio especfico compatible para la evaporadora

de carbn y oro y el MEB y se realiza el recubrimiento con una capa de C y Au. Finalmente terminado el proceso anterior, las muestras estn listas para ser observadas en el

MEB Zeiss Modelo DSM 940 A.

ff ->, '/ ,,'

i I-' , - * 5.4. Resultados

5.4.1. Reactor de lote alimentado

En el caso del reactor de lote alimentado las observaciones cualitativas durante el

experimento son semejantes a las presentadas en las cinticas de bioensayos. Es decir en la

inoculacin no hubo ningn cambio en el medio, pero a p d r del segundo da ya se

apreciaba UM turbidez del medio. Al final del experimento se advierte la formacin de flculos (

Resulrados

bicultivo formado no se encontraba en las condiciones idneas, adems de observar el comportamiento durante la experimentacin.

Los resultados de los parmetms momtoreah en el experimento del reactor de lote alimentado, se muestran en la Figura 5.3. la cual se construye como concentracin en furicin del tiempo. En sta figura se observan las etapas de acuerdo a la variacin en la concenhacin de acetamida

En la etapa uno, se tiene que a pa& de una concentracin de acetamida de 2 giL.

(experimental 38 mM), sta se agota a los siete das mientras que el acetato firmado presenta

un perodo de saturacin mxima de 19 mM (apmx. el 50 % del sustrato inicial). Cuando el acetat0 empieza a desaparecer comienza a registrarse la produccin de metano hasta llegar a UM concentracin de casi 30 mmolCHJL a los veinte das. Sin embargo, esta concentracin

de metano es mayor que el acetato firmado por lo que es probable que parte de la bacteria aerobia se estuviera hidrolizando por la fdta de oxgeno en el medio y esta hidrlisis celular

sirviera para que Methanosarcim mazei produjera metano. Guyot el al. (194) demostraron la

presencia de metano por hidrlisis celular a partir de cultivos con Iodos.

I I II I 111 I N

o IO 20 90 40 60 Tiempo (das)

Figura 5.3. Compoitamiento del reactor de lote aii~~entado, el cual muestra la desspanci6n de acetamib (e), la fomiacin de acetato (13 y la aparicin de metano (*).

En la segunda etapa, a m d o todo el acetat0 se consume, se reaiimenta el reactor con 1.5 g& de acetamida en 100 mL de medio aerobio con la finalidad de no perder las condiciones

42

Resultados

anaerobias que ya se tenan, esperando que la desaparicin del sustrato fuera en menos tiempo.

Sin embargo, la falta de oxgeno en el reactor hace que la hidrlisis sea ms lenta y con muy poca formacin de acetato. Esto tal vez se debi a la baja concentracin de oxgeno adicionado

ai medio, por lo que se decidi reaiimentar el reactor con 500 mL de medio aerobio y 1 g& de

acetamida (da 25). En esta fase la hidrlisis del sustrato fue todava ms lenta que la etapa

anterior y la acumulacin de acetato no se vi favorecida (< 5mM en promedio), y en lo que

concierne al metano formado alcanzh los 12 mmolCHJL cuando se observ que la acetamida

casi haba desaparecido por completo, indicando que parte de este metano se origin

probablemente de una hidrlisis celular.

En la ltima etapa a los cuarenta y un das de tiempo de iniciado el experimento, se realiment

con 2 g/L de acetamida en 500 mL de medio aerobio con la finalidad de repetir las condiciones iniciales las cuales haban sido satisfactorias. La hidrlisis del sustrato se mejor

notablemente siendo similar que al inicio pero la formacin de acetato no se vi favorecida (<

25%) y por lo tanto, tambin la concentracin de metano

Los resultados muestran que al adicionar la acetamida y oxigeno disuelto en el medio dentro

del reactor aumenta la biomasa de Bacillus sphericits, ya que el acetato producido por la hidrlisis es consumido principalmente por el mismo bacilo para producir biomasa, quedando

muy poco acetato residual para la metanognesis

Se muestra tambin que la produccin de metano presenta una fase lag cada vez ms larga

debida probablemente a la presencia de oxgeno en el reactor y al poco acetato residual

:-I d

5.4.2. Reactor Continuo

5.4.2.1. Hidrlisis de la acetamida

El comportamiento de los parmetros ms importantes como son la acetamida, la

produccin de acetato y de metano se muestran en la Figura 5.4, la cual se construye como

carga volumtnca a travs del tiempo, B,(g/L.d)=f{t(das)). La concentracin del oxgeno

disuelto en la entrada del reactor fue constante e igual a 6.4 mg/L y en la salida no se

detect valor alguno.

43

2.5

1 .o

0.5

0.0

L-

O 50 100 150 200 250 30 Tiempo (das)

Figura 5.4. Gmportamieko de la aceramida a la entrada (e), a la salida (B), del acetat0 a la entrada (13, a la salida (0) y la deteccin de memo (*) a las diferentes cargas volmtricas en el reactor continuo.

9

El anlisis se har con referencia a la degradacin de acetamida como indicador del estado estacionario mencionando como se comportaron los otros parmetros en cada periodo. La informacin detallada se presenta sintetizada en la Tabla 5.3. .-

Tabla 5.3. Hidrlisis de acetam& y formacin de productos medidos por etapa en el reactor

(das) (d) (pn .d) (gn) (gn) W) (Bn) ETAPA Pedodo TRH BV [Am],g[Am]~EfiC.Am [ A c ] ~ [a] OD

A 4 1.38 1.08 1.4980 0.9021 39.57 0.1302 0.0079 4.63 B 7 1.85 1.18 2.0074 1.0791 45.35 0.3624 0.0062 3.46 C 9 1.87 1.09 2.0320 1.0832 48.46 0.0792 0.0261 3.42 D 40 1.94 1.01 1.9553 1.0207 47.79 0.4914 0.1189 3.30 E 29 1.41 1.39 1.9553 1.2467 36.24 0.3900 0.0925 4.60 F 17 1.41 1.39 1.9553 1.0301 47.29 0.0552 0.0395 4.60 G 5 1.46 2.05 2.9960 1.64% 46.65 0.9117 0.0885 3.12 H 44 2.09 1.43 2.9960 1.6597 44.61 0.7925 0.1688 4.50 I 11 2.01 1.49 2.9960 1.6691 44.29 0.6781 0.1002 4.30 J 9 2.07 0.70 0.1037 0.2374 3.09

NOTA El p h d o sc rrfvn al t*sopo de opaacibn; *- . cmacddo.AbreViahins :TRH=oeiipode

ICH41= - . deMtaM;suMtdiocginf=infhmtr,,dl=ehmtc. ; Bv = carga Vohndhica; [Am] = cmcatw5h dc acdmmda; [Ac] = cmca*h de acdato, En la etapa (A) con una carga de 1.1 g/L.d de acetamida se obtuvo una hidrlisis del 39.6% en promedio y aunque hay una acumulacin de acetato del orden de O. 13 g (2mM) no se observa produccin de metano.

44

Resultados

Se decidi subir la carga volumtrka a 1.2 &.d de acetamida, de la cual se obtuvo una

eficiencia de hidrlisis del 48.1% en promedio. Cabe sealar que esta etapa fue dividida en

tres secciones (B, C y D) debido a la adicin de M. muzei dentro del reactor; En la seccin B se observa una mayor acumulacin de acetato cuyo valor es de 0.36 g (6 mM) pero no hay produccin de metano. En la segunda seccin (C) despus de adicionar M. mmei disminuye la acumulacin de acetato a 0.08 g (1.3 mM) y se observa un ligero incremento

en la concentracin de metano de 1.6 mmolCH4/L dentro del reactor, pero no hay

desplazamiento por biogs. En la seccin D se observa un incremento en la acumulacin de acetato (0.49 g) y tambin un incremento notorio en la concentracin de metano (7.8

mmolCi-i&,) dentro del reactor pero sin desplazamiento por biogs.

Una vez alcanzado el estado estacionario de esa etapa se procedi a realizar un cambio en la carga volumtrica de entrada a 1.4 g 5 . d . disminuyendo el TRH a 1.5 das obteniendo una eficiencia de hidrlisis de la acetamida de 36% (etapa E), observando tambin una ligera disminucin en la concentracin de. acetato (0.39 g) al igual que en el metano (5.6

mmolCH&) dentro del reactor. Una vez mas se adicion biomasa de la bacteria anaerobia

dentro del reactor (etapa F) manteniendo las mismas condiciones anteriores de operacin y se observ que la eficiencia de hidrlisis aument a un 47.3%, tambin se not una

disminucin en la acumulacin de acetato (0.06 g) de la misma manera que en la

concentracin de metano (2.5 mmolCH&) dentro del reactor.

El siguiente cambio en la carga volumtrica del sustrato consisti en 2.1 glL.d a un TRH de

1.5 das encontrando una eficiencia de hidrlisis del 47% (etapa G) en la fase final de la etapa, por lo que se observa un aumento en la acumulacin de acetato (0.91 g), aunque no

se observ la produccin de biogs medida por desplazamiento pero la concentracin de

metano dentro del reactor se mantuvo constante (5.5 mmolCH4/L).

Alcanzado una vez el estado estacionario de la etapa anterior se decidi hacer un cambio en la carga volumtrica a 1.43 g/L.d y un TRH de 2 das (etapa H). Bajo estas condiciones se observ una mayor concentracin de metano en el biogs, es decir, mejores condiciones

para M. mazei. La eficiencia de hidrlisis en este periodo es de 44.6%, la aparicin de acetato es de 0.79 glL y la concentracin de metano es de 11.1 mmolCHJL la mas alta

alcanzada durante todo el experimento usando como sustrato a la acetamida.

r-1 -11

(1 2

45