Metode zymogram: deteksi aktivitas protease/protease

Pembuatan gel 12% SDS-PAGE

1. Bersihkan kaca dan karet yang akan digunakan untuk mencetak gel dengan alkohol 70%2. Susun cetakan gel dengan urutan sbb: kaca-karet-kaca-penjepit (kanan-kiri) (lih. gambar)

Catatan: pastikan cetakan gel tidak bocor dan rata (cek dengan mengisi air pada cetakan)3. Separating gel dibuat dengan mencampurkan:

No Bahan Volume (zymogram Protease)

Volume(zymogram amylase)

1 1.5 mM tris-HCl pH 8.8-0.4%SDS 1.875 ml 1.875 ml2 30% Akrilamide 3 ml 3 ml3 ddH2O 1.852 ml 2.45 ml4 10 APS 25 µl 25 µl5 TEMED 2.25 µl 2.25 µl6 Gelatin (Stock 1%)/ pati (stock 10%) 742.5 µl (0.2%) 149.5 µl (0.2%)7 Total 7.475 µl 7.475 µl

4. Tuang larutan gel perlahan dalam cetakan gel untuk mencegah adanya bubling. Setelah cetakan gel penuh, tambahkan 1-1.5 mL akuades pada lapisan atas (biarkan sebagian cairan tumpah)

5. Gel didiamkan hingga mengeras ±1 jam (ditandai dengan adanya garis yang memisahkan antara gel dan akuades)

6. Setelah gel mengeras, lapisan atas (akuades) dibuang.7. Selanjutnya dibuat gel stacking dengan mencampurkan akuades-bufer stacking:

No Bahan Volume1 0.5 mM tris-HCl pH 6.8-0.4%SDS 0.625 ml2 30% Akrilamide 0.325 ml3 ddH2O 1.525 ml4 10 APS 12.5 µl5 TEMED 2.5 µl

8. Tuang larutan gel perlahan dalam cetakan gel hingga penuh, sisipkan sisir dengan bagian yang timbul menghadap ke luar.

Preparasi sampel

1. Siapkan eppendorf steril sesuai dengan jumlah sampel2. Tambahkan 12 L sampel dan 3 L non-denaturating loading dye (homogenkan).

Running elektroforesis

1. Siapkan perangkat elektroforesis2. Lepaskan penjepit, karet, dan sisir pada cetakan gel SDS-PAGE3. Rangkai perangkat elektroforesis seperti gambar, tambahkan karet pada bagian tengah bila

perlu4. Tambahkan bufer running 1x SDS hingga memenuhi setengah chamber luar. Bufer

ditambahkan dari bagian tengah chamber.

5. Kurangi busa yang terdapat pada bagian bawah plate dengan memiringkan chamber ke kiri dan ke kanan secara perlahan.

6. masukkansampel dan penanda bobot molekul (marker, sebagai pembanding) ke dalam well7. pasangkan kutub katoda(+)-merah, kutub anoda(-)-hitam set 100 volt, 40 mA, 120 menit 8. Setelah elektroforesis selesai, kaca cetakan dibuka dengan menggunakan sudip, buang

bagian stacking gel9. Lepaskan gel dari kaca secara perlahan menggunakan sudip, apabila gel sulit terlepas, alirkan

air dari bawah gel.10. Simpan gel di wadah bersih (gel harus selalu basah)

Pewarnaan dengan Commasie Blue

1. Untuk deteksi aktivitas protease, gel diwarnai dengan Commassie Brilliant Blue G-250 selama 2 jam atau sampai terlihat zona bening. Proses pewarnaan dilakukan di atas rocker. Kemudian Destaining dengan larutan destain jika diperlukan.

2. Untuk deteksi aktivitas amylase gel diwarnai dengan larutan KI-I2 sampai terbentuk zona bening. Proses pewarnaan dilakukan di atas rocker. Kemudian sisa larutan KI-I2 yang terisa pada gel dicuci dengan larutan 0.8% NaCl.

3. Gel dipindahkan secara perlahan dan dibungkus dalam plastik mika, yang menutupi seluruh permukaan gel.

4. Dokumentasikan (scan).

Referensi

Raser KJ, Posner A, Wang KK. Casein zymography: a method to study mu-calpain, m-calpain, and their inhibitory agents. Arch Biochem Biophys1995; 319 (1): 211-216.Kleiner DE, Stetler-Stevenson WG. Quantitative zymography: detection of picogram quantities of gelatinases. Anal Biochem 1994; 218 : 325-329.