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Métodos de gerar animais transgênicos e controle da
expressão gênica
Prof. Dr. Vinicius Campos Disciplina de Transgênese Animal
Graduação em Biotecnologia - UFPel
1. Histórico e contextualização
2. Métodos de gerar animais transgênicos
3. Métodos de controle da expressão de um transgene
Abordagens da aula...
• 1980 – Primeiro animal transgênico – camundongo – Gordon et al. via microinjeção de DNA
• 1982 – Camundongo gigante (GH) – Palmiter et al.
• 1985 – Coelhos, suínos e ovelhas transgênicas
• 1989 – Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT)
• 1992 – Knockout por recombinação homóloga – Oliver Smithies
• 1997 – Transgênese via Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)
• 2003 – Knockdown em animais transgênicos
Histórico e contextualização
Histórico
Palmiter & Brinster , 1982
• Camundongo Gigante
• Inserção do gene do GH sob controle
do promotor da metalotioneína
• Gerados Via Microinjeção
Macacos GFP positivos
Camundongos GFP
Atualmente os animais transgênicos
são uma das ferramentas mais
importantes da moderna biotecnologia
animal
Aplicações dos Animais Transgênicos
I – Estudo da função dos genes - knockout
II - Melhoramento Animal
III – Produção de proteínas recombinantes
Geração os animais e controle do transgene
Cada aplicação dos animais transgênicos
Precisa de um método específico de geração e controle da expressão do
transgene
Métodos de Geração dos Animais Transgênicos
Tran
sfer
ênci
a G
ênic
a Embriões
Gametas
Células
Construção do DNA exógeno (transgene)
1ª ETAPA 2ª ETAPA
Tran
sfer
ênci
a G
ênic
a
Embriões
Gametas
Células
Microinjeção de DNA
Infeção com retrovírus
ou Lentivírus
SMGT
TMGT
OMGT
Local da Transferência Gênica
Técnicas Usadas
Células Germinativas
Células-Tronco
Embrionárias (ES)
SCNT
Transferência Gênica em Embriões
Microinjeção Pronuclear
Microinjeção Citoplasmática
Infecção com Retrovírus ou
Lentivírus (Espaço perivitelínico)
• Primeiro método para gerar animais transgênicos
• Método mais utilizado na geração de animais transgênicos
• Taxas de eficiência de 1-5% em camundongos
• Pouco eficiente em animais domésticos (bovinos, suínos, ovinos e caprinos)
• Necessidade de equipamentos sofisticados como o micromanipulador - mão de obra treinada
• Não execução de recombinação homóloga
• Injeção de DNA ultrapuro – até 1000 cópias
Embriões - Microinjeção pronuclear
Embriões - Microinjeção pronuclear em Bovinos
Centrifugação dos grânulos de lipídeos
permite a visualização dos
pronúcleos
• Utilizada em animais onde os pronúcleos NÃO são visíveis – peixes
• Método mais utilizada na geração de peixes transgênicos
• Taxas de eficiência de até 20% em zebrafish
• Não permite recombinação homóloga
• Necessidade de altas concentrações de DNA exógeno – 20 milhões de cópias - o que induz alta toxicidade aos embriões
• Alta porcentagem de mosaicos
Embriões - Microinjeção citoplasmática
Placa com
agarose Zigotos
Microinjeção
citoplasmátia de
DNA exógeno
Embriões - Microinjeção citoplasmática
Embriões – Infecção Viral
• Vetores retrovirais ou lentivirais (vírus de RNA)
• Manipulados geneticamente para conter o gene de interesse – processo lento e trabalhoso
• Principal técnica de geração de aves transgênicas – mas também é usada em mamíferos
• DNA viral leva ao silenciamento do transgene durante as gerações
• Há uma preocupação com a possível ativação do vírus durante a vida do animal – mesmo que os genes antigênicos tenham sido desativados
• Baixas taxas de integração
Embriões – Infecção Viral
Zigoto
Lentivírus
Injeção no
espaço
perivitelínico
Em mamíferos
Infectam células
quiescentes
Embriões – Infecção Viral
Zigoto Incubação com
Lentivírus
Tratamento com
pronase para
tornar a zona
pelúcia
permeável
Em mamíferos
Tran
sfer
ênci
a G
ênic
a
Embriões
Gametas
Células
Microinjeção de DNA
Infeção com retrovírus
ou Lentivírus
SMGT
TMGT
OMGT
Local da Transferência Gênica
Técnicas Usadas
Células Germinativas
Células-Tronco
Embrionárias (ES)
SCNT
Transferência gênica para os gametas
• Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT)
• Transferência gênica mediada por testículos (TMGT)
• Transferência gênica mediada por oócitos (OMGT)
Transferência gênica para os gametas
• Técnicas relativamente simples em relação aos outros métodos de geração de animais transgênicos
• Técnicas de geração em massa – em um procedimento podem ser gerados vários animais transgênicos
• O método mais simples para a geração de animais
transgênicos e pode ser aplicado a qualquer espécie
que use o espermatozóide para reprodução
• Não necessita equipamentos sofisticados
• Baixa repetibilidade
• Baixas taxas de integração no genoma hospedeiro –
muitos mosaicos
• Baixa incorporação de DNA pelo espermatozóide
Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT)
Métodos de Transfecção de DNA
Eletroporação
Lipofecção
Incubação
Baixa eficiência para espermatozóides
• Remoção do plasma seminal • Eletroporação • Desidratação e reidratação • Lipofecção, DMSO • Linker-Based SMGT – Anticorpos carreadore de DNA • REMI-SMGT • Lentivirus • Aumento da permeabilidade da membrana • ICSI-SMGT • NanoSMGT
Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT)
Técnicas para aumentar a transfecção de DNA para espermatozoides
• Na inseminação artificial ou na FIV nem sempre o espermatozoide transfectado irá fecundar um oócito
• Na ICSI é possível escolher apenas os espermatozóides transfectados e injetá-los no oócito
• Altas taxas de transgênese
• Muito utilizada em bovinos
• Porém reduz a simplicidade da SMGT
ICSI-SMGT
• Utilização de nanoestruturas na transfecção de DNA para os espermatozóides
• Nanotubos, nanopolímeros, nanopartículas
• Permite uma maior taxa de transfecção
• Proteção contra DNases no plasma seminal
NanoSMGT
• Dependendo da aplicação do animal transgênico – macho ou fêmea
• Sêmen sexado em bovinos
• Comercialmente disponível
• Custos acessíveis
Sêmen Sexado - SMGT
USO DE SÊMEN SEXADO NA SMGT PARA PRODUZIR BOVINOS TRANSGÊNICOS COM SEXO
PREDEFINIDO
• Transfecção de espermatozóides com mais de um gene ao mesmo tempo
• Possibilidade de gerar animais multi-transgênicos
Multi-SMGT
• É uma variante da SMGT
• É a SMGT in vivo
• Injeção de DNA direta nos testículos
• Captura do DNA exógeno pelas espermatogônias
• Geração de espermatozoides ¨transgênicos¨
• Aplicado principalmente em camundongos e aves
• Compartilha das mesmas limitações da SMGT
• Entretanto, a integração de DNA é maior que na SMGT – incorporação do DNA pelas espermatogônias
Transferência gênica mediada por testículos (TMGT)
Transferência gênica mediada por oócitos (OMGT)
• Método pouco utilizado • Injeção de DNA direta nos ovários • Poucos estudos • Captura do DNA pelas oogônias
Tran
sfer
ênci
a G
ênic
a
Embriões
Gametas
Células
Microinjeção de DNA
Infeção com retrovírus
ou Lentivírus
SMGT
TMGT
OMGT
Local da Transferência Gênica
Técnicas Usadas
Células Germinativas
Células-Tronco
Embrionárias (ES)
SCNT
Embora a transferência gênica para células envolva em algum momento a manipulação de gametas ou embriões, a transferência gênica é
feita através da transfecção de DNA para células cultivadas
Transferência Gênica para Células
Células transfectadas com
vetor pEGFP
• Tranferência gênica para células germinativas
– Spermatogônias
– Células Primordiais germinativas
• Tranferência gênica para células tronco-embrionárias
• Tranferência gênica para células somáticas
– Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)
Transferência Gênica para Células
• São os métodos mais avançados para a geração de animais transgênicos
• Transferência-gênica em células permite a recombinação homóloga
• Transgênese condicional – Sistema CreLoxP
• Permite a integração sítio-dirigida ou gene targeting
Transferência Gênica para Células
Transferência gênica para células-tronco embrionárias (ES)
• Permite a recombinação homóloga
• Transgênese condicional via sistema CreLoxP
• Knockout condicional
• Knockin condicional
• Baixas taxas de mosaicismo após a F1
• Apenas em camundongos há o cultivo de ES
Métodos de Geração dos Animais Transgênicos
Tran
sfer
ênci
a G
ênic
a Embriões
Gametas
Células
Construção do DNA exógeno (transgene)
1ª ETAPA 2ª ETAPA
Na construção do transgene definimos como controlar a sua
expressão
• O controle da expressão do transgene se dá através de duas situações:
1. Pela forma como o transgene foi construído, como foi projetado para ser expresso
2. Pelo local de integração no genoma hospedeiro
Métodos de controle da expressão gênica em animais transgênicos
Construção do Vetor
Local de integração
Definem como o
transgene será expresso
Métodos de controle da expressão gênica em animais transgênicos
• Regras gerais na construção de vetores para a produção de animais transgênicos
– Evitar fragmentos com ilhas CpG
– Usar DNA genômico com introns ao invés de cDNA
– Usar promotores grandes com enhancers
– Evitar usar DNA bacteriano ou viral
– Remover genes de resistência à antibióticos antes da transferência gênica
–
Construção do vetor (cassete gênico)
• Promotor
– Enhancers
• Região transcrita
– Íntrons
– 3’ UTR
– 5’ UTR
– Região codificadora (CDS)
– Região Terminadora
– Construções bicistrônicas
• Regiões Flanqueadoras
– Insulators
– Sítios para integração sitio-dirigida
Componentes de um vetor para gerar animais transgênicos
• É a principal região regulatória da construção
• É o principal responsável pelo direcionamento da expressão para algum órgão ou tecido
• Pode ser tecido-específico ou constitutivo
• Deve conter enhancers para aumentar a intensidade da expressão
• Evitar regiões com ilhas de CpG
• É indispensável para qualquer construção de vetores para geração de animais transgênicos
Promotor
• Ex. Citomegalovírus (CMV)
• Ex. Beta-actina
• Ex. Metalotioneína
• Ex. EF1α
Promotores constitutivos
Induzem a expressão do transgene em todas as células do animal transgênico
Promotores constitutivos
Camundongos Transgênicos expressando o
gene EGFP sob controle do promotor CMV
Aumento da taxa de mosaicismo
• Ex. Beta-lactoglobulina – glândula mamária
• Ex. Ovalbumina – oviduto de aves
• Ex. Uromodulin - rins
Promotores tecido-específicos
Direcionam a expressão do transgene em todas as células do animal
transgênico
Todos precisam de fatore de transcrição específicos sintetizados apenas nos tipos
celulares específicos
• Introns – Presentes na maioria dos genes eucarióticos
– 50-250 pb
– A ausência de introns reduz a expressão gênica
– Utilizar pelo menos um intron no flanco 5’ da região codificadora
– Pode conter sítios para fatores de transcrição
– Facilitam o transporte do RNA mensageiro para o citoplasma
– Indispensável
Região transcrita
• 5’ UTR – Deve conter o mínimo de sequencias GC
– Codon de iniciação AUG deve ser precedido de uma sequencia de Kozak – ACC
• 3’ UTR – Sítio de poliadenilação poly(A)
– Sítios-alvo para microRNAs devem ser removidos
– Regiões ricas em CU aumentam a estabilidade do RNA mensageiro
Região transcrita
• Região codificadora – Contém a mensagem genética
– Otimização de códons preferenciais
– www.kazusa.or.jp/codon
– Utilização de genes sintéticos
– Evitar ilhas de CpG
Região transcrita
• Isoladores ou Insulators – Usadas nos dois flancos do transgene para sobrepor o
efeito da posição de integração no genoma
– Insulator do gene da beta-globina (5’HS4)
– 300 pb
– Impede que sequencias vizinhas intefiram na expressão do transgene
– “Sequencia abridora de cromatina”
– Mantém a cromatina aberta permitindo a transcrição
– Aumenta a especificade da transcrição
Regiões Flanqueadoras
• Motivos para integração sítio-específica – Sítios para reconhecimento de transposases
– Sítios para meganucleases
– Sítios LoxP para reconhecimento por Cre recombinase
Regiões Flanqueadoras
• OVA/EPO vector – Promotor da ovalbumina com enhancers
– cDNA da EPO humana com códons otimizados para aves
– Paente depositada INPI - Campos et al., 2012 -
– “Sequencia de DNA recombinante para produção de eritropoetina recombinante em galinhas transgênicas”
Exemplo de um cassete gênico
5’ 3’
Promotor OVA 2784 pb
Kozak EPO CDS SV40 Poly (A)
BamHI XhoI
• Promotores induzíveis por poluente ambientais – Promotor da com motivos responsívos à
poluentes
Vetores para controle da expressão do transgene por indutores externos
Elemento Responsivo Motivo de DNA no promotor
EPRE – metais pesados GGTGACAAAGC
ERE - estrógenos TAATGGTGACAAAGCAACTT
AHRE – hidrocarbonetos TGCTGACTCAGCA
• Knockout – bloqueio da expressão – Vetores para recombinação homóloga
– CreLoxP
• Knockdown – diminuição da expressão – Vetores para RNAi
– Vetores para microRNAs
Vetores para inibição da expressão de um gene endógeno
• Proteínas transdominantes negativas – Vetores para superexpressar uma proteína
semelhante porém inativa
– Irá competir com a proteína nativa, porém terá vantagem
– Maior concentração que a proteína nativa
Vetores para inibição da expressão de um gene endógeno
• Tão responsável quanto o vetor no controle da expressão do transgene
• Se o vetor for integrado num sítio de heterocromativa ficará silenciado
• Se o vetor se inserir no meio de um gene ativo causará mutagênese insercional
Controle do local de integração no genoma hospedeiro
• Integração passiva
– Microinjeção
– SMGT
– ICSI-SMGT
• Integração ativa ou sítio dirigida ou gene targeting
– ES
– SCNT
– PGCs
Controle do local de integração no genoma hospedeiro
• Integração passiva
– Sem controle do local de integração
– Concatâmeros – múltiplas cópias
– Pode ocorrer silenciamento
• Integração ativa ou sítio dirigida ou gene targeting
– Controle preciso do local de integração através de enzimas
– Única cópia
– Rara ocorrência do silenciamento
Controle do local de integração no genoma hospedeiro
• Zinc Finger Nucleases
• Meganucleases
– I-SceI
• Transposons
– Tol2
– SleepBeauty
– piggyBac
Integração ativa ou sítio-dirigida ou gene targeting
Prof. Dr. Vinicius Farias Campos Graduação em Biotecnologia [email protected]