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Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
METODOS DE SEPARACIÓN Y TECNICAS DE ELECTROFORESIS CAPILAR
GUILLERMO SALAMANCA GROSSO
Universidad del Tolima Colombia
Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
QUIMICA ANALITICA E INSTRUMENTAL: Conjunto de procesos funcionales y aproximaciones operacionales que se integran funcionales y aproximaciones operacionales que se integran para resolver problemas con la ayuda de la información cualitativa y cuantitativa y haciendo uso de equipos e instrumentos.
Universidad del Tolima Colombia
Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
Mé d d ióMé d d ióMétodos de separaciónMétodos de separaciónSimpleSimple
CristalizaciónCristalizaciónCentrifugaciónCentrifugación
12
PrecipitaciónPrecipitaciónZonasZonasCentrifugaciónCentrifugación 2
3
4FiltraciónFiltraciónExtracciónExtracción
Líquido Líquido -- LíquidoLíquido
En fase sólidaEn fase sólida
45
FiltraciónFiltración
ClasificaciónClasificaciónLixiviaciones
SimpleSimple6
CromatografícosCromatografícosDestilaciónDestilación
FraccionadaFraccionada6
7ME Fase SólidaME Fase Sólida
Técnica analítica. Principio científico adaptado a uno o varios
ElectroforesisElectroforesis
ME.Fase SólidaME.Fase Sólida89
Universidad del Tolima Colombia
Técnica analítica. Principio científico adaptado a uno o variosinstrumentos para obtener información sobre diversos materiales.
Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
ELECTROFORESIS CAPILAR
Cortesia: Toni Pomar. Universidad de Virginia
Evolución y desarrollo de la electrónica
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Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
1 Ciencias Biomédicas Proteínas. Péptidos. ADNMarcadores genéticos. Drogas
Drogas de abuso. Forense
2 C. Farmacéuticas Estudio farmacodinamia y cinéticaBiotecnología. Estudio de quiralidad
3 Alimentos Colorantes. Aditivos. AminoácidosProteínas. Aminas biogénicas. Tóxicos
Vitaminas
P l t t P ti id Hid bElectroforesisModos de operación.
Bases de la separación
Ambiente4 Polutantes. Pesticidas. HidrocarburosMetales pesados
Técnica que ha venido creciendo con el desarrolo de la instrumentación
electrónica y métodos de detecciónpermite aplicaciones diversas
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Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
•En (CZE): La composición del Buffer es constante en lazona de separación.•El potencial aplicado genera separación diferencial en lamovilidad iónica
Termostatización
Detector movilidad iónica•Zonas resueltas bien definidas.•o parcialmente solapadas.
DA
ElectrodoElectrodo FP
Carrusel de Porta muestrasElectroforegramaElectroforegrama
ELECTROFORESIS: Técnica de separación basada en la MOVILIDADBuffer
Ánodo CátodoÁnodo Cátodo
ELECTROFORESIS: Técnica de separación basada en la MOVILIDADDIFERENCIAL de una mezcla de analitos (partículas cargadas o no) bajo elefecto de un CAMPO ELÉCTRICO. Proceso de separación debida a ladiferencias en la velocidad de migración de las especies.
Universidad del Tolima ColombiaTubo capilar < 0.5 m; 0.1 mm diTubo capilar < 0.5 m; 0.1 mm di
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TermostatizaciónTermostatización
DetectorDA
ElectrodoElectrodo FP
Carrusel de Porta muestrasCarrusel de Porta muestras
Buffer
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Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
Ánodo (+) Cátodo (-)
DetectorFuente de luz
280 nm
Detectores: UV:Conductividad
Ánodo (+) Cátodo (-)
DetectorFuente de luz
280 nm
Detectores: UV:Conductividad
Ánodo (+) Cátodo (-)Ánodo (+) Cátodo (-)
Buffer Buffer
Fotorreceptorηπµ
rqv
6==
E1 2
Buffer Buffer
Fotorreceptorηπµ
rqv
6==
E1 2
ComputadorSistema de
registro
ComputadorSistema de
registro
ELECTROFORESIS: Técnica de separación basada en la MOVILIDAD
g
10- 60 kV
g
10- 60 kV
DIFERENCIAL de una mezcla de analitos (partículas cargadas o no) bajo elefecto de un CAMPO ELÉCTRICO. Proceso de separación debida a ladiferencias en la velocidad de migración de las especies.
Universidad del Tolima ColombiaTubo capilar < 0.5 m; 0.1 mm di
Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
Columna capilar en síliceColumna capilar en sílice
••DiámetroDiámetro internointerno:: 22 aa 100100 µµmm••DiámetroDiámetro externoexterno:: 363363 µµmm••LongitudLongitud:: 100100 cmcmC b tC b t lii idlii id••CoberturaCobertura poliimidapoliimida
••PermeabilidadPermeabilidad luzluz UVUV••DetecciónDetección enen columnacolumna••AcondicionamientoAcondicionamiento previoprevio dede lala columnacolumnaAcondicionamientoAcondicionamiento previoprevio dede lala columnacolumna
2 a 100 2 a 100 µµmm 363 363 µµmm
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Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
Universidad del Tolima Colombia
Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
+ -+ + + CátodoÁnodo
Aniones -
+ - - -CátodoÁnodo
Medio de conducciónCationes +
Naturaleza de los iones
CargaTamaño
Carga
TamañoMigración alta
µ qv==
µ = movilidad electroforéticav = velocidad del ionE = campo eléctricoηπ
µr6
==E E = campo eléctrico
q = carga del iónr = radio η = viscosidad del medioMovilidad electroforética η = viscosidad del medio
depende:Carga eléctrica moléculapH medioFuerza ionica
µ: Se relaciona con la selectividad
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Fuerza ionica
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A i
+ -+ + + CátodoÁnodo
Aniones -
- - -
Medio de conducciónCationes +
•Movilidad electroforética: CapacidadPara el desplazamiento de una especie en unmedio conductor. Respuesta al campo
Movilidad electroforéticaµef
aplicado.
•Flujo electroosmótico: Movilidad del medio conductor. FEO
La velocidad de migración es unarelación directa entre el tamaño y lacarga de cada especie
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carga de cada especie.
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1 E. Capilar de Zona Buffer constante en a la zona de separación. El potencial aplicado genera migración diferencial de
2 C. Electrocinética micelar
g gespecies
3 E. Capilar en gel
Electroforesis capilar
Modos de operación
Isoelectroenfoque4
Modos de operación.Bases de la separación Isotacoforesis5
Electrocromatografía
Electroforesis quiral
6
7Universidad del Tolima Colombia
Electroforesis quiral7
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1 E. Capilar de Zona
Sistema de surfactantes
2 C. Electrocinética micelarDSS. Formacion de micelasAdición de ciclodextrinas
3 E. Capilar en gel
Electroforesis capilar
Modos de operación
Isoelectroenfoque4+ -
Modos de operación.Bases de la separación Isotacoforesis5
Piridoxinas. Riboflavina. A ascorbicoTiamina Complejo B
Electrocromatografía
Electroforesis quiral
6
7
Tiamina. Complejo B.
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Electroforesis quiral7
Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
1 E. Capilar de Zona
2 C. Electrocinética micelar
2 Buffers: Acido y BaseAnfolitos en la columna: Mezcla agregados
3 E. Capilar en gel
Moleculares: Acido Polietilen pentamina.Separación selectiva a pH´s
Electroforesis capilar
Modos de operación.Bases de la separación
Isoelectroenfoque
I t f i
4
5Bases de la separación Isotacoforesis
Electrocromatografía
5
6
Electroforesis quiral7
Universidad del Tolima Colombia
Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos
1 E. Capilar de Zona
2 C. Electrocinética micelar
3 E. Capilar en gel
Combinación de Buffers:Iones rápidos y lentos.
Mismo contra-Ion en cada casoPara el sistema de buffers.
Electroforesis capilar
Modos de operación.Bases de la separación
Isoelectroenfoque
I f i
4
5 Capilares con poliacrilamidas para citratos, oxalatos, piruvatos
Bases de la separación Isotacoforesis
Electrocromatografía
5
6
Electroforesis quiral7
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Métodos de inyección:
•Usa un sistema de generación de presión (Pistón).Mueve uno de los viales del electrolito.
1. Hidrodinámica.
No discriminativa
•Vacío.•Presión•Sifonación: Capilaridad
Efecto capilaridadkV
Inyección presión
Presión
Inyección presión
VacíoInyección presión
Vacío
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Métodos de inyección: 2. Electrocinética.
Discriminativa
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M ilid d l t óti Fl j l t óti FEOMovilidad electroosmótica. Flujo electroosmótico. FEO
- -+µFEO
a
+ ++
+-
- ++
+-
--
-Seno disolución
+ + ++
+-
- ++
+-
oble
Cap
aCapa móvil
+- - - - - - - - -+ + + +Capa fija
Pared capilar
Do
+ - CátodoÁnodoDirección flujo electoósmotico
Pared capilar
La velocidad de migración es unarelación directa entre el tamaño y
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yla carga de cada especie.
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FEO
Grupos SiOH ~ 5x1014 cm-2
FEO
10Campo eléctrico
FEO
FEO
Calentamiento
SiO-
FEO
FEOFEO
FEO ModificacionespH+ -
FEOpH Buffer
FEO
Modificaciones de la carga soluto
Método para ajustar FEO
FEO
FEO
µ=1/2ΣCiZi2Potencial Zeta
2.0 FEOSiOH2+
Universidad del Tolima ColombiaModificaciones especiales según sea el pH Uso de surfactantes
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Colorantes: Amplio uso en los alimentos y bebidas. Aditivo mejora de aspecto. Xantofilas(E-161). Origen Natural o artificiales. Internacionalmente aparecen codificados E-100 a E-180. Naturales origen mineral, vegetal o animal (como la Cochinilla o E-120).
E102 T t i E124Tartracina
(colorante azoico)E124
Rojo cochinilla A
E131Azul Patentado V
E110 Amarillo anaranjado S
E123 E129Rojo Allura AC
E123 Amaranto
Cancerigeno Embriotoxico
Universidad del Tolima ColombiaInocuidad y toxicidad. Aspectos legales. En los países nórdicos están prohibidos casi todos los colorantes sintéticos y en cambio otros paises los autorizan.
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E102 Tartracina
(colorante azoico)E124
Rojo cochinilla A
E131
En ECZ: La composición del tampón es constante en a la
E110 A ill j d S
E131Azul Patentado V
pzona de separación.
Amarillo anaranjado S
selección de BufferCampo aplicado
Separaciónes diferenciablesE129
Rojo Allura AC E123
AmarantoCancerigeno Embriotoxico
Separaciónes diferenciables
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Separación
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tm = tiempo de migraciónml V L µef
p g= recorrido del soluto= Potencial aplicado= Longitud del capilar= Movilidad del soluto
µFEO = Velocidad flujo electroosmótica
E102 Tartracina
(colorante azoico)
E131Azul Patentado V
Incrementos del flujo electroosmotico provoca reducción en el tiempo de análisis, pero se pierde resolución
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Protocolo para Acidos Orgánicos en Vinos
Muestra de vino Bebidas y aperitivos
Minicolumna C18 Centrifuga a 10K rpm
Volumen de exclusión Diluye 1/50 idem vinos
Centrifuga a 10K rpm 7 – 10 min. Ac. cadena corta
Diluye 1/1000 en bufferPftalato 50 mM *Para Ac. de cadena larga se usa
Buffer Benzoato 50 mM
7 – 10 minutosAnalisis
Buffer Benzoato 50 mM
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Acido acetico Acido Láctico
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Electroferogramas de Acidos Orgánicos2
11
13
3
3
1 23
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CarotenoNo se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.
CarotenoCarotenoProcesos de la visión. Metabolismo del calcioProtector de las vitaminas A y C (Antioxidante)Factor de coagulación
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Procesos de la visión. Metabolismo del calcioProcesos de la visión. Metabolismo del calcioProtector de las vitaminas A y C (Antioxidante)Protector de las vitaminas A y C (Antioxidante)Factor de coagulaciónFactor de coagulación
LiposolublesNo se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.
LiposolublesLiposolublesCalciferolTocoferolFiloquinionaK (Farnoquinona Menaiona)
CarotenoCarotenoCalciferolCalciferolTocoferolTocoferolFiloquinionaFiloquiniona
gFactor de coagulaciónFactor de coagulación
VitaminasNo se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.
VitaminasVitaminas
K (Farnoquinona, Menaiona)K K (Farnoquinona, Menaiona)(Farnoquinona, Menaiona)
B1TiaminaB2 RiboflavinaB3 Niacina
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BB11 TiaminaTiaminaBB22 RiboflavinaRiboflavinaBB NiacinaNiacina
HidrosolublesNo se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.
HidrosolublesHidrosolubles
B3 NiacinaB6 PiridoxinaB7 Ácido fólicoB12 Cianocobalamina
BB33 NiacinaNiacinaBB66 PiridoxinaPiridoxinaBB77 Ácido fólicoÁcido fólicoBB1212 CianocobalaminaCianocobalamina
Vitamina CB1212 CianocobalaminaCianocobalaminaVitamina CVitamina CComplejo B: Metabolismo carbohidratos,
grasas y proteínas. Piel visión, Glóbulos rojos, Crecimiento
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Complejo B: Metabolismo carbohidratos, Complejo B: Metabolismo carbohidratos, grasas y proteínas. Piel visión, Glóbulos grasas y proteínas. Piel visión, Glóbulos rojos, Crecimientorojos, Crecimiento
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16
14
12
10n) 10
8
6
t m(m
i
7 7.5 8.5 9.58 9 pH
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Control de calidad en los edulcorantes adicionados enalimentos. Autenticidad de las mieles y mieles de mielada.Regulaciones y normativas. Japón controla la presencia de
l jsacarosa en los jugos.
Condiciones analíticasColumna:Capilar sílice fundida80.5 cm72 cm efectivoD.I. 50µmPotencial25 kV
Patró n carbohidratos
Jugo de naranja
Temperatura15 ºCDetectorArreglo deDiodosMuestra: Dilución. Filtración.
Yogurt
280 nmInyección50 mbar x 6 sBuffer
SeparaciónBuffer Aniónico
Respuesta lineal: 50 a 1000µg/mlCV: < 0.16%. HPLC Vs EC
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Hesperidina 1
Naringina
2
Hesperedina 3
4Naringenina
Detección electroquímica vs ESC +0.95 V.Amperometria. Columna capilar 75 cm
25 id. X360 od. µm Sílice fundidaó ff ó f ó
Rutina
Patrón. Buffer borato. Jugo extracción y filtraciónPiel extracción etOH Ultrasonido
Filtración membrana 0.2 µ m56
Universidad del Tolima ColombiaAc. Ascorbico
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Hesperidina 13
4
Naringina 25
Hesperedina
23
4
12 6
Naringenina
Detección electroquímica vs ESC +0.95 V.Amperometria. Columna capilar 75 cm
25 id X360 od m Sílice fundida25 id. X360 od. µm Sílice fundidaPatrón. Buffer borato. Jugo extracción y filtración
Piel extracción etOH UltrasonidoFiltración membrana 0.2 µ m56
Universidad del Tolima ColombiaRutina
Ac. Ascorbico
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Hesperidina 12Jugo
Piel
Naringina 2
1
Hesperedina
1
Naringenina
3
466
RutinaAc. Ascorbico
5
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AFLATOXINAS B (B1,B2 Y B2a), que emitenfluorescencia Compuestos altamente ionizablesy por ello muy reactivos, pudiendo modificarDNA RNA y proteínas celularesDNA, RNA y proteínas celulares.
Complejo proceso de extracción. Características de la matriz. Test Elisa. HPLC.
Fluidos supercriticos.
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•Ocratoxina A (OTA): Micotoxina generada porhongos género Aspergillus y Penicillium. Estable yresistente a los tratamientos térmicos.C l li t A M í M í C fé•Cereales y alimentos: Arroz. Maíz. Maní. Café.
Polen.•Efectos: Nefrotoxicidad. Efectos: Teratogénico, Carcinogénico, Genotóxico e imunotóxico.
EC: Capacidad de resolución y menor uso de disolventes orgánicos.Límites de detección comparables con HPLC
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Factores que influencian la eficiencia de CEFactores que influencian la eficiencia de CE
Difusión : De mayor concentración a menor concentración.Diferencias causadas por fluctuaciones térmicas.
Adsorción : Mayormente ocurre con macromoléculas en las paredes delcapilar.
Calentamiento Joule : Parte del potencial E. se transforma en calor.
Dispersión electroforética : Asimetrias de picos por distorciones de dosamortiguadores al mezclarse (cambios de conductividad yamortiguadores al mezclarse (cambios de conductividad y
campo eléctrico).
Inyección : Largo de la inyección.
Detección : Ancho de la zona de detección (menor resolución).
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CONCLUSIONES
•Separaciones según mecanismos definidos en un ámbito capilar.Ofrece facilidades y velocidad respecto de (HPLC).
Eli i l bl d l l t d l HPLC l t i id d d l•Elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de losmismos y su costo.
•Emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy bajap g y y jconcentración iónica.
•Incorpora los principios de la automatización a través de un hardwarecreado especialmente con un software altamente optimizadocreado especialmente con un software altamente optimizado.
•Las separaciones se obtienen en pocos minutos, on line con lacorrida, obteniéndose simultáneamente resultados cuantitativos.,
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