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8/17/2019 Métodos en Biología Celular BLOT
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Métodos en Biología Celular
Métodos de transferencia de proteínas a filtros
Métodos de transferencia a filtros : 'dot blot', 'slot blot',
'western blot'Introducción : aplicación directa vs. transferencia
electroforética.Electroblottinginción de proteínas en el
filtroIntroduccióninción de proteína totalIn!unotinción
IntroducciónBlo"ueoEleccción del siste!a de anticuerpos
#ecundario $ proteín % $ proteína iste!as de reveladoEni!as
( )ero*idasa der+bano ( osfatasa alcalina
-adio"uí!icosro coloidal
Métodos de transferencia a filtros
Introducción : aplicación directa vs. transferencia
electroforética
/a transferencia de proteínas o 'blotting' supone la
in!oviliaciónde las proteínas sobre !e!branas sintéticas, seguido
de ladetección e!pleando siste!as especial!ente dise0ados para
latinción de 'blots'. El !étodo !+s potente es el
deno!inado'1estern blot' en el "ue las proteínas son separadas en
pri!erlugar !ediante electroforesis en geles de poliacrila!ida
2posterior!ente se transfieren !ediante la aplicación de unca!po
eléctrico perpendicular al gel a una !e!brana. Elprocedi!iento es
an+logo al desarrollado por el )rof. E. #out3ern4'#out3ern
blotting'5 2 por ello se le deno!inó '1estern'. 6a2 sine!bargo
otros !étodos de transferir o aplicar proteínas sobreuna !e!brana.
El !+s sencillo es aplicarlas directa!ente enfor!a de una pe"ue0a
gota de una solución concentrada sobrela !e!brana. /a absorción de
la gota provoca la ad3esión de laproteína a la !e!brana, "uedando
en for!a de una !anc3a o'dot' 4es el caso del 'dot blot'. E*isten
dispositivos "ue facilitan la
aplicación de las proteínas directa!ente a la !e!brana,aplicando
una succión "ue facilita la penetración de la solución, 2
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#M%C3%A9todos%20de%20transferencia%20a%20filtros%23M%C3%A9todos%20de%20transferencia%20a%20filtroshttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Introducci%C3%B3n%23Introducci%C3%B3nhttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Electroblotting%23Electroblottinghttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Tinci%C3%B3n%20de%20prote%C3%ADnas%20en%20el%20filtro%23Tinci%C3%B3n%20de%20prote%C3%ADnas%20en%20el%20filtrohttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Introducci%C3%B3n-especifica%23Introducci%C3%B3n-especificahttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Prote%C3%ADna%20total%23Prote%C3%ADna%20totalhttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Detecci%C3%B3n%20espec%C3%ADfica%20de%20prote%C3%ADnas%20en%20filtros%23Detecci%C3%B3n%20espec%C3%ADfica%20de%20prote%C3%ADnas%20en%20filtroshttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Introducci%C3%B3n-especifica%23Introducci%C3%B3n-especificahttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Bloqueo%20de%20la%20membrana%23Bloqueo%20de%20la%20membranahttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Elecci%C3%B3n%20del%20sistema%20de%20anticuerpos.%23Elecci%C3%B3n%20del%20sistema%20de%20anticuerpos.http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Secundarios%20/%20prote%C3%ADna%20A/%20prote%C3%ADna%20G%23Secundarios%20/%20prote%C3%ADna%20A/%20prote%C3%ADna%20Ghttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Elecci%C3%B3n%20del%20sistema%20de%20revelado%23Elecci%C3%B3n%20del%20sistema%20de%20reveladohttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Enzimas%23Enzimashttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Peroxidasa%20de%20r%C3%A1bano%20(HRP)%23Peroxidasa%20de%20r%C3%A1bano%20(HRP)http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Peroxidasa%20de%20r%C3%A1bano%20(HRP)%23Peroxidasa%20de%20r%C3%A1bano%20(HRP)http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Fosfatasa%20alcalina%23Fosfatasa%20alcalinahttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Sistemas%20radioqu%C3%ADmicos%20de%20revelado%23Sistemas%20radioqu%C3%ADmicos%20de%20reveladohttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#oro%20coloidal%23oro%20coloidalhttp://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/slotblot2.jpghttp://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/dotslotblotp.jpghttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#M%C3%A9todos%20de%20transferencia%20a%20filtros%23M%C3%A9todos%20de%20transferencia%20a%20filtroshttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Introducci%C3%B3n%23Introducci%C3%B3nhttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Electroblotting%23Electroblottinghttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Tinci%C3%B3n%20de%20prote%C3%ADnas%20en%20el%20filtro%23Tinci%C3%B3n%20de%20prote%C3%ADnas%20en%20el%20filtrohttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Introducci%C3%B3n-especifica%23Introducci%C3%B3n-especificahttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Prote%C3%ADna%20total%23Prote%C3%ADna%20totalhttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Detecci%C3%B3n%20espec%C3%ADfica%20de%20prote%C3%ADnas%20en%20filtros%23Detecci%C3%B3n%20espec%C3%ADfica%20de%20prote%C3%ADnas%20en%20filtroshttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Introducci%C3%B3n-especifica%23Introducci%C3%B3n-especificahttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Bloqueo%20de%20la%20membrana%23Bloqueo%20de%20la%20membranahttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Elecci%C3%B3n%20del%20sistema%20de%20anticuerpos.%23Elecci%C3%B3n%20del%20sistema%20de%20anticuerpos.http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Secundarios%20/%20prote%C3%ADna%20A/%20prote%C3%ADna%20G%23Secundarios%20/%20prote%C3%ADna%20A/%20prote%C3%ADna%20Ghttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Elecci%C3%B3n%20del%20sistema%20de%20revelado%23Elecci%C3%B3n%20del%20sistema%20de%20reveladohttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Enzimas%23Enzimashttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Peroxidasa%20de%20r%C3%A1bano%20(HRP)%23Peroxidasa%20de%20r%C3%A1bano%20(HRP)http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Peroxidasa%20de%20r%C3%A1bano%20(HRP)%23Peroxidasa%20de%20r%C3%A1bano%20(HRP)http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Fosfatasa%20alcalina%23Fosfatasa%20alcalinahttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#Sistemas%20radioqu%C3%ADmicos%20de%20revelado%23Sistemas%20radioqu%C3%ADmicos%20de%20reveladohttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#oro%20coloidal%23oro%20coloidal
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reciben los no!bres de 'dot blot' o 'slot blot' en función de
"ue laproteína "uede aplicada en for!a de una gota circular o de
unalínea. En la i!agen puedes ver dos de estos dispositivos.
raba7ar con las proteínas fi7adas sobre una !e!brana tiene
venta7as sobre el
e!plearlas dentro del propio gel :
• son !+s r+pidas de te0ir 2 deste0ir. • no se produce
tinción de los a!folitos en los geles de isoelectroenfo"ue. •
se detectan cantidades !enores de proteínas pues se concentran en
la
superficie 2 no se dilu2en en todo el espesor del gel. • el
'blot' es un registo conveniente 2 có!odo de !anipular del
gel. • las !e!branas son !uc3o !+s f+ciles de !anipular "ue el
propio gel
odo procedi!iento de 'blotting' consta de 8 etapas :
• In!obiliación de proteínas sobre la !e!brana 2a sea
!ediantetransferencia 4electroforética, aspiración, presión, ...5 o
!edianteaplicación directa.
• #aturación de todos los lugares de unión de proteínas de la
!e!branano ocupados para evitar la unión no específica de
anticuerpos, "ue sonproteínas.
• Incubación del 'blot' con anticuerpo pri!arios contra la$s
proteína$s deinterés.
• Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos
"ue act9an
de ligando del anticuerpo pri!ario unidos a eni!as u otros
!arcadores.
• /as bandas de proteínas !arcadas con eni!as se 3acen visibles
porincubación con los sustratos apropiados para for!ar
productoscoloreados insolubles en el lugar donde se encuentran las
bandas deproteína.
6a2 tres !étodos para transferir proteínas a las !e!branas :
. ransferencia capilar ;. ransferencia por difusión
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En este !étodo, descrito por owbin, las proteínas son
transferidasdesde el gel a la !e!brana electroforética!ente. /a
venta7a deeste proceso es su corta duración 4de
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El grosor del gel es un factor "ue influ2e notable!ente en la
transferencia,siendo !u2 ineficiente a partir de geles de ; !! de
espesor, 2 tanto !+seficiente cuanto !+s fino es el gel, con un
lí!ite debido a los proble!as de!anipulación en torno a los =.
!!.
/a !e!brana "ue se e!plea !+s frecuente!ente es la
nitrocelulosa, aun"uecuando se re"uieren soportes !+s robustos, por
e7e!plo cuando la !e!brana3a de ser reutiliada diversas veces se
recurre al G2lon. sin e!bargo las!e!branas de G2lon se blo"uean con
!+s difciultad "ue las de nitrocelulosa 2suelen presentar !a2or
'bacJground'. /as !e!branas de )A? tienen grancapacidad de unión a
proteínas 2 gran resistencia !ec+nica pero se3u!edecen con !+s
dificultad.
odas las !e!branas son 3idrofóbicas 2 re"uieren un trata!iento
previo con!etanol antes de su!ergirlas en soluciones acuosas.
Es i!portante incorporar en el gel a transferir un control de la
transferencia "ue3abitual!ente es el propio carril donde se 3an
cargado los !arcadores de peso!olecular "ue al transferirlos se
ti0en sobre el filtro para ver si la transferenciade toda la ga!a
de pesos !oleculares 3a sido correcta.
E*isten algunas variantes a la transferencia electroforética
descritaprevia!ente. El siste!a !+s e*tendido es el '#e!i(?r2
blotting' enel "ue los geles son so!etidos a una intensidad de
corrienteelevada entre dos electrodos planos entre los "ue se
coloca unapila for!ada por papel, el gel, la !e!brana 2 !+s
papel,e!papados en ta!pón de transferencia. El 9nico lí"uido "ue
3a2es el "ue e!papan los papeles. /a venta7a de este siste!a es
surapide, consiguiendo transferencias en pocos !inutos.
( arriba (
Tinción de proteínas en el filtro
6abitual!ente se e!plean técnicas de tinción de proteínas sobre
el filtro co!ocontrol de la transferencia. E*isten diferentes
!étodos para te0ir todas lasproteínas presentes en el filtro, pero
los "ue !+s interés despiertan son los
!étodos de tinción de proteínas específicas a partir de !eclas
co!ple7asseparadas en geles 2 transferidos a filtros, son los
!étodos de tinciónespecíficos, usual!ente basados en !étodos
in!uno"uí!icos.
)roteína total
Colorantes
/os colorantes "ue per!iten te0ir las proteínas en los geles de
poliacrila!idano son utiliables en los filtros pues se unen
inespecífica!ente a éstos. )arate0ir las proteínas en los filtros
se e!plean : )onceau #, intsa c3ina o Gegro
%!ido.
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#arriba%23arribahttp://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/transfer2.jpghttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#arriba%23arriba
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)onceau # se e!plea en for!a de solución acuosa. /a tinción es
r+pida perono es per!anente 2 puede desaparecer en el procesa!iento
posterior. Co!o latinción desaparece es co!patible con casi todos
los procedi!ientos dedetección con anticuerpos.
El !étodo de tinción de filtros con tinta c3ina es reproducible,
sensible 2per!anente, 2 no interfiere con los procedi!ientos de
in!unodetección, peropuede tapar la tinción colori!étrica del
proceso in!uno"uí!ico. /a tinción sebasa en la ad3erencia
preferente de las partículas coloidales de carbón de latinta sobre
las proteínas in!oviliadas. /adestinción se 3ace en )B#.
El negro a!ido es !enos sensible "ue la tinta c3ina. /as bandas
aparecennegras sobre un fondo aul claro. ?espués de la tinción se
desti0e con unasolución de !etanol$+cido acético. Este !étodo de
tinción es inco!patible conla in!unodetección posterior.
( arriba (
inción !ediante biotina(estreptavidina
Este !étodo de tinción se basa en la afinidad de la
estreptavidinapor la biotina. /os grupos a!ino pri!arios 2
secundarios de lasproteínas unidas a la nitrocelulosa se pueden
biotinilar e!pleandoun derivado G(3idro*ido succini!ida de la
biotina "ue contiene unbrao espaciador 3idrofóbico. n lavado
posterior eli!ina el e*cesode biotina 2 después se blo"uea la
!e!brana con una solución delec3e en polvo. /as proteínas
biotiniladas pueden ser detectadase!pleando un co!ple7o prefor!ado
de estreptavidina(eni!a 2 elsiste!a de detección de la actividad
eni!+tica.
( arriba (
inción !ediante oro coloidal
E*isten productos co!erciales co!o %uro?2e(- de %!ers3a! "ue
act9a co!ocolorante para proteínas sobre filtros. #e trata de una
solución coloidalestabiliada de oro a p6
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na proteína específica puede ser identificada 2 visualiada enun
'1estern blot' e!pleando técnicas de in!unodetección. Estastécnicas
e!plean la capacidad de reconoci!iento de losanticuerpos a sus
antígenos. En '1estern blot' se e!pleaco!un!ente el siste!a de
in!unodetección indirecta "ue se
representa en la figura. En este !étodo se e!plea un
anticuerpopri!ario para localiar la proteína de interés. n
segundoanticuerpo, !arcado con un eni!a, 2 contra la especie en
la"ue se 3a producido el pri!ero, se e!plea para localiar dondese
for!aron los co!ple7os antígeno(anticuerpo. Este
anticuerposecundario se puede !arcar de for!as !u2 diversas con el
finde producir una se0al detectable 4por e7e!plo una se0al sobreuna
película radiogr+fica o una !anc3a de color en el filtro5.
Enocasiones se e!plean en lugar del anticuerpo secundarioproteína %
o proteína &.
( arriba (
Blo"ueo de la !e!brana
na etapa co!9n a todos los procedi!ientos de in!unodetección es
elblo"ueo, para prevenir la unión no específica del siste!a de
detección a la!e!brana, con el riesgo asociado de tener un elevado
'bacJground' o falsospositivos.
#e 3an descrito nu!erosas soluciones blo"ueantes, 2 todas ellas
sonefectivas. El factor esencial a tener en cuenta es elgegir un
site!a de blo"ueoco!patible con el siste!a de detección e!pleado.
)or e7e!plo, las solucionesde blo"ueo "ue contienen lec3e desnatada
contienen una gran cantidad decarbo3idratos co!ple7os, 2 por ello
deben descartarse cuando se van ae!plear anticuerpos "ue reconocen
deter!inantes en carbo3idratos, o pore7e!plo se 3a de evitar el uso
de suero co!pleto si en la detección se e!pleaproteína % o proteína
&.
/as dos soluciones de blo"ueo "ue son co!patibles con casi
cual"uier siste!ade detección son las soluciones de lec3e desnatada
2 las soluciones dealb9!ina sérica bovina 4B#%5. a!bién se
reco!ienda el blo"ueo en ween(;=
si 3a2 de!asiado 'bacJground'. #in e!bargo es conveniente usar
con cuidadolos detergentes no iónicos co!o ween(;= pues pueden
solubiliar lasproteínas transferidas al filtro.
En la tabla siguiente se recogen algunas de las soluciones de
blo"ueo !+sco!un!ente e!pleadas :
Tabla : !oluciones de blo"ueo más comunes en #$estern
blotting#
%genteblo"ueante
Características
/ec3e en polvo8F de lec3e desnatada en )B# $B#. Mu2 econó!ico.
Conpoco 'bacJground'. #e deteriora con rapide. Es posible "uetape
algunos antígenos.
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#arriba%23arribahttp://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica/diapositiva8.jpghttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm#arriba%23arriba
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/ec3e $ ween(;=
Econó!ico. 8F de lec3e desnatada en )B#$B# ( =Fween(;=. Con poco
'bacJground'. #e deteriora con rapide.Es posible "ue tape algunos
antígenos.
ween(;==.F ween(;=, =.=;F aida sódica en )B#$B#.Econó!ico.
)er!ite la tinción después de la
in!unodetección. )uede "uedar un 'bacJground' residual.B#%
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• eni!as, "ue catalian una reacción en la "ue se for!a un
precipitadocoloreado, o en la "ue se e!ite lu.
• radio"uí!icos, "ue e!iten radiaciones ioniantes • oro
coloidal, "ue acu!ulado local!ente produce un color ro7io, 2
"ue
puede actuar co!o cataliador para la deposición de plata, con lo
"ue se
incre!enta la se0al.
( arriba (
Eni!as
/os dos eni!as !+s e!pleados para !arcar proteína % o
& o anticuerpos sonla pero*idasa de r+bano 2 la fosfatasa
alcalina.
)ero*idasa de r+bano 46-)5
/a pero*idasa de r+bano 46-)5 se e!plea con gran frecuencia. #e
dispone desustratos "ue for!an un precipitado coloreado así co!o de
sustratos"ui!iolu!iniscentes.
• sustratos colorimétricos. #e basan en la for!ación de un
productocoloreado insoluble "ue precipita sobre la !e!brana en el
lugar deacción del eni!a. #e 3an descrito tres sustratos para la
6-).
&' diaminoben(idina )%*+.
En presencia de peró*ido de o*ígeno ls poli!eriación o*idativa2
el ciclado de la ?%B por acción de la 6-) produce la apariciónde un
precipitado !arron. #e puede intensificar la reaccióna0adiendo
iones de Cobalto o de Gi"uel, "ue provocan unca!bio de color del
precipitado de !arrón a gris(negro. /areacción es !u2 r+pida 2 es
f+cil "ue se desarrolle en e*cesoprovocando un elevado 'bacJground'
en el filtro. ?%B es una!olécula de acción carcinogénica 2 es
necesario to!arprecauciones para su !anipulación.&'',',#
tetrametilben(idina )TM*+
Es un sustrato alternativo para la ?%B, !+s sensible antes de
laa!plificación con !etales. #e for!a un precipitado aul.
#ine!bargo su uso es reducido pues el precipitado es se!isolubleen
agua 2 desaparece con facilidad en algunas
condiciones. %ctual!ente se dispone de nuevas for!ulaciones
del sustrato"ue producen productos !+s estables.
-cloro/naftol
En presencia de 6-) 2 de peró*ido de 3idrógeno el
cloronaftolproduce un precipitado aul(negro. /a reacción es
f+cil!ente
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/proteinaag.htmhttp://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/reacciondab.jpghttp://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/proteinaag.htm
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controlable, aun"ue es relativa!ente insensible cuando seco!para
con ?%B o MB.
• sustratos "uimioluminiscentes. /a reacción"ui!iolu!iniscente
ocurre cuando la energía de una
reacción "uí!ica se e!ite en for!a de lu. #e e!plea lapero*idasa
de r+bano 46-)5 para cataliar la o*idación dellu!inol en presencia
de peró*ido de 3idrógeno.In!ediata!ente después de la o*idación el
lu!inol seencuentra en un estado e*citado del "ue pasa a la
situaciónbasal, reducida, !+s estable, e!itiendo lu. /a lu
e!itidatiene una longitud de onda de ;@ n!, con un !+*i!o dee!isión
entre 8 2 ;= !inutos despues de iniciada lareacción 2 una e!isión
"ue se puede prolongar de ; a <3oras. #i esta reacción se
produce sobre una !e!brana encontacto con una película de
autorradiografía ésta "uedai!presionada. Este siste!a tiene la
venta7a de "ue per!iteeli!inar el siste!a de anticuerpos
secundarios 4'striping'5 2volver a analiar la !e!brana con otros
anticuerpos4'reprobing'5.
( arriba (
osfatasa alcalina
/a fosfatasa alcalina tiene una acción si!ilar a la pero*idasa
de r+bano. #e 3an
descrito asi!is!o sustratos colori!étricos 2 sustratos
"ui!iolu!iniscentes./os sustratos colori!étricos de la fosfatasa
alcalina son :
• bro!ocloroindolil fosfato $ nitroblue tetraoliu! 4BCI)$GB5.
or!a unprecipitado a9l(p9rpura( Es el resultado de la
desfosforilación 2posterior o*idación de BCI) a indigo, acoplada a
la reacción de GB adifor!aon. /a reacción es progresiva lo "ue
facilita el control de la!is!a a7ustando el tie!po de
desarrollo.
• Gaftol(%#(MK fosfato $ ast red 4G%M)$-5 2 naftol(%#(BI(fosfato
$ ast-ed - 4G%B)$-5 /as dos pare7as de productos confor!an dos
sustratos "ue se transfor!an en un precipitado insoluble de
color ro7o.Este siste!a es !enos sensible "ue el anterior 4BCI)$GB5
pero el color obtenido tiene un !e7or contraste con la
!e!brana.
• %) !istl2 purple $ %) li"uid purple. #on productos
co!erciales4%!ersa3!, co!posición e*acta no conocida5 con
propiedades desustrato específicas para la fosfatasa alcalina. #e
for!a un precipitadointensa!ente p9rpura "ue no desaparece con el
tie!po.
El sustrato "ui!iolu!iniscente de la fosfatasa alcalina es
el
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2 !et32!et3a(o*2benoato "ue pasa de un estado
inestable,e*citado, a otro estable, rela7ado, e!itiendo lu.
En la figura ad7unta se !uestran filtros de 'western blot' "ue
3an sidorevelados con algunos de los sustratos colori!étricos antes
citadospara la pero*idasa de r+bano 2 la fosfatasa alcalina.
( arriba (
#iste!as radio"uí!icos de revelado
)ara poder detectar las proteínas !ediante el uso de isótopos
radiactivos esnecesario "ue éstas incorporen este tipo de isótopos.
E*isten diferentesestrategias para conseguirlo. /a elección de una
u otra depender+ del ob7etivoperseguido. Aea!os algunos e7e!plos
:
• si el ob7etivo es detectar las proteínas sintetiadas en un
período detie!po en un siste!a celular, el !étodo de elección es el
deno!inado!arca7e !etabólico, "ue consiste en la adición al !edio
de cultivo de lascélulas de a!ino+cidos !arcados 4en general se
e!plean losa!ino+cidos aufrados cisteína 2 !etionina con el isótopo
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inción !ediante oro coloidal
Es posible detectar las proteínas fi7adas sobre un filtro
e!pleandoanticuerpos "ue directa!ente o indirecta!ente
4anticuerpossecundarios o proteína % o &5 estén unidos a oro
coloidal.
?ebido a las características del oro coloidal la
interacciónantígeno anticuerpo se observa co!o una se0al rosacea
deintensidad proporcional a la cantidad de antígeno presente.
/ase0al es ténue 2 tiende a desaparecer. )or ello se 3an
dise0adosiste!as de intesificación de se0al "ue en general se basan
enla precipitación de plata !et+lica en torno al oro coloidal.
/areacción de a!plificación con plata se basa en la reducción
deiones de plata a plata !et+lica por acción del oro, "ue act9aco!o
cataliador. #e for!a un precipitado !arrón oscuro,estable, "ue
incre!enta la sensibilidad = veces.
/a tinción "ue se obtiene es per!anente 2 casi sin
'bacJground'.El proceso de intensificación de la se0al del oro con
plata esprogresivo 2 puede ser !onitoriado 3asta obtener la
se0aldeseada.
En las i!+genes se !uestra, en la pri!era, unaco!paración entre
un filtro de 'western blot'revelado con oro coloidal o
a!plificado
posterior!ente con plata. El au!ento desensibilidad es
i!portante. En la segunda se!uestra el efecto del ta!a0o de la
partícula de orocoloidal sobre la sensibilidad de la detección.
( arriba (
Material docente dise0ado 2 elaborado por Manuel -eina. Llti!a
actualiación : . Co!entarios : !reinaub.edu
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