MÉTODOS HISTOLÓGICOS

Los diferentes métodos histológicos permiten examinar células vivas o muertas, así como componentes celulares, los histólogos utilizan estos métodos para resolver problemas histológicos (Banks, 1996):

Los cultivos celulares permiten la observación directa de células vivientes. Se realizan de manera rutinaria gracias a los antibióticos. Los cultivos celulares también permiten efectuar observación continua y manipulación. Esto facilita el estudio de diferenciación, transformaciones, citogenética, metabolismo, interacciones, relaciones huésped-parásito y otros procesos biológicos celulares. Los cultivos celulares son indispensables en el diagnóstico virológico, al igual que para el desarrollo y producción de vacunas.

El uso de cámaras transparentes de observación, así como la exteriorización y transiluminación de órganos y tejidos, complementa la observación directa. Aunque las técnicas de exteriorización limitan el tiempo de observación, se ha logrado profundizar con respecto a microcirculación y respuestas de órganos y tejidos a quimioterapéuticos. Las cámaras transparentes de observación extienden el periodo de ésta. Con dichas técnicas pueden estudiarse neoformación vascular, diferenciación y movimiento celular, al igual que otros procesos vitales. La cámara anterior del ojo es una cámara de observación natural que se ha utilizado para este tipo de enfoque.

La fijación selectiva de colorantes vitales y supravitales ha aportado conocimientos de la función y estructura celulares, así como respecto de los materiales de la matriz extracelular. Estos colorantes tienen baja toxicidad; pueden inyectarse en organismos vivos (colorante vital) o usarse en células vivas tomadas del organismo (colorante supravital).

Examinar células y tejidos con el microscopio no es fácil, por que son transparentes y gruesos. El índice de refracción de los componentes celulares es similar para todos, lo que dificulta su identificación y diferenciación fáciles. Los artefactos superpuestos y la absorción excesiva de luz limitan la utilidad y confiabilidad de la información que se obtiene a partir de materiales vivos no procesados. Los problemas señalados se reducen cuando se obtiene cortes delgados que se tiñen y examinan. Esto requiere manejo y procesado excesivo de los tejidos, pero constituye el tipo de enfoque habitual de los estudios histológicos. Con objeto de reducir las alteraciones estructurales, por lo común células y tejidos para examen microscópico, se “matan” incluyéndolos en fijadores. En consecuencia el proceso termina incluyendo los tejidos en algún material para simplificar la obtención de cortes finos.

TÉCNICA DE INCLUSIÓN EN PARAFINA

La técnica de inclusión en parafina para preparar muestras es sencilla y confiable. Aunque modifica células y tejidos, las muestras procesadas brindan confianza y precisión, y permite inferir datos respecto de las situaciones in vivo. la técnica de inclusión en parafina constituye el método de más uso para la preparación de

especímenes para cursos de histología, diagnóstico histopatológico e investigación morfológica con microscopio de luz (Banks, 1996).

Obtención

Obtener muestras es un paso fundamental. La obtención de muestras implica tener conocimientos de anatomía macroscópica. Una vez que se identifica la muestra deseada, debe obtenerse de modo atraumático. La mayoría de los tejidos vivos son entidades frágiles cuya morfología puede cambiar si se manipulan en exceso y mediante técnicas inadecuadas de obtención. Estar consciente de los tejidos es tan importante para el histólogo como para el cirujano. Un escalpelo o tijeras romos y sucios, así como la presión o tracción excesivas durante el muestreo, alteran los componentes celulares.

Muchas células y tejidos degeneran cuando se separan de su ambiente ideal. Los tejidos deben extraerse con rapidez y destreza; sobre todo han de colocarse de inmediato en un buen fijador para inactivar las enzimas autolíticas.

Fijación

La fijación química se usa en especímenes histológicos: con el fin principal de detener la autolisis postmortem. Los fijadores inactivan, por desnaturalización de proteínas, las enzimas autolíticas que causan los cambios postmortem. Los fijadores que se utilizan con más frecuencia son formaldehído, glutaraldehído, paraformaldehído, alcohol etílico, ácido acético, ácido pícrico, dicromato de potasio, cloruro de mercurio, ácido crómico y ácido ósmico. Cada uno de ellos tiene propiedades específicas que a su vez les confiere ventajas y desventajas.

Algunos agentes químicos son fijadores coagulantes. Inducen cambios celulares semejantes a los que se producen cuando se aplica calor aun huevo. La conformación molecular se altera con este tipo de fijadores (Metano y Etanol). Estos fijadores originan cambios estructurales profundos.

Otros fijadores se describen como fijadores aditivos, en los que la fijación ocurre por reacción química con los componentes bioquímicos de las células. No inducen cambios morfológicos tan marcados como los característicos de los fijadores coagulantes. Los aldehídos (Formaldehído, Paraformaldehído y Glutaraldehído) son fijadores aditivos útiles para estudios histológicos.

El fijador más común es la solución al 10% de formalina neutralizada con soluciones amortiguadoras. Consiste en 10 volúmenes de formalina comercial (Formaldehído en agua al 40%) y 90 volúmenes de agua amortiguada con fosfato.

La acción de casi todos los fijadores es múltiple:

1. Previene la autólisis por postmortem por inactivación de enzimas hidrolíticas.2. Facilitan la obtención de cortes mediante endurecimiento de los tejidos.3. Intensifican la tinción al actuar como mordientes. 4. Reducen el arrastre de agua de muchos de los componentes durante el

proceso ulterior.5. Estabilizan los componentes para que se acerquen a su condición in vivo.

6. Protegen al histólogo mediante sus propiedades antisépticas.

La inmersión de la muestra en fijador debe realizarse tan pronto como sea posible, una vez que se ha obtenido del organismo. A partir del recortado del cubo de tejido en el fijador, debe obtenerse una muestra de pocos milímetros de espesor. De esta manera se permite la penetración (y fijación) de la totalidad de la muestra. El índice ideal es de 30:1 de volumen de fijador por volumen de tejido.

El tiempo real requerido para la fijación completa varía según las propiedades de difusión y la concentración del fijador, y de acuerdo con la densidad del tejido. Por lo general, bastan 24 horas para la fijación con formaldehído.

Deshidratación y Aclarado

Diversas sustancias químicas se usan como parte del procedimiento. Cuando se infiltra en la muestra parafina o una sustancia similar con objeto de obtener cortes, debe eliminarse el agua. Normalmente, el agua constituye el 75% de casi todos los tejidos. Después de lavar de manera escrupulosa la muestra para eliminar todo rastro de formalina, se deshidrata el espécimen como preparación previa a la inclusión.

Se usan muchos deshidratante (Etanol, Butanol, Dioxano, Isopropanol) pero el Etanol es el más utilizado. Las muestras de tejido se sumergen en concentraciones crecientes de etanol, hasta que se obtiene la deshidratación total en alcohol absoluto. Las muestras se procesan con un aclarante porque los deshidratantes y agentes para inclusión no son miscibles el uno en el otro. El aclarante sustituye al deshidratante.

Inclusión

Las muestras aclaradas se procesan pasándolas por soluciones de parafina a diferentes concentraciones. Los reactivos para inclusión se mantienen a las temperaturas de su fusión (50 a 68ºC) durante todo el proceso de infiltración. No obstante, el calor requerido puede inducir ciertos cambios morfológicos en los tejidos. En el comercio se obtienen mezclas de parafina purificada y polímeros de plástico que constituyen eficaces materiales para inclusión. Los especímenes infiltrados se colocan en moldes llenos de parafina y se dejan enfriar.

Obtención De Cortes

Una vez que la parafina se ha endurecido y ya que se han retirado los moldes, los cubos se recortan para exponer una cara del tejido incluido. Los cubos se montan en el micrótomo y se hacen cortes muy finos (secciones) sobre la superficie. Estas secciones así obtenidas tienden a formar cintas – el último borde de la sección precedente se adhiere al primer borde de la que sigue – lo que facilita la recolección de secciones de la muestra. Debido a cierta compresión generada por el proceso de corte, las cintas pueden hacerse flotar en agua tibia, estirarse después y recogerse con portaobjetos. Parte de las cintas se fijan en los portaobjetos, y éstos se colocan sobre una platina caliente para reducir los artefactos por compresión.

Un micrótomo rotatorio permite obtener secciones hasta de un 1 µm de espesor. La mayoría de los especímenes requeridos para examen histológicos se corta con un espesor de entre 5 y 7 µm y se montan sobra portaobjetos.

Tinción y Montaje

Las secciones de materiales incluidos en parafina, montados sobre portaobjetos de vidrio, simplifican el resto de la operación de teñido y montaje. Muchos colorantes tisulares son solubles en agua o alcohol; la parafina debe eliminarse antes de teñir. Se rehidratan las secciones y se tiñen. Se deshidratan de nuevo, se aclaran y se cubren con un medio de montaje miscible en el medio aclarante. Al aplicar un cubreobjetos se obtiene una preparación permanente.

(Bacha, 2000)

PRINCIPIOS DE TINCIÓN

Características Generales

En casi todos los exámenes de secciones histológicas se utiliza el campo claro del microscopio. Las células y los componentes tisulares son similares, desde el punto de

vista óptico, y su estudio se dificulta si no se resalta sus cualidades ópticas mediante la tinción. Muchos colorantes y combinaciones de éstos se usan en el laboratorio de histología debido a que pueden reaccionar de modo variable con células y tejidos. Algunas tinciones son específicas para ciertas células o componentes extracelulares o ambos; otras no lo son. Hematoxilina (H) y eosina (E) son tinciones generales que a menudo se usan juntas.

Las tinciones son útiles y la información que se obtiene con ellas se magnifica si se comprenden bien los principios del teñido. Las reacciones químicas detalladas, de todas las tinciones no se comprenden del todo; sin embargo, se conocen muchos mecanismos de tinción y esto proporciona la ventaja adicional de entender algunas de las particularidades químicas relacionadas con las células y sus componentes (Banks, 1996).

Colorantes Básicos y Ácidos

Muchos de los colorantes usados en histología son sales solubles en agua que se califican como colorantes ácidos o básicos. Si el colorante que proporciona color se encuentra entre los radicales ácidos, se dice que el colorante es ácido. Si en cambio está entre los básicos, se considera que es un colorante básico.

La tinción ácida o básica depende las cargas aniónicas o catiónicas de las proteínas celulares. La carga neta de estos colorantes proviene del número total y de la naturaleza de sus radicales ionizables, así como del pH del entorno. Los componentes celulares básicos reaccionan con los colorantes ácidos mediante un proceso de neutralización, lo que origina formación de una sal coloreada y agua. Los componentes celulares y tisulares ácidos reaccionan de manera similar con los colorantes básicos. Los componentes celulares y tisulares básicos son acidófilos, es decir reaccionan con tintes ácidos. Por otra parte, los componentes ácidos son basófilos, esto es, reaccionan con tintes básicos.

Hematoxilina Y Eosina

El mecanismo de tinción de la H y E ocurre por neutralización. El colorante básico, la Hematoxilina, se aplica primero. Confiere un color azul a púrpura a componentes ácidos de las células, como la cromatina y algunos productos de secreción. La Eosina, el colorante ácido, se aplica en seguida; confiere color rosa pálido a rojo a componentes básicos de la célula, como el citoplasma y muchos productos extracelulares.

Tinción de Romanowsky

La tinción de Romanowsky modificada es una combinación de colorantes de mucha utilidad, entre los que se destacan el azul de metileno y la Eosina. El azul de metileno se oxida y produce colorantes azur. Las combinaciones de éstos (azur A, B, y C) con azul de metileno se conocen como azul de metileno policromo y tienen un amplio espectro de tinción para los componentes ácidos de la célula. La eosina es el colorante ácido de contraste. Esta combinación de tintes (Romanowsky y eosina) se utiliza a menudo para teñir muestras de sangre y médula ósea.

Tinción de Ácido Peryódico de Schiff

La tinción de ácido peryódico de Schiff (PAS) es de mucha utilidad en los estudios histológicos. El procedimiento requiere de dos etapas sucesivas para obtener la reacción característica. La primera reacción consiste en oxidar, por medio de ácido peryódico, alcoholes alfa-amino o grupos 1,2-glicol, o ambos, a aldehídos. Dichos aldehídos se exponen al reactivo de Schiff. Este último contiene fucsina básica, originalmente rojo violeta, decolorada con ácido sulfuroso. La reacción subsecuente de los aldehídos con el reactivo, produce un complejo que restituye el color magenta. La tinción de contraste suele ser la hematoxilina. Muchos carbohidratos y complejos Carbohidrato-Proteína son positivos a PAS.

TÉCNICAS SELECTAS DE PREPARACIÓN

La cantidad y el tipo de información que puede obtenerse a partir de los estudios histológicos queda solo limitada por el enfoque elegido. Si únicamente se requiere estudiar las relaciones estructurales, la técnica de inclusión en parafina es de utilidad suficiente. Sin embargo, muchos inconvenientes son obvios (Banks, 1996):

1. La fijación utilizada.2. El calor que se necesita durante el proceso.3. El uso de solventes que tiene efectos sobre las células. 4. La necesidad de secciones gruesas (5-7 µm) para facilitar la observación.5. El tiempo requerido para completar el procedimiento.

Diversos enfoques técnicos proporcionan información diferente (Cubillos, 2006):

Estudios Citológicos

Los estudios citológicos constituyen una alternativa útil cuando la estructura tisular es de poca importancia.

Técnicas de Congelación

La preocupación por las alteraciones de morfología y función, debidas a los métodos de fijación y al procesamiento subsecuente, han impulsado el desarrollo de técnicas menos lesivas que las de uso rutinario. También la reducción del tiempo de procesamiento ha influido en ello. Las técnicas de congelación se desarrollaron para satisfacer éstas y otras necesidades. Las secciones congeladas, como las biopsias transoperatorias, se procesan con rapidez para examinarse.

La técnica de liofilización consiste en congelar a temperatura de nitrógeno líquido (-170ºC) una muestra de tejido fresco obtenida mediante biopsia, en tanto se encuentra al vacio. La sublimación subsecuente del agua, al elevar paulatinamente la temperatura, evita el uso de fijación, deshidratación y aclarado. Las muestras son incluidas, cortadas y teñidas. La posibilidad de efectuar estudios químicos en tales tejidos tiene especial interés. Valiosos datos se han obtenido sobre la localización de actividad enzimática. Los tejidos procesados por este método han mostrado menos

artefactos que los preparados por medio de procedimientos más convencionales de fijación química.

Las muestras preparadas por congelación tienen tantas ventajas como las que se obtienen con el procedimiento antes descrito; sin embargo, el daño celular se presenta cuando se forman cristales de hielo; asimismo, el grosor de los cortes es una limitante más. Las muestras de tejidos se congelan con rapidez a -40ºC y se cortan dentro de un aparato que mantiene constante la temperatura. El utensilio de corte, el criotomo, consiste en un micrótomo rotatorio que se halla en la cámara de entorno frío.

Histoquímica Y Citoquímica

Estas técnicas proceden del intento de localizar e identificar sustancias químicas dentro de células y tejidos intactos, que los químicos puedan reconocer con rapidez en el tubo de ensayo. El procedimiento vara de lo sencillo a lo complejo, pero el principio básico es simple. Si un componente químico puede unirse con un colorante para mejorar se visualización, entonces es adecuado para el estudio. Lo preciso de la visualización y localización está en función de:

1. La especificidad de la reacción de tinción. 2. La localización y estabilidad del componente en estudio. 3. El grado hasta el cual la sustancia examinada se altera con el método de

procesamiento.

Muchas células y constituyentes celulares pueden ser examinados mediante técnicas histoquímicas y citoquímicas: minerales, carbohidratos, grasas, proteínas y enzimas.

En general el término histoquímica se aplica a estudios conducidos con microscopio de luz; Citoquímica, en cambio, se utiliza respecto de estudios con microscopio electrónico. Las técnicas de congelación con uso de fijadores químicos moderados o sin utilización de éstos, se emplean para estudios enzimáticos; ello, por que los fijadores químicos de uso común tienen sobre ella efecto desnaturalizante. Los estudios con microscopio electrónico de reacciones Citoquímica hacen necesario que el producto final de éstas tenga densidad electrónica, para que pueda visualizarse y localizarse.

Técnica de Metacrilato

La técnica de inclusión en parafina es un método rápido, fácil y confiable. Sin embargo, a pesar de sus ventajas también tiene sus desventajas. La resolución de detalles finos no es posible en especímenes cortados que tiene 5 - 7µm de grosor. También, el calor y los solventes fuertes que requiere la técnica de parafina producen cambios por artefactos celulares y tisulares.

El microscopio electrónico ofrece la ventaja de una resolución mejorada en gran medida. Esta resolución ampliada es la suma de las características del rayo y de la facilidad para obtener cortes de especímenes en inclusiones plásticas, de aproximadamente de 40 nm o menos. Desafortunadamente, es necesario usar sustancias químicas dañinas durante la técnica de procesado.

El metacrilato de glicol (GMA) es un medio plástico de inclusión, soluble en agua con el que evita el uso de muchos químicos enérgicos (deshidratantes y aclarantes) y el calor requerido en las técnicas de parafina. Asimismo, se reduce la aparición de artefactos por el procesamiento. La técnica de GMA puede seccionarse en un intervalo de 0.5 y 4µm. Esta fineza de corte aumenta el detalle citológico que puede observarse mediante el microscopio de luz.

La fijación en GMA es útil en las técnicas histoquímicas y citoquímicas. La determinación de la actividad enzimática específica aumenta cuando se evita el uso de sustancia químicas lesivas, y por que al eliminar o al menos reducir la exposición al agua las sustancias hidrosolubles se retienen en células y tejidos.

Autorradiografía

Esta técnica es útil en el estudio histológico de procesos celulares dinámicos. Las secciones de tejidos se incuban con sustancia radiactivas. Por lo general, los marcadores radiactivos son emisores de radiación beta corta. Las secciones se cubren con una emulsión fotográfica que es expuesta por la emisión radiactiva. La imagen latente en la emulsión fotográfica se revela de modo rutinario. La tinción subsecuente permite visualizar los granos de plata sobre las secciones. Estas secciones pueden visualizarse con microscopio de luz o con electrónico, ello, debido a que los granos de plata son negros y también tienen densidad electrónica. Estos métodos permiten una visión profunda de síntesis, secreción y mitosis celular.

Inmunohistoquímica

Este procedimiento se utiliza en estudios de investigación con microscopio de luz y electrónico para localizar e identificar sustancias potencialmente antigénicas. Se prepara un extracto purificado de la sustancia que se busca. Se inyecta como antígeno (Ag) en otro animal, mismo que desarrolla una respuesta inmunitaria y produce anticuerpos (Ac). Los anticuerpos se aíslan y purifican. El tratamiento subsecuente lo determina el tipo específico de técnicas inmunohistoquímicas que se quiera utilizar.

En la técnica directa de anticuerpos fluorescentes, un colorante fluorescente, por lo común isotiocianato de fluoresceína (FITC), se conjuga con el anticuerpo. El conjugado Ac-FITC reacciona con el espécimen. El lavado elimina el reactivo libre y sólo queda el que reaccionó formando un complejo Ag-Ac-FITC. El examen mediante luz ultravioleta, permite localizar al antígeno fluorescente. En la técnica indirecta de anticuerpos fluorescentes, se requiere un paso más para producir una antiglobulina (An) para el anticuerpo producido originalmente. El colorante fluorescente se liga a la antiglobulina. La muestra se incuba como se describió, pero esta vez la reacción origina el complejo Ag-Ac-An-FITC. Esta técnica tiene la ventaja de que ocasiona una reacción de mayor intensidad y especificidad, al permitir que se formen más conjugados. Los marcadores que es posible usar con este método no se limitan a los colorantes fluorescentes. La enzima peroxidasa puede conjugarse con Ac y con An. La visualización de conjugados se consigue por medios de demostración histoquímica de actividad de la peroxidasa. Es posible conjugar la ferritina con Ac y An. Esta sustancia contiene 23% de hierro, tiene densidad electrónica y, por ende, permite ser visualizada con microscopio electrónico. Las investigaciones con esta técnica no se limitan al

estudio de antígenos característicos. Cualquier sustancia capaz de suscitar respuesta Ac en otro animal, puede localizarse mediante esta técnica.

Microscopia Electrónica de Transmisión

La preparación de material biológico para microscopia electrónica, incluye procedimientos similares a los descritos en cuanto al método de inclusión en parafina. La muestra debe obtenerse de modo atraumático. Cualquier manejo descuidado o proceso de contaminación, o bien ambos, durante esta etapa del proceso, se evidencia de inmediato por los diferentes aumentos que se utilizan. El procedimiento habitual de fijación que se efectúa a base de paraformaldehído o glutaraldehído, con ácido ósmico o sin éste, debe ser excelente; a menudo esto se logra a 4ºC. La deshidratación es similar a la de las preparaciones de microscopia de luz. Los aclaradores se usan de la manera descrita, para permitir la inclusión del espécimen en plástico.

La inclusión en plástico, la precisión de los instrumentos de corte y el uso de navajas de diamante o vidrio, facilitan la obtención de especímenes delgados (30-60nm de espesor). Para el libre paso de los rayos de electrones, es esencial que las secciones sean muy delgadas. Si los especímenes son delgados en extremo, la dispersión es insuficiente. Los fragmentos gruesos, en cambio, absorben electrones del rayo. Las tinciones de metales pesados (ácido ósmico, plomo y uranio) se utilizan en el teñido de constituyentes celulares y extracelulares. Estos metales pesados, que se dispersan de modo diferencial por toda la extensión de la muestra, determinan la dispersión del rayo electrónico y la formación de la imagen.

Durante el proceso de corte, a menudo se examinan secciones de tejido de 1 a 2µm de espesor, con propósitos de orientación. Estos cortes delgados son útiles para estudio histológico.

Microscopia Electrónica de Barrido

Las técnicas de preparación para este tipo de microscopia son similares a las descritas antes para la microscopia electrónica de transmisión, solo que no se requiere seccionar ni teñir los fragmentos. Los especímenes que se usan en esta técnica presentan una superficie natural o que se prepara de modo artificial. Se obtienen, se fijan y se deshidratan por medio de secado al punto critico (para reducir distorsiones por tensión superficial) y luego se cubren con u conductor, a menudo oro, que dispersa los electrones secundarios hacia atrás a un colector. Tales fragmentos requieren tratamiento mínimo y, aun así, proporcionan visión detallada de las relaciones tridimensionales.

Congelado y Fractura

Esta técnica utiliza la congelación rápida de muestras con nitrógeno líquido (o freón) y prescinde de fijación química y deshidratación. Las muestras congeladas se montan en láminas que se colocan en un aparato especial. Las láminas se mueven ligeramente y se fractura el espécimen. Metales vaporizados desde una fuente de calor, cubren las superficies fracturadas y forman réplicas metálicas ultrafinas, mismas que se retiran de la superficie de fractura del tejido y se usan como muestras que se

examinan con microscopio electrónico de transmisión. Esta técnica proporciona una visión de alta resolución de la estructura de superficies reales y artificiales – plasmalema, citomembranas, otros organitos, componentes de la matriz e inclusiones.

MICROSCOPIA E INTERPRETACIÓN

Para estudiar histología eficazmente, deben entenderse las técnicas de preparación y los muchos modos en que células y tejidos pueden examinarse. Ambos imponen o limitan, la información que puede obtenerse de las muestras histológicas. La habilidad para interpretar es también componente esencial de la histología (Banks, 1996).

MICROSCOPIA

La capacidad que el microscopio tiene para amplificar es importante para la histología, pero la consideración mas significativa es que permite mostrar dos puntos, muy cercanos entre si, como dos imágenes independientes. Exhibir dos objetos muy cercanos entre sí como imágenes separadas, es el poder de resolución de un lente o sistema de lentes. La resolución se define como: R + 0.61 ג/AN.

El poder de resolución (R) (en angstroms) se determina por la longitud de onda (ג) de la fuente de luz y la abertura numérica (AN) del lente objetivo. La abertura numérica de un lente, n seno de alfa, es el índice de refracción (n) multiplicado por el seno de la mitad del ángulo formado entre el espécimen y la máxima abertura del lente. Este concepto describe las propiedades de la concentración de luz del lente. Por lo común, un microscopio de luz usa longitudes de onda del orden de 5000 Â, y la abertura numérica de un buen lente de inmersión en aceite es de alrededor de 1.4. El poder de resolución de un sistema con estos parámetros seria del orden de 2200 Â. Cualquier componente mas cercano entre si que 2200 Â no serian vistos como dos objetos separados. La aberración esférica, incapacidad de una superficie curva para reunir en un punto focal luz monocromática, puede disminuir la resolución. La aberración cromática, presencia de focos múltiples a través de la refracción diferencial de luz policromática, también puede afectar de modo negativo la calidad de la imagen. En los sistemas ópticos de calidad, dichas aberraciones están corregidas en las lentes.

Microscopio de Campo Claro

El microscopio de campo claro que se usa en histología tiene limites de resolución del orden de 2200 Â. Para la máxima eficacia de este tipo de microscopio se requieren secciones teñidas, debido a la transparencia de los tejidos vivos.

La resolución del microscopio de campo claro puede aumentar con la adaptación de una fuente de luz con longitud de onda más corta. Las longitudes de ondas menores a 4000 Â no se transmite a través de las lentes de vidrio. La resolución más refinada de estos microscopios, esta en función de las características de las lentes y no de la longitud de onda.

Microscopio de Luz Ultravioleta

Este tipo de microscopio utiliza una fuente emisora de rayos ultravioleta con longitud de onda de entre 1000 y 3000 Â. La resolución calculada para este sistema varia entre 500 y 1500 Â. Para permitir el paso de longitudes de onda tan pequeñas al sistema óptico, se requieren lentes de cuarzo. Deben usarse técnicas fotográficas debido a que la radiación ultravioleta es invisible, y lesiona la retina y a los organismos vivos. La aplicación principal de este tipo de microscopio es la microespectrofotometría, auxiliar de los estudios histoquímicos.

Microscopio de Fluorescencia

Este microscopio de luz visible utiliza una fuente de luz ultravioleta. La radiación monocromática excita las moléculas, que absorben energía de fotones y la remiten en longitudes de onda dentro el espectro visible. Para evitar que la radiación ultravioleta que logra pasar el sistema de lentes lesione la retina del observador, se colocan filtros de barrera que impiden el paso de las ondas más cortas. Este microscopio se usa en las técnicas de anticuerpos fluorescentes.

Microscopio de Campo Oscuro

Este instrumento es una modificación del microscopio de campo claro. El condensador usual es reemplazado por otro que desvía la luz para que llegue a la imagen en ángulo oblicuo. No hay iluminación directa que alcance el lente objetivo. La luz que llega a éste es la que se disemina en las orillas de los componentes, con índice de refracción diferente. Las células y otras estructuras tisulares se aprecian brillantes sobre fondo oscuro. Los límites de resolución son similares a los del microscopio de campo claro. Estos aparatos ópticos permiten examinar especímenes vivos sin teñir.

Microscopios de Contraste de Fase y de Interferencia

Se hace una descripción de ambos debido a que la luz se usa de modo semejante.

El Microscopio de contraste de fases es un microscopio de luz modificado que requiere un condensador especial (Condensador de Zernike) y una placa de fases. La alineación de los componentes ópticos se realiza con un telescopio de enfoque. Al ser transiluminados, los especímenes vivos o sin teñir permiten que sus varios constituyentes transmitan la luz de fase alterada en función de la pequeña diferencia de los índices de refracción y de su grosor. Esta luz de fase alterada (desviada) en acción reciproca con luz monofásica (no desvaída) produce una imagen, que al crearse mediante interferencias constructivas y destructivas, se hace visible a intensidades alteradas. Los microscopios de contraste de fases convierten las diferencias de fase indetectables en diferencias de amplitudes visibles para la retina humana. Este microscopio tiene utilidad en el estudio de especímenes vivos y no teñidos.

Los mismos principios rigen el Microscopio de interferencia de fases de Normarski. Su única pero más importante ventaja es que proporciona imágenes tridimensionales de células y tejidos.

Microscopio de Luz Polarizada

Muchas sustancias contenidas en las células o secretadas por estas, tienen estructura molecular ordenada. Cuando un rayo de luz polarizada pasa a través de dichas sustancias, la luz trasmitida se divide en dos rayos perpendiculares entre sí. Un rayo ordinario sigue las leyes de refracción; el rayo extraordinario sufre un cambio de velocidad. Este fenómeno, llamado birrefringencia, es la propiedad de tener mas de un índice de refracción (anisotropía, A). los índices dependen del plano en que vibran la luz polarizada en relación con la orientación de las moléculas. Aquellas sustancias que tienen un solo índice independiente del plano de vibración de la luz polarizada, son isotrópicas.

Este microscopio es un instrumento de campo claro al que se añaden un polarizador y un analizador, entre los cuales se halla el espécimen.se utiliza para el estudio de bandas A e I del músculo, y para estudiar la naturaleza ordenada del hueso.

Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)

Los principios rectores de los sistemas ópticos de luz, son los mismos que se aplican en microscopia electrónica. Los microscopios electrónicos tienen características únicas relacionadas con la naturaleza de su fuente de iluminación – el electrón. La columna masiva invertida del MET tiene una fuente de electrones, un dispositivo acelerador de éstos, lentes electromagnéticas para controlar los electrones, un sistema de vacio y un sistema traductor de imágenes.

La fuente de iluminación es un tríodo con filamento de tungsteno caliente que es la fuente catódica de electrones. Los electrones se aceleran desde el cátodo por el elevado potencial de la placa del ánodo; la rejilla (tapa del cañón) controla la cantidad del flujo electrónico. La longitud de onda de los electrones. La mayoría de los MET modernos alcanza resoluciones valoradas en 3 a 5 Â, pero la naturaleza de los especímenes limita estas resoluciones a solo 20 Â en promedio, que representa una mejoría de 110 veces con respecto a la que se obtiene con microscopio de campo claro.

Las lentes electromagnéticas controlan el rayo de electrones, desde las lentes condensadora, del objetivo y proyectora a una pantalla de observación fosforescente. Los electrones se dispersan y absorben conforme pasan a través del espécimen. El resto de los electrones del rayo alcanzan la pantalla fluorescente, lo que ocasiona emisión de luz en el espectro visible, mismas que se usa para localizar y enfocar estructuras; sin embargo, el estudio morfológico se hace con fotografías.

La formación de imágenes en el microscopio electrónico debe producirse al vacio, debido a que el promedio del paso libre de electrones en aire es muy pequeño. El rayo d electrones pasa a través del espécimen (<1000 Â) y el metal pesado que tiñe los componentes dispersan los electrones. El rayo disminuido en electrones que se proyecta en la pantalla de observación, puede considerarse la sombra del espécimen.

Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)

El sistema óptico del MEB es más simple que el del sistema MET y sus principios de operación son diferentes. El MEB tiene una fuente de electrones (cátodo, rejilla y ánodo), y lentes condensadora y del objetivo. El rayo se enfoca sobre la superficie de

un espécimen cubierto, pero aquel no es estacionario. Un generador de barrido mueve el rayo, de manera ordenada, a lo largo de la superficie del espécimen – un patrón de rastrillo. El generador de barrido sincroniza el patrón de rastrillo de un tubo de rayos catódicos (TRC) con el patrón del rayo rastrillo. Los electrones se dispersan desde la superficie del espécimen hacia atrás y excitan un colector de electrones. El barrido del rayo rastrillo sincronizado con el del TRC permite un despliegue punto por punto de los electrones dispersados hacia atrás sobre el TRC. La diversidad de ángulos del espécimen determina el número de electrones que llega al colector. Esto da lugar a la intensidad variable de la imagen tridimensional exhibida. La ampliación en este microscopio esta en función de la longitud del barrido que efectúa el rastrillo de TCR, dividida entre la longitud del barrido de rayo rastrillo. El barrido del TCR es constante, pero la disminución de longitud de barrido de rayo rastrillo, aumenta la amplificación.

El MEB no sustituye al MET, la mayor ventaja del MEB es su profundidad de campo, lo que permite exhibir imágenes tridimensionales.

INTERPRETACIÓN

La capacidad de interpretación implica tener conocimientos sobre las limitaciones y ventajas de las técnicas y del microscopio que se usa. Debido a que la información que se obtiene con un tipo de microscopio es limitada, se puede facilitar la solución de problemas mediante la utilización de varios tipos de microscopios.

La comprensión de la estructura capacita para traducir disecciones bidimensionales estáticas a relaciones dinámicas tridimensionales que son características de los órganos vivos (Bacha, 2000).

Examen de Especímenes

Muchos estudios histológicos empiezan cuando se obtiene la muestra. El histólogo conoció el órgano de origen y probablemente aprecio su estructura macroscópica (normal o anormal). El estudio histológico sin orientación anatómica macroscópica ocasiona una situación didáctica artificial, en especial si el examen requiere apoyarse solo en las características microscópicas para identificar células, tejidos y órganos.

Todos los órganos de origen conocido o desconocido deben examinarse primero sin uso de instrumentos ópticos. Muchas características microscópicas se evidencian con este primer paso superficial pero eficaz. La distribución de las propiedades de tinción (basofilia, acidofilia), la presencia o ausencia de espacios vacíos (luces) y la estructura característica, pueden orientar la atención a ciertas regiones del corte. Además, si este examen se lleva a cabo con cuidado, se limita el número de interpretaciones posibles.

El deseo de “querer observar más” pasando de inmediato a amplificaciones mayores, solo produce desorientación. Cada paso a mayores amplificaciones disminuye el campo visual. Es preferible pasar a cada etapa de amplificación, anotando las características específicas de cada campo. Se obtiene mayor información sobre una menor porción de tejido a cada incremento de la amplificación. Un examen puede finalizar con la lente de inmersión. A menudo, la información deseada sobre tejidos se obtiene sin usar dicho lente.

Color y Morfología

Si se aprende y se comprende la morfología, el color pierde importancia. El color ayuda al aprendizaje y al estudio. Las microfotografías electrónicas, elemento importante en el estudio de la histología, aparece en blanco y negro. Entre mas pronto se pueda encontrar apoyo en la morfología, independientemente de las propiedades de tinción, más pronto se entiende la histología.

Cortado y Morfología

Tres desafíos se enfrentan al preparar secciones histológicas:

1. Comprender que las porciones fijadas, procesadas, teñidas y seccionadas, representan excelentes muestras de los constituyentes del cuerpo. Las relaciones estructurales y funcionales visibles en el portaobjetos, son un momento capturado de la vida de un organismo o de una parte de éste. Si la muestra es representativa. Pueden hacerse importantes inferencias sobre el organismo, sus partes constituyentes o ambos.

2. Comprobar la confiabilidad en una sección de tejido. En realidad un corte de tejido de cualquier órgano ¿representa todo el órgano? La respuesta es afirmativa si la muestra se obtuvo con cuidado. Deben aceptarse las muestras como representativas y entonces hay que proceder a convertirlas mentalmente en una imagen tridimensional y dinámica.

3. Convertir las secciones de dos planos en un tubo tridimensional. Los científicos tienen buenas razones para trabajar con secciones. Estas representan un modo expedito de obtener visualizaciones importantes de las partes constituyentes y del organismo, sin examinar cada miligramo de este. La habilidad para convertir esas secciones de dos planos en un todo tridimensional es una parte importante de la histología.

Los objetos de la vida diaria son conceptuados con facilidad. Sin embargo, en histología a menudo es necesario poner en tercera dimensión un plano simple de una sección, relacionado con un objeto no familiar. Un corte realizado a lo largo del eje longitudinal de una célula aplanada, proporciona información engañosa sobre la forma celular. En ambos se debe considerar la tercera dimensión. Resulta muy útil relacionar estructuras tridimensionales con imágenes en dos dimensiones de objetos familiares. La primera rebanada perpendicular al eje longitudinal de un huevo duro, difícilmente causa sorpresa si no tiene yema. Los cortes sucesivos en un momento dado mostrarán y dejarán de mostrar la yema. La relación tridimensional de la yema y la clara determinan la estructura de las secciones.

En los cortes de tejido se encuentran situaciones similares. Aunque todas las células tiene núcleo, no todos los núcleos se hallan en una determinada sección (plano) determinado tejido. Se puede tener tanta confianza en encontrar un núcleo como se tiene en encontrar yema. Es posible que se den interpretaciones equivocadas respecto de la estructura y los componentes, al seccionar un huevo. Las mismas interpretaciones erróneas pueden esperarse en histología. Las siguientes

consideraciones ayudan a disminuir tales errores de interpretación: se debe estar familiarizado con lo que se corta, hay que aumentar el número de secciones y ha de tenerse confianza en el conocimiento acumulado de la histología, en relación con la estructura tridimensional. Los componentes tisulares de muchos órganos se disponen en diseños con rasgos variados; al cortar un limón se demuestra la apariencia de cierta rebanada de esta fruta. Las secciones de órganos también se ven diferentes en función de l plano de corte. Se debe estar consciente de las diferentes representaciones, cuando se examina una sección.

Es posible cortar algunos órganos cilíndricos sólidos de modo longitudinal, transversal o en sentido oblicuo. Su representación puede compararse con la apariencia de diferentes planos de un cable coaxial. La apariencia alterada del cable, en especial en el borde oblicuo, puede dar la engañosa impresión de falta de continuidad entre los componentes. Algunas estructuras alargadas, huecas o cilíndricas, pueden adoptar formas variadas al seccionarlas. Si las formas no se examinan e interpretan con cuidado, es posible obtener impresiones falsas sobre la verdadera naturaleza de dichas entidades estructurales.

(Bacha, 2000)

Artefactos Histológicos

Al procesar muestras histológicas, se inducen cambios en células y tejidos. Se debe aprender a distinguir los cambios predecibles y constantes de aquellas alteraciones originadas por manejo inadecuado, por procesamiento de los especímenes (artefactos) o bien por ambas causas. El exceso de retracción o aumento de volumen, o ambos pueden alterar los tejidos. Si la inclusión se efectúa de modo incompleto, con frecuencia se produce pérdida de una región del tejido durante la obtención de secciones. La deficiente eliminación de colorante puede originar precipitados abundantes. Si el ángulo de la navaja es inapropiado durante la obtención de secciones, es posible que proporcione apariencia ondulada al corte. Las partes gruesas aparecen más densas debido a la sobreposición de artefactos. Las navajas mal afiladas raspan los cubos de parafina al cortar las secciones; si éstas no se extienden en el portaobjetos., aparecen dobleces o arrugas. La extensión excesiva de las secciones de parafina también puede causar distorsión de las relaciones espaciales.

TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS PARA EL ESTUDIO PATOLÓGICO

En todos los casos, la toma de muestras dependerá directamente del tipo de patología de la que se sospecha. Es decir, para cada enfermedad sería conveniente tener un protocolo específico de toma de muestras, ya no sólo para histopatología, sino para cada tipo de test o prueba que se precise realizar. En primer lugar es necesario considerar que estas muestras se deben fijar en formol previamente a todo procesado que se pretenda realizar. Lo ideal es fijar la muestra tan pronto como sea posible (Segalés, 2003):

Fijación de las muestras

Debería utilizarse formol tamponado al 10%. A nivel práctico, no obstante, es suficiente la utilización del formol comercial que se vende en las droguerías diluido 1:10. Lo que no se debe hacer en ningún caso con una muestra en la cual se pretenda realizar un estudio histopatológico es congelarla (dado que se forma una cantidad muy importante de artefactos asociados a la congelación, que tienden a enmascarar la posible existencia de lesiones). Se recomienda en todos los casos utilizar contenedores de plástico con cierre hermético (los botes de cristal se rompen con gran facilidad durante el transporte), llenados hasta las 4/5 partes de su capacidad con formol. Es muy importante, especialmente para evitar la autolisis incluso dentro del bote de formol, que la proporción entre el volumen de tejido fijado y el volumen de formol sea aproximadamente de 1:5 a 1:10.

Correcta fijación de tejidos para su posterior evaluación microscópica (izquierda) en comparación con unafijación deficiente (derecha).

(Segalés, 2003)

Características de las muestras a tomar

Dependerá de la enfermedad de la que se sospecha, pero en general se pueden marcar las siguientes pautas:

• Cerebro: Se extrae y se fija entero. Si se pretende realizar aislamiento microbiológico, es adecuado sacar primero un hisopo de meninges o del tercer ventrículo. Si se quiere realizar un aislamiento vírico, entonces se fija sólo la mitad del cerebro y la otra mitad se utiliza para el estudio virológico.

• Pulmón: Se suelen recoger 3-4 muestras de diferentes partes del pulmón, tanto de la zona supuestamente lesionada como de la zona aparentemente no lesionada. Se cortan rodajas de unos 0,5 cm de ancho, y especialmente de los lóbulos apicales y medios (son los lóbulos donde generalmente las lesiones microscópicas son más evidentes). Las muestras deben ser pequeñas para facilitar la penetración del formol.

• Corazón: Se toma una porción de la pared ventricular derecha, izquierda y del tabique interventricular. En todos los casos, la rodaja no debe medir más de 0,5 cm de ancho.

• Nódulos Linfáticos: Se pueden recoger enteros, pero abiertos mediante un corte sagital para facilitar su fijación.

• Estómago/Intestino: Estas son probablemente las muestras más delicadas de tomar adecuadamente. Dado la normal presencia de una flora bacteriana en estas localizaciones (especialmente intestino), el proceso de autolisis (putrefacción) comienza inmediatamente después de la muerte del animal. De hecho, se considera que después de 3 o 4 horas post-mortem, la mucosa intestinal ya se encuentra autolítica. Por tanto la muestra ideal es aquélla que procede de un animal muerto recientemente o al que el propio veterinario le ha practicado la eutanasia. Las

muestras que conviene tomar suelen ser 2 o 3 porciones de unos 4-5 cm de longitud de yeyuno, una de íleon, una de ciego y 1 o 2 de colon. En todos los casos es necesaria la apertura longitudinal de la sección intestinal recogida para poder lograr una fijación eficiente. La no realización de la apertura del tracto intestinal recolectado puede suponer que igualmente se produzca la autolisis de la mucosa, aunque la muestra corresponda a un animal recientemente muerto o al que se le ha practicado la eutanasia.

• Otros Órganos: Habitualmente se suelen tomar secciones de órganos parenquimatosos de un grosor igual o menor a 0,5 cm. En muchos casos es adecuado recoger varias porciones de un mismo órgano. En caso de órganos pequeños (casos de glándulas adrenales, ganglio trigémino, etc.) se toma el órgano entero.

Envío de las muestras al laboratorio

Es indispensable una correcta rotulación del contenedor de la muestra tomada, con identificación de granja, número del animal, y tipo de muestra o muestras que contiene. Además de este tipo de información, también debe incluirse un resumen de la historia clínica, listado de las muestras remitidas, la sospecha de la problemática y los datos de contacto del veterinario o granjero (teléfono y dirección). Las muestras correctamente etiquetadas y referenciadas en botes de plástico de cierre hermético no necesitan refrigeración. Lógicamente, se debe incluir una referencia adecuada en el exterior del paquete. Para facilitar un diagnóstico histopatológico lo más rápido posible, se recomienda el transporte urgente de la muestra al laboratorio de diagnóstico.

Diagnóstico histopatológico

Cabe recordar que el procesado de las muestras para histopatología requiere unas 18-24 horas de fijación (tiempo que generalmente ya se consigue desde que la muestra es fijada hasta que llega al laboratorio), y aproximadamente unas 24 horas más para la realización de los procesos de corte de la muestra, inclusión en parafina, corte del bloque de parafina en secciones de 4 μm, y tinción con hematoxilina y eosina. Una vez realizados estos procesos, la muestra se encuentra a punto para ser examinada por el patólogo. En caso de petición de técnicas especiales, inmunohistoquímicas o de hibridación in situ (para la detección de agentes infecciosos, generalmente), se precisa al menos entre 24 y 48 horas más de tiempo para su consecución. Desde un punto de vista práctico, la histopatología es una herramienta diagnóstica excelente para orientar

problemas patológicos de difícil caracterización clínica y problemas de origen neurológico. Lógicamente, también permite la correlación entre la detección de agentes infecciosos y la existencia de lesiones asociadas. Este último punto es muy importante, y cada vez más, dado que la detección de un agente infeccioso no supone necesariamente que éste sea la causa de la problemática clínica o de las lesiones macroscópicas observadas.

TOMA DE MUESTRAS PARA OTROS ANALISIS

La realización de la necropsia incluye, en muchos casos, la toma de muestras para análisis complementarios. Es muy importante que ésta se lleve a cabo de forma correcta. Normalmente, siempre existe una toma de muestras para histopatología que determinará las posibles lesiones histológicas y además, en numerosas ocasiones, será necesario llegar a un diagnóstico etiológico para lo cual necesitaremos realizar pruebas complementarias como aislamiento microbiológico o identificación de virus e incluso detección de posibles sustancias tóxicas. Por tanto, la toma de muestras se efectúa para poder llevar a cabo (Fernández, 2002):

• Estudio histopatológico.• Estudio microbiológico.• Estudio toxicológico.

En todo caso, las muestras remitidas deben identificarse claramente y adjuntar la mayor cantidad de información posible de los antecedentes clínicos y hallazgos de necropsia.

Estudio Histopatológico

Las muestras que se tomarán para este análisis serán pequeñas piezas de 0,5-1 cm de grosor, aproximadamente y se incluirán en formol al 10% (100 cc de formalina comercial, que se considera pura, en 900 cc de agua). Las muestras deben ser representativas de la lesión, a ser posible incluyendo zona afectada y sana, nunca de los órganos de hipóstasis o de zonas de necrosis. Es muy importante que las muestras sean pequeñas (2-3 cm máximo) para que el formol penetre lo más rápidamente posible y así evitar las reacciones de autolisis. Las piezas se introducirán en un bote de boca ancha y de tamaño adecuado al número de muestras enviadas, ya que con la fijación en formol los tejidos aumentan de volumen. Se recomienda que el cerebro se remita entero, o en su defecto la mitad en un bote separado, con 10 veces más cantidad de formol que su tamaño. Es conveniente que el cerebro se envuelva en papel de celulosa para que se fije la zona del cerebro que contacta con las paredes del bote. Los botes deberán ir adecuadamente etiquetados e identificados.

Material necesario para la toma de muestra de histopatología (Fernández, 2002)

Estudio Microbiológico

Cuando existe o se establece la sospecha de una enfermedad infecciosa o parasitaria, las muestras deben tomarse en primer lugar siguiendo un orden y sistemáticamente por cavidades. Los tejidos deben remitirse por separado en contenedores estériles. Esto último es fundamental si hay que realizar un diagnóstico microbiológico o micológico. No es tan importante si el proceso es de etiología vírica, siempre y cuando no se vaya a intentar un aislamiento vírico, en cuyo caso las condiciones para la toma de muestras serán muy rigurosas en términos de esterilidad y rapidez de obtención una vez abierto el cadáver. Otro de los puntos fundamentales para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y parasitarias son las horas transcurridas tras la muerte y el proceso de conservación del cadáver. Es una práctica habitual la congelación del cadáver en congeladores domésticos que no superan la temperatura de –20°C, en el mejor de los casos. En general, en términos microbiológicos y virológicos es preferible congelar, incluso en estas condiciones, siempre y cuando se realice de forma inmediata después de la muerte del animal. Con las bacterias hay que evitar una diseminación postmortem que disfrace el alcance y extensión de la infección. En el caso de las infecciones por virus, la correcta conservación del tejido soporte hospedador evitará el envejecimiento, autolisis y la contaminación bacteriana, lo que permitirá y mejorará el uso de técnicas de diagnóstico directas como Inmunofluorescencia o PCR (“polimerase chain reaction”).

Placa de siembra para el diagnostico microbiológico

(Fernández, 2002)

Para el diagnóstico laboratorial de las enfermedades parasitarias, es preferible obtener las muestras en fresco, tanto para parasitosis intestinales, como para sistémicas como por ejemplo: sistema nervioso central en neospora o citologías en leishmaniosis. Por último, en las enfermedades sistémicas siempre deberemos demostrar la presencia del agente infeccioso o parasitario en diversas localizaciones orgánicas, tejidos o células diana. Ello deberá realizarse a fin de demostrar su distribución y poder de este modo atribuir la causa de la muerte al agente o agentes en cuestión. Si no existe orientación sobre qué órganos son los más implicados en la enfermedad, se puede realizar una toma de muestras básica que incluye: trozos grandes de órganos parenquimatosos (bazo, hígado, pulmón, etc.) a fin de poder sembrar en profundidad en el caso de bacteriología, así como un asa de intestino delgado y otra de intestino grueso ligadas por ambos extremos. Siempre se deben tomar lo más rápidamente posible durante el transcurso de la necropsia en envases estériles individualizados (cada órgano en un envase): éstos deben ir a una cámara de refrigeración, hasta su remisión al laboratorio de referencia (con un tiempo máximo de 12 horas). Además de la toma de muestras señalada anteriormente, también se pueden tomar muestras mediante hisopos estériles preferiblemente con medio de transporte para el cultivo microbiológico de exudados nasales, conjuntivales o auditivos, orales, sangre, heces, orina, líquido articular, etc.

Material básico para la toma de muestra de microbiología

(Fernández, 2002)

Estudio Toxicológico

Si el cuadro clínico o el estudio anatomopatológico sugieren un posible caso de intoxicación poco específico, es aconsejable tomar muestras de contenido gastrointestinal (200 g) e hígado (100 g en formol), orina (50 ml), sangre (10 ml), humor acuoso (en su defecto un ojo entero), grasa corporal (100 g), líquido cefalorraquídeo y cerebro (la mitad fresco y la otra mitad en formol) durante la necropsia. Las muestras se remitirán acompañadas del historial, sintomatología y lesiones observadas en la necropsia; como siempre, se proporcionará la máxima cantidad de información posible. Es importante considerar tres hechos a la hora de tomar muestras para toxicología:

• Seleccionar las muestras adecuadas.

• Tomar las cantidades necesarias.• Preservar las muestras correctamente.

Para optimizar los resultados es conveniente que el envío de muestras se realice siguiendo una serie de pautas:

• Las muestras enviadas deben estar libres de contaminación química o detritus (por ejemplo, pelos, vómitos, tierra, etc., que pueden contaminar las muestras y producir errores en los resultados). Es recomendable enviar los cadáveres o muestras en fresco o en refrigeración. Sin embargo, si fuera necesario congelar el animal o las muestras, éstas deben llegar congeladas.

• No congelar sangre entera. El suero debe estar separado de fracción coagulada y no hemolizado para poderse congelar.

• Siempre separar las muestras de distintos órganos y fluidos.

• Etiquetar cada muestra de forma clara.

• Nunca añadir sustancias para preservar las muestras salvo que exista una razón justificada. En ese caso se recomienda que se envíe una muestra de dicha sustancia conservante.

• Remitir las muestras para análisis químicos de contaminantes orgánicos de baja concentración, tales como residuos de pesticidas o PCB en contenedores de cristal, nunca en envases de plástico. En algunos casos de intoxicaciones químicas necesitaremos muestras específicas dependiendo del compuesto químico que sospechemos como principio activo. Así, en caso de sospecha de intoxicación por:

• Metales (plomo, fósforo, cobre, etc.): Orina (10 ml), riñón (50 g), hígado (100 g), sangre completa (10 ml), alimento y suero (5 ml, no para el plomo).• Nitratos y nitritos: Contenido gastrointestinal + cloroformo o formol (llenar el bote) y sangre (10ml).• Antibióticos: Hígado (100 g), riñón (completo), contenido del estómago (100 g), alimento (50 g), orina (200 g).• Rodenticidas anticoagulantes (warfarina, dicumarol, etc.): Sangre completa (5 cc), alimento (100 g), hígado (100 g), contenido estómago (100 g).

• Cianuro: Sangre completa (10 ml), hígado (50 g), músculos esqueléticos (100 g), alimento (100 g) o contenido del estómago (100 g).• Etilenglicol: Suero (10 ml), contenido estómago (100 g), riñón en formol y orina (10 ml).• Organofosforados o insecticidas carbamatos: Alimento (100 g), contenido del estómago (50 g), sangre completa (10 ml), la mitad del cerebro.• Estricnina: Hígado (100 g), riñón (50 g), contenido del estómago (100 g), orina (10 ml), alimento (100 ml).