MÉTODOS RÁPIDOS

1MTODOS RPIDOS PARA ANALISE

MICROBIOLOGICA DE ALIMENTOS

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2- Tcnica de epifluorescncia em filtros;

- Tcnica de filtrao em membranas de grade hidrofbica

-Reidratao de filmes secos

-Mtodo de Redigel

-Mtodo Simplate

-Mtodos fsicos, imunolgicos e qumicos


3TCNICA DE EPIFLUORESCNCIA DIRETA EM FILTROS (TEDF)

Amostra de alimento diludo - filtra em membrana denylon de 5 m filtrado tratado com Triton X 100 e tripsina(lise de clulas) filtra em membrana de policarbonato de0,6 m o filtro corado c/ laranja de acridina contagemde clulas em microscpio de fluorescncia.

Resultados em 25 a 30 minutos.

Uso: contagem de bactrias gram + e gram no leiteEstimar nmero de microrg em carnes e aves


4MEMBRANA FILTRANTE COM GRADE HIDROFBICA

-Filtro especial com 1600compartimentos de cera emuma membrana;

-Deteco - mnimo 10 clulas/g;Resultado em NMP

-Resultados em 24 horas ou menos;

-O filtro colocado sobre um gar apropriado;

-Uso especificamente para microg. Indicadores, fungos,Pseudomonas e Salmonelas.

Membranas Isogrid usa o gar SD-39.

Isogrid


5Membrana Noegrid


6Procedimento de filtrao

Sistema de filtrao Coloca-se a membrana

Ajuste do filtro Adio do diluente

1) 2)

3)4) 5)


76)

Adio da amostra

7)

Aplica-se o vcuo

8)

Remove-se a membranaE coloca-se em meio garadequado


8Bactrias totais

leveduras

Salmonella


9Sistema Isogrid


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PETRIFILME 3M Reidratao de filmes secos

-2 filmes plsticos (polipropileno e polietileno) unidospor um lado, um dos filmes coberto com meio de culturaonde adiciona-se a 1 mL amostra diluda.;

-Aps incubao (24 h) aparecem microcolniasvermelhas Deteco de coliformes totais e E.coli. Contagembactrias aerbias


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Coliformes totais e fecais em Petrifilm EC


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A faixa de contagem de 15 a 150

Contagem de E.coli = 13Contagem de Coliformes Totais = 28

incontveis


13

Contagem de Coliformes Totais = 3

Coliformes Totais = 69 (colnias com gs).


14

Contagem de Aerbios colnias vermelhas

Contagem de coliformes colnias vermelhas com gs

Contagem de E. coli colnias azuis com gs

Leveduras = Colnias pequenas , rosa escuro a azulesverdeada;

Bolores = colnias grandes , colorao variada.

PETRIFILME 3M - USOS


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Silva et al., (2006) Avaliao do padro coliformes a 45C e comparao da eficincia das tcnicas dos tubos mltiplos e Petrifilm EC na deteco de coliformes totais e Escherichia coli em alimentos

Amostras de lingia

Coliformes a 45C

tubos mltiplos (NMP/g) Petrifilm E. coli (UFC/g)

18 9,0.102 1,0.104

42 1,1.103 1,6.104

37 2,8.103 6,0.103

38 7,0.102 1,3.104

45 2,3.103 1,4.104

39 3,0.102 1,2.104

4 Ausente 1,0.105

14 Ausente 2,0.104

15 Ausente 2,0.104

47 Ausente 3,7.104

48 Ausente 2,8.104

25 Ausente 7,3.103

26 Ausente 6,0.103


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REDIGEL

-O meio (no contem gar- pectinato de clcio) misturadocom alimentos diludos ;

- Deixado em repouso por 30 minutos ;

-Incubados por tempo e temperaturas adequados ;

-Atrativo para microrg. psicotrficos - sensvel ao calor

Usado para a contagem de coliformes totais


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MTODO SIMPLATE

- Baseado na atividade de enzimas comuns em microrganismos deorigem alimentar;

- O meio contm substratos que so hidrolisados pelas enzimas;

-Libera um composto fluorescente visvel em luz UV;

-- possui 84 ou 198 poos de incubao

-mesfilos totais e Coliformes 35 C/24h

-Bolores e leveduras 25C/72h

-Pode ser usado C. jejuni

-Conta o numero de cavidades positivas-e converte para NMP


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MTODO SIMPLATE

C jejuni 48 h 24 h

Microrg. totais, 24 h

Leveduras56 a 72h


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N. de cavidades positivas = NMP/mL ou g

1= 22=43=64=8......50 =150....83 =73884 >738


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MTODOS FSICOS CONTAGEM INDIRETA

IMPEDNCIA-CONDUTNCIA(impedncia (Ohms) relao entre diferena de potencial (U em Volts) entreos terminais de um determinado Circuito eltrico dividido pela corrente eltrica(amperes)Condutncia inverso da resistncia eltrica

- Baseado na alterao da corrente eltrica do meiodevido a atividade metablica de microrganismos;- Bactometer instrumento que mede mudanas decondutncia;A quantidade de microrganismos presentes definida pela determinao do TEMPO DE DETECO tempo para que a curva de impedncia comece a se elevar- em conc de 106-107 /mL

Ex: detecta coliformes em carnes 103/g em 6,5 h


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BACTOMETER

64 a 512 AMOSTRAS

Mtodo convencional BactometerContagem total 48 hrs. 6-24 hrs.Coliformes 24 hrs. 6-14 hrs.Leveduras e mofos 5 dias 24-48 hrs.Bactrias lcticas 3-5 dias 24-48 hrs.


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MICROCALORIMETRIA

- Baseado na gerao DE CALOR durante a multiplicaodos microrganismos;

- O calor produzido proporcional quantidade demicrorganismos presentes na amostra;

- Estimar bactrias em carne moda, estudo dadeteriorao em alimentos enlatados.

-Carne moda com 105 a 108 UFC/g gerao de calorcom 24 hs.-S. aureus em 2 hs com 107 a 108 UFC/g.

MTODOS FSICOS CONTAGEM INDIRETA


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Aparelho de Calvet

Sensvel a um fluxo de calor De 0,01 cal/h para uma amostra De 10 mL.


24

Estudos do efeito de agentes antifngicos em

Microrganismos atravs da microcalorimetria

(Montanari et al., 1993)


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CITOMETRIA DE FLUXO

MTODOS FSICOS

- Mede componentes e propriedades de clulasindividuais (fluorescncia, absorbncia ou disperso daluz) em uma suspenso lquida.

-Utiliza fontes como argnio, criptnio ou laser ecorantes fluorescentes.

- Deteco de S. typhimurium em ovos e leite em 40 min-sensibilidade de 103/mL.


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MTODOS QUMICOS

SUBSTRATOS FLUOROGNICOS

- Substrato adicionado nos meio de placas, NMP e emmtodos de filtrao em membranas;

- O substrato fluorognico libera um compostofluorescente detectado por luz ultravioleta

Substrato MUG (4-metilumbeliferil--D-glucurondeo) porao de B-D glucuronidase libera o compostofluorescente 4-metilumbeliferil;

- Usado para a determinao de E. coli;

-Tempo de deteco varia entre 4-16 horas;


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SUBSTRATO CROMOGNICO

- ONPG o-nitrofenil--D-galactopiranosdeo hidrlise pela -galactosidase- produz cor amarela deteco a 420 nm.

Mnimo de 107 clulas.

Azul E.coli

Transparente - coliformes

Meios cromognicos em placas


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Prpura salmonela

Azul - enterobacter

Meio - Salmonella Chromogenic CM1007


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Mtodo COLITAG (Hexis cientfica) substrato cromognico ONPG-MUG

deteco de coliformes totais e E.coli em gua

Incubao a 35-37 C por 24 horas.

Mudana de cor- amarelo - + para coliformes totais

365 nm UV se apresenta fluorescncia positivo p/ E. coli ausncia de fluorescncia negativo p/ E.coli


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MTODOS IMUNOLGICOS

Baseados em reaes entre antgenos e anticorposespecficos.

Em microbiologia de alimentos:

Imunocaptura;

Imunoenzimtico;

Imunofluorescncia.

Sondas de DNA Mtodo molecular


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TCNICA DE IMUNOCAPTURA OU IMUNOSSEPARAOMAGNTICA isolamento de um microrganismo especfico

- Baseia-se na capacidade do microrganismo aderir superfcie de partculas metlicas magnticas revestidas deanticorpos especficos.

-As partculas so colocadas em suporte que contm um m;

-O material concentrado pode ser usado para plaqueamento;

-Aplicao : Listeria monocytogenes, Salmonella spp., toxinado Clostridium perfringens.

-Incubao at 24 horas.


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TCNICA IMUNOENZIMTICA

-Baseado na reao entre um antgeno (PATGENOPROCURADO) com um anticorpo especfico, sendo um delesmarcado com uma enzima.

- O antgeno ou anticorpo esto aderidos superfcie de umamatriz slida (poliestireno)- A quantidade de enzima presente identificada por reaocolorimtrica com o substrato da enzima;

-Amplamente usada para detectar e quantificarmicrorganismos em alimentos

-Usados para Salmonella, Listeria, aflatoxinas, enterotoxinasde S. Aureus


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ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) um teste imunoenzimticoque permite a deteco de anticorpos especficos

Microplacas para teste ELISA

Contendo anticorposAnti-bactria - Os anticorpos possuem Enzimas que reagem com substratos

Produzindo compostos fluorescentes que sero visualizados no leitor dePlacas ELISA


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Ensaio Imunoadsorvente Ligado Enzima - ELISA

substrato (incolor)

Ac marcados com Enzimas + + = COR

Microrg

Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase


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Leitora de placas ELISA


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- A presena do PATGENO detectada pela ligao umanticorpo marcado com um composto flourescente;

TCNICA DE IMUNOFLUORESCNCIA

- Observao em microscpio de fluorescncia

- Usado amplamente para a deteco presuntiva deSalmonellas;

-Resultados falso positivos devido a reaes com outrasbactrias.


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SONDAS DE DNA

1) Os microrganismos so fixados em um suporte slido(membrana de celulose, nitrocelulose ou acetato decelulose) ou em soluo lquida;

-segmentos de DNA de fita simples DO PATGENO DEINTERESSE, capazes de reconhecer e formar hbridos comfitas complementares de DNA OU RNA.

-As sondas so marcadas radioativamente ou colorimtricas.

2) Os microrganismos so tratados para expor seu DNA eseparar em duas fitas simples;

MTODOS GENTICOS


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3) O suporte colocado na soluo que contm a sondagentica;

4) Aps a lavagem, os filtros so revelados por auto-radiografia ou tcnicas colorimtricas;

Identificao de patognicos com Listeria, Salmonella,S aureus, E. coli enterotoxignica)

Limite de deteco 106 a 107 clulas.

C/ 108 clulas resultado em 10 a 12 horas.


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REAO DE POLIMERASE EM CADEIA (PCR) identificaode microrganismos em alimentosPermite a multiplicao de um fragmento

de DNA em milhes de cpias em poucashoras atravs da ao da enzima DNA polimerase;

MTODOS GENTICOS

ETAPAS

-Desnaturao do DNA em fita simples a 95 C por 1 min;

-Ligao dos oligonucleotdeos iniciadores a 37 C por 2 min;

-Polimerizao com formao de fita complementar a 72 C por3 min;

-Permite 105 a 106 cpias de cada fragmento do DNA original


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A amplificao do nmero de cpias de DNA do microgpermite que os testes de hibridizao sejam feitos com maioreficincia;

Vrios microg. Importantes em alimentos tem sido estudadospor esta tcnica.


41

Equipamento para PCR


42

Amplificao de DNA


43

Cada ciclo envolve as seguintes etapas:

- Desnaturao do DNA e separao da fita simples, feita a 95 C por 1 min;

-Ligao dos primers a 37 C por 2 min;

-Polimerizao com formao de fita complementar feita a 72 C por 2min;


44

Visualizao de bandas de DNA marcadas com sondasRadioativas em gel de agarose


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Anlise comparativa entre microbiologia convencional,ELISA e PCR para deteco de Salmonella enteritidis,S. typhimurium, S. gallinarum e S. pullorum emcarne de frango contaminada artificialmente

Elci Lotar Dickel, Laura Beatriz Rodrigues,Luciana Ruschel dos Santos, Stella de Faria Valle, Fernando Pilotto,CarlaRodembush, Vera Beatriz Wald,Cludio Wageck Canal, Vladimir Pinheiro do Nascimento. R. bras. Ci. Vet., v. 12, n. 1/3, p. 5-10, jan./dez. 2005

foram coletadas 30 carcaas de frango em matadourode Inspeo Federal. As carcaas foram analisadas - negativas para Salmonella

Contaminao artificial dos microrganismos

A metodologia utilizada para o isolamento de Salmonella sp.foi baseada na Portaria no 08 de 23/1/1995 mtodo convencional

A tcnica de ensaio imunoenzimtico (ELISA) foi realizadaconforme a indicao do fabricante do kit (SalmonellaImunoensaio Visual (SALVIA)- TECRA).


46

Para a realizao da PCR, o DNA foi extradoatravs do protocolo de tratamento trmicoOs ciclos constaram de uma desnaturao inicial de 94C por 1 minuto, seguida por 30 ciclos de desnaturao (93C/1 minuto), anelamento (50C/ 30 segundos) e extenso (72C/1 minuto), com uma extenso final de 72C por cinco minutos.

As amostras de DNA foram visualizadas por eletroforese sobre luz ultravioleta.


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Tabela 1 Resultados obtidos na recuperao de Salmonella, atravs da Microbiologia Convencional (MC), ELISA e PCR, em carnes de frango contaminadas artificialmente. De 300 amostras

Parmetros MC ELISA PCRPositivos 170a 213b 225bPorcentagem (%) 56,6 71 75


48

Tabela 2 Resultados obtidos na deteco de Salmonellatyphimurium (ST), S. enteritidis (SE), S. gallinarum (SG) e S. pullorum (SP), pelo microbiolgico convencional (MC), ELISA e PCR, em amostras de carne de frango contaminada artificialmente.

Tcnicas ST SE SP SG(n=75) (n=75) (n=75) (n=75)

(MC 64 53 19 34ELISA 72 71 24 46PCR 71 66 39 49

O mtodo PCR foi mais eficaz


49

Exemplos de Aplicaes da tcnica PCR:

-Pode detectar de 1 a 5 colnias de E. coli em 100 mL de gua;

-Deteco de 1 a 10 colnias de L. monocytogenes;

-Deteco de Vibrio vulnificus em ostras, em 24 horas, quantidades Inferiores a 102 UFC/g


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CONSIDERAES FINAIS

A Escolha da metodologia a ser adotada depende :

Preciso pretendida;

Custo/tempo da anlise;

Simplicidade;

Treinamento do analista;

Disponibilidade de meios e reagentes;

Assistncia tcnica do fabricante

PR REQUISITO: MICROBIOLOGISTA TREINADO SEMPRE!


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Temas de cada aluno

- Tcnica de filtrao em membranas de grade hidrofbica- Beatriz

-Reidratao de filmes secos- Bianca

-Mtodo Simplate- laila

-Mtodos fsico CITOMETRIA DE FLUXO- erick

-Mtodo cromognico- fernanda

-Mtodo fluorognico- lary

-- Imunocaptura- alane

-Imunoenzimtico Elisa- yara

-- PCR - manuela


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Microbiologia aplicada ao desenvolvimento de produto novo de

interesse para a indstria de alimentos

Ou aplicao de microbiologia preditiva

PROJETO TERICO PRTICO GRUPO 3 ALUNOS

-INTRODUO-OBJETIVO-METODOLOGIA-PRODUTO ESPERADO-REFERNCIAS


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