LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA: Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección

Juan Carlos Montero Rubio

Instituto de Ciencias de la Salud

Consejería de Sanidad de Castilla-La Mancha

Laboratorio de Salud Pública:

Presentación de Experiencias

con Métodos Rápidos de

Detección


Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección


Ecología:

• Abundante su presencia en biocapas – Sistemas acuáticos antropogenicos.

• Relación con protozoos como comensal o parásito.

• Viven en su interior y se reproducen en muchas ocasiones.

• Protectores de agresiones externas.

• Importante papel en la amplificación y propagación de la Legionella (Rowbotham TJ 1980, Baranree JM 1986).

• Aparente relación con su capacidad patogénica (Breiman RF 1990, Cirillo JD 1994, Byrne B & Swanson MS 1998).

• La Legionella coloniza pero no se reproduce en la biocapa (Donlan RM 2005, Murga R, 2001)

Rowbotham TJ 1980




RD 2210/95, 28 diciembre, incluye la legionelosis como EDO.

R.D. 865/03 por el que se establecen criterios higiénico sanitarios para la prevención y control de la legionelosis.

• Instalaciones con mayor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella:

• Instalaciones con menor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella:

Almacenamiento. Siembra.

Concentración. Incubación.

Descontaminación. Confirmación

Análisis realizado según la norma ISO 11731, 1998. Water quality

- detection and enumeration of Legionella. UNE-ISO 11731, 2007.




Inconvenientes recuento en placa.

(ISO 11731, 1998).

• Crecimiento lento: resultados más allá de un semana.

• Enmascaramiento debido a la microbiota acompañante.

• Posibles células viables y no cultivables.

• Recuento de colonias de muy distinta procedencia. 1 Vacuola

(103 bacterias) -1 UFC (Berk SG, 1998)







Francisco Javier Castro

LRSP Comunidad de Madrid

Inhibición de Legionella por otros Microorganismos

Cotuk, A. et al., 2005;

Amin A. et al., 2013;

Giao M.S. et al., 2011

En ocasiones, la microbiota

acompañante puede inhibir el

crecimiento de Legionella. Ejemplo

especies del género Aeromonas o

Pseudomona.

La presencia de algunos

microorganismos en la muestra no

desciende la viabilidad de

Legionella pero sí su cultivabilidad.




Confirmación (ISO 11731)

Morfología característica.

“Las colonias de Legionella son

frecuentemente de color blanco, gris, azul

o púrpura, pero también pueden ser de

color marrón, rosa, verde-amarillento o

rojo intenso”

Punto 9.2.6. UNE-ISO 11731:2007

"Crecimiento excesivo de microorganismos que

dificulta la posible detección de Legionella en la

muestra analizada. "




PCR a tiempo real.

Fundamento del método.

• Multiplica (amplifica) pequeñas cantidades de ADN cientos de miles o millones de veces por la acción de la enzima ADN polimerasa.

• La amplificación se realiza en un termociclador, aparato capaz de calentar y enfriar rápidamente las muestras.

• La amplificación se mide al detectar la fluorescencia emitida por un fluoróforo excitado.




qPCR

Reacción en cadena de la Polimerasa. ISO/TS 12869:2012 (Water quality –

Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by

concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction

(qPCR).

General testing conditions Expression of the results Technical protocol for the characterization and the validation of the method

Procedure Test report Quality controls

Concentration

DNA extraction

DNA amplification

Quantitative detection




Inconvenientes PCR Tiempo Real.

• La legislación solo admite ISO (ISO 11731, 1998).

Distintas unidades.

Falta de exactitud del método de referencia

• No disponibilidad de la bacteria para estudios

posteriores.

• Imposibilidad de diferenciar células vivas y muertas.

• Posible presencia de inhibidores de la reacción.




Estudios que en los últimos 10 años han

comparado resultados de qPCR y Cultivo: 28

En todos los casos los resultados por qPCR es

mayor que en cultivo. Solo en un caso salen

resultados equivalentes.

Sumando los resultados obtenidos en todos los

estudios:

• PCR: 2.856/3.967 (72%)

• Cultivo: 1.331/3.967 (34%)

Whiley H & Taylor M, 2014




Señala las ventajas de el análisis

mediante PCR:

- Resultados más rápidos.

- Mayor detección (brotes)

- Posibilidad de generar resultados

específicos de L. pneumophila

Parece razonable obtener unos valores

de referencia para PCR.

Estos se deben obtener a través del

análisis de la comparación de los

resultados de ambos métodos, en una

misma serie de muestras.

ANSES, 2009




Lee JV et al, 2011

Estudio Multicéntrico

7 laboratorios de 6 países.

Cada laboratorio al menos 6 sistemas por

ambos métodos, durante al menos 6

semanas

Objetivo:

Definir el umbral de acción de la PCR en

tiempo real para el seguimiento de la

legionela en los diferentes tipos de sistemas

de agua




232 muestras de torres de refrigeración.

Legionella pneumophila Δ=0,71 (log)

Legionella sp Δ=2,03 (log)

506 muestras da agua sanitaria caliente y fría

Legionella pneumophila Δ=0,62 (log)

Legionella sp Δ=1,05 (log)

RESULTADOS




•Presencia de microorganismos dañados, moribundos o muertos que no son

capaces de crecer en un medio artificial pero todavía contiene ADN y pueden

ser detectado por la PCR

•Perdida de microorganismos a lo largo del proceso de cultivo: concentración

filtración, resuspensión, tto. ácido y calor, medio selectivo con antibióticos.

•Inhibición por otros microorganismos presentes

•En poblaciones muy activas y en crecimiento: genoma dividido, pero no división

celular.

•Peores resultados para Legionella spp pues el método fue diseñado originalmente

para Legionella pneumophila

•PCR. Reacciones cruzadas con otros especies no aisladas o descritas. NF T90-461:

validada 36 cepas de Legionella spp de varias especies y 17 especies no Legionella

spp del mismo ecosistema

Motivos de No Equivalencia




Enzimoinmunoensayo combinado con una retención magnética del

microorganismo diana.

Cuantificación mediante método colorimétrico.

Resultado en U.F.C




1) Captura sólo de Legionella. Especificidad

• Elimina la competencia en crecimiento en placa.

• Elimina la confusión con la morfología.

• La captura depende de lo dañada que esté la célula: células viables no

sean cultivables

2) Las células capturadas se marcan con una enzima que produce un

color. Procedimiento identificación sencillo.

CEIA (captura magnética e inmunoensayo)

Limitaciones:

• Bacteria no disponible para posteriores estudios.

• Se desconocen otras por el momento.




Comparar efectividad y eficiencia de los métodos rápidos de

detección y recuento de Legionella spp frente al método de la

norma ISO 11731, 1998. (Water quality - detection and

enumeration of Legionella. UNE-ISO 11731, 2007) para tener

elementos objetivos que permitan tomar decisiones respecto a su

implantación en un laboratorio de salud pública.

Objetivo




Se realizó un experimento con 20 muestras de 250 mL cada una, desglosadas de la siguiente manera:

Un control negativo.

Una muestra con 102 UFC de Legionella spp. (Bioréference, Eurofins, France).

Seis muestras con 103 UFC de Legionella spp. más un conjunto de microbiota interferente conocida, divididas en dos bloques.

3 muestras adicionadas con Mix 1: P. aeruginosa, E. faecalis y E. coli.

3 muestras adicionadas con Mix 2: P. aeruginosa y Hongo.

Seis concentrados de muestras ambientales procedentes de torres de refrigeración positivas (MA1, MA2, MA3, MA4, MA5, MA6).

Las seis muestras anteriores adicionadas con 103 UFC de Legionella spp.

Metodología (Madrid)




Identificación SIM log UFC +/- Cultivo log UFC +/-

CN ND - ND -

L. spp (102) 3.37 + 3.52 +

L. spp (103) + MIX 1 2.45 + ND -

L. spp (103) + MIX 1 3.15 + ND -

L. spp (103) + MIX 1 3.51 + ND -

L. spp (103) + MIX 2 3.26 + 3.00 +

L. spp (103) + MIX 2 3.67 + 3.48 +

L. spp (103) + MIX 2 3.67 + NA +

MA1 0.37 - ND -

MA2 2.68 + ND -

MA3 2.57 + ND -

MA4 3.32 + 4.36 +

MA5 2.57 + ND -

MA6 1.98 + 3.04 +

L. spp (103) + MA1 2.86 + 2.54 +

L. spp (103) + MA2 2.94 + 3.60 +

L. spp (103) + MA3 3.08 + 3.00 +

L. spp (103) + MA4 2.57 + 3.30 +

L. spp (103) + MA5 3.01 + 3.58 +

L. spp (103) + MA6 3.21 + 3.40 +

Tabla 3.- Resultados del experimento Cultivo – SIM realizado en la Comunidad de Madrid.




Separación Inmunomagnética

Cultivo

Positivo Negativo Total

Positivo 13 1 14

Negativo 5 1 6

Total 18 2 20

Resultados (Madrid)

Tabla 4.- Tabla de contingencia relacionando positivos – negativos de cultivo en placa y SIM.





Cultivo

Acción Alerta Satisfactorio

Total ≥ 104 UFC l -1 ≥ 103 UFC l -1 < 103 UFC l -1

Acción ≥ 104 UFC l -1 0 1 0 1

Alerta ≥ 103 UFC l -1 0 6 3 9

Satisfactorio < 103 UFC l -1 0 4 6 10

Total 0 11 9 20

Resultados (Madrid)

Tabla 4.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de acción de cultivo en

placa y SIM.




Primer estudio:

14 muestras inoculadas con Legionella spp. (Bioréference, Eurofins, France).

Niveles de dopaje realizados:

5 muestras 104

5 muestras 103

4 muestras 102

4 muestras naturales provenientes de torres de refrigeración.

Estas 18 muestras de 2 litros se procesaron por PCR y Separación Inmunomagnética (1L + 1L).

Metodología (Castilla - La Mancha)




Metodología (Castilla - La Mancha)

Segundo estudio:

65 muestras naturales provenientes de diferentes equipos e instalaciones para analizar la máxima variabilidad de los métodos.

Agua sanitaria (caliente y fría)

Torres de refrigeración

Nebulizadores

Balnearios

Estas muestras, también de 2 litros, se concentraron mediante filtración en 20 mL, de los cuales se utilizaron:

10 mL para PCR

9 mL para Separación inmunomagnética

1 mL restante para cultivo en placa (sin tratamiento)




Resultados (Castilla - La Mancha)


Acción Alerta Satisfactorio Total

Legionella

spp Sanitaria Torres

≥104

UFC/vol

≥103

UFC/vol <103 UFC/vol

Acción ≥105

UG/vol

≥106

UG/vol 10 2 0 12

qPCR Alerta ≥104

UG/vol

≥105

UG/vol 0 2 1 3

Satisfactorio < 104

UG/vol

< 105

UG/vol 1 5 62 68

Total 11 9 2 74/83 (89%)

Tabla 5.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de actuación de

qPCR y SIM.







Legionella

spp ≥104 CFU l-1 ≥103 CFU l-1 <103 CFU l-1

Acción ≥104 CFU l-1 0 0 0 0

Cultivo Alerta ≥103 CFU l-1 0 2 1 3

Satisfactori

o <103 CFU l-1 1 2 59 62

Total 1 4 60 61/65 (94%)


cultivo en placa y SIM.





qPCR


Sanitaria ≥105 UG/vol ≥104 UG/vol < 104 UG/vol

Legionella

spp Torres ≥106 GU l-1 ≥105 GU l-1 < 105 GU l-1

Acción ≥104 CFU l-1 0 0 0 0

Cultivo Alerta ≥103 CFU l-1 0 0 3 3

Satisfactorio <103 CFU l-1 0 1 61 62

Total 0 1 64 61/65 (94%)


cultivo en placa y qPCR.




Conclusiones Los resultados de los métodos analizados presentan un porcentaje de

coincidencia frente a nivel de actuación cercano al 90%.

Los métodos alternativos utilizados muestran ser tanto o más efectivos para la detección de Legionella spp. en muestras de rutina que el método de referencia.

• La elección de uno u otro se debe motivar en otro tipo de elementos tales como coste, objetivos del análisis, disponibilidad de medios y personal o el tipo de muestras gestionadas en el laboratorio.

Frente a muestras muy sucias el método que peor respuesta presenta es el cultivo en placa, debido principalmente a la presencia de microbiota interferente.

En el caso de qPCR, esta suciedad puede provocar inhibiciones en la detección, debido a sustancias presentes en la muestra.

SIM y qPCR presentan el inconveniente de no disponer finalmente de la bacteria para estudios posteriores. Importante en brotes.




Health & Medicine

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