Metody badań Metody badań toksyczności toksyczności

substancji substancji chemicznychchemicznych

Ustalanie ADI, badania Ustalanie ADI, badania epidemiologiczneepidemiologiczne

Toksykologia żywnościToksykologia żywności Przedmiotem badań i oceny Przedmiotem badań i oceny

toksykologicznej są:toksykologicznej są: substancje naturalnie występujące substancje naturalnie występujące

w żywności w żywności substancje stanowiące substancje stanowiące

zanieczyszczenia żywności zanieczyszczenia żywności substancje lub ich mieszaniny substancje lub ich mieszaniny

dodawane do żywności w określonym dodawane do żywności w określonym celu (dodatki do żywności)celu (dodatki do żywności)

Badania toksykologiczneBadania toksykologiczne Dotyczą zazwyczaj działania Dotyczą zazwyczaj działania

określonego związku, rzadziej określonego związku, rzadziej mieszaniny substancji znanych i mieszaniny substancji znanych i bardzo rzadko mieszaniny o bardzo rzadko mieszaniny o nieznanym składzienieznanym składzie

Badania wykonuje się na kilku Badania wykonuje się na kilku gatunkach zwierzątgatunkach zwierząt

Zwierzęta doświadczalneZwierzęta doświadczalneSą to najczęściej:Są to najczęściej: Myszy białeMyszy białe Szczury białeSzczury białe ChomikiChomiki Świnki morskieŚwinki morskie Króliki Króliki Psy Psy Do oceny działania mutagennegoDo oceny działania mutagennego Używa sięUżywa się bakterii i drożdżybakterii i drożdży

Badania toksykologiczne- Badania toksykologiczne- znaczenie paszy znaczenie paszy

Dieta syntetyczna o stałym składzieDieta syntetyczna o stałym składzie Dieta półsyntetyczna – składająca się Dieta półsyntetyczna – składająca się

tylko częściowo z czystych związków tylko częściowo z czystych związków chemicznych (węglowodany, chemicznych (węglowodany, aminokwasy, witaminy, składniki aminokwasy, witaminy, składniki mineralne) oraz z oczyszczonych mineralne) oraz z oczyszczonych składników naturalnych (skrobia, składników naturalnych (skrobia, cukier, kazeina)cukier, kazeina)

Podawanie paszy i wodyPodawanie paszy i wody Najczęściej stosuje się podawanie Najczęściej stosuje się podawanie

paszy i wody paszy i wody ad libitum ad libitum z z jednoczesną kontrolą spożyciajednoczesną kontrolą spożycia

Substancje badane podaje się w Substancje badane podaje się w paszy, zgłębnikiem dożołądkowo paszy, zgłębnikiem dożołądkowo (rzadko) lub w wodzie do picia(rzadko) lub w wodzie do picia

Przy badaniu wpływu metali na Przy badaniu wpływu metali na organizm woda powinna być organizm woda powinna być dejonizowanadejonizowana

Badaniom powinny Badaniom powinny podlegaćpodlegać

Związki pochodzenia naturalnego lub Związki pochodzenia naturalnego lub ich mieszaninyich mieszaniny

Związki otrzymane na drodze syntezy Związki otrzymane na drodze syntezy chemicznej lub ich mieszaninychemicznej lub ich mieszaniny

Związki lub ich mieszaniny otrzymane Związki lub ich mieszaniny otrzymane na drodze syntezy biologicznej, np. na drodze syntezy biologicznej, np. preparaty enzymatycznepreparaty enzymatyczne

Nowe środki spożywcze lub Nowe środki spożywcze lub preparaty, np. białkowe, tłuszczowe, preparaty, np. białkowe, tłuszczowe, ich substytuty dodawane do żywnościich substytuty dodawane do żywności

Zakres badań Zakres badań toksykologicznychtoksykologicznych

Toksyczność ostra, podostra i przewlekłaToksyczność ostra, podostra i przewlekła Działanie rakotwórczeDziałanie rakotwórcze Działanie mutagenneDziałanie mutagenne Działanie teratogenne i embriotoksyczneDziałanie teratogenne i embriotoksyczne Wpływ na płodność i rozrodczośćWpływ na płodność i rozrodczość MetabolizmMetabolizm Synergizm i antagonizmSynergizm i antagonizm Działanie drażniące oka i skóryDziałanie drażniące oka i skóry Działanie alergiczneDziałanie alergiczne

Zasady badań Zasady badań toksykologicznychtoksykologicznych

Do doświadczeń używa się zwierząt Do doświadczeń używa się zwierząt zdrowych, znanego szczepu i ze zdrowych, znanego szczepu i ze znanej hodowli; są to zwierzęta obu znanej hodowli; są to zwierzęta obu płci, młode, karmione bez ograniczeń płci, młode, karmione bez ograniczeń paszą pełnowartościową paszą pełnowartościową zapewniającą prawidłowy wzrost i zapewniającą prawidłowy wzrost i rozmnażanierozmnażanie

Toksyczność ostraToksyczność ostra To działanieTo działanie toksyczne wywołane toksyczne wywołane

podaniem badanej substancji w podaniem badanej substancji w dawce pojedynczej lub w kilku dawce pojedynczej lub w kilku dawkach w ciągu 24 hdawkach w ciągu 24 h

Jej jednostką jest medialna DLJej jednostką jest medialna DL50 50

wyrażona w mg/kg m. c. wyrażona w mg/kg m. c. zwierzęciazwierzęcia

Toksyczność ostraToksyczność ostra Jej badanie przeprowadza się Jej badanie przeprowadza się

przynajmniej na 3 gatunkach przynajmniej na 3 gatunkach zwierząt, młodych, o zbliżonej masie zwierząt, młodych, o zbliżonej masie ciała np. szczury ok. 200gciała np. szczury ok. 200g

Substancję podaje się Substancję podaje się per os per os w kilku w kilku różnych dawkachróżnych dawkach, , obserwuje się obserwuje się zwierzęta przez określony czas zwierzęta przez określony czas

(co najmniej 14 dni) i liczy zwierzęta, (co najmniej 14 dni) i liczy zwierzęta, które padły w każdej grupie które padły w każdej grupie

Toksyczność ostraToksyczność ostra Obserwacje powinny obejmować: Obserwacje powinny obejmować:

początek wystąpienia, charakter i początek wystąpienia, charakter i czas trwania objawów toksycznych czas trwania objawów toksycznych

Powinny dotyczyć: ośrodkowego i Powinny dotyczyć: ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, obwodowego układu nerwowego, oddechowego, sercowo-oddechowego, sercowo-naczyniowego, pokarmowego, naczyniowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, wyglądu moczowo-płciowego, wyglądu skóry, błon śluzowych i oczuskóry, błon śluzowych i oczu

Toksyczność ostraToksyczność ostra Kilka dni przed podaniem badanej Kilka dni przed podaniem badanej

substancji i do czasu zakończenia substancji i do czasu zakończenia obserwacji kontroluje się masę ciała obserwacji kontroluje się masę ciała początkową i końcową oraz spożycie początkową i końcową oraz spożycie paszypaszy

Wykonuje się sekcję zwierząt Wykonuje się sekcję zwierząt padłych i uśpionych po zakończeniu padłych i uśpionych po zakończeniu doświadczenia oraz badania makro- i doświadczenia oraz badania makro- i mikroskopowe narządówmikroskopowe narządów

Toksyczność Toksyczność podprzewlekłapodprzewlekła

Jej badanie wykonuje się na 2 Jej badanie wykonuje się na 2 gatunkach zwierząt (1 to najczęściej gatunkach zwierząt (1 to najczęściej szczury, a drugi nie powinien być szczury, a drugi nie powinien być gryzoniem)gryzoniem)

Czas trwania doświadczenia wynosi Czas trwania doświadczenia wynosi zwykle ok. 1/10 normalnego okresu zwykle ok. 1/10 normalnego okresu życia zwierząt (szczury, myszy – 90 życia zwierząt (szczury, myszy – 90 dni, świnie – 1 rok)dni, świnie – 1 rok)

Używa się młodych zwierząt (np. Używa się młodych zwierząt (np. szczury 4-5 tyg. o masie ok. 50-60 g)szczury 4-5 tyg. o masie ok. 50-60 g)

Toksyczność Toksyczność podprzewlekłapodprzewlekła

Badaną substancję podaje się w Badaną substancję podaje się w paszy w 3-4 różnych dawkachpaszy w 3-4 różnych dawkach

Dawki powinny być tak dobrane Dawki powinny być tak dobrane aby jedna stanowiła poziom aby jedna stanowiła poziom NOAELNOAEL a druga a druga LOAELLOAEL

Wielkość dawek ustala się w Wielkość dawek ustala się w badaniach pilotażowych badaniach pilotażowych trwających ok. 4 tyg.trwających ok. 4 tyg.

Toksyczność Toksyczność podprzewlekłapodprzewlekła

Zakres badań obejmujeZakres badań obejmujeBadania ogólneBadania ogólne:: wygląd i ogólny stan zdrowia, wygląd i ogólny stan zdrowia,

zachowanie zwierzątzachowanie zwierząt śmiertelność (ustalenie przyczyn)śmiertelność (ustalenie przyczyn) codzienne spożycie paszy i wodycodzienne spożycie paszy i wody przyrost masy ciała przyrost masy ciała

Toksyczność Toksyczność podprzewlekłapodprzewlekła

Badania hematologiczne:Badania hematologiczne: hematokrythematokryt zawartość hemoglobinyzawartość hemoglobiny liczba krwinek czerwonych, liczba krwinek czerwonych,

białych i płytek krwi białych i płytek krwi czas protrombinowyczas protrombinowy

Toksyczność Toksyczność podprzewlekłapodprzewlekła

Badania biochemiczne:Badania biochemiczne: W surowicyW surowicy: m.in. białko, glukozę, azot : m.in. białko, glukozę, azot

mocznikowy, TG, cholesterol, mocznikowy, TG, cholesterol, elektrolity, enzymy- ALAT, ASPAT, APelektrolity, enzymy- ALAT, ASPAT, AP

W wątrobieW wątrobie: białko, enzymy- ALAT, : białko, enzymy- ALAT, ASPAT, AP i wiele innychASPAT, AP i wiele innych

Badanie moczu Badanie moczu oraz badania oraz badania hematologiczne i biochemiczne hematologiczne i biochemiczne wykonuje się po 2, 4 i 12 tyg. wykonuje się po 2, 4 i 12 tyg. równolegle w grupach badanych i równolegle w grupach badanych i kontrolnychkontrolnych

Toksyczność Toksyczność podprzewlekłapodprzewlekła

Badanie oczu Badanie oczu – na początku i na – na początku i na końcukońcu

Sekcja zwierzątSekcja zwierząt padłych i padłych i uśpionych po zakończeniu uśpionych po zakończeniu doświadczenia –doświadczenia – należy zważyć należy zważyć wszystkie narządy i wykonać wszystkie narządy i wykonać

Badanie histopatologiczneBadanie histopatologiczne – co – co najmniej 20-22 narządów i tkaneknajmniej 20-22 narządów i tkanek

Toksyczność przewlekłaToksyczność przewlekła Dobór zwierząt jak w Dobór zwierząt jak w

toksyczności podostrejtoksyczności podostrej Czas trwania doświadczenia – Czas trwania doświadczenia –

praktycznie cały okres życia praktycznie cały okres życia zwierząt, np. dla szczurów – ok. 2 zwierząt, np. dla szczurów – ok. 2 lata, myszy – 1,5 roku, świń – 5-7 lata, myszy – 1,5 roku, świń – 5-7 latlat

Toksyczność przewlekłaToksyczność przewlekła

Substancję badaną podaje się w Substancję badaną podaje się w paszypaszy w różnych dawkach w różnych dawkach ustalonych wcześniej w ustalonych wcześniej w badaniach toksyczności badaniach toksyczności podprzewlekłej, tak aby można podprzewlekłej, tak aby można było wyznaczyć poziomy:było wyznaczyć poziomy:

NOAEL i LOAELNOAEL i LOAEL

Toksyczność przewlekłaToksyczność przewlekła ObserwacjeObserwacje zwierząt, badania krwi, zwierząt, badania krwi,

wątroby i moczu – tak jak w badaniu wątroby i moczu – tak jak w badaniu toksyczności podostrejtoksyczności podostrej

po 6, 12, 18 i 24 miesiącach (dla po 6, 12, 18 i 24 miesiącach (dla gryzoni)gryzoni)

Badania histopatologiczne – w Badania histopatologiczne – w zależności od wyników badań zależności od wyników badań toksyczności podostrej mogą być toksyczności podostrej mogą być poszerzone o inne narządy (aortę, poszerzone o inne narządy (aortę, oko, język, grasicę, ślinianki i inne)oko, język, grasicę, ślinianki i inne)

Badanie rakotwórczościBadanie rakotwórczości ZwierzętaZwierzęta: myszy i szczury : myszy i szczury

młode, jak w teście młode, jak w teście podprzewlekłym, pochodzące od podprzewlekłym, pochodzące od rodziców otrzymujących przez rodziców otrzymujących przez ok. 2 miesiące przed kojarzeniem ok. 2 miesiące przed kojarzeniem paszę z dodatkiem badanej paszę z dodatkiem badanej substancji w odpowiednich substancji w odpowiednich dawkachdawkach

Badanie rakotwórczościBadanie rakotwórczościGrupy zwierzątGrupy zwierząt:: KontrolnaKontrolna Otrzymująca dawkę maksymalną Otrzymująca dawkę maksymalną

– – Otrzymująca 1/3 dawki Otrzymująca 1/3 dawki

maksymalnejmaksymalnej Otrzymująca 1/9 dawki Otrzymująca 1/9 dawki

maksymalnejmaksymalnej

Badanie rakotwórczościBadanie rakotwórczościLiczba zwierzątLiczba zwierząt 100 szczurów (po 50 każdej płci) 100 szczurów (po 50 każdej płci)

dla każdego poziomu dawkidla każdego poziomu dawki 100 myszy (po 50 każdej płci) dla 100 myszy (po 50 każdej płci) dla

każdego poziomu dawkikażdego poziomu dawkiCzas podawania substancji w paszyCzas podawania substancji w paszy Szczury – 2 lataSzczury – 2 lata Myszy – 1,5 rokuMyszy – 1,5 roku Psy, świnie – 5-7 latPsy, świnie – 5-7 lat

Badanie rakotwórczościBadanie rakotwórczościObserwacjeObserwacje:: Spożycie paszy, wody i masa ciała – jak Spożycie paszy, wody i masa ciała – jak

w toksyczności przewlekłejw toksyczności przewlekłej Stan zwierząt – każdego dnia, dzień Stan zwierząt – każdego dnia, dzień

śmierci zwierząt padłych i jej przyczynę śmierci zwierząt padłych i jej przyczynę na podstawie sekcjina podstawie sekcji

Na końcu – sekcja pozostałych zwierząt Na końcu – sekcja pozostałych zwierząt i badania makroskopowe, waży się: i badania makroskopowe, waży się: wątrobę, nerki, śledzionę, nadnercza, wątrobę, nerki, śledzionę, nadnercza, węzły chłonne, tarczycę, jajniki, mózg, węzły chłonne, tarczycę, jajniki, mózg, przysadkę, jądra, płuca, pęcherzprzysadkę, jądra, płuca, pęcherz

Badanie rakotwórczościBadanie rakotwórczości Wykonuje się rozmaz krwi i Wykonuje się rozmaz krwi i

szpikuszpiku Badana mikroskopowe 7 Badana mikroskopowe 7

pierwszych narządów ale bada pierwszych narządów ale bada się także te narządy, w których się także te narządy, w których obserwowano zmiany w czasie obserwowano zmiany w czasie sekcjisekcji

Badanie rakotwórczościBadanie rakotwórczościInterpretacjaInterpretacja:: Oparta jest na liczbie się guzów i Oparta jest na liczbie się guzów i

czasie ich pojawienia się w tych czasie ich pojawienia się w tych samych narządach zwierząt samych narządach zwierząt badanych i kontrolnych oraz badanych i kontrolnych oraz czasie przeżycia zwierzątczasie przeżycia zwierząt

Uwzględnia się guzy złośliwe i Uwzględnia się guzy złośliwe i niezłośliweniezłośliwe

Badanie zdolności Badanie zdolności rozrodczej i wpływu na rozrodczej i wpływu na

potomstwopotomstwo Ma na celu zbadanie możliwego Ma na celu zbadanie możliwego

wpływu badanej substancji na wpływu badanej substancji na płodność i laktację oraz pozwala płodność i laktację oraz pozwala na zaobserwowanie zmian na zaobserwowanie zmian genetycznychgenetycznych

Grupy zwierząt i dawkiGrupy zwierząt i dawki – jak przy – jak przy toksyczności przewlekłej toksyczności przewlekłej

Badanie zdolności Badanie zdolności rozrodczej i wpływu na rozrodczej i wpływu na

potomstwopotomstwoObserwacje:Obserwacje: % zapłodnienia% zapłodnienia Okres ciąży (krótszy, dłuższy)Okres ciąży (krótszy, dłuższy) Liczba młodych w każdym miocieLiczba młodych w każdym miocie Masa ciała młodychMasa ciała młodych Śmiertelność noworodkówŚmiertelność noworodków Odchylenia od stanu prawidłowego w Odchylenia od stanu prawidłowego w

4, 12 i 21 dniu życia4, 12 i 21 dniu życia Badania histopatologiczne narządów Badania histopatologiczne narządów

od 10 samic i 10 samców z każdej od 10 samic i 10 samców z każdej grupygrupy

Badanie teratogennościBadanie teratogenności ZwierzętaZwierzęta:: Szczury, chomiki, króliki (zalecane Szczury, chomiki, króliki (zalecane

samice po raz pierwszy zapładniane), samice po raz pierwszy zapładniane), po 20 zwierząt dla każdej dawkipo 20 zwierząt dla każdej dawki

Młode, zdrowe, dojrzałe fizycznie i Młode, zdrowe, dojrzałe fizycznie i płciowopłciowo

Badaną substancję podaje się w Badaną substancję podaje się w paszy ciężarnym samicom w okresie paszy ciężarnym samicom w okresie organogenezy (szczury – 6-15 dzień organogenezy (szczury – 6-15 dzień ciąży, chomiki – 6-10 dzień, króliki ciąży, chomiki – 6-10 dzień, króliki dzień- 6-18)dzień- 6-18)

Badanie teratogennościBadanie teratogenności Dawkowanie substancji zależy Dawkowanie substancji zależy

od szybkości jej wydalania z od szybkości jej wydalania z organizmu oraz jej działania organizmu oraz jej działania embrio- i cytotoksycznegoembrio- i cytotoksycznego

Badanie teratogennościBadanie teratogenności Wymagane są co najmniej 3 Wymagane są co najmniej 3

poziomy dawek, np.poziomy dawek, np. Grupa kontrolnaGrupa kontrolna Grupa otrzymująca dawkę małą – Grupa otrzymująca dawkę małą –

1/250 DL1/250 DL5050

Grupa otrzymująca dawkę Grupa otrzymująca dawkę pośrednią – 1/100 DLpośrednią – 1/100 DL5050

Grupa otrzymująca dawkę dużą – Grupa otrzymująca dawkę dużą – 1/50 DL1/50 DL5050

Badanie teratogennościBadanie teratogennościObserwacje:Obserwacje: Spożycie paszy i wody oraz Spożycie paszy i wody oraz

kontrola masy ciała w określonych kontrola masy ciała w określonych dla danego zwierzęcia dniach dla danego zwierzęcia dniach ciążyciąży

Płody wyjmuje się przez cesarskie Płody wyjmuje się przez cesarskie cięcie u szczurów na 1 dzień przed cięcie u szczurów na 1 dzień przed porodem, u królików – 2 dniporodem, u królików – 2 dni

Badanie teratogennościBadanie teratogennościOcenia się:Ocenia się: Liczbę płodów po prawej i lewej stronie Liczbę płodów po prawej i lewej stronie

macicymacicy LiczbęLiczbę resorpcjiresorpcji Liczbę ciałek żółtychLiczbę ciałek żółtych Masę płodów z łożyskiem i bezMasę płodów z łożyskiem i bez Długość płodu z ogonem, długość Długość płodu z ogonem, długość

ogonaogona PłećPłeć Deformacje makroskopoweDeformacje makroskopowe Deformacje szkieletuDeformacje szkieletu Liczbę krwiakówLiczbę krwiaków

Badanie teratogennościBadanie teratogenności U 20% samic w grupie nie U 20% samic w grupie nie

wykonuje się cesarskiego cięcia wykonuje się cesarskiego cięcia Płody normalnie urodzone Płody normalnie urodzone

obserwuje się przez 2-3 miesiące obserwuje się przez 2-3 miesiące aby wychwycić wady pojawiające aby wychwycić wady pojawiające się w czasie rozwojusię w czasie rozwoju

Wybrane losowo zwierzęta kojarzy Wybrane losowo zwierzęta kojarzy się w celu otrzymania II generacjisię w celu otrzymania II generacji

Młode tej generacji usypia się po Młode tej generacji usypia się po 21 dniach i bada ich rozwój21 dniach i bada ich rozwój

Badanie mutagennościBadanie mutagenności Działanie mutagenne jest ściśle Działanie mutagenne jest ściśle

związane z działaniem związane z działaniem rakotwórczymrakotwórczym

Ok. 90% związków Ok. 90% związków rakotwórczych wykazuje rakotwórczych wykazuje działanie mutagenne w prostych działanie mutagenne w prostych testach bakteryjnych testach bakteryjnych

Badanie mutagennościBadanie mutagenności Stosuje się testy bakteryjne AmesaStosuje się testy bakteryjne Amesa Pozwalają wykryć mutacje Pozwalają wykryć mutacje

punktowe:punktowe: mikrojąderkowy – umożliwia mikrojąderkowy – umożliwia

wykrycie uszkodzeń w wykrycie uszkodzeń w chromosomachchromosomach

test reperacji DNAtest reperacji DNA

Badanie działania Badanie działania alergicznego- alergicznego-

kontaktowegokontaktowego Testy na zwierzętachTesty na zwierzętach Badania z udziałem ludzi – testy Badania z udziałem ludzi – testy

w klinikach dermatologicznychw klinikach dermatologicznych

Dotyczą kosmetyków i środków Dotyczą kosmetyków i środków piorących piorących

Ekstrapolacja wyników Ekstrapolacja wyników badańbadań

Biorąc pod uwagę wyniki wszystkich Biorąc pod uwagę wyniki wszystkich badań na zwierzętach oraz ustaloną badań na zwierzętach oraz ustaloną w badaniach toksyczności w badaniach toksyczności przewlekłej dawkę przewlekłej dawkę NOAEL NOAEL – ustala – ustala się dawkę się dawkę ADIADI dla człowieka dla człowieka

ADI = NOAEL : 100 ADI = NOAEL : 100 (najczęściej ale (najczęściej ale może to być także :10 lub :1000)może to być także :10 lub :1000)

Badania Badania epidemiologiczneepidemiologiczne

Kiedy wiadomo, że zanieczyszczenie Kiedy wiadomo, że zanieczyszczenie wnikające do organizmu ma potencjalne wnikające do organizmu ma potencjalne właściwości rakotwórcze jest możliwe:właściwości rakotwórcze jest możliwe:

Retrospektywne badanie epidemiologiczne Retrospektywne badanie epidemiologiczne jeżeli wykaże ono zależność między jeżeli wykaże ono zależność między

ekspozycją na czynnik rakotwórczy i ekspozycją na czynnik rakotwórczy i zachorowalnością oraz śmiertelnością – zachorowalnością oraz śmiertelnością – czynnik może zostać uznany za rakotwórczy czynnik może zostać uznany za rakotwórczy dla ludzidla ludzi