R O C Z N IK I G LEBO ZN A W C ZE , T. X IX , z. 2, W A R SZ A W A 1968

Prace metodyczne

ALICJA STRZELCZYK

METODY BADANIA GRZYBÓW GLEBOWYCH

Polskie Towarzystwo Gleboznawcze, Komisja Biologii Przewodniczący — prof. dr J. Gołębiowska

WSTĘP

Grzyby stanow ią obok bakterii ważną grupę drobnoustrojów roz­w ijających się w glebie. Ich grzybnia przenika grudki gleby w formie strzępek tworząc w wolnych przestrzeniach pomiędzy nimi olbrzym ie ilości zarodników. W odróżnieniu od grzybni rozw ijającej się w glebie i aktyw nie uczestniczącej w jej przem ianach biochem icznych zarodniki grzybów są form am i nieaktyw nym i o bardzo słabej przem ianie m aterii.

W glebie w ystępują licznie przedstaw iciele następujących klas grzy­bów: Phycomycetes (glonowce), Ascomycetes (workowce), Basidiomycetes (podstawczaki) oraz Fungi imperfecti (grzyby niedoskonałe). Więcej niż połowę ogólnej liczby grzybów rozw ijających się w glebie stanow ią przedstaw iciele grzybów niedoskonałych [5, 7], wśród których najczęściej spotykane są gatunki należące do rodzajów: Pénicillium, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium i inne. Rozw ijają się one szybko i z łatwością zarodnikują. Szybko rosnące grzyby opanowują łatw iej środowisko w pły­w ając często ograniczająco na rodzaje o słabym tem pie w zrostu przez konkurencję pokarm ową lub przez w ytw arzanie toksycznych produktów przem iany m aterii. Przedm iotem zainteresow ania mikrobiologów są głównie te grzyby, k tóre aktyw nie przeprow adzają procesy biochemiczne w glebie, niezależnie od ich zdolności do zarodnikowania. W yodrębnianie aktyw nych form grzybów (strzępek) z gleby jest trudne i wym aga zasto­sowania specjalnych metod. Trudność stanow i tu również uzyskanie inform acji dotyczących system atycznego zróżnicowania grzybów zasie­dlających badaną glebę (np. w yodrębnianie podstawczaków obok grzybów niedoskonałych).

406 A. Strzelczyk

Opisane w niniejszej pracy m etody należą do najczęściej stosowanych przez mikrobiologów i mikologów. O bejm ują one technikę w yodrębniania i oznaczania grzybów rozw ijających się w glebie i zasiedlających korzenie roślin oraz m etody hodowli, pom iaru w zrostu grzybów, obserwacje orga­nów rozm nażania oraz przechowyw ania czystych ku ltu r grzybów.

I. POBIERANIE PRÓBEK GLEBY DO BADAŃ MIKOLOGICZNYCH [17]

W y k o n a n i e . Odkażoną łopatką zdejm uje się górną, ok. 3-centy- m etrową, w arstw ę gleby i m etalow ym pierścieniem w ycina się słupek gleby odpowiedniej wysokości (ok. 15 cm). W braku odpowiedniego cylindra można pobrać glebę łopatką w yjałow ioną z głębokości 3-15 cm. W celu otrzym ania średniej próbki pobiera się z jednego m iejsca po 5 pró­bek gleby i miesza dokładnie w jałow ym naczyniu lub w w orku p lasti­kowym. Do badań bierze się ok. 50 g takiej gleby. W celu uzyskania możliwie dokładnego zespołu m ikoflory określonego pola należy pobrać z niego ok. 5 średnich próbek. Próbki gleby przechowuje się w chłodnym miejscu. Analizę mikrobiologiczną takiej gleby należy przeprowadzać w możliwie najkró tszym czasie po jej pobraniu. W ten sposób pobrane próbki gleby można analizować jedynie m etodą rozcieńczeniową. P rzy stosowaniu innych m etod badania gleba nie powinna być m ieszana, gdyż zabieg ten niszczy jej pierw otną struk tu rę .

II. METODY OKREŚLANIA LICZEBNOŚCI GRZYBÓW W GLEBIE

1. R O ZC IEŃ C ZE N IO W Ą M ETO DA PŁ Y T K O W A [17]

W y k o n a n i e . Glebę przesiew a się przez sito w celu usunięcia z niej zanieczyszczeń w postaci kam ieni, w iększych resztek roślinnych itp. 10-gramową próbkę gleby umieszcza się w 90 m l jałowej wody destylo­wanej i w ytrząsa silnie przez 5 m inut. Tę zawiesinę trak tu je się jako rozcieńczenie 1 : 10. Z niej przygotow uje się dalsze rozcieńczenie prze­nosząc po 10 ml takiej zawiesiny do 90 m l jałowej wody. Po przygoto­w aniu każdego następnego rozcieńczenia w ytrząsa się otrzym aną zawie­sinę przez 1 min. Po otrzym aniu odpowiedniego rozcieńczenia końcowego, którego wielkość należy uprzednio ustalić doświadczalnie dla każdej gleby oddzielnie, przenosi się jednom ililitrow ą porcję do płytek Petriego i zalewa rozpuszczonym, przestudzonym agarem glikozowo-peptonowym M artina [17, 34] lub pożywkę OAES [19]. Hodowlę pozostawia się w tem ­

Metody badania grzybów glebowych 407

peraturze 20-25°C do czasu pojaw ienia się kolonii. Za najodpow iedniejsze rozcieńczenie gleby należy uznać to, w k tórym rozw ija się średnio 25 ko­lonii grzybów na płytce. O trzym ane w yniki przelicza się najczęściej na 1 g suchej m asy gleby. W yrosłe na p łytkach kolonie odszczepia się na skos z agarem glikozowo-ziem niaczanym [40].

Opisana m etoda jest powszechnie stosowana do oznaczania ogólnej liczebności bakterii i promieniowców w glebie. Stosowana jest również do oznaczania liczebności grzybów, chociaż w tym przypadku ma nieco mniejsze zastosowanie. M etoda ta pozwala bowiem na oznaczanie przede wszystkim grzybów szybko rosnących i łatwo zarodnikujących. Pożywka M artina, zaw ierająca róż bengalski i antybiotyki, uznana jest za na j­lepszą przy ilościowym oznaczaniu grzybów tą metodą. Jest również lepsza od innych stosow anych przy w yodrębnianiu grzybów z gleby [17, 21]. Róż bengalski ogranicza wielkość kolonii szybko rosnących grzybów nie przeszkadzając innym . A ntybiotyk ham uje rozwij bakterii i promieniowców. K a u f m a n n i in. [19] poleca pożywkę OAES, na k tórej uzyskali najw iększą ilość kolonii o najw iększej różnorodności rodzajów. Na tej pożywce zostaje nieco w strzym any rozwój grzybów szybko rosnących bez zaham owania tw orzenia zarodników, co czyni ją przydatną do identyfikacji grzybów w yrosłych bezpośrednio na płytkach. Nadto pożywka ta jest bezbarw na w przeciw ieństw ie do pożywki M artina zabarwionej różem bengalskim.

2. M ET O D A PŁ Y T E K GLEBO W YCH W A R C U PA (THE SO IL P L A T E S ) [52]

W y k o n a n i e . N iewielką ilość gleby przenosi się aseptycznie do szalek Petriego. Ilość gleby zależy od jej zasobności w grzyby i dlatego należy ją doświadczalnie ustalić (0,005-0,15 g). Glebę w szalkach zalewa się 8-10 ml przestudzonej pożywki agarowej (agar Czapek-Doxa z dodat­kiem 0,05Vo wyciągu drożdżowego, zakwaszony do pH 4,0 kwasem fosfo­rowym [17]). P ły tk i inkubuje się w tem peraturze 20-25°C.

Przytoczona m etoda jest szeroko stosowana w badaniach ekologicznych nad rozmieszczeniem różnych grup grzybów w glebie. Bezpośrednie umieszczenie gleby w płytce zapew nia wzrost grzybów zasiedlających większe cząstki m ineralne i organiczne gleby (humus), które w metodzie rozcieńczeń zostają pom inięte w skutek opadania ich na dno naczynia z zawiesiną. Nadto m asy zarodników m ają tu prawdopodobnie większą szansę zachowania swego naturalnego układu pozostając nie rozbite. Tą m etodą udaje się w yodrębnić większą ilość rodzajów grzybów w porów­naniu z m etodą rozcieńczeniową. W arcup w ykazał, że wiele wyhodow a­nych tą m etodą grzybów pochodzi z cząstek hum usu.

408 A. Strzelczyk

3. M O D Y FIK A C JA M ETODY W A R C U PA [18, 29, 30, 31]

W y k o n a n i e . Z 6 miejsc badanego pola pobiera się ok. 100 g próbki gleby z głębokości 3-15 cm do jałow ych kolbek. Po przeniesieniu do p ra ­cowni miesza się je dokładnie razem. M ałą ilość gleby przenosi się na­stępnie do p ły tk i i miesza ruchem rotacyjnym , aby najdrobniejsze cząstki gleby osadziły się na dnie. 1 g tej najdrobniejszej frakcji miesza się następnie w moździerzu z niew ielką ilością jałowego, drobnego piasku kwarcowego, odsypanego z 74 g porcji. W przypadku gleby mało próchni- cznej należy mieszać krótko i łagodnie. Glebę silnie próchniczną rozciera się ok. 2 min. Po uzyskaniu bezgrudkowej m ieszaniny przenosi się ją do kolby z resztą piasku. W ten sposób uzyskuje się proporcję gleby do piasku równo 1 : 74. Glebę z piaskiem miesza się łagodnie obracając na­czynie lub tocząc je po stole przez 10 min. Porcję ok. 30 m m 3 tej m ie­szaniny przenosi się do płytek i zalewa przestudzoną pożywką (agar M artina z dodatkiem 0,5% wyciągu glebowego). Inkubuje się w 21-23°C.

M a ń k a i współpracownicy stosowali tę m etodę do gleb zaw ierają­cych bogatą m akroflorę.

III. METODY BEZPOŚREDNIEGO BADANIA MIKOFLORY GLEBOWEJ

1. M ETO DA SZ K IEŁ E K K O N TA K TO W Y CH C H O Ł O D N Y -R O SSI [1]

W y k o n a n i e . Szkiełka przedm iotowe umieszcza się bezpośrednio w glebie. Po upływie 1, 2 i 3 tygodni w yjm uje się je ostrożnie z gleby, usuwa większe grudki gleby przez opłukanie ich lekkim strum ieniem wody lub zanurzając w naczyniu z wodą. Szkiełka suszy się, następnie utrw ala w słabym płomieniu, barw i erytrozyną przez 5-6 m in i m ikro­skopuje.

2. M O D Y FIK A C JA M ETODY C H O Ł O D N Y -R O SSI W ED ŁU G ZIEM IĘCK IEJ [55]

W y k o n a n i e . Szkiełka przedm iotowe powleka się roztw orem bada­nego substra tu (np. glikozy, skrobi, peptonu itp.) i umieszcza w glebie. W określonych odstępach czasu w yjm uje się szkiełka z gleby, u trw ala i barw i jak wyżej. W ten sposób można badać metabiozę (następczy rozwój) drobnoustrojów .

Metody przygotowania szlifów glebowych do obserw acji drobno­ustrojów w struk tu ra lnej (nie naruszonej) glebie, utw ardzonej agarem lub żywicą syntetyczną, znaleźć można w pracach K u b i e n y [22], H a r - l o v a i W e i s s - F o g h a [13], A l e x a n d r a i N i c h o l a s a [6].

Metody badania grzybów glebowych 409

IV. METODA IZOLOWANIA GRZYBÓW Z GLEBY

1. IZO LO W A N IE Z PŁ Y T E K AGARO W YCH

Najczęściej stosow anym sposobem wyodrębniania" grzybów z gleby jest odszczepianie kolonii w yrosłych na p łytkach agarow ych (przygotowanych m etodam i II.1-II.3) na skosy z uniw ersalną pożywką (najczęściej agar glikozowo-ziem niaczany lub pożywka z wyciągiem słodowym).

2. M ETO D A B EZ P O ŚR E D N IE G O SZ C Z E P IE N IA G LEBĄ (DIRECT IN O C U L A T IO N ) [17, 51]

W y k o n a n i e . G rudkę gleby ok. 1 cm średnicy przenosi się jałowo na środek płytki z zestaloną pożywką agarową (agar glikozowo-ziem nia­czany lub pożywka M artina). P ły tk i inkubuje się w 20-22°C przez 24 godz. Po tym czasie odszczepia się grzybnię w yrasta jącą z grudki gleby.

M etoda ta pozwala na wyodrębnienie grzybów przerastających glebę w postaci grzybni. Czas hodowli jest tu krótki, aby w ystarczył na w y­tworzenie z zarodników obecnych w glebie grzybni widocznej gołym okiem. P rzy jm uje się więc, że uzyskane grzyby pochodzą ze strzępek, a nie z zarodników grzyba.

3. M ETODA PŁ Y T E K PE R FO R O W A N Y C H (SCR EEN ED IM M ERSIO N PL A T E S) [49]

Jest to m odyfikacja m etody opisanej w punkcie III. 2.W y k o n a n i e . Szkiełko przedm iotowe w w ym iarach 10,5X4,0 cm

umieszcza się w ściśle pasującym płytkim pudełeczku z pleksiglasu (rys. 1). W ierzch pudełeczka zakryw a się p ły tką z pleksiglasu o grubości 1 mm, w której znajdu ją się 2 rzędy po 5 otworów o średnicy 5 mm. Po w yjałow ieniu urządzenie to umieszcza się w dużej alum iniowej płytce i zalewa w odnym agarem (2% agaru). Agar nalewa się przez jeden z otwo­rów w perforow anej płytce zw racając uwagę, aby ta p ły tka nie zetknęła się z w arstw ą agaru. Po zakrzepnięciu agaru perforow aną p łytkę za­m ienia się drugą płytką, a otwory zabezpiecza przed infekcją zakryw ając dużym jałow ym nakryw kow ym szkiełkiem. Całe urządzenie przenosi się V/ płytce na pole. Tam w yjałow ionym nożem w ykonuje się odkrywki, do których przytw ierdza się szalki wraz z całym urządzeniem . Uprzednio usuwa się z powierzchni szkiełko zakryw ające otwory. Zależnie od celu pracy serię p ły tek perforow anych umieszcza się w płaszczyźnie pionowej lub poziomej profilu glebowego. Należy uważać, aby szkiełka nie były przetrzym yw ane zbyt długo w glebie, gdyż strzępki w yrastające z gleby

410 A. Strzelczyk

do agaru przez pory w płytce z pleksiglasu mogą przerastać się naw zajem tworząc kolonie mieszane lub w zajem nie się hamować. Po w yjęciu p łytek z gleby szkiełka przedm iotowe umieszcza się (agarem w dół) pod m ikro­skopem na m etalow ym statyw ie. Zaobserwowane strzępki grzyba od- szczepia się na świeżą pożywkę.

Rys. 1. Płytka perforowana, widziana z góry oraz z boku wraz z pudełeczkiem, według John­

sona [17]a — o tw o r y w p ły tce , b — p ły tk a p e r fo r o w a n a , c — w a r ste w k a agaru , cl — szk ie łk o p r z ed m io to w e , e — p u ­

d e łec zk o

Screen immersion plate seen from top and side according to Johnson [17]

a — p e r fo r a tio n in scr een , b — scre en , с — agar film , d — s lid e , e — b o x

T h r o n t o n [50] podał m odyfikację tej metody. Perforow ana p łytka jest w niej zastąpiona wieczkiem przykryw ającym pudełeczko ze szkieł­kiem przedm iotowym . Średnica otworów wynosi w nim ok. 0,3 cm.

4. M ETO D A R U R EK PE R FO R O W A N Y C H (THE IM M ERSIO N T U BE ) [9, 10, 17]

W y k o n a n i e . W glebie w yw ierca się otwór za pomocą odpowiedniej długości korkobora. Na m iejsce usuniętej gleby umieszcza się perforow aną ru rk ę z pożywką (rys. 2). Grzyby w rasta ją do pożywki przez otwory. Rurkę perforow aną przygotow uje się z grubościennej probówki, k tórej dno

Rys. 2. Rurka perforowana do jałowienia, według Johnsona [17] a — k o rk i z w a ty , b — p ro b ó w k a do w y ja ła w ia n ia , с — k a p tu re k s z k la ­n y , d — rurka p er fo ro w a n a , e — p ro b ó w k a o ch r o n n a , / — k a p lla ry , g — p o ży w k a a garow a , h — p o d k ła d k a z w a ty , i — w p u k lo n a k ap ilara ,

w id o czn a z b ok u

Immersion tube prepared to sterilisation according to Johnson[17]

a — c o tto n p lu g s, b — s te r il isa t io n tu b e , с — g la ss h o od , d — p e r fo r a te d tu b e, e — ja c k e t tu b e , / — in v a g in a te d c a p illa r ie s , g — agar m ed iu m ,

h — c o tto n bed , i — in v a g in a te d c a p illa r y s e e n fr o m s id e

wyciąga się nad płomieniem, aby pow stał szpiczasty koniec. Jednocześnie z dolnej połowy ru rk i wyciąga się 4-6 kapilar wzdłuż spiralnej linii obiegającej probówkę. Te kapilary skręca się, rozgrzewa i za pomocą nawoskowanej igły w pukla do w ew nątrz (rys. 2, F, i). Ostre końce tych kapilar, w nikające w św iatło ru rk i, spiłowuje się tak, aby średnica otwo­

Metody badania grzybów glebowych 411

rów w kapilarach wynosiła ok. 1,5 mm. K apilary nie pow inny zbyt głę­boko wnikać w światło ru rk i. Dolną część ru rk i, zaopatrzoną w kapilary , umieszcza się w niskiej probówce ochronnej o nieco większej średnicy (rys. 2, E). Od góry ru rk a zam knięta jest korkiem i zakry ta szklanym kapturkiem , k tó ry w w arunkach polowych m a chronić korek przed zamoknięciem. Całość umieszcza się w grubej probówce i zam yka kor­kiem z w aty. W tej probówce ru rkę perforow aną poddaje się w yjało­wieniu. Następnie napełnia się ją pożywką agarową do wysokości 1 cm nad najw yżej położony otwór. Agaryzowana pożywka napełnia ru rkę i przez otw ory przedostaje się do probówki ochronnej. Po napełnieniu pożywką całość jałowi się ponownie. Gdy w yjałow iona pożywka zakrzepnie, ru rkę w yjm uje się z probówki ochronnej i usuwa się w yjałow ioną igłą resztki na zew nątrz zakrzepniętego agaru. Pow ierzchnię przeciera się alkoholem i umieszcza w jałow ej probówce. W takim stanie kom plet ru rek przenosi się na pole i po w yjęciu z probówek umieszcza w otw orach wyw ierconych w glebie. R urki pozostawia się w glebie przez 7 dni. W tym czasie grzyb­nia z gleby przerasta do pożywki przez kapilarne otwory. Po w yjęciu ru rek z gleby do ich w nętrza w prowadza się m etalow y korkobor (0,6 cm średnicy) i w ycina słupek agaru z ru rk i. Słupek ten w ypycha się jałową bagietką z korkoboru zaznaczając położenie najw yższej i najniższej kapi­lary. N astępnie taki słupek dzieli się na 4 różne części i każdą z nich przenosi do jałowej płytki. Z kolei cząstki te tnie się na 4 równoległe krążki, które umieszcza się przy brzegach płytki. Na środek p ły tk i nalew a się ostrożnie przestudzoną pożywkę agarową, k tó ra otacza krążki agarowe i zastyga. Rozw ijające się po paru dniach kolonie grzybów odszczepia się i porów nuje z grzybam i w yrosłym i z krążków um ieszczonych w sąsiedz­tw ie poszczególnych otworów w rurce.

M etoda ta pozwala na uzyskanie inform acji w zespołach grzybów prze­rasta jących glebę w form ie aktyw nej grzybni. M odyfikację tej m etody podają: M u e l l e r i D u r r e l l [37] oraz M а с - W h i t h e y [24].

M etodą pozw alającą na wyodrębnienie z gleby grzybów należących do rzędu Oomycetes opisują M a ń k a i K o w a l s k i [32], M i l l e r [35] oraz E t c h e l l s i inni [11] podając m etody w yodrębniania drożdży, a W а г с u p [54] — metodę w yodrębniania podstawczaków z gleby.

5. IZO L O W A N IE ST R Z ĘP EK G R Z Y B N I Z G LEBY

a. Metoda Warcupa [55]

W y k o n a n i e . G rudkę gleby 1,0-1,5 g umieszcza się w wodzie do nasycenia. Po 4-5 m in rozbija się ją silnym strum ieniem wody wodocią­gowej. Całość pozostawia się na 1-1,5 m in w celu opadnięcia większych

412 A. Strzelczyk

cząstek. Zawiesinę wylewa się pozostawiając osad, k tóry przepłukuje się tak długo, dopóki woda ponad nim nie stanie się zupełnie klarowna. Osad składający się z szybko opadających cząstek przenosi się następnie z od­robiną wody do trzech jałow ych płytek. W nich pod m ikroskopem w y­najdu je się poszczególne kaw ałki grzybni i delikatnie przenosi do kropli wody umieszczonej w innej jałowej płytce. Strzępki obrastające cząstki m ineralne lub cząstki hum usu pow inny być starannie wypreparow ane. Skupienia strzępek należy rozdzielić na pojedyncze fragm enty, gdyż prze­ważnie składają się one z wielu gatunków grzybów. 20-50 fragm entów strzępek umieszcza się na jednej szalce, po czym zalewa 10-13 ml prze­studzonej agarowej pożywki. Po zestawieniu agaru ogląda się odwróconą płytkę pod m ikroskopem i zaznacza m iejsca rozmieszczenia fragm entów grzybni. Codziennie przeprowadza się obserwacje wzrostu. Z wyrosłej grzybni obcina się końce strzępek i wraz z bloczkiem agaru przenosi na świeżą pożywkę. Odszczepia się tylko kolonie w yrastające z grzybni, a nie z zarodników. Kolonie w yrastające z zarodników lub z bogatych w nie szczątków hum usu należy usunąć, gdyż mogą zagłuszyć rozwój powoli rosnących lub nie zarodnikujących grzybów. Począwszy od dzie­siątego dnia obserwacje przeprowadza się co kilka dni. Jako pożywkę poleca się agar Czapek-Doxa, z dodatkiem 0,5%> wyciągu drożdżowego o pH 5,6-5,8, rozcieńczoną 1 : 6 [52].

Opisana m etoda pozwala na uzyskanie rodzajów grzybów glebowych pom ijanych zwykle w w ysiewach innym i metodami. W ykazano bowiem, że w czasie przygotow yw ania wodnej zawiesiny gleby w metodzie roz- cieńczeniowej, jak również w badaniach grzybów glebowych innym i m etodami wiele grzybów nie udaje się w ykryć, gdyż pozostają w osadzie.

b. Metoda pasków z folii nylonowej [12]

Stosuje się wąskie paski oddzielone od siebie tak, aby strzępka okre­ślonego grzyba mogła rozw ijać się wzdłuż jednego tylko paska.

W y k o n a n i e . W prostokącie z folii nylonowej w ycina się paseczki o szerokości 1 mm pozostawiając je połączone na jednym jego boku. Paseczki te w m iejscu połączenia przylepia się do szkiełka przedm ioto­wego, a końce ich umocowuje przylepcem na drugim końcu szkiełka (ułatw ia to w yprostow anie i zagrzebanie pasków w glebie). Paski na szkiełku jałowi się alkoholem i umieszcza w glebie, podobnie jak w m e­todzie Chołodny-Rossi-Ziem ięckiej. Pozostawia się je w glebie przez okres jednego tygodnia. Po w yjęciu z gleby szkiełko wraz z paskam i płucze się jałową wodą, paski odcina w yjałow ioną żyletką i układa na płytkach z pożywką, stroną eksponowaną do góry. Część pasków pozo­

Metody badania grzybów glebowych 413

staw ia się do dokładnej kontroli m ikroskopowej. W razie zbyt silnego w zrostu grzybów na paskach tnie się je w poprzek przed wyłożeniem na pożywkę. N astępnie p ły tk i odwraca się i pod m ikroskopem przy po­większeniu 100-krotnym zaznacza się położenie strzępek grzybów. Ob­serw acje w zrostu kolonii przeprowadza się codziennie przez 3-4 dni od- szczepiając cienką igiełką pojaw iające się kolonie. Izolaty oczyszcza się na świeżej pożywce.

G a m s izolował tą m etodą wiele rodzajów grzybów glebowych, m.in. Fusarium, Pénicillium, Mortierella, grzyby nie owocujące — Mycelia ste- rilia oraz podstawczaki.

c. Wyodrębnianie strzępek celulolitycznych [12]

W y k o n a n i e . W ilgotne paski celofanowe ok. 1 cm szerokości n a ­kłada się na szkiełka, suszy i końce przytw ierdza przylepcem . W ycina się z nich żyletką paseczki szerokości 1 mm. Jałow i się w alkoholu i umieszcza w glebie. Czas pozostawania ich w glebie należy ustalić do­świadczalnie. Pow inien on być dłuższy niż w metodzie pasków nylono­wych z uwagi na to, że celofan jako pożywka ma działać selekcjonująco na m ikroflorę sprzyjając rozwojowi grzybów celulolitycznych. Po w y­jęciu z gleby paski spłukuje się jałow ą wodą i oczyszcza jałow ym pędzel­kiem. Ma to na celu ułatw ienie obserwacji i izolowania grzybów. W pływa zaś w bardzo nieznacznym stopniu na skład jakościowy i ilościowy w y­odrębnianych grzybów. Paski układa się następnie na selektyw nym pod­łożu dla grzybów błonnikow ych z karboksym etylocelulozą (np. agar Czapeka z dodatkiem 1ю/о karboksym etylocelulozy lub rozdrobnionej bibuły filtracy jnej W hatm an 1) [8, 16].

V. BADANIE GRZYBÓW ZASIEDLAJĄCYCH KORZENIE ROŚLIN

1. PR Z Y G O T O W A N IE PR Ó B E K K O R ZENI DO B A D A Ń

W y k o n a n i e . Rośliny w ykopuje się z całym system em korzenio­wym, otrząsa je z przylegającej gleby i w yjałow ioną żyletką lub nożycz­kam i obcina cienkie, nie zdrew niałe korzenie. W przypadku roślin o grubych zdrew niałych korzeniach (np. rośliny drzew iaste lub lucer­na) do badań przeznacza się korzenie boczne, nie zdrew niałe, grubości do 3 mm.

13 R oczn ika G leb o zn a w cze T. X IX , z. 2

414 A. Strzelczyk

2. O Z N A C Z A N IE L IC Z E BN O ŚC I G RZYBÓ W W R IZ O SFE R ZE R O ŚL IN [44]

W y k o n a n i e . Około 10 g korzeni umieszcza się w jałowej wodzie (90 ml) w w ytarow anej butelce i w ytrząsa przez 5 m in (rozcieńczenie 10“ 1). Z tej zawiesiny przygotow uje się wyższe rozcieńczenie w ytrząsając silnie każdorazowo następne rozcieńczenie przez 1 m in w w ytarow anej butelce. Po uzyskaniu odpowiedniego rozcieńczenia końcowego (rzędu 10~4-1 0 ” 6) dozuje się w 1 m l porcję zawiesiny gleby rizosferowej na p ły tk i i zalewa przestudzoną pożywką M artina.

Korzenie pozostałe na dnie pierwszej butelk i (10-1) opłukuje się do­kładnie i odrzuca. Pozostałą w butelkach glebę z rozcieńczenia 10-1 i 10-2 łączy się i odparowuje. Pozostałość suszy się w 105°C. O trzym ane w yniki przelicza się na 1 g suchej m asy gleby rizosferowej.

3. IZO LO W A N IE G RZYBÓ W Z R IZ O SFE R Y R O ŚL IN

a. Metoda

M etoda ta podana przez H a r l e y ’ a i W a i d a [14] została wielo­krotnie zm odyfikowana. Z najduje jednakże szerokie zastosowanie w ba­daniach nad składem gatunkow ym grzybów zasiedlających rizosferę roślin [31, 39, 47]. Poniżej podaje się m odyfikację M ańki [31].

W y k o n a n i e . Przygotow uje się serię dziewięciu 200-m ililitrow ych kolb zaw ierających po 70 ml jałowej wody. O statnia z serii zawiera oprócz wody 30 g jałowego drobnego piasku. W ytrząsa się 1 g korzeni kolejno po 2 m in w serii kolb z wodą. Po jednej kropli zawiesiny uzyska­nej w każdej kąpieli korzeni nakrap la się na p ły tk i z pożywką M artina i rozprowadza po płytce za pomocą szklanej szpachelki. Po 6 dniach hodowli w tem peraturze 23°C kolonie grzybów wyrosłe na powierzchni odszczepia się i oznacza.

M etoda ta może mieć zastosowanie przy ilościowym oznaczaniu grzy­bów zasiedlających rizosferę.

W celu w yodrębnienia grzybów z powierzchni korzeni (rizoplana) w ypłukane w 9-krotnej kąpieli korzenie (jak wyżej) osusza się w w arun ­kach jałowych, tnie na fragm enty długości 5 mm i umieszcza na p ły t­kach z pożywką H a g e n - M e l i n [31] lub na agarze M artina. Inkubacja trw a 6 dni w tem peraturze 23°C. Potem odszczepia się i identyfikuje wyrosłe grzyby.

Metody badania grzybów glebowych 415

b. M odyfikacja wg Parkinsona [17, 38]

W y k o n a n i e . Pozbawione gleby (przez otrząśnięcie) korzenie (jak w punkcie 1) przenosi się do jałowej p ły tk i i przez w strząsanie nią od­dziela się najdrobniejsze części gleby rizosferowej, przylegającej do ko­rzeni. Porcje gleby o ciężarze 0,005-0,01 g przenosi się do następnych jałow ych płytek i rozkrusza igłą. Na tę glebę nalew a się 8-10 m l ostu­dzonej pożywki agarowej i dokładnie miesza. W yrosłe grzyby przesiewa się na skosy agarowe (np. agar glikozowo-ziemniaczany).

c. Izolowanie grzybów z powierzchni korzeni (rizoplana) [39, 47]

W ykonanie. Rośliny w ykopuje się ostrożnie nie naruszając syste­mu korzeniowego. Korzenie otrząsa się z przylegającej gleby i opłu- kuje w bieżącej wodzie. W ypreparow uje się cienkie nie zdrew niałe korzonki, które tnie się na fragm enty długości 5 cm i umieszcza w 50-mili- litrow ych kolbach Erlenm eyera z 20 ml jałowej wody. W ytrząsa się przez 5 min, dekantuje i 4-krotnie zmienia wodę w ytrząsając za każdym razem przez 1 min. N astępnie korzenie przenosi się do świeżej porcji wody i 4-krotne płukanie pow tarza jeszcze 5 razy. W ypłukane fragm enty ko­rzeni przenosi się na jałową p łytkę i obcina 5-milimetrowe odcinki z obu końców każdego fragm entu. Te odcinki w ykłada się na pożywkę M artina i hoduje w tem peraturze 20-22°C. W yrosłe strzępki przesiewa się na skosy.

d. Izolowanie grzybów z wnętrza korzeni [25, 26, 27, 28]

W y k o n a n i e . Korzenie tnie się na odcinki długości 3 cm, płucze s tarann ie wodą wodociągową i dezynfekuje (alkohol e ty lo w y — 10-15 sek, sublim ât — 30 sek, woda destylow ana i jałow a po 90 sek). Po w yjało­wieniu korzenie tnie się na odcinki 5 m m i w kłada na agar glikozowo- ziem niaczany. Po inkubacji w tem peraturze pokojowej odszczepia się rozw ijające się kolonie na skosy agarowe.

VI. METODY BADANIA INTENSYWNOŚCI WZROSTU GRZYBÓW

M ają one zastosowanie w badaniach nad w pływem różnych czynników na grzyby.

1. PO M IA R PR Z Y R O ST U ŚR E D N IC Y K O L O N II [57]

W y k o n a n i e . P rzygotow uje się zawiesinę zarodnikńw grzybów w półpłynnym agarze w odnym (0,3% agaru). Taką zawiesiną zaszczepia

1 3 *

416 A. Strzelczyk

się p ły tk i z agarem glikozowo-ziem niaczanym um ieszczając kroplę za­wiesiny na środku płytki. W celu uniknięcia rozpryskiw ania się zarod­ników szczepienia dokonuje się przy odwróconej płytce. P ły tk i inkubuje się w tem peraturze 21-25°C dokonując przez 10 dni co 24 godz. pom iarów średnicy kolonii grzyba.

2. O Z N A C Z A N IE PR Z Y R O ST U SU C H EJ M A SY GRZYBÓ W [33, 43, 47]

W y k o n a n i e . P łynną pożywkę dla grzybów w ilości 20 ml rozlewa się do 100-mililitrowych kolbek Erlenm eyera i zaszczepia 0,5 ml wodnej zawiesiny zarodników grzyba. Zawiesinę przygotow uje się z 7-dniowej ku ltu ry grzyba na skosie agarow ym spłukując ją 5 ml jałowej wody. Po 10 dniach hodowli w tem peraturze 20-25°C grzybnię oddziela się od po­żywki na zważonym sączku bibułowym, tkaninie jedw abnej lub sicie0 bardzo drobnych oczkach, przem ywa dokładnie wodą i suszy do stałej wagi w tem peraturze 80°C.

Grzyby rozw ijające się słabo w płynnych pożywkach można hodować na p łytkach agarowych. Po inkubacji p ły tki podgrzewa się w celu roz­puszczenia agaru, następnie odsącza się na bibule i płucze gorącą wodą. Dalsze postępowanie jak wyżej.

VII. BADANIA ZDOLNOŚCI KIEŁKOWANIA ZARODNIKÓW

1. B A D A N IE W PŁY W U A N TA G O N IST Ó W N A K IEŁ K O W A N IE Z A R O D N IK Ó W [42]

W y k o n a n i e . Szczep drobnoustroju antagonistycznego, w yrosły w postaci rysy na płytce, zalewa się 2 ml zawiesiny zarodników badanego grzyba w rozpuszczonym agarze glikozowo-ziemniaczanym. Kiełkowanie zarodników spraw dza się umieszczając p łytki pod m ikroskopem po 1, 31 7 dniach. Po zaobserwowaniu strefy zaham owania wzrostu grzyba w y­cina się skalpelem paski agaru z tych stref. Umieszcza się je następnie na szkiełku przedm iotowym , u trw ala i barw i roztw orem błękitu baw ełnia­nego laktofenolu (2-3 min), następnie się płucze. Spraw dza się pod m ikro­skopem zaham owanie kiełkowania zarodników.

2. B A D A N IE W PŁYW U FU N G IC Y D Ó W N A K IEŁ K O W A N IE ZA R O D N IK Ó W [3, 4, 2*0]

W y k o n a n i e . Na dwóch szkiełkach przedm iotowych umieszcza się po 3 krążki w ykonane z parafiny, o w ew nętrznej średnicy 7 mm. W nich umieszcza się po ok. 0,05 ml roztw oru badanego preparatu , k tóry wysusza

Metody badania grzybów glebowych 417

się w tem peraturze pokojowej. Na suchy osad środka grzybobójczego nanosi się 0,05 ml zawiesiny zarodników. Przygotow uje się ją z 5-dniowej hodowli grzyba spłukując wzrost wodą. Zaleca się przem ycie spłukanych zarodników jałową wodą i odwirowanie. Szkiełka z naniesionym i kroplam i umieszcza się następnie na 24-42 godz. w wilgotnej komorze w 20°C. Po tym czasie oblicza się pod m ikroskopem procent skiełkowanych zarodni­ków, analizując po 50 zarodników w każdym krążku (razem 300 zarod­ników). W yniki w yraża się w procencie zarodników nie w ykiełkow anych oraz w stopniach skuteczności obliczonych w stosunku do kontroli (bez fungicydu). Stopień skuteczności oblicza się wg wzoru:

gdzie:A — ilość zarodników w ykiełkow anych w kom binacji kontrolnej,В — ilość zarodników w ykiełkow anych w kom binacji badanej.

Na podstawie co najm niej 5 stężeń p repara tu w ykreśla się krzyw ą ED (effective dose) i graficznie wyznacza wartość ED50 (dawka ham ująca k ieł­kowanie w 50°/o).

VIII. OTRZYMYWANIE KULTUR Z JEDNEGO ZARODNIKA [41]

1. W y k o n a n i e . 10 m l rozpuszczonej pożywki agarowej szczepi się niew ielką ilością zarodników grzyba i wylewa na płytkę. Reszta pożywki pozostała w probówce służy jako inoculum do zaszczepienia następnej probówki z rozpuszczoną pożywką, k tórą wylewa się również na płytkę. W ten sposób otrzym uje się coraz rzadszą zawiesinę zarodników w po­żywce. Po 24-48 godz. hodowli w ybiera się z p łytek pod lupą lub pod m ałym powiększeniem m ikroskopu 1 w ykiełkow any zarodnik, wycina się go wraz z otaczającym agarem i przenosi na świeżą pożywkę.

2. W y k o n a n i e . Na płytkę z pożywką agarową wylewa się rzadką zawiesinę zarodników grzyba w wodzie. Po paru m inutach nadm iar wody zlewa się. Część zarodników pozostaje przytw ierdzona do powierzchni agaru. Po krótkiej inkubacji wszczepia się pojedyncze zarodniki na p ły tk i ze świeżą pożywką.

L i l l y i B a r n e t t [23] podają łatw y sposób wyizolowania poje­dynczych zarodników z agaru. M ałą igłę do szycia umieszcza się ostrym końcem w uchwycie. Drugi jej koniec zagina się tak, aby mógł być umieszczony równolegle do powierzchni agaru. Uszko zaokrągla się i spiłowuje w ten sposób, aby od strony agaru tworzyło oczko. Na płytce pod m ałym powiększeniem m ikroskopu znajduje się skiełkow any poje­dynczy zarodnik. Igłę umieszcza się nad nim w ten sposób, aby przez

418 A. Strzelczyk

uszko można było widzieć zarodnik. W bija się uszko w agar i wraz z nim przenosi zarodnik na świeżą pożywkę.

3. W y k o n a n i e . Zawiesinę spor w wodzie lub w płynie fizjologicz­nym rozcieńcza się dotąd, dopóki 1 eza nie zawiera 1 zarodnika (sprawdzić pod mikroskopem). N astępnie przenosi się ezą krople zawiesiny na agar spraw dzając pod mikroskopem , gdzie znajdują się pojedyncze zarodniki. M iejsca te zaznacza się na dnie płytki. Po inkubacji kolonię powstałą z 1 zarodnika przeszczepia się na świeżą pożywkę.

4. M etoda Hansena w yodrębniania grzybów o dużych zarodnikach [15]. W y k o n a n i e . Sporządza się zawiesinę spor w rozpuszczonej pożywce agarowej. Wciąga się ją do kapilar o św ietle nieznacznie większym od średnicy zarodników. Pod m ikroskopem w ynajduje się m iejsca w kapi- larach zaw ierające po jednym zarodniku. Te m iejsca w yłam uje się z ka­pilar, jałowi zew nętrznie i przenosi na p ły tk i ze świeżą pożywką.

IX. METODY OBSERWACJI ORGANÓW ROZMNAŻANIA U GRZYBÓW

1. B E Z P O ŚR E D N IA O B SE R W A C JA M IK R O SK O PO W A

Jest to najprostszy i najpow szechniejszy sposób obserwowania orga­nów rozm nażania u grzybów.

W y k o n a n i e . G rzyby hoduje się na pożywkach uniw ersalnych, np. pożywka glikozowo-ziemniaczana, brzęczkowa, pożywka z wyciągu słodowego lub pożywka Czapek-Doxa. Po otrzym aniu obfitego w zrostu (9-12 dni hodowli lub dłużej) do wieczka odwróconej p ły tki w lewa się kilka m ililitrów 5-10-procentowego roztw oru form aliny i jałowi się grzyb przez 10-12 godz. Po tym zabiegu można z hodowli grzyba w ykraw ać wycinki do obserw acji m ikroskopowej. W przypadku grzybów trudno owocujących należy stosować pożywki naturalne, jak pożywka m archw io- wa, fasolowa, śliwkowa i inne.

W pracy z grzybam i należy zwracać baczną uwagę na aseptyczne w arunki pracy, gdyż wszelka nieostrożność, np. preparow anie żywych zarodnikujących hodowli, powoduje rozsiewanie się zarodników w po­w ietrzu, co następnie uniem ożliwia u trzym anie grzybów w czystych hodowlach i grozi zakażeniem pracow ników przez grzyby chorobotwór­cze, w ystępujące w glebie.

2. M IK R O K ULTU R Y

Ten typ hodowli grzybów stosuje się do rodzajów tw orzących małe sporofory. W hodowlach tego typu można również obserwować ak tyw ­ność kiełkowania zarodników.

Metody badania grzybów glebowych 419

W y k o n a n i e . Dwa szkiełka przedm iotowe umieszcza się w płytce na zgiętej tró jkątn ie grubej bagietce. Całość jałowi się w autoklawie. Z pożywki agarowej w ylanej na p łytkę wycina się dwa krążki i przenosi na szkiełka umieszczone w płytce. K rążki zaszczepia się ku ltu rą badanego grzyba i zakryw a w yjałow ionym szkiełkiem nakryw kow ym . Na dno p ły tk i nalew a się kilka m ililitrów jałowego 20-procentowego roztw oru glicerolu, w celu zapew nienia odpowiedniej wilgotności pow ietrza w p ły t­ce. Po kilku dniach inkubacji obserw uje się sporofory w yrastające pod szkiełkiem nakryw kow ym na brzegu krążka agarowego.

3. H O D O W LA N A K W A D R A C IK A C H C ELO FA N O W Y CH [41]

W y k o n a n i e . K w adraciki celofanowe nasyca się rozcieńczoną po­żywką, osusza bibułką i umieszcza w płytce. Jałow i się w bieżącej parze w odnej. 6-8 kw adracików umieszcza się w jałow ej płytce na zwilżonej bibule. K ażdy kw adracik szczepi się w jednym lub kilku m iejscach i inku- buje. K w adraciki w yjm uje się co pewien czas w celu spraw dzenia poja­w iania się ciał owocujących. W celu otrzym ania przejrzystych cienkich kolonii należy używać pożywki rozcieńczonej 10-100-krotnie. W celu obserw acji zdolności kiełkow ania zarodników tą m etodą używa się po­żywek o pełnym składzie.

X. METODA PRZECHOWYWANIA KULTUR

1. PR Z E C H O W Y W A N IE PO D OLEJEM PA R A F IN O W Y M

Jest to najczęściej stosow any sposób przychow yw ania k u ltu r grzybów. W tych w arunkach pozostają one praw ie nie zmienione zachowując ży­wotność przez kilka lat.

W y k o n a n i e . Grzyb hoduje się na krótkim skosie agarowym. Po uzyskaniu dobrego wzrostu i zarodnikow ania hodowlę zalewa się jałow ym olejem parafinow ym (jałowic 30 min przy ciśnieniu 1 at) zanurzając całą hodowlę pod olej.

2. PR ZEC H O W Y W A N IE W JA Ł O W EJ GLEBIE

W y k o n a n i e . Zmieszać 1 część ogrodowej gleby, 1 część grubego piasku, V°/o C aC 03, rozdzielić do probówek, zakorkować w atą, wyjałow ić 30 m in w 1 at. Sprawdzić jałowość gleby na bulionie odżywczym. Za­szczepić ok. 2 m l zawiesiny zarodników. Po ok. 10 dniach inkubacji uszczelnić korki parafiną.

420 A. Strzelczyk

3. PR ZE C H O W Y W A NIE N A Ź D ŹB Ł A C H SŁ O M IA N Y C H

W y k o n a n i e . Umieścić w probówkach źdźbła słomy długości2-3 cm. Dodać 2-3 ml wody, wyjałowić, zaszczepić grzybem. W yhodować go w ciągu ok. 10 dni, dopóki woda na dnie nie wyschnie. Następnie cały korek z w aty wkręcić do probówki, a wylot uszczelnić parafiną.

Podobnie można przechowywać ku ltu ry grzybów na wysuszonych skosach agarowych.

XI. SPIS PODSTAWOWYCH POŻYWEK

A g a r g l i k o z o w o - p e p t o n o w y M a r t i n a [17,34]Agar 20,0 gk h 2p o 4 1,0 gM gS04-7H20 0,5 gpepton 5,0 gglikoza 10,0 gwoda destylow. 1000,0 mlróż bengalski 10,0 m l roztw oru 1 : 300streptom ycyna 30 mcg/mllub aureom ycyna 2 mcg/ml

P r z y g o t o w a n i e . W szystkie składniki, oprócz różu bengalskiego i antybiotyku, rozpuszcza się w wodzie. M ieszaninę ogrzewa się powoli do zagotowania. Odstawia się i dodaje roztw ór różu bengalskiego. Przed w ylaniem pożywki na p łytki dodaje się roztw ór antybiotyku w jałowej wodzie. Ze względu na liczne drobnoustroje streptom ycynoodporne spo­tykane w glebie bardziej polecane jest stosowanie aureom ycyny.

E k s t r a k t g l e b o w y [18]500 g badanej gleby zalać 1500 ml wody. Po 24 godz. zdekantować

i przesączyć przez f iltr bakteriologiczny. Dodawać do pożywki po w y ja­łowieniu, przed w ylaniem na płytki.

A g a r g l i k o z o w o - z i e m n i a c z a n y [17, 40]Agar 17,0 gziem niaki (obrane i po­krojone) 200,0 gglikoza 20,0 gwoda 1000,0 ml

Ziem niaki gotuje się przez 1 godz. lub paru je w autoklaw ie przez 40 min z 500 ml wody. Agar rozpuszcza się w pozostałych 500 ml wody. W yciąg z ziem niaków dekantuje się i sączy łącząc go z rozpuszczonym

Metody badania grzybów glebowych 421

agarem i glikozą. Objętość dopełnia się wodą do 1000 ml. Jałow i się w bieżącej parze przez 3 dni po 30 min.

A g a r C z a p e k - D o x a [17,48]Agar 15,0 gN aN 03 2,0 gk 2h p o 4 1,0 gM gS04-7H20 0,5 gKC1 0,5 gF e S 0 4 • 7H20 0,01 gsacharoza 30,0 gwoda destylow ana 1000,0 ml

Sacharozę dodaje się tuż przed jałowieniem . Można dodać do pożywki 1 g wyciągu drożdżowego.

P o ż y w k a H a g e n - M e l i n [31]Glikoza 20,0 gwyciąg słodowy 5,0 gK H 2P 0 4 1,0 gamon bursztynian 0,5 gM gS04-7H20 0,5 gZ n S 0 4 0,5 m l (1 : 500 roztw. wodnego)cytrynian żelaza 0,5 m l (l°/o roztw. wodnego)w itam ina В 50 mcgagar 15,0 gwoda destylow ana 1000,0 m l

P o ż y w k a n a w y c i ą g u s ł o d o w y m W yciąg słodowy 30,0 g„M alto”agar 17,0 gwoda 1000 ml

P o ż y w k a m a r c h w i o w a z g l i k o z ą [41]100 g m archw i pokrojonej drobno gotuje się 1 godz. w 1 1 wody. Sączy

się, dopełnia wodą do 1 1, dodaje 2%> sacharozy oraz 1,5-2,0% agaru. Jałow ość 20-30 m in przy ciśnieniu 1 at.

Podobnie przygotow uje się pożywkę z fasoli (50 g fasoli na 1 litr wody). Pożyw ka ze śliwek (80 g suszonych śliwek na 1 1 wody) bez dodatku cukru nadaje się do hodowli większości grzybów.

P o ż y w k a OAES (wg przepisu Ohio A gricultural Experim ental S tation) [19]

Glikoza 5,0 gekstrak t drożdżowy 2,0 g

422 A. Strzelczyk

N aN 03 1,0 gM gS04 0,5 gKH2PO4 1,0 gsiarczan streptom ycyny 0,050 gchlorom ycetyna 0,050 goxgall 1,0 gpropionian sodu 1,0 gagar 20,0 gwoda destylow ana 1000 m l

Jałow ic w 3/4 at przez 15 min.R o z t w ó r b ł ę k i t u b a w e ł n i a n e g o w l a k t o f e n o l u [41J

Błękit baw ełniany 0,05 glaktofenol 100,0 ml

L a k t o f e n o l d o u t r w a l a n i a h o d o w l i [41]Fenol 10,0 gkwas m lekowy 10,0 gglicerol 20,0 gwoda destylow ana 10,0 ml

Fenol z wodą ogrzewa się do rozpuszczenia. N astępnie dodaje się kwas m lekowy i glicerol.

LITERATURA

[1] A l l e n O. N.: Experiments in soil bacteriology. Burgess Publ. Co. Minneapolis, 1951.

[2] A l e x a n d e r F. E. S., J a c k s o n R. M.: Preparation of sections for study of soil microorganisms. Soil Zoology, Butterworth Scientific Publications - -London, Acad. Press, New York 1955.

[3] B o r e c k i Z., B u r k o w i c z A.: Badania biologiczne nad fungicydem Ro- datox i jego zastosowaniem w ochronie sadów. Acta Agrobot., XII, 149-173, 1962.

[4] B o r e c k i Z., C z e r w i ń s k a E., E c k s t e i n Z., K o w a l i k R.: Che­miczne środki grzybobójcze-fungicydy, PWRiL, Warszawa 1965.

[5] B u r g e s A.: The soil microflora — its nature and biology. Ecology of soil born plant pathogens-prelude to biological control. Univ. Calif. Press, Ber­keley, Los Angeles 1965.

[6] B u r g e s A., N i c h o l a s D. P.: Use soil sections in studying amount of fungal hyphae in soil. Soil Sei., 92, 25-29.

[7] B u r g e s A.: Microorganisms in the soil. Hutchinson Univ. Library, London 1964.[8] C h a k r a v a r t y Т., В o s е е R. G., B a s u S. N.: Fungi growing in jute

fabrics deteriorating under weather exposure and in storage. Appl. Microbiol., 10, 5, 1962, 441-447.

[9] C h e s t e r s C. G. C.: A method for isolating soil fungi. Trans. Brit. Mycol, Soc., 24, 1940, 352-355.

[10] E t c h e l s J. L., С о s t i 1 o w R. N., В e 11 T. A., D e m a i n A. L.: Appl. Microbiol., 2, 1954, 296-300.

Metody badania grzybów glebowych 423

[11] C h e s t e r s C. G. C.: A contribution to the study of fungi in the soil. Trans. Brit. Mycol. Soc., 30, 1948, 100-117.

[12] G a m s W.: Isolierung von Hyphen aus dem Boden. Sydowie, Annales Myco­logie., II, 13, 1959, 1-6.

[13] H a a r l o v a. W e i s s - F o g h : A microscopical technique for studying the undisturbed texture of soils. Soil Zoology. Butterworth Scientif. Publications, London Acad. Press N. Y., 1955.

[14] H a r l e y J. L., W a i d J. S.: A method of studying active m ycelia on living roots and other surfaces in the soil. Trans. Brit. Mycol. Soc., 38, 1955, 104-119.

[15] H a n s e n H. N.: A simple method of obtaining single spore cultures. Sei. 64, 1926, 384.

[16] H o r t o n J. C., K e e n N. T.: Regulation of induced cellulose synthesis in Pyrenochaeta terrestris Gorntz at al. by utilizable carbon compounds. Can. J. Microbiol., 12, 1966, 209-220.

[17] J o h n s o n F. L., C u r l E. A., B o n d J. H., F r i b o u r g H. A.: Method for studying soil microflora-plant disease relationships. Burgess Publ. Comp., Minneapolis, Minn., 1960.

[18] J o h n s o n F. L., M a ń к a K.: Modification of Warcup’s soil plate method for isolating soil fungi. Soil Sei., 92, 1961, 79-84.

[19] K a u f m a n n D. D., W i l l i a m s L. E., S u m n e r C. В.: The effect of plating medium and incubation temperature on growth of fungi in soil dilution plates. Can. J. Microbiol., 9, 1963, 741-751.

[20] K o o p m a n s M. J.: Fungicide Research. Philips Technical Review, 17 (7-8), 1956, 222-229.

[21] K u l i ń s k a D., M o l s k a I.: Metody inwentaryzacji grzybów glebowych. Post. Mikrobiol., 2, 1962, 245-252.

[22] К u b i e n a W. L.: Micropedology, Iowa 1938.[23] L i l l y V. G., B a r n e 11 H. L.: Fizjologia grzybów. Tłumaczenie, PWRiL,

Warszawa 1959.[24] M a c W r i t h e y H. S.: Another modification of the Chester’s tube method

for exam ination of soil miaroflora. Rept. 36th Ann. Conven. Norwest Ass. Hort. Etomol. and Plant Pathol., 1957.

[25] M a ń k a I.: Badania terenowe i laboratoryjne nad opieńką miodową Armil- laria melles (Vahl.) Quel. Warszawa 1953.

[26] M a ń k a K., T r u s z k o w s k a W.: Próba mykologicznej analizy korzeni świerka Picea excels LK. Acta Soc. Bot. Pol., XVII, 1958, 45-73.

[27] M a ń k a K., G i e r c z a k M.: Badania nad florą grzybową korzeni sosnyzwyczajnej Pinus silvestris (L). P.T.P.N. IX, 1961, 1, 3-47.

[28] M a ń k a K., R z ą s a S.: Badania nad mikroflorą korzeniową drzew leśnych. Folia Forest. Polon., 6, A, 1961, 27-48.

[29] M a ń k a K., B ł o ń s k a A., W n ę k o w s k i S.: Badania nad skła-demmikoflory kilku rodzajów gleb i jej oddziaływanie na rozwój niektórychpasożytniczych grzybów glebowych. Prace Nauk. Inst. Ochr. Roślin, 3, 2, 1961. 145-231.

[30] M a ń k a K.: Próby dalszego udoskonalenia zmodyfikowanej metody Warcupa izolowania grzybów z gleby. P.T.P.N., 17, 1964, 29-45.

[31] M a ń k a K.: Saprophytic soil fungi as a factor determining the development of phytopathogenic fungi living in the soil. Wyd. Powiel. IOR, Poznań 1965.

[32] M a ń k a K., K o w a l s k i S.: Porównawcze studium nad metodami izolo­wania z gleby grzybów należących do podklasy Oomycetes. P.T.P.N., w druku.

424 A. Strzelczyk

[33] M a r s h a l l C. K., A l e x a n d e r M.: Competition between soil bacteria and Fusarium. Plant a. Soil, 2, I960, 143.

[34] M a r t i n J. P.: Use of acid, rose bengal and streptomycin in the plate method of estimating soil fungi. Soil Sei., 69, 1950, 215-233.

[35] M i l l e r J. J.: Isolation of yeasts from soil with the aid of acid, rose bengal and oxgall. Soil Sei., 77, 1954, 197-204.

[36] M i n d e r m a n n G.: The preparation of microtome sections of unaltered soil for the study of soil organisms in situ. Pant and Soil, 8, 1956, 42-48.

[37] M u e l l e r K. E., D u r r e l l L. W.: Sampling tubes for soil fungi, Phyto- pathol., 1957, 47, 423.

[38] P a r k i n s o n D.: New methods for the qualitative and quantitative study of fungi in the rhizosphere. Symposium Methodes d’Etudes Microbioloques du Sol, Louvain.

[39] P e t e r s o n E. A.: Observations of fungi associated with plant roots. Can. J. Microbiol., 4, 1958, 257-265.

[40] R i к e r A. J., R i к e r R. S.: Introduction to research on plant disceases. John Swift and Co., St. Louis, Mo., 1936.

[41] S m i t h G., R a i s t r i c k H.: An introduction to industrial mycology. Ed. Arnold and Co. Ltd., London 1946.

[42] S t e v e n s o n I. L.: Antibiotic activity of actinomycetes in soil as demon­strated by direct observation techniques. J. Gen. Microbiol., 15, 1956, 372-380.

[43] S t r z e l c z y k E., S t r z e l c z y k A.: Wpływ środków owadobójczych i grzybobójczych na mikroflorę gleby. Annales UMCS, Sec. E, 18, 1963, 55-71.

[44] S t r z e l c z y k E.: Studies on the rhizosphere microflora of plants resistant and susceptible to soil borne diseases. I. Microbial characteristics of rhizosphere and non-rhizosphere soil. Acta Microbiol. Polon., 12, 1963, 211-223.

[45] S t r z e l c z y k E.: Studies on the rhizosphere mikroflora of plants resistant and susceptible to soil borne diseases. II. Effect of aminoacids and vitamins on growth of Thielaviopsis basicola and Fusarium oxysporum f. Uni. Acta Microbiol. Polon., 13, 1964, 137-148.

[46] S t r z e l c z y k E.: Studies on the rhizosphere microflora of plants resistant and susceptible to soil borne diseases. III. Incidence of antagonists and competi­tors of Fusarium oxysporum /. Uni and Thielaviopsis basicola in rhizosphere and non rhizosphere soil. Acta Microbiol. Polon., 14, 1965, 87-100.

[47] S t r z e l c z y k E., S z e m b e r A., W y c z ó ł k o w s k i A.: Fungi associated with roots of tobacco resistant and susceptible to black root rot. Acta Micro­biol. Polon., 14, 1965, 315-320.

[48] T h o m C., R a p e r K. B.: A mannual of Aspergilli. Williams a. Wilkins Co., Baltimore Md. 1945.

[49] T h o r n t o n R. H.: The screend immersion plate — a method of isolating soil microorganisms. Research, 5, 1952, 190-191.

[50] T h o r n t o n R. H.: Rhizoctonia in natural grassland soils. Nature, 177, 1956, 230-231.

[51] W a к s m a n S. A.: Do fungi live and produce mycelium in the soil? Sei., N.S., 44, 1916, 320-322.

[52] W a г с u p J. H.: The soil-plate method for isolation of fungi from soil. Nature, 166, 1950, 117-118.

[53] W a r e u p J. H.: Isolation of fungi from hyphae present in soil. Nature, 175, 1955, 953-955.

Metody badania grzybów glebowych 425

[54] W a r c u p J. H.: Studies on Basidiomycetes in soil. Trans. Brit. Soc. Mycol., 1, 1959, 227-231.

[55] Z i e m i ę c k a J.: Mikrobiologia gleby i nawozów organicznych. PWRiL,Warszawa 1958.

[56] Z i e m i ę c k a J.: The ecology of soil fungi. Intern. Symp. Liverpool Univ. Press, I960.

[57] V i n c e n t J. M.: J. Soc. Chem. Ind., 66, 1947, 149. Opracowano w 1967 r.

А. С Т РЖ Е Л Ь Ч И К

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЕННЫХ ГРИБОВ

П ол ь ск ое О бщ ество П оч в ов едов , К ом и сси я Б и ологи и

Р е з ю м е

Описаны методы наиболее часто применяемые почвенными микробиоло­гами и микологами. Методы касаются техники изолирования и идентифика­ции грибов развивающихся в почве и в корневой системе растений. Описаны также методы культивирования, определения интенсивности их возраста, на­блюдения органов размножения и хранения чистых культур грибов.

A. STR ZELC ZYK

METHODS OF STUDYING OF SOIL FUNGI

P o lish S o il S c ie n c e S o c ie ty . C om m ision o f B io lo g y

S u m m a r y

The Methods most often applied by soil microbiologists and mycologists are described.

They comprise the techniques of isolation and determination of fungi habitating the soil and plant roots, the methods of their cultivation, and growth measurment, the observation of fruit bodies and storage of fungal pure cultures.