1. Colorația GRAM – efectuarea unui frotiu, colorarea și examinarea microscopică - Principiu-evidenţiază forma, gruparea şi afinitatea tinctorială a germenului, clasificând germenii Gram pozitivi şi Gram negativi pe baza structurii fizico-chimice a peretelui celular. Germenii Gram pozitivi au peretele gros, dar simplu care rezistă la decolorare şi păstrează culoarea violet iniţială. Germenii Gram negativi au peretele subţire dar complex ca structură după culorare devenind roşii.Metodologie

frotiul uscat şi fixat se acoperă cu violet de genţiană 2 minute. mordansarea-se acoperă lama cu Lugol care se menţine 2 minute, apoi se varsă

fără a se spăla. diferenţierea-se acoperă frotiul cu un amestec alcool-acetonă şi se imprimă

mişcări de inclinare a lamei. După 10 secunde se spală frotiul cu apă de la robinet.

recolorarea-se acopera frotiul cu fuxină Ziehl diluată 1/10 timp de 1-2 minuteSe spală cu apă de la robinet. Se usucă şi se examinează la microscop.

2.Coloraţia Ziehl-Neelsen – principui, metodologie, interpretarePrincipiu-bacilii acido-alcoolo-rezistenţi au în structura peretelui substanţe lipidice care se colorează greu dar odată coloraţi nu-şi pierd culoarea nici cu un decolorant puternic rămânând coloraţi în roşu. Celelalte microorganisme, împreuna cu elementele celulare, se decolorează şi, după recolorare, devin albastre. Metodologie

se acoperă frotiul cu fuxină fenicată. Se aşează flacăra sub frotiu şi se menţine până la emisie de vapori. Încălzirea durează 5 minute. Se înlătură fuxina, se spală lama cu apă de la robinet .

decolorarea cu o soluţie de acid sulfuric 20% timp de 1 minut. Se spală pe ambele feţe.

recolorarea cu albastru de metilen 1% timp de 1 minut. Se spală cu apă de la robinet. Se usucă şi se examinează la microscop cu obiectivul cu imersie.

În coloraţia Ziehl-Neelsen bacilii alcool-acido rezistenţi apar roşii, iar restul florei şi elementele celulare colorate cu albastru.

3. Caractere de cultura ale germenilor patogeniCaractere de cultura pe medii solide:

Elementul caracteristic al multiplicării bacteriene în mediul solid este reprezentat de "colonia bacteriană" care genetic reprezintă multiplicarea în generaţii successive pornind de la un singur individ iniţial.

■ Dimensiuni:Mici: dimensiuni cuprinse intre 0,1-1 mm. Exemplu: germeni din genul Haemophylus, Brucella,

Bordetella.- Mijlocii: dimensiuni de 1-2 mm. Exemplu: Proteus, Salmonella, Streptococcus.- Mari: dimensiuni de 2-3 mm. Exemplu: Staphylococcus, E. Coli.

■ Formă: Rotunde; Ovalare; Dendritice;Lenticulare;Filamentoase.

1

■ Suprafaţă: Netede: în general tulpinile proaspăt izolate, Rugoase: unele tulpini întreţinute "in vitro " prin pasaje repetate; Bombate: Stafilococul, E. coli, Vibrionul holeric; Mamelonate: Bacilul tuberculos, Bacilii difterici - formele "gravis " şi "intermedius "; Aplatizate: Pseudomonas; Ombilicate („în farfurie"): Pneumococ.

Contur (margini)Circular, regulat, întreg, majoritatea germenilor la primoizolare;- încreţit: forma „gravis" Ondulat-invaziv: cu valuri successive de invadarea a mediului - Proteus Cu prelungiri - lobate, filamentoase. Transparenţă-Opacitate (densitate optică) Hipertransparente: vibrion holeric; Transparente. Haemophyllus („în picătură de rouă"), Shigella; Translucide: Salmonella, Proteus; Opace: Stafilococ, E. coli.

Strălucire-Matitate- Lucioase (strălucitoare): Brucella, Streptococ fî-hemolitic (forma "glossy"), Shigella;- Mate: Streptococ fi-hemolitic (forma "matt"); Uscate, granulare: bacilul tuberculors.

■ ConsistenţaFriabile: bacilul tuberculos; - Mucoase, filante: Klebsiella, Streptococ /3-hemolitic (forma "mucoides") (figura 9); Untoasă; păstoasă; Spumoasă, ca albuşul de ou bătut spumă.

■ Aderenţa Ia mediuNeaderente {streptococ, stafilococ, Shigella); Aderente: (bacilulpiocianic); încastrate in

mediu

■ Culoarea: Prin pigment propriu: coloniile pot fi: albe (stafilococ alb); galben-aurii (stafilococ aureu); galben-citrin (stafilococ citrin); verde fluorescent (Pseudomonas aeruginosa); portocalii (streptococ de grup B).

- Virarea culorii indicatorului din mediu: culoare galbenă (indicator albastru de bromtimol) sau roşie (indicator roşu fenol) la bacteriile lactozo-pozitive (E. coli, Klebsiella), culoare galbenă: stafilococ aureu in cazul tulpinilor manito-pozitive (figura 12); culoare albastră, in cazul tulpinilor care folosesc citratul ca unică sursă de carbon (indicator albastru de bromtimol): Klebsiella, Enterobacter (figura 11).

■ Mirosul degajat de unele colonii poate fi caracteristic:Aromă de flori de tei: Pseudomonas aeruginosa; Putrid: Proteus; „Corn ars": Clostridium tetanii; Fecaloid: E. coli.

■ Hemoliza La zona de hemoliză se apreciază: Dimensiunile zonei în raport cu diametrul bacteriei:dimensiuni mari: la stafilococ beta-hemolitic, streptococ a-hemolitic (viridans), Bordetella,

hemofili. dimensiuni mici: stafdococ;

Prin coroborarea a câteva dintre caracterele coloniilor microbiene (contur, suprafaţă), se disting două mari categorii:

- forma „S" („smooth "): contur circular, suprafaţă netedă, bombate;- forma „R" („rough"): contur încreţit, suprafaţă rugoasă, sau mamelonată, turtite.

CARACTERE DE CULTURĂ PE MEDII LICHIDE

■ Turbiditatea care se traduce prin tulburarea mediului fie în mod omogen, în toată masa mediului de cultură {stafilococ, Salmonella, Proteus etc); fie in mod inegal, sub forma unui depozit grunjos la

2

partea inferioara şi pe pereţii eprubetei si cu un aspect mai limpede in celelalte doua treimi superioare.(streptococul b-hemolitic); fie sub aspectul unui depozit floconos şi aderent la fundul eprubetei, mediul fiind clar în rest (bacilul antraxului).

Aspecte la suprafaţa mediului: formare de val subţire la suprafaţă: vibrion holeric, C. diphteriae; formarea unei pelicule fine (unele tulpini de Proteus); formarea unei membrane groase, rugoase, încreţite la suprafaţă, restul mediului fiind limpede (bacilul tuberculos); formarea unei membrane uscate, „scuamoase" (Bacillus subtillis); formarea unui inel aderent la joncţiunea dintre concavitatea nivelului superior al lichidului şi pereţii eprubetei (unele tulpini de E. coli).

■ CuloareaApariţia unei coloraţii diferite de cea a mediului neînsămânţat, dată de eliberarea de pigmenţi

bacterieni hidrosolubili ca fluoresceina, piocianina, melanină (coloraţie verde-albăstruie în cazul Pseudomonas aeruginosa).

Miros caracteristic: aromat, de flori de tei: Pseudomonas;fecaloid: E. coli;/putrid: Proteus;corn ars: bacilul tetanic.

5. Antibiograma: principiu si interpretare. Este testarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene la agenţi chimioterapici sau antibiotice. Principiul metodei constă în punerea în contact a suspensiei bacteriene cu diferite antibiotice.

a) Metoda difuzimetrică -gradientul de concentraţie necesar determinării se realizează în mediu agarizat prin difuzarea radială a antibioticului dintr-un depozit depus pe suprafaţa mediului, însămânţată “în pânză” cu bacteria de testat. Acest gradient scade proporţional cu pătratul distanţei de la antibiotic. Cultura nu apare în aria în care antibioticul realizează CMI pentru bacteria testată. Metoda difuzimetrică se utilizează numai pentru bacteriile cu creştere rapidă. Permite testarea mai multor antibiotice pe aceeaşi floră.

b) Metoda diluţiilor permite determinarea concentraţiei minime inhibitorii(CMI). În mediul lichid, inoculul bacterian se distribuie într-o serie de tuburi sau godeuri, conţinând bulion Mueller-Hinton cu antibioticul în concentraţii crescânde(0; 0,25; 1; 2; 4; 8; 16 mg/l). Inoculul constă dintr-o suspensie din tulpina microbiană de testat diluată de ordinul 105germeni/ml. După incubare 24 de ore la 37oC, CMI este indicată de tubul sau godeul care conţine cea mai mică concentraţie de antibiotic la care creşterea bacteriană nu mai este vizibilă.

9. Diagnosticul de laborator in tuberculoza.2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

2.1. Examenul directPrezintă o etapă esenţială în diagnosticul de laborator al tuberculozei şi constă în efectuarea de frotiuri direct din

produsul patologic. Produsele patologice (în special sputa) sunt supuse în prealabil omogenizării prin tratare cu hidroxid de sodiu şi agitare (fluidificarea produsului şi repartizarea uniformă a bacililor) şi concentrării bacililor în stratul superior cu xilol şi apă distilată.Se efectuează:- „screeningul" prin fluorescentă cu auramină şi rodamină şi examinare în ultraviolet (puncte strălucitoare pe fondul pal-verzui al câmpului, în caz de prezenţă a bacililor Koch). Probele pozitive trebuie controlate prin coloraţia Ziehl-Neelsen;

- baciloscopie directă prin coloraţia Ziehl-Neelsen permite diagnosticul de certitudine: barili roşii, dispuşi în

cordoane, celelalte elemente (floră de asociaţie, polimorfonucleare, celule epiteliale întregi sau detritusuri) albastre

(figurile 1 şi 2).

3

2.2. Izolare:Se face:

• in vitro pe mediul Lowenstein-Jensen (bogat în substanţe nutritive şi conţinând verde-malahit ca inhibitor al

florei de asociaţie) (figura 3) cu incubare la 37°C timp de 2 luni;

• in vivo: se utilizează cobai masculi de 400 g, se inoculează subcutanat, pe faţa internă a coapsei 1-2 ml produs

patologic.

• 2.3. Identificare \• Caractere cultură:

Pe mediul Lowenstein: colonii „R" (margini neregulate, suprafaţa mamelonată), „conopidiforme", uscate, alb-gălbui; cele de tip uman cresc după 14 zile, cele de tip bovin după 30 de zile, cele atipice cresc în primele zile şi sunt colorate (figurile 4, 5, 6 şi 7).

• Caractere morfologice:Frotiul din cultură (colorat Ziehl-Neelsen) evidenţiază bacili acido-alcoolo-rezistenţi, roşii, uneori dispuşi

în cordoane prin bogăţia de factor „cord" (factor de patogenitate), alături de celule epiteliale, leucocite, floră de asociaţie, colorate în albastru (figura 8).

• Caractere biochimice:- Testul catalazei diferenţiază mycobacteriile atipice la care reacţia este pozitivă de bacilul Koch, unde reacţia este negativă. Se acoperă coloniile obţinute pe suprafaţa mediilor solide cu soluţie de pirocathelor, perhidrol şi apă distilată. După 2-5 minute se face citirea reacţiei. Reacţia este pozitivă dacă se observă apariţia bulelor de gaz.

- Testul la niacin (Konno) este utilizat pentru punerea în evidenţă a niacinei.

• Caractere de patogenitateAnimalul de elecţie pentru reproducerea experimentală a infecţiei tuberculoase e cobaiul, care se inoculează subcutanat

pe faţa internă a coapsei, iar evoluţia bolii se face timp de 2-6 luni, după care cobaiul slăbeşte şi moare. După 10-15 zile, de sănătate aparent deplină, cobaiul devine apatic, pofta de mâncare scade, iar la locul inoculării apar modificări, în sensul că regiunea se împăstează, apoi devine fluctuentă, iar la nivelul plicii inghinale se palpează un ganglion, care creşte şi se ramoleşte, abcedând. La scurt timp sunt prinşi ganglionii regionali. La autopsie se poate observa invadarea întregului sistem limfatic şi a viscerelor.

DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGICPrezenţa imunităţii celulare, principala modalitate de apărare specifică antituberculoasă, se testează prin IDR la

tuberculină. Organismele infectate cu bacili tuberculoşi reacţionează diferit faţă de tuberculină, comparativ cu cele indemne. Intradermoreacţia la tuberculină testează răspunsul imun celular (hipersensibilitate întârziată), faţă de tuberculină. Se injectează pe faţa anterioară a antebraţului 0,2 ml tuberculină, dintr-o diluţie de 1/10.000. Reacţia se citeşte după 72 de ore de la injectare, când la locul inoculării apare un eritem şi un edem cu diametru diferit, în funcţie de gradul de răspuns imun faţă de tuberculină.

11. Diagnosticul de laborator in infectiile cu E.ColiSunt germeni condiţionat patogeni ce pot determina:

- infecţii urinare (cistite, pielite, pielonefrite);- infecţii intestinale (enterite, colite, enterocolite). La sugar, copil mic, în cazurile cu rezistenţă scăzută a

organismului, pot apare şi septicemii. suprainfecţia plăgilor;infecţii purulente (apendicite, pcritonite, colecistite).

E. coli poate determina diareea malignă a nou-născutului;

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICESe pot recolta:

4

• materii fecale din scaunul emis spontan sau recoltate cu sonda Nelaton (infecţii ale tractului digestiv); urină pentru urocultură; bilă (în infecţii ale căilor biliare); -• sânge pentru hemocultură (în caz de septicemii);

• puroi de la nivelul plăgilor; exudate diverse focare inflamatorii);alimente, produs de vărsătură (toxiinfecţiile alimentare);• probe de organe de la cadavru (diaree malignă a nou-născutului);• sputa (infecţii ale tractului respirator); exudat nazo-faringian; ' LCR (localizări meningeale).

2. DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC (BACTERIOLOGIC)2.1. Examenul direct

Este important pentru produsele patologice normal sterile (LCR, urină, bilă); frotiul colorat Gram efectuat direct din produsele patologice, evidenţiază bacili Gram negativi, drepţi sau uşor încurbaţi, nesporulaţi, necapsulaţi, mobili (E coli)

2.2. IzolareaIzolarea acestor enterobacterii se realizează prin însămânţarea prelevatului pe două tipuri de medii: medii simple, fără inhibitori (geloză glucozată 2%) şi medii cu inhibitori (slab sau moderat selective: EMB/Levine, Istrate-Meitert). Aceste medii vor fi incubate la 37°C 18-20 de ore. 2.3. Identificarea germenilor Caractere de cultură Geloză simplă

Escherichia coli determină colonii S, convexe, umede, cu suprafaţă lucioasă, margini netede, uşor emulsionabile în ser fiziologic, sau colonii R, uscate, cu margini crenelate, care se emulsionează greu şi neuniform în ser fiziologic. Uneori, E. coli poate să determine şi colonii mucoide .

■ Mediul Istrate-MeitertE. coli: determină colonii lactozo pozitive, varianta „S", opace, galbene,

individualizate chiar pe traseul de însămânţare; mediul special de cultură pentru E. coli este mediul Levine;

Geloză-sângeE. coli: poate determina hemoliză incompletă, relativ restrânsă, fără legătură cu patogenitatea.

c. Caractere metaboliceE. coli (figurai3):

• fermentează glucoza cu producere de gaz în cantităţi moderate; acidifwă partea înclinată a mediului TSI (lactoză/zaharoză pozitivă); nu produce H2S;- este mobilă pe MIU; uree negativă; indol pozitivă; lizindecarboxilază pozitivă; ornitindecarboxilază variabilă; citrat negativă;

• fenilalanină negativă.

d. Caractere antigeniceAceastă etapă se practică pentru: - E. coli enteropatogen (EPEC) care poate determina diareea

malignă a nou-născutului (până la vârsta de 2 ani).Reacţia folosită în acest scop este reacţia de aglutinare pe lamă folosind trusa de seruri imune standard anti-E.

coli. Identificarea se realizează în 2 etape: aglutinarea cu serul polivalent anti-E. coli;Tot pentru identificarea E. coli se poate folosi reacţia de imunofluorescenţă indirectă.

6. Diagnosticul de laborator al infectiilor stafilococice.7. Reactia ASLO: pricipiu, interpretare, importanta practica medicala.8. Secretia uretrala: rolul examenului direct microscopic in cadrul examenului de laborator al uretritelor.10. Diagnosticul de laborator in infectii cu E. Colli.

5

11. Diagnosticul de laborator in infectii cu Salmonella.12. Diagnosticul de laborator cu Shigella.13. Diagnosticul de laborator pentru sifilis.14. Coprocultura cu bacterii conditionat patogene.15. Coprocultura cu bacterii patogene.16. Urocultura.

6