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Microscopio Ottico Video-Confocale

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INDICE

Introduzione ................................................................................................................................5 Descrizione del sistema...............................................................................................................5 Componenti del sistema..............................................................................................................5 Dettaglio del sistema...................................................................................................................6 Microscopio .................................................................................................................................6 Camera .........................................................................................................................................6 Sistemi aggiuntivi necessari al funzionamento confocale ...........................................................6 Software .......................................................................................................................................6 Funzionamento del sistema.........................................................................................................7 Allineamento................................................................................................................................7 Acquisizione.................................................................................................................................7

Immagini bidimensionali mono-parametriche .........................................................................7 Immagini bidimensionali multi-parametriche..........................................................................7 Immagini tri-dimensionali........................................................................................................7 Immagini tetra-dimensionali ....................................................................................................8 Modalità convenzionale C=0 (non confocale):........................................................................8 Modalità confocali C=1, 2, 3: ..................................................................................................8

Struttura del programma ViCo....................................................................................................8 Interfaccia Utente........................................................................................................................9 Global...........................................................................................................................................9

Enable area of interest:............................................................................................................9 Binning:....................................................................................................................................9 Pixel depth: ..............................................................................................................................9 Cooling.....................................................................................................................................9 View Grabbed Image ...............................................................................................................9 Split VideoGrab .......................................................................................................................9 Use One Grid for All................................................................................................................9 Close shutter between channels ..............................................................................................9

Time/Z axis ................................................................................................................................11 Enable Z axis..........................................................................................................................11 Enable time axis .....................................................................................................................11

Modes.........................................................................................................................................13 Illum.......................................................................................................................................13 Weel color ..............................................................................................................................13 Wide acquisition ....................................................................................................................13 Conf acquisition .....................................................................................................................13 Super acquisition....................................................................................................................13 Grid ........................................................................................................................................13 Steps .......................................................................................................................................13 Z grid position........................................................................................................................13 Start focus - Last focus ..........................................................................................................13 Gain - Offset ..........................................................................................................................14 Integration ..............................................................................................................................14 Copy To .................................................................................................................................14 Copy From .............................................................................................................................14 Auto Integr. ............................................................................................................................14 Auto Offset.............................................................................................................................14

Image manager...........................................................................................................................15

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Time - Prof µm......................................................................................................................15 Color channel .........................................................................................................................15 Display ...................................................................................................................................15

Finestra comune .........................................................................................................................16 Start Acuire/ Stop Acquire:....................................................................................................16 Save........................................................................................................................................17 Open.......................................................................................................................................17 Snap........................................................................................................................................17 Snap on Current .....................................................................................................................17 Start/Stop Preview..................................................................................................................17 Save Setting............................................................................................................................17 Open Setting...........................................................................................................................17 Cur/Img ..................................................................................................................................17

Esecuzione pratica delle misure................................................................................................18 Impostazioni Comuni a tutti i tipi di acquisizione .....................................................................18 Impostazioni comuni a tutti i tipi di immagini 2D (X,Y) ..........................................................18 Impostazioni comuni a tutti i tipi di immagini 3D X, Y, Z........................................................18 Impostazioni comuni a tutti i tipi di immagini 3D X, Y, T........................................................19 Impostazioni di immagini convenzionali monoparametriche....................................................19 Impostazioni di immagini convenzionali multiparametriche.....................................................20 Acquisizione di immagine confocale monoparametrica. ...........................................................20 Acquisizione di immagine confocale multiparametrica.............................................................21 Criteri per la selezione della griglia di scansione confocale (Modelli 80i-TE2000) ................22 Schema di posizionamento delle griglie di modulazione sulla maschera.................................23 Criteri per la selezione della griglia di scansione confocale (Modello Ti) ...............................26 Schema di posizionamento delle griglie di modulazione sulla maschera.................................27

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Introduzione Vi ringraziamo per aver acquistato il sistema ViCo per la microscopia video-confocale.

Descrizione del sistema ViCo è un microscopio ottico di nuovo tipo che riassume in sé le capacità operative tipiche del microscopio ottico convenzionale, di quello assistito da telecamera e di quello confocale. Viene proposto per offrire, riunite in un unico sistema controllato dal calcolatore, versatili e potenti soluzioni analitiche per svariati problemi di indagine microscopica, tradizionalmente affrontati per mezzo di strumenti e metodi distinti. ViCo permette di realizzare, anche simultaneamente, modalità di contrasto in luce trasmessa ed in luce incidente, nelle quali si può flessibilmente passare dall’analisi a vasto-campo a quella confocale. Si adatta quindi allo studio anche combinato dei preparati microscopici assorbenti, di fase, riflettenti e fluorescenti. ViCo fornisce i mezzi necessari all’ acquisizione, alla visualizzazione e all’archiviazione in forma di immagini sia piane sia multi-dimensionali, rappresentative di dati XY, XYZ, XYT e XYZT. Tali immagini sono a loro volta riferite ad uno o più canali di raccolta, corrispondenti a bande cromatiche e a metodi di contrasto diversi.

Componenti del sistema Il sistema ViCo si compone delle seguenti parti: - microscopio da ricerca corredato delle parti ottiche e degli accessori necessari al funzionamento

con illuminazione sia in luce trasmessa che incidente; - accessori per compiere analisi anche combinate, in campioni assorbenti, di fase, riflettenti e

fluorescenti; - sorgenti per l’illuminazione in luce trasmessa e incidente basate su lampade ad incandescenza e

ad arco; - dispositivi opto-elettro-meccanici aggiuntivi e relative unità di controllo per la modulazione

spaziale dell’illuminazione incidente; - camera digitale a stato-solido con tecnologia CCD ad otturatore elettronico, per l’acquisizione

elettronica delle immagini; - apparecchiatura di calcolo, visualizzazione e archiviazione basata su PC. - software di supporto per la gestione generale dello strumento, l’acquisizione, il trattamento, la

visualizzazione e l’archiviazione delle immagini, basato su ImageProPlus (Media Cybernetics, USA).

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Dettaglio del sistema

Microscopio - stativo da ricerca, motorizzato internamente o esternamente e controllato da PC; - parti per l’illuminazione ad incandescenza in luce trasmessa.; - parti per l’illuminazione ad arco compatto in luce incidente; - combinazioni di filtri e specchi per la fluorescenza e/o la riflessione; - corredo di obiettivi; - condensatore per illuminazione a campo chiaro e/o a contrasto di fase; - raccordo ottico per telecamera con attacco “C”.

Camera - di tipo CCD digitale di tipo interline-transfer ad otturatore elettronico.

Sistemi aggiuntivi necessari al funzionamento confocale Maschera di modulazione spaziale multipla avente le seguenti caratteristiche: dimensioni 32x16 mm, motorizzata entro 25 x 12mm, fochettabile entro 10 mm e contenente 8 filtri spaziali (griglie). Controllo per la scelta della griglia e del passo di scansione mediante motori passo-passo (micro-step) controllati da PC.

Software Il supporto software si basa su ImageProPlus (Media Cybernetics, USA). Un’estensione è stata appositamente sviluppata per automatizzare le operazioni di acquisizione delle immagini. Essa permette la gestione: dei parametri di funzionamento della camera, dei filtri, dello shutter, del fuoco del microscopio, dello spostamento della maschera di modulazione spaziale e della raccolta delle immagini. Provvede inoltre alla visualizzazione e al salvataggio delle immagini acquisite sia in formato proprietario, sia nei formati messi a disposizioni dal programma ospite.

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Funzionamento del sistema

Allineamento Al lancio del software di controllo del sistema ViCo vengono inizializzati sia il microscopio, nelle sue parti automatizzate, sia i sistemi opto-elettro-meccanici aggiuntivi. ViCo si dispone così in condizioni operative entro pochi secondi. A partire da tale momento, posto un campione nel microscopio, l’operatore potrà procedere all'osservazione diretta in illuminazione incidente e/o trasmessa, agendo sui controlli manuali e su quelli controllati dal calcolatore.. Quando l’operatore desidera procedere ad osservare, e quindi analizzare, un campione adottando i parametri scelti relativamente ad un canale di misura, premendo “Set” viene scelta la griglia di modulazione spaziale dell'illuminazione voluta ed aperto l’otturatore dell’illuminazione. Potranno anche essere osservate sullo schermo le immagini ottenute attraverso la camera, in tempo reale. Tale operazione permette, tra l'altro, di centrare e mettere a fuoco la zona di interesse del preparato, avendo cura di attenuare opportunamente il fascio di illuminazione per non danneggiarlo o saturare il sensore della telecamera.

Acquisizione Il processo di acquisizione permette di procedere alla visualizzazione e alle successive elaborazioni delle immagini. A seconda delle esigenze, svariate sono le modalità di analisi e conseguentemente ampia la variabilità dei parametri coinvolti. Associando le diverse condizioni di acquisizione, si possono anche ottenere più immagini bidimensionali secondo Z o T, nella forma di sequenze focali e/o temporali. In ordine di complessità crescente, si possono avere:

Immagini bidimensionali mono-parametriche L’acquisizione con: - metodo di illuminazione a vasto campo oppure a campo ristretto seguito dall’elaborazione

confocale delle immagini preliminari, - metodi di contrasto diversi, - filtri di colore diversi porta all’ottenimento di immagini bidimensionali I(X, Y).

Immagini bidimensionali multi-parametriche L'acquisizione di due o più immagini mono-parametriche permette di combinarle per ottenere immagini multi-parametriche, ad es. utilizzando una opportuna codifica RGB di colore.

Immagini tri-dimensionali In seguito alla raccolta di sequenze di immagini piane, rappresentative di sezioni ottiche lungo l’asse Z del campione esaminato o del tempo T, si perviene all’ottenimento di immagini tri-dimensionali I(X, Y, Z) oppure I(X, Y, T).

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Immagini tetra-dimensionali In seguito alla raccolta di sequenze di immagini tridimensionali nel tempo, si può pervenire all’ottenimento di immagini spazio-temporali I(X, Y, Z, T). Quindi, agendo sui comandi resi disponibili dal software di controllo, è possibile accedere alle seguenti procedure di acquisizione:

Modalità convenzionale C=0 (non confocale): - immagini piane I(X, Y) mono-cromatiche e mono-modali - idem con diverse modalità di contrasto e canali cromatici; - idem I(X, Y, Z) oppure I(X, Y, T) oppure I(X, Y, Z, T);

Modalità confocali C=1, 2, 3: - immagini preliminari IUV (X, Y) mono-cromatiche e mono-modali; - da cui, immagini piane I(X, Y) mono-cromatiche e mono-modali - idem con diverse modalità di contrasto e più canali cromatici; - idem I(X, Y, Z) oppure I(X, Y, T) oppure I(X, Y, Z, T);

Struttura del programma ViCo Il programma ViCo è un componente aggiuntivo (plug-in) del software ImageProPlus di Media Cybernetics, ViCo può solo funzionare all’ interno di questo programma e non può essere utilizzato come applicazione “stand alone”. L’ interfaccia utente è composta da 4 pagine che permettono di impostare i parametri di funzionamento del sistema, queste pagine sono divise in modo logico, la prima “Global” serve ad impostare i parametri globali di funzionamento comuni a tutte le immagini che verranno acquisite durante l’esperimento. La seconda “Time/Z axis” permette di impostare se e come acquisire stack di immagini sull’asse Z per immagini tridimensionali e/o sequenze di immagini nel tempo. Questi stacks e sequenze saranno comuni a tutti le immagini impostate nella pagina “Modes”. ViCo permette di impostare fino a 10 modalità di acquisizione che saranno ripetute per ogni step di asse Z e per ogni step di intervallo T selezionato precedentemente. Nella pagina “Modes”, per ognuna di queste attivata, e’ possibile selezionare diversi parametri che sono indipendenti tra un modo e l’altro. La quarta pagina, non attiva fino a che non e’ stata acquisita o richiamata da disco una immagine, serve a selezionare le modalità di post-elaborazione e di visualizzazione. La sezione di destra della finestra di dialogo e’ utilizzata per la gestione dell’ acquisizione delle immagini, del salvataggio e riapertura delle stesse, del salvataggio e richiamo dei parametri di acquisizione.

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Interfaccia Utente

Global Come scritto precedentemente serve a definire le modalità generali della camera, del microscopio e delle opzioni comuni di acquisizione. Alcune delle voci descritte possono non essere presenti se si usa l’interfaccia semplificata.

Enable area of interest: Se il dettaglio che si vuole acquisire non copre tutta l’ immagine visualizzata, questa opzione permette di acquisire un’ area inferiore a quella complessiva. Il ritaglio di un’ area di interesse consente di utilizzare meno memoria, di velocizzare le operazioni di trasferimento delle immagini dalla camera al P.C. e di velocizzare le operazioni di elaborazione e di memorizzazione delle immagini, oppure di aumentare il numero di modi o di step dello stack Z. Per utilizzare la funzione occorre acquisire una immagine su cui effettuare il ritaglio, cliccare sul tasto Unlock e, con lo strumento di ritaglio di Image Pro Plus, evidenziare la regione di interesse, nelle 4 caselle (Top, Left, Bottom e Right margin) verranno riportati i margini dell’ area ritagliata. Cliccare sul tasto lock per bloccare la modifica dei valori e spuntare la casella “Enable area of interest”, da questo momento in poi tutte le immagini acquisite avranno la dimensione e la posizione definite dal ritaglio. Da notare che variando alcuni parametri della camera tipo il Bining, il ritaglio viene disabilitato. Per disabilitare la funzione o definire una nuova area di interesse eliminare il segno di spunto nella casella “Enable area of interest”.

Binning: Il binning e’ un metodo per incrementare la velocita’ e la sensibilita’ della camera. Il binning causa un aumento della luminosita’ e una riduzione della dimensione dell’ immagine, puo’ essere usato per intensificare un’ immagine molto poco luminosa o, riducendo il tempo di esposizione, velocizzare l’acquisizione. Dato che la dimensione e’ ridotta, viene inoltre diminuito il tempo di trasferimento tra camera e PC.

Pixel depth: Seleziona la profondità di colore dell’ immagine acquisita, ovverosia il numero di bit utilizzati per la conversione analogico/digitale dei pixels. Riducendo il numero di bits si velocizza il trasferimento e si ha una minor occupazione di memoria a scapito della risoluzione cromatica delle immagini ottenute.

Cooling Attiva il raffreddamento della camera, se presente. Questa opzione permette di ottenere immagini con una minor quantita’ di rumore.

View Grabbed Image Abilita la visualizzazione delle immagini acquisite durante le scansioni.

Split VideoGrab Abilitando questa opzione si velocizza l’esecuzione della acquisizione effettuando il trasferimento delle immagini tra camera e PC durante la movimentazione della griglia.

Use One Grid for All Permette di utilizzare una sola griglia per tutti i modi.

Close shutter between channels Permette di non illuminare il preparato durante i tempi morti dell’ acquisizione. L’ apertura e la chiusura dello shutter ha tempi di attuazione non nulli, attivando l’opzione si rallenta quindi l’ esecuzione della misura.

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Time/Z axis Permette di abilitare l’acquisizione di immagini multiple e/o di sequenze secondo l’asse di fuoco del microscopio od il tempo. Permette inoltre di definire i parametri riguardanti l’acquisizione.

Enable Z axis Abilita l’acquisizione di una stack di immagini secondo l’ asse Z del microscopio. Selezionando questa opzione di abilitano le seguenti voci:

Steps mumber Definisce il numero di passi da effettuare per completare la scansione.

Z step µm Definisce il passo con cui effettuare la scansione.

full Z excursion µm Definisce l’escursione totale della scansione.

Questi tre parametri sono interdipendenti, definiti due di questi il terzo e’ automaticamente impostato, i bottoni auto presenti servono pertanto a definire quali di questi tre parametri dipende dagli altri due.

Step test Permette di selezionare uno degli n steps definiti e tramite il bottone “Test Focus” portare il microscopio in quella posizione di fuoco.

Set Start Focus - Set End Focus

Impostano il fuoco di partenza e di fine scansione, Il bottone di fine scansione se il parametro “full Z excursion µm” e’ in auto sara’ disattivato.

Start focus - last focus Portano il microscopio ad assumere la posizione di fuoco di inizio e fine scansione impostate.

Enable time axis Abilita l’acquisizione di una sequenza di immagini. Selezionando questa opzione si abilitano le seguenti voci:

Steps mumber Definisce il numero di sequenze di immagini da effettuare per completare la sequenza.

Time Interval Definisce l’ intervallo di tempo tra due immagini/sequenze.

Total Time Definisce la durata totale della misura. Questi tre parametri sono interdipendenti, definiti due di questi il terzo e’ automaticamente impostato, i bottoni auto presenti servono pertanto a definire quali di questi tre parametri dipende dagli altri due.

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Modes Questa pagina è composta da 10 sottopagine. Permette di selezionare uno o più canali di acquisizione e di definire i parametri specifici per ogni singolo canale, i canali possono essere abilitati indipendentemente anche non in sequenza. Per abilitare un canale si deve selezionare una delle due modalità di acquisizione, Convenzionale, Confocale o Superconfocale. Per disabilitarlo basta deselezionare entrambe le modalità. Ogni canale può avere i seguenti parametri impostati diversamente uno dall’altro:

Illum Definisce la modalità di illuminazione del preparato, l’illuminazione in trasmissione può essere abilitata solo in modalità Convenzionale.

Weel color Seleziona il filtro di eccitazione.

Wide acquisition Determina l’elaborazione dell’immagine pseudo-convenzionale dalla scansione delle immagini confocali.

Conf acquisition Determina l’elaborazione dell’immagine confocale.

Smoothing Esegue un filtraggio delle immagini per una riduzione dei disturbi nell’immagine elaborata.

Super acquisition Determina l’elaborazione dell’immagine confocale con esaltazione della risoluzione.

Smoothing Esegue un filtraggio delle immagini per una riduzione dei disturbi nell’immagine elaborata.

Grid Seleziona la griglia di scansione da utilizzare.

Steps Imposta il numero di step per completare la scansione della griglia. Questo numero e’ dipendente dai parametri dimensionali della griglia selezionata, vedere il capitolo relativo.

Z grid position La griglia di scansione ha una posizione di messa a fuoco che può variare a seconda della lunghezza d’onda della luce utilizzata per l’illuminazione del preparato e del piano di fuoco del microscopio. I due slider presenti definiscono la messa a fuoco della griglia alla Z di inizio stack e di fine stack.

Start focus - Last focus Posizionano il fuoco del microscopio a quello di partenza e di fine scansione,

Start - End Posizionano la griglia in posizione di inizio e di fine scansione, nel caso non sia abilitato una sequenza sull’ asse Z del microscopio, lo slider inferiore ed i bottoni sono disabilitati.

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Lamp Intensity Nel caso il microscopio possa modulare l’intensità di illuminazione del preparato questo cursore permette di impostarne il valore.

Gain - Offset Impostano il guadagno e l’offset analogico della camera prima della conversione digitale.

Integration Cursore che serve a stabilire il tempo di esposizione dell’immagine. Per i comandi : Z grid position, Lamp Intensità, Gain, Offset e Integration, per immettere direttamente il valore desiderato, fare doppio click sul valore numerico, si aprira’ una finestra di dialogo dove sara’ possibilie inserirlo.

Copy To Utilizzare questo tasto per copiare i parametri impostati nel canale in uso in un altro canale.

Copy From Utilizzare questo tasto per copiare i parametri impostati da un canale diverso in quello in uso.

Auto Integr. Esegue un aggiustamento automatico del tempo di integrazione della camera con i parametri impostati correntemente.

Auto Offset Esegue un aggiustamento automatico dell’ offset della camera con i parametri impostati correntemente.

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Image manager Permette di selezionare tra i vari canali acquisiti quali visualizzare per generare un’ immagine a falsi colori. Si possono visualizzare fino a nove canali in contemporanea tra quelli precedentemente acquisiti. Si può associare ad ognuno dei nove canali un colore diverso.

Time - Prof µm Quando durante l’impostazione dei parametri si abilita l’acquisizione di una sequenza o di uno stack di immagini vengono conseguentemente abilitati i riquadri Time e/o Prof µm che permettono di selezionare o tutta la sequenza o una parte di essa.

Color channel La selezione e le impostazioni dei falsi colori sono raggruppate tre a tre (1-3, 4-6, 7-9) e possono essere selezionate cliccando sul tab relativo, quando all’ interno del gruppo uno piu’ canali e’ abilitato, il tab si colora di blu per indicarne lo stato. Per ogni falso colore, attivato mettendo lo spunto nella casella Active, e’ possibile effettuare le seguenti operazioni: - Selezionare un canale da utilizzare per questo colore, per ogni canale di acquisizione

verranno elencati tutti i modi utilizzabili per la visualizzazione (wide, min, max, conf…). - Selezionare il colore da utilizzare per visualizzare il canale. Premendo il bottone “Select” si

apre la finestra Tavolozza per scegliere il falso colore. I colori presentati in alto sono quelli standard di Windows, in basso e’ possibile utilizzare la prima fila di 8 per definire dei colori personalizzati, la seconda fila viene generata automaticamente dal programma ed imposta un numero di tinte sature cromaticamente equispaziate pari al numero di canali attivi in quel momento.

- Impostare il modo di operazione da effettuare, se il check box “Max” e’ vuoto, il canale selezionato viene sommato algebricamente ai canali precedenti, quando la voce “Max” viene selezionata, l’ operazione eseguita sul canale e su tutti i successivi e’ quella del massimo, in altre parole, l’ immagine risultante e’ il massimo, pixel per pixel, tra il canale in questione e l’ immagine risultante dai canali precedenti.

- Impostare il modo di normalizzazione del livello di luminanza none: il canale non verra’ sottoposto ad alcuna normalizzazione ma visualizzato esattamente come acquisito. auto: vengono automaticamente regolati livello e contrasto per sfruttare tutta la dinamica di visualizzazione. auto gain: viene aumentato il contrasto dell’immagine senza variarne la luminanza di base. manual: l’immagine viene trattata utilizzando i coefficienti di contrasto e luminanza impostati manualmente mediante la funzione Enhance -> Display Range di Image Pro Plus. Cliccando sul bottone preview si visualizza l’anteprima del canale e contemporaneamente la funzione di regolazione luminanza e contrasto.

Display Terminata l’assegnazione dei canali ai vari colori premere il tasto display per visualizzare il risultato.

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Finestra comune La parte destra della finestra di dialogo è comune ai 4 ambienti sopra descritti, permette di gestire il salvataggio ed il richiamo delle immagini acquisite, dei parametri di acquisizione e le funzioni di acquisizione dalla camera.

Start Acuire/ Stop Acquire: Determina l’ avvio dell’acquisizione, durante questa il tasto cambia funzione e permette di terminare l’ acquisizione prima della sua fine naturale. In questo caso si presenta la finestra

seguente che consente le seguenti opzioni di terminazione: Terminate immediately and save: termina il canale corrente o lo step Z corrente e mantiene le immagini acquisite. Wait current T loop end and terminate: termina completamente lo stack ma interrompe la sequenza e mantiene le immagini acquisite. Terminate immediately and delete all: Termina immediatamente l’acquisizione e scarta tutto cio’ che e’ stato gia’ acquisito Cancel: riprende l’ acquisizione

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Save Salva la misura correntemente in memoria. L’estensione del file di salvataggio e’ .vdf ed e’ proprietario del sistema, nel file vengono memorizzati inoltre i parametri di acquisizione. Tutti i modi abilitati vengono salvati, non solo quelli visualizzati, e’ possibile modificare o variare i modi di visualizzazione anche riprendendo il file da archivio. Per salvare le immagini in un formato standard usare gli appositi comandi del programma Image Pro Plus.

Open Riapre una misura da archivio, Oltre alla misura vengono reimpostati tutti i parametri con i quali la misura era stata fatta, per passare dai parametri dell’ immagine a quelli correnti agire sui pulsanti Cur – Img.

Snap Esegue la cattura di un’ immagine in una nuova finestra con i parametri correntemente impostati.

Snap on Current Esegue la cattura di un’ immagine nella finestra attiva con i parametri correntemente impostati.

Start/Stop Preview Abilita/ disabilita la finestra di anteprima; quando attiva, viene visualizzata anche la finestra del profilo di luminanza, utile per impostare i parametri della camera. Programma i vari dispositivi con i parametri impostati e apre lo shutter del microscopio. In questo modo e’ posibile regolare i valori di guadagno, offset, integrazione e messa a fuoco.

Save Setting Salva tutti i parametri di acquisizione correntemente impostati

Open Setting Carica da file un set di parametri di acquisizione, I parametri correnti, se non precedentemente salvati, verranno persi.

Cur/Img Passa dai parametri dell’ immagine in memoria a quelli correnti di acquisizione

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Esecuzione pratica delle misure Passiamo ora a esemplificare l’uso dello strumento con alcuni esempi pratici. Lanciato il programma ImageProPlus, si accede alle funzioni di microscopia confocale tramite la voce di menu: Acquire -> ViCo acquisition. L’applicazione carica automaticamente le ultime impostazioni salvate. Attendere qualche secondo per far si che il sistema si posizioni nelle condizioni iniziali.

Impostazioni Comuni a tutti i tipi di acquisizione Appena appare la finestra di dialogo selezionare la pagina “Global” Deselezionare Enable Area of Interest Impostare il Binning a 1*1 Posizionare Clearance recovery su No Deselezionare Interalace scanning sia X che Y Posizionare Close shutter su No Posizionare Offline mode su No Selezionare View Grabbed Image e Split VideoGrab Deselezionare View Processed Image

Impostazioni comuni a tutti i tipi di immagini 2D (X,Y) Selezionare la pagina “Time/Z axis” Deselezionare Enable Z Axis Deselezionare Enable time Axis

Impostazioni comuni a tutti i tipi di immagini 3D X, Y, Z Selezionare la pagina “Time/Z axis” Selezionare Enable Z Axis Deselezionare Enable time Axis Cliccare sul bottone auto sotto “Steps number” Posizionare il fuoco del microscopio nella posizione di inizio scansione. Cliccare sul bottone Set Start Focus Posizionare il fuoco del microscopio nella posizione di fine scansione. Cliccare sul bottone Set End Focus Se si desidera ottenere un passo di scansione fisso, impostare nella casella Z step µm l’incremento desiderato, in numero di step verrà determinato automaticamente, se invece si vuole un numero noto di step, cliccare sul bottone auto sotto Z setp µm e impostare il numero di step.

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Impostazioni comuni a tutti i tipi di immagini 3D X, Y, T Selezionare la pagina “Time/Z axis” Deselezionare Enable Z Axis Selezionare Enable Time Axis Se si conosce il tempo totale di osservazione e l’ intervallo tra due misure, mettere in auto il riquadro Steps number Impostare il tempo intercorrente tra due misure nel riquadro “Time Interval” e la durata totale dell’ osservazione in “Total Time”. Il numero di misure verra’ automaticamente determinato. Notare che l’ intervallo tra le misure deve essere necessariamente superiore al tempo necessario per eseguire la misura. La combinazione Dei due modi sopra descritti porta all’ esecuzione di una misura tetra-dimensionale X-Y-Z-T

Impostazioni di immagini convenzionali monoparametriche. Selezionare la pagina “Modes” Questa pagina e’ composta da 10 sottopagine nelle quali e’ possibile impostare diversi modi di acquisizione, le linguette ch1 ch2….. chn colorate di blu indicano i canali attivi, per cominciare selezionare tutti i canali attivi e disattivarli eliminando nel riquadro Mode il segno di spunto sia su Convention. sia su Confocal. Selezionare il canale 1 Selezionare Mode Convention. Selezionare il modo di illuminazione tra Trasmissione e riflessione, in modo riflessione selezionare la griglia 4 per ottenere un campo aperto e in Weel color il colore di eccitazione. Cliccare il bottone Set, tutti i parametri verranno impostati. Far partire il preview, nella finestra di anteprima dovrebbe apparire l’immagine. Agire sul comando di Z del microscopio per mettere a fuoco l’ immagine, se il tempo di integrazione e’ molto lungo e’ conveniente metterla a fuoco guardando negli oculari. Impostare i valori di guadagno, offset e tempo di integrazione della camera per ottenere il miglior risultato possibile. Far partire l’acquisizione con il tasto Start Acquire. Terminata l’acquisizione il programma si pone automaticamente sulla pagina “Image manager” Mettere il segno di spunto nella casella Active di sinistra, selezionare Conv , gray e auto. Cliccare il bottone Display, Verra’ visualizzata l’immagine risultante. All’ inizio dell’ acquisizione il previw viene fermato e la ripartenza va effettuata manualmente, al termine dell’ acquisizione lo shutter viene chiuso, riaprirlo con il bottone Set.

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Impostazioni di immagini convenzionali multiparametriche. Selezionare la pagina “Modes” Selezionare tutti i canali attivi e disattivarli eliminando nel riquadro Mode il segno di spunto sia su Convention. sia su Confocal. Selezionare il canale 1 Selezionare Mode Convention. Selezionare il modo di illuminazione tra Trasmissione e riflessione, in modo riflessione selezionare la griglia 4 per ottenere un campo aperto e in Weel color il colore di eccitazione. Cliccare il bottone Set, tutti i parametri verranno impostati. Far partire il preview, nella finestra di anteprima dovrebbe apparire l’immagine. Agire sul comando di Z del microscopio per mettere a fuoco l’ immagine, se il tempo di integrazione e’ molto lungo e’ conveniente metterla a fuoco guardando negli oculari. Impostare i valori di guadagno, offset e tempo di integrazione della camera per ottenere il miglior risultato possibile. Ripetere il passo precedente per tutti i canali desiderati. Far partire l’acquisizione con il tasto Start Acquire. In questa modalita’ di funzionamento verranno eseguite successivamente le scansioni di ogni canale, i canali non selezionati non verranno eseguiti. Terminata l’acquisizione il programma si pone automaticamente sulla pagina “Image manager” Mettere il segno di spunto nella casella Active di sinistra, selezionare Conv ch1, red e auto. Mettere il segno di spunto nella casella Active di centro, selezionare Conv ch2 , green e auto. Cliccare il bottone Display, Verra’ visualizzata l’immagine risultante. In questa modalita’ si possono acquisire fino a 10 immagini in modalita’ differenti, ne possono pero’ essere visualizzate solo 3 contemporaneamente.

Acquisizione di immagine confocale monoparametrica. Selezionare la pagina “Modes” Selezionare tutti i canali attivi e disattivarli eliminando nel riquadro Mode il segno di spunto sia su Convention. sia su Confocal. Selezionare il canale 1 Selezionare Mode Confocal. Abilitare Conf acquisition e portare il relativo cursore di Smoothing tutto a sinistra. Selezionare la griglia desiderata e il numero di step con la quale effettuare la scansione ( per questi parametri vedere il capitolo relativo). Impostare in Weel color il colore di eccitazione. Cliccare il bottone Set, tutti i parametri verranno impostati. Far partire il preview: nella finestra di anteprima dovrebbe apparire l’immagine. Agire sul comando di Z del microscopio per mettere a fuoco l’ immagine, se il tempo di integrazione e’ molto lungo e’ conveniente metterla a fuoco guardando negli oculari. Impostare i valori di guadagno, offset e tempo di integrazione della camera per ottenere il miglior risultato possibile. Agire sul controllo Z grid position per mettere a fuoco la griglia sull’immagine. Far partire l’acquisizione con il tasto Start Acquire. Terminata l’acquisizione il programma si pone automaticamente sulla pagina “Image manager” Mettere il segno di spunto nella casella Active di sinistra, selezionare Conf ch1, gray e auto. Cliccare il bottone Display, Verra’ visualizzata l’immagine risultante.

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Acquisizione di immagine confocale multiparametrica. Selezionare la pagina “Modes” Selezionare tutti i canali attivi e disattivarli eliminando nel riquadro Mode il segno di spunto sia su Convention. sia su Confocal. Selezionare il canale 1 Selezionare Mode Confocal. Abilitare Conf acquisition e portare il relativo cursore di Smoothing tutto a sinistra. Selezionare la griglia desiderata e il numero di steps con la quale effettuare la scansione ( per questi parametri vedere il capitolo relativo). Impostare in Weel color il colore di eccitazione. Cliccare il bottone Set, tutti i parametri verranno impostati. Far partire il preview: nella finestra di anteprima dovrebbe apparire l’immagine. Agire sul comando di Z del microscopio per mettere a fuoco l’ immagine, se il tempo di integrazione e’ molto lungo e’ conveniente metterla a fuoco guardando negli oculari. Impostare i valori di guadagno, offset e tempo di integrazione della camera per ottenere il miglior risultato possibile. Agire sul controllo Z grid position per mettere a fuoco la griglia sull’immagine. Selezionare il canale 2 Ripetere tutti i passi precedenti variando i parametri desiderati, ad esempio se si vuole acquisire un’immagine che rappresenti l’emissione di un diverso fluorocromo, selezionare il filtro appropriato, regolare diversamente i valori di guadagno, offset, tempo di integrazione della camera e posizione di fuoco della griglia per ottenere il miglior risultato possibile, . Ripetere il passo precedente per tutti i canali desiderati. Far partire l’acquisizione con il tasto Start Acquire. In questa modalità di funzionamento verranno eseguite successivamente le scansioni di ogni canale, i canali non selezionati non verranno eseguiti. Terminata l’acquisizione il programma si pone automaticamente sulla pagina “Image manager” Mettere il segno di spunto nella casella Active di sinistra, selezionare Conf ch1, red e auto. Mettere il segno di spunto nella casella Active di centro, selezionare Conf ch2 , green e auto. Cliccare il bottone Display, Verra’ visualizzata l’immagine risultante. In questa modalita’ si possono acquisire fino a 10 immagini in modalita’ differenti, ne possono pero’ essere visualizzate solo 3 contemporaneamente.

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Criteri per la selezione della griglia di scansione confocale (Modelli 80i-TE2000) Per la raccolta di immagini confocali è necessario disporre di dispositivi per l'illuminazione a "campo-ristretto" del campione. Ciò si ottiene con l'inserimento di apposite griglie di modulazione nel piano focale del sistema di illuminazione. Ogni griglia permette il passaggio della luce entro aperture quadrate disposte su un reticolo quadrato ed è quindi caratterizzata dal lato delle aperture (SIDE) e dal passo tra di esse (PITCH). L’apposito dispositivo di traslazione permette di scegliere da programma la griglia desiderata, di metterla a fuoco. Inoltre, durante la raccolta delle immagini, viene comandata la scansione della griglia che permette di illuminare l'intera area presa in esame. Si dispone di 8 griglie (Fig. 1). La 0/0 consiste in un unica apertura che copre tutto il campo in modo da poter usare il microscopio in modalità a “vasto-campo” senza dover rimuovere la maschera. Le restanti 7 offrono una serie di combinazioni tra 4 aperture, da 4 a 32 µm, e 3 passi, da 16 a 64 µm (Fig. 2). Per ricostruire una sezione ottica da una serie di immagini acquisite, la scansione deve coprire l’intero campo visualizzato, una spaziatura maggiore richiede quindi un maggior numero di immagini parziali. I criteri di scelta della griglia da utilizzare per l’acquisizione di immagini confocali sono molteplici ed a volte in contrasto tra di loro. Si ha un migliore risoluzione spaziale ed un migliore sezionamento ottico usando griglie con fori piccoli. In genere, è bene avvicinarsi alle dimensioni degli elementi sensibili della camera CCD, anche tenendo presente l'eventuale attivazione della funzione di "binning". Ad esempio, aperture di 8 µm possono essere usate per sfruttare al meglio la risoluzione spaziale della camera CCD. Per quanto riguarda la scelta del rapporto apertura/passo si cerca possibilmente di mantenersi entro valori bassi in modo da coprire con poche acquisizioni l’area interposta tra le aperture. Ad esempio, per la totale copertura del campo osservato, usando la griglia 16/64 (apertura di 16 µm e passo di 64 µm con rapporto passo/foro = 4) devono essere effettuati un minimo di 4 spostamenti in orizzontale e 4 in verticale per un totale di 16 immagini. Usando invece, la griglia 8/64 le immagini da acquisire per ottenere una sezione ottica diventano 8*8=64. D’altra parte, un maggiore rapporto apertura/passo permette una migliore contrasto dell’immagine mentre se le aperture sono troppo ravvicinate, specialmente in presenza di un preparato spesso e denso, il contrasto può abbassarsi tanto da rendere impossibile la misura. Si deve infatti tenere presente che una percentuale della luce che penetra nel preparato viene diffusa e diffratta. Pertanto, l’immagine del campione illuminato spesso non mostra un netto alternarsi di zone illuminate e zone buie, ma appare smussata. Quest’ultimo effetto influisce anche sul numero di immagini da acquisire: se è alto ne diminuisce il numero, se è basso lo aumenta. Dal rapporto apertura/passo dipende anche l’efficienza di illuminazione. Quindi, anche se con l’aumento del passo si rallentano le analisi, una minore quantità di luce viene inviata al campione e non aumenta la foto-invasività dell’analisi. Ricapitolando: - Aperture piccole: maggior risoluzione spaziale; - Aperture grandi: maggiore illuminazione - Passi piccoli: maggiore rapidità di analisi; - Passi grandi: maggior contrasto anche in preparati spessi e densi; Griglie adatte a buona parte delle applicazioni sono 32/64 per la buona rapidità di analisi, 8/64 per la buona risoluzione spaziale e 16/64 per un favorevole compromesso tra le due.

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Schema di posizionamento delle griglie di modulazione sulla maschera

Figura 1

Dimensione in µm fori e interasse griglie

Nome Foro Interasse0/0 Aperta 16/32 16 32 32/64 32 64 8/32 8 32 16/64 16 64 4/16 4 16 8/64 8 64 4/32 4 32

Figura 2

23

R

ipro

duzi

one

non

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ala

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mas

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Figura 3

24

64 µ

m

32 µ

m

16 µ

m Wid

e fie

ld

32x3

2µm

16x1

6µm

8x8

µm

4x4

µm

1 / 1

1 / 2

1 / 4

1 / 8

1 / 1

1 / 4

1 / 1

61

/ 64

Figura 4

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Criteri per la selezione della griglia di scansione confocale (Modello Ti) Per la raccolta di immagini confocali è necessario disporre di dispositivi per l'illuminazione a "campo-ristretto" del campione. Ciò si ottiene con l'inserimento di apposite griglie di modulazione nel piano focale del sistema di illuminazione. Ogni griglia permette il passaggio della luce entro aperture quadrate disposte su un reticolo quadrato ed è quindi caratterizzata dal lato delle aperture (SIDE) e dal passo tra di esse (PITCH). L’apposito dispositivo di traslazione permette di scegliere da programma la griglia desiderata, di metterla a fuoco. Inoltre, durante la raccolta delle immagini, viene comandata la scansione della griglia che permette di illuminare l'intera area presa in esame. Si dispone di 4 griglie (Fig. 5) piu’ la 0/0 che consiste in un unica apertura che copre tutto il campo in modo da poter usare il microscopio in modalità a “vasto-campo” senza dover rimuovere la maschera. Le 4 griglie offrono una serie di combinazioni tra 3 aperture, da 8 a 32 µm, e 2 passi: 64 e 128 µm (Fig. 6). Per ricostruire una sezione ottica da una serie di immagini acquisite, la scansione deve coprire l’intero campo visualizzato, una spaziatura maggiore richiede quindi un maggior numero di immagini parziali. I criteri di scelta della griglia da utilizzare per l’acquisizione di immagini confocali sono molteplici ed a volte in contrasto tra di loro. Si ha un migliore risoluzione spaziale ed un migliore sezionamento ottico usando griglie con fori piccoli. In genere, è bene avvicinarsi alle dimensioni degli elementi sensibili della camera CCD, anche tenendo presente l'eventuale attivazione della funzione di "binning". Ad esempio, aperture di 8-16 µm possono essere usate per sfruttare al meglio la risoluzione spaziale della camera CCD. Per quanto riguarda la scelta del rapporto apertura/passo si cerca possibilmente di mantenersi entro valori bassi in modo da coprire con poche acquisizioni l’area interposta tra le aperture. Ad esempio, per la totale copertura del campo osservato, usando la griglia 16/64 (apertura di 16 µm e passo di 64 µm con rapporto passo/foro = 4) devono essere effettuati un minimo di 4 spostamenti in orizzontale e 4 in verticale per un totale di 16 immagini. Usando invece, la griglia 8/64 le immagini da acquisire per ottenere una sezione ottica diventano 8*8=64. D’altra parte, un maggiore rapporto apertura/passo permette una migliore contrasto dell’immagine mentre se le aperture sono troppo ravvicinate, specialmente in presenza di un preparato spesso e denso, il contrasto può abbassarsi tanto da rendere impossibile la misura. Si deve infatti tenere presente che una percentuale della luce che penetra nel preparato viene diffusa e diffratta. Pertanto, l’immagine del campione illuminato spesso non mostra un netto alternarsi di zone illuminate e zone buie, ma appare smussata. Quest’ultimo effetto influisce anche sul numero di immagini da acquisire: se è alto ne diminuisce il numero, se è basso lo aumenta. Dal rapporto apertura/passo dipende anche l’efficienza di illuminazione. Quindi, anche se con l’aumento del passo si rallentano le analisi, una minore quantità di luce viene inviata al campione e non aumenta la foto-invasività dell’analisi. Ricapitolando: - Aperture piccole: maggior risoluzione spaziale; - Aperture grandi: maggiore illuminazione - Passi piccoli: maggiore rapidità di analisi; - Passi grandi: maggior contrasto anche in preparati spessi e densi; Griglie adatte a buona parte delle applicazioni sono 32/128 per la buona rapidità di analisi, 16/128 per la buona risoluzione spaziale e 16/64 per un favorevole compromesso tra le due.

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Schema di posizionamento delle griglie di modulazione sulla maschera

Figura 5

Dimensione in µm fori e interasse griglie

Nome Foro Interasse0/0 Aperta 16/128 16 128 8/64 8 64 32/128 32 128 16/64 16 64

Figura 6

27

Rip

rodu

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asch

era

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Figura 7

28

128

µm

64µm

Wid

e fie

ld

32x3

2µm

16x1

6µm

8x8

µm

1 / 1

1 / 4

1 / 8

1 / 1

1 / 1

61

/ 64

Figura 8

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