Clostridium difficile-påvisning av toksin i cellekultur

Hege Enger

Svein Arne Nordbø

St Olavs Hospital

Clostridium difficile

• Apatogen og patogen form– den patogene formen er toksinproduserende

– men produksjon av toksin alene er ikke nok til å gi sykdom

• Toksin A: enterotoksin, kjemotaktisk for nøytrofile granulocytter som infiltrerer ileum og frigjør toksiner. Cytopatogen effekt, ødeleggelse av tight junctions mellom cellene og økt permeabilitet av tarmveggen

– vanndig diare

• Toksin B: cytotoksin, depolymeriserer aktin, gir ødelagt cytoskjelett– colitt

• De fleste patogene Clostridium difficile har både toksin A og B, men toksin B er ansett å være mer sykdomsfremkallende

• Ribotype 027– hypervirulent stamme

– høyere toksinproduksjon

– i tillegg et binært toksin

– mer alvorlig klinikk

Forutsetning for Clostridium difficile-infeksjon

• Forstyrrelse av normal tykktarmsflora

– antibiotikabehandling, spesielt bredspektret

– normal tarmflora beskytter mot sykdom

• Eksposisjon for toksinproduserende CD-stamme

– toksin A og B

– skjer vanligvis på sykehus eller sykehjem

• Vertsfaktorer/mottagelighet for infeksjon

– nyfødte har høy forekomst av toksinproduserende CD, men sjelden sykdom(mangler reseptorer)

– høy alder

– alvorlig sykdom

• Smitte skjer fra person til person(kontaktsmitte) eller via kontaminert miljø(sporene kan overleve i lang tid)

• Inkubasjonstid: få dager-8 uker

Bærertilstand av Clostridium difficile

• Spedbarn <1 år:

– 30-50 %. De utvikler sjelden Clostridium difficile-assossiert sykdom, sannsynligvis fordi tarmcellene mangler reseptorer for toksinet

• Friske voksne:

– 3-5 %

• Hospitaliserte, sengeliggende pasienter:

– 10-50 %

Romney et al: Laboratory Diagnosis of Bacterial

Gastroenteritis(CMR jan 2015)

Klinikk

• Varierende sykdomsgrad

– Clostridium difficile- assossiert diare

– Clostridium difficile- assossiert colitt

– Pseudomembranøs colitt

– Toksisk megacolon

Diagnostikk, St Olav

• Avføringsprøve uten tilsetning

• Tidligere:

– ELISA-test med påvisning av toksin A og B

– real-time-PCR med påvisning av toksin B, dyrkning av positive

• Nå:

– bredt panel av PCR-tester, inkl C.difficile

– de som bare ber om C.difficile, får inhouse –PCR

– PCR-positive prøver: dyrkning på FA-skål og CD agar

– Dyrkningspositive->ny PCR for bekreftelse

• Ribotyping retrospektivt (alle inneliggende)

Hvorfor toksinpåvisning i cellekultur?

• Få laboratorier bruker den i rutinediagnostikken – høyt prøvevolum

– mer ressurskrevende enn f eks PCR

• Men:

• Er PCR for sensitivt? Mange publikasjoner støtter dette

• PCR skiller ikke mellom bærerskap og infeksjon, mulig at toksinpåvisning i cellekultur skiller bedre? Påvisning av toksineffekt

versus påvisning av genet for toksinet *

• Toksinpåvisning i cellekultur historisk ansett som gullstandard

• *The Lancet Infectious Diseases 2013: Differences in outcome according to Clostridium difficile testing method: a prospective multicentre diagnostic validation study of C difficile infection

Metode

• Kommersielt kit med toksin og antitoksin (Techlab, Alere)

• Vi testet ut HE-celler, TMG1 og LLC-MK2-celler, som allerede benyttes i rutinen på virus dyrkningslab

– HE-celler(Humane Embryonale fibroblaster) fungerte best

• Sannsynligvis bare toksin B som påvises, toksin A gir bare toksineffekt på spesialceller(HT29-celler)*

• Prosedyre:

– forbehandling av fæces

– fortynning av fæces, toksin og antitoksin

– tilsetting i cellekultur

– Avlesning etter 18-24 timer

*Manual of Clinical Microbiology, 10th edition

Forbehandling av fæces/fortynning

Forbehandling av fæces

• Flytende konsistens: bruker volum 1-1,5 ml

• Fastere konsistens: blandes med virusdyrkningsmedium til volum ca 1-1,5 ml

• Sentrifugeres 10 min

• Supernatant filtreres gjennom 450 µm membran

Fortynning

• Fæces 1:100

• Toksin 1:100

• Antitoksin 1:25

Utsæd i cellekultur og avlesning av CPE

• Utsæd:

– Fortynnet fæcesprøve tilsettes cellekultur med HE-celler

– Fortynnet fæces + antitoksin tilsettes i parallell brønn med HE-celler for å se etter opphevet toksineffekt/nøytralisasjon

• Avlesning:

– Kan se ganske umiddelbar toksineffekt i noen tilfeller, men anbefalt avlesning skjer etter 18-24 timer

– Positiv test dersom typisk CPE(cytopatogen effekt) i brønn tilsatt fortynnet fæces og dersom toksineffekt oppheves i parallell brønn tilsatt fortynnet fæces og antitoksin

Normale HE-celler(negativ kontroll)

Positiv kontroll

CPE grad 4 i pasientprøve

Nøytralisasjon(fæces tilsatt antitoksin)

Resultater

• Til sammen 70 PCR-positive prøver testet

• Positive i cellekultur: 55 (79 %)

• Negative i cellekultur: 15 (21 %)(inkludert 1 som var litt usikker)

• Dersom prøver med sparsomt materiale ble ekskludert: 62

• Positive i cellekultur: 50 (81%)

• Negative i cellekultur: 12 (19%)

Resultater

Pos i cellekultur Neg i cellekultur

Gjennomsnittlig CT-verdi 29,96 32,06

Pos i cellekultur Neg i cellekultur

CT≥35(12 prøver) 7(58%) 5(42%)

Pos i cellekultur Neg i cellekultur

CT<35(57 prøver) 48(84%) 9(16%)

Konsistens

• Registrert på 49 av prøvene

• 10 av 49 prøver hadde fast konsistens

• CT-verdier: 40-40-39-40-29-36-32-28-26-28

• Fast konsistens utelukker ikke positivt resultat (verken for PCR eller cellekultur)

• Unødvendig prøvetaking, da disse pasientene per definisjon ikke har Clostridium difficile-assossiert diare og etter retningslinjene ikke skal ha behandling. Avvisning av slike prøver har vært praktisert tidligere

Pos i cellekultur Neg i cellekultur

10 prøver 7 3

Hva med de PCR-positive som ble negative i cellekultur?

• 15 prøver/pasienter

• 10 var testet for tarmpatogene: negative

• 3 var testet for norovirus: negative

– 1 av disse 3 var også testet for andre virus(adeno og rota): negativ

De PCR-positive og cellekultur negative

Pas 1 Barn kreft Nøytropenfeber

Pas 9 Fastlege Ktr. etter beh. Cl.diff

Pas 2 ØNH Løs mage Pas 10 Gastro pol Ulcerøs colitt 6 mndr.

Pas 3 Gastrokir Diare Pas 11 Ort avd Slim, hyppig avføring

Pas 4 Gastrokir Diare x 11, CRP 200

Pas 12 Fastlege Løs og hyppig avføring

Pas 5 Med OSS Høy feber, red AT

Pas 13 Fastlege Vært i Tyrkia, diare

Pas 6 Gastro pol Løs avf 1 mnd

Pas 14 Øya helsehus

Ingen kliniske opplysninger

Pas 7 Med OSS Nitritt pos Pas 15 Ort avd Tyntflytende vanndigdiare 1 døgn

Pas 8 Nyre/endo Redusert AT, diare

Hva skjer videre?

• Cellekultur i tillegg til PCR på PCR-positive med usikre symptomer?

• Cellekultur på PCR-negative med høy klinisk mistanke om Clostridium difficile-infeksjon?

– Vi har ikke testet PCR-negative bortsett fra en prøve med rotavirus(som ble negativ i cellekultur). Sensitivitet har ikke vært beskrevet som et problem med PCR

• Vi sliter med leveranse av antitoksin…..