Upload
others
View
6
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZA V MARIBORU
MEDICINSKA FAKULTETA
DOKTORSKA DISERTACIJA
NOVI MEHANIZMI TOKSIČNOSTI PRI BAKTERIJI
Clostridium difficile
OKTOBER, 2010 Mateja Zemljič
UNIVERZA V MARIBORU
MEDICINSKA FAKULTETA
DOKTORSKA DISERTACIJA
NOVI MEHANIZMI TOKSIČNOSTI PRI BAKTERIJI
Clostridium difficile
DOCTORAL DISSERTATION
A NEW MECHANISMS OF TOXICITY IN Clostridium
difficile
OKTOBER, 2010 Mateja Zemljič
MENTORICA: izr. prof. dr. Maja Rupnik
UDK
615.9:579.852.13(043.3)
616.98-092:577.1/.2.083.3(043.3)
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. II
KAZALO VSEBINE
1 UVOD ......................................................................................................................... 1
1.1 PRIČAKOVANI IZVIRNI ZNANSTVENI PRISPEVKI ............................... 1
2 PREGLED OBJAV ..................................................................................................... 3
2.1 BAKTERIJA Clostridium difficile IN BOLEZNI, KI JIH POVZROČA ........ 3
2.2 BAKTERIJSKI TOKSINI KOT DEJAVNIKI VIRULENCE ......................... 4
2.2.1 Citolitični (hemolitični) bakterijski toksini ................................................... 5
2.3 Toksini, ki tvorijo pore (PFT) ........................................................................... 5
2.3.1.1.1 Od holesterola odvisni citolizini (CDC)............................................. 6
2.3.1.1.2 Toksini, ki tvorijo majhne pore (ang. "small PFT") ........................... 7
2.3.1.1.3 RTX toksini ("repeats found in each toxin") ...................................... 7
2.3.1.2 Citolitični encimi ................................................................................... 8
2.3.1.3 Toksini z neznanim mehanizmom delovanja ...................................... 11
2.3.2 Toksini bakterij iz rodu Clostridium ........................................................... 11
2.3.3 Toksini bakterije Clostridium difficile ........................................................ 12
2.3.3.1 Zgradba TcdA, TcdB in CDT .............................................................. 13
2.3.3.2 Molekularni mehanizem delovanja TcdA, TcdB in CDT ................... 15
2.3.3.3 Vloga toksinov TcdA in TcdB v patogenezi ....................................... 18
2.3.3.4 Vloga toksina TcdB v patogenezi ........................................................ 20
2.3.3.5 Vloga N-terminalne in C-terminalne domene v patogenezi ................ 20
2.4 MODELI ZA ŠTUDIJ PATOGENEZE C. difficile ....................................... 21
2.4.1 In vitro modeli za študij patogeneze C. difficile ......................................... 21
2.4.2 In vivo modeli za študij patogeneze C. difficile .......................................... 22
2.4.2.1 Ţivalski modeli za študij okuţbe s C. difficile ..................................... 22
2.4.2.2 Nevretenčarski ţivalski modeli za študij okuţbe s C. difficile ............ 23
2.5 AVTOFAGIJA IN NJENA VLOGA PRI NASTANKU CELIČNE SMRTI 24
3 MATERIALI IN METODE ...................................................................................... 26
3.1 BAKTERIJSKI SEVI IN GOJENJE BAKTERIJ .......................................... 26
3.1.1 Clostridium difficile .................................................................................... 26
3.1.2 Escherichia coli .......................................................................................... 26
3.2 CELIČNE LINIJE IN GOJENJE CELIC ....................................................... 27
3.3 PRIPRAVA REKOMBINANTNE C-TERMINALNE VEZAVNE DOMENE
TOKSINA B (rec-TcdB3VPI, 8864) ...................................................................................... 28
3.4 MERJENJE CELOKUPNE KONCENTRACIJE PROTEINOV Z METODO
BCA ........................................................................................................................ 29
3.5 DOLOČANJE CELIČNE VIABILNOSTI S TESTOM MTT ...................... 29
3.6 DOLOČANJE DELEŢA CELIC V POSAMEZNIH FAZAH CELIČNEGA
CIKLA S PRETOČNIM CITOMETROM Z UPORABO PROPIDIJEVEGA JODIDA
(PI) ........................................................................................................................ 30
3.7 METODA S FLUORESCENTNO OZNAČENIM PROTEINOM ANEKSIN-
V (AV) IN BARVILOM PROPIDIJEV JODID (PI) ZA DOLOČANJE DELEŢA
APOPTOTIČNIH CELIC S PRETOČNIM CITOMETROM .......................................... 30
3.8 SLEDENJE PROTEINOV BCL-2, BAX IN PARP Z NADS-PAGE, S
PRENOSOM PO WESTERNU IN IMUNODETEKCIJO ............................................... 31
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. III
3.9 DOLOČANJE AKTIVNOSTI IZVRŠITELJSKE KASPAZE-3 S
PRETOČNIM CITOMETROM ........................................................................................ 31
3.10 SLEDENJE APOPTOZE Z VSE-KASPAZNIM ZAVIRALCEM Z-VAD-
FMK (BENZYLOXYCARBONYL-VAL-ALA-ASP-FLUOROMETHYLKETONE) .. 32
3.11 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE PREKO TVORBE
REAKTIVNIH KISIKOVIH SPOJIN (ROS) S TESTOM MTT ..................................... 32
3.12 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE PREKO TVORBE
REAKTIVNIH KISIKOVIH SPOJIN (ROS) S PRETOČNIM CITOMETROM ........... 33
3.13 MERJENJE MITOHONDRIJSKEGA MEMBRANSKEGA POTENCIALA
(MMP) S PRETOČNIM CITOMETROM ....................................................................... 33
3.14 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE Z DIFERENCIALNIM
BARVANJEM Z BARVILOM DIHIDRORODAMIN 123 (DHR 123) ........................ 34
3.15 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z UPORABO BARVILA AKRIDIN ORANŢNO
(AO) ZA KONFOKALNO MIKROSKOPIJO ................................................................. 34
3.16 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z UPORABO BARVILA AKRIDIN ORANŢNO
(AO) S PRETOČNIM CITOMETROM ........................................................................... 34
3.17 SLEDENJE PROTEINOV LC3 IN KATEPSINA B ZA UGOTAVLJANJE
AVTOFAGIJE Z NADS-PAGE, S PRENOSOM PO WESTERNU IN
IMUNODETEKCIJO ....................................................................................................... 35
3.18 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z METODO PCR V REALNEM ČASU (RT-
PCR) ........................................................................................................................ 35
3.19 SLEDENJE INHIBICIJE AVTOFAGIJE S TESTOM MTT ........................ 38
3.19.1 Določanje celične viabilnosti z inhibitorji avtofagije ................................. 38
3.19.2 Določanje celične viabilnosti po transfekciji celic za utišanje izraţaja gena
becn1 ..................................................................................................................... 38
3.20 SPREMEMBE V AKTINSKEM CITOSKELETU ....................................... 38
3.21 IMUNOFLUORESCENCA PROTEINA TESNIH STIKOV ZO-1 .............. 39
3.22 TRANSEPITELNA ELEKTRIČNA UPORNOST (TEER) CELIC T84 ...... 39
3.23 DOLOČANJE KONCENTRACIJE IL-8 PRI CELICAH HT-29 Z
IMUNSKIM TESTOM ELISA ......................................................................................... 40
3.24 UGOTAVLJANJE UČINKA SEVOV BAKTERIJE C. difficile NA
ERITROCITE ................................................................................................................... 41
3.24.1 Hemoliza β in sevi bakterije C. difficile ..................................................... 41
3.24.2 Ugotavljanje hemolitične aktivnosti supernatanta kulture na eritrocitih .... 42
3.25 NEMATOD C. elegans KOT ŢIVALSKI MODEL ZA OKUŢBO Z
BAKTERIJO C. difficile .................................................................................................. 43
3.25.1 Nematod C. elegans in pogoji vzdrţevanja ................................................ 43
3.25.2 Ugotavljanje učinka TcdB in supernatantov sevov C. difficile na C. elegans
..................................................................................................................... 44
3.25.3 Ugotavljanje učinka sevov C. difficile na C. elegans ................................. 44
3.26 STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV ............................................ 44
4 REZULTATI ............................................................................................................. 45
4.1 UČINEK TOKSINA B (TcdB) IN REKOMBINANTNE VEZAVNE
DOMENE TOKSINA B (rec-TcdB3) NA VIABILNOST CELIC .................................. 45
4.1.1 Določanje celične viabilnosti s testom MTT v prisotnosti TcdB in rec-
TcdB3 ..................................................................................................................... 45
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. IV
4.2 UČINEK TOKSINA B (TcdB) IN REKOMBINANTNE VEZAVNE
DOMENE TOKSINA B (rec-TcdB3) NA APOPTOZO .................................................. 47
4.2.1 Deleţ celic v posameznih fazah celičnega cikla in deleţ apoptotičnih celic v
subG1 fazi v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3 ............................................................ 47
4.2.2 Določanje deleţa apoptotičnih in nekrotičnih celic z barvilom aneksin-V
(AV) in barvilom propidijev jodid (PI) v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3 ................ 49
4.2.3 Določanje aktivnosti izvrševalne kaspaze-3 s pretočno citometrijo v
prisotnosti rec-TcdB3 ................................................................................................ 51
4.2.4 Detekcija apoptoze s sledenjem Bcl-2, Bax in cepitve PARP v prisotnosti
rec-TcdB3 ................................................................................................................. 52
4.2.5 Prisotnost vse-kaspaznega zaviralca Z-VAD-FMK (benzyloxycarbonyl-
Val-Ala-Asp-fluoromethylketone) ............................................................................ 54
4.2.6 Določanje membranskega mitohondrijskega potenciala (MMP) v
prisotnosti rec–TcdB3 ............................................................................................... 55
4.2.7 Ocena znotrajcelične oksidacije s testom MTT v prisotnosti rec-TcdB3 ... 57
4.2.8 Ocena znotrajcelične oksidacije s pretočno citometrijo v prisotnosti rec-
TcdB3 ..................................................................................................................... 58
4.2.9 Ocena znotrajcelične oksidacije s konfokalno mikroskopijo v prisotnosti
TcdB in rec-TcdB3 ................................................................................................... 59
4.3 UČINEK TOKSINA B (TcdB) NA AVTOFAGIJO ..................................... 61
4.3.1 Diferencialno barvanje morfoloških sprememb celic z akridin oranţnim
(AO) ..................................................................................................................... 61
4.3.2 Dokazovanje kislih vezikularnih organelov z uporabo pretočne citometrije ..
..................................................................................................................... 63
4.3.3 Sinteza proteinov LC3 in katepsina B ........................................................ 64
4.3.4 Izraţanje genov vpletenih v proces avtofagije ............................................ 65
4.3.5 Inhibicija avtofagije s testom MTT ............................................................ 68
4.4 UČINEK TcdB IN rec-TcdB3 NA CITOSKELET ........................................ 71
4.4.1 Reorganizacija aktina .................................................................................. 71
4.4.2 Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na protein tesnih stikov ZO-1 ........................... 73
4.4.3 Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na transepitelno električno upornost (TEER) celic
T84 ..................................................................................................................... 74
4.5 VPLIV TcdB IN rec-TcdB3 NA IZRAŢANJE IL-8 V CELICAH HT-29 .... 76
4.6 HEMOLITIČNA AKTIVNOST BAKTERIJE C. difficile ........................... 77
4.6.1 Hemoliza β in sevi bakterije C. difficile ..................................................... 77
4.6.2 Hemolitična aktivnost supernatanta kulture ................................................ 78
4.7 ŢIVALSKI MODEL NEVRETENČAR C. elegans ...................................... 81
4.7.1 Učinki TcdB in supernatantov sevov C. difficile na C. elegans ................. 81
4.7.2 Učinki sevov bakterije C. difficile na C. elegans ........................................ 81
5 RAZPRAVA IN SKLEPI ......................................................................................... 82
5.1 RAZPRAVA ................................................................................................... 82
5.1.1 Novi mehanizmi delovanja ţe znanih toksinov .......................................... 82
5.1.1.1 Celična smrt - apoptoza, nekroza ali avtofagija .................................. 83
5.1.2 C-terminalna vezavna domena toksina B vpliva na prerazporeditev
aktinskih filamentov in ZO-1 .................................................................................... 86
5.1.3 Motena regulacija imunskega sistema ........................................................ 87
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. V
5.1.4 C. difficile in hemolitična aktivnost ............................................................ 88
5.1.5 Ţivalski model nevretenčar C. elegans ....................................................... 89
5.2 SKLEPI ........................................................................................................... 89
6 POVZETEK .............................................................................................................. 91
7 VIRI .......................................................................................................................... 94
8 ZAHVALA ............................................................................................................. 109
9 PRILOGE ................................................................................................................ 110
9.1 ČLANEK KOT DEL DOKTORSKE NALOGE ......................................... 110
9.2 ŢIVLJENJEPIS ............................................................................................ 116
9.3 OSEBNA BIBLIOGRAFIJA ZA OBDOBJE 1996-2010 ............................ 117
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. VI
KAZALO SLIK
Slika 1. Toksini bakterije Clostridium difficile.. .............................................................. 15
Slika 2. Receptorska vezavna podenota (RBD) toksina reagira s celičnim receptorjem. 17
Slika 3. Učinek TcdB in rec-TcdB3 na celično viabilnost.. ............................................. 46
Slika 4. A. Razdelitev celic v posameznih fazah celičnega cikla.. ................................... 48
Slika 5. Rezultati analize pretočne citometrije. ................................................................ 50
Slika 6. Rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 aktivirata kaspazo-3.. ....................................... 52
Slika 7 Rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 sproţita izraţanje Bcl-2 (29 kDa) in Bax (23
kDa). ................................................................................................................................. 52
Slika 8. Slika filma po prenosu Western prikazuje cepitev PARP po tretiranju z rec-
TcdB3VPI in rec-TcdB8864 (100 μg/ml).. ............................................................................ 53
Slika 9. Deleţ ţivih, zgodnje in pozno apoptotočnih celic ter nekrotičnih celic po analizi
s pretočnim citometrom z metodo Aneksin-V/Propidijev jodid.. ..................................... 54
Slika 10. Vloga mitohondrijskega membranskega potenciala pri celicah tretiranih z rec-
TcdB3VPI, 8864, ki sproţijo apoptozo.. ............................................................................... 56
Slika 11. Učinek rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 v prisotnosti NAC (N-acetyl-L-cysteine)
in GST (glutathione S-transferase) na celično viabilnost.. ............................................... 57
Slika 12. Rezultati analize pretočne citometrije celic HT-29 . ......................................... 58
Slika 13. Tvorba znotrajceličnih ROS pri celicah HT-29. ............................................... 60
Slika 14. Celice obarvane z akridin oranţnim smo opazovali s konfokalnim
mikroskopom.. .................................................................................................................. 61
Slika 15. Prikaz diagramov in histogramov netretiranih celic in celic tretiranih. ............ 63
Slika 16. TcdBVPI in TcdB8864 sproţita izraţanje proteina LC3.. ..................................... 64
Slika 17. TcdBVPI in TcdB8864 sproţita izraţanje proteina katepsina B (39 kDa).. .......... 65
Slika 18 Stopnja izraţanja gena lc3 pri različnih časih inkubacije.. ................................ 66
Slika 19. Stopnja izraţanja gena becn1 pri različnih časih inkubacije.. ........................... 67
Slika 20. Učinki TcdB in zaviralcev avtofagije na celično viabilnost.. ........................... 68
Slika 21. Učinki TcdB in siRNA na celično viabilnost. ................................................... 70
Slika 22. TcdB in rec-TcdB3 povzročita reorganizacijo aktinskih niti.. .......................... 72
Slika 23. Vpliv TcdB in rec- TcdB3 na organizacijo ZO-1.. ............................................ 74
Slika 24. Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na TEER.. ................................................................ 75
Slika 25. TcdB in rekombinantna vezavna domena TcdB bakterije C. difficile sproţita
izločanje IL-8.. .................................................................................................................. 76
Slika 26. Netoksinogeni sev bakterije C. difficile C23 (levo) in toksigeni sev AT11 .. ... 78
Slika 27. Izbrani pogoji, s katerimi smo ugotavljali hemolitično aktivnost supernatantov
izbranih sevov bakterije C. difficile.. ................................................................................ 80
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. VII
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1. Toksini in encimi, ki jih izločajo citolitične bakterije in njihovi
patogenetični učinki. ......................................................................................................... 10
Preglednica 2. Sestava reakcijske mešanice za RT-PCR. ............................................... 36
Preglednica 3. Uporabljeni začetni oligonukleotidi za RT-PCR. .................................... 37
Preglednica 4. Sestava gojišča za ugotavljanje hemolitične aktivnosti bakterije
Clostridium difficile. ......................................................................................................... 41
Preglednica 5. Različni pogoji za hemolitično aktivnost supernatanta kulture. ............. 43
Preglednica 6. Rezultati zaznavanja hemolize sevov bakterije Clostridium difficile na
gojiščih, ki se med seboj razlikujejo po sestavi in občutljivosti za hemolizo. .................. 78
Preglednica 7. Različni pogoji za hemolitično aktivnost supernatanta kulture. ............. 79
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. VIII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
A450 absorbanca (negativni logaritem prepustnosti) pri valovni dolţini 450
nm
APS amonijev persulfat
AO akridin oranţno (ang. »Acridin Orange«)
AV aneksin V
Bak beljakovina pospeševalka apoptoze (ang. »Bcl-2 homologus
antagonist«)
Bax beljakovina zaviralka apoptoze (ang. »Bcl-2 associated protein x«)
Bcl-2 beljakovina pospeševalka apoptoze (ang. »B-cell lymphoma/leukemia
2«)
BCA reagent cicinhoninsko-kislinski reagent
BHI gojišče BHI (ang. »Brain Heart Infusion«)
bp bazni par
BSA goveji serumski albumin (ang. »Bovine Serum Albumin«)
cDNA komplementarna deoksiribonukleinska kislina (ang. »complementary
DNA«)
C. difficile Clostridium difficile
C. elegans Caenorhabditis elegans
CDC od holesterola odvisni citolizin (ang. »cholesterol dependent
cytolysin«)
CDT binarni toksin C. difficile
COH krvni agar (ang. »Columbia agar«)
Da Dalton (enota za molekulsko maso, ki ustreza 1/12 mase ogljikovega
atoma 12
C)
dH2O deionizirana voda
DHR 123 dihidrorodamin 123
D-MEM gojišče za celice (ang. »Dulbecco's Modified Eagle Medium«)
DNA deoksiribonukleinska kislina
DTT ditiotreitol
EDTA etilendiaminotetraocetna kislina
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. IX
EU enota za encimsko aktivnost
FBS serum govejega fetusa (ang. »Fetal Bovine Serum«)
g gram
GST glutation transferaza (ang. »glutathione S-transferase«)
HBSS (ang. »Hank's Balanced Salt Solution«)
IL-8 interlevkin 8
IPTG izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid
KA krvni agar
kbp tisoč baznih parov
l liter
JC-1 5,5',6,6'-tetrakloro-1,1,3,3'-tetraetilbenzimidazolilkarbocijanin iodid
LB-medij Luria-Bertanijev medij
LC3 zaznamovalec avtofagije (ang. »microtubule-associated protein1 light
chain 3»)
LCT veliki klostridijski toksini (ang. »Large Clostridial Toxins«)
LLO listeriolizin O
M molarnost
mg miligram
µg mikrogram
µl mikroliter
MEM NEA (ang. »Minimum Essential Medium with Non-Essential Amino Acids«)
min minuta
ml mililiter
mRNA informacijska RNA (ang. » messenger RNA«)
MMP mitohondrijski membranski potencial (ang. »Mitochondrail Membrane
Potentia«l)
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolium bromid (ang. »(3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide«)
NAC N-acetil-L cistein (ang. »N-acetyl-L-cysteine«)
NaDS natrijev dodecil sulfat (ang. »sodium dodecyl sulfate«)
NGM gojišče za C.elegans (ang. »Nematode Growth Medium»)
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. X
obr/min število obratov v eni minuti
OCD okuţba z bakterijo Clostridium difficile
OD620 optična gostota (ang. "optical density") pri valovni dolţini 620 nm
PaLoc patogenski lokus (ang. "Pathogenicity Locus")
PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza
PARP tarčna beljakovina kaspaze 3 (ang. "poly(ADP-ribose) polymerase")
PBS fosfatni pufer s soljo (ang. "Phoshate-buffered saline")
PCR reakcija veriţnega pomnoţevanja s polimerazo (ang. "Polymerase
Chain Reaction")
pH negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov
PFO perfringolizin O
PFT toksin, ki tvori pore (ang. "pore-forming toxin")
PI propidijev jodid (ang. "Propidium Iodide")
PMSF fenil-metil-sulfonil-fluorid (ang. "phenylmethylsulfonyl fluoride")
PVDF poliviniliden difluorid
rec-TcdB3 rekombinantna vezavna domena toksina B
Rho 123 rodamin 123
RIPA lizni pufer (ang. »RIPA Lysis Buffer»)
ROS reaktivne kisikove spojine (ang. »Reactive Oxygen Species«)
RNAza ribonukleaza
RPMI gojišče za celice (ang. »Roswell Park Memorial Institute«)
RT-PCR reakcija veriţnega pomnoţevanja s polimerazo v realnem času (ang.
»Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction»)
RTX (ang. »repeats found in each toxin«)
s sekunda
SE standardna napaka
SLO streptolizin O
TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilen diamin
TEER transepitelijska električna upornost (ang. »Transepithelial Electrical
Resistance«)
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XI
TcdA toksin A C. difficile
TcdB toksin B C. difficile
Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol
Z-VAD-FMK benziloksikarbonil-val-ala-asp-fluorometilketon
(ang.«benzyloxycarbonyl-val-ala-asp-fluoromethylketone«)
ZO-1 protein tesnih stikov (ang. «Tight Junction-associated Polypeptide«)
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XII
IZVLEČEK
Clostridium difficile proizvaja tri toksine. Toksin A (TcdA, enterotoksin in citotoksin) in
toksin B (TcdB, močen citotoksin) sta glavna dejavnika virulence, ki povzročata
simptome driske in kolitisa. Nekateri sevi pa tvorijo še binarni toksin CDT. Prav tako bi
določeni sevi lahko proizvajali tudi toksine, ki jih do sedaj pri tej bakteriji še ne poznamo.
Toksin A in toksin B sta enoveriţna proteina, sestavljena iz štirih funkcionalnih domen:
encimske domene na N-terminalnem delu, cisteinske proteazne domene, centralne
hidrofobne domene in vezavne domene na C-terminalnem delu proteina.
Rekombinantni protein N-terminalne encimske domene toksina B in del rekombinantne
C-terminalne vezavne domene toksina A imata lastnosti enake holotoksinu (celična smrt,
imunski odgovor). Podobno delovanje za C-terminalno vezavno domeno toksina B do
sedaj še ni bilo opisano.
V raziskavo smo vključili seve bakterije C. difficile s poznanimi in atipičnimi toksičnimi
učinki na celice. Uporabili smo TcdB referenčnega seva VPI 10463 in variantnega seva
8864 in njuni rekombinantni vezavni domeni rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864. Za in vitro
študije interakcij med črevesnimi epitelnimi celicami in bakterijskimi toksini smo
uporabili celični liniji epitelnih celic črevesja HT-29 in T84. Za proučevanje virulence
sevov bakterije C. difficile pa smo izbrali ţivalski nevretenčarski model Caenorhabditis
elegans.
Rekombinantni vezavni domeni toksina B tako kot holotoksina poškodujeta epitelij,
povzročita razpad tesnih stikov ter nekrozo oziroma apoptozo. Z vezavo na črevesne
epitelijske celice vzpodbudita celice imunskega sistema in sproţita izločanje interlevkina
8. Holotoksin B sproţi še proces avtofagije v črevesnih epitelijskih celicah.
Nekateri sevi bakterije C. difficile so hemolitični. Poznavanje mehanizmov njihovega
delovanja je tako bistvenega pomena za razumevanje bolezenskih znakov, ki jih
povzročajo.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XIII
Ţivalski nevretenčarski model C. elegans se je izkazal kot neprimeren ţivalski model za
preučevanje virulence, vendar je njegova uporaba šele na začetku.
Prvič smo opisali toksičnost C-terminalne domene TcdB, ki je neodvisna od modifikacije
majhnih GTPaz in zelo verjetno predstavlja pomemben del pri okuţbi z bakterijo C.
difficile. Prav tako je poznavanje mehanizma delovanja toksina B pomembno za
razumevanje njegove vloge pri celični smrti. Ker C. difficile pripada rodu z veliko in zelo
razširjeno skupino toksinov, je velika verjetnost, da sevi C. difficile proizvajajo tudi
toksine, ki celice lizirajo (hemolizini).
S poznavanjem mehanizma delovanja toksinov lahko razloţimo nekatere osnovne, pa tudi
na prvi pogled nejasne fiziološke procese.
Ključne besede: Clostridium difficile, vezavna domena, toksin B, citotoksičnost,
patogeneza, Caenorhabditis elegans
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XIV
ABSTRACT
Clostridium difficile produces three toxins. Toxin A (TcdA, enterotoxin and cytotoxin)
and toxin B (TcdB, cytotoxin) are recognized as the main virulence factors responsible
for diarrhea and colitis. Some strains produce also binary toxin CDT. And so it is possible
that some strains produce, reports so far, unknown toxins.
Toxin A and toxin B are single chain proteins with four functional domains: N-terminal
catalytic domain, cysteine protease domain, central hydrophobic domain and C-terminal
binding domain.
Recombinant N-terminal enzymatic domain of toxin B and a part of recombinant C-
terminal repetitive domain of toxin A had comparable effects as holotoxins (cell death,
immune response). It is not known whether C-terminal repetitive domain of toxin B has
any significant effect.
In our study we included strains from bacteria C. difficile with known and atypical toxic
effect on cells. We used TcdB from reference strain VPI 10463 and variant strain 8864
and their recombinant repetitive domain rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864. Intestinal
epithelial cell lines HT-29 and T84 were used for in vitro study to elucidate the
interaction between intestinal cell lines and bacterial toxins. Caenorhabditis elegans has
been used as a host model for the study of Clostridium difficile virulence and
pathogenesis.
Both recombinant receptor-binding domains as well as holotoxins induced intestinal
epithelial cell damage that ultimately lead to cell death by necrosis or apoptosis. They
stimulated immune cells to produce interleukin IL-8 after binding on intestinal epithelial
cells. Holotoxin B also induced autophagosome formation.
Some strains from bacteria C. difficile have hemolytic activity and by studying
mechanism of their activity it will be possible to understand clinical signs of disease.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XV
C. elegans has been showed as inappropriate animal model for studying virulence of C.
difficile, but also the study including C.elegans as an animal model, is at the beginning.
This is the first description of glycosyltransferase independent toxicity of TcdB and these
C-terminal mediated effects may contribute in the pathophysiology of Clostridium
difficile infection. Toxin B additional effect is also important in the role of cell death.
Although many clostridial species produce toxins with hemolytic activity, C. difficile is
so far unique among the clostridia for hemolytic activity.
Such information could improve better understanding of essential and undefined
physiological process.
Key words: Clostridium difficile, repetitive domain, toxin B, cytotoxicity, pathogenesis,
Caenorhabditis elegans
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 1
1 UVOD
Bakterija Clostridium difficile je najpogostejši povzročitelj črevesnih okuţb v bolnišnicah.
Bolezenska znamenja so različna, od blagih drisk do hudega pseudomembranoznega
kolitisa, običajno pa se pojavljajo kot zaplet po zdravljenju z antibiotiki.
Bolezen povzročajo le toksigeni sevi, ki delajo toksin A (TcdA), toksin B (TcdB) in/ali
binarni toksin CDT. Seve, ki ne delajo nobenega od teh treh toksinov, označimo kot
netoksinogene in takšni sevi običajno ne povzročajo bolezni (Rupnik, 2001).
Toksina TcdA in TcdB sta glavna dejavnika virulence. Kljub temu njuna vloga v
patogenezi še ni popolnoma utemeljena. Odraz toksičnega delovanja so izločanje
tekočine v lumen črevesja, edem črevesne sluznice, odmiranje celic črevesnega epitelija
ter vnetni odziv z infiltracijo nevtrofilcev in aktivacijo makrofagov. Gotovo pa se sevi C.
difficile med seboj razlikujejo tudi glede na prisotost alternativnih dejavnikov virulence,
ki pa so le slabo poznani. Večina novejših študij opisuje adhezine in druge molekule v
celični steni (Pĕchinĕ in sod., 2005). Prav tako bi določeni sevi lahko delali tudi toksine,
ki jih do sedaj pri tej vrsti še ne poznamo.
S poznavanjem mehanizma delovanja toksinov smo ţeleli razloţiti nekatere osnovne, pa
tudi na prvi pogled nejasne fiziološke procese.
1.1 PRIČAKOVANI IZVIRNI ZNANSTVENI PRISPEVKI
Razumevanje alternativnega mehanizma delovanja toksina TcdB na celice preko
vezavne domene.
Razumevanje vloge vezavne domene toksina TcdB v patogenezi.
Karakterizacija hemolitične aktivnosti, ki do sedaj pri C. difficile še ni bila opisana in
je lahko vezana na delovanje ţe znanih toksinov ali novih, še neopisanih toksinov.
Razvoj novega nevretenčarskega ţivalskega modela za študij virulence C. difficile.
Z uporabljenimi variantnimi sevi, ki so bili ţe dober model za iskanje novih dejavnikov
virulence, z opazovanjem citopatskega učinka na gojenih sesalčjih celicah in
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 2
toksičnega učinka na ţivalskem modelu nevretenčarja C. elegans, bomo opredelili
dodatne mehanizme virulence, ki so posledica toksičnih učinkov pri bakteriji C.
difficile, s končnim ciljem boljšega poznavanje patogeneze ter razvoja testnih
sistemov za določanje virulence bakterije C. difficile.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 3
2 PREGLED OBJAV
2.1 BAKTERIJA Clostridium difficile IN BOLEZNI, KI JIH POVZROČA
Bakterija Clostridium difficile je sporogena, pogojno patogena bakterija, ki je normalno
del črevesne mikrobne flore. Razvoj bolezni je odvisen od dejavnikov gostitelja ter od
virulenčnih dejavnikov bakterije, med katerimi sta najpomembnejša toksin A in toksin B,
ki onemogočata normalno absorptivnost črevesa.
Kadar se razmerje v normalni črevesni flori poruši zaradi jemanja antibiotikov,
sistemskega zdravljenja ali operativnih posegov, se poveča tveganje za okuţbo z
bakterijo C. difficile (OCD) (Rupnik in Kotnik Kevorkijan, 2009). Porušeno ravnovesje v
normalni črevesni flori in razrast bakterije lahko mineta neopazno ali pa povzročita
različno stopnjo teţav. Klinična slika se spreminja od asimptomatske kolonizacije do
blage driske ali pa do hude bolezni s pseudomembranoznim kolitisom (Bartlett in
Gerding, 2008). Če bolezen ni pravočasno zdravljena, lahko pride do dilatacije debelega
črevesa ali celo perforacije črevesa ter posledično do smrti bolnika (Rupnik in sod., 2009).
Nedavni endemični izbruhi okuţbe s hipervirulentnim sevom (C. difficile BI/NAP1/027)
so povzročili tudi do 16 % umrljivost (Pépin in sod., 2005 in McDonald in sod., 2006).
OCD je pogostejša pri starejših osebah in hospitaliziranih bolnikih, ki se zdravijo z
antibiotiki. Kljub temu, da so bolnišnične okuţbe s C. difficile še vedno velik zdravstveni
problem, pa narašča število opisanih primerov pri mlajših ljudeh, ljudeh brez predhodne
hospitalizacije in zdravljenja z antibiotiki (Chernak in sod., 2005), pri nosečnicah
(Rouphael, 2008) ter otrocih (Kim, 2008).
Spore so stalni vir okuţbe. So vsepovsod, zato C. difficile izolirajo tudi iz okolja,
ţivalskih iztrebkov, hrane (Rupnik, 2007) in so lahko vir okuţbe tako hospitaliziranih kot
nehospitaliziranih bolnikov.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 4
2.2 BAKTERIJSKI TOKSINI KOT DEJAVNIKI VIRULENCE
Bakterijski proteinski toksini so pomembni dejavniki virulence, ki poškodujejo celice v
gostiteljevem telesu ali ovirajo njihovo delovanje. Nekateri celice lizirajo, drugi
preprečujejo celično rast in tretji pretirano okrepijo običajna fiziološka dogajanja. Z
zaviranjem ali pa s pospeševanjem delovanja lahko ubijajo, na da bi poškodovali eno
samo celico napadenega organizma. Tetanusni toksin na primer ohromi telo, vendar ne
poškoduje prizadetih nevronov (Patrick in sod., 1995).
Zapisi za bakterijske toksine so pogosto v plazmidih in bakteriofagih. Zaradi lokalizacije
genov v prenosljivih genskih elementih se lahko sposobnost izdelovanja toksinov s
konjugacijo ali transudkcijo razširi na netoksigene bakterije iste ali sorodnih vrst (Dale,
1994).
Bakterijski toksini se med seboj razlikujejo glede na tkivno specifičnost: nekateri
prizadenejo samo določene vrste celic, drugi pa lahko poškodujejo različne celice in tkiva.
Celice nekaterih bakterijskih vrst izločajo zgolj en toksin, dostikrat pa lahko sintetizirajo
številne toksine hkrati.
Toksine delimo po: mehanizmu delovanja (i) toksini, ki tvorijo pore in (ii) toksini, ki
delujejo kot encimi, mestu delovanja (i) toksini z delovanjem na celično membrano, (ii)
toksini z znotrajceličnim delovanjem (toksini A-B) in (iii) toksini, ki se veţejo na
receptorje ter učinkih na organizem (i) nevrotoksini, (ii) enterotoksini, (iii) toksini, ki
vplivajo na strjevanje krvi, delujejo hemoragično in lokalno, (iv) toksini, ki delujejo na
citoskelet, (v) superantigeni.
S kratkim pregledom predstavljenih skupin je zajet le del obseţne tematike toksinov. V
nadaljevanju bomo natančneje opisali le nekatere skupine bakterijskih toksinov:
citolitične toksine in toksine rodu Clostridium in vrste C. difficile.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 5
2.2.1 Citolitični (hemolitični) bakterijski toksini
Bakterijski citolitični proteini niso enotna skupina sorodnih substanc, ampak se
razlikujejo tako po strukturi kot po izvoru in mehanizmu delovanja. Glede na mehanizem
delovanja jih delimo na:
2.3 Toksini, ki tvorijo pore (PFT)
PFT so zelo pomembna skupina naravnih toksinov. Spontano se vstavljajo v membrane in
tvorijo eksogene transmembranske pore, ki omogoči prehajanje ionov in majhnih molekul.
Posledica je propad celice, največkrat zaradi koloidno-osmotskega šoka (Popoff in Geny,
2006; Alouf , 2006; Pizza in sod., 2005).
Sintetizirani so kot topni monomeri, ki se naknadno vstavljajo v membrane.
Transformacija PFT iz topne oblike v, za celico smrtonosno, membransko vezano obliko,
je podvrţena velikim konformacijskim spremembam ter agregaciji in je večstopenjski
proces. Nekateri toksini potrebujejo za vezavo na membrano specifične receptorje. Ti so
največkrat lipidi (npr. holesterol pri holesterol odvisnih citolizinih) in proteini. Receptorji
omogočajo koncentriranje toksinov na površini membrane ter njihovo hitrejšo
oligomerizacijo in insercijo.
Glede na strukturne elemente, ki tvorijo stene pore, razdelimo PFT v dve skupini:
(1) α-PFT perforirajo membrano z α-vijačnicami (Anderluh in Lakey, 2008). Pri α-PFT
se izpostavijo prej zakrite hidrofobne α-vijačnice, ki se nato vstavijo v membrane.
Procesa oligomerizacije in insercije lahko potekata sočasno (Pizza in sod., 2005).
(2) β-PFT so toksini, ki v membrano vstavljajo amfipatične β-lasnice in z njihovim
prečnim povezovanjem tvorijo stabilni transmembranski β-sodček (Anderluh in Lakey,
2008). Za β-PFT je značilno, da se hidrofobni deli, potrebni za vključitev v membrano,
oblikujejo šele po nastanku oligomerov. Pri tem vsak monomer prispeva majhen deleţ
amfipatične stukture, kar v končni fazi omogoči nastanek dovolj velikega hidrofobnega
področja za vključitev v membrano (Pizza in sod., 2005).
Glede na raznolikost med zaporedji in strukturami je jasno, da se tudi mehanizmi tvorbe
por razlikujejo. Kljub temu obstajajo nekatere podobnosti (Alouf in sod., 2006).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 6
Toksini zavzemajo takšno obliko, da so na površini v glavnem le hidrofilni
aminokislinski ostanki, hidrofobni pa so skriti v notranjosti proteina oz. v stikih med
monomeri. Pri nekaterih bakterijskih toksinih mora pred vezavo priti do določenih
modifikacij, ki aktivirajo toksin. Nekateri toksini se izločijo v obliki preprotoksinov (npr.
termolabilni hemolizin HlyA bakterije Vibrio cholerae) (Yamamoto in sod., 1990) ali
protoksinov (npr. Cry δ-endotoksin bakterije Bacillus thuringensis) (Li in sod., 1996).
Učinki toksinov, ki tvorijo pore so različni in navadno odvisni od koncentracije toksina in
velikosti pore. Večino učinkov pri nizkih koncentracijah toksina lahko pripišemo vdoru
Ca2+
v celico, ki kot sekundarni prenašalec, lahko sproţi številne procese (npr. sproščanje
vnetnih mediatorjev) (Alouf in sod., 2006). Če so pore prevelike, lahko pride do izhajanja
večjih makromolekul. Nastanek takšnih por povzročijo npr. od holesterola odvisni
citolizini (Tweten in sod., 2001).
2.3.1.1.1 Od holesterola odvisni citolizini (CDC)
Predstavniki skupine bakterij, katerih glavni virulenčni dejavniki so od holesterola
odvisni citolizini, so eni najhujših patogenov, nevarni tudi človeku. Tvorijo eksogene
pore v membranah gostitelja (Gendeh in sod., 1997). Izločajo se kot vodotopni proteini.
Sposobni so preiti v membransko vezano obliko, ki je nato sestavni del pore. Pri tem
spremenijo konformacijo brez pomoči beljakovine, ki je potrebna za pravilno gubanje
polipeptidne verige (Lesieur in sod., 1997). Nekateri toksini potrebujejo za vezavo na
membrano specifične receptorje.
Zato potekajo danes na teh toksičnih proteinih številne raziskave. Obstaja več tehnik za
študije njihovega delovanja. Največkrat uporabljeni tehniki sta merjenje hemolitične
aktivnosti pri citolizinih (Geoffroy in sod., 1987; Dubail in sod., 2001; Giammarini in
sod., 2003) in elektronska mikroskopija (Parker in sod., 1998b; Tweten, 2001). Pogosto
uporabljeni tehniki sta tudi tehniki pretočne citometrije in masne spektroskopije
(Polekhina in sod., 2005).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 7
Znanih je nad 20 od holesterola odvisnih citolizinov (Shatursky in sod., 1999; Tweten in
sod., 2001). Proizvajajo jih predstavniki petih rodov po Gramu pozitivnih bakterij:
Arcanobacterium, Bacillus, Clostridium, Listeria in Streptococcus (Pizza in sod., 2005;
Alouf in sod., 2006). Predstavljajo veliko skupino β-PFT. Najbolje so raziskani
perfringolizin O (Clostridium perfringens), streptolizin O (Streptococcus pyogenes),
listeriolizin O (Listeria monocytogenes) in pnevmolizin (Streptococcus pneumoniae)
(preglednica 1).
Od holesterola odvisni citolizini se izločajo kot vodotopni, enoveriţni proteini. Vsi so si
podobni po primarni strukturi in imajo ohranjeno 11 aminokislin dolgo zaporedje na C-
terminalnem delu molekule (Morgan in sod., 1996; Alouf in sod., 2006). Iz podobnosti
primarnih zaporedij lahko sklepamo na podobnost v 3D strukturi in aktivnosti.
2.3.1.1.2 Toksini, ki tvorijo majhne pore (ang. "small PFT")
Premer takšne pore je 1-1,5 nm in omogoči prehajanje ionov in majhnih molekul z
molekulsko maso pod 2 kDa (Pizza in sod., 2005; Tweten in Melton, 2006).
Glavni predstavniki so α-hemolizin (αHL), levkocidin in γ-hemolizin (γHL) bakterije
Staphylococcus aureus (Menestrina in sod., 1998; Pizza in sod., 2005), hemolizin II
bakterije Bacillus cereus, β-toksin bakterije Clostridium perfringens (Pizza in sod., 2005),
aerolizin bakterije Aeromonas hidrophila in α-toksin bakterije Clostridium septicum
(Tweten in Melton, 2006) (preglednica 1).
2.3.1.1.3 RTX toksini ("repeats found in each toxin")
RTX toksini so enoveriţni, veliki, od Ca2+
odvisni hemolizini z molekulsko maso med
100 in 120 kDa. Karakteristična značilnost RTX toksinov so ponovitve 9 aminokislin
dolgega zaporedja bogatega z glicinom in aspartatom (Pizza in sod., 2005).
Predstavniki so (1) hemolizin bakterije E.coli (Pizza in sod., 2005), (2) hemolizini
bakterije rodu Enterobacteriaceae in Pasteurellaceace, (3) hemolizin bakterije
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 8
Actinobacillus pleuropneumoniae (Pizza in sod., 2005), (4) levkotoksin bakterije
Actinobacillus actinomycetemcomitans (Kraig in sod., 1990; Piaza in sod., 2005), (5)
adenilat ciklaza hemolizin bakterije Bordetella pertussis (Pizza in sod., 2005)
(preglednica 1).
2.3.1.2 Citolitični encimi
Citolitični encimi se med seboj razlikujejo po strukturi in mehanizmu delovanja. Vsem pa
je skupno to, da razgradijo membranske lipide in poškodujejo celične membrane, porušijo
nadzor nad prehanjem snovi in povzročijo smrt celice. Njihov mehanizem delovanja je
različen prav zaradi različnih razmerij in porazdelitve gradbenih elementov membran pri
različnih celicah, na katere vplivajo. Le redko so direktno litični, ponavadi le povečajo
občutljivost membrane za lizo. Pomembni so zaradi sinergističnega delovanja s snovmi,
ki so toksične za membrane. Najpogostejši predstavniki so fosfolipaze, ki hidrolizirajo
fosfolipide v membrani in jo poškodujejo.
Najpomembnejši citolizin, ki ga izdeluje in izloča bakterija Clostridium perfringens, je
toksin alfa. Deluje na različne fosfolipide, predvsem na lecitin, zato ga imenujemo tudi
lecitinaza oziroma fosfolipaza C. V rodu Clostridium spp. izločata fosfolipazo C
Clostridium sordellii in Clostridium bifermentas (Karasawa in sod., 2003). Listeria
monocytogenes izloča nespecifično fosfolipazo C in fosfatidilinozitol-specifično
fosfolipazo C. Encima sodelujeta pri razgradnji membranskih lipidov in bakteriji
omogočata pobeg v citosol. V citosolu inducira polimerizacijo aktina, kar povzroči
izvihavanje celične membrane evkariontske celice. Tako ovita z membrano gostitelja se
vrine v sosednjo celico in jo na ta način okuţi (Goldfine in sod., 1995). Staphylococcus
aureus vsebuje fosfolipazo C oziroma sfingomielinazo C, ki hidrolizira sfingomielin v
citoplazemski membrani eritrocitov, zato ga imenujemo tudi hemolizin β (toksin β)
(Gouaux in sod., 1997; Murray in sod., 1999). Streptolizin S, ki ga izdeluje bakterija
Streptococcus pyogenes, poškoduje fosfolipide v citoplazemski membrani eritrocitov in
levkocitov (Nizet, 2002). Bakterija Corynebacterium pseudotuberculosis pa vsebuje
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 9
fosfolipazo D, ki deluje tako na sfingomielin kot na lizolecitin (Murray in sod., 1999)
(preglednica 1).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 10
Preglednica 1. Toksini in encimi, ki jih izločajo citolitične bakterije in njihovi patogenetični učinki.
Table 1. Toxins and enzymes produced by cytolitic bacteria and their pathogenetic effects.
MEHANIZEM
DELOVANJA
TOKSIN BAKTERIJA PATOGENETIČNI
UČINKI
PFT perfringolizin O C. perfringens plinska gangrena
listeriolizin L. monocytogenes apoptoza
pnevmolizin S. peumoniae ovira kemotakso,
fagocitozo in tvorbo
protiteles,
apoptoza
streptolizin O S. pyogenes razpad eritrocitov,
citotoksično učinkuje na
nevtrofilce, trombocite in
miokard, celična smrt
majhni PFT Α-hemolizin S. aureus apoptoza limfocitov T
Γ-hemolizin S. aureus citotoksično učinkuje na
levkocite
hemolizin II B. cereus nekrotični enteritis
Β-toksin C. perfringens neurološki učinki
aerolizin A. hidrophila celična permeabilnost,
liza
Α-toksin C. septicum šok
RTX toksini
hemolizin E.coli liza eritrocitov,
levkocitov, endotelijskih
celic, humanih limfocitov
T
hemolizin Enterobacteriaceae in
Pasteurellaceace
celična permeabilnost,
liza
hemolizin A. pleuropneumoniae celična permeabilnost,
liza
levkotoksin A. actinomycetemcomitans apoptoza
bifunkcionalni adenilat
ciklaza hemolizin
B. pertussis celična permeabilnost,
liza
citolitični encimi
lecitinaza (fosfolipaza C) C. perfringens razgradi membranske
lipide in poškodujejo
celične membrane
fosfolipaza C C. sordellii in C. bifermentas razgradijo membranske
lipide in poškodujejo
celične membrane
fosfolipaza C in
fosfatidilinozitol-
specifično fosfolipazaC
L. monocytogenes razgradijo membranske
lipide in bakteriji
omogočijo vstop v citosol
fosfolipaza C oziroma
sfingomielinaza C
S. aureus razgradijo membranske
lipide (sfingomielin)
streptolizin S S. pyogenes poškoduje fosfolipide v
citoplazemski membrani
eritrocitov in levkocitov
fosfolipaza D C. pseudotuberculosis razgradi membranske
lipide (sfingomielin,
lizolecitin)
PFT: toksini, ki tvorijo pore
RTX toksini (ang. "repeats found in each toxin"): značilne so ponovitve 9 aminokislin dolgega zaporedja bogatega z
glicinom in aspartatom
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 11
2.3.1.3 Toksini z neznanim mehanizmom delovanja
V to skupino uvrščamo toksine, katerih delovanje kljub obseţnim raziskavam ni
popolnoma pojasnjeno kot npr. citolitični toksini bakterij iz rodu Vibrio, ki imajo
sposobnost povzročiti propad celic ter depolarizacijo ţivčnih in mišičnih celic (Harvey,
1990).
2.3.2 Toksini bakterij iz rodu Clostridium
Klostridiji so heterogena skupina mikrobov, ki so večinoma prisotni v zemlji, v
prebavnem traktu ţivali in ljudi. Medicinsko pomembni patogeni klostridiji izdelujejo
encime in toksine, ki povzročajo hude bolezenske znake in invazivne histotoksične
okuţbe. Toksigeni sevi C. tetani izločajo tetanusni toksin, ki deluje nevrotoksično.
Toksin je usmerjen na oddaljene cilje v osrednjem ţivčnem sistemu. Veţe se na ţivčne
celice, ki omogočajo sproščanje mišic. Nevrotoksini vrste C. botulinum so antigensko
različni toksini, označeni kot tip A, B, C, D, E, F in G. Deluje na periferne ţivčne končiče.
Iz črevesja se po krvi prenese do nevromuskularnih povezav. Pri vrsti C. perfringens
ločimo 5 serotipov (A, B, C, D in E), ki izločajo 12 vrst toksinov. θ-toksin je povzročitelj
popolne hemolize eritrocitov in nekroze mišic. Skupaj z α-toksinom oslabi migracijo
nevtrofilcev na mestu infekcije in povzroči razpad endotelijskih celic. Posledica tega so
povečana permeabilnost membrane endotelijskih celic, edem, ishemija in ustvarjanje
anaerobih pogojev v mišičnem tkivu, ki vzpodbudi hitrejše razmnoţevanje C. perfringens
(Boquet in sod., 1998; Petit in sod., 1999). Toksični C. novyi tipa A toksin α ima kardio-,
nevro-, histo- in hepatotoksične lastnosti, toksin Tcnα C. septicum deluje nekrotizirajoče
in hemolitično. C. hystoliticum, ki tvori več toksinov, povzroči odmiranje tkiva in plinsko
gangreno (Borriello in sod., 2005). Clostridium sordellii sintetizira dva toksina, letalni
toksin TcsL in hemoragični toksin TcsH (Cohen in sod., 2007). C. bifermentas proizvaja
dva hemolizinu podobna proteina (Barley in sod., 1998).
Pri C. difficile so dosedaj opisani trije toksini. Toksina A in B vrste C. difficile sta
sorodna toksinom TcsL in TcsH vrste C. sordellii ter Tcnα vrste C. novyi (Bette in sod.,
1991; Hofmann in sod., 1995). Homologen z opisanimi toksini je na novo odkrit toksin
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 12
TcpL vrste C. perfringens tip C (Amimoto in sod., 2007), a z manjkajočo ponavljajočo
vezavno domeno. Tretji toksin CDT spada v skupino klostridijskih binarnih toksinov
skupaj s toksinom C2 C. botulinom tipa C in D, jota toksinom C. perfringens tipa E in
jota toksinu podobnim vrste C. perfringens (Boquet in sod., 1998; Considine in Simpson,
1991).
Ker C. difficile pripada rodu z veliko in zelo razširjeno skupino toksinov, je velika
verjetnost, da sevi vrste C. difficile delajo še druge toksine, med njimi tudi takšne, ki
celice lizirajo (hemolizini).
2.3.3 Toksini bakterije Clostridium difficile
Kot ţe omenjeno C. difficile proizvaja tri toksine, in sicer toksin A (enterotoksin), toksin
B (citotoksin) in/ali CDT (binarni toksin).
Toksina A (TcdA) in B (TcdB) sta glavna dejavnika virulence, kar kaţejo tako
epidemiološke raziskave kot tudi poskusi na ţivalih. Odraz toksičnega delovanja so
izločanje tekočine v lumen črevesja, edem črevesne sluznice, odmiranje celic črevesnega
epitelija ter vnetni odziv z infiltracijo nevtrofilcev in aktivacijo makrofagov. Vendar seve,
ki delajo toksin A in toksin B lahko izoliramo iz bolnikov s celotnim spektrom
bolezenskih znakov, od blagih do izjemno hudih (George in sod., 1978; Viscidi in sod.,
1981). To po eni strani lahko razloţimo z dejavniki gostitelja (npr. prisotnost zaščitnih
protiteles), gotovo pa se sevi C. difficile med seboj razlikujejo tudi glede na prisotost
alternativnih dejavnikov virulence. Pĕchinĕ in sod. (2005) opisujejo adhezine in druge
molekule v celični steni.
Po drugi strani lahko imata ţe znana toksina A in B raznolike in nove načine delovanja na
gostiteljsko celico, kar še posebej velja za t.i. variantne toksine. Najbolj znani variantni
sevi, ki delajo toksine s spremenjenimi lastnostmi so sevi, ki delajo samo toksin B.
Najprej so jih opisali pri asimptomatskih dojenčkih in so veljali za nevirulentne (Depitre
in sod., 1993), kasneje pa so jih izolirali iz številnih bolnikov z OCD (Al-Barrak in sod.,
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 13
1999; Alfa in sod., 2000; Rupnik in sod., 2003, Lyras in sod., 2009). Vendar imajo lahko
tudi sevi, ki delajo oba toksina, spremenjene variantne toksine (Rupnik, 2008).
Sevi z binarnim toksinom CDT so bili v času, ko je bil ta toksin prvič opisan (Popoff in
sod., 1988) zelo redki (0,2 - 0,5 %), danes pa predstavljajo pribliţno 25 % vseh izoliranih
sevov C. difficile.
2.3.3.1 Zgradba TcdA, TcdB in CDT
Toksina A (TcdA) in B (TcdB) uvrščamo v skupino velikih klostridijskih toksinov (LCT)
z molekulsko maso med 250 in 308 kDa (von Eichel-Streiber in sod., 1996). Toksina sta
monomerna enoveriţna proteina s štirimi funkcionalnimi domenami: N-terminalno
katalitično domeno, ki glukozilira majhne GTPaze (Faust in sod., 1998; Hofmann in sod.,
1997) in predstavlja biološko aktivni del toksina, cisteinsko proteazno domeno, centralno
hidrofobno domeno, odgovorno za translokacijo in C-terminalno vezavno domeno, ki se
veţe na receptor (Frish et al., 2003; Reinert in sod., 2005). Vendar pa natančna narava
receptorjev dosedaj še ni znana.
Poznavanje kristalne strukture glukoziltransferazne domene toksina B (1-543 aminokislin,
Reinert in sod., 2005) in vezavne domene toksina A (toksinotip VI, 2582-2709
aminokislin, Ho in sod., 2005; Greco in sod., 2006) je prispevalo k razumevanju
strukture in delovanja toksinov v skupini velikih klostridijskih toksinov (LCT).
Toksina sta skupaj s tremi drugimi geni (tcdC, tcdR in tcdE) zapisana na 19,6 kb velikem
toksinskem lokusu PaLoc, ki ga najdemo samo pri toksinogenih sevih (Braun in sod.,
1996) (slika 1). PaLoc sestavljajo geni tcdA, tcdB, tcdC (negativni regulator prepisa tcdA
in tcdB) (Matamouros et al., 2007), tcdR (alternativni sigma faktor RNA polimeraze,
pozitivni regulator prepisa) (Dupuy, 2006) in tcdE (verjetno prenos toksinov iz celice)
(Tan in sod., 2001) (slika 1). Pri netoksinogenih sevih je na tem mestu zaporedje dolgo
115 bp (Braun in sod., 1996).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 14
Tretji toksin CDT je sestavljen iz dveh proteinskih podenot in ga uvrščamo v skupino
klostridijskih binarnih toksinov (Barth in sod., 2004).
4,3 kb velik toksinski lokus CdtLoc nosi zapis za binarni toksin CDT in je sestavljen iz
genov za podenoti binarnega toksina cdtA in cdtB in regulatornega gena cdtR (Carter in
sod., 2007). Gen cdtA kodira encimsko podenoto (~50 kDa) in gen cdtB (~100 kDa)
vezavno podenoto (Perelle in sod., 1997) (slika 1).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 15
TcdDpozitivni
regulator
TcdBcitotoksin
TcdEprenos toksinov
iz celice
TcdAenterotoksin
TcdCnegativni
regulator
encimska domena
receptorska-vezavna
domena
transmembranska
domena
CROPsW102 & DXD
substratna
specifičnost
encimska domena translokacijska in vezavna domena
Slika 1. Toksini bakterije Clostridium difficile. (a) Toksin A in toksin B sta zapisana na toksinskem lokusu,
ki ga sestavlja 5 genov. Sestavljeni so iz funkcionalnih domen in iz kombinacij manjših motivov. (b) Tretji
toksin, binarni toksin (CDT) je zapisan na toksinskem lokusu CdtLoc, ki ga sestavljajo 3 geni. Binarni
toksin sestavljata dve nepovezani proteinski podenoti, CdtB in CdtA. CdtB je vezavna komponenta in CdtA
je encimska komponenta (povzeto po Rupnik in sod., 2009).
Figure 1. Toxins produced by Clostridium dificile. (a) Two large toxins, toxin A (TcdA) and toxin B
(TcdB) are encoded on the pathogenicity locus (PaLoc), which comprises five genes. Several functional
domains and motifs have been identified. (b) A third toxin, the binary toxin (CDT) is encoded on a seperate
region of the chromosome (CdtLoc) and comprises three genes. The binary toxin is composed of two
unlinked proteins, CdtB and CdtA. CdtB has a binding function and CdtA is the enzymatic component
(Rupnik et al., 2009).
2.3.3.2 Molekularni mehanizem delovanja TcdA, TcdB in CDT
TcdA in TcdB sta monoglukoziltransferazi (Just in sod., 1995). Sproščata se iz
bakterijskih celic in se nato veţeta na tarčne celice gostitelja. Vezava TcdA na slabo
poznan receptor na mukozni strani črevesnega epitelija povzroči odprtje tesnih stikov
med celicami črevesnega epitelija. Skozi odprte tesne stike se TcdB pomakne na
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 16
bazolateralno stran epitelija, kjer se verjetno veţe na receptorje, ki leţijo na tej strani
črevesnega epitelija. Receptorska vezavna podenota (RBD) (slika 2) toksina reagira s
celičnim receptorjem gostiteljeve celice. Vezavi na receptor sledi endocitoza. Kisli pH
omogoči hidrofobni transmembranski domeni (TMD), da oblikuje pore v endosomalni
membrani (Giesemann in sod., 2006) in omogoči, da encimska podenota (CAT) tako
vstopi v citoplazmo. Prodor v celico pa aktivira proteolitično cepljenje. Cepitev
glukoziltransferazne domene je avtokatalitični proces, odvisen od gostiteljevega
citosolnega kofaktorja inozitolfosfata (InsP6) (Reineke in sod., 2007; Egerer in sod.,
2007).
Encimska podenota v citosolu tarčne celice prenaša glukozo iz UDP-glukoze na majhne
GTP vezavne proteine iz poddruţin Rho (slika 2) in Ras. Majhne GTPaze so v celici
odgovorne za kontrolo aktinskega citoskeleta, vpletene so tudi v kontrolo celične delitve,
oblikovanje stičišča na apikalni strani epitelijske celice in celične smrti.
Monoglukozilacija ohranjenega treonina (Thr-37) v efektorski regiji GTPaz onemogoči
interakcije le-teh z njihovimi efektorskimi molekulami (Ser/Thr kinaze, lipidne kinaze,
lipaze in ogrodni proteini) in prekine signalizacijo odvisno od majhnih GTPaz.
Najvidnejši učinek modifikacije GTPaz je depolimerizacija F-aktina (Jaffe in Hall, 2005),
porušenje citoskeleta in posledično zaokroţanje celic, sprememba ultrastrukture,
polarizacija jedra, izguba barierne funkcije (Voth in Ballard, 2005) ter apoptoza.
Porušenje citoskeleta je odvisno od modifikacije proteina RhoA (Just in sod., 1995;
Halabi-Cabezon in sod., 2008), motnje pri prepisovanju genov, blokada tvorbe
lamelipodij in gubanje membrane so posledica modifikacije proteina Rac1 ter blokada
tvorbe filopodij kot posledica modifikacije proteina Cdc42 (Halabi-Cabezon in sod.,
2008). Občutljivost celičnih linij je verjetno odvisna od gostote celičnih receptorjev za
posamezni toksin (Chaves-Olarte in sod., 2003).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 17
Slika 2. Receptorska vezavna podenota (RBD) toksina reagira s, še nepoznanim, celičnim receptorjem
gostiteljske celice (1). Vezavi na receptor sledi endocitoza (2, 3). Kisli pH omogoči hidrofobni
transmembranski domeni (TMD), da oblikuje pore v endosomalni membrani (4) in omogoči, da encimska
domena (CAT) tako vstopi v ciljno celico (5). Cepitev encimske domene je avtokatalitični proces (6).
Encimska podenota v citosolu glukozilira proteine Rho (7) (povzeto po Genth in sod., 2008).
Figure 2. Schematic representation of target cell entry of the glucosylating toxins. The receptor binding
domain (RBD) binds to the (yet unknown) toxin receptor (1). The toxin-receptor complex is internalised (2)
with the toxin being in the lumen of the endosome (3). Acidification of the endosome induces refolding of
the toxin and insertion of the transmembrane (TMD) into the endosomal membrane (4). The catalytic
domain (CAT) translocates through a pore into the cytosol (5). The CAT is proteolitically cleaved off by
the cysteine protease domain (6). The refolded CAT glucosylates cellular Rho proteins (7) (Genth et al.,
2008).
Binarni toksin CDT je ADP-ribozil transferaza. Vezavna komponenta CDTb se po
proteolitski cepitvi propeptida veţe na še neidentificirani celični receptor, neznana
proteaza pa odcepi del komponente CDTb in s tem omogoči vezavo encimske podenote
CDTa ter vstop CDTa v celico (Gulke in sod., 2001). To vodi v depolimerizacijo
aktinskih mikrofilamentov po dveh mehanizmih (i) modificiran G-aktin se veţe na hitro
rastoči konec F-aktina in kot pokrovni protein prepreči nadaljno vezavo monomerov, (ii)
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 18
modificiran G-aktin ne doprinese k ravnoteţni koncentraciji G-aktina v celici, zato F-
aktin depolimerizira (Considine in Simpson, 1991). Za toksično delovanje sta potrebni
obe podenoti (Boquet in sod., 1998).
Vlogo binarnega toksina kot dodatnega virulenčnega dejavnika so raziskali Schwan in
sod. (2009). CDT in drugi binarni ADP-ribozil transferaze toksini, vključno s toksin C2
vrste Clostridium botulinum in binarnimi toksini Clostridium perfringens, povzročijo
prerazporeditev in preoblikovanje mikrotubulov na površini črevesnih epitelnih celic.
Ker je za C. spiriforme s podobnim binarnim toksinom znano, da povzroča črevesne
infekcije samo pri kuncih (Carman in sod, 1991) so Stare-Gerič in sod. (2007) seve A-B
-
CDT+
bakterije C. difficile testirali na modelu prevezane črevesne zanke kunca. Prisotna
tekočina v zankah je potrdila enterotoksično aktivnost in vlogo binarnega toksina CDT
kot dodatnega virulenčnega dejavnika.
2.3.3.3 Vloga toksinov TcdA in TcdB v patogenezi
Toksina A in B poškodujeta epitelij, ki postane bolj propusten (Riegler in sod., 1995; von
Eichel-Streiber in sod., 1996). V črevesu toksina povzročita poškodbe sluznice, povečano
sekrecijo v lumen črevesa, ki je tudi posledica delovanja toksina A na nevrone, ki
oţivčujejo črevo (Castagliuolo in sod., 2004) in vnetno reakcijo. Toksina zmanjšata
fagocitno aktivnost, povečata izločanje citokinov, delujeta kemotaktično na granulocite
(Guerrant, 1994, Bongaerts in Lyerly, 1994).
Oba toksina, TcdA in TcdB, z inaktivacijo Rho in Ras sorodnih GTPaz (RhoA, B, C,
Rac1 in Cdc42) (Aktories in Just, 1995; Just in sod., 1995; Aktories, 1997; Halabi-
Camezon in sod., 2008) vplivata na morfološke in patofiziološke spremembe na
kultiviranih celicah. Toksina imata tako citopatski učinek (celice se zaokroţijo zaradi
neučinkovitih proteinov Rho) kot tudi citotoksični učinek (celična smrt) (Huelsenbeck in
sod., 2007). GTPaze imajo ključno vlogo v apoptozi (Coniglio in sod., 2001; Coleman in
Olson, 2002; Huelsenbeck in sod., 2007) ali sodelujejo pri proapoptotičnem
(Huelsenbeck in sod., 2007) ali antiapoptotičnem dogodku kot odgovor na stres (Fritz in
Kaina, 2006). Oba toksina sproţita apoptozo v intestinalnih epitelijskih celicah
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 19
(Fiorentini in sod., 1998; Mahida in sod., 1998; Brito in sod., 2002; Liu in sod., 2003;
Carneiro in sod., 2006;), nevronih (Le in sod., 2005), endotelijskih celicah (Hippenstiel in
sod., 2002), HeLa celicah (Qa'Dan in sod., 2002) in monocitih (Warny in Kelly, 1999).
Morfološke spremembe v skrčeni apoptotski celici so zgoščen kromatin ob robu jedrne
membrane, na citoplazemski membrani se oblikujejo brstiči, celica razpade v apoptotska
telesca, obdana z membrano, ki vsebujejo citoplazmo, jedrne fragmente in organele.
Spremembe v lipidnem dvosloju citoplazemske membrane se pojavijo ţe zelo zgodaj v
procesu apoptoze.
Eden izmed zgodnejših dogodkov v procesu apoptoze je tudi upadanje mitohondrijskega
transmembranskega potenciala, ki se in vitro odraţa z izgubo celične sposobnosti za
kopičenje fluorokromov v mitohondrijih. Toksina A in B poškodujeta mitohondrijsko
membrano (Matarrese in sod., 2007). Posledica je sprostitev citokroma c iz mitohondrijev,
ki aktivira kaspaze in sproţi apoptozo.
Toksina sproţita tudi nekrozo, ki jo spremljajo izguba ATP, produkcija prostih kisikovih
radikalov, izguba membranske integritete, ki ne omogoča več ohranjanja celične
homeostaze, in aktivacija kalpaina/katepsina (Voth in Ballard, 2005; Kim in sod., 2006;
Huelsenbeck in sod., 2007). V patogenezi OCD ima nekroza morebiti večji pomen kot
apoptoza. Celica in njeni organeli nabreknejo, celična membrana poči in vsebina se izlije
v okolje. Sproţi se imunski odziv kar povzroči vnetje (Genth in sod., 2008).
Toksina A in B prav tako povzročata bolezen pri ţivalih, ki so model za bolezen pri
človeku kot je opisano v nadaljevanju.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 20
2.3.3.4 Vloga toksina TcdB v patogenezi
Prvi poskusi na ţivalih so dokazovali pomen toksičnega delovanja obeh toksinov ali
izoliranega toksina A, medtem ko toksin B ni bil toksičen in je bolezen povzročil šele v
kombinaciji s toksinom A (Lyerly in sod., 1985). Riegler in sod. (1995) so na pripravkih
človeškega debelega črevesa dokazali, da oba toksina poškodujeta epitelij in povzročita,
da postane bolj prepusten, ter da toksin B učinkuje celo pri niţjih koncentracijah kot
toksin A. Na pomen toksina B pri infekciji kaţejo tudi sevi, ki delajo samo ta toksin in so
lahko viruletni za ţivali in človeka (Borriello in sod., 1992).
Lyras in sod. (2009), ki so primerjali divji tip z mutantami brez toksina A ali brez toksina
B, so potrdili, da je toksin B zelo pomemben dejavnik virulence.
2.3.3.5 Vloga N-terminalne in C-terminalne domene v patogenezi
Rekombinantni protein s 546 aminokislinami N-terminalnime encimske domene toksina
B ima enake lastnosti kot holotoksin, ker glukozilira iste GTPaze, uporablja isti substrat
in povzroča značilne citopatske učinke. Rekombinantni protein s prvimi 468 oziroma 516
aminokislinami encimske domene toksina B pa ni več citotoksičen (Hofmann in sod,
1997).
Na pomen rekombinantne domene toksina B so opozorili tudi Qa'Dan in sod. (2002).
Rekombinatna katalitična domena toksina B deluje na celice citotoksično in sproţi proces
apoptoze, ki je lahko od kaspaze odvisna ali neodvisna.
Po opravljenih študijah ponavljajoče vezavne domene toksinov bakterije C. difficile tako
kot druge vezavne domene enterotoksinov (npr. kolera toksin) niso odgovorne več samo
za vezavo ne receptorje. C-terminalna vezavna domena toksina A, uporabljena kot
adjuvans oziroma nosilni protein za mukozno imunizacijo, sproţi imunski odgovor na
antigen (Castagliuolo in sod., 2004; Pavliakova in sod., 2000). Prav tako del
rekombinantne vezavne domene toksina A stimulira imunske celice (Brun in sod., 2008)
ter z vezavo aktivira endotelijske celice, ki sproščajo citokine in adhezijske molekule, ki
inducirajo migracijo levkocitov in adhezijo in vitro (Yeh in sod., 2008).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 21
Podobno delovanje za C-terminalno vezavno domeno ni opisano.
2.4 MODELI ZA ŠTUDIJ PATOGENEZE C. difficile
Primeren organizem za raziskave mora imeti naslednje lastnosti: biti mora evkariontski
organizem, imeti mora zelo dobro preučen metabolizem, na določenem nivoju primerljiv
z metabolizmom in funkcijami višjih organizmov, biti dostopen v velikih količinah in
varen za delo.
2.4.1 In vitro modeli za študij patogeneze C. difficile
Celične kulture so najbolj pogost in vitro model za študije mikroorganizmov na črevesno
površino. Med njimi so največkrat uporabljene celične linije Caco-2 in HT-29. Celice se
diferencirajo in so zelo podobne človeškim celicam tankega črevesa (Toumola in
Salminen, 1998). Za študij mikrobnega učinka na membransko permeabilnost,
mehanizme transcitoze in celične invazije se uporabljajo polarizirane celične kulture
(Caco-2). Prednost sesalskih celičnih kultur v primerjavi z eksperimenti in vivo je tudi
izvajanje poskusa v kontroliranih pogojih (konstantnost in stabilnost celične linije,
manjša moţnost infekcije), stroški so niţji in poskusi manj etično sporni.
Pri celicah, tretiranih s C. difficile toksini, opazimo različne morfološke spremembe,
odvisno od tarčnih GTPaz v celici, ki jih običajni in variantni toksini prepoznajo. Pri
različnih kultiviranih celicah lahko opazujemo porušenje citoskeleta in zaokroţanje celic,
poleg tega pa še spremembe ultrastrukture, polarizacijo jedra ali fragmentacjo jedra,
izgubo barierne funkcije epitelija (Nusrat in sod., 2001; Riegler in sod., 1995), apoptozo
(He in sod., 2000; Qa'Dan in sod., 2002; Kim in sod., 2006; Carneiro in sod., 2006;
Matarrese in sod., 2007) ter sproščanje različnih citokinov iz imunskih celic (Savidge in
sod., 2003).
Adhezija toksinov na humane črevesne epitelijske celice spodbudi izločanje ključnega
mediatorja imunskega sistema, kemotaktičnega citokina interlevkina 8 na bazolateralni
strani celic, ki stimulira celice imunskega odziva. Ta spodbudi dendritične celice, sproţi
migracijo nevtrofilcev in monocitov, ki fagocitirajo bakterije in nadaljnjo izločanje
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 22
provnetnih citokinov, aktivacijo celic TH ter aktivacijo nuklearnega faktorja kappa B (NF-
κB).
Oba toksina lahko sproţita izločanje citokinov v humanih monocitih, nevtrofilcih in
epitelijskih celicah (Flegel in sod., 1991; Main in sod., 2003; Kim in sod., 2006).
2.4.2 In vivo modeli za študij patogeneze C. difficile
2.4.2.1 Ţivalski modeli za študij okuţbe s C. difficile
Hrček je standardni ţivalski model za C. difficile in se uporablja predvsem v študijah
učinkov izoliranih toksinov (Lyerly in sod., 1985, 1988), virulence (Wilson in sod., 1985;
Rolfe, 1991; Sambol in sod., 2001) in zaščite pred okuţbo (Libby in sod., 1982; Wilson
in Sheagren, 1983; Toothaker in Elmer, 1984; Sambol in sod., 2002; Fekety in sod.,
1993; Merrigan in sod., 2003).
V študijah enterotoksičnega učinka izoliranih toksinov oziroma supernatantov različnih
sevov bakterije C. difficile se kot ţivalski model navadno uporablja kunce (Lyerly in sod.,
1982; Justus in sod., 1982; Borriello in sod., 1992; Lyerly in sod., 1992). Enterotoksičen
učinek in vivo se testira na prevezani zanki črevesa (Lyerly in sod., 1982; Justus in sod.,
1982; Borriello in sod., 1992; Lyerly in sod., 1992). Akumulacija tekočine v zanki,
hemoragija in histološke spremembe so odraz toksičnega delovanja.
Za laboratorijski testni ţivalski model za preučevanje OCD pri ljudeh so uporabili tudi
morske prašičke, miši in podgane (Keel in Songer, 2006), ki pa niso bile tako občutljive
kot kunci (Steele in sod., 2010).
Delovanje toksinov je predvsem lokalno, kjer povzročijo hudo lokalno tkivno poškodbo.
Toksini pa lahko delujejo na oddaljena tkiva, kamor pridejo po krvnem obtoku.
Sistemsko delovanje toksina potrjujejo poskusi na modelu embrijev zebric (Danio rerio).
Aplikacija TcdB je povzročila kardiomiopatije, motnje kardiovaskularnega sistema in
smrt embrijev. Z aplikacijo inhibitorja kaspaze-3 so zaustavili proces apoptoze oziroma
zmanjšali motnje kardiovaskularnega sistema. Proučevali so tudi povezanost črevesne
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 23
infekcije, ki je posledica delovanja enterotoksina TcdA s kardiotoksičnim učinkom TcdB.
Zelo verjetno je, da poškodba črevesja s TcdA sprosti TcdB v krvni obtok, ki se veţe na
perikard (Hamm in sod., 2006).
Prisotnost toksinov v blatu, telesnih tekočinah in serumu ter IL-8 kot imunski odziv na
okuţbo s C. difficile so dokazali Steele in sod. (2010). Za ţivalski model spremljanja
akutne in kronične oblike OCD so izbrali gnotobiotične prašičke. Kljub sistemski okuţbi
so pri eksperimentalno okuţenih prašičkih C. difficile izolirali le v črevesu.
2.4.2.2 Nevretenčarski ţivalski modeli za študij okuţbe s C. difficile
Poskusi na vretenčarjih so dragi, teţko jih je izvajati v kontroliranih pogojih, stroški
vzdrţevanja opreme za biološke poskuse in stroški vezani na vzdrţevanje ţivali v
obdobjih, ko poskusi ne potekajo, presegajo dohodke namenjene raziskovalnemu delu,
predvsem pa so vretenčarski ţivalski modeli etično sporni. V mikrobiologiji se zato
uveljavljajo novi ţivalski modeli kot so niţji vretenčarji, in sicer embriji zebric (Danio
rerio), ki so bili opisani tudi za študije učinkov C. difficile (Hamm in sod., 2006), larve
sviloprejk (Bombyx mori), nematodi (Caenorhabditis elegans), vinske mušice
(Drosophila melanogaster) in amebe.
Zaradi poznanega genoma, enostavnih pogojev za rast in hitrega razmnoţevanja bi bil za
ugotavljanje toksičnosti najbolj primeren nevretenčar C. elegans. Na nevretenčarju C.
elegans ţelimo testirati seve C. difficile, ki delajo oba toksina (A+B
+ sevi), le toksin TcdB
(A-B
+ sevi) ali nobenega od toksinov (A
-B
-CDT
-sevi) in seve, ki delajo binarni toksin
CDT, ne pa tudi obeh toksinov, da bi določili virulenčni potencial toksinov.
Razumevanje celičnega odziva na nivoju celične populacije kot tudi ţivalski modeli so
pomembni pri študijah patogeneze in preţivelosti C. difficile v okolju, s tem pa tudi pri
preprečevanju okuţb.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 24
2.5 AVTOFAGIJA IN NJENA VLOGA PRI NASTANKU CELIČNE SMRTI
Toksin A in toksin B s svojim delovanjem sproţita celično smrt, ki je lahko rezultat
apoptoze ali nekroze kot smo pisali v podpoglavju 2.2.3.3. Nekroza je posledica
fizikalnih poškodb in ni genetsko nadzorovana, medtem ko je apoptoza genetsko
nadzorovan celični odgovor na specifične razvojne draţljaje ali draţljaje iz okolja (Vaux
in sod., 1996). Z apoptozo in nekrozo je tesno povezana avtofagija. Lahko jo sproţi ali
prepreči. Do sedaj še ni ugotovljeno, ali toksina A in B lahko sproţita avtofagno celično
smrt.
Avtofagija je pomemben obrambni proces celice, pri katerem kisle vakoule z dvojno
membrano, avtofagosomi, zbirajo znotrajcelično vsebino (poškodovani organeli ali
makromolekule) in jo po fuziji z lizosomi razgradijo. To pomeni, da je avtofagija
bistvenega pomena za preţivetje, diferenciacijo, razvoj in homeostazo. Njena vloga je
prilagojena za zaščito organizmov proti raznolikim boleznim, vključno z okuţbami,
rakom, nevrodegeneracijo, staranjem in srčnimi boleznimi. Avtofagija usmerja patogene,
ki bivajo v citosolu ali v fagosomih v endolizosomalno pot razgradnje (Trombetta in
Mellman, 2005). Prehranski status, hormonski dejavniki in drugi pokazatelji, kot so
temperatura, koncentracija kisika in gostota celic, so pomembni pri nadzoru avtofagije.
Zato je potrebno dobro razumevanje fizioloških funkcij avtofagije in njene vloge pri
preprečevanju bolezni oziroma pri povzročitvi, če avtofagija uide iz nadzora (Levine in
Kroemer, 2008).
Kot vsak proces ima tudi avtofagija svoje pomanjkljivosti. Rakave celice jo lahko
izkoristijo za svoje preţivetje. Ob stradanju, ki ga povzroči slabša prekrvavitev tumorja,
se sproţi avtofagija in podaljša ţivljenjsko vlogo rakavih celic. Ob zdravljenju s
citostatiki se iz mitohondrijev sproţijo prosti radikali, z avtofagijo se rakaste celice
zaščitijo pred apoptozo. Rešitev bi bila ustaviti proces avtofagije med zdravljenjem.
Bakterije in virusi lahko preprečijo zlitje avtofagosoma z lizosomom in tako avtofagosom
postane prostor, kjer se celični mikrobi prehranjujejo in razmnoţujejo (Levine in
Kroemer, 2008).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 25
Nepravilno delovanje avtofagije se kaţe v različnih boleznih. Ljudje, ki bolehajo za
Chronovo boleznijo, imajo okvarjen avtofagosomni sistem, ki ne more obvladovati
namnoţevanja črevesnih mikroorganizmov. Pri nevrodegenerativnih boleznih
(Alzheimerjeva bolezen, spongiformna encefalopatija, Parkinsonova bolezen in
Huntingtonova bolezen) se zaradi okvarjene avtofagije v nevritih kopičijo nefunkcionalne
avtofagne vakoule, ki motijo delovanje nevrona (Rubinsztein in sod., 2007, Williams in
sod., 2006). Kopičenje avtofagosomov so ugotovili tudi pri bolnikih s srčnoţilnimi
boleznimi (preobremenitve srca, ishemija, bolezni koronarnih arterij, povišan krvni tlak,
bolezni srčnih zaklopk in kongestivno srčno popuščanje). Avtofagija s starostjo ni več
tako učinkovita in človeški organizem postaja bolj dovzeten za bolezni in staranje.
Povsod, kjer je celična degeneracija rezultat nekega obolenja, je lahko sproţenje ali
zaviranje celične smrti pot k ozdravljenju.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 26
3 MATERIALI IN METODE
Za poznavanje mehanizma delovanja in pomen toksinov smo uporabili čisti holotoksin B
(TcdB) referenčnega laboratorijskega seva VPI 10463 (A+B
+) in variantnega seva 8864
(A-B
+) (tgcBIOMICS, Mainz, Nemčija) ter rekombinatni vezavni domeni holotoksina B
(rec-TcdB3).
3.1 BAKTERIJSKI SEVI IN GOJENJE BAKTERIJ
3.1.1 Clostridium difficile
Vsi uporabljeni sevi bakterije Clostridium difficile so bili identificirani s klasičnimi in
molekularnimi postopki (Rupnik in sod., 1998; http://www.mf.uni-mb.si/Mikro/tox/) in
so trajno shranjeni v zbirki sevov Oddelka za raziskovalno dejavnost, Centra za
mikrobiologijo, Zavoda za zdravstveno varstvo Maribor pri – 80°C.
Seve bakterije Clostridium difficile, ki smo jih uporabili za hemolizni test in na modelu
nevretenčarja Caenorhabditis elegans, smo s cepilno zanko nanesli na površino
selektivnega trdnega gojišča za izolacijo posameznih kolonij. Plošče smo anaerobno
inkubirali pri 37°C 72 ur. Tipično kolonijo smo s trdnega gojišča prenesli v epruvete s 5
ml obogatitvenega tekočega gojišča in inkubirali 5 dni pri 37°C, kadar smo za poskus
uporabili supernatant seva. Po kultivaciji smo vsebino premešali na vrtinčniku, ločili
supernatant od peleta, tako da smo kulturo bakterije C.difficile centrifugirali (12000
obr/min, 10 min) in supernatant prefiltrirali skozi membranski poliacetni filter s porami
premera 0,22 µm (Millipore) ter tako pred vsakim poskusom pridobili ustrezno količino
osnovne kulture za nadaljnje delo.
3.1.2 Escherichia coli
Za transformacijo smo uporabili bakterijo Escherichia coli BL21(DE3). Sev BL21(DE3)
je izpeljava seva B bakterije E. coli. V gen int ima vstavljen fragment DNA, ki nosi gen
za RNA polimerazo faga T7, promotor lacUV5 in lacI (kodira represor gena lac, ki
nadzira promotor lacUV5). Tako sev BL21(DE3) omogoča visoko raven izraţanja
rekombinantnih proteinov, ki so zapisani na vektorjih s promotorjem T7. Poleg tega sta
pri tem sevu okvarjena gena lon in ompT, ki kodirata proteaze, ki bi lahko razgradile
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 27
rekombinantne proteine. Sintezo ekspresijskega proteina smo sproţili z dodatkom IPTG-
ja (Sigma, ZDA) v gojišče, ki omogoči prepis T7 RNA polimeraze.
Za vsako posamezno transformacijo smo porabili 100 μl suspenzije kompetentnih celic
E.coli BL21(DE3).
Nepatogeno bakterijo Escherichia coli OP50 smo uporabili kot hrano za nevretenčarski
model C. elegans. Za rast bakterije smo koliformne kolonije cepili na agar LB ali v
tekoče gojišče LB (Sigma, ZDA) in inkubirali aerobno pri 37°C preko noči.
3.2 CELIČNE LINIJE IN GOJENJE CELIC
Za in vitro študije interakcij med črevesnimi epitelnimi celicami in bakterijskimi toksini
smo uporabljali celični liniji humanih črevesnih epitelnih celic T84 in HT-29. Te celične
linije, ki smo jih dobili iz ameriške zbirke tipskih kultur (American Type Culture
Collection, ATCC), so obdrţale strukturne in funkcionalne lastnosti posameznih tipov
črevesnih epitelnih celic. Celična linija T84 se v fazi konfluentne rasti spontano
diferencira v absorbcijskim celicam podobne celice, medtem ko celice HT-29 v tej fazi
izraţajo lastnosti absorbcijskih in sluz producirajočih celic. Slabost celične linije HT-29
je, da ponavadi absorbcijske in sluz producirajoče celice predstavljajo le okoli 5 % vseh
celic, ostalo so pa nediferencirane celice. Za celice T84 je značilen polariziran fenotip.
Delo s celičnimi kulturami je vedno potekalo v sterilnih pogojih, v brezprašni komori.
Celice smo vzdrţevali v dopolnjenem gojišču D-MEM [10 % FBS, 1 % MEM NEA, 1 %
natrijev piruvat, penicilin (100 U/ml) in streptomicin (100 μg/ml); Gibco-Invitrogen,
Kalifornija, ZDA] v CO2 inkubatorju pri 37°C v aerobnih razmerah s 5 % CO2 in zračno
vlago. Za gojenje smo uporabljali različne posodice za gojenje celičnih kultur.
Stekleničke s površino 75 cm2 smo zaradi velike površine uporabljali za razmnoţevnaje
celic, za poskuse pa manjše gojitvene posodice, kot so 6-, 12- in 96 jamske ploščice.
Celice smo presejali enkrat tedensko. Da smo celice odlepili od podlage, smo jih najprej
sprali z RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen, Kalifornija, ZDA), nato pa medcelične povezave
prekinili z 0,25 % tripsin-EDTA (Gibco-Invitrogen, Kalifornija, ZDA). Celice smo
resuspendirali v gojišču D-MEM in jih prešteli.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 28
3.3 PRIPRAVA REKOMBINANTNE C-TERMINALNE VEZAVNE DOMENE
TOKSINA B (rec-TcdB3VPI, 8864)
Za izolacijo proteina (CDB3, 1751-2366 aa) rec-TcdB3VPI (74,080 kDa) toksina B seva
VPI 10463 in rec-TcdB38864 (73,104 kDa) seva 8864 bakterije C. difficile smo uporabili
ekspresijski sistem pGEX-2T z označevalnikom glutation-S-transferazo (GST). Za
pomnoţevanje gena za protein smo uporabili oligonukleotidne začetnike CDB3C,
CDB3N(5'-AGATCTCTTATGTCAACTAGTGAAGA-3',
5'- GGATCCCTATTCACTAATCACTAATT-3') pod pogoji pomnoţevanja s PCR
(denaturacija, 94°C, 10 s; naleganje, 48°C, 30 s; podaljševanje 68°C, 3 min; 30-krat)
(Hofmann in sod., 1997). Uspešnost kloniranja smo preverili z restrikcijo ter z
določanjem nukleotidnega zaporedja vnesenega fragmenta DNA izločili potencialne
mutacije, do katerih bi lahko prišlo zaradi napak polimeraze Taq.
Plazmid (0,1 μg/μl) smo transformirali v bakterijo Escherichia coli BL21(DE3). Zmes
smo 30 minut inkubirali na ledu, izvedli toplotni šok (37°C, 2 min), inkubirali na ledu,
dodali tekoče gojišče LB in stresali (37°C, 1 ura, 200 obr/min). 100 μl suspenzije smo
razmazali na agar LB z dodanim ampicilinom (100 μg/ml, Applichem, GmbH, Nemčija).
Naslednji dan smo prešteli število zraslih kolonij ter preverili ustreznost transformacije
kolonij s PCR in agarozno gelsko elektroforezo. Celice smo namnoţili v prekonočni
kulturi LB z ustreznim antibiotikom. Transformirane bakterije smo gojili pri 37°C do
OD600= 0,6-1, dodali IPTG (0,1 mM IPTG) in kultivirali preko noči. Supernatant smo
ločili od celičnega lizata po cetrifugiranju (4°C, 10 min, 4000 obr/min). Bakterijski pelet
smo resuspendirali z litičnim pufrom (50 mM TRIS-HCl, pH=8, 200 mM KCl, 1 mM
EDTA, pH=8, 1 % Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mg/ml lizocima, 1 mM PMSF; Sigma,
ZDA). Resuspendirane celice smo izmenično dvakrat inkubirali (-80°C/37°C, 20 min),
sonicirali (3 x 20 s) in centrifugirali (4°C, 45 min, 13000 obr/min), da smo očistili
supernatant bakterijskih membranskih in ostalih proteinov. Delno očiščen vzorec z
zamenjanim pufrom (1 M Tris-HCl, pH=8, 5 M NaCl) smo nadalje očistili z afinitetno
kromatografijo (Glutathione Sepharose 4B, Amersham Bioscience, New Yersey, ZDA) z
zaporednim spiranjem s pufrom in metodo izvajali po navodilih proizvajalca. Zaradi
prepoznavnavnega mesta za trombin v proteinskem konstruktu med fuzijskim (GST) in
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 29
rekombinatnim (CDB3) proteinom smo dodali trombin (Amersham Bioscience, New
Yersey, ZDA) in pustili reakcijo teči preko noči. Faze čiščenja rekombinatnih proteinov
in uspešnost rezanja s trombinom smo spremljali z elektroforezo NaDS-PAGE.
3.4 MERJENJE CELOKUPNE KONCENTRACIJE PROTEINOV Z METODO BCA
Koncentracijo proteinov smo merili z metodo BCA. Uporabili smo BCA Protein Assay
Kit (Pierce, Rockford, ZDA). Komplet vsebuje BCA reagent A in BCA reagent B. Kot
standard smo uporabili goveji serumski albumin (BSA, Sigma, ZDA). Umeritveno
premico smo uporabili z osmimi koncentracijami standarda BSA. Za meritve smo
uporabili 96 jamske mikrotitrske ploščice z ravnim dnom. 10 μl vzorca in standarda smo
nanesli v duplikatu. V vsako luknjico smo dodali 200 μl mešanice reagentov A in B (v
razmerju 50:1), ploščico pokrili s pokrovčkom in inkubirali 30 minut pri 37°C. Po
inkubaciji smo s čitalcem za mikrotitrske ploščice izmerili absorbanco pri valovni dolţini
492 nm. Iz povprečnih vrednosti absorbance in znanih koncentracij BSA smo izrisali
umeritveno krivuljo in izračunali enačbo regresijske premice s programom Excel. Iz
izmerjenih vrednosti absorbance vzorcev in iz enačbe regresijske premice smo izračunali
koncentracijo proteinov.
3.5 DOLOČANJE CELIČNE VIABILNOSTI S TESTOM MTT
Celice HT-29 z gostoto 1,0 x 104/100 μl gojišča smo nasadili v 96 jamske mikrotitrske
ploščice. Celice smo inkubirali v CO2 inkubatorju (37°C, 5 % CO2 ) samo v gojišču
(negativna kontrola) in v prisotnosti TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) ter rec-TcdB3VPI in
rec-TcdB38864 (25-100 μg/ml) 24, 48, 72 in 120 ur. Po inkubaciji smo dodali 10 μl MTT
(5 mg/ml-1
v 1 x PBS, Sigma, ZDA) in nadalje inkubirali 4 ure v CO2 inkubatorju, da je
potekla tvorba kristalov formazana. S 100 μl 10 % SDS v 0,1 M HCl smo raztopili
kristale in po inkubaciji preko noči pri sobni temperaturi izmerili absorbanco pri valovni
dolţini 620 nm z optičnim čitalcem (Tecan instruments, ZDA).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 30
3.6 DOLOČANJE DELEŢA CELIC V POSAMEZNIH FAZAH CELIČNEGA
CIKLA S PRETOČNIM CITOMETROM Z UPORABO PROPIDIJEVEGA
JODIDA (PI)
Za analizo celičnega cikla smo potrebovali 1,5 x 105/ml
celic HT-29. Celice smo najprej
prešteli s svetlobnim mikroskopom in jih v kompletnem gojišču nasadili v 6 jamske
ploščice, ki smo ga po 24 urah odstranili in celice inkubirali nadaljnjih 24 ur v gojišču
RPMI 1640 brez seruma, da smo celice časovno uskladili. Celice smo inkubirali samo v
gojišču (negativna kontrola) in v prisotnosti TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) ter rec-
TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) v CO2 inkubatorju (37°C, 5 % CO2 ) 24, 48, 72
in 120 ur. Po inkubaciji smo celice, ţe odlepljene od podlage in odlepljene po
tripsinizaciji, zbrali v epruvete za pretočni citometer (BD Biosciences, Kanada),
centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), sprali z 1 x PBS, utrdili z ledeno hladnim 70 %
etanolom in inkubirali najmanj 30 minut na ledu. Po centrifugiranju smo celice inkubirali
z RNazo (100 g/ml v 1 x PBS, Sigma, ZDA) 60 minut pri 37°C, dodali PI (100 μg/ml v
1x PBS, Sigma, ZDA) in inkubirali v temi pri sobni temperaturi 30 minut. Tako označene
celice smo analizirali s pretočnim citometrom (FACSCalibur, BD Biosciences, ZDA) in z
računalniškim programom (WinMDI Version 2.9).
3.7 METODA S FLUORESCENTNO OZNAČENIM PROTEINOM ANEKSIN-V
(AV) IN BARVILOM PROPIDIJEV JODID (PI) ZA DOLOČANJE DELEŢA
APOPTOTIČNIH CELIC S PRETOČNIM CITOMETROM
To smo določali s kompletom Annexin V-FLUOS Apoptosis Detection Kit (Roche,
GmbH, Mannheim, Nemčija) in izvajali test po navodilih proizvajalca.
Celice HT-29 s koncentracijo 1,5 x 105/ml smo nasadili v 6 jamske ploščice ter inkubirali
samo v gojišču (negativna kontrola) in v prisotnosti 50 ng/ml TcdBVPI in TcdB8864 ali 100
μg/ml rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 za 24 ali 72 ur. Po inkubaciji smo celice zbrali v
epruvete za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), dodali vezavno
raztopino AV/PI in inkubirali pri sobni temperaturi 15 minut. Tako označene celice smo
analizirali s pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman, ZDA) s
spremljanjem fluorescenčne emisije v območju 488-525 nm za fluorescenčno označen
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 31
FITC-AV in 560-680 nm za PI. Za vsako barvilo smo za vzbujanje fluorescence
uporabljali navedeno valovno dolţino (λex) ter spremljali spremembe v intenziteti
fluorescence pri maksimumih, specifičnih za posamezna barvila (λem).
3.8 SLEDENJE PROTEINOV BCL-2, BAX IN PARP Z NADS-PAGE, S
PRENOSOM PO WESTERNU IN IMUNODETEKCIJO
Celice HT-29 (1,5 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola) ter z rec-
TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 24, 72 ali 120 ur. Po končani inkubaciji smo
odpipetirali gojišče, sprali z 1 x PBS in postrgali adherentne celice. Po centrifugiranju
(4°C, 10 min, 7500 obr/min) smo resuspendirali celični pelet v pufru RIPA (150 mM
NaCl, 1 % NonidetR P40, 0,5 % natrijev deoksiholat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl,
pH=8), ki smo mu neposredno pred uporabo dodali proteazni inhibitor (1 %, Merck,
Darmstadt, Nemčija), PMSF (10 mg/ml, Sigma, ZDA) in leupeptin (100 μg/ml, Sigma,
ZDA) in inkubirali na ledu 45 minut. Celokupni celični protein (supernatant) smo ločili
od peleta po centrifugiranju (4°C, 20 min, 13000 obr/min) in shranili na -20°C do
priprave vzorca za NaDS-PAGE, za prenos po Westernu in imunodetekcijo. Celokupno
koncentracijo proteina smo izmerili z metodo BCA (podpoglavje 3.4) in nanesli 20 μg
denaturiranih (100°C, 10 min) proteinskih vzorcev na 12 % poliakrilamidni gel. Gel smo
ločili od podlage in prenesli na membrano PVDF (Bio-Rad, Kalifornija, ZDA). Sledilo je
inkubiranje membrane s primarnimi poliklonskimi protitelesi [Bcl-2 (0,4 μg/ml, Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, ZDA), Bax (0,4 µg/ml, GeneTex, Irvine, ZDA, PARP
(0,5 µg/ml, Cell Signaling Technology, Massachusettes, ZDA)] in s sekundarnimi
protitelesi (specifičnimi za primarna poliklonska protitelesa) z vezano hrenovo
peroksidazo. Membrano smo prilepili v kaseto za razvijanje. Film Kodak Biomax MR-1
(Sigma, ZDA) smo izpostavili kemiluminiscentni svetlobi za 10 sekund do 20 minut. Čas
izpostavitve smo prilagajali intenziteti lis in tako optimizirali razločnost lis.
3.9 DOLOČANJE AKTIVNOSTI IZVRŠITELJSKE KASPAZE-3 S PRETOČNIM
CITOMETROM
Celice HT-29 (1,5 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola) ter z rec-
TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 72 ur. Po inkubaciji smo celice zbrali v epruvete
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 32
za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), resuspendirali celice v
pufru CytofixTM
(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, ZDA) za 20 minut in jih po
tem sprali z raztopino Perm/WashTM
(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, ZDA).
Celice smo 30 minut inkubirali s FITC označenim kaspaza-3 poliklonskim protitelesom
(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, ZDA). Po inkubaciji smo celice še enkrat sprali
in analizirali s pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman, ZDA).
3.10 SLEDENJE APOPTOZE Z VSE-KASPAZNIM ZAVIRALCEM Z-VAD-FMK
(BENZYLOXYCARBONYL-VAL-ALA-ASP-FLUOROMETHYLKETONE)
To smo določali s kompletom Annexin V-FLUOS Apoptosis Detection Kit (Roche,
GmbH, Mannheim, Nemčija) in izvajali test po navodilih proizvajalca.
Celice HT-29 s koncentracijo 1,5 x 105/ml smo nasadili v 6 jamske ploščice in inkubirali
samo v gojišču (negativna kontrola), v prisotnosti 100 μg/ml rec-TcdB3VPI in rec-
TcdB38864 ter 50μM Z-VAD-FMK za 72 ur. Po inkubaciji smo celice zbrali v epruvete za
pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), dodali AV/PI vezavno
raztopino in inkubirali pri sobni temperaturi 15 minut. Tako označene celice smo
analizirali s pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman, ZDA) s
spremljanjem fluorescenčne emisije v območju 488-525 nm za fluorescenčno označen
FITC-AV in 560-680 nm za PI. Za vsako barvilo smo za vzbujanje fluorescence
uporabljali navedeno valovno dolţino (λex) ter spremljali spremembe v intenziteti
fluorescence pri maksimumih, specifičnih za posamezna barvila (λem).
3.11 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE PREKO TVORBE REAKTIVNIH
KISIKOVIH SPOJIN (ROS) S TESTOM MTT
Za oceno ROS s testom MTT smo nasadili HT-29 celice (1,0 x 104/100 μl) v 96 jamske
mikrotitrske ploščice in jih po 24 urah inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola), z
rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml), z NAC (5 mM, Sigma, ZDA) in GST (200
μM, Sigma, ZDA) v CO2 inkubatorju (37°C, 5 % CO2 ) 72 ur. Po inkubaciji smo dodali
10 μl MTT (5 mg/ml-1
v 1 x PBS) in nadaljevali po ţe opisanem protokolu (podpoglavje
3.5).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 33
3.12 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE PREKO TVORBE REAKTIVNIH
KISIKOVIH SPOJIN (ROS) S PRETOČNIM CITOMETROM
Za oceno znotrajcelične oksidacije preko tvorbe reaktivnih kisikovih spojin s pretočnim
citometrom smo uporabili fluorescenčno barvilo 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetat
(H2DCFDA, Molecular Probes, ZDA) in hidroetidin (HE, Molecular Probes, ZDA).
Celice HT-29 (1,5 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola) ter z rec-
TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 72 ur. Po inkubaciji smo celice zbrali v epruvete
za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), resuspendirali celice v
pufru HBSS (Gibco-Invitrogen, Kalifornija, ZDA) s HE (2,5 M) in H2DCFDA (0,1 M)
in inkubirali 30 minut pri 37°C. Po inkubaciji smo celice centrifugirali, resuspendirali v
pufru HBSS in pogledali s pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman,
ZDA) s spremljanjem fluorescenčne emisije v območju 585 nm in 530 nm za HE in
H2DCFDA. Za vsako barvilo smo za vzbujanje fluorescence uporabljali navedeno
valovno dolţino (λex) ter spremljali spremembe v intenziteti fluorescence pri
maksimumih, specifičnih za posamezna barvila (λem).
3.13 MERJENJE MITOHONDRIJSKEGA MEMBRANSKEGA POTENCIALA
(MMP) S PRETOČNIM CITOMETROM
Celice HT-29 (1,5 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola) ter z rec-
TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 72 ur. Po inkubaciji smo celice zbrali v epruvete
za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 minut, 1400 obr/min) in resuspendirali v
pufru HBSS z JC-1 (1 M, Gibco-Invitrogen, Kalifornija, ZDA). Celice smo nadalje
inkubirali 10 minut pri 37°C, centrifugirali, resuspendirali v pufru HBSS in analizirali s
pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman, ZDA) s spremljanjem
fluorescenčne emisije v območju 488 nm.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 34
3.14 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE Z DIFERENCIALNIM
BARVANJEM Z BARVILOM DIHIDRORODAMIN 123 (DHR 123)
Celice HT-29 (1,0 x 104/100 l) smo nasadili na objektna stekla. Celice smo najprej
preinkubirali z 10mM DHR 123 (Sigma, ZDA) 30 minut pri 37°C in nato inkubirali samo
v gojišču (negativna kontrola), s TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) za 12, 24 in 48 ur ali z
rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 g/ml) za 48 in 72 ur. Po inkubaciji smo celice
fiksirali v 4 % raztopini paraformaldehida v 3 x PBS 20 minut, sprali s pufrom 1 x PBS,
prekrili s snovjo proti zbleditvi signala (0,02 M natrijev borat, 90 % glicerol, 3 % N-
propil galat) in jih pritrdili na objektnik. Tako pripravljene preparate smo pregledali s
konfokalnim mikroskopom Leica TCS-NT/SP2.
3.15 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z UPORABO BARVILA AKRIDIN ORANŢNO
(AO) ZA KONFOKALNO MIKROSKOPIJO
HT-29 celice (1,0 x 105/ml) smo nasadili na objektna stekla in inkubirali samo v gojišču
(negativna kontrola), s TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) 24 in 48 ur ali z rec-TcdB3VPI in
rec-TcdB38864 (100 g/ml) 48 in 72 ur. Po inkubaciji smo medij D-MEM zamenjali z
medijem D-MEM z AO (0,5 l/ml, Sigma, ZDA). Celice smo inkubirali 15 minut pri
37°C, sprali s pufrom HBSS in fiksirali v 4 % raztopini paraformaldehida v 3 x PBS 20
minut, prekrili s snovjo proti zbleditvi signala (0,02 M natrijev borat, 90 % glicerol, 3 %
N-propil galat) in jih pritrdili na objektnik. Tako pripravljene preparate smo pregledali s
konfokalnim mikroskopom Leica TCS-NT/SP2.
3.16 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z UPORABO BARVILA AKRIDIN ORANŢNO
(AO) S PRETOČNIM CITOMETROM
Celice HT-29 (1,0 x 105/ml) smo nasadili na objektna stekla ter jih inkubirali samo v
gojišču (negativna kontrola) in s TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) 24 in 48 ur. Po
inkubaciji smo celice zbrali v epruvete za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min,
1400 obr/min) in resuspendirali celice v D-MEM z AO (0,5 l/ml). Celice smo inkubirali
15 minut pri 37°C, centrifugirali, resuspendirali v pufru HBSS in analizirali s pretočnim
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 35
citometrom (Coulter Cytomics FC500) s spremljanjem fluorescenčne emisije v območju
500 nm in 526 nm za AO. Za barvilo smo za vzbujanje fluorescence uporabljali navedeno
valovno dolţino (λex) ter spremljali spremembe v intenziteti fluorescence pri
maksimumih, specifičnih za posamezna barvila (λem).
3.17 SLEDENJE PROTEINOV LC3 IN KATEPSINA B ZA UGOTAVLJANJE
AVTOFAGIJE Z NADS-PAGE, S PRENOSOM PO WESTERNU IN
IMUNODETEKCIJO
Celice HT-29 (1,5 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola), s
TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) 12, 24 in 48 ur. Po končani inkubaciji smo odpipetirali
gojišče, sprali z 1 x PBS in postrgali adherentne celice. Po centrifugiranju (4°C, 10 min,
7500 obr/min) smo resuspendirali celični pelet v pufru RIPA, ki smo mu neposredno pred
uporabo dodali proteazni inhibitor (1 %), natrijev ortovanadat (1mM, Sigma, ZDA) in
natrijev fluorid (10 mM, Sigma, ZDA) in inkubirali na ledu 45 minut. Celokupni celični
protein (supernatant) smo ločili od peleta po centrifugiranju (4°C, 20 min, 13000
obr/min) in shranili na -20°C do priprave vzorca za NaDS-PAGE, za prenos po Westernu
in imunodetekcijo. Koncentracijo proteina smo izmerili z metodo BCA (podpoglavje
3.4). 20 μg denaturiranih (100°C, 10 min) proteinskih vzorcev smo nanesli na 12 ali 15 %
poliakrilamidni gel. Gel smo ločili od podlage in prenesli na PVDF membrano (Bio-Rad,
Kalifornija, ZDA). Sledilo je inkubiranje membrane z LC3 ali katepsin B primarnim
protitelesom (1 µg/ml, Sigma, ZDA) in za primarno protitelo specifičnim sekundarnim
protitelesom. Membrano smo prilepili v kaseto za razvijanje. Film Kodak Biomax MR-1
(Sigma, ZDA) smo izpostavili kemiluminiscentni svetlobi za 5 do 30 minut. Čas
izpostavitve smo prilagajali intenziteti lis in tako optimizirali razločnost lis.
3.18 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z METODO PCR V REALNEM ČASU (RT-PCR)
Celice HT-29 (4 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola) ter s
TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) 6, 12, 24 in 36 ur. Po inkubaciji smo celice sprali z 1 x
PBS, postrgali adherentne celice in jih prenesli v 1,5 ml mikrocentrifugirke. Celice smo
centrifugirali (4°C, 8 min, 2500 obr/min), da smo ločili celice od pufra. Za izolacijo
mRNA smo uporabili komplet SV Total RNA Isolation System (Promega, ZDA) in delali
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 36
po navodilih proizvajalca. Z metodo RT-PCR smo ugotavljali izraţanje genov na nivoju
mRNA, zato je bila vključena predstopnja obratne transkripcije, v kateri smo z reverzno
transkriptazo prepisali izolirano mRNA v cDNA, izhodiščni material za pomnoţevanje z
reakcijo RT-PCR. Za vsako reakcijo smo pripravili reagente v obliki skupne reakcijske
mešanice, ki smo jo razdelili v luknjice mikrotitrske ploščice s 96 jamicami, po 20 μl v
vsako luknjico. Pred reakcijo smo v vsako luknjico dodali še 5 μl cDNA. Mikrotitrsko
ploščico s pripravljeno standardno krivuljo in vzorci smo zatisnili z optično prepustno
folijo in jo prenesli v ABI Prism 7000 detektor za zaporedje (Applied Biosytems,
Anglija) in vzpostavili temperaturno-časovni protokol pomnoţevanja (preglednica 2).
Preglednica 2. Sestava reakcijske mešanice za RT-PCR.
Table 2. Composition of RT-PCR mixture.
gen in reakcijska mešanica 1 x 20 μl program RT-PCR
gadph
TaqMan® (Applied Biosystems,
Anglija)
12,5 μl
stopnja 1: 50°C 2 min
stopnja 2: 95°C 10 min
95°C 15 s
stopnja 3: 95°C 15 s
60°C 1 min 40x
P1 hGADPH F (10 pmol/l) 0,3 μl
P2 hGADPH R (10 pmol/l) 0,3 μl
sonda hGADPH (100 μM,
Applied Biosystems, Anglija )
6-FAM-ATGGCCTTCCGTGTCCCCACTG-TAMRA
1 μl
ddH2O 5,9 μl
lc3/ becn1
SYBR®Green
(Applied Biosystems, Anglija) 12,5 μl
stopnja 2: 95°C 10 min
95°C 15 s
stopnja 3: 60°C 45 s 35x
P1 MAP1 F/hBECN1 F
(10 pmol/l)
0,3 μl
P2 MAP1 R/hBECN1 R
(10 pmol/l)
0,3 μl
ddH2O 6,9 μl
cDNA (dodamo pred reakcijo) 5,0 μl
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 37
Preglednica 3. Uporabljeni začetni oligonukleotidi za RT-PCR.
Table 3. Appropriate primer pairs for RT-PCR.
OZNAKA ZAČETNEGA
NUKLEOTIDA
ZAPOREDJE ZAČETNIH
NUKLEOTIDOV
VIR
hGADPH F 5'-tgaacgggaagctcactgg-3' Colell in sod., 2007
hGADPH R 5'-ggtccaccactgacacgttg-3'
MAP1 F 5'-catgagcgagttggtcaaga-3' He in sod., 2003
MAP1 R 5'-ccatgctgtgctggttca-3'
hBECN1 F 5'-ggatggtgtctctcgcagat-3' Katayama in sod., 2007
hBECN1 R 5'-ttggcactttctgtggacat-3'
Pri relativni kvantifikaciji s standardno krivuljo smo izhodišćno koncentracijo tarčnega
dela gena pri vseh vzorcih odčitali iz standardne krivulje. Vrednosti preiskovanih vzorcev
smo delili z vrednostmi kontrolnih vzorcev. Količino tarčnega gena v preiskovanih
vzorcih smo nato izrazili kot relativno vrednost glede na količino tarčnega gena v
notranjem standardu ter tako normalizirali izraţanje prisotno pod normalnimi rastnimi
pogoji. Vzdrţevalni gen gadph smo uporabili za notranjo kontrolo. Na ta način smo
izničili še razlike v količini celokupne cDNA in izračunali n-kratno
povečanje/zmanjšanje prepisa preiskovanih genov glede na tretiran vzorec.
Podatki o intenziteti fluorescence, ki smo jih dobili po končani analizi z metodo RT-PCR
so bili pridobljeni iz ciklov RT-PCR med eksponentnim pomnoţevanjem reakcije PCR,
torej pri optimalnih pogojih in v zanesljivem razmerju med intenziteto fluorescence in
začetno količino tarčnega gena v vzorcih. Po končani reakciji RT-PCR smo osnovne
podatke o intenziteti fluorescence obdelalli s programom SDS 2.1 (Applied Biosystems,
Anglija). Le-ta je avtomatično beleţil osnovne podatke o intenziteti fluorescence kot
kopičenje pomnoţkov med vsakim ciklom reakcije RT-PCR ter prikazal v krivulji
pomnoţevnja (intenziteta fluorescence je v razmerju s številom ciklom). Ko smo
pregledali in morebiti popravili vse ustrezne nastavitve, smo dobljene rezultate prenesli v
program Microsoft Excel. Vzorcem, ki smo jih naredili v dveh ali treh ponovitvah, smo
izračunali povprečno vrednost in standardno deviacijo (lc3/hgadph oziroma
becn1/hgadph) ter jih predstavili v grafih.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 38
3.19 SLEDENJE INHIBICIJE AVTOFAGIJE S TESTOM MTT
3.19.1 Določanje celične viabilnosti z inhibitorji avtofagije
Za oceno celične viabilnosti smo nasadili celice HT-29 (1,0 x 104/100 μl) v 96 jamske
mikrotitrske ploščice in jih po 24 urah inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola), s
TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml), z vortmaninom (20 μM, Sigma, ZDA), 3-metiladeninom
(1 mM, Sigma, ZDA) in bafilomicinom A1 (200 nM, Sigma, ZDA) v CO2 inkubatorju pri
37°C 48 ur. Po inkubaciji smo dodali 10 μl MTT (5 mg/ml v 1xPBS) in nadaljevali po ţe
opisanem protokolu (podpoglavje 3.5).
3.19.2 Določanje celične viabilnosti po transfekciji celic za utišanje izraţaja gena
becn1
Za oceno celične viabilnosti transfeciranih celic v prisotnosti holotoksina TcdBVPI, 8864
smo prav tako uporabili test MTT. Celice smo transfecirali za utišanje izraţanja gena
becn1 po protokolu proizvajalca Reverse Transfection of StealthTM
RNAi or siRNA using
LipofectamineTM
2000 in 96 well plate format (Invitrogen, Kalifornija, ZDA) preden smo
dodali TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml). Kontrolne celice po transfekciji niso bile
izpostavljene TcdB. Po 24 in 48 urni inkubaciji smo dodali 10 μl MTT (5 mg/ml v 1 x
PBS) in nadaljevali po ţe opisanem protokolu (podpoglavje 3.5).
3.20 SPREMEMBE V AKTINSKEM CITOSKELETU
Celice HT-29 (3 x 104/100 μl) smo gojili v standardnih razmerah na objektnih stekelcih,
ki smo jih poloţili v 12 jamsko ploščico. Po inkubaciji celic s TcdBVPI in TcdB8864 (50
ng/ml) ter rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) smo odstranili medij, sprali z 1 x
PBS in fiksirali 10 minut v 4 % raztopini paraformaldehida v 3 x PBS. Po fiksaciji smo
celice spirali z 1 x PBS, povečali prepustnost celične membrane z 0,2 % raztopino triton
X-100 in blokirali nespecifično barvanje ozadja s 30 minutno inkubacijo v 2 % raztopini
BSA. Celice smo po tem inkubirali s FITC označenim faloidinom (50 μg/ml, Sigma,
ZDA) v 0,5 % raztopini BSA 1 uro. Po končani inkubaciji smo celice temeljito sprali,
prekrili s snovjo proti zbleditvi signala (0,02 M natrijev borat, 90 % glicerol, 3 % N-
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 39
propil galat) in jih pritrdili na objektnik. Tako pripravljene preparate za
imunofluorescenčno dokazovanje proteinov citoskeleta smo pregledali s konfokalnim
mikroskopom Leica TCS-NT/SP2.
3.21 IMUNOFLUORESCENCA PROTEINA TESNIH STIKOV ZO-1
Celice T84 (3 x 104/100 μl) smo gojili v standardnih razmerah na objektnih stekelcih, ki
smo jih poloţili v 12 jamsko ploščico. Po inkubaciji s TcdBVPI (50 ng/ml) ter rec-
TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) smo odstranili medij, sprali z 1 x PBS in fiksirali
10 minut v 4 % raztopini paraformaldehida v 3 x PBS. Po fiksaciji smo celice spirali z 1 x
PBS, povečali prepustnost celične membrane z 0,2 % raztopino triton X-100 in blokirali
nespecifično barvanje ozadja s 30 minutno inkubacijo v 2 % raztopini BSA. Celice smo
po tem inkubirali s primarnim poliklonskim protitelesom ZO-1 (0,2 µg/ml, Invitrogen,
Kalifornija, ZDA) v 0,5 % raztopini BSA 1 uro. Po končani inkubaciji smo celice
temeljito sprali in inkubirali s FITC označenim sekundarnim protitelesom (0,1µg/ml,
Invitrogen, Kalifornija, ZDA) še 1 uro. Celice smo sprali z 1 x PBS, prekrili s snovjo
proti zbleditvi signala (0,02 M natrijev borat, 90 % glicerol, 3 % N-propil galat) in jih
pritrdili na objektnik. Tako pripravljene preparate za imunofluorescenčno dokazovanje
proteina tesnega stika smo pregledali s konfokalnim mikroskopom Leica TCS-NT/SP2.
Vzporedno z označevanjem ustreznih antigenov smo naredili tudi negativne kontrole, kjer
smo izpustili inkubacijo s primarnimi protitelesi, ostali protokol pa je bil nespremenjen.
3.22 TRANSEPITELNA ELEKTRIČNA UPORNOST (TEER) CELIC T84
Da bi ugotovili učinek toksina na skladnost epitela, smo celice T84 (6 x 104/600 μl) gojili
v 12 jamskih ploščicah na filterskih vstavkih. Transepitelno električno upornost smo
merili z Millicell-ERS Volt/Ohm metrom (Millipore) in pripadajočim parom elektrod.
Eno elektrodo smo pomočili v gojišče nad filtrom s plastjo celic, drugo pa v gojišče v
predel pod filtrom ter merili upornost celične plasti oziroma razliko v napetosti med
apikalno (zgornjo) in bazolateralno (spodnjo) površino celic. TEER praznega filtra smo
odšteli od TEER plasti kot prikazuje enačba: R [Ωcm2] = (Rv-Rf) [Ω]*P [cm
2]
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 40
[R= upornost plasti celic, Rv = upornost plasti celic in filtra, Rf = upornost praznega filtra
(brez celic), P = površina filtra].
Celice smo gojili v 12 jamskih ploščicah na filtrskih vstavkih. TEER smo merili od
nasaditve celic do 12 dneva starosti. Gojišče smo menjali vsaki drugi dan in pred
stimulacijo smo celicam prav tako zamenjali gojišče. Gojišče D-MEM smo odstranili iz
predela pod filtrom in iz celic na filtru. Celice smo izpostavili toksinom v časovnem
intervalu (1, 2, 3, 4, 7, 12, 24, 36, 48, 72 ur), tako da smo nanesli nad filter v 0,6 ml D-
MEM 50 ng/ml TcdB3VPI in TcdB38864 ter 100 μg/ml rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864.
Negativno kontrolo so predstavljale celice, ki niso bile izpostavljene toksinom. TEER
vrednosti plasti celic, ki so bile izpostavljne TcdB in rec-TcdB3 smo primerjali s TEER
vrednostjo negativne kontrole. Poskus smo izvedli v dveh ponovitvah s tremi paralelkami.
3.23 DOLOČANJE KONCENTRACIJE IL-8 PRI CELICAH HT-29 Z IMUNSKIM
TESTOM ELISA
Celice smo gojili v 96 jamskih ploščicah in inkubirali 24 in 72 ur s TcdBVPI, 8864 (50
ng/ml) in rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml). Negativno kontrolo so predstavljale celice, ki
jih nismo inkubirali s holotoksinom oziroma z rekombinantnim proteinom. Poskus smo
opravili v dveh paralelkah. Po inkubaciji smo supernatante prenesli v 1,5 ml
mikrocentrifugirke in centrifugirali 10 minut, da bi jih pri morebitni usedlini ločili od
supernatantov, in supernatante shranili na -20°C za kasnejše meritve koncentracij IL-8.
Za merjenje IL-8 smo uporabili komplet Interleukin 8 (ImmunoTools, GmbH, Nemčija)
in delali po navodilih proizvajalca. Absorbanco pri valovni dolţini 450 nm smo izmerili s
čitalcem mikrotitrskih ploščic (Tecan instruments). Iz povprečnih vrednosti optične
gostote izmerjenih pri standardih IL-8 znanih koncentracij, smo izrisali umeritveno
premico in izračunali enačbo regresijske premice s programom Excel. Iz izmerjenih
vrednosti optične gostote vzorcev in iz enačbe regresijske premice smo izračunali
koncentracijo IL-8.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 41
3.24 UGOTAVLJANJE UČINKA SEVOV BAKTERIJE C. difficile NA
ERITROCITE
3.24.1 Hemoliza β in sevi bakterije C. difficile
Pri naključno testiranih sevih AT11, AT25, AT30, C23, ZZV07-584 in ZZV07-585 smo
opazili cono hemolize na trdnem gojišču Schaedler, diferencialnem gojišču z ovčjo krvjo.
Te seve smo zato testirali na različnih trdnih diferencialnih gojiščih (preglednica 4), da bi
potrdili njihovo hemolitično aktivnost in optimizirali metodo. Po tri dnevni anaerobni
inkubaciji pri temperaturi 37°C smo ocenili in izmerili cono hemolize (hemolizo smo
opredelili kot hemoliza β zaradi bistrosti cone). Kontaminacijo smo izključili s
toksinotipizacijo (Rupnik in sod., 1998; http://www.mf.uni-mb.si/Mikro/tox/)
hemolitične kolonije.
Preglednica 4. Sestava gojišča za ugotavljanje hemolitične aktivnosti bakterije C. difficile.
Table 4. Structure of media for testing hemolytic activity from bacteria C. difficile.
kolonija izbranega seva
bakterije C. difficile
diferencialno gojišče
KA
(5 % ovčja kri)
pepton 15,0 g/L
jetrni ekstrakt 2,5 g/L
kvasni ekstrakt 5,0 g/L
NaCl 5,0 g/L
agar 13,0 g/L
COH
(5 % konjska kri)
politon 10,0 g/L
hidrolizirani ţivalski in
rastlinski proteini
10,0 g/L
mioton 3,0 g/L
koruzni škrob 1,0 g/L
NaCl 5,0 g/L
agar 13,0 g/L
KA za ET
(5 % goveja kri)
kazein 10,0g/L
ţivalsko tkivo 10,0 g/L
kvasni ekstrakt 2,0 g/L
dekstroza 1,0 g/L
NaCl 5,0 g/L
NaHSO3 0,1 g/L
hemin 0,1 g/L
vitamin K1 0,01 g/L
agar 15,0 g/L
Schaedler
(5 % ovčja kri)
kazein 8,2 g/L
ţivalsko tkivo 2,5 g/L
soja 1,0 g/L
dekstroza 5,8 g/L
kvasni ekstrakt 5,0 g/L
NaCl 1,7 g/L
Tris aminometan 3,0 g/L
hemin 0,01 g/L
K2HPO4 0,8 g/L
L-cistin 0,4 g/L
vitamin K1 0,01 g/L
agar 13,5 g/L
pH 7,4 ± 0,1 pH 7,3 ± 0,1 pH 7,0 ± 0,2 pH 7,6 ± 0,1
pogoji inkubacije:
37°C, 3 dni, anaerobno
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 42
3.24.2 Ugotavljanje hemolitične aktivnosti supernatanta kulture na eritrocitih
Ovčje eritrocite, ki so bili shranjeni v konzervansu za eritrocite (Alseverjev reagent; 4,2 g
NaCl, 8 g Na3C6H5O7 x 2H2O, 0,55 g C6H8O7 x H2O, 20,5 g D-glukoza, 1000 ml vode)
pri 4°C, smo uporabili za optimizacijo metode. Eritrocite smo pripravili tako, da smo jih
centrifugirali pri 2500 obratih na minuto, 5 minut. Supernatant smo zavrgli, usedlino pa
trikrat sprali z 0,85 % fiziološko raztopino. Po spiranju s fiziološko raztopino smo
usedlino sprali še v pufru za eritrocite (0,1 M Tris, 0,1 M cistein, 0,85 % NaCl, pH =7,6).
Pred testiranjem hemolitične aktivnosti smo spreminjali: odstotek eritrocitov (0,5 %, 1 %,
2 %), sestavo eritrocitnega pufra (0,1 M Tris, 0,1 M cistein, 0,85 % NaCl, pH =7,6 ali
5 mM Tris, 5 mM cistein, 0,85 % NaCl, pH =7,6 ali PBS) in temperaturo inkubacije
supernatanta (22°C ali 37°C).
Ko smo izbrali ustrezni odstotek eritrocitov, pufer in temperaturo inkubacije supernatanta,
smo pod različnimi pogoji ugotavljali hemolitično aktivnost supernatanta kulture
(preglednica 5).
Hemolitično aktivnost smo testirali pri supernatantih sevov AT11, AT25, AT30, C23,
ZZV07-584 in ZZV07-585 in jih primerjali s hemolitično aktivnostjo supernatanta
bakterije Clostridium perfringens tip C.
Za ugotavljenje hemolitične aktivnosti smo odpipetirali supernatant testiranega seva in
suspenzijo eritrocitov v 1,5 ml mikrocentrifugirko in inkubirali pri izbranih pogojih. Z
dodajanjem holesterola (prosti holesterol lahko inhibira aktivnost), proteinaze K
(encimsko aktivno sevi, ki lahko izločajo depolimerizacijske encime) ali cisteina (nujen
za lizo membrane) smo po učinku na eritrocite ţeleli ugotoviti molekularni mehanizem
delovanja supernatantov (preglednica 5). Po končani inkubaciji smo z mikročitalcem
izmerili absorbanco na mikrotitrni plošči, kjer smo v jamico odpipetirali 100 µl
suspenzije. Preostanek suspenzije smo centrifugirali (5min, 4000 obr/min), da smo
ocenili še motnost supernatanta in nastali pelet (hemoliza).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 43
Za negativno kontrolo je sluţil vzorec brez dodanega supernatanta, samo s sterilno vodo.
Supernatant bakterije Clostridium perfringens tip C pa smo uporabili za pozitivno
kontrolo.
Preglednica 5. Različni pogoji za hemolitično aktivnost supernatanta kulture.
Table 5. Different conditions of supernatant hemolytic activity.
supernatant kulture in
POGOJI OPTIMIZACIJE A B C D E F G H I J
holesterol (1 mg/ml v EtOH, Sigma) - - - - - - - - + +
proteinaza K (0,01 mg/ml, Sigma) + - - - + - - + + -
cistein (5 mM, pH=7,6, Sigma) + + + + - - - - + +
inkubacija pri T=22°C, 30 min + - + + + + + + + +
inaktivacija pri T=95°C, 2uri + - - + - - + + + -
eritrociti + + + + + + + + + +
inkubacija pri T=37°C, 1 ura + + + + + + + + + +
centrifugiranje (5 min, 4000 obr/min) + + + + + + + + + +
3.25 NEMATOD C. elegans KOT ŢIVALSKI MODEL ZA OKUŢBO Z BAKTERIJO
C. difficile
3.25.1 Nematod C. elegans in pogoji vzdrţevanja
Naš modelni organizem je bil mikroskopsko majhen večcelični evkariot C. elegans.
C. elegans smo gojili na agarju NGM [2,5 g peptona, 3 g NaCl, 17 g agarja, 1000 ml
vode, 25 ml 1M KH2PO4 (pH=6), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml holesterola (5
mg/ml v EtOH], z nepatogeno bakterijo Escherichia coli OP50, s katero se nematodi
prehranjujejo, pri temperaturi 22°C. Razvoj C. elegans poteka od jajčeca, preko larve
(L1-L4) do odraslega nematoda 3 do 7 dni. Na sveţi agar NGM s prekonočno kulturo E.
coli OP50 smo C. elegans prenašali vsak peti dan in na agar NGM brez E. coli pred
pripravo poskusa.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 44
3.25.2 Ugotavljanje učinka TcdB in supernatantov sevov C. difficile na C. elegans
Učinek na C. elegans smo testirali pri holotoksinu TcdBVPI in TcdB8864 in supernatantih
sevov VPI, 630 (A+B
+CDT
- seva), R12078 (A
+B
+CDT
+sev) in C23 (A
-B
-CDT
-sev) ter ga
primerjali z učinkom tekočega gojišča NGM in BHI.
Za poskus smo uporabili 12 jamske ploščice. 10 do 30 nematodov vseh razvojnih oblik
smo prenesli v 500 μl tekočega gojišča s TcdBVPI, 8864 s končno koncentracijo 5 μg/ml, v
500 μl sterilnega supernatanta kulture in v 500 μl tekočega gojišča (negativna kontrola)
za 24, 48 in 72 ur. Po inkubaciji smo suspenzije odpipetirali v 1,5 ml mikrocentrifugirke,
centrifugirali (22°C, 30 s, 3300 obr/min), sprali trikrat zaporedoma s pufrom M9 (6 g
Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO4*7H2O, 1000 ml vode) in nematode
prenesli na trdno gojišče NGM. C. elegans smo še nadalje spremljali 24, 48 in 72 ur.
3.25.3 Ugotavljanje učinka sevov C. difficile na C. elegans
Učinek na C. elegans smo testirali pri sevih VPI, 630 (A+B
+CDT
- seva), R12078
(A+B
+CDT
+sev) in C23 (A
-B
-CDT
-sev). Spore izbranih sevov smo inokulirali na trdno
gojišče NGM in inkubirali pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 37°C tri dni. Nato smo
prenesli 50 do 100 nematodov na trdno gojišče NGM s sevi C. difficile in jih opazovali 12
dni.
3.26 STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV
S programom SPSS 15.0 smo rezultate statistično ovrednotili in označili za statistično
pomembno odstopanje od kontrole pri P< 0,05.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 45
4 REZULTATI
4.1 UČINEK TOKSINA B (TcdB) IN REKOMBINANTNE VEZAVNE DOMENE
TOKSINA B (rec-TcdB3) NA VIABILNOST CELIC
4.1.1 Določanje celične viabilnosti s testom MTT v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3
Preverjali smo citotoksičnost rekombinantne vezavne domene rec-TcdB3 na rakavi
celični liniji HT-29 in s tem določili koncentracijo in čas, pri kateri deluje rec-TcdB3
toksično. Viabilnost izbrane celične linije smo spremljali pri koncentracijah 25, 50 in 100
μg/ml. Celice so bile nespremenjene pri koncentraciji 25 μg/ml. Prve učinke smo opazili
pri koncentraciji 50 μg/ml, statistično značilni učinek rekombinantnih vezavnih domen na
HT-29 pa pri koncentraciji 100 μg/ml po 72 urni inkubaciji.
Preverjali smo tudi mejo citotoksičnosti s holotoksinom B pri koncentracijah 50, 100 in
200 ng/ml in izbrali koncentracijo 50 ng/ml, pri kateri deluje TcdB citotoksično.
Primerjali smo izmerjene spremembe metabolične aktivnosti na rakavi celični liniji HT-
29 v prisotnosti rekombinantne vezavne domene rec-TcdB3 s holotoksinom B (slika 3).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 46
kon
trola
Tcd
BV
PI
Tcd
B8
86
4
via
bil
nost
cel
ic (
%)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Tcd
BV
PI
rec-
Tcd
B3
VP
I
Tcd
B8
86
4
rec-
Tcd
B3
886
4
rec-
Tcd
B3
VP
I
rec-
Tcd
B3
886
4
24 ur 48 ur 72 ur 120 ur
*** *** *** ** ** *** ******
Slika 3. Učinek TcdB in rec-TcdB3 na celično viabilnost. Celice HT-29 smo tretirali s 50 ng/ml TcdBVPI ali
TcdB8864 in 100μg/ml rec-TcdB3VPI ali rec-TcdB38864. Deleţ viabilnih celic smo ugotavljali po 24, 48, 72
in 120 urah s testom MTT. V histogramih je prikazana standardna napaka treh neodvisnih eksperimentov. P
vrednost nam pove, ali je razlika statistično značilna ali ne (*p<0.05, p**<0.01, ***p<0.001). * označuje
statistično pomembno odstopanje od kontrole.
Figure 3. Effect of TcdB or rec-TcdB3 treatment on cell viability. HT-29 cells were treated with 50 ng/ml
of TcdBVPI or TcdB8864 and 100μg/ml of rec-TcdB3VPI or rec-TcdB38864. The percentage of viable cells was
determined after 24 hours, 48 hours, 72 hours and 120 hours exposure by MTT assay. Data are expressed as
mean SEM of at least three independent experiments. A P value of <0.05 was considered statistically
significant (*p<0.05, p**<0.01, ***p<0.001). An asterisk indicates a statistically significant difference
from the control.
Razvidne so razlike med holotoksinom in rekombinantno vezavno domeno. Deleţ
viabilnih celic med obema rekombinantnima domenama je enak. V primerjavi s TcdB VPI,
8864 pa je za toksičen učinek rekombinantnih domen potreben daljši čas in višja
koncentracija.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 47
4.2 UČINEK TOKSINA B (TcdB) IN REKOMBINANTNE VEZAVNE DOMENE
TOKSINA B (rec-TcdB3) NA APOPTOZO
Deleţ apoptotičnih celic v celičnih vzorcih smo določali z dvema metodama pretočne
citometrije: analizo celičnega cikla in AV/PI. Z izbranima metodama pretočne citometrije
smo pridobili podatke o deleţu celic v različnih fazah celičnega cikla in deleţu
apoptotičnih oziroma nekrotičnih celic.
4.2.1 Deleţ celic v posameznih fazah celičnega cikla in deleţ apoptotičnih celic v
subG1 fazi v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3
Celična membrana je v odvisnosti od faze celičnega cikla različno prepustna za
propidijev jodid (PI). Z barvanjem s PI (podpoglavje 3.6) smo ugotovili, v kateri fazi
celičnega cikla ter v kakšnih deleţih se nahajajo celice tretirane s holotoksinoma
TcdBVPI,8864 in rekombinatnima proteinoma rec-TcdB3VPI, 8864 (slika 4).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 48
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
G1
S
G2/M
A
24 ur 48 ur 72 ur 120 ur
razp
ored
itve
celic
v r
azlič
nih
faza
h ce
ličn
ega
cikl
a (%
)
subG1
Tcd
BV
PI
Tcd
B88
64
kont
rola
kont
rola
kont
rola
rec-
Tcd
B3 V
PI
Tcd
BV
PI
Tcd
B88
64
rec-
Tcd
B3 88
64
rec-
Tcd
B3 V
PI
rec-
Tcd
B3 88
64
kont
rola
subG
1 fa
za (a
popt
otič
ne ce
lice)
(%)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
kont
rola
kont
rola
kont
rola
kont
rola
TcdB
VPI
TcdB
VPI
TcdB
8864
TcdB
8864
rec-
TcdB
3 VPI
rec-
TcdB
3 VPI
rec-
TcdB
3 8864
rec-
TcdB
3 8864
24 ur
* ** * *** ** ** **
48 ur 72 ur 120 ur
B
Slika 4. A. Razdelitev celic v posameznih fazah celičnega cikla. Celice smo obdelali in obarvali z barvilom
PI ter opravili analizo s pretočnim citometrom. B. Deleţ celic v subG1 fazi celičnega cikla. V histogramih
je prikazana standardna napaka dveh neodvisnih eksperimentov. P vrednost nam pove, ali je razlika
statistično značilna ali ne (*p<0.05, p**<0.01, ***p<0.001). * označuje statistično pomembno odstopanje
od kontrole.
Figure 4. Panel A. Distribution of cells in the various phases of the cell cycle. Cells were fixed and stained
with propidium iodide (PI) and analyzed by flow cytometry. Panel B. Percentage of cells in SubG1 phase.
Data are mean SEM of two separate experiments with duplicate determinations. A P value of < 0.05 was
considered statistically significant (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). An asterisk indicates a statistically
significant difference from the respective time-matched control.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 49
Celice so v različnih fazah celičnega cikla različno produktivne. Kontrolni sistem
celičnega cikla se odziva na različne zunanje in notranje celične signale in če niso
zagotovljeni vsi pogoji, se napredovanje celičnega cikla v določenih točkah lahko
zaustavi. Po dobljenih rezultatih, v primerjavi z netretiranimi celicami (kontrola), TcdB
in rec-TcdB3 vplivata na zaporedje dogodkov, s pomočjo katerih celica vstopi v novo
fazo celičnega cikla. Največji deleţ tretiranih celic je v G1 fazi, kar je običajno, ker je to
najdaljša faza celičnega cikla. Zniţan deleţ celic v S fazi posledično vpliva na povečanje
deleţa celic v G2/M fazi, kjer se celice delijo. Visok deleţ celic v G2/M fazi zabeleţimo
po tretiranju celic s TcdB kot tudi z rec-TcdB3. Zaustavljen celični cikel v G2/M fazi
blokira delitveno vreteno, povzroči depolimerizacijo mikrotubulov, ki so del celične
delitve in obnove. Inhibicija povzroči celično smrt. Celice v subG1 fazi označimo kot
pozno apoptotične celice.
V subG1 fazi celičnega cikla je po tretiranju s TcdBVPI 19 % celic in po tretiranju s
TcdB8864 17 % ter 11 % po tretiranju z rec-TcdB3VPI in 5 % po tretiranju z rec-TcdB38864.
Deleţ celic v subG1 fazi sorazmerno naraste z daljšim časom inkubacije, hkrati pa se
zniţa deleţ celic v G2/M fazi. Po rezultatih lahko predpostavljamo, da je zaradi delovanja
toksinov TcdB in rec-TcdB3 nadzor rasti G1 faze, uvajanja S faze in delitve celic v G2/M
fazi porušen, kar vodi v povečanje števila pozno apoptotičnih celic (subG1).
4.2.2 Določanje deleţa apoptotičnih in nekrotičnih celic z barvilom aneksin-V (AV)
in barvilom propidijev jodid (PI) v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3
S FITC označen aneksin-V se ob prisotnosti Ca2+
ionov veţe na fosfatidilserin, ki je
prisoten na notranji strani celične membrane. Ko celica sproţi apoptozo, se fosfatidilserin
prenese na zunanjo stran membrane, na katerega se veţe s fluorokromom označen
aneksin-V. Barvilo PI vstopi samo v celice s poškodovano celično membrano.
S to metodo smo določili deleţ ţivih celic (AV-, PI
-), zgodnje apoptotičnih (AV
+, PI
-),
pozno apoptotičnih (AV+PI
+) in nekrotičnih celic (AV
-PI
+).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 50
Annexin VAnnexin V Annexin V
PI
PI
PI
kontrola rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864
kontrola TcdBVPI TcdB8864
Annexin V Annexin V
PI
PI
PI
Annexin V
A
B
0
20%
40%
60%
80%
100%
72 ur24 ur
Tcd
BV
PI
kon
trola
razm
erj
e c
eli
c (
%)
žive celice
zgodnje apoptotične celice
pozne apoptotične celice
nekrotične celice
Tcd
B88
64
rec-T
cd
B3
VP
I
rec-T
cd
B3
88
64
kon
trola
Slika 5. Rezultati analize pretočne citometrije spremenjene membrane celic HT-29 tretiranih s TcdBVPI in
TcdB8864 (50 ng/ml) (A) ali rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) (B) v izbranem času.
Zgoraj: Prikaz diagramov z metodo Aneksin-V/Propidijev jodid s pretočnim citometrom. Spodnji levi
kvadrant (B3/L3) predstavlja deleţ ţivih celic (AV-, PI
-), spodnji desni kvadrant (B4/L4) predstavlja deleţ
zgodnje apoptotičih celic (AV+, PI
-), zgornji levi kvadrant (B1/L1) predstavlja deleţ nekrotičnih celic (AV
-,
PI+) in zgornji desni kvadrant (B2/L2) predstavlja deleţ pozno apoptočnih celic (AV
+, PI
+).
Spodaj: Deleţ ţivih, zgodnje in pozno apoptotočnih celic ter nekrotičnih celic smo prikazali grafično po
analizi s pretočnim citometrom. Rezultati so povprečje dveh neodvisnih poskusov.
Figure 5. Flow cytometry analysis of membrane alteration in HT-29 cells treated with TcdBVPI and
TcdB8864 (50 ng/ml) or rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864 (100 μg/ml) for the indicated times.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 51
Upper panels. Representative flow cytometry biparametric analysis of Annexin-V-FITC versus PI signal.
Bottom left quadrant represents live cells (AV-, PI
-), bottom right quadrant represents early apoptotic cells
(AV+, PI
-), top left quadrant represents necrotic cells (AV
-, PI
+). top right quadrant represents late apoptotic
cells (AV+, PI
+).
Lower panel: Percentage of alive, early and late apoptotic as well as necrotic cells based on flow cytometric
analysis. Data are representative of two independent experiments with similar results.
Z metodo AV/PI smo določili obliko celične smrti in ugotovili, da je po inkubaciji s
TcdBVPI visok deleţ aneksin-V pozitivnih celic (30 % zgodnje in 11,6 % pozno
apoptotičnih celic) in niţji deleţ nekrotičnih celic (19,8 %). Po inkubaciji s TcdB8864 je v
nasprotju s TcdBVPI višji deleţ nekrotičnih celic (19,8 %) in niţji deleţ aneksin-V
pozitivnih celic (14,4 % zgodnje in 10,3 % pozno apoptotičnih celic). Rekombinantna
proteina imata podoben učinek kot holotoksina. Po inkubaciji z rec-TcdB3VPI je kot pri
TcdBVPI več zgodnje apoptotičnih celic (13,4 %) kot nekrotičnih celic (8,0 %), medtem
ko je po inkubaciji z rec-TcdB38864 enako kot pri TcdB8864 več nekrotičnih celic (16,9 %)
in manj zgodnje apoptotičnih celic (11,0 %).
4.2.3 Določanje aktivnosti izvrševalne kaspaze-3 s pretočno citometrijo v
prisotnosti rec-TcdB3
Z ugotavljanjem aktivnosti kaspaze-3 lahko določimo, če se sproţi proces apoptoze po
notranji ali zunanji poti, saj je kaspaza-3 skupna obema potema in je končna molekula v
kaskadi kaspaz. Kaspaza-3 se ob aktivaciji cepi na dve podenoti. S FITC označenim
monoklonskim protitelesom, ki se veţe le na eno podenoto, smo potrdili aktivnost
kaspaze-3 (slika 6).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 52
kontrola rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864
R R R
Slika 6. Rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 aktivirata kaspazo-3. Celice HT-29 smo inkubirali z obema
rekombinantnima proteinoma 72 ur. Z monoklonskim FITC označenim protitelesom smo z analizo
celičnega cikla s pretočnim citometrom dokazovali aktivnost kaspaze-3.
Figure 6. Caspase-3 induced activity by rec-TcdB3VPI and recTcdB38864. HT-29 cells were incubated in the
presence of the two recombinant protein and 72 h of treatment, cells were harvested, and stained with an
anti-human active caspase-3 fragment monoclonal antibody conjugated with FITC, and analysed by flow
cytometry.
Oba rekombinantna proteina po 72 urah inkubacije aktivirata kaspazo-3, kar pomeni, da
lahko sproţita od kaspaze odvisno pot.
4.2.4 Detekcija apoptoze s sledenjem Bcl-2, Bax in cepitve PARP v prisotnosti rec-
TcdB3
Kot kazalec celične smrti smo uporabili tudi razmerje stopnje izraţanja proteinov
Bax/Bcl-2, ki je količnik med relativnim izraţanjem proapoptotskega proteina Bax in
relativnim izraţanjem antiapoptskega proteina Bcl-2 v posamezni celični kulturi.
kontrola rec-TcdB3VPI
Bcl-2 / 24 ur
Bcl-2 / 72 ur
Bcl-2 / 120 ur
Bax / 24 ur
Bax / 72 ur
Bax / 120 ur
β-aktin
β-aktin
β-aktin
β-aktin
β-aktin
β-aktin
rec-TcdB38864 kontrola rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864
Slika 7. Prisotnot proteinov Bcl-2 (29 kDa) in Bax (23 kDa). Slika filma po prenosu Western prikazuje
stopnjo upadanja signala Bcl-2 in stopnjo naraščanja signala Bax pri različnih časih. Celice HT-29 smo
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 53
tretirali s 100 μg/ml rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 in ločili protein iz čistega celičnega lizata na 12 % SDS
poliakriamidni gel.
Figure 7. Presence of Bcl-2 (29 kDa) and Bax (23kDa) proteins. Representative Western blots showing the
time-dependent down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of Bax. HT-29 cells were treated with 100
μg/ml rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864 and the protein from the whole cell lysate was separated on a 12 %
SDS plyacryamide gel.
Celice tretirane z rec-TcdB3VPI, 8864 so vstopile v apoptozo, ki je sorazmerna z razmerjem
Bax/Bcl-2 (slika 7). Višje izraţanje proapoptotskega proteina Bax in posledično višje
razmerje Bax/Bcl-2 opazimo pri obeh rekombinantnih vezavnih proteinih. Ker smo
izbrali rakave celice HT-29, zaznamo prisotnost obeh proteinov tudi pri kontrolnih
celicah, a je razmerje med proteinoma Bax/Bcl-2 v korist antiapoptotskega proteina Bcl-2,
ki deluje tako, da omogoča celično preţivetje.
Cepitev PARP, ki v celici sodeluje pri obnovi molekule DNK, izkoriščamo pri eni od
metod sledenja apoptoze. S protitelesom, ki prepozna samo cepljeno obliko PARP smo
lahko sledili napredovanju apoptoze v celicah. Razviti prenos po Westernu je na sliki 8.
PARP-1 (poli(ADP)-riboza polimeraza), ki je jedrni substrat za kaspaze, je razcepljen in
označuje začetek apoptoze.
rec-TcdB8864
72 ur
rec- TcdB3VPI
72 ur
116 kDa
85 kDa
Slika 8. Slika filma po prenosu Western prikazuje cepitev PARP po tretiranju z rec-TcdB3VPI in rec-
TcdB8864 (100 μg/ml). Celice smo tretirali z rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 72 ur in ločili celoten celični
protein na 12 % SDS poliakrilamidni gel, prenesli na PVDF membrano in inkubirali s proti-PARP
protitelesom.
Figure 8. Representative Western blot showing the cleavage of PARP after treatment with rec-TcdB3VPI
and rec-TcdB8864 (100 μg/ml). Cells were treated with rec-TcdB3VPI and rec-TcdB8864 for 72 h and
total cellular protein was separated on a 12 % SDS polyacrylamide gel, transferred to a PVDF membrane,
and immunoblotted with anti-PARP antibody.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 54
Potrdili smo, da rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 sproţita apoptozo zaradi encimske
razgraditve PARP-1 preko aktivirane kaspaze-3.
4.2.5 Prisotnost vse-kaspaznega zaviralca Z-VAD-FMK (benzyloxycarbonyl-Val-
Ala-Asp-fluoromethylketone)
Z dosedaj opisanimi metodami smo ugotovili, da oba rekombinantna proteina sproţita
apoptozo, ki je od kaspaze odvisna (slika 6). Regulatorji apoptoze kontrolirajo aktivnost
kaspaz, ki so glavni izvršitelji apoptoze in preprečijo prehod celic v apoptozo. Vse-
kaspazni zaviralec apoptoze Z-VAD-FMK deluje kot učinkoviti ireverzibilni inhibitor
brez dodatnih citotoksičnih učinkov, zato smo ţeleli potrditi njegov zaviralni učinek pri
celicah tretiranih z rec-TcdB3.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
žive celice
zgodnje apoptotične celice
pozne apoptotične celice
nekrotične celice
kon
trola
+ z
VA
D
kon
trola
rec-
Tcd
B3
VP
I+z
Z-V
AD
rec-
Tcd
B3
VP
I
rec-
Tcd
B3
VP
I+z
Z-V
AD
rec-
Tcd
B3
886
4
razm
erje
med
cel
icam
i bre
z in
z Z
-VA
D-F
MK
(%
)
Slika 9. Deleţ ţivih, zgodnje in pozno apoptotočnih celic ter nekrotičnih celic po analizi s pretočnim
citometrom z metodo Aneksin-V/Propidijev jodid. Celice smo tretirali 72 ur z rec-TcdB3VPI in rec-
TcdB38864 (100 μg/ml) in hkrati z vse kaspaznim inhibitorjem Z-VAD-FMK (50 μM) tako tretirane celice z
rekombinantnim proteinom kot tudi netretirane celice (negativna kontrola).
Figure 9. Percentage of alive, early and late apoptotic as well as necrotic cells based on flow cytometric
analysis of Annexin-V-FITC versus PI signal. Cells were treated for 72 h with rec-TcdB3VPI and rec-
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 55
TcdB38864 (100 μg/ml) and at the same time control cells and with rec-TcdB3 incubated cells were trated
with pan- caspase inhibiotor Z-VAD-FMK (50 μM).
Spremljali smo deleţ ţivih celic, zgodnje in pozno apoptotičnih celic in nekrotičnih celic.
Pri z rec-TcdB3 tretiranih celicah, ki smo jim dodali vse-kaspazni zaviralec se je povečal
deleţ ţivih celic, in sicer iz 80,2 % na 86,8 % pri celicah tretiranih z rec-TcdB3VPI in iz
53,1 % na 70,6 % pri celicah tretiranih z rec-TcdB38864. Sorazmerno se je zniţal deleţ
zgodnje in pozno apoptotičnih celic ter nekrotičnih celic. S tem smo potrdili, da je celična
smrt, ki jo sproţita rekombinantna proteina od kaspaz odvisna.
4.2.6 Določanje membranskega mitohondrijskega potenciala (MMP) v prisotnosti
rec–TcdB3
Z izgubo fosfolipidne asimetrije z izpostavitvijo fosfatidilserina na eksoplazemski strani
celične membrane se spremenijo pogoji prenosa za prehod ionov skozi membrano. Vpliv
rec-TcdB3 na elektrokemijski gradient smo zato določili z merjenjem membranskega
mitohondrijskega potenciala s pretočnim citometrom (slika 10).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 56
kontrola rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864
AG
RE
GA
TI
MONOMER
AG
RE
GA
TI
AG
RE
GA
TI
MONOMER MONOMER
A
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
spre
mem
ba m
embr
ansk
ega
mito
hond
rijs
kega
pot
enci
ala
(%)
kontrola rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864
B
Slika 10. Vloga mitohondrijskega membranskega potenciala pri celicah tretiranih z rec-TcdB3VPI, 8864, ki
sproţita apoptozo. Prikaz diagramov (A) in histograma (B) MMP po barvanju z JC-1 (10 μg/ml) pri celicah
HT-29, tretiranih z rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 72 ur. Deleţ depolariziranih mitohondrijev
prikazujeta kvadrant B4 (A) in histogram (B).
Figure 10. Role of mitochondrial membrane potencial in rec-TcdB3VPI, 8864 induced apoptosis in living
cells. Biparametric and grafic analysis (A, B) of MMP after staining with JC-1(10 μg/ml) in HT-29 cells
treated with rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) for 72 h. The percentage of cells with depolarized mitochondria
in quadrant B4 (A) and in histogram (B) is reported.
V zgodnji fazi apoptoze se lahko spremeni tudi mitohondrijska membranska prepustnost
(mt). mt smo merili z zelo specifičnim in občutljivim fluorescenčnim barvilom JC-1
(5,5', 6,6'-tetrakloro-1,1,3,3'-tetraetilbenzimidazolilkarocijanin iodid). JC-1 se kopiči v
mitohondrijih zdravih celic v obliki skupkov (diagram A, kvadrant B2). Ob začetku
apoptoze se mitohondrijski potencial spremeni, JC-1 se ne more več kopičiti v
mitohondrijih in ostane v citoplazmi v obliki monomera (slika 10; diagram A, kvadrant
B4). Pri netretiranih celicah (kontrola) se tvorijo številni JC-1 skupki (visok mt),
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 57
medtem ko se pri celicah, tretiranih z rec-TcdBVPI, 8864 v mitohondrijih tvori manj JC-1
skupkov (nizek mt) in posledično več monomerov.
4.2.7 Ocena znotrajcelične oksidacije s testom MTT v prisotnosti rec-TcdB3
Biokemični procesi, v katerih nastajajo nevarne ROS so v celicah običajni. ROS
odstranjujejo ali sodelujejo pri odstranjevanju primarni antioksidativni obrambni sistemi,
sekundarni pa vključujejo sisteme za popravljanje ali odstranjevanje poškodovanih
molekul. Sekundarni antioksidativni sistemi prevzamejo vlogo, ko primarni niso več
dovolj učinkoviti. Pomembnejša komponenta sekundarne obrambe je glutation, ki
reducira disulfidne mostičke v beljakovinah.
Celice HT-29 smo inkubirali z NAC in GST, da bi potrdili tvorbo reaktivnih kisikovih
spojin (ROS), ki bi lahko sproţile celično smrt v obliki apoptoze (slika 11).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140% ***
kont
rola
rec-
Tcd
B3 V
PI
rec-
Tcd
B3 88
64
NA
C i
nre
c-T
cdB
3 8864
NA
C i
nre
c-T
cdB
3 VP
I
GS
T i
nre
c-T
cdB
3 VP
I
GS
T i
nre
c-T
cdB
3 8864
Glu
tath
ione
S-t
rans
fera
se
(GS
T)
N-a
cety
l-L
-cys
tein
e (N
AC
)
viab
ilno
st c
elic
(%
)
Slika 11. Učinek rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 v prisotnosti NAC (N-acetyl-L-cysteine) in GST
(glutathione S-transferase) na celično viabilnost. Celice HT-29 smo tretirali z rec-TcdB3VPI in rec-
TcdB38864 (100 μg/ml), z NAC (5 mM) in GST (200 μM) ločeno in skupaj. Odstotek viabilnih celic smo
ugotavljali po 72 urah s testom MTT. V histogramih je prikazana standardna napaka treh neodvisnih
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 58
eksperimentov. P vrednost nam pove, ali je razlika statistično značilna ali ne (*p<0.05, p**<0.01,
***p<0.001). * označuje statistično pomembno odstopanje od kontrole.
Figure 11.. Effect of rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 in the presence of NAC (N-acetyl-L-cysteine) and GST
(glutathione S-transferase) on cell viability. HT-29 cells were treated with rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864
(100 μg/ml), with NAC (5 mM) and GST (200 μM) separated or together. The percentage of viable cells
was determined after 72 hours exposure by MTT assay. Data are expressed as mean SEM of at least
three independent experiments. A P value of <0.05 was considered statistically significant (*p<0.05,
p**<0.01, ***p<0.001). An asterisk indicates a statistically significant difference from the control.
Deleţ viabilnih celic, ki so bile tretirane hkrati z rec-TcdB3VPI, 8864 in NAC oziroma z rec-
TcdB3VPI, 8864 in GST nam pove, da so celice še sposobne ohranjanja celične homeostaze.
4.2.8 Ocena znotrajcelične oksidacije s pretočno citometrijo v prisotnosti rec-
TcdB3
Celice HT-29 tretirane z rec-TcdB3 smo inkubirali z NAC, da bi potrdili tvorbo
reaktivnih kisikovih spojin (ROS) tudi s pretočnim citometrom. Za detekcijo
superoksidnega aniona (O2-) in hidroperoksidnega radikala (HO2
-) smo uporabili dve
fluorescentni barvili, hidroetidin (HE) in 2'-7'-diklodihidrofluorescein (H2-DCFDA)
(slika 12).
kontrola N-acetyl-L-cysteine (NAC)
+ rec-TcdBVPI
rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864N-acetyl-L-cysteine (NAC)
+ rec-TcdB8864
Annexin V Annexin V Annexin V Annexin V Annexin V
PI
72 ur
Slika 12. Rezultati analize pretočne citometrije celic HT-29 v prisotnosti rec-TcdB3VPI, rec-TcdB38864 ali z
NAC (N-acetyl-L-cysteine) z metodo AV/PI.
Celice HT-29 smo tretirali z rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) in z NAC (5 mM) ločeno in skupaj.
Deleţ ţivih, zgodnje in pozno apoptotičnih celic ter nekrotičnih celic smo ugotavljali po 72 urah s
pretočnim citometrom. V diagramu so v levem spodnjem kvadrantu (E3) ţive celice (AV-PI
-), v desnem
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 59
spodnjem kvadrantu (E4) so zgodnje apoptotične celice (AV
+PI
-), v levem zgornjem kvadrantu (E1) so
nekrotične celice (AV-PI
+) in v desnem zgornjem kvadrantu (E2) so pozno apoptotične celice (AV
+PI
+).
Figure 12. Representative flow cytometry biparametric AV/PI analysis of HT29 cells in the presence with
rec-TcdB3VPI, rec-TcdB38864 or with NAC (N-acetyl-L-cysteine).
Cells were treated with rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864 (100 μg/ml) and with NAC (5 mM) separated or all
together. Percentage of alive, early and late apoptotic cells as well as necrotic cells were analysed after 72 h
by flow cytometry. Bottom left quadrant (E3) represents live cells (AV-PI
-), bottom right quadrant (E4)
represents early apoptotic cells (AV+PI
-), top left quadrant (E1) represents necrotic cells (AV
-PI
+) and top
right quadrant (E2) represents late apoptotic cells (AV+PI
+).
Deleţ ţivih celic, nekrotičnih, zgodnje in pozno apoptotičnih celic, ki so bile tretirane
hkrati z rec-TcdB3VPI, 8864 in NAC se ujema z deleţem celic, ki so bile tretirane samo z
rec-TcdB3VPI, 8864. Tudi z drugo metodo smo potrdili, da so celice še sposobne ohranjanja
celične homeostaze in da je tvorba ROS zelo majhna.
4.2.9 Ocena znotrajcelične oksidacije s konfokalno mikroskopijo v prisotnosti
TcdB in rec-TcdB3
ROS se nenehno proizvajajo v celici kot posledica aerobne presnove. Natančno merjenje
ROS je bistvenega pomena za oceno redoks stanja celice. Zato smo preverili razmerje
med oksidativnim stresom in smrtjo celice, ki jih tretiramo z rec-TcdB3 še z
diferencialnim barvanjem z uporabo barvila dihidrorodamin 123 (DHR 123) (slika 13).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 60
KONTROLA
rec-TcdB3VPI
/ 48 ur rec-TcdB3VPI
/ 72 ur rec-TcdB38864
/ 48 ur rec-TcdB38864
/ 72 ur
TcdBVPI
/ 12 ur TcdBVPI
/ 24 ur TcdBVPI
/ 48 ur
TcdB8864
/ 12 ur TcdB8864
/ 24 ur TcdB8864
/ 48 ur
Slika 13. Tvorba znotrajceličnih ROS pri celicah HT-29 po izpostavitvi s TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) za 12, 24
in 48 ur ter z rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) za 48 in 72 ur. Dihidrorodamin 123 (DHR 123, 10 mM) je
oksidiral v svetlo fluorescenten rodamin 123 (Rho 123) z nastankom znotrajceličnih reaktivnih kisikovih
spojin.
Figure 13. Formation of intracellular ROS after stimulation of HT-29 cells with TcdBVPI, 8864 for 12, 24 and
48 h as well as with rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) for 48 and 72 h. Oxidation of dihidrorhodamine 123
(DHR 123, 10 mM) to the fluorescent compound rhodamine 123 (Rho 123) was used to detect the
production of oxygen metabolites.
Nefluorescenten DHR 123 postane svetlo fluorescenten po oksidaciji v Rho 123 pri
celicah, ki smo jih tretirali tako s TcdBVPI, 8864 kot tudi z rec-TcdB3VPI, 8864. Fluorescenca
barvila se povečuje sorazmerno z nastankom znotrajceličnih oksidacijskih spojin. Na
osnovi fluorescence barvila, ki narašča vzporedno s časom inkubacije vidimo, da TcdB
vpliva na tvorbo znotrajceličnih radikalov. Tudi z rec-TcdB3 tretirane celice v primerjavi
z netretiranimi celicami fluorescirajo, a fluorescenca barvila se s časom inkubacije ne
povečuje, ostane enaka.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 61
Na osnovi rezulatov konfokalne mikroskopije ne moremo izključiti moţnosti, da rec-
TcdB3 tvori proste radikale, prav tako ne moremo potrditi, da je celična smrt povezana s
tvorbo prostih radikalov.
4.3 UČINEK TOKSINA B (TcdB) NA AVTOFAGIJO
Stopnjo avtofagije smo spremljali s tremi neodvisnimi testi in primerjali rezultate.
Uvodni poskus je temeljil na diferencialnem barvanju morfoloških sprememb celic po
tretiranju s TcdB in z rec-TcdB3. Celice, ki smo jih inkubirali z rec-TcdB3 so bile enake
kontrolnim celicam, zato smo v poskus avtofagije vključili samo TcdB (slika 14).
4.3.1 Diferencialno barvanje morfoloških sprememb celic z akridin oranţnim (AO)
KONTROLA rec-TcdB3VPI
/ 48 in 72 ur rec-TcdB38864
/ 48 in 72 ur
TcdBVPI
/ 12 ur TcdBVPI
/ 24 ur TcdBVPI
/ 48 ur
TcdB8864
/ 12 ur TcdB8864
/ 24 ur TcdB8864
/ 48 ur
Slika 14. Celice obarvane z akridin oranţnim smo opazovali s konfokalnim mikroskopom. Akridin oranţno
prosto prehaja skozi celično membrano in se kopiči v kislih strukturah (fluorescentno svetlo rdeče). Na sliki
vidimo kisle vezikularne organele v citoplazmi celic, ki smo jih tretirali s TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) 24 in 48
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 62
ur. Kontrolne celice in celice, ki smo jih tretirali z rec-TcdB3VPI, 8864 48 in 72 ur (100 μg/ml) nimajo kislih
vezikularnih organelov in ostanejo neobarvane.
Figure 14. Cell staining with acridine orange were obtained with confocal microscopy Acridin orange
moves freely to cross membrane and acumulates in acidic compartments where it seen as fluorescence
bright red. As shown in picture staining with acridin orange showed accumulation of acidic vesicular
organelles in the cytoplasm of cells exposed to TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) for 24 and 48 h. Uncoloured control
cells and cells exposed to rec-TcdB3VPI, 8864 for 48 and 72 h (100 μg/ml) exhibited no acidic vesicular
organelles .
Celice, ki smo jih inkubirali s TcdB vsebujejo kisle vezikularne organele, ki so značilne
za avtofagijo.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 63
4.3.2 Dokazovanje kislih vezikularnih organelov z uporabo pretočne citometrije
kontrola TcdBVPI , 24 ur TcdBVPI , 48 urTcdB8864 , 24 ur TcdB8864 , 48 ur
B
A
C
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
ko
ntr
ola
Tcd
BV
PI
24
ur
Tcd
BV
PI
48
ur
Tcd
B8
864
24
ur
TcdB
886
4
48
ur
akri
din
ora
nžno
po
ziti
vne
celi
ce (
%)
D
Slika 15. Prikaz diagramov in histogramov netretiranih celic in celic tretiranih s TcdBVPI in TcdB8864 (50
ng/ml) 24 in 48 ur po barvanju z barvilom akridin oranţnim.
Figure 15. Biparametric and grafic analysis of untreated cells and cells exposed to TcdBVPI and TcdB8864
for 24 and 48 h (50 ng/ml) after staining with acridin orange.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 64
Na diagramu (slika 15) smo ustvarili regijo in izbrali celice za analizo (A). Z uporabo
izbrane regije smo odstranili celični debris. V histogramih B, C in D (slika 15) smo
prikazali število vezikularnih organel v celicah.
Na osnovi rezultatov sklepamo, da imajo celice, ki jih tretiramo s TcdB, veliko
vezikularnih vakuol. Oblikovanje le-teh se ujema s slikami konfokalne mikroskopije
(slika 14). Število vakuol se zelo poveča po 48 urah inkubacije tako pri celicah, ki jih
inkubiramo s TcdBVPI (56,2 %) kot s TcdB8864 (37,4 %).
4.3.3 Sinteza proteinov LC3 in katepsina B
LC3 (ang. microtubule-associated protein 1 light chain 3) je protein membrane
avtofagosoma. Tvori dve obliki, to sta LC3-I (citosolna oblika) in LC3-II (membranska
oblika). Razmerje LC3-II/LC3-I je povezano s številom nastalih avtofagosomov.
TcdBVPI TcdB 886
12 ur 12 ur24 ur 24 ur48 ur 48 ur
LC3-I
LC3-II
18kDa
12kDa
kontrola
Slika 16. TcdBVPI in TcdB8864 sproţita izraţanje proteina LC3. Slika filma po prenosu Western prikazuje
naraščanje signala LC3-II pri različnih časih. Celice HT-29 smo tretirali s 50 ng/ml TcdBVPI in TcdB8864 in
ločili protein iz čistega celičnega lizata na 12 % SDS poliakrilamidni gel.
Figure 16. TcdBVPI and TcdB8864 induce expression of LC3. Representative Western blots showing the
time-dependent up-regulation of LC3-II. HT-29 cells were treated with 50 ng/ml TcdBVPI and TcdB8864 and
the protein from the whole cell lysate was separated on a 12 % SDS plyacrylamide gel.
Razlike v razmerje LC3-II/LC3-I opazimo pri celicah tretiranih s TcdBVPI, 8864. Pri
poskusih uporabljamo HT-29 celično linijo, ki so po izvoru rakave celice. Zaradi tega
smo prav tako pri kontrolnih netretiranih celicah zaznali obe obliki proteina LC3. V
primerjavi s tretiranimi celicami, pa je signal obeh oblik proteina LC3 enako močan
(slika 16).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 65
kont
rola
TcdB
VPI
TcdB
886
TcdB
VPI
TcdB
VPI
TcdB
886
TcdB
886
12 ur 48 ur24 ur
Slika 17. TcdBVPI in TcdB8864 sproţita izraţanje proteina katepsina B (39 kDa). Slika filma po prenosu
Western prikazuje izraţen protein katepsin B pri različnih časih. Celice HT-29 smo tretirali s 50 ng/ml
TcdBVPI in TcdB8864 in ločili protein iz čistega celičnega lizata na 12 % SDS poliakrilamidni gel.
Figure 17. TcdBVPI and TcdB8864 induce expression of cathepsin B (39 kDa). Representative Western blots
showing the time-dependent expression of protein cathepsin B. HT-29 cells were treated with 50 ng/ml
TcdBVPI and TcdB8864 and the protein from the whole cell lysate was separated on a 12 % SDS
plyacrylamide gel.
Katepsin B je prisoten pri netretiranih kot tretiranih celicah s toksinom (slika 17). Razliko
v jakosti signala smo opazili pri celicah, ki so bile tretirane s TcdBVPI, 8864 po 48 urah.
4.3.4 Izraţanje genov vpletenih v proces avtofagije
Z metodo obratnega prepisa ter veriţne reakcije s polimerazo smo preiskovali izraţanje
genov lc3, becn1 in hgadph pri celicah v osnovnem celičnem mediju ali v prisotnosti
TcdBVPI, 8864 za 6, 12, 24 in 36 ur. Kot kazalca avtofagije smo uporabili stopnjo izraţanja
genov lc3 in becn1. Dodali smo hišni gen hgadph, katerega izraţanje je, glede na
literaturo, stabilno ne glede na okoljske pogoje. Rezultate smo ovrednotili in jih
predstavili na grafu (sliki 18 in 19).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 66
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10lc
3/ hgadph
ko
ntr
ola
, 6
ur
ko
ntr
ola
, 1
2 u
r
ko
ntr
ola
, 2
4 u
r
ko
ntr
ola
, 3
6 u
r
TcdB
VP
I, 12
ur
Tcd
BV
PI, 6
ur
TcdB
VP
I, 24
ur
Tcd
BV
PI, 3
6 u
r
Tcd
B8
864
, 6
ur
TcdB
886
4, 1
2 u
r
TcdB
886
4, 2
4 u
r
Tcd
B88
64
, 3
6 u
r
A
Slika 18 Stopnja izraţanja gena lc3 pri različnih časih inkubacije. Izraţanje gena smo določili z RT-PCR.
Pokazane so povprečne vrednosti razmerja lc3/hgadph. Uporabili smo podatke dveh neodvisnih poskusov v
dveh vzporednih ponovitvah.
Figure 18. Level of time-dependent expression from gene lc3. RT-PCR was used for gene expression.
Average lc3/hgadph ratio values are shown. Data from two independent experiments in parallel repetitions
are used.
Na sliki 18 so prikazane numerične vrednosti pomnoţenih genov lc3 in hgadph.
Statistično pomembne razlike v izraţanju izbranega gena pri različnih časih izpostavitve
celic TcdB ni. V primeru gena lc3 je bila stopnja izraţanja najvišja pri 36 urah pri celicah
tretiranih z obema toksinoma in pri 12 urah samo pri s TcdB8864 tretiranimi celicami. Pri
ostalih časih je bila stopnja izraţanja gena lc3 dokaj izenačena, celo niţja pri 24 urah s
TcdB8864 tretiranimi celicami kot pri kontroli.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 67
bec
n1
/ hg
adp
h
kont
rola
, 6 u
r
kont
rola
, 12
ur
kont
rola
, 24
ur
Tcd
BV
PI, 6
ur
kont
rola
, 36
ur
Tcd
BV
PI, 1
2 u
r
Tcd
BV
PI, 2
4 u
r
Tcd
BV
PI, 3
6 u
r
Tcd
B8
864
, 6 u
r
Tcd
B88
64
, 12
ur
Tcd
B88
64
, 24
ur
Tcd
B88
64
, 36
ur
B
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Slika 19. Stopnja izraţanja gena becn1 pri različnih časih inkubacije. Izraţanje gena smo določili s RT-
PCR. Pokazane so povprečne vrednosti razmerja becn1/hgadph. Uporabili smo podatke dveh neodvisnih
poskusov v dveh vzporednih ponovitvah.
Figure 19. Level of time-dependent expression from gene becn1. RT-PCR was used for gene expression.
Average becn1/hgadph ratio values are shown. Data from two independent experiments in parallel
repetitions are used.
Na sliki 19 so prikazane numerične vrednosti pomnoţenih genom becn1 in hgadph.
Statistično pomembne razlike v izraţanju izbranega gena pri različnih časih izpostavitve
celic TcdB tudi ni. V primeru gena becn1 je bila stopnja izraţanja najvišja pri 12 urah pri
celicah tretiranih s TcdBVPI in pri 6 urah pri celicah tretiranih TcdB8864. Pri 12 in 24 urah
s TcdBVPI, 8864 tretiranimi celicami je bila niţja stopnja izraţanja v primerjavi s kontrolo.
Pri 36 urah je bila stopnja izraţanja gena becn1 pri celicah tretiranih s TcdB izenačena z
netretiranimi celicami.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 68
V našem eksperimentu smo celotno izolacijo ter obdelavo RNA izvajali istočasno in
enako za netretirane kot tretirane celice.
4.3.5 Inhibicija avtofagije s testom MTT
Če smo ţeleli ugotoviti odnos med TcdBVPI ali TcdB8864 in avtofagijo, smo morali
uporabiti zaviralce avtofagije, kot so vortmanin, 3-metiladenin in bafilomicin A1.
Zaviralci avtofagije so pokazatelji neposrednega odnosa med zaviranjem nastanka
avtofagnih vakuol in zmanjšano oziroma povečano sposobnostjo preţivetja celic.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
kon
trol
a
vort
man
in, 48
ur
3-m
etil
aden
in, 48 u
r
bafi
lom
icin
A1, 48
ur
votm
anin
, T
cdB
VP
I, 4
8 u
r
3-m
etil
aden
in, T
cdB
VP
I, 48 u
r
bafi
lom
icin
A1, T
cdB
VP
I, 48 u
r
vort
man
in, T
cdB
8864
, 48 u
r
3-m
etil
aden
in, T
cdB
8864
, 48 u
r
bafi
lom
icin
A1, T
cdB
8864
, 48 u
r
Tcd
BV
PI,
48 u
r
Tcd
B8
864,
48 u
r
viab
iln
ost
celi
c (%
)
Slika 20. Učinki TcdB in zaviralcev avtofagije na celično viabilnost. Celice HT-29 smo tretirali s 50 ng/ml
TcdBVPI ali TcdB8864 in z vortmaninom (20 μM), 3-metiladeninom (1 mM) ali bafilomicinom A1 (200 nM)
posebej in skupaj. Odstotek viabilnih celic smo ugotavljali po 48 urah s testom MTT. V histogramih je
prikazana standardna napaka treh neodvisnih eksperimentov. Sposobnost celičnega preţivetja netretiranih
celic smo ocenili kot 100 %.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 69
Figure 20. Effect of TcdB and autophagy inhibitors on cell viability. HT-29 cells were treated with 50
ng/ml TcdBVPI or TcdB8864 and with worthmannin (20 μM), 3-methyladenine (1 mM) and baphylomycin
A1 (200 nM). The percentage of viable cells was determined after 48 hours exposure by MTT assay. Data
are expressed as mean ± SEM of at least three independent experiments. The viability of the untreated cells
was regarded as 100 %.
Avtofagija ni glavni del procesa inducirane citotoksičnosti in z zaviralci avtofagije
TcdBVPI, 8864 ne sproţita apoptoze (slika 20). Celice smo inkubirali 48 ur, saj smo v tem
času s pretočnim citometrom zaznali največ vakuol (slika 14).
Z uporabo siRNA smo utišali gen becn1 in njegovo izraţanje preverili z RT-PCR. Deleţ
viabilnih celic pa ocenili s testom MTT. Tako smo preverili vlogo beklina1 v celicah HT-
29 v prisotnosti TcdBVPI, 8864 in dobili dodaten vpogled v odnos med avtofagijo in
apoptozo.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 70
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
via
bil
no
st c
elic
(%
)
ko
ntr
ola
TcdB
VP
I, 2
4 u
r
siR
NA
, 2
4 u
r
siR
NA
, 4
8 u
r
TcdB
VP
I, 4
8 u
r
Tcd
B8
864
, 2
4 u
r
Tcd
B8
864
, 4
8 u
r
siR
NA
in T
cdB
VP
I, 2
4 u
r
siR
NA
in T
cdB
VP
I, 4
8 u
r
siR
NA
in
Tcd
B8
864
, 2
4 u
r
siR
NA
in T
cdB
8864
, 4
8 u
r
*** ** ** ***
Slika 21. Učinki TcdB in siRNA na celično viabilnost. S transfekcijo celic HT-29 smo prenesli siRNA (100
nM) za utišanje gena becn1. Celice smo tretirali s 50 ng/ml TcdBVPI ali TcdB8864 po 48 urah za 24 in 48 ur.
Deleţ viabilnih celic smo preverili s testom MTT. V histogramih je prikazana standardna napaka treh
neodvisnih eksperimentov. P vrednost nam pove, ali je razlika statistično značilna ali ne (*p<0.05,
p**<0.01, ***p<0.001). * označuje statistično pomembno odstopanje od kontrole. Sposobnost celičnega
preţivetja netretiranih celic smo ocenili kot 100 %.
Figure 21. Effect of TcdB and siRNA on cell viability. HT-29 cells was transfected for delivery of siRNA
to knockdown gene becn1. After 48 h cells were treated with 50 ng/ml of TcdBVPI or TcdB8864 for 24 and
48 h. The percentage of viable cells was determined by MTT assay. Data are expressed as mean ± SEM of
at least three independent experiments. A P value of <0.05 was considered statistically significant (*p<0.05,
p**<0.01, ***p<0.001). An asterisk indicates a statistically significant difference from the control. The
viability of the untreated cells was regarded as 100 %.
Citotoksični učinek se ne razlikuje med celicami, ki smo jih tretirali samo s holotoksinom
in celicami, ki smo jih tretirali s holotoksinom po transfekciji (slika 21).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 71
4.4 UČINEK TcdB IN rec-TcdB3 NA CITOSKELET
Interakcije med molekulami aktina so v celici zelo dinamične. Porušenje aktinskega
citoskeleta povzroči lahko depolarizacijo mitohondrijske membrane, povečano tvorbo
ROS, aktivacijo kaspaz in celično smrt.
4.4.1 Reorganizacija aktina
Razporeditev fluorescenčno označenih aktinskih filamentov pri celicah tretiranih s
TcdBVPI in rec-TcdB3VPI, 8864 smo preverili s konfokalno mikroskopijo (slika 22).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 72
KO
NT
RO
LA
Tcd
BV
PI
rec-
Tcd
B3 V
PI
rec-
Tcd
B3 88
64
APIKALNO BAZALNO
Slika 22. TcdB in rec-TcdB3 povzročita reorganizacijo aktinskih niti. Organizacija F-aktina pri kontrolnih
celicah in celicah, ki smo jih izpostavili TcdBVPI (50 ng/ml) in rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml).
Slike konfokalne mikroskopije kaţejo pravilno razporeditev F-aktina pri kontrolnih celicah na apikalni in
bazalni strani. Inkubacija s TcdBVPI (24 ur) povzroči uničenje in razkroj F-aktina tako na apikalni kot na
bazalni strani celic HT-29. Podobne učinke vidimo pri celicah, ki smo jih inkubirali z rec-TcdB3VPI in rec-
TcdB38864 (72 ur).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 73
Figure 22. TcdB and rec-TcdB3 induced reorganization of actin filaments. F-actin distribution in control
cells or after TcdBVPI (50 ng/ml) and rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864 (100 μg/ml) exposure. Confocal
microscopic analysis reveals normal F-actin distribution in control epithelial monolayers at apical and basal
site. Incubation with TcdBVPI (24 h) induced disruption and disorganzation of F-actin in both the apical and
basal poles of HT-29 cells. Similar effects were observed following exposure to rec-TcdB3VPI and rec-
TcdB38864 exposure (72 h).
TcdB in obe rekombinantni domeni povzročita reorganizacijo aktinskih filamentov pri
celični liniji HT-29.
4.4.2 Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na protein tesnih stikov ZO-1
Rekombinantni vezavni domeni vplivata na razporeditev in strukturo proteina ZO-1. V
neobdelanih celicah je flourescenčni signal omejen na periferno območje citoplazme. V
primerjavi s kontrolnimi celicami je signal izrazitejši in večina signala je razpršena po
citoplazmi ali na večje skupke v citoplazmi (slika 23). Opazna je sprememba v velikosti
in obliki celice, ki bi lahko bila pogojena tudi z reorganizacijo aktinskih nitk.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 74
KONTROLA TcdBVPI
rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864
Slika 23. Vpliv TcdB in rec- TcdB3 na organizacijo ZO-1. Monosloj celic T84 smo inkubirali s TcdBVPI
(50 ng/ml) 24 ur in z rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 72 ur. TcdBVPI in rec-TcdB3VPI, 8864
vplivata na premestitev ZO-1.
Figure 23. Distribution of ZO-1 is influenced by TcdB in rec- TcdB3. T84 monolayers were incubated with
50 ng/ml TcdBVPI for 24 h or 100 μg/ml rec-TcdBVPI and rec-TcdB8864 for 72 h. TcdB and rec-TcdB3VPI, 8864
toxins exposure induced the displacement of ZO-1.
4.4.3 Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na transepitelno električno upornost (TEER) celic
T84
Z merjenjem TEER smo preverili, ali celice tretirane s TcdB in rec-TcdB3 poškodujejo
epitelij (slika 24).
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 75
0 0 ur 1 ura 2 uri 3 ure 4 ure 7 ur 24 ur
TE
ER
(%)
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
TcdBVPI
TcdB8864
A
0 0 ur 12 ur 24 ur 36 ur 48 ur 72 ur
TE
ER
(%)
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
rec-TcdB3VPI
rec-TcdB38864
B
Slika 24. Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na TEER. Celice smo izpostavili TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) (A) in rec-
TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) (B). Kontrolne celice niso bile izpostavljene toksinom. TEER smo merili 1, 2, 3,
4, 7, 12, 24, 36, 48, 72 ur po končani inkubaciji celic T84 s TcdBVPI, 8864 in rec-TcdB3VPI, 8864. Meritev smo
ocenili kot 100 % TEER kontrolnih celic ob vsakem času inkubacije.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 76
Figure 24. Influence of TcdB in rec-TcdB3 on TEER. T84 were exposed to TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) (A) and
rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) (B). TEER was measured after a recovery time of 1, 2, 3, 4, 7, 12, 24, 36, 48,
72 h. The electrical resistance measurement indicate the level of tight junction integrity and is expressed as
a percentage of the resistance measurement in the untreated monolayer at a given time point.
Tako TcdBVPI, 8864 kot rec-TcdB3VPI, 8864 zniţata TEER.
4.5 VPLIV TcdB IN rec-TcdB3 NA IZRAŢANJE IL-8 V CELICAH HT-29
Zanimalo nas je, če TcdBVPI, 8864 in rec-TcdB3VPI, 8864 spodbudijo sintezo IL-8. Uporabili
smo dva različna inkubacijska intervala, 24 in 72 ur, pri netretiranih celicah in celicah, ki
smo jih tretirali s TcdB in rec-TcdB3. Koncentracije IL-8 (ng/ml) so prikazane na sliki 25.
kon
trol
a
Tcd
BV
PI
Tcd
B88
64
Tcd
BV
PI
Tcd
B88
64
IL-8
(n
g/m
l)
0
2
4
6
8
10
12
rec-
Tcd
B3 V
PI
kon
trol
a
rec-
Tcd
B3 V
PI
rec-
Tcd
B3 8
864
** *
*** *
24 ur 72 urre
c-T
cdB
388
64
Slika 25. TcdB in rekombinantna vezavna domena TcdB bakterije C. difficile sproţita izločanje IL-8.
Konfluentni monosloj celic HT-29 smo inkubirali s TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) ter z rec-TcdB3VPI in
rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 24 in 72 ur. V histogramih je prikazana standardna napaka dveh neodvisnih
eksperimentov s trikratno ponovitvijo. P vrednost nam pove, ali je razlika statistično značilna ali ne
(*p<0.05, p**<0.01, ***p<0.001). * označuje statistično pomembno odstopanje od kontrole.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 77
Figure 25. TcdB and recombinant binding domain from C. difficile induce IL-8 release. HT-29 confluent
monolayers were incubated with TcdBVPI and TcdB8864 (50 ng/ml) or with rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864
(100 μg/ml) for 24 hours and 72 hours. Results are presented as mean ± SEM of two separate experiments
with triplicate determinations. A P value of < 0.05 was considered statistically significant (*p<0.05,
**p<0.01, ***p<0.001).
Koncentracije IL-8 so bile minimalne, ko celice niso bile izpostavljene TcdB ali rec-
TcdB3. Epitelne celice HT-29 so se najbolj odzvale ob prisotnosti rekombinantnega
proteina, ker sintetizirajo več IL-8 kot ob prisotnosti TcdB, ki pa je v obratnem
sorazmerju s citotoksičnim učinkom. Koncentracija IL-8 je bila povečana ob prisotnosti
TcdB, vendar nismo zaznali splošnega trenda povečanja količine IL-8. Če primerjamo
količino IL-8 v celicah HT-29, ki so bile izpostavljene TcdB ali rec-TcdB3 72 ur in
količino IL-8 v celicah, ki so bile izpostavljene samo celičnemu mediju, ugotovimo, da so
razlike v koncentraciji IL-8 statistično značilne (p<0.05) (slika 25).
Inkubacija celic TcdB oziroma rec-TcdB3 vpliva na povečanje sinteze IL-8.
4.6 HEMOLITIČNA AKTIVNOST BAKTERIJE C. difficile
4.6.1 Hemoliza β in sevi bakterije C. difficile
Pri izbranih sevih (podpoglavje 3.24) smo opazovali hemolizo na diferencialnih agarjih,
ki se med seboj razlikujejo po sestavi (tabela 6). Sevi delajo ozek pas hemolize na trdnem
gojišču Schaedler (slika 26). Poraslim kolonijam bakterijskega seva smo izmerili cono
hemolize in za nadaljnje testiranje uporabili tiste s premerom hemolize 2 mm. S
toksinotipizacijo smo potrdili izbrani sev bakterije C. difficile in pripravili supernatant
kulture.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 78
Preglednica 6. Rezultati zaznavanja hemolize sevov bakterije C. difficile na gojiščih, ki se med seboj
razlikujejo po sestavi in občutljivosti za hemolizo.
Table 6. Results from hemolytic perception by strains from bacteria C. difficile, growing on media with
different structure and sensitivity for hemolysis.
gojišče KA COH KA za ET Schaedler
izbrani sevi bakterije
C. difficile
AT 11 - - - ++
AT 25 - - - +
AT 30 - - - +
C23 - - - +
ZZV07-584 - - - +
ZZV07-585 - - - +
- (brez cone hemolize), + (cona hemolize, 2r = 0,8 do 1 mm), ++ (močna cona hemolize, 2r = 2 mm)
- (no hemolysis), + (hemolysis), ++ (strong hemolysis)
Slika 26. Netoksinogeni sev bakterije C. difficile C23 (levo) in toksigeni sev AT11 (desno) tvorita na
agarju po Schaedlerju pas hemolize (2r=2mm). Čisti kulturi smo inkubirali 3 dni pri anaerobnih pogojih in
37°C.
Figure 26. Nontoxinogenic C. difficile strain C23 (left) and toxigenic strain AT11 (right) with hemolysis
zone on Schaedler agar (2r=2mm). Pure cultures were incubated for 3 days anaerobically at 37°C.
4.6.2 Hemolitična aktivnost supernatanta kulture
Test vpliva temperature, eritrocitov in dodatkov (holesterol, proteinaza K, cistein) na
hemolitičnost je prikazan v preglednici 7. Z uvodnimi optimizacijskimi poskusi smo
pridobili osnovne informacije o medsebojni odvisnosti zgoraj naštetih dejavnikov za
nadalnji postopek testiranja hemolize.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 79
Preglednica 7. Različni pogoji za hemolitično aktivnost supernatanta kulture.
Table 7. Different conditions of supernatant hemolytic activity.
supernatant kulture in
POGOJI OPTIMIZACIJE A B C D E F G H I J
holesterol (1 mg/ml v EtOH, Sigma) - - - - - - - - + +
proteinaza K (0,01 mg/ml, Sigma) + - - - + - - + + -
cistein (5 mM, pH=7,6, Sigma) + + + + - - - - + +
inkubacija pri T=22°C, 30 min + - + + + + + + + +
inaktivacija pri T=95°C, 2uri + - - + - - + + + -
eritrociti + + + + + + + + + +
inkubacija pri T=37°C, 1 ura + + + + + + + + + +
centrifugiranje (5 min, 4000 obr/min) + + + + + + + + + +
hemolitičnost DA DA DA DA NE NE NE NE DA DA
Na izbranem grafu (slika 27) smo pokazali vpliv cisteina in temperature na hemolitičnost
pod pogoji, ki so najboljše vplivali na rezultate izmerjene hemolitične aktivnosti pri
testiranih supernatantih kulture.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 80
200 obr/min, 3 min200 obr/min, 3 min200 obr/min, 3 min200 obr/min, 3 mincentrifugiranje
1 ura / 37° C1 ura / 37° C1 ura / 37° C1 ura / 37° Cinkubacija
125μl 2 % suspenzije
ovčjih eritrocitov
125μl 2 % suspenzije
ovčjih eritrocitov
125μl 2 % suspenzije
ovčjih eritrocitov
125μl 2 % suspenzije
ovčjih eritrocitov
eritrociti
2 uri / 95° C2 uri / 95° C--inkubacija
125μl-125μl-cistein
125μl125μl125μl125μlsupernatant
DCBA
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6A
450
AT11 AT25 AT30 C23 ZZV07-584 ZZV07-585 - kontrola + kontrola
A
B
C
D
Slika 27. Izbrani pogoji, s katerimi smo ugotavljali hemolitično aktivnost supernatantov izbranih sevov
bakterije C. difficile. Primerjalne vrednosti testiranih sevov, z uporabljenim pufrom 5 mM TRIS-om, 5 mM
cisteinom in 0,85 % NaCl-om (pH = 7,6) in 2 % suspenzijo eritrocitov, pod pogoji A, B, C, D z negativno
in s pozitivno kontrolo po izmerjeni A450.
Figure 27. Hemolytic activity of supernatans from choosen strains of C. difficile under different conditions.
Under conditions A, B, C, D values of tested strains, in 5 mM TRIS, 5 mM cystein and 0,85 % NaCl buffer
(pH = 7.6) and 2 % erythrocite suspension, were compaired with negative and positive control after A450.
Iz pozitivnih rezultatov z dodanim cisteinom lahko sklepamo na pomen cisteina pri
hemolitični aktivnosti.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 81
4.7 ŢIVALSKI MODEL NEVRETENČAR C. elegans
Pri C. elegans smo po inkubaciji s sporami baketrije C. difficile ali po inkubaciji s
supernatantom kulture opazovali spremembo gibanja, odziv ob dotiku in morfološke
spremembe črevesja pod svetlobnim mikroskopom.
4.7.1 Učinki TcdB in supernatantov sevov C. difficile na C. elegans
Gibanje in obnašanje C. elegans , ki smo jih izpostavili holotoksinu B in supernatantom
toksigenih sevov 630, VPI in R12078 je bilo nespremenjeno in enako kot pri nematodih,
ki smo jih izpostavili osnovnemu mediju NGM ali BHI, kot tudi supernatantu
netoksinogenega seva C23.
Da bi zagotovili čim večjo zanesljivost testa, so bili nevretenčarji izpostavljeni
supernatantom kulture in osnovnemu mediju v sedmih neodvisnih ponovitvah.
4.7.2 Učinki sevov bakterije C. difficile na C. elegans
12 dni smo opazovali 50 do 100 nematodov na agarju NGM s sporami bakterije C.
difficile. Zabeleţili smo 40 % mrtvih nematodov, ki so bili izpostavljeni sporam
hipervirulentnega seva R12078, 10 do 20 % mrtvih nematodov, ki so bili izpostavljeni
sporam sevov 630 in VPI. Na agarju NGM s sporami netoksinogenega seva C23 so bili
vsi nematodi ţivi.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 82
5 RAZPRAVA IN SKLEPI
5.1 RAZPRAVA
Toksina TcdA in TcdB bakterije C. difficile sta najpomembnejša virulenčna dejavnika za
OCD. Toksično delovanje toksinov je posledica modifikacije majhnih GTPaz, na katere
deluje encimska N-terminalna domena.
Po opravljenih študijah lahko sklepamo, da do sedaj odkriti mehanizem delovanja TcdA
in TcdB ni edini, ampak da obstajajo še drugi mehanizmi delovanja toksina TcdA in
predvsem toksina TcdB.
Pri toksinu TcdB ima rekombinantni protein N-terminalni katalitični del enake lastnosti
kot cel protein. Da bi preučili vlogo domen, predvsem pa, da bi določili funkcijo
rekombinantnega vezavnega proteina C-terminalne domene toksina B, smo ugotavljali
učinke rekombinatne vezavne domene toksina B referenčnega seva VPI 10463 in
variantnega seva 8864 ter ju primerjali s holotoksinom.
Prvič smo pokazali, da C-terminalna vezavna domena toksina TcdB vpliva na različne
celične dogodke pomembne za razvoj bolezenskih znakov, kot so toksičnost, epitelijska
barierna disfunkcija in produkcija interlevkina-8.
Delo je tudi prva raziskava o delovanju holotoksina B, ki sproţi avtofagocitozo.
5.1.1 Novi mehanizmi delovanja ţe znanih toksinov
Virulenca se med bakterijskimi sevi razlikuje in je odvisna od celotnega spektra
virulenčnih dejavnikov, ki so pri določenemu sevu prisotni. Predpostavljamo, da so
mehanizmi toksičnosti pri visokovirulentnih sevih C. difficile posledica tako delovanja ţe
znanih toksinov kot tudi delovanja novih toksinov.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 83
Eksponentno narašča število bakterijskih toksinov, ki z vezavo na receptorje
mitohondrijske membrane povzročijo apoptozo in med temi tudi toksin TcdB kot pro-
apoptotični faktor sproţi proces apoptoze z vezavo na receptorje mitohondrijske
membrane v intestinalnih celicah (Matarrese in sod., 2007). Prav zato je bilo za nadaljnje
raziskovanje pomembno, ali TcdB lahko deluje kot pro-apoptotični faktor na gostiteljeve
celice z vezavo C- terminalne receptorske vezavne podenote na celični receptor ter, ali je
ta lastnost pri variantnem sevu s TcdB močneje izraţena.
5.1.1.1 Celična smrt - apoptoza, nekroza ali avtofagija
V populaciji celic je apoptoza neusklajena. Pri enih se sproţi prej kot pri drugih in tudi
časovni razpon za izvršitev procesa je od celice do celice različen. Pri nekaterih traja le
30 minut, pri drugih pa celo nekaj dni (Collins in sod., 1997; Willingham, 1999).
Toksini s svojim delovanjem posegajo v določene fiziološke procese celic. Ena izmed
moţnih mehanizmov toksičnosti je njegov vpliv na apoptozo. Apoptozo v sesalski celici
sproţijo različni zunajcelični ali znotrajcelični signali (Lockshin in Zakeri, 2004).
Toksina TcdBVPI in TcdB8864 sproţita apoptozo (Fiorentini in sod., 1998; Mahida in sod.,
1998; Warny in Kelly, 1999; Brito in sod., 2002; Hippenstiel in sod., 2002; Qa'Dan in
sod., 2002; Liu in sod., 2003; Le in sod., 2005; Carneiro in sod., 2006) ali nekrozo (Voth
in Ballard, 2005; Kim in sod., 2006; Huelsenbeck in sod., 2007). Podobno smo opazili pri
rekombinantni C-terminalni domeni. Apoptotične celice so bile številnejše po tretiranju s
celim toksinom TcdBVPI. Medtem ko smo visok odstotek nekrotičnih celic opazili po
tretiranju s TcdB8864 in rec-TcdB38864 kot tudi z rekombinantnim proteinom rec-TcdB3VPI
(slika 5). Oba rekombinantna proteina po 72 urah inkubacije aktivirata kaspazo-3, kar
pomeni, da lahko sproţita od kaspaze odvisno pot. Zaradi encimske razgraditve PARP-1
(slika 8) preko aktivirane kaspaze-3 smo dodatno potdili aktivnost kaspaze-3.
Ključna vprašanja o vlogi mitohondrija v apoptozi in nekrozi ostajajo. Vloga
mitohondrijev pri celični smrti je povezana s kontrolo mitohondrijske morfologije.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 84
Mitohondriji so tudi glavni proizvajalci ROS in so glavne tarče za oksidativno poškodbo.
ROS se sproščajo med normalnim celičnim metabolizmom. V normalnih razmerah rasti
so endogeni antioksidativni obrambni sistemi dovolj učinkoviti, da obdrţijo količino ROS
na neškodljivi ravni. Kadar pride do porušenja ravnoteţja med tvorbo ROS in
antioksidantov nastopi oksidativni stres (Betteridge, 2000).
Toksin TcdB kot pro-apoptotični faktor sproţi proces apoptoze z vezavo na receptorje
mitohondrijske membrane v intestinalnih celicah in povzroči hiperpolarizacijo ali
depolarizacijo mitohondrijske membrane (Matarrese in sod., 2007).
Pomembni ključni dejavniki, ki urejajo MMP vključujejo kalcij in prisotne reaktivne
kisikove spojine (ROS). Prisotnost reaktivnih kisikovih spojin smo zato preverili pri
celicah tretiranih z rec-TcdB3VPI, 8864.
Po dobljenih rezultatih kot so nizek membranski potencial (slika 10), neaktivnost kaspaze
9, minimalna produkcija ROS (slika 11-13) sklepamo, da rekombinantni vezavni domeni
rec-TcdB3VPI, 8864 ne sproţita apoptoze ali nekroze preko mitohondrijev.
Ker poznamo dva procesa nadzorovane celične smrti, apoptozo in avtofagijo, smo zato v
raziskovalnem delu ţeleli preveriti vpliv holotoksina B in njegove rekombinantne
domene na še drugem strogo nadzorovanem biološkem procesu. Nedavne raziskave
namreč kaţejo na ključno vlogo avtofagije pri številnih različnih boleznih (Levine in
Kroemer, 2008).
Avtofagija je proces, v katerem celica odstranjuje izrabljene celične strukture in proste
radikale, ki poškodujejo celico. Povezana je z apoptozo, lahko jo prepreči ali sproţi.
Celice jo lahko izkoristijo za svoje preţivetje in se zaščitijo pred apoptozo.
Celice s številnimi kislimi vakuolami, lizosomi in avtofagosomi so zelo dovzetne za
avtofagijo. S pretočnim citometrom in konfokalno mikroskopijo smo opazili številne
vakuole v celicah, ki so bile tretirane s holotoksinoma (slika 14).
Z nadaljnjimi poskusi (slika15-21) smo zato ugotavljali, ali holotoksina sproţita
avtofagijo kot primarno obliko celične smrti.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 85
Z mikrotubuli povezan protein lahke verige 3 (LC3) je glavni sestavni del avtofagosoma
in se uporablja kot poseben marker za avtofagijo (He in sod., 2000). Pretvorba LC3 v
obliki LC3 I in LC3 II ter njuno razmerje se uporablja za spremljanje avtofagocitoze. Z
metodo Western blot smo potrdili prisotnost proteina LC3 (slika 16). Z RT-PCR smo
preverili tudi izraţanje gena lc3 (slika 18).
Nedavna raziskava je potrdila pomembno vlogo lizosoma pri regulaciji apoptoze.
Lizosomi vsebujejo prebavne encime in sodelujejo pri celični prebavi. Encimi lizosoma
lahko poškodujejo membrano lizosoma in vsebina lizosoma se izlije v citosol, kar sproţi
apoptozo (Boya in Koemer, 2008). Ugotavljali smo, ali TcdB sproţi izločanje katepsina
B in s tem njegovo sodelovanje pri celični smrti. Katepsin B je odgovoren za lokalno
rušenje membrane, kar je eden izmed zgodnjih morfoloških znakov aktivne celične smrti.
Predpostavljamo, da je katepsin B (slika 17) lahko udeleţen v procesu avtofagije, ki
celice ščiti pred apoptozo, če le-te niso preveč poškodovane oziroma vzpodbudi apoptozo
zaradi posledično aktiviranih vseh znotrajceličnih mehanizmov. Prav tako ne smemo
izključiti moţnosti, da je katepsin B ostal v lizosomih, njegova prisotnost je lahko
posledica poškodovane membrane lizosoma med pripravo celega celičnega lizata in ne
zaradi poškodovane membrane lizosoma, ki jo povzročita toksina.
Razgradnja celičnih proteinov preko avtofagosomne-lizosomske poti je pomembna in
poteka pod nadzorom, a je lahko pomanjkljiva v tumorskih celic.
Avtofagijo sproţi tudi prekomerno izraţen beklin1, ki se veţe na PI3KC3 ali Bcl-X (L),
da se oblikujejo kompleksi beklin 1-PI3KC3 ali beklin1-Bcl-X (L), ki so neodvisni drug
od drugega (Wang, 2008). Beklin 1 ima zato pomembno vlogo pri usklajevanju
znotrajcelične signalizacije. Z RT-PCR smo zato preverili izraţanje gena becn1 (slika
19).
Opazili smo, da so bile kontrolne celice (celice brez prisotnosti toksina) bolj dovzetne za
izraţanje avtofagnih genov lc3 in becn1. Prav tako nismo potrdili avtofagije s testom
MTT (slika 20, 21), kjer smo z inhibitorji avtofagije in transfekcijo testiranih celic ţeleli
sproţiti apoptozo kot dokaz, da celice ne morejo vključiti avtofagije, če inhibiramo njeno
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 86
funkcijo. Za te razlike je moţnih več vzrokov, kljub temu da smo poskuse vedno izvajali
na enak način in pri enakih pogojih. Biokemijsko stanje celic se morda razlikuje v
posameznih pasaţah. Prav tako je mogoče, da antiapoptotični protein Bcl-2 sodeluje s
ključnim proteinom avtofagije, beklinom1. Vendar pa je malo znanega o funkcionalnem
pomenu tega sodelovanja. Pattingre in sodelavci (2005) so pokazali, da Bcl-2 ne deluje le
kot antiapoptotični, ampak tudi kot avtofagosomni zaviralni protein preko svojega
sodelovanja z beklinom1. Ta funkcija Bcl-2 lahko pomaga ohranjati avtofagijo na ravneh,
ki so zdruţljivi za preţivetje celice, ne pa za smrt celice.
Zelo verjetno pa je, da lahko avtofagija v pozni fazi spodbudi nekatere signale, da
sproţijo mitohondrijsko membransko in lizosomsko permeabilizacijo (slika 14, 15), ki so
hkrati vključeni v celično smrt.
5.1.2 C-terminalna vezavna domena toksina B vpliva na prerazporeditev aktinskih
filamentov in ZO-1
Citoskelet povezuje kakovostno različna območja v celici in predstavlja ogrodje za
specifično mikrolokalizacijo sporočilnih molekul v celici. Odziv, ki ga povzroči določen
signal v celici, je zato kompleksen in lahko vključuje spremembe v celični polarnosti,
spremembe pri oblikovanju citoplazemskih podaljškov, pri vzpostavljanju in prekinjanju
proteinsko-proteinskih povezav. Zaradi tega se mu pripisuje pomembna vloga pri prenosu
sporočila v celici in za funkcionalno povezavo med aktinskim filamentom in proteini
tesnega stika.
Toksini prehajajo iz apikalne na bazolateralno stran enterocitov trancelularno (skozi
celico) ali paracelularno (med celicami), kar povzroči razdor tesnih stikov celice in padec
transepitelijske električne upornosti (TEER). TEER je merilo za prepustnost tesnih stikov
celic in integriteto monosloja ter pogost način spremljanja vpliva bakterijskih toksinov na
epitelne celice v pogojih in vitro.
Holotoksin B zniţa TEER (Lawrence in sod., 1997) in vpliva na strukturo in funkcijo
proteinov tesnih stikov (Nusrat in sod., 2001). Posledica tega sta prerazporeditev
aktinskih filamentov in porušenje tesnih stikov med celicami.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 87
Z opravljenimi poskusi na monosloju epitelijskih intestinalnih celicah T84 smo pokazali,
da tudi rekombinantni domeni rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 ireverzibilno spremenita
transepitelijsko upornost (TEER) (slika 24). Ob prisotnosti holotoksinov kot tudi
rekombinantih vezavnih domen toksina B je prišlo do zniţanja TEER, kar je posledica
prerazporeditve aktinskih filamentov in porušenja tesnih stikov med celicami.
Tesni stiki vzpostavljajo in vdrţujejo tkivno bariero med različnimi sistemi v organizmu.
Transmembranski protein ZO-1 sodeluje pri povezavah med sosednjimi celicami ter
celicami in zunajceličnim matriksom. Veţe se na aktinski citoskelet. Prisotnost TcdB in
rec-TcdB3 povzroči reorganizacijo aktina (slika 22) v celicah in spremembe v
razporeditvi ZO-1 (slika 23) ter zmanjša povezanost ZO-1 z F-aktinom, ki je osrednjega
pomena za njegovo delovanje. V celicah, ki so bile izpostavljene TcdBVPI in rec-
TcdB3VPI, 8864 se je ZO-1 preoblikoval v tanjše in nepravilne strukture, ki se razlikujejo od
pravilne razporeditve ZO-1 v kontrolnih celicah.
5.1.3 Motena regulacija imunskega sistema
Epitelne celice delujejo kot prva obrambna linija, kjer se sproţi lokalni imunski odziv. Ta
odziv vključuje tudi povečano sintezo vnetnih citokinov, predvsem interlevkina 8 (IL-8).
Dobro poznano je, da tako toksin B kot A sproţita izločanje IL-8 iz intestinalnih celic
(Savidge et al., 2003). Povečana sinteza IL-8 je bila opisana pri pacientih s kolitisom
(Steiner et al., 1997).
Pokazali smo, da obe rekombinantni vezavni domeni TcdB sproţita imunski odgovor.
Podoben učinek je bil opisan za rekombinantni protein N-terminalne encimske domene
toksina A (Yeh et al., 2008).
Preverili smo, če v celicah lahko spodbudimo in zaznamo izločanje interlevkina 8. Merili
smo koncentracijo IL-8 po stimulaciji z rekombinantnima vezavnima domenama kot s
holotoksinoma. Zanimala nas je predvsem razlika v količini IL-8. Videli smo, da so
celice izdelale manj IL-8, ko so bile inkubirane s holotoksinom (slika 25). Rezultate bi
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 88
lahko pojasnili z visoko citotoksičnostjo TcdBVPI, 8864 ţe znotraj 24 ur, medtem ko je
toksičnost pri rec-TcdB3VPI, 8864 najbolj opazna po 72 urah (slika 3).
S temi poskusi smo dokazali, da sta imunski odgovor in izločanje IL-8 lahko posledica
dodatnega mehanizma preko katerega deluje C-terminalna vezavna domena. Zato je zelo
verjetno povezana z vnetjem, diarejo in nekaterimi drugimi bolezenskimi znaki črevesja v
patofiziologiji OCD.
5.1.4 C. difficile in hemolitična aktivnost
Bakterije iz rodu Clostridium pogosto delajo več različnih toksinov, sevi Clostridium
perfringens npr. lahko izdelujejo kar 12 različnih toksinov. Posamezni toksini te vrste so
znani kot hemolizini, njihov učinek namreč ocenjujemo na sposobnost lize rdečih krvničk.
Pri C. difficile so zaenkrat opisani trije toksini, a nobeden od njih ni bil povezan s
hemolitično aktivnostjo. Naši rezultati kaţejo (slika 26), da so med sevi bakterije C.
difficile takšni, ki celice lizirajo.
Med uporabljenimi sevi smo naredili selekcijo sevov, ki povzročijo lizo eritrocitov in
optimizirali laboratorijske pogoje za izraţanje hemolitične aktivnosti. S preizkušanjem
različnih testnih sistemov za analizo hemolize smo izbrali tistega (slika 27), s katerim
lahko zanesljivo določamo hemolitično aktivnost testiranih sevov.
Ţelimo ugotoviti, da je hemoliza posledica delovanja novega toksina, ki bi bil lahko glede
na mehanizem delovanja ali encimska beljakovina, fosfolipaza, ki hidrolizira fosfolipide
v citoplazemski membrani in jo tako poškoduje, ali strukturna beljakovina, ki se vgradi v
citoplazemsko membrano in oblikuje pore (preglednica 7). Z izolacijo proteinske frakcije
s hemolitično aktivnostjo iz supernatanta bakterijskih kultur bomo poskušali ovrednotiti
njihovo funkcijo in ugotoviti od česa je odvisna, analizirati biokemijske lastnosti proteina
in ugotoviti specifičnost vezave.
Razlog, da so bili ti toksini do sedaj neodkriti je lahko izjemno nizka prevalenca med sevi,
ki trenutno kroţijo v humani in ţivalski populaciji. Prav tako preliminarni poizkusi
kaţejo, da je izraţanje hemolitične aktivnosti pri posameznem sevu variabilno.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 89
5.1.5 Ţivalski model nevretenčar C. elegans
Po začetnih opaţanjih vloge toksinov v patogenezi pri hrčkih se je začelo iskanje enakih
sprememb še pri drugih organizmih, in sicer so kot model vključili zebrice (Qa'Dan in
sod., 2002). Naš modelni organizem je bil mikroskopsko majhen večcelični evkariont C.
elegans, ki se je izkazal kot neprimeren za študije virulenčnega potenciala pri toksigenih
sevih.
Ker so dosedaj raziskovali virulentnost pri bakteriji Staphylococcus aureus (Wu in sod.,
2009) in bakteriji Pseudomonas aeruginosa (Tan in sod., 1999), in vivo dobljene rezultate
z uporabo ţivalskega modela nevretenčarja C. elegans teţko primerjamo z literaturo.
5.2 SKLEPI
Večina testov je zasnovanih na predpostavki, da je neprekinjena, nepoškodovana celična
membrana znak za ţivo celico.
Predpostavlili smo moţnost reverzibilne avtofagije, ki jo sproţita TcdBVPI in TcdB8864, ki
celicam omogoči daljšo zaščito pred celično smrtjo.
Rekombinantni vezavni domeni rec-TcdB3VPI,8864 z vezavo na intestinalne epitelijske
celice delujeta toksično in pri celicah sproţita apoptozo oziroma nekrozo, vplivata na
reorganizacijo aktinskih filamentov in protein tesnih stikov ter vzpodbudita imunski
odziv.
Vezavna domena toksina B ima lahko odločilno vlogo na številne učinke funkcionalnih
domen toksina pri uspešni mikrobni infekciji.
Med sevi bakterije C. difficile so nekateri toksigeni kot tudi netoksinogeni sevi, ki
povzročijo lizo eritrocitov in imajo hemolitično aktivnost.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 90
Preizkusili smo model nevretenčarja C. elegans za študij toksičnih učinkov izoliranega
toksina B (TcdBVPI, 8864) oziroma supernatantov različnih sevov C. difficile in virulence
sevov C. difficile.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 91
6 POVZETEK
Večina toksigenih sevov C. difficile sintetizira toksin A (TcdA) in/ali toksin B (TcdB), ki
sta glavna dejavnika virulence.
Glavni mehanizem trenutno znanega delovanja toksina TcdA in TcdB je vezan na
encimsko funkcijo katalitične N-terminalne domene, ki z modifikacijo in inaktivacijo
majhnih GTP vezavnih proteinov povzroči depolimerizacijo F-aktina, porušenje
citoskeleta in zaokroţanje celic, medtem ko je vezavna domena odgovorna za vezavo na
celične receptorje in vnos v celico.
Po drugi strani lahko imata ţe znana toksina TcdA in TcdB raznolike in nove načine
delovanja na gostiteljsko celico, kar še posebej velja za t.i. variantne toksine. Pri teh sevih
sta gena tcdA in tcdB spremenjena in sevi s spremenjenimi toksinskimi geni so ţe
pripomogli k novim pogledom na vlogo toksinov v patogenezi in pri določanju toksičnih
predelov toksina B.
Glavni cilji, ki smo si jih postavili, so bili (i) ugotoviti prisotnost do sedaj neznanih
dejavnikov virulence (toksinov) pri C. difficile, (ii) ugotoviti moţne nove mehanizme
delovanja toksinov TcdA in TcdB pri ţe znanih variantnih sevih (toksinotipih), (iii)
natančneje določiti vlogo C- terminalne vezavne domene toksina B v patogenezi in
ugotoviti, ali so lastnosti rekombinantne vezavne domene pri variantnem sevu močneje
izraţene ter (iv) preveriti ali je nevretenčarski ţivalski model primeren za študij virulence.
Uporabili smo rekombinantno vezavno domeno rec-TcdB3 dveh različnih sevov
(referenčni laboratorijski C. difficile sev VPI 10463 in variantni sev 8864).
Rekombinantni protein smo pripravili v GST-2 ekspresijskem sistemu in kot kontrolo
uporabljali holotoksine TcdB referenčnega seva VPI 10463 in variantnega seva 8864.
Za in vitro študije interakcij med črevesnimi epitelnimi celicami in bakterijskimi toksini
smo uporabili rakavi celični liniji epitelnih celic črevesja T84 in HT-29, ki imajo
ohranjene strukturne in funkcionalne lastnosti posameznih tipov črevesnih epitelnih celic.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 92
Z različnimi metodami pretočne citometrije smo spremljali celični cikel celice, celično
viabilnost in obliko celične smrti ter tako pridobili čimveč informacij o karakteristikah
celic T84 in HT-29.
Pokazali smo, da imata rekombinantna proteina podoben učinek na celično smrt kot
holotoksina. V celicah sproţita apoptozo, ki je od kaspaze odvisna, oziroma nekrozo.
Spremenjen elektrokemijski gradient preko mitohondrijske membrane je eden od
zgodnjih dogodkov med apoptozo. Z oceno znotrajcelične oksidacije pa nismo potrdili,
ali je celična smrt povezana s tvorbo prostih kisikovih spojin in neposredno z
mitohondriji.
Holotoksina TcdBVPI in TcdB8864 aktivirata še tretjo obliko celične smrti, to je avtofagijo.
Tukaj opisujemo avtofagijo kot prvo zaščito celice pred delovanjem holotoksina. Glede
na to, da sta toksina močna citotoksina, ki celice zelo poškodujeta in sproţita apoptozo
oziroma nekrozo. Z metodo RT-PCR nismo potrdili pričakovanega vpliva TcdB na
izraţanje izbranih genov, ki sodelujejo v avtofagiji.
S konfokalno mikroskopijo, z merjenjem transepitelne električne upornosti in primerjavo
z znanim učinkom holotoksinov na citoskelet smo pokazali, da tudi rec-TcdB3VPI, 8864
vplivata na prerazporeditev aktinskih filamentov in transmembranski protein ZO-1, ki
sodeluje pri povezavah med sosednjimi celicami in zunajceličnim matriksom.
Prav tako rekombinantni vezavni domeni spodbudita sproščanje vnetnega citokina IL-8,
ki modulira imunski odgovor. Dolgotrajna prisotnost rec-TcdB3 zato lahko ima za
posledico kaskado vnetnih odzivov in sproščanje še drugih mediatorjev vnetja.
Nekateri sevi bakterije C. difficile povzročijo hemolizo, razpad membrane eritrocitov in
posledično sproščanje hemoglobina ter ostalih komponent eritrocitov v okolje.
Karakterizirali smo jih na diferencialnem krvnem agarju, kjer so hemolitični sevi
povzročili lizo eritrocitov, kar smo opazili kot območje zbistritve okrog kolonij, in z
merjenjem hemolitične aktivnosti.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 93
Molekularni in fiziološki mehanizmi, ki so vpleteni v procese morfoloških sprememb
celice v prisotnosti toksina B in rekombinantne vezavne domene toksina B ostajajo
predmet nadaljnjih raziskav. Tudi za hemolitične seve, ki so ţe pripomogli k novim
pogledom na vlogo toksinov v patogenezi in pri določanju novih virulentnih dejavnikov,
je pomembno pravilno ovrednotenje rezultatov hemolitične aktivnosti sevov. Na osnovi
naših rezultatov lahko sklepamo, da je nematod C. elegans neprimeren za študije
virulenčnega potenciala variantnih sevov. Vendar so za dokaz potrebne še dodatne
klinične študije na nevretenčarskem ţivalskem modelu.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 94
7 VIRI
Al-Barrak A., Embil J., Dyck B., Olekson K., Nicoll D., Alfa M., Kabani A. 1999. An outbreak of toxin A
negative, toxin B positive Clostridium difficile-associated diarrhea in a Canadian tertiary-care hospital.
Canada Communicable Disease Report, 25:65-69.
Alfa M.J., Kabani A., Lyerly D., Moncrief S., Neville L.M., Al-Barral A., Harding G.H.K., Dyck B.,
Olekson K., Embil J.M. 2000. Characterization of a toxin A-negative, toxin B-positive strain of Clostridium
difficile responsible for nosocomial outbreak of Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical
Microbiology, 38:206-2714.
Alouf J.E. 2006. Paradigms and classification of bacterial membrane-damaging toxins. V:The Source Book
of Bacterial Protein Toxins (Alouf J.E. and Popoff M.R., eds), Elsevier Academic press, Amsterdam,
26:507-515.
Alouf J.E., Billington S.J., Jost B.H. 2006. Repertoire and general features of the family of cholesterol-
dependent cytolysins.V: The Source Book of Bacterial Protein Toxins (Alouf J.E., Popoff M.R., eds),
Elsevier Academic press, Amsterdam, 36:643-654.
Amimoto K., Noro T., Oishi E., Shimizu M. 2007. A novel toxin homologous to large clostridial cytotoxins
found in culture supernatant of Clostridium perfringens type C. Microbiology, 153(Pt 4):1198-206.
Anderluh G., Lakey J.H. 2008. Disparate proteins use similar architectures to damage membranes. Trends
in Biochemical Sciences, 33(10):482-490.
Aktories K., Just I. 1995. Monoglucosylation of low-molecular-mass GTP binding Rho proteins by
clostridial cytotoxins. Trends Cell Biology, 5:441-443.
Aktories K. 1997. Rho proteins: Targets for bacterial toxins. Trends in Microbiology, (5): 282-288.
Barth H., Aktories K., Popoff M.R., Stiles B.G. 2004. Binary bacterial toxins: biochemistry, biology, and
applications of common Clostridium and Bacillus proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews,
68(3):373-402.
Barloy F., Lecadet M.M., Delecluse A. 1998. Cloning and sequencing of three new putative toxin genes
from Clostridium bifermentans CH18. Gene, 211:293-299.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 95
Bartlett J.G., Gerding D.N. 2008. Clinical Recognition and Diagnosis of Clostridium difficile Infection.
Clinical Infectious Diseases, 46:S12–S18.
Bette P., Oksche A., Mauler F., von Eichel-Streiber C., Popoff M.R., Habermann E. 1991. A comparative
biochemical, pharmacological and immunological study of Clostridium novyi alpha-toxin, C. difficile toxin
B and C. sordellii lethal toxin. Toxicon, 29(7): 877-887.
Betteridge D.J. 2000. What is oxidative stress? Metabolism, 49(2 Suppl 1):3-8.
Bongaerts G.P., Lyerly D.M. 1994. Role of toxins A and B in the pathogenesis of Clostridium difficile
disease. Microbial Pathogenesis, 17(1):1-12.
Borriello S.P., Wren B.W., Hyde S., Seddon S.V., Sibbons P., Krishna M.M., Tabaqchali S., Manek S.,
Price A.B. 1992. Molecular, immunological, and biological characterization of a toxin A-negative, toxin B-
positive strain of Clostridium difficile. Infection and Immunity, 60:4192-4199.
Boquet P., Munro P., Fiorentini C., Just I. 1998. Toxins from anaerobic bacteria: specifity and molecular
mechanism of action. Current Opinion in Microbiology, 1:66-74.
Braun V., Hundsberger T., Leukel P., Sauerborn M., von Eichel-Streiber C. 1996. Definition of the single
integration site of the pathogenicity locus in Clostridium difficile. Gene, 181(1-2): 29-38.
Boya P., Kroemer G. 2008. Lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogene, 27:6434-6451.
Britto G.A.C., Fujji J., Carneiro B.A., Lima A.A.M., Obrig T., Guerrant R.L. 2002. Mechanism of
Clostridium difficile toxin A-induced apoptosis in T84 cells. Journal of Infectious Diseases, 186:1438-1447.
Brun P., Scarpa M., Grillo A., Palu G., Mengoli C., Zecconi A., Spigaglia P., Mastrantonio P., Castagliuolo
I. 2008. Clostridium difficile TxAC314 and SLP-36kDa enhance the immune response toward a
coadministered antigen. Journal of Medical Microbiology, 57:725-731.
Carman R.J, Wilkins T.D. 1991. In vitro susceptibility of rabbit strains of Clostridium spiroforme to
antimicrobial agents. Veterinary Microbiology, 28(4):391-7.
Carneiro B.A., Fujii J., Britto G.A., Alcantara C., Oria R.B., Lima A.A., Obrig T., Guerrant R.L. 2006.
Caspase and Bid involvement in Clostridium difficile toxin A-induced apoptosis and modulation of toxin A
effects by glutamine and alanyl-glutamine in vivo and in vitro. Infection and Immunity, 74:81-87.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 96
Carter G.P., Lyras D., Allen D.L., Mackin K.E., Howarth P.M., O'Connor J.R., Rood J.I. 2007. Binary
toxin production in Clostridium difficile is regulated by CdtR, LytTR family response regulator. Journal of
Bacteriology, 189(20): 7290-7301.
Castagliuolo I., Sardina M., Brun P., DeRos C., Mastrotto C., Lovato I., Palu G. 2004. Clostridium difficile
toxin A carboxyl-terminus peptide lacking ADP-ribosyltransferase activity acts as a mucosal adjuvant.
Infection and Immunity, 72:2827-2836.
Chart H., Jenkins C., Smith H.R., Hedges D., Rowe B. 1998. Haemolysin production by strains of
Verocytotoxin-roducing Escherichia coli. Microbiology, 144:103-107.
Chaves Olarte E., Freer E., Parra A., Guzman-Verri C., Moreno E., Thelestam M. 2003. R-Ras
glucosylation and transient RhoA activation determine the cytophatic effect produced by toxin B variants
from toxin A-negative strains of Clostridium difficile. The Journal of Biological Chemistry, 278:7956-7963.
Chernak E., Johnson C.C., Weltman A., McDonald L.C., Wiggs L., Killgore G., Thompson A., LeMaile-
Williams M., Tan E., Lewis F.M. 2005. Severe Clostridium difficile-associated disease in population
previously at low risk-four states. Journal of the American Medical Association, 295(1):25-27.
Cohen A.L, Bhatnagar J., Reagan .S, Zane S.B., D'Angeli M.A., Fischer M., Killgore G., Kwan-Gett T.S.,
Blossom D.B., Shieh W.J., Guarner J., Jernigan J., Duchin J.S., Zaki S.R., McDonald L.C. 2007. Toxic
shock associated with Clostridium sordellii and Clostridium perfringens after medical and spontaneous
abortion. Obstetrics and Gynecology, 110(5):1027-33.
Coleman M.L., Olson M.F. 2002. Rho GTPase signaling pathway in the morphological changes associated
with apoptosis. Cell Death and Differentiation, 9:493-504.
Colell A., Ricci J.E, Tait S., Milasta S., Maurer U., Bouchier-Hayes L., Fitzgerald P., Guio-Carrion A.,
Waterhouse N.J., Li C.W., Mari B., Barbry P., Newmeyer D.D., Beere H.M., Green D.R. 2007. GAPDH
and autophagy preserve survival after apoptotic cytochrome c release in the absence of caspase activation.
Cell, 129(5):983-97.
Collins J.A., Cshandl C.A., Young K.K., Vesely J., Willingham M.C. 1997. Major DNA fragmentation is a
late event in apoptosis. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45(7):923-934.
Coniglio S.J., Jou T.S., Symons M. 2001. Rac1 protects epithelial cells against anoikis. Journal of
Biological Chemistry, 276:28113-28120.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 97
Considine R.V., Simpson L.L. 1991. Cellular and molecular actions of binary toxins possessing ADP-
ribosyltransferase activity. Toxicon, 29(8):913-936.
Dale J.W. 1994. Molecular genetics of bacteria. Chichester: John Wiley and Sons.
Depitre C., Delmée M., Avesani V., L'Haridon R., Roels A., Popoff M.R., Corthier G. 1993. Serogroup F
strains of Clostridium difficile produce toxin B but not toxin A. Journal of Medical Micobiology, 38:434-
441.
Dubail I., Autret N., Beretti J., Kayal S., Berche P., Charbit A. 2001. Functional assembly of two
membrane-binding domains in listeriolysin O, the cytolysin of Listeria monocytogenes. Microbiology, 147,
2679-2688.
Dupuy B., Raffestein S., Matamouros S., Mani N., Popoff M.R., Sonenshein A.L. 2006. Regulation of
toxin and bakteriocin gene expresion in Clostridium difficile by interchangeable RNA polymerase sigma
factors. Molecular Microbiology, 60(4):1044-1057.
Egerer M., Giesmann T., Jank T., Fullner Satchell K.J., Aktories K. 2007. Auto-catalytic cleavage of
Clostridium difficile toxins A and B depends on cysteine protease activity. Journal of Biological Chemistry,
282(35):25314-25321.
Faust C., Ye B., Song K.P. 1998. The enzymatic domain of Clostridium difficile toxin A is located within
its N-terminal region. Biochemical and Biophysical Research Communications, 251:100-105.
Fekety, R., Shah, A.B. 1993. Diagnosis and treatment of Clostridium difficile colitis. JAMA, 269:71-75.
Fiorentini C., Fabbri A., Falzano L., Fattorossi A., Matarrese P., Rivabense R., Donelli G. 1998.
Clostridium difficile toxin B induces apoptosis in intestinal cultered cells. Infection and Immunity,
66:2660-2665.
Flegel W.A., Muller F., Daubener W., Fisher H.G., Hadding U., Northhoff H. 1991. Cytokine response by
human monocytes to Clostridium difficile toxin A and toxin B. Infection and Immunity, 59:3659-3666.
Frish C., Gerhard R., Aktories K., Hofmann F., Just I. 2003. The complete receptor-binding of Clostridium
difficile toxin A is required for endocytosis. Biochemical and Biophysical Research Communications,
300:706-711.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 98
Fritz G., Kaina B. 2006. Rho GTPases: promising cellular targets for novel anticancer drugs. Current
Cancer Drug Targets, 6:1-14.
George W.L., Sutter V.L., Goldstein E.J., Ludwig S.L., Finegold S.M. 1978. Etiology of antimicrobial-
agent-associated collitis. Lancet, 1(8068):802-803.
Gendeh G.S., Young L.C., de Medeiros C.L., Jeyaseelan K., Harvey A.L., Chung M.C. 1997. A new
potassium channel toxin from the sea anemone Heteractis magnifica: isolation, cDNA cloning, and
functional expression. Biochemistry, 36 (38):11461-11471.
Genth H., Dreger S.C., Huelsenbeck J., Just I. 2008. Clostridium difficile toxins: More than mere inhibitors
of Rho proteins. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 40:592-597.
Geoffroy C., Mengaud J., Alouf J.E., Cossart P. 1990. Alveolysin, the Thiol-Activated Toxin of Bacillus
alvei, Is Homologous to Listeriolysin O, Perfringolysin O, Pnemolysin, and Streptolysin O and contains a
Single Cysteine. Journal of Bacteriology, 172:7301-7305.
Giammarini C., Andreoni F., Amagliani G., Casiere A., Barocci S. in Magnani M. 2003. High level
expression of the Listeria monocytogenes listeriolysin O in Escherichia coli and the preliminary
characterization of the purified protein. Protein expression and purification, 28(1):78-85.
Giesemann T., Jank T., Gerhard R., Maier E., Just I., Benz R., Aktories K. 2006. Cholesterol-dependent
pore formation of Clostridium difficile toxin A. Journal of Biological Chemistry, 281(16):10808-1.
Greco A., Ho J.G., Lin S.J., Palcic M.M, Rupnik M., Ng K.K.S. 2006. Carbohydrate recognition by
Clostridium difficile toxin A. Nature Structural and Molecular Biology, 13:460-461.
Goldfine H., Knob C., Alford D., Bentz J. 1995. Membrane permeablization by Listeria monocytogenes
phosphatidylinositol-specific phospholipase C is independent of phospholid hydrolysis and cooperative
with listeriolysin O. Proceedings of the National Academy of Science, 99:2979-2983.
Gouaux E., Hobaugh M., Song L. 1997. Alpha-hemolysin, gamma-hemolysin and leukocidin from
Staphylococcus aureus: distant in sequence, but similar in structure. Protein Science, 6:2631-2635.
Guerrant R.L. 1994. Lessons from diarrheal diseases: demography to molecular pharmacology. The Journal
of Infectious Disease, 169(6):1206-18.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 99
Gulke I., Pfeifer G., Liese J., Fritz M., Hofmann F., Aktories K., Barth H. 2001. Characterization of the
enzymatic component of the ADP-ribosytransferaze toxin CDTa from Clostridium difficile. Infection and
Immunity, 69:6004-6011.
Halabi-Cabezon I., Huelsenbeck J., May M., Ladwein M., Rottner K., Just I., Genth. Prevention of the
cytopathic effect induced by Clostridium difficile toxin B by active Rac1. FEBS Letters, 582:3751-3756.
Hamm E.E., Voth D.E., Ballard J.D. 2006. Identification of Clostridium difficile toxin B cardiotoxicity
using a zebrafish embryo model of intoxication. Proceedings of the National Academy of Science, 103
(38):14176-14181.
Harvey A.L. 1990. Presynaptic effects of toxins. International Review of Neurobiology, 32:201-39.
He D., Hagen J., Pothoulakis C., Chen M., Medina N.D., Warny M., LaMont J.T. 2000. Clostridium
difficile toxin A causes early damage to mitochondria in cultered cells. Gastroenterology, 119:139-150.
He H., Dang Y., Dai F., Guo Z., Wu J., She X., Pei Y., Chen Y., Ling W., Wu C., Zhao S., Liu J.O.,Yu L.
2003. Post-translational modifications of three members of the human MAP1LC3 family and detection of a
novel type of modification for MAP1LC3B. Journal of Biological Chemistry, 278:29278-29287.
Hippenstiel S., Schmeck B., N'Guessan P.D., Seybold J., Krüff M., Preissner K., von Eichel-Streiber C.,
Suttorp N. 2002. Rho protein inactivation induced apoptosis of cultured human endothelial cells. American
Journal of Physiology Lung Cell Molecular Physiology, 283:L830-L838.
Ho J.G., Greco A., Rupnik M., Ng K.K. 2005. Crystal structure of receptor binding C-terminal repeats from
Clostridium difficile toxin A. Proceedings of the National Academy of Science, 102:18373-18378.
Hofmann F., Herrmann A., Habermann E., von Eichel Streiber C. 1995. Sequencing and analysis of the
gene encoding the α-toxin of Clostridium novyi proves its homology to toxins A and B of Clostridium
difficile. Molecular and General Genetics, 247: 670-679.
Hofmann F., Busch G., Prepens U., Just I., Aktories K. 1997. Localization of the glucosyltransferase
activity of Clostridium difficile toxin B to the N-terminal part of the holotoxin. Journal of Biological
Chemistry, 272:11074-11078.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 100
Huelsenbeck J., Dreger S., Gerhard R., Barth H., Just I., Genth H. 2007. Difference in the Cytotoxic Effects
of Toxin B from Clostridium difficile Strain VPI 10463 and Toxin B from Variant Clostridium difficile
Strain 1470. Infection and Immunity, 75(2):801–809.
Jaffe A.B., Hall A. 2005. Rho GTPases: biochemistry and biology. Annual Review of Cell and
Developmental Biology, 21:247-69.
Just I., Selzer J., Wilm M., von Eichel-Streiber C., Mann M, Aktories K. 1995. Glucosylation of Rho
proteins by Clostridium difficile toxin B. Nature, 375:500-503.
Justus P.G., Martin J.L., Goldberg D.A., Taylor N.S., Bartlett J.G., Alexander R.W., Mathias J.R. 1982.
Myoelectric effects of Clostridium difficile: motility-altering factors distinct from its cytotoxin and
enterotoxin in rabbits. Gastroenterology, 83(4):836-843.
Karasawa T., Wang X., Maegawa T., Michiwa Y., Kita H., Miwa K., Nakamura S. 2003. Clostridium
sordellii Phospholipase C: Gene Cloning and Comparison of Enzymatic and Biological Activities with
Those of Clostridium perfringens and Clostridium bifermentas Phospholipase C. American Society for
Microbiology, 71:641-646.
Katayama M., Kawaguchi T., Berger M.S. and Pieper R.O. DNA damaging agent-induced autophagy
produces a cytoprotective adenosine triphosphate surge in malignant glioma cells. Cell Death and
Differentiation, 2007:548–558.
Keel M.K., Songer J.G. 2006. The comparative pathology of Clostridium difficile-associated disease.
Veterinary Pathology, 43:225-240.
Kim J.M., Lee J.Y., Yoon Y.M., Oh Y.K., Youn J., Kim Y.J. 2006. NF-kappa B activation pathway is
essential for the chemokine expression in intestinal cells stimulated with Clostridium difficile toxin A.
Scandinavian Journal of Immunology, 63:453-460.
Kim J., Smathers P.P., Leckerman K.H., Coffin S., Zaoutis T. 2008. Epidemiological features of
Clostridium difficile-associated disease among inpatients at children's hospitals in the United States, 2001-
2006. Pediatrics, 122(6):1266-1270.
Kraig E., Dailey T., Kolodrubety D. 1990. Nucletide sequence of the leukotoxin gene from Actinobacillus
actinomycetemcomitans: homology to the alpha-hemolysin/leukotoxin gene family. Infection and Immunity,
58:920-929.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 101
Lawrence J.P, Brevetti L., Obiso RJ., Wilkins T.D., Kimura K., Soper R. 1997. Effects of epidermal growth
factor and Clostridium difficile toxin B in a model of mucosal injury. Journal of Pediatric Surgery,
32(3):430-433.
Le S.S., Loucks F.A., Udo H, Richardson-Burns S., Phelps R.A., Bouchard R.J., Barth H., Aktories K.,
Tyler K.L., Kandel E. R., Heidenreich K.A., Linseman D.A. 2005. Inhibition of Rac GTPase triggers a c-
Jun and Bim-dependent mitochondrial apoptotic cascade in cerebellar granule neurons. Journal of
Neurochemistry, 94:1025–1039.
Lesieur C., Vecsey-Semjen B., Abrami L., Fivaz M., Gisou van der Goot F. 1997. Membrane insertion: The
strategies of toxins. Molecular Membrane Biology, 14(2), 45-64.
Levine B., Kroemer G. 2008. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell, 132: 27-42.
Li J., Koni P.A., Ellar D.J. 1996. Structure of the mosquitocidal delta-endotoxin CytB from Bacillus
thuringiensis sp. kyushuensis and implications for membrane pore formation. Journal of Molecular Biology,
257(1):129-52.
Libby J.M., Wilkins T.D. 1982. Production of antitoxins to two toxins of Clostridium difficile and
immunological comparison of the toxins by cross-neutralization studies. Infection and Immunity, 35:374-
376.
Liu T.S., Musch M.W., Sugi K., Walsh-Reitz M.M., Ropeleski M.J., Hendrickson B.A., Pothoulakis C.,
LaMont J.T., Chang E.B. 2003. Protective role of HSP72 against Clostridium difficile toxin A-induced
intestinal epithelial cell dysfunction. American Journal of Physiology Cell Physiology, 284:C1073-C1082.
Lockshin R.A., Zakeri Z. 2004. Apoptosis, autophagy, and more. The International Journal of Biochemistry
and Cell Biology, 36(12):2405-19.
Lyerly D.M., Barroso L.A., Wilkins T.D., Depitre C., Corthier G. 1992. Characterization of a toxin A-
negative, toxin B-positive strain of Clostridium difficile. Infection and Immunity, 60:4633-4639.
Lyerly D.M., Krivan H.C., Wilkins T.D. 1988. Clostridium difficile: its disease and toxins. Clinical
Microbiology Reviews, 1(1):1-18.
Lyerly D.M., Saum K.E., MacDonald DK., Wilkins T.D. 1985. Effects of Clostridium difficile toxins given
intragastrically to animals. Infection and Immunity, 47(2):349-352.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 102
Lyerly D.M., Lockwood D.E., Richardson S.H., Wilkins, T.D. 1982. Biological activities of toxins A and B
of Clostridium difficile. Infection and Immunity, 35(3): 1147-1150.
Lyras D., O'Connor J.R., Howarth P.M., Sambol S.P., Carter G.P., Phumoonna
T., Poon R., Adams
V.,
Vedantam G., Johnson S., Gerding D.N., Rood
J.I. 2009. Toxin B is essential for virulence of Clostridium
difficile. Nature, 458: 1176-1179.
Mahida Y.R., Galvin A., Makh S., Hyde S., Sanfilippo L., Borriello S.P., Sewel J.L. 1998. Effect of
Clostridium difficile toxin A on human colonic lamina propria cells: early loss of macrophages followed by
T-cell. Infection and Immunity, 66:5462-5469.
Main E.R., Jackson S.E., Regan L. 2003. The folding and design of repeat proteins: reaching a consensus.
Current Opinion in Structural Biology, 13: 482-489.
Matamourus S., England P., Dupuy B. 2007. Clostridium difficile toxin expresion is inhibited by the novel
regulator TcdC. Molecular Microbiology, 64(5): 1274-1288.
Matarrese P., Falzano L., Fabbri A., Gambardella L., Frank C., Geny B., Popoff M.R., Malorni W.,
Fiorentini C. 2007. Clostridium difficile toxin B causes apoptosis in epithelial cells by thrilling
mitochondria. Involvement of ATP-sensitive mitochondrial potassium channels. The Journal of Biological
Chemistry, 282(12):9029-41.
McDonald L.C., Owings M., Jernigan D.B. 2006. Increasing rates of Clostridium difficile infection among
patients discharged from US short-stay hospitals, 1996-2003. Emerging Infectious Diseases, 12(3):409-415.
Menestrina G., Ferreras M., Höper F., Dalla Serra M., Colin D.A., Prevost G. 1998. The interaction of
Staphylococcus aureus bi-component γ-hemolysins and leucocidins with cells and lipid membranes.
Biochimica et biophysica acta, 1414:108-126.
Merrigan M.M., Sambol S.P., Johnson S., Gerding D.N. 2003. Prevention of fatal Clostridium difficile-
associated disease during continous administration of clindamycin in hamsters. Journal of Infectious
Diseases, 188(12):1922-1927.
Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover T.C., Yolken R.H. 1999. Manual of clinical microbiology.
7th
ed. American Society for microbiology, Washington.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 103
Nizet V. 2002. Streptococcal β-hemolysins:genetics and role in disease pathogenesis. Trends in
Microbiology, 10:12.
Nusrat A., von Eichel-Streiber C., Turner J.R, Verkde P., Madara J.I., Parkos CA. 2001. Clostridium
difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight
junction proteins. Infection and Immunity, 69(3):1329-1336.
Pattingre S., Tassa A., Qu X., Garuti R., Liang X.H., Mizushima N., Packer M., Schneider M.D., Levine
B.2005. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell, 122(6):927-39.
Patrick S., Larkin M.J. 1995. Immunological and molecular aspects of bacterial virulence. Chichester: John
Wiley and Sons.
Pavliakova D., Moncrief J. S., Lyerly D.M., Schiffmann G., Bryla D.A., Robbins J.B., Schneerson R. 2000.
Clostridium difficile recombinant toxin A repeating units as a carrier protein for conjugate vaccines: studies
of pneumococcal type 14, Escherichia coli K1, and Schigella flexneri type 2a polysaccharides in mice.
Infection and Immunity, 68:2161-2166.
Pĕchinĕ S., Janoir C., Collignon A., 2005. Variability of Clostridium difficile surface proteins and specific
serum antibody responce in patients with Clostridium difficile associated disease. Journal of Clinical
Microbiology, 43(10): 5018-5025.
Pépin J., Valiquette L., Cossette B. 2005. Mortality attributable to nosocomial Clostridium difficile–
associated disease during an epidemic caused by a hypervirulent strain in Quebec. Canadian Medical
Association Journal, 173(9): 1037–1042.
Perelle S., Gilbert M., Bourlioux P.C., Popoff M.R. 1997. Production of a complete binary toxin (actin-
specific ADP ribosyltransferaze) by Clostridium difficile CD 196. Journal of Clinical Microbiology, 65(4):
1402-1407.
Petit L., Gibert M., Popoff M. 1999. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in
Microbiology, 7(3):104-10.
Pizza M., Masignani V., Rappuoli R. Bacterial toxins. 1997. V: Aktories K. (ed.), Bacterial toxins, tools in
cell biology and pharmacology, Chapman & Hall, Weinhheim; str. 299-340.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 104
Polekhina G., Giddings K.S., Tweten R.K., Parker M.W. 2005. Insight into the action of the superfamily of
cholesterol-dependent cytolysins from studies of intermedilysin. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 102(3):600-605.
Popoff M.R., Rubin E.J., Gill D.M., Boquet P. 1988. Actin-specific ADP-ribosyltransferase produced by a
Clostridium difficile strain. Infection and Immunity, 56:2299-2306.
Popoff M.R., Geny B. 2006. Bacterial protein toxins and lipids:pore formation or toxin entry into cells.
Biology of the Cell, 98: 667-678.
Qa'Dan M., Ramsey M., Daniel J., Spyres L.M., Safiejko-Mroczka B., Ortiz-Leduc W., Ballard J.D. 2002.
Clostridium difficile toxin B activates dual caspase-dependent and caspase-independent apoptosis in
intoxicated cells. Cell Microbiology, 4:425-434.
Reineke J., Tenzer S., Rupnik M., Koschinski A., Hasselmayer O., Schrattenholz A., Schild H., von Eichel-
Streiber C. 2007. Autocatalytic cleavage of Clostridium difficile toxin B.Nature, 446:415-419.
Reinert D.J., Jank T., Aktories K., Shulz G.E. 2005. Structural basis for the function of Clostridium difficile
toxin B. Journal of Molecular Biology, 351:973-981.
Riegler M., Sedivy R., Pothoulakis C., Hamilton G., Zacherl J., Bischof G., Cosentini E., Feil W., Schiessel
R., LaMont J.T., Wenzl E. 1995. Clostridium difficile toxin B is more potent than toxin A in damaging
human colonic epithelium in vitro. Journal of Clinical Investigation, 95:2004-2011.
Rolfe R.D. 1991. Binding kinetics of Clostridium difficile toxins A and B to intestinal brush border
membranes from infant and adult hamster. Infection and Immunity, 59(4):1223-1230.
Rouphael N.G., O'Donell J.A., Bhatnagar J., Lewis F., Polgreen P.M., Beekmann S., Guarner J., Killgore
G.E., Coffman B., Campbell J., Zaki S.R., McDonald L.C. 2008. Clostridium difficile-associated diarrhea:
An emerging threat to pregnant women. American Journal of Obstetrics and Gynecology, 198(6):635e1-
635e6.
Rubinsztein D.C., Gestwicki J.E., Murphy L.O., Klionsky D.J. 2007. Potential therapeutic applications of
autophagy. Nature Reviews Drug Discovery, 6:304–312.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 105
Rupnik M., Avesani V., Janc M., von Eichel-Streiber C., Delmee M. 1998. A novel toxinotyping scheme
and correlation of toxinotypes with serogroups of Clostridium difficile isolates. Journal of Clinical
Microbiology, 36(8): 2240-2247.
Rupnik M. 2001. How to detect Clostridium difficile variant strains in routine laboratory. Clinical
Microbiology and Infection, 7(8): 417-420.
Rupnik M., Grabnar M., Gerič B. 2003. Binary toxin producing Clostridium difficile strains. Anaerobe,
9(6): 289-294.
Rupnik M. 2007. Clostridium difficile toxinotypes. Maribor, Medicinska fakulteta. http://www.mf.uni-
mb.si/Mikro/tox/ (3.sept.2009): 8 str.
Rupnik M. 2008. Heterogeneity of large clostridial toxins: Importance of Clostridium difficile toxinotypes.
FEMS Microbiology Reviews, 32(3):541-555.
Rupnik M., Kotnik Kevorkijan B. 2009. Clostridium difficile: ali postaja pogostejši tudi v Sloveniji?
JAMA-SI,17(3):107-109.
Rupnik M., Wilcox M.H., Gerding D.N. 2009. Clostridium difficile infection: New developments in
epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology, 7(7):526-536.
Sambol S.P., Tang J.K., Merrigan M.M., Johnson S., Gerding D.N. 2001. Infection of hamster with
epidemiologically important strains of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases, 183:1760-
1766.
Sambol S.P., Merrigan M.M., Tang J.K., Johnson S., Gerding D.N. 2002. Colonization for the prevention
of Clostridium difficile disease in hamsters. The Journal of Infectious Diseases, 186(12):1781-1789.
Savidge T.C., Pan W.H., Newman P., O‘Brien M., Anton P.M., Pothoulakis C. 2003. Clostridium difficile
toxin B is an inflammatory enterotoxin in human intestine. Gastroenterology, 125:413-420.
Schwan C., Stecher B., Tzivelekidis T., van Ham M., Rohde M., Hardt W.D., Wehland J., Aktories K. 2009.
Clostridium difficile toxin CDT induces formation of microtubule-based protrusions and increases
adherence of bacteria. PLoS Pathogen 5(10):e1000626-1000626.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 106
Shatursky O., Heuck A.P., Shepard L.A., Rossjohn J., Parker M.W., Johnson A.E., Tweten R.K. 1999. The
mechanism of membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: A nove paradigm for pore
forming toxins. Cell 99:293-299.
Stare Geric B., Delmée M., Rupnik M. 2007. Variant forms of the binary toxin CDT locus and tcdC gene in
Clostridium difficile strains. Journal of Medical Microbiology, 56:329-335.
Steele J., Feng H., Parry N., Tzipori S. 2010. Piglet models for acute or chronic Clostridium difficile illness
(CDI). Journal of Infectious Disease, 201(3):428-434.
Steiner T.S., Flores C.A., Pizzaro T.T., Guerrant R.L. 1997. Fecal lactoferrin, interleukin1-beta, and
interleukin-8 are elevated in patients with severe Clostridium difficile colitis. Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology, 4(6):719-722.
Tan M.W., Rahme L.G., Sternberg J.A., Tompkins R.G. 1999. Pseudomonas aeroginosa killing of
Caenorhabditis elegans used to identify P. aeruginosa virulence factors. Proceedings of the National
Academy of Science, 96:2408-2413.
Tan K.S., Wee B.Y., Song K.P. 2001. Evidence for holin function of tcdE gene in the pathogenicity of
Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology, 50(7):613-619.
Toothaker R.D., Elmer G.W. 1984. Prevention of clindamycin-induced mortality in hamsters by
Saccharomyces boulardii. Antimicrobial Agents and Chemotherapeutics, 26(4):552-556.
Trombetta E.S., Mellman I. 2005. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual Review of
Immunology, 23:975-1028.
Tuomola E.M., Salminen S.J. 1998. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2
cell cultures International Journal of Food Microbiology, 41 (1):45-51.
Tweten R.K., Parker M.W., Johnson A.E. 2001. The cholesterol-dependent cytolysins. Current Topics in
Microbiology and Immunology, 257:15-33.
Tweten R.K., Melton J. 2006. Clostridium septicum pore-forming α-toxin.V:The Source Book of Bacterial
Protein Toxins (Alouf J.E., Popoff M.R., eds), Elsevier Academic press, Amsterdam, 34:623-630.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 107
Vaux D.L., Strasser A. 1995. The molecular biology of apoptosis. Proceedings of the National Academy of
Science 93: 2239-2244.
Viscidi R., Willey S., Bartlett J.G. 1981. Isolation rates and toxigenic potential of Clostridium difficile
isolates from various patient populations. Gastroenterology, 81(1):5-9.
von Eichel-Streiber C., Boquet P., Sauerborn M., Thelstam M. 1996. Large clostridial cytotoxins-a family
of glycosyltransferases modifying small GTP-binding proteins. Trends in Microbiology, 4(10):375-382.
Voth D.E., Ballard J.D. 2005. Clostridium difficile Toxins: Mechanism of Action and Role in Disease.
Clinical Microbiology Reviews, 18(2):247-263.
Wang J. 2008. Beclin 1 bridges autophagy, apoptosis and differentiation. Autophagy, 4(7):947-948.
Warny M., Kelly C.P. 1999. Monocytic cell necrosis is mediated by potassium depletion and caspase-like
proteases. American Journal of Physiology, 276:C717-C724.
Williams A., Jahreiss L., Sarkar S., Saiki S., Menzies F.M., Ravikumar B., Rubinsztein D.C. 2006.
Aggregate-prone proteins are cleared from the cytosol by autophagy: therapeutic implications. Current
Topics in Developmental Biology, 76:89–101.
Willingham M.C. 1999. Cytochemical methods for detection of apoptosis. Journal on Histochemistry and
Cytochemistry, 47(9):1101-1109.
Wilson K.H., Sheagren J.N. 1983. Antagonism of toxigenic Costridium difficile by nontoxigenic C. difficile.
The Journal of Infectious Diseases, 147(4):733-736.
Wilson K.H., Sheagren J.N., Freter R. 1985. Population dynamics of ingested Clostridium difficile in the
gastrointestinal tract of the Syrian hamster. The Journal of Infectious Diseases, 151(2):355-361.
Wu K., Conly J., McClure J.A., Elsayed S., Louie T., Zhang K. 2009. Caenorhabditis elegans as a host
model for community-asociated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology
Infection, 16:245-254.
Yamamoto K., Ichinose Y., Shinagawa H., Makino K., Nakata A., Iwanaga M., Honda T., Miwatani T.
1990.Two-step processing for activation of the cytolysin/hemolysin of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor:
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 108
nucleotide sequence of the structural gene (hlyA) and characterization of the processed products. Infection
and Immunity, 4106-4116.
Yeh C.Y., Lin C.N., Chang C.H., Lin C.H., Lien H.T., Chen J.Y., Chia J.S. 2008. C-terminal repeats of
Clostridium difficile toxin A induce production of chemokine and adhesion molecules in endothelial cells
and promote migration of leukocytes. Infection and Immunity, 76:1170-1178.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 109
8 ZAHVALA
Iskrena hvala mentorici prof. dr. Maji Rupnik za priloţnost, za izčrpno znanje, ki sem ga
lahko deleţna, za pomoč pri iskanju odgovorov na številna vprašanja in za izoblikovanje
mojih ciljev. Hvala za nesebično vodenje, razumevanje in skrb za razvoj moje poti v svet
znanosti.
Najlepša hvala prof. dr. Gregorju Anderluhu za natančen in učinkovit pregled
doktorskega dela, za delo v laboratoriju, usmeritve in sodelovanje.
Doc. dr. Saši Lipovšek bi se prav tako zahvalila za natančen in učinkovit pregled
doktorskega dela. Hvala za prijazne in vzbodbudne besede in za nova pričakovanja.
Hvala prof. dr. Ignaziu Castagliuolu za delo v laboratoriju na Oddelku za histologijo,
mikrobiologijo in medicinsko tehnologijo Univerze v Padovi. Z veseljem sem zbirala in
gradila novo znanje, delovne in ţivljenjske izkušnje. Hvala za sodelovanje pri nastajanju
večine tega dela.
Vsem zaposlenim na Centru za mikrobiologijo Zavoda za zdravstveno varstvo Maribor bi
se rada zahvalila za vrnjeno prijaznost, mikrobiološke nasvete, pomoč in sproščeno
razpoloţenje.
Katji in Mojci hvala za napolnitev zaloge energije, za drobne, a zelo koristne delovne
nasvete.
Tomaţ, hvala za zbiranje poučnih računalniških informacij in pomoč pri oblikovanju
naloge.
Sandra, Valerija, Tomaţ, Jure, Aleksander, Sara, Mateja, Beata in Niall, hvala za
druţenje in raziskovalno ustvarjanje. Lepo je prihajati vsak dan na Oddelek za
raziskovalno dejavnost, poleg dela samega, prav zaradi vas. Hvala za zaupanje, smeh,
sproščeno vzdušje, pripravljenost pomagati, za pripombe, za kritične pogovore, nova
premišljevanja in nove izzive.
Hvala Ines za pomoč pri celicah in ţivalskih modelih kot tudi Nataši za druţenje in
pestrost pri mojih prvih delovnih začetkih.
HVALA moji druţini in prijateljem. Za velikodušno poslušanje količine mojega
govorjenja, da doţiveto radost in srečo lahko delim z vami, da vedno znova verjamete
vame, mi dajete prostor in svobodo, da sem to, kar sem.
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 110
9 PRILOGE
9.1 ČLANEK KOT DEL DOKTORSKE NALOGE
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 111
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 112
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 113
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 114
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 115
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 116
9.2 ŢIVLJENJEPIS
OSEBNI PODATKI
Ime in priimek: Mateja Zemljič
Datum rojstva: 24.03.1980
Naslov: Borštnikova 100, 2000 Maribor
ZAPOSLITEV
mlada raziskovalka na Oddelku za raziskovalno dejavnost, na Centru za mikrobiologijo na Zavodu za
zdravstveno varstvo Maribor pri mentorici prof. dr. Maji Rupnik
asistentka za predmetno področje mikrobiologija na Medicinski fakulteti Univerze v Mariboru
IZOBRAZBA
2006-2010: Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, podiplomski študij Biomedicinska tehnologija
Univerze v Mariboru
1999-2006: Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta, doktorica veterinarske medicine
1995-1999: Prva gimnazija Maribor, gimnazijski maturant
NAGRADE
Prešernova nagrada za delo Dokazovanje virusa mačje imunske pomanjkljivosti (FIV) in virusa mačje
levkoze (FeLV) s testom ELISA in metodo veriţne reakcije s polimerazo (pcr) (2005)
ZNANJA
tuji jeziki:
angleščina-aktivno
nemščina-pasivno
italijanščina-pasivno
računalništvo:
Word, Excel, internet, elektronska pošta
PEDAGOŠKO DELO
2010/2011: Izvedba vaj pri predmetu Mikrobiologija za študente 2.letnika dodiplomskega študija "Splošna
Medicina" na Medicinski fakulteti Univerze v Mariboru
2009/2010: Izvedba vaj pri predmetu Mikrobiologija za študente 2.letnika dodiplomskega študija "Splošna
Medicina" na Medicinski fakulteti Univerze v Mariboru
IZOBRAŢEVANJE V TUJINI
27.10.2009 – 7.11.2010: izobraţevanje na Univerzi na Dunaju, Oddelku za mikrobiologijo in
imunobiologijo
01.07.2008 – 11.6.2009: izobraţevanje na Univerzi v Padovi, Oddelku za histologijo, mikrobiologijo in
medicinsko tehnologijo
3.12. – 9.12.2006: delovni obisk na Centre for Biomolecular Sciences, School of Molecular Medical
Sciences, University of Nottingham
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 117
9.3 OSEBNA BIBLIOGRAFIJA ZA OBDOBJE 1996-2010
MATEJA ZEMLJIČ [28598]
Osebna bibliografija za obdobje 1996-2010
ČLANKI IN DRUGI SESTAVNI DELI
1.01 Izvirni znanstveni članek
1. TOZON, Nataša, NEMEC, Alenka, ZEMLJIČ, Mateja, ZAKOŠEK, Maja, BARLIČ-
MAGANJA, Darja. High prevalence of feline immunodeficiency virus (FIV) and feline
leukemia virus (FeLV) in Slovenia. Acta vet. (Beogr.), 2008, vol. 58, no. 2/3, str. 191-201.
[COBISS.SI-ID 2946170]
2. ZIDARIČ, Valerija, ZEMLJIČ, Mateja, JANEŢIČ, Sandra, KOCUVAN, Aleksander,
RUPNIK, Maja. High diversity of Clostridium difficile genotypes isolated from a single
poultry farm producing replacement laying hens. Anaerobe (Lond. Engl.), 2008, issue 6,
vol. 14, str. 325-327. [COBISS.SI-ID 651807]
3. AVBERŠEK, Jana, JANEŢIČ, Sandra, PATE, Mateja, RUPNIK, Maja, ZIDARIČ,
Valerija, LOGAR, Katarina, VENGUŠT, Modest, ZEMLJIČ, Mateja, PIRŠ, Tina,
OCEPEK, Matjaţ. Diversity of Clostridium difficile in pigs and other animals in Slovenia.
Anaerobe (Lond. Engl.), 2009, vol. 15, no. 6, str. 252-255, doi:
10.1016/j.anaerobe.2009.07.004. [COBISS.SI-ID 3096186]
tipologija 1.08 -> 1.01
4. ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja, SCARPA, Melania, ANDERLUH, Gregor, PALÙ,
Giorgio, CASTAGLIUOLO, Ignazio. Repetitive domain of Clostridium difficile toxin B
exhibits cytotoxic effects on human intestinal epithelial cells and decreases epithelial
barrier function. Anaerobe (Lond. Engl.), 2010, vol. 16, issue 5, str. 527-532.
http://dx.doi.org/10.1016/j.anaerobe.2010.06.010, doi: 10.1016/j.anaerobe.2010.06.010.
[COBISS.SI-ID 2248783]
1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci
5. ZIDARIČ, Valerija, RUPNIK, Maja, AVBERŠEK, Jana, ZEMLJIČ, Mateja,
JANEŢIČ, Sandra, PIRŠ, Tina, OCEPEK, Matjaţ. Prevalence and diversity of
Clostridium difficile in poultry, pigs and calves. V: 9th biennial congress of the anaerobe
society of the Americas, 2008. Anaerobe 2008. Long Beach: Anaerobe society of the
Americas, 2009, session XIV, str. 12. [COBISS.SI-ID 2976122]
6. ZIDARIČ, Valerija, JANEŢIČ, Sandra, ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja.
Clostridium difficile genotypes isolated from animals. V: BARLIČ-MAGANJA, Darja
(ur.), RASPOR, Peter (ur.). 4th Congress of the Slovenian Microbiological Society with
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 118
International Participation, Portoroţ, November 2008. Microbiology for today : book of
abstracts = zbornik povzetkov. Ljubljana: Slovensko mikrobiološko društvo: = Slovenian
Microbiological Society, 2008, str. 125. [COBISS.SI-ID 660255]
7. ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja, SCARPA, Melania, BRUN, Paola, PALU,
Giorgio, CASTAGLIUOLO, Ignazio. N-terminal repetitive domain of Clostridium
difficiele toxin B exhibits cytopathic effects on human intestinal epithelial cells. V:
GOLIČNIK, Marko (ur.), BAVEC, Aljoša (ur.). Joint Congress of the Slovenian
Biochemical Society and the Genetic Society of Slovenia with International Participation,
Otočec, September 20-23, 2009. Book of abstracts. Ljubljana: Slovenian Biochemical
Society: Genetic Society of Slovenia, 2009, str. 151. [COBISS.SI-ID 26105817]
8. ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja, SCARPA, Melania, BRUN, Paola, PALU,
Giorgio. Repetitive domain of Clostridium difficile toxin B exhibits cytopathic effectson
human intestinal epithelial cells. V: GOLIČNIK, Marko (ur.), BAVEC, Aljoša (ur.). Joint
Congress of the Slovenian Biochemical Society and the Genetic Society of Slovenia with
International Participation, Otočec, September 20-23, 2009. Book of abstracts. Ljubljana:
Slovenian Biochemical Society: Genetic Society of Slovenia, 2009, str. 152.
[COBISS.SI-ID 26130393]
9. ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja, SCARPA, Melania, BRUN, Paola, PALÙ,
Giorgio, CASTAGLIUOLO, Ignazio. Biological effects of C-terminal repetitive domain
of Clostridium difficile toxin B. V: 6th ClostPath International Conference, Rome, 19-23
October 2009, Istituto Superiore di Sanitá, Hall Pocchiari. Clostridia : the impact of
genomics on disease control, str. 108 (P50). [COBISS.SI-ID 512095032]
MONOGRAFIJE IN DRUGA ZAKLJUČENA DELA
2.12 Končno poročilo o rezultatih raziskav
10. ZEMLJIČ, Mateja, ZAKOŠEK, Maja. Dokazovanje virusa mačje imunske
pomanjkljivosti (FIV) in virusa mačje levkoze (FeLV) s testom ELISA in metodo verižne
reakcije s polimerazo (PCR) = Feline immunodeficiency virus (FIV) and feline leukemia
virus (FeLV) detectionby ELISA and polymerase chain reaction (PCR). Ljubljana:
[Mateja Zemljič, Maja Zakošek], 2005. 82 f., ilustr., tab. [COBISS.SI-ID 2463354]
SEKUNDARNO AVTORSTVO
Urednik
11. RUPNIK, Maja (ur.), JANEŢIČ, Sandra (ur.), ZEMLJIČ, Mateja (ur.). Abstract
book : www.mf.uni-mb/mikro/icds2010. Maribor: Zavod za zdravstveno varstvo, cop.
2010. 181 str. ISBN 978-961-90895-3-8. [COBISS.SI-ID 65519105]
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 119
NERAZPOREJENO
12. BRAČKO, Judita, PURG, Karmen, ŠTUKOVNIK, Vita, ZAKRAJŠEK, Jure,
ZEMLJIČ, Mateja, ŢALIK, Estera. Primerjava strukture naslovov v dnevnikih (Delo,
Večer), tedniku 7D in mesečniku Moj pes, (I. gimnazija, Maribor, Raziskovalne naloge).
Maribor: [s. n.], 1996. 43 f., graf. prikazi. [COBISS.SI-ID 4982792]
13. ŠTUKOVNIK, Vita, ZEMLJIČ, Mateja. Stilno zaznamovane besede v naslovih
dnevnika Večer in tednika Nedeljski dnevnik, (I. gimnazija, Maribor, Raziskovalne
naloge). Maribor: [s. n.], 1997. 98 f., graf. prikazi, obrazci. [COBISS.SI-ID 6174728]
14. MAUKO, Bojana, ZEMLJIČ, Mateja. Samostalniški in pridevniški zaimki v
mariborskem pogovornem jeziku : slovenski jezik : raziskovalna naloga. Maribor: Prva
gimnazija, 1998. 23 f., graf. prikazi. [COBISS.SI-ID 7529992]
Vir bibliografskih zapisov: Vzajemna baza podatkov COBISS.SI/COBIB.SI
Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.
Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 120
UNIVERZA V MARIBORU
MEDICINSKA FAKULTETA
IZJAVA DOKTORSKEGA KANDIDATA
Podpisana Mateja Zemljič, vpisna številka 30803375
izjavljam,
da je doktorska disertacija z naslovom
Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile
rezultat lastnega raziskovalnega dela,
da so rezultati korektno navedeni in
da nisem kršil-a avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih.
Podpis doktorske kandidatke: