MIKROBIOLOGIJA IN BIOTEHNOLOGIJA HRANE - bf.uni-lj.si · MIKROBIOLOGIJA IN BIOTEHNOLOGIJA HRANE. NAVODILA IN DELOVNI ZVEZEK ZA II. DEL LABORATORIJSKIH VAJ 5 pijačam, najprej izmerimo

Barbara Jeršek

2016

MIKROBIOLOGIJA IN

BIOTEHNOLOGIJA HRANE NAVODILA IN DELOVNI ZVEZEK ZA II. DEL

LABORATORIJSKIH VAJ

MIKROBIOLOGIJA IN BIOTEHNOLOGIJA HRANE. NAVODILA IN DELOVNI ZVEZEK ZA II. DEL LABORATORIJSKIH VAJ

I

Barbara Jeršek Mikrobiologija in biotehnologija hrane Navodila in delovni zvezek za II. del laboratorijskih vaj Izdajatelj: Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo CI - Kat zapis o publikaciji CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 579.67(075.8)(076.5)(0.034.2) JERŠEK, Barbara Mikrobiologija in biotehnologija hrane [Elektronski vir] : navodila in delovni zvezek za II. del laboratorijskih vaj / Barbara Jeršek. - El. knjiga. - Ljubljana : Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2016 Način dostopa (URL): http://www.bf.uni-lj.si/knjiznice/knjiznica-odd-za-zivilstvo/ucbeniki-v-elektronski-obliki ISBN 978-961-6908-08-5 (pdf) 284320512 Ljubljana, april 2016

Vse pravice pridržane. Noben del te publikacije se ne sme reproducirati ali uporabiti na kakršenkoli drug način (grafični, elektronski ali mehanski, vključno s fotokopiranjem, snemanjem ali prenosom v

baze podatkov) brez pisnega soglasja nosilca avtorskih pravic.


II

KAZALO VSEBINE

1 VAJA: MIKOTOKSIGENE PLESNI V ŽIVILU ............................................................................. 4

1.1 NAMEN ................................................................................................................................................ 4

1.2 POTEK EKSPERIMENTALNEGA DELA ............................................................................................. 4

1.3 NAVODILA ........................................................................................................................................... 4

1.3.1 IZOLACIJA PLESNI IZ ŽIVILA S KLASIČNIMI MIKROBIOLOŠKIMI METODAMI .......................................... 4

1.3.1.1 HOMOGENIZACIJA .............................................................................................................................. 4

1.3.1.2 TEHTANJE IN PRIPRAVA OSNOVNE (MATIČNE) RAZTOPINE......................................................... 4

1.3.1.3 . PRIPRVA RAZREDČITEV VZORCA ................................................................................................... 5

1.3.1.4 IZOLACIJA IN KVANTIFIKACIJA PLESNI ............................................................................................ 5

1.3.2 IDENTIFIKACIJA PLESNI ............................................................................................................................... 6

1.3.3 DOLOČITEV POTENCIALNO MIKOTOKSIGENIH PLESNI ........................................................................... 7

1.3.4 DOLOČITEV MIKOTOKSINA S TENKOPLASTNO KROMATOGRAFIJO (tlc) ............................................... 7

1.3.4.1 DOLOČITEV TVORBE OTA S TLC....................................................................................................... 8

1.3.4.2 DOLOČITEV TVORBE AFB1 S TLC ..................................................................................................... 8

1.4 DELOVNI ZVEZEK .............................................................................................................................. 9

1.4.1 IZVEDBA ......................................................................................................................................................... 9

1.4.2 MATERIAL, POTEK DELA IN REZULTATI ................................................................................................... 10

2 VAJA: AKTIVNOST RAZKUŽILA ............................................................................................. 14

2.1 NAMEN .............................................................................................................................................. 14

2.2 POTEK EKSPERIMENTALNEGA DELA ........................................................................................... 14

2.3 NAVODILA ......................................................................................................................................... 14

2.3.1 PRIPRAVA RAZKUŽILA ............................................................................................................................... 14

2.3.2 PRIPRAVA BAKTERIJSKIH KULTUR .......................................................................................................... 14

2.3.3 INOKULACIJA IN DOLOČITEV PREŽIVELOSTI .......................................................................................... 14

2.3.4 BAKTERICIDNA AKTIVNOST ...................................................................................................................... 15

2.3.5 KOMERCIALNI PODATKI O RAZKUŽILU .................................................................................................... 15

2.4 DELOVNI ZVEZEK ............................................................................................................................ 16

2.4.1 IZVEDBA ....................................................................................................................................................... 16

2.4.2 MATERIAL, POTEK DELA IN REZULTATI ................................................................................................... 17

3 VAJA: PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST ............................................................................. 19

3.1 NAMEN .............................................................................................................................................. 19

3.2 POTEK EKSPERIMENTALNEGA DELA ........................................................................................... 19

3.3 NAVODILA ......................................................................................................................................... 19

3.3.1 PRIPRAVA BAKTERIJ IN PLESNI ............................................................................................................... 19

3.3.2 PRIPRAVA OSNOVNE IN DELOVNE RAZTOPINE PROTIMIKROBNE SNOVI .......................................... 19

3.3.3 IZVEDBA RAZREDČEVANJA V MIKROTITRSKI PLOŠČICI ZA BAKTERIJE ............................................. 19


III

3.3.3.1 NAČRT IZVEDBE ................................................................................................................................ 19

3.3.3.2 IZVEDBA ............................................................................................................................................. 20

3.3.3.3 ODČITAVANJE MIC ............................................................................................................................ 21

3.3.3.4 DOLOČITEV MBC ............................................................................................................................... 22

3.3.4 IZVEDBA RAZREDČEVANJA V MIKROTITRSKI PLOŠČICI ZA PLESNI .................................................... 22

3.4 DELOVNI ZVEZEK ............................................................................................................................ 23

3.4.1 IZVEDBA RAZREDČEVANJA V MIKROTITRSKI PLOŠČICI ZA BAKTERIJE ............................................. 23

3.4.2 MATERIAL, POTEK DELA IN REZULTATI ZA BAKTERIJE ......................................................................... 24

3.4.3 IZVEDBA RAZREDČEVANJA V MIKROTITRSKI PLOŠČICI ZA PLESNI .................................................... 26

3.4.4 MATERIAL, POTEK DELA IN REZULTATI ZA PLESNI ............................................................................... 27

4 NAVODILA ZA VARNO DELO ................................................................................................. 29

5 VIRI .......................................................................................................................................... 30

KAZALO SLIK

Slika 1: SHEMA GOJIŠČ IN TEMPERATUR INKUBACIJE ZA IDENTIFIKACIJO PLESNI (1, 2:

oznaki izolatov) ................................................................................................................................. 7

Slika 2: SHEMA TLC ......................................................................................................................... 8

Slika 3: SHEMA MIKROTITRSKE PLOŠČICE ZA IZVEDBO METODE RAZREČEVANJA; (A) OZNAKE, (B) KONCENTRACIJE .................................................................................................... 20

Slika 4: PRIMER ODČITAVANJA VREDNOSTI MIC ....................................................................... 21


4

1 VAJA: MIKOTOKSIGENE PLESNI V ŽIVILU

1.1 NAMEN

V vzorcu živila določite, ali vsebuje plesni, ki tvorijo ohratoksin A ali aflatoksin B1.

1.2 POTEK EKSPERIMENTALNEGA DELA

• Določite prisotnost plesni na/v živilu

• Identificirajte izbrane plesni

• Določite potencialno mikotoksigene plesni

• Določite tvorbo ohratoksina A in aflatoksina B

• Ovrednotite rezultate

1.3 NAVODILA

1.3.1 IZOLACIJA PLESNI IZ ŽIVILA S KLASIČNIMI MIKROBIOLOŠKIMI METODAMI

1.3.1.1 HOMOGENIZACIJA

Da bi zagotovili kar najbolj enakomerno porazdelitev mikroorganizmov uporabimo homogenizacijo

vzorca. Za določitev plesni na živilu le-tega aseptično na Al-foliji razrežemo, zdrobimo na več

manjših delov. Za določitev plesni v živilu le tega razkužimo z 70 % etanolom (na primer oreh v lupini, potopimo v etanol), nato živilo aseptično razrežemo, zdrobimo. Homogeniziramo celoten

vzorec ali najmanj 100 g oziroma 50 g odvisno od vrste vzorca in vrste mikrobiološke preiskave. Za homogenizacijo uporabimo električno mešalo z rezili ali gnetilnik in aseptično tehniko dela.

1.3.1.2 TEHTANJE IN PRIPRAVA OSNOVNE (MATIČNE) RAZTOPINE

Glede na vrsto mikrobiološke preiskave aseptično tehtamo določeno maso homogeniziranega

vzorca z natančnostjo ± 0,1 g.

Za kvantitativne mikrobiološke preiskave pripravimo osnovno ali matično raztopino. Pripravimo jo

zato, da zagotovimo čim bolj enakomerno razporeditev mikroorganizmov v preiskovani količini živila.

Odtehtamo preiskovano maso ali odmerimo volumen živila v sterilno čašo ali sterilno plastično vrečko, dodamo devetkratno količino topila in suspenzijo homogeniziramo (ISO 6887-1: 1999(E)).

Matična raztopina pomeni 10-1 razredčitev živila. Če ni posebnih predpisov, je najmanjša količina preiskovanega živila 10 g (ml) oziroma 20 g (ml). 10 g (ml) vzorca aseptično dodamo 90 ml topila

(oziroma 20 g (ml) in dodamo 180 ml topila). Tako dobimo osnovno razredčitev (R = 10-1). Vzorec homogeniziramo z gnetilnikom ali mešalom. V nekaterih primerih 50 g (ml) vzorca dodamo 450 ml

topila.

Kot topilo lahko uporabimo peptonsko vodo, puferirano peptonsko vodo (ISO 6887-1: (1999)),

fosfatni pufer ali fiziološko raztopino. Pri živilih z visokim deležem maščob, na primer pri surovem

maslu, smetani, sirih, sladoledu, uporabimo namesto fiziološke raztopine 2 % raztopino natrijevega citrata, ki jo segrejemo na 45 oC. Kislim živilom, na primer sadnemu soku, sirupu, osvežilnim


5

pijačam, najprej izmerimo pH, nato pa 100 ml vzorca nevtraliziramo z 0,1 N raztopino KOH. Matično

raztopino pripravimo iz nevtraliziranega vzorca.

1.3.1.3 . PRIPRVA RAZREDČITEV VZORCA

Naslednjo 10-kratno razredčitev vzorca pripravimo tako, da določenemu volumnu osnovne

razredčitve (1 ml) dodamo v devetkraten volumen topila (9 ml). Tako dobimo 100-kratno razredčitev vzorca (R = 10-2). Razredčevanje ponavljamo tolikokrat, da dobimo ustrezno razredčitev vzorca, ki je

odvisna od števila mikroorganizmov ali mikrobiološkega kriterija. Z razredčitvami živila se zmanjšuje količina preiskovanega vzorca in število mikroorganizmov v enoti volumna. Za pripravo razredčitev

vzorca uporabimo enako topilo kot za pripravo matične raztopine. Čas od priprave matične raztopine do mikrobiološke preiskave naj ne bo daljši od 45 minut. Razredčitve naj bodo pripravljene v prvih

30-ih minutah.

1.3.1.4 IZOLACIJA IN KVANTIFIKACIJA PLESNI

Razredčitve vzorca cepimo na/v ustrezno trdno ali tekoče gojišče. Za izolacijo plesni lahko uporabimo gojišča DRBC (ang. Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol; gojišče z barviloma

dikloran rdeče in bengal ter klormfenikolom), OGY (ang. Oxytetracyclin Glucose Yeast Agar, gojišče z glukozo, kvasnim ekstraktom in oksitetraciklinom), MEA (ang. Malt Extract Agar, gojišče s sladnim

ekstraktom) in DG-18 (angl. Dichloran Glycerol, gojišče z dikloranom in glicerolom). Gojišči DRBC in OGY se uporabljata za izolacijo in kvantifikacijo plesni iz živil, ki vsebujejo tudi večje koncentracije

bakterij, saj vsebujeta antibiotik, ki njihovo rast zavira. Gojišče MEA uporabljamo za izolacijo in kvantifikacijo plesni in kvasovk iz živil. Vsebuje sladni ekstrakt in pepton, dodano pa ima tudi mlečno

kislino, ki inhibira rast bakterij (pH gojišča 3,5). Gojišče DG-18 se uporablja za izolacijo in kvantifikacijo kserofilnih plesni iz suhih in pol-suhih živil (sušeno sadje, kandirano sadje, začimbe,

žita, mesni in ribji izdelki). Gojišče DG-18 vsebuje pepton kot vir dušika, glukozo kot vir energije,in vitamine ter minerale potrebne za rast gliv. V gojišču so tudi dikloran, ki inhibira razširjanje kolonij, kloramfenikol in klor-tetraciklin, ki inhibirata rast bakterij. V gojišču je 18 % (w/w) glicerola, ki zniža

aw (aktivnost vode) iz 0,999 na 0,95. Gojišči MEA in DG-18 z vzorci 7 dni inkubiramo pri 25 oC.

Po inkubaciji izolacijskega gojišča pri določeni temperaturi in po določenem času rezultate kvantificiramo. Primeri:

• Če za izolacijo uporabimo trdno vnaprej v petrijevko (2r = 90 mm) razlito gojišče, potem nanj

cepimo 0,1 ml razredčitve vzorca in ga s sterilno stekleno palčko enakomerno nanesemo po vsej površini.

• Če za izolacijo nimamo vnaprej razlitega trdnega gojišča, cepimo 1 ml razredčitve vzorca v sterilno prazno petrijevko. Trdno gojišče raztopimo, ohladimo na 45 oC v vodni kopeli in v

petrijevko z vzorcem dodamo 15 ml gojišča. Vzorec z gojiščem takoj premešamo »3x gor-dol, 3xlevo-desno«.

Po inkubaciji trdnega izolacijskega gojišča, preštejemo značilne kolonije v tistih petrijevkah, kjer je

zrastlo števno število kolonij (splošno velja, da je števna plošča za bakterije 15 – 300 kolonij, števna

plošča za plesni 15 – 150 kolonij). Pri izračunu števila mikroorganizmov v 1 g ali 1 ml vzorca (cfu/g, cfu/ml) upoštevamo povprečno število kolonij in razredčitev.

Primeri:


6

• Če imamo števne plošče-gojišča pri več razredčitvah vzorca, izračunamo število

mikroorganizmov po naslednji formuli:

• Če imamo števne plošče-gojišča le pri eni razredčitvi vzorca, izračunamo število mikroorganizmov po naslednji formuli:

• Če so plošče-gojišča pri vseh razredčitvah neštevne, podamo rezultat kot oceno števila

mikroorganizmov, ki jo izračunamo po naslednji formuli:

1.3.2 IDENTIFIKACIJA PLESNI

Po inkubaciji gojišč MEA in DG-18 opišemo rezultate in izberemo posamezne kolonije plesni za njihovo identifikacijo. Za identifikacijo plesni pripravimo suspenzijo v 0,5 % agarju s Tweenom (AT)

tako, da s cepilno zanko spore posamezne plesni prenesemo v AT.

Za vsako plesen nato precepimo spore plesni na naslednja gojišča: CYA (angl. Czapek yeast extract agar), MEA, G25N (25 % Glicerol nitratni agar) (Pitt in Hocking, 1997) po shemi na sliki 1.

N število mikroorganizmov v vzorcu (cfu/ml, cfu/g) ΣC vsota vseh kolonij na števnih ploščah n1 število petrijevk-gojišč pri prvi razredčitvi vzorca n2 število petrijevk-gojišč pri drugi razredčitvi vzorca R prva razredčitev vzorca, pri kateri smo prešteli kolonije

N število mikroorganizmov v vzorcu (cfu/ml, cfu/g) np povprečno število kolonij R razredčitev vzorca, pri kateri smo prešteli kolonije

N* < 1/R N* ocena števila mikroorganizmov v vzorcu (cfu/ml, cfu/g) R najmanjša razredčitev vzorca z naštevnimi ploščami


7

SLIKA 1: SHEMA GOJIŠČ IN TEMPERATUR INKUBACIJE ZA IDENTIFIKACIJO PLESNI (1, 2: OZNAKI IZOLATOV)

Po 7-dnevni inkubaciji določimo za vsak izolat na gojiščih prikazanih na sliki 1 makromorfološke

lastnosti (velikost kolonije – premer-2r, barvo substratnega micelija, strukture substratnega micelija, barvo(e) zračnega micelija, strukturo zračnega micelija, tvorbo eksudata) in mikromorfološke

lastnosti vidne z lupo pri 40x povečavi (tvorba kleistotecijev, askusov) in na nativnem barvnem preparatu pri 400x in 1000x povečavi (septiranost micelija, tvorba in izgled askospor, tvorba

sporngiospor ali konidijev, vrsta konidiogenih celic, izgled konidijev, apeks, metula, fialida, kleistotecij z askosporami). Nativni barvni preparat pripravimo v kapljici vode, dodamo z lakto-fuksin,

pokrijemo s krovnim steklcem in odvečno barvilo pobrišemo s papirnato brisačo. Podrobna navodila in ključi za identifikacijo so v Pitt in Hocking (1997) in Samson in sod. (2000). Po zaključenem

mikroskopiranju preparate dekontaminiramo v raztopini NaOCl (18 %) in očistimo objektive na mikroskopu.

1.3.3 DOLOČITEV POTENCIALNO MIKOTOKSIGENIH PLESNI

Glede na vrsto identificiranih plesni nato iz literature predvidimo, kateri od izolatov lahko tvorijo

mikotoksine in kateri bi lahko tvoril ohratoksin A in/ali aflatoksin B1. Te izolate precepimo na gojišče YES (Yeast Succrose Agar) in MEA ali CYA ali DG-18 kot je opisano pri točki 2 in inkubiramo 7-28

dni pri 25 oC.

1.3.4 DOLOČITEV MIKOTOKSINA S TENKOPLASTNO KROMATOGRAFIJO (TLC)

Pri delu z mikotoksini je obvezna uporaba zaščitnih sredstev! Ves material, ki pride v stik z mikotoksinom odvržemo v pripravljene raztopine NaOCl! Z vsemi topili ravnamo kot z nevarnimi

snovmi in delo opravimo v digestoriju.

1. Glede na vrsto mikotoksina, ki ga določamo s TLC pripravimo najprej mešanico topil – mobilno fazo (200 ml za veliko komoro, 20 ml za malo komoro).

2. Kot stacionarno fazo uporabimo ploščo TLC (TLC Silica gel 60 F294), ki je sestavljena iz nosilca (aluminijeva pločevina ali steklo) z naneseno tanko plastjo stacionarne faze (silikagel

in aluminijev oksid). 3. Na ploščo TLC s svinčnikom rahlo označimo spodnjo črto (2,5 cm od spodnjega roba) in na

njej označimo vzorce v razmiku po 1,5 cm (slika 2).


8

4. Vedno na prvo mesto (S) nanesemo standardno raztopino mikotoksina (5 µl) – pri tem

moramo vzorec nanesti zelo pazljivo tako, da je premer lise manjši od 3 mm 5. Nato nanesemo na mesta V1, V2, V3, W vzorce čepov plesni. Vsak vzorec plesni nanesemo

3x. 6. Ko zaključimo z nanosom vzorcev v digestoriju odparimo topilo.

7. Ploščo z vzorci zelo previdno postavimo v komoro z mobilno fazo, komoro pokrijemo ter počakamo, da zaradi kapilarnega tlaka mobilna faza pripotuje skoraj do vrha plošče.

8. Ploščo vzamemo iz komore in počakamo, da topilo odpari v digestoriju. 9. Z UV-svetlobo (366 nm) osvetlimo ploščo tako, da postanejo lise vidne in jih označimo.

Izmerimo razdalje, ki jih prepotuje posamezna spojina. 10. Nato izmerimo razdalje (d), ki jih prepotujejo posamezne spojine in mobilna faza in

izračunamo retencijske faktorje. Količnik med razdaljo, ki jo prepotuje posamezna spojina in tisto, ki jo prepotuje mobilna faza imenujemo retencijski faktor (Rf):

Rf = d spojina / d Mobilna faza

SLIKA 2: SHEMA TLC

TLC se lahko uporablja kot hitrejša presejalna metoda za oceno tvorbe posameznih mikotoksinov in pri natančni izvedbi lahko poda semi-kvantitativne podatke.

1.3.4.1 DOLOČITEV TVORBE OTA S TLC

Za določitev tvorbe OTA pripravimo mešanico topil – mobilno fazo: TEF v razmerju 5:4:1 (toluen, etil

acetat, mravljinčna kislina). Na ploščo TLC s svinčnikom rahlo označimo spodnjo črto (2,5 cm od spodnjega roba) in na njej označimo vzorce, ki jih bomo nanesli v razmiku po 1,5 cm (slika 2). Vedno

nanesemo na 1, 3, 5, W mesto standardno raztopino OTA (5 µl s koncentracijo 1 µg/ml) in nato vzorce čepov plesni. Postopek nadaljujemo po opisu pri točki 1.3.4.

1.3.4.2 DOLOČITEV TVORBE AFB1 S TLC

Za določitev tvorbe aflatoksina B1 pripravimo mešanico topil – mobilno fazo: KAC v razmerju 9:1

(kloroform:aceton). Na ploščo TLC s svinčnikom rahlo označimo spodnjo črto (2,5 cm od spodnjega roba) in na njej označimo vzorce, ki jih bomo nanesli v razmiku po 1,5 cm (slika 2). Vedno nanesemo

na 1, 3, 5, W mesto standardno raztopino aflatoksina B1 (5 µl s koncentracijo 1 µg/ml) in nato vzorce čepov plesni. Postopek nadaljujemo po opisu pri točki 1.3.4.


9

1.4 DELOVNI ZVEZEK

1.4.1 IZVEDBA

Narišite shemo eksperimentalnega dela!


10

1.4.2 MATERIAL, POTEK DELA IN REZULTATI

1. Opis živila v/na katerem določate plesni

2. Opis izolacije plesni iz živila

3. Določitev plesni v živilu s klasičnimi mikrobiološkimi metodami - kvalitativni in kvantitativni opis

plesni izoliranih na gojišču za izolacijo; izbira in oznaka izolatov za identifikacijo


11

4. Identifikacija plesni

V preglednico vpišite makromorfološke lastnosti izolata z oznako WWWW..

Gojišče Makromorfološke lastnosti

MEA

25 oC

2r:

SM:

ZM:

EK:

CYA 25 oC

2r:

SM:

ZM:

EK:

CYA 37 oC

2r:

SM:

ZM:

EK:

CYA

5 oC

2r:

SM:

ZM:

EK:

G25N

25 oC

2r:

SM:

ZM:

EK:

Legenda: 2r: premer kolonije; SM: substratni micelij; ZM: zračni micelij; EK: eksudat


12

Mikromorfološke lastnosti izolata z oznako WWWWWWWWWW.so:

Izolat je identificiran kot plesni vrste WWWWWWWW.WWWWWWWWWWWWWW..

V preglednico vpišite identificirane plesni in dodajte literatutrne podatke o njihovi tvorbi mikotoksinov.

Vrsta plesni Mikotoksini


13

5. Določitev tvorbe OTA s TLC - narišite shemo plošče TLC, izmerite razdalje, izračunajte retencijske

faktorje in opišite rezultate!

6. Določitev tvorbe AFB1 s TLC - narišite shemo plošče TLC, izmerite razdalje, izračunajte retencijske faktorje in opišite rezultate!


14

2 VAJA: AKTIVNOST RAZKUŽILA

2.1 NAMEN

Z razredčevalno-nevtralizacijsko metodo določite, ali ima preiskovana raztopina na osnovi kvarternih amonijevih spojin učinek razkužila na testnih bakterijah vrst Staphylococcus aureus in Pseudomonas

aeruginosa!


• Preverite komercialne podatke o razkužilu

• Pripravite ustrezne koncentracije razkužila in bakterije vrst Staphylococcus aureus in

Pseudomonas aeruginosa

• Določite baktericidno delovanje v predvidenih kontaktnih časih


2.3 NAVODILA

Z razredčevalno-nevtralizacijsko metodo (SIST EN 1040, 2001) ugotavljamo učinek različnih

koncentracij predvidenega razkužila v različnih kontaktnih časih na preiskovane kulture. Po standardu SIST EN 1040 (2001) ima dezinfekcijsko sredstvo baktericidno aktivnost takrat, ko zniža

število testnih bakterij (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) v določenem kontaktnem času najmanj za 105 cfu/ml. Metoda je standardizirana in kot preiskovane bakterije predpisuje vrsti

Pseudomonas aeruginosa in Staphylococcus aureus. Poenostavljena metoda vsebuje naslednje stopnje:

2.3.1 PRIPRAVA RAZKUŽILA

Pripravimo tri različne koncentracije razkužila, pri tem naj bodo dve koncentraciji v območju, ki ga

predpisuje proizvajalec. Za raztopine uporabimo sveže destilirano in sterilizirano voda (ne deionizirano) in sterilno steklovino. Raztopine razkužil razlijemo (po 9 ml) v sterilne epruvete.

2.3.2 PRIPRAVA BAKTERIJSKIH KULTUR

Določimo število bakterij v prekonočni kulturi bakterij vrst P. aeruginosa in S. aureus z metodo štetja kolonij na ploščah.

2.3.3 INOKULACIJA IN DOLOČITEV PREŽIVELOSTI

V epruvete z raztopinami razkužila (2.3.1) dodamo 1 ml čiste kulture (18-urna kultura z 108 cfu/ml),

premešamo in merimo kontaktni čas (na primer: 1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min).

Po preteku določenega kontaktnega časa, vsebino epruvete premešamo in 1 ml suspenzije prenesemo v 9 ml nevtralizatorja. Epruveto z razkužilom in kulturo naprej inkubiramo pri 20o C in

vzorčenje ponavljamo ob vsakem kontaktnem času.

V vsakem vzorcu (suspenzija razkužila in nevtralizatorja) določimo število preživelih bakterij z metodo štetja kolonij na ploščah (homogenizacija in prenos 2-krat po 1 ml suspenzije v prazni sterilni petrijevki).


15

V petrijevke nato razlijemo stopljeno in na 45o C ohlajeno gojišče (tripton soja agar s kvasnim

ekstraktom) in suspenzijo umešamo. Po 24-urni inkubaciji preštejemo kolonije in določimo število N (cfu/ml).

2.3.4 BAKTERICIDNA AKTIVNOST

Baktericidno aktivnost razkužila določimo kot koncentracijo razkužila, ki v določenem kontaktnem času, zniža število testnih bakterij najmanj za 105 cfu/ml.

2.3.5 KOMERCIALNI PODATKI O RAZKUŽILU

Ime: Nevtralno razkužilo na osnovi kvarternih amonijevih spojin.

Uporaba: Razkužilo z aktivnimi kationskimi učinkovinami je primerno za razkuževanje s

pršenjem, oblivanjem in potapljanjem po temeljitem predčiščenju.

Izgled: Brezbarvna prozorna tekočina.

Vonj: Skoraj brez vonja.

Gostota: 1g cm-3 (1 kg = 1 l)

Vrednost pH (1 %): Nevtralno.

Uporaba: Uporablja se 1 – 3 % raztopina, čas učinkovanja 15 min.

Agresivnost: Ob predpisani koncentraciji sredstvo ne bo poškodovalo običajnih materialov.

Posebni napotki: Površine, ki pridejo v stik s hrano, po uporabi temeljito sperite z veliko količino

vode.

Varnostni napotki: Dražljivo.

Draži oči in kožo.

Ob stiku s kožo takoj izprati z obilo vode.

Če pride do zaužitja, poiskati zdravniško pomoč in pokazati embalažo ter

etiketo.

Embaliranje: Ročke 20 kg

Rok uporabe: 18 mesecev


16

2.4 DELOVNI ZVEZEK

2.4.1 IZVEDBA



17

2.4.2 MATERIAL, POTEK DELA IN REZULTATI

1. V tabelo vpišite podatke!

Pripravljene koncentracije razkužila

Čista kultura

Kontaktni časi

Nevtralizator

Trdno gojišče

Razmere inkubacije

2. Koncentracija bakterij v času 0:

Staphylococcus aureus

Pseudomonas aeruginosa

3. Vpišite števila bakterij Staphylococcus aureus (N, cfu/ml) v razkužilu glede na preizkušene

kontaktne čase in koncentracije razkužila!

Kontaktni čas (min)

Število preživelih bakterij N (cfu/ml) pri različnih koncentracijah razkužila (%)


18

4. Vpišite števila bakterij Pseudomonas aeruginosa (N, cfu/ml) v razkužilu glede na preizkušene

kontaktne čase in koncentracije razkužila!

Kontaktni čas (min)

Število preživelih bakterij N (cfu/ml) pri različnih koncentracijah razkužila (%)

5. Komentirajte rezultate


19

3 VAJA: PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST

3.1 NAMEN

Določite protimikrobno (protibakterijsko in protiglivno) učinkovitost rastlinskih ekstraktov.


• Pripravite prekonočni kulturi grampozitivnih in gramnegativnih bakterij in suspenzijo plesni, ki ste jih izolirali pri 1. vaji

• Pripravite načrt izvedbe metode razredčevanja v mikrotiterski ploščici

• Pripravite osnovno raztopino protimikrobne učinkovine

• Določite MIC in MBC protimikrobne učinkovine za bakterije

• Določite MIC in MBC protimikrobne učinkovine za plesni


3.3 NAVODILA

Z metodo razredčevanja v mikrotitrski ploščici v tekočem gojišču določimo minimalno inhibitorno koncentracijo (MIC) in mikrobicidno koncentracijo (MBC) protimikrobne snovi.

3.3.1 PRIPRAVA BAKTERIJ IN PLESNI

Iz prekonočne kulture bakterij (24 h, 37°C) pripravimo inokulum tako, da vsebino epruvete dobro premešamo in prenesemo 0,15 ml kulture v 10 ml TSB. Koncentracija celic v gojišču naj bi bila 106 – 107 cfu/ml. Točno število določimo z metodo štetja kolonij na trdem gojišču TSA.

Iz kolonije plesni na gojišču (MEA ali DG18, shranjena od 1. vaje) pripravmo suspenzijo spor tako,

da s cepilno zanko 3-5x prenesemo spore v 4 ml gojišča RPMI. Koncentracija spor v gojišču naj bi bila 106 – 107 cfu/ml. Točno število določimo z metodo štetja kolonij na trdem gojišču MEA ali DG18..

3.3.2 PRIPRAVA OSNOVNE IN DELOVNE RAZTOPINE PROTIMIKROBNE SNOVI

Osnovno raztopino protimikrobne snovi pripravimo tako, da zatehtmo določeno maso protimikrobne snovi in jo raztopimo v 1 ml etanola (99,9%), na primer 500 mg v 2-ml epruveti dodamo 1 ml etanola.

Delovno raztopino protimikrobne snovi pripravimo tako, da osnovno raztopino razredčimo s tekočim gojiščem TSB, na primer 250 µl osnovne raztopine dodamo 750 µl gojišča TSB.

3.3.3 IZVEDBA RAZREDČEVANJA V MIKROTITRSKI PLOŠČICI ZA BAKTERIJE

3.3.3.1 NAČRT IZVEDBE

Za vsak poskus si najprej pripravimo načrt izvedbe in pri tem upoštevamo koncentracije protimikrobne snovi ter posebej kontrolne vzorce. Primer na sliki 3.


20

SLIKA 3: SHEMA MIKROTITRSKE PLOŠČICE ZA IZVEDBO METODE RAZREČEVANJA; (A) OZNAKE, (B) KONCENTRACIJE

(A) OZNAKE:

B1: bakterijska kultura 1 v gojišču TSB z različnimi koncentracijami protimikrobne snovi

B2: bakterijska kultura 2 v gojišču TSB z različnimi koncentracijami protimikrobne snovi

PK1: pozitivna kontrola bakterijske kulture 1 v gojišču TSB z različnimi koncentracijami etanola

PK2: pozitivna kontrola bakterijske kulture 2 v gojišču TSB z različnimi koncentracijami etanola

PK3: pozitivna kontrola bakterijske kulture 1 v gojišču TSB

PK4: pozitivna kontrola bakterijske kulture 1 v gojišču TSB

NK1: negativna kontrola gojišča TSB in etanola

NK2: negativna kontrola gojišča TSB

(B) KONCENTRACIJE

Kolone 1,2,4 in 5: koncentracija protimikrobne snovi (mg/ml) v gojišču TSB

Koloni 7 in 8: koncentracije etanola v gojišču TSB (%)

3.3.3.2 IZVEDBA

Aseptično izvedemo naslednje korake:

1. V prvo vrstico, v prostorčke kjer bomo testirali bakterije (A1, A2, B4, B5) odpipetiramo 100 µl

delovne raztopine protimikrobne snovi.

2. V vse druge vrstice (B-H) v kolonah 1, 2, 4 in 5 odpipetiramo 50 µl gojišča TSB.

3. 2x-no redčenje protimikrobne snovi izvedemo v vsaki koloni tako, da iz prvega prostorčka (A1)

prenesemo 50 µl delovne raztopine protimikrobne snovi v drugi prostorček (B1) in vsebino previdno premešamo. Nato iz drugega prostorčka (B1) vzamemo 50 µl suspenzije in jo prenesemo v tretji

prostorček (C1) in vsebino previdno premešamo. Razredčevanje nadaljujemo do H1 in iz tega


21

prostorčka po mešanju 50 µl suspenzije zavržemo. Enak postopek ponovimo v koloni 2, nato še

kolonah 4 in 5.

4. V koloni 7 v prvi prostorček (A7) odpipetiramo 100 µl delovne raztopine etanola (to pripravimo tako, da 250 µl etanola dodamo 750 µl gojišča TSB). Enako ponovimo v koloni 8.

5. V vse druge vrstice (B-H) v kolonah 7 in 8 odpipetiramo 50 µl gojišča TSB.

6. 2x-no redčenje delovne raztopine etanola izvedemo tako, da iz prvega prostorčka (A7) prenesemo 50 µl delovne raztopine etanola v drugi prostorček (B7) in vsebino previdno premešamo.

Nato iz drugega prostorčka (B7) vzamemo 50 µl suspenzije in jo prenesemo v tretji prostorček (C7) in vsebino previdno premešamo. Razredčevanje nadaljujemo do H7 in iz tega prostorčka po

mešanju 50 µl suspenzije zavržemo. Enak postopek ponovimo v koloni 8.

7. V koloni 10 v vse prostorčke (A-H) dodamo 50 µl gojišča TSB.

8. V kolone 1, 2 in 7 v vse prostorčke dodamo 50 µl bakterijske kulture 1, v koloni 10 dodamo

bakterijsko kulturo 1 LE v prve 4 prostorčke (A10, B10, C10, D10).

9. V kolone 4, 5 in 8 v vse prostorčke dodamo 50 µl bakterijske kulture 2, v koloni 10 dodamo bakterijsko kulturo 1 LE v zadnje 4 prostorčke (E10, F10, G10, H10).

10. V koloni 12 v prostorčke A12, B12, C12, D12 odpipetiramo 50 µl TSB in dodamo 50 µl delovne raztopine etanola, v prostorčke E12, F12, G12 in H12 odpipetiramo 100 µl gojišča TSB.

11. Vsebino mikrotitrske ploščice premešamo na mešalniku in mikrotitrsko ploščico inkubiramo 24 h

pri 37 oC.

3.3.3.3 ODČITAVANJE MIC

Po inkubaciji mikrotitrske ploščice aseptično dodamo v vse prostorčke po 10 µl reagenta INT (p-iodo-nitro-tetrazolium violet, 2 mg/ml). Reagent INT je indikator metabolne aktivnosti, ki lahko sprejme

elektrone iz encima dehidrogenaze in jih reducira v rdeče obarvan formazan. Po dodatku reagenta INT mikrotitrsko ploščico inkubiramo (0,5 do 2 h pri 37 °C). Rezultate odčitamo vizuelno glede na

spremembo barve. Prvi neobarvan prostorček (slika 4) v koloni pomeni MIC za določeno kombinacijo bakterij in protimikrobne snovi. Vzporedno preverimo pozitivne in negativne kontrolne

vzorce.

SLIKA 4: PRIMER ODČITAVANJA VREDNOSTI MIC


22

3.3.3.4 DOLOČITEV MBC

Po inkubaciji mikrotitrske ploščice lahko določimo MBC tako, da v prostorčkih kjer ni vidne

metabolne aktivnosti določimo število preživelih bakterij z metodo štetja kolonij na trdih gojiščih. Na primer za bakterijsko kulturo 1 (slika 4) kot vzorce vzamemo prostorčke C1, B1 in A1 ter po

inkubaciji trdnih gojišč MIC določimo pri tisti vrednosti kjer ni več bakterijske rasti.

3.3.4 IZVEDBA RAZREDČEVANJA V MIKROTITRSKI PLOŠČICI ZA PLESNI

Načrt in izvedba sta enaka kot pri bakterijah (3.3.3), le da uporabljamo gojišče RPMI in da je

inkubacija dalj časa (7-10 dni) pri 25 oC.


23

3.4 DELOVNI ZVEZEK

3.4.1 IZVEDBA RAZREDČEVANJA V MIKROTITRSKI PLOŠČICI ZA BAKTERIJE



24

3.4.2 MATERIAL, POTEK DELA IN REZULTATI ZA BAKTERIJE


Protimikrobna snov

Osnovna raztopina protimikrobne

snovi

Delovna raztopina protimikrobne snovi

Bakterijska kultura 1


Delovna raztopina etanola

2. Načrt mikrotitrske ploščice:

1 2 43 5 6 87 9 10 1211

A

B

C

D

E

F

G

H


25

3. Določitev MIC

Protimikrobna snov



4. Določitev MBC

Protimikrobna snov





26

3.4.3 IZVEDBA RAZREDČEVANJA V MIKROTITRSKI PLOŠČICI ZA PLESNI



27

3.4.4 MATERIAL, POTEK DELA IN REZULTATI ZA PLESNI


Protimikrobna snov

Osnovna raztopina protimikrobne

snovi

Delovna raztopina protimikrobne snovi

Kultura plesni 1

Kultura plesni 2

Delovna raztopina etanola

2. Načrt mikrotitrske ploščice:

1 2 43 5 6 87 9 10 1211

A

B

C

D

E

F

G

H


28

3. Določitev MIC

Protimikrobna snov

Kultura plesni 1

Kultura plesni 2

4. Določitev MBC

Protimikrobna snov

Kultura plesni 1

Kultura plesni 2



29

4 NAVODILA ZA VARNO DELO

Pri izvedbi laboratorijskih vaj dosledno upoštevajta osnovna navodila varnega dela in podrobna

navodila, predstavljena pri posamezni laboratorijski vaji:

• V laboratoriju vedno nosite zaščitne halje.

• V laboratoriju je prepovedano kajenje ter uživanje hrane in pijač.

• Na delovnem pultu je samo material, ki ga potrebujete za izvedbo preiskave.

• Okna in vrata morajo biti med eksperimentalnim delom zaprta zaradi nevarnosti kontaminacije.

• Pri delu vedno uporabljate aseptično tehniko.

• Plinske gorilnike na začetku in ob koncu dela odpre in zapre vodja vaje oziroma tehnik.

• Pri delu ob plinskem gorilniku bodite pazljivi in zbrani.

• Če pridete do neposrednega kontakta z mikroorganizmi, to takoj sporočite vodji vaj oziroma

tehniku.

• Če pride do kontaminacije okolja, mesto najprej razkužite, sperete z vodo in obrišete s

papirnato brisačo.

• Kontaminirano steklovino in plastične nastavke za avtomatske pipete odlagajte v pripravljene

košare oziroma posode z razkužili.

• V smetnjak nikoli ne odvrzite smeti, ki so kontaminirane z mikroorganizmi.

• Mikroorganizmov ne smete odnašati iz mikrobiološkega laboratorija.

• Z aparati (mikroskop, pH-meter, PCR-aparat,W) ravnajte pazljivo; pazite, da bodo po končanem delu očiščeni in ugasnjeni.

• Mikroskopske preparate ne mečite v smeti, ampak v pripravljene posode z razkužili.

• Po končanem delu pospravite delovni pult in ga razkužite.

• Po končanem delu razkužite roke, jih temeljito operete z vodo in milom ter posušite s

papirnato brisačo.

• Z zdravju škodljivimi in strupenimi snovmi delajte v digestoriju.

• Pri delu bodite zbrani in pazljivi.

Rezultate in opažanja zapisujte v delovni zvezek


30

5 VIRI

Downes F. P., Ito K. 2001. Compendium of methods for microbiological examination of foods. 4th edition.

Washington, APHA, 659 str.

Harrigan W. F. 1998. Laboratory methods in food microbiology. 3rd edition. London, Academic Press Limited,

532 str.

International standard. ISO 7954. 1987. Microbiology - General guidance for the enumeration of yeast and

moulds - Colony count technique at 25oC. 1st ed. Geneve: International Organization for Standardization, 3

str.

International standard. ISO 4833. 1991. Microbiology - General guidance for the enumeration of

microorganisms - Colony count technique at 30 oC. 2nd ed. Geneve: International Organization for

Standardization, 4 str.

International standard. ISO 7218. 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for

microbiological examination. - 2nd ed., Geneve: International Organization for Standardization, 43 str.

International standard. ISO 6887-1. 1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test

samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. Part 1, Genearal rules for

the preparation of the initial suspension and decimal dilutions. - 1st ed. - Geneve: International Organization

for Standardization, 5 str.

Jeršek B. Praktikum mikrobiološke analize: skripta in delovni zvezek za študente IV. letnika živilstva. 2008.

Barbara. Ljubljana: Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za živilsko mikrobiologijo, 45 str.

Jeršek B. Higiena živil : laboratorijske vaje za študente živilstva in prehrane. 2. dopolnjena izd. Ljubljana:

Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2009. 79 str. ISBN 978-961-6333-77-1. http://www.bf.uni-

lj.si/fileadmin/groups/2752/Higiena_zivil.pdf.

Jeršek B., Poklar Ulrih N., Skrt M., Gavarić N., Božin B., Smole Možina S. 2014. Effects of selected essential

oils on the growth and production of ochratoxin A by Penicillium verrucosum. Arhiv za higijenu rada i

toksikologiju, 65, 2, 199-208

Jeršek B. 2014. Osnovni principi identifikacije plesni, kvasovk in bakterij v živilih : skripta in delovni zvezek za

laboratorijske vaje pri predmetu Živilska mikrobiologija. Ljubljana: Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo,

2014. ISBN 978-961-6333-68-9. http://www.bf.uni-lj.si/fileadmin/groups/2752/Skripta_ZM_2014.pdf.

Jeršek B. 2014. Toksikologija in kontaminacija živil : navodila in delovni zvezek za laboratorijske vaje.

Ljubljana: Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014. ISBN 978-961-6908-06-1. http://www.bf.uni-

lj.si/fileadmin/groups/2752/Skripta_ToKo_2014.pdf.

Klančnik A., Piskernik S., Jeršek B., Smole Možina S. 2010. Evaluation of diffusion and dilution methods to

determine the antibacterial activity of plant extracts. Journal of microbiological methods, 2, 81, 121-126

Pitt J.I., Hocking, A.D. Fungi and food spoilage. London, Blackie Academic & Professional, cop. 1997, 593 str.

Samson R. A., Hoekstra E.S., Frisvad J.C., Filtenborg O. Introduction to food- and airborne fungi. Utrecht :

Centraalbureau voor Schimmelcultures. 389 str.

SIST EN 1040:2001 Kemična razkužila in antiseptiki - Osnovno baktericidno delovanje - Preskusna metoda in

zahteve (faza 1). 2001, 31 str.

Zakon o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (ZZUIZS). Uradni list RS

52/2000; 42/2002

Documents

MIKROBIOLOGIJA IN BIOTEHNOLOGIJA HRANE - bf.uni-lj.si · MIKROBIOLOGIJA IN BIOTEHNOLOGIJA HRANE. NAVODILA IN DELOVNI ZVEZEK ZA II. DEL LABORATORIJSKIH VAJ 5 pijačam, najprej izmerimo