1

MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRME

Can AYDOĞANKlinik Pazarlama Müdürü

Kasım 2011, Antalya

Mikrobiyal Genotiplendirme

Diversilab çalışma adımları

Sonuç değerlendirmesi

Kütle Spektrometresi – VITEK MS

Sistem tanıtımı (demo)

İÇERİK

2

Mikrobiyal Genotiplendirme

Diversilab çalışma adımları

Sonuç değerlendirmesi

Kütle Spektrometresi – VITEK MS

Sistem tanıtımı (demo)

Moleküler Tiplendirme

Bir çok farklı yöntem mevcut

Tüm yöntemlerin avantaj ve dezavantajları var

Yöntem seçimi

Ayırım gücü ve tekrarlanabilirlik

Yöntemin kullanılabilirliği ve sonuçların değerlendirilmesi

Kurulum ve çalışma maliyetleri

İhtiyaç ve gerekli olan beceri seviyesi

Klinik laboratuarında kullanım için uygunluk ve otomasyon

Yöntem seçimi

3

Bir çok farklı yöntem mevcut

Tüm yöntemlerin avantaj ve dezavantajları var

Yöntem seçimi

Ayırım gücü ve tekrarlanabilirlik

Yöntemin kullanılabilirliği ve sonuçların değerlendirilmesi

Kurulum ve çalışma maliyetleri

İhtiyaç ve gerekli olan beceri seviyesi

Klinik laboratuarında kullanım için uygunluk ve otomasyon

Bacterial Barcodes

Bacterial Barcodes - Athens, Georgia / ABD

Ekim 2006’da bioMérieux tarafından satın alındı

Nisan 2007 ECCMID / Munih’te Diversilab lansmanı yapıldı

Komple Enfeksiyon Kontrol Çözümü

4

Bacterial Barcodes - Athens, Georgia / ABD

Ekim 2006’da bioMérieux tarafından satın alındı

Nisan 2007 ECCMID / Munih’te Diversilab lansmanı yapıldı

Komple Enfeksiyon Kontrol Çözümü

Diversilab

Ne işe yarar? Bakteri, küf ve mayaların genotiplendirmesini yapar

- Köken tayini

- Parmakizi tayini

Neden suş genotiplendirmesi yapılır? Organizmaların gelişim ve yayılımlarının takibi amacı ile organizmaların genetik

benzerliklerini ve değişimlerini ortaya koymak için

55

Ne işe yarar? Bakteri, küf ve mayaların genotiplendirmesini yapar

- Köken tayini

- Parmakizi tayini

Neden suş genotiplendirmesi yapılır? Organizmaların gelişim ve yayılımlarının takibi amacı ile organizmaların genetik

benzerliklerini ve değişimlerini ortaya koymak için

KKromoromozzomal DNAomal DNA AAnalnaliziizi

REA REA-Prob Dizi Analizi

• PFGE

• RAPD• AP-PCR• DAF• ERIC-PCR• BOX-PCR• REPREP--PCRPCR• (GTG)5

• MLVA & VNTR• ARDRA• ITS (tRNA-PCR)• SSCP• TGGE & DGGE

• RFLP• Ribotyping• AFLP

•MLST• SLST

PCR

Moleküler Tiplendirme Yöntemleri

66

• PFGE

• RAPD• AP-PCR• DAF• ERIC-PCR• BOX-PCR• REPREP--PCRPCR• (GTG)5

• MLVA & VNTR• ARDRA• ITS (tRNA-PCR)• SSCP• TGGE & DGGE

• RFLP• Ribotyping• AFLP

•MLST• SLST

•DiversiLab

Vitek, API

Riboprinting

MicroSeq

Riboprinter

Filogenetik Sınıflandırma

7

DiversiLab

Genetik Farklılıklar: FAZLA AZ

Teknik Ayırım: DÜŞÜK YÜKSEK

AFLP

PFGE

Önlem

Sürveyans

Bilgi Yönetimi

Müdahale

Sağlık Bakımı İlişkili Enfeksiyonlar

88

HAIÖnlem

Tarama

Çevre Kontrolü

Yapı,Organizasyon,

süreç

İletişim Eğitimi

Müdahale

HAI Tanı

Salgın Yönetimi

DüzenleyiciEylem Planı

Önlem

Sürveyans

Bilgi Yönetimi Myla

DiversiLab

Müdahale

Sağlık Bakımı İlişkili Enfeksiyonlar

99

HKEÖnlem

Hasta Tarama

Çevre Kontrolü

Yapı,Organizasyon,

süreç

İletişim Eğitim

chromID MRSA, ESBL,VRE

Hava: air IDEAL+ media

Yüzey: Count-tact

Su: GVPC, BCYE, SlidexLegionella

DiversiLab

Müdahale

HKE Tanı

Salgın Yönetimi

Eylem Planları

VITEK MS, VT2 (ID/AST),API, Media, Slidex, E-

test

Nuclisens MRSA, KPC,RSV, bioNexia, RSV

Direct IF identification

Vikia Rota Adeno

Vidas CDAB, Rota

DiversiLab

BacT-Alert

1010

DiversiLab bu adımları otomatize eder

Bean, P., et al J Clin Micro 1999 Vol 37

Tekrarlayan diziler : Organizmaların DNA’sında fonksiyonlarıbilinmeyen kısa DNA dizileri (35-40 bp) belirli bir düzende tekrarlanır.

1. rep-PCR primerleri genom boyunca aralara yayılmış olan spesifiktekrarlayan dizilere bağlanırlar. Çeşitli uzunluklarda bir çok parça amplifiyeedilir.

2. Parçalar boyut ve yük olarak ayrılabilerler. Çeşitli boyutlarda bir çokbanttan oluşan rep-PCR parmakizi profili oluşturulur.

3. Mikrobiyal klonların profilleri suşlara spesifiktir. Bu parmakizleri dahasonra mikroorganizmalar arasındaki ilişkileri göstermede kullanılabilir.

Çalışma Prensibi

1111

Tekrarlayan diziler : Organizmaların DNA’sında fonksiyonlarıbilinmeyen kısa DNA dizileri (35-40 bp) belirli bir düzende tekrarlanır.

1. rep-PCR primerleri genom boyunca aralara yayılmış olan spesifiktekrarlayan dizilere bağlanırlar. Çeşitli uzunluklarda bir çok parça amplifiyeedilir.

2. Parçalar boyut ve yük olarak ayrılabilerler. Çeşitli boyutlarda bir çokbanttan oluşan rep-PCR parmakizi profili oluşturulur.

3. Mikrobiyal klonların profilleri suşlara spesifiktir. Bu parmakizleri dahasonra mikroorganizmalar arasındaki ilişkileri göstermede kullanılabilir.

İzole kültürden manuelDNA ekstraksiyonu

yapılır.

Thermalcycler’daDiversiLab Parmakizikitleri kullanılarakrep-PCR yapılır.

I. II.

Çalışma Adımları

1212

Biyoanalizör kullanılarakotomatik microfluidicelektroforez yapılır.

İnternet tabanlı yorumlamayazılım programı ile kolay vehızlı değerlendirme yapılır.

Sonuç süresi = izole organizmadan ~4 saat

III. IV.

DiversiLab LabChip

microfluidic elektroforez

LabChip

1313

Elektroferogram Jel

Standardize Parmakizi Kitleri

Valide test protokolleri

Kitlerde + / - kontrol

24 testlik ambalaj

Uzun son kullanım tarihi

Dondurma/çözme imkanı

Teknik destek

Standardizasyon…

1414

Standardize Parmakizi Kitleri

Valide test protokolleri

Kitlerde + / - kontrol

24 testlik ambalaj

Uzun son kullanım tarihi

Dondurma/çözme imkanı

Teknik destek

410946 DiversiLab Acinetobacter Kit 24 test 410983 DiversiLab Listeria Kit 24 test

410948 DiversiLab Archaebacteria Kit 24 test 410984 DiversiLab Mycobacterium Kit 24 test

410949 DiversiLab Aspergillus Kit 24 test 410985 DiversiLab Mycoplasma Kit 24 test

410962 DiversiLab Bacillus Kit 24 test 410986 DiversiLab M. tuberculosis Kit 24 test

410963 DiversiLab Bifidobacterium Kit 24 test 410987 DiversiLab Propionibacterium Kit 24 test

410964 DiversiLab Campylobacter Kit 24 test 410988 DiversiLab Pseudomonas Kit 24 test

410965 DiversiLab Candida Kit 24 test 410989 DiversiLab Salmonella Kit 24 test

Test Menüsü

1515

410966 DiversiLab Clostridium Kit 24 test 410991 DiversiLab Staphylococcus Kit 24 test

410967 DiversiLab C. perfringens Kit 24 test 410992 DiversiLab Streptococcus Kit 24 test

410968 DiversiLab Enterobacter Kit 24 test 411007 DiversiLab Bacterial KitDiversiLab Bacterial Kit 24 test

410969 DiversiLab Enterococcus Kit 24 test 411008 DiversiLab Fungal Kit 24 test

410980 DiversiLab Escherichia Kit 24 test 410990 DiversiLab Serratia Kit 24 test

410981 DiversiLab Klebsiella Kit 24 test 410993 DiversiLab Francisella Kit 24 test

410982 DiversiLab Lactobacillus Kit 24 test 410994 DiversiLab Saccharomyces Kit 24 test

Web tabanlı kullanıcı yazılımı

Otomatik değerlendirme

Kullanıcılara özel şifre

Her an verilere erişim imkanı

Veri kaybetme riski yok

İstendiğinde farklı üniteler ile veri paylaşma imkanı

Standart bMx kütüphaneleri ile hızlı identifikasyon imkanı

Her zaman en güncel sürüm kullanımı

Ücretsiz yazılım güncellemeleri

Yazılım…

1616

Web tabanlı kullanıcı yazılımı

Otomatik değerlendirme

Kullanıcılara özel şifre

Her an verilere erişim imkanı

Veri kaybetme riski yok

İstendiğinde farklı üniteler ile veri paylaşma imkanı

Standart bMx kütüphaneleri ile hızlı identifikasyon imkanı

Her zaman en güncel sürüm kullanımı

Ücretsiz yazılım güncellemeleri

1717

Sonuçlar…

1818

Sonuçlar…

1919

Liste Dağılım

Sonuçlar…

2020

Mevcut kütüphaneler

MRSA C. difficileMycobacterium KüfMaya Candida Francisella E.coli SalmonellaGram +Gram -

Geliştirilen kütüphaneler

Acinetobacter VRE Non-Fermenter Coag-Neg Staph

Standardize Kütüphaneler…

2121

Mevcut kütüphaneler

MRSA C. difficileMycobacterium KüfMaya Candida Francisella E.coli SalmonellaGram +Gram - M. chelonae – M. abscessus, M. avium – M. intercellulare, M.

tuberculosis – M. Bovis, M. peregrinum – M. septicum Candida glabrata – Candida albicans Salmonella typhimurium – Salmonella enterditis E. coli O157 – O155

Mycobacterium Mycobacterium

2222

MayaMaya

2323

Escherichia coli

2424

• 30 günde 10 defa 2 E.coli O157H7suşunun subkültürü yapıldı

• –70°C’de 5 defa donduruldu

• Petriler 4°C’de 7 ve 14 günbekletildi

• Toplam 100 DNA ekstraksiyonu

Yüksek tekrarlanabilirlik…

2525

200bp 4Kb

• Altı farklı Biyoanalizör

• Üç farklı teknisyen

• Üç gün

• %1’den az varyasyon%99

Healy, et al. JCM Jan 2005

• 30 günde 10 defa 2 E.coli O157H7suşunun subkültürü yapıldı

• –70°C’de 5 defa donduruldu

• Petriler 4°C’de 7 ve 14 günbekletildi

• Toplam 100 DNA ekstraksiyonu

Yüksek tekrarlanabilirlik…

2626

• Üç farklı mikroorganizma

• Üç farklı teknisyen tarafından

• Üçer farklı DiversiLab Parmakizi kiti lotu ile çalışıldı ve < %2 varyasyon bulundu

%98

Healy, et al. JCM Jan 2005

Yenidoğan Yoğun Bakım Ünitesi…

2727

MRSAkronikotitli

sağlıkçalışanı

Erciyes Üniversitesi…

2828

Moleküler Kongresi, 2010

Erciyes Üniversitesi…

2929

XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 2010

GATA…

3030

GATA…

3131

Erciyes Üniversitesi…

3232

XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 2010

DiversiLab PFGE

3333

24 Numune:6 saat

İzole kültürden ~4 saatte hızlı sonuç

Web tabanlı arayüzü ile kolay kullanım

Standardizasyon & Yüksek Tekrarlanabilirlik

Otomatik Değerlendirme & Yorumlama

Teknik Destek

Diversilab

3434

İzole kültürden ~4 saatte hızlı sonuç

Web tabanlı arayüzü ile kolay kullanım

Standardizasyon & Yüksek Tekrarlanabilirlik

Otomatik Değerlendirme & Yorumlama

Teknik Destek

Klinik Laboratuarı’nda Genotiplendirme

Erciyes Üniversitesi

Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi

Marmara Üni. Pendik Eği. Ve Araş. Hastanesi

Çukurova Ü. Veterinerlik Fakültesi

Mersin Üniversitesi

Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi

Gaziantep Üniversitesi

Koç Üniversitesi / Amerikan Hastanesi

Hacettepe Ü., Süleyman Demirel Ü. (proje bazında)

Türkiye’de Diversilab…

3535

Erciyes Üniversitesi

Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi

Marmara Üni. Pendik Eği. Ve Araş. Hastanesi

Çukurova Ü. Veterinerlik Fakültesi

Mersin Üniversitesi

Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi

Gaziantep Üniversitesi

Koç Üniversitesi / Amerikan Hastanesi

Hacettepe Ü., Süleyman Demirel Ü. (proje bazında)

FMLA ( Full Microbiology Lab Automation)

HastaneHastaneKaynaklıKaynaklı

EnfeksiyonlarınEnfeksiyonlarınYönetimiYönetimi ––

DiversilabDiversilab

3636

NumuneninEkimi

GramBoyama

İdentifikasyonAntibiyogram

Kültür

37

KÜTLE SPEKTROMETRE

“Kütle Spektrometresi” numunenin temel içeriğinin belirlenmesinde

kullanılan analitik bir tekniktir.

MS prensibi yüklü moleküller oluşturup onların kütle – yük oranını

ölçerek kimyasal bileşiğin iyonizasyonu esasına dayanır.

Doğrudan koloniden MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix

Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) ile

bakteri/maya/mantarların hızlı tanımlanması.

MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight)

Matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi

Kütle Spektrometresi Nedir?

38

“Kütle Spektrometresi” numunenin temel içeriğinin belirlenmesinde

kullanılan analitik bir tekniktir.

MS prensibi yüklü moleküller oluşturup onların kütle – yük oranını

ölçerek kimyasal bileşiğin iyonizasyonu esasına dayanır.

Doğrudan koloniden MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix

Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) ile

bakteri/maya/mantarların hızlı tanımlanması.

MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight)

Matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi

protein bacterial cell

DNA

genome

Modern Mikrobiyal Taksonomi:Proteomikler & Genomikler

39

speciesdefinition & determination

genomeproteome

DNAfingerprint

3000 5000 7000 9000 11000 13000Mass (m/z)

2117.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117]

44

24

.2

94

76

.2

48

61

.0

88

23

.5

58

97

.8

62

71

.2

80

54

.3

66

29

.0

74

24

.9

12

27

1.4

47

38

.6

69

84

.6

83

83

.8

67

86

.7

65

33

.3

90

75

.2

31

32

.3

61

37

.3

72

09

.8

89

03

.3

86

10

.6

10

11

0.8

47

65

.4

10

97

5.2

40

26

.9

45

35

.6

33

11

.8

10

49

3.9

34

91

.4

96

11

.5

massfingerprint

ManuelÖn-seçim

ManuelÖn-seçim yok

24 saatlik kültür

Günümüzde Kullanım…

40

VITEK 2 -Sistemi

API - Sistemi

GörselMetodlar

Direnç Testleri Serolojik Testler

Mikroorganizma tanımlaması

MALDI-TOF MSSARAMIS

Sadece 2 dakika4 – 72 saat

PCR

Mayıs 2010: bioMérieux tarafından satın alındı* SARAMIS: Mikrobiyal ID veritabanı (patentli SuperSpectra™) ve algoritmaları

Haziran 2010: ile anlaşma yapıldı Mikrobiyoloji laboratuvarları için ortak kütle spektrometre geliştirilmesi MALDI-TOF teknolojisi Shimadzu tarafından bulunmuştur

bioMérieux Kütle Spektrometre Tarihçesi…

41

Mayıs 2010: bioMérieux tarafından satın alındı* SARAMIS: Mikrobiyal ID veritabanı (patentli SuperSpectra™) ve algoritmaları

Haziran 2010: ile anlaşma yapıldı Mikrobiyoloji laboratuvarları için ortak kütle spektrometre geliştirilmesi MALDI-TOF teknolojisi Shimadzu tarafından bulunmuştur

*SARAMIS = Spectral ARchive And Microbial Identification System

İyon dedektörü

+ +

++

Hareket alanıayırım

tespit

MALDI-TOF MS: Temel Prensip

42

+

+

++

kuyucuk

matriks / analitkristallerii

Hızlanma alanı

elektrot

desorpsiyon

iyonizasyon

hızlanma

48 pozisyonlu plak

Tek koloni veyasüspansiyondan seçimve transfer

0.3 µl Matriks solüsyonu eklenmesi

İş akışı: Numune Hazırlığı (Adım 1)

43

Tek koloni veyasüspansiyondan seçimve transfer

Otomatik spektrum eldesi ~60 sn.

Sağlam protein iyonizasyonu vemoleküler ağırlık ölçümü

Pow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum Negative

İş akışı: Ölçüm (Adım 2)

44

3000 5000 7000 9000 11000 13000Mass (m/z)

1648.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3

37

75

70

75

80

74

87

44

10

93

9

94

53

99

94

79

80

10

34

7

50

15

78

63

11

57

2

70

92

59

31

96

54

35

81

68

37

93

30

73

67

10

22

6

84

50

10

60

8

11

90

6

Pow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum Negative

Mikroorganizmatanımlaması

İş akışı: Analiz (Adım 3)

45

Veritabanı ilekarşılaştırma

Algoritmahesaplaması

Tam bakteri hücresindeki kütle spektrometresine göre farklı peak paternlerinin oluşması

4000 m/z 8000

Burkholderia cepacia

Raoultella ornithinolytica

Staphylococcus aureus

Pantoea agglomerans

Acinetobacter lwoffi

Escherichia coli

464000 m/z 8000

Burkholderia cepacia

Raoultella ornithinolytica

Staphylococcus aureus

Pantoea agglomerans

Acinetobacter lwoffi

Escherichia coli

İş akışı adımları Süre (dakika)n = 5izolat

n = 24izolat

n = 96izolat

Plak 1 5 16Matriks 1 3 10Kurutma 2 2 7Okuma 5 12 43Sonuç süresiToplam 9 22 76

Sonuç Süresi…

47

İş akışı adımları Süre (dakika)n = 5izolat

n = 24izolat

n = 96izolat

Plak 1 5 16Matriks 1 3 10Kurutma 2 2 7Okuma 5 12 43Sonuç süresiToplam 9 22 76

Myla : Kullanım arayüzüMS-ID sonuç görüntülenmesi

48

VITEK MS sonuçları

Çok hızlı tanımlama

Kolay kullanım

Maliyet etkin

Kullanıcı dostu

Sürekli genişleyen veritabanı ve geliştirmeler ile

mükemmel performans

LIS ve diğer laboratuvar sistemleri ile entegrasyon

49

Çok hızlı tanımlama

Kolay kullanım

Maliyet etkin

Kullanıcı dostu

Sürekli genişleyen veritabanı ve geliştirmeler ile

mükemmel performans

LIS ve diğer laboratuvar sistemleri ile entegrasyonPow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum Negative

Türkiye’de VITEK MS…

50Marmara Ü. Pendik Eğit. ve Araş. Hastanesi

Sorularınız ?

51

52