Mikroskopický pr kaz infek ních agens Sv telná mikroskopiemikrobiologie.unas.cz/soubory/mikroskopie_tisk.pdf · 19 • Nativní preparát připravíme pouze kápnutím suspenze

1

Mikroskopie v mikrobiologii&

Mikrobiologická barveníVýuková prezentace z:

Lékařské bakteriologieJan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009

2

Mikroskopický průkaz infekčních agens

• Pro průkaz infekčních agens používáme jejich přímé pozorování pomocí– Světelné mikroskopie– Fluorescenční mikroskopie– Pozorování v temném poli– Metodu fázového kontrastu– Elektronové mikroskopie

3

• Světelný mikroskop je složené optické zařízenískládající se ze – Zdroje světla – žárovka– Posuvného reostatu, který reguluje světelný tok

vycházející ze žárovky– Kondenzoru který soustřeďuje proud paprsků– Clony která upravuje jejich množství– Stolku na nějž upevňujeme řez umístěný na

podložním sklíčku do speciální svorky– Objektivu, který zvětšuje obraz řezu a promítá ho

směrem k okuláru– A ze samotného okuláru který obraz ještě více

zvětšuje a jímž obraz pozorujeme

Světelná mikroskopie

4


5

– Zaostření mikroskopu provádíme mikrometrickým šroubem, který se nachází z obou stran a posunuje polohu stolku se sklíčkem

– Polohu sklíčka upravujeme posuvnými šrouby, které sklíčkem upnutým ve svorce pohybují předozadně a pravolevě

– Běžná rozlišovací schopnost u světelného mikroskopu je 0,5 - 0,2 um


6

• V mikrobiologii se nejčastěji používáběžného binokulárního mikroskopu– V parazitologii se používají objektivy se

zvětšením 200-300 násobným– V bakteriologii pak se zvětšením 1000 a více

násobným– Ve virologii se běžný světelný mikroskop

používá jen zřídkakdy např. při průkazu buněčných inkluzí v tkáních


7

• Ve mikrobiologii se pro pozorování ve světelném mikroskopu používají– Nativní preparáty – zejména pro pozorování

pohybu a dělení mikroorganizmů. Tento druh preparátů je diagnosticky významný zejména v parazitologii.

– Fixované preparáty – nejčastěji nátěry suspenze obsahující infekční agens barvenépomocí přehledných nebo diagnostických barvení.


8

• Preparáty pozorujme– Suchým optickým systémem

• U něj je však limitováno dosažitelné zvětšenína 60-450x)

– Imerzním optickým systémem• Na fixovaný a obarvený nátěr suspenze se

kápne kapka kvalitního oleje a speciálníimerzní objektiv se do něj ponoří (takto se v prostředí s dobrým indexem lomu u běžných mikroskopů možné zvětšení zvýší na 1050 násobné a vyšší)


9

• Fluorescenční mikroskop se od běžného světelného mikroskopu odlišuje hlavnězdrojem světla

• Ten vydává nejčastěji ultrafialové záření, které je po styku se speciálními barvivy (fluorochromy) absorbováno a vyzářeno jako viditelné světlo

Fluorescenční mikroskopie

10

• Je speciální a již zřídkakdy užívaný způsob mikroskopování používajícíspeciální mikroskop, který pomocídoplňkové optiky odkloní zdroj světla od zdroje a umožní pozorování mikrobiálních částic zachycujících rozptýlené světlo v temném poli

• Rutinně se využívá při diagnostice syfilis

Pozorování v temném poli

11

• Je speciální druh mikroskopie, který používá clony pracující na principu tzv. fázové destičky, která mění vytváříohybové spektrum

• To po průchodu pozorovanými mikrobiálními částicemi vytváří duhový efekt, který umožňuje pozorovánínebarvených a nefixovaných preparátů

Metoda fázového kontrastu

12

• Tzv. nativní preparáty – používají se pro pozorování pohybových

projevů a dělení mikrobů a dále v parazitologii

Metoda fázového kontrastu

13

• Elektronový mikroskop se od světelného mikroskopu odlišuje rozlišovací schopností která je až1000x větší tj. až 0,2 nm

Elektronová mikroskopie

14

• Jednotlivé typy elektronové mikroskopie– TEM - Transmisní elektronová mikroskopie je

nejstarší metodou EM a pracuje v analogii se světelným mikroskopem.

– SEM - Skenovací elektronová mikroskopie umí zobrazovat povrchy objektů a jejich tvar


15

• Preparát TEM


16

• Preparát SEM


17

• V mikrobiologii (zejména ve virologii) se nejčastěji používají klasické TEM a SEM metody– Preparáty pro TEM se připravují jako jemně

homogenizované suspenze nanesené na běžné elektronmikroskopické mřížce. Pro lepší zvýraznění se barví pokovením solemi kovů

– Preparáty pro SEM se připravují značněrozličně podle svého konkrétního účelu


18

• Nativní preparáty – Používají se zejména pro pozorování pohybu

a dělení mikroorganizmů– Tento druh preparátů je diagnosticky

významný zejména v parazitologii– Velmi často se pozorují metodou fázového

kontrastu

Příprava preparátu

19

• Nativní preparát připravíme pouze kápnutím suspenze mikroba na podložní sklíčko a překrytím krycím sklíčkem

• V případě, že chceme aby měl preparát delší trvanlivost musíme ho ochránit před vyschnutím přilepením okrajůkrycího sklíčka


20

PodloPodložžnníí sklsklííččkoko

KrycKrycíí sklsklííččkoko

Kapka Kapka suspenzesuspenze

Tmel proti Tmel proti vyschnutvyschnutíí


21

• Fixovaný preparát připravíme kápnutím suspenze mikroba na podložní sklíčko a pomocí bakteriologické kličky ji rozmícháme ve středu sklíčka

• Takto připravené sklíčko na Bunsenovým kahanem vysušíme a zfixujeme 3x protažením sklíčka v plameni


22

PodloPodložžnníí sklsklííččkokoVysuVysuššenenáá a a zfixovanzfixovanáásuspenzesuspenze


23

• Tato metoda fyzikální fixace je nejpoužívanější–Existují i jiné metody – např. fixace

chladem, chemická fixace methanolem a jiné

–Používají se však méně


24

• Takto připravené preparáty můžeme barvit přehlednými mikrobiologickými barveními

• Po obarvení a vysušení jsou preparáty připraveny k pozorovánísuchým i imerzním systémem


25

• Metodika jednoduchých (orientačních) mikrobiologických barvení je založena zejména na afinitě barviv k bakteriálním komponentám– Např. Krystalvioleť barví snáze struktury,

které neobsahují ve stěně mnoho nepolárních sloučenin

Princip barvení

26

ČČáástice barviva stice barviva kovalentnkovalentněě vváázanzanéév bakteriv bakteriáálnlníí ststěěnněě

Princip barvení

27

• U složitějších (diagnostických) barvenípoužívajících více barviv je pak obarveníči neobarvení dané struktury dáno jejími vlastnostmi– Např. U Gramova barvení si původní obarvení

krystalvioletí udrží pouze sloučeniny, kteréneobsahují ve stěně nepolární sloučeniny

– Při oplachu acetonem dojde totiž k vymytítěchto struktur a tím i vymytí krystalvioleti

Princip barvení

28

• Moderní metodika v poslední doběpoužívaných barvení dává přednost umělému zvýšení afinity ke konkrétním strukturám navázáním barviva na protilátky– To umožňuje selektivní průkaz daných

struktur v preparátu, což má značný diagnostický význam

– Ve virologii už tento typ metodik převládl

Princip barvení

29

ČČáástice barviva vstice barviva váázanzanáápomocpomocíí protilprotiláátky na tky na

bakteribakteriáálnlníí epitopepitop

Princip barvení

30

• Podle Grama: – Za normální teploty, běžnými koncentracemi.– Gram+ modré– Gram- červené– Gram labilní fialové

• (buď vlastnost,nebo špatný preparát)– Barvivo: Krystalvioleť,Karbolfuchsin– Moření: Lugolův roztok– Odbarvení: Aceton

Diagnostická barvení

31

• Postup Gramova barvení:– 1.Na fixovaný preparát dáme pár kapek krystalvioleti– 2.Barvíme asi 20 sec– 3.Opláchneme Lugolovým roztokem– 4.Navrstvit Lug.rozt. na 20 sec– 5.Slijeme a odbarvíme Acetonem asi 20(30) sec– 6.Dobarvíme Karbolfuchsinem 30 sec– 7.Sušíme mezi dvěma listy filtračního papíru– 8.Pozorujeme imerzním systémem

• Výsledek:– Gram + modré– Gram neg. červené


32

• Výsledek Gramova barvení


33

• Podle Ziehl - Neelsena:– Koncentrovanými barvivy,za tepla

• Slouží k znázornění acidorezistentních bakterií– = Mykobakterie (Kochův bacil – původce TBC)

• Preparát ze sputa (hlen,chrchle)– Barviva:

• Karbolfuchsin (koncentrovaný).• Malachitová zeleň(1%)

– Odbarvení: Kyselým alkoholem


34

• Postup barvení podle Ziehl - Neelsena :– 1.Preparát zfixujeme 3x protažením v plameni.– 2.Přelijeme koncentrovaným Karbolfuchsinem 3-5 min– 3.Odbarvujeme v kyselém alkoholu.– 4.Opláchneme ve vodě.– 5.Dobarvíme malachitovou zelení 0,5-1 min.– 6.Opláchneme ve vodě.– 7.Sušíme vysoko nad kahanem.– 8.Pozorujeme imerzním systémem

• Prohlédnout alespoň 50 zorných polí !!!

• Výsledek:– Acidorezistentní bakterie budou znázorněny červeně a zbytek

bude zelený.


35

• Výsledek barvení podle Ziehl - Neelsena


36

• Albertova metoda:– Za normální teploty, běžnými koncentracemi.– Slouží k znázornění metachromatických =– (volutinových=Erunt-Beletových granul)= Původci záškrtu (Corynebacterium diphtheriae)

• Barvivo: Albertův roztok• Moření: Lugolův roztok


37

• Postup při barvení Albertovou metodou– 1.Normálně zfixovaný preparát.– 2.Barvení Albertovým roztokem 3 min.– 3.Slití a opláchnutí ve vodě.– 4.Přelití Lugolovým roztokem na 1 min.– 5.Slití a opláchnutí ve vodě.– 6.Sušení mezi dvěma filtračními papíry.– 7.Pozorujeme imerzním systémem.

• Výsledek:• Korynebaktérie jsou zelené,metachromatická

granula jsou tmavě modrá až černá.


38

• Výsledek barvení podle Albertse


39

• Burriho metoda:– Za normální teploty,běžnými koncentracemi.– Slouží k negativnímu znázornění bakteriálních

pouzder.– Barvivo:

• Karbolfuchsin ředěný – (můžeme použít Krystalvioleť)

• tuš černá a 6% sacharóza


40

• Postup Burriho metody– 1.Na okraj podložního sklíčka dáme kapku sacharózy.– 2.Bakteriální kulturu rozmažeme v kapce.– 3.Rohem krycího sklíčka rozmícháme.– 4.Rozetřeme a necháme zaschnout.– 5.Zfixujeme metylalkoholem.– 6.Dobarvíme zřeď. Karbolfuchsinem (Krystalvioleťí)– 7.Opláchneme ve stojaté vodě.– 8.Sušíme vysoko nad kahanem.– 9.Pozorujeme.

• Výsledek:– Pouzdra nejsou obarvená a svítí na tmavém pozadí.


41

• Výsledek barvení podle Burriho


42

• Wirtz – Conklinova metoda:– Za vysoké teploty.– Slouží k znázornění bakteriálních spor– Barvivo:

• 5% Malachitová zeleň• Karbolfuchsin ředěný


43

• Postup u Wirtz – Conklinovy metody:– 1.Preparát zfixujeme běžným způsobem.– 2.Barvíme při zahříváním nad kahanem Malachitovou zelení 3x-

4x do výstupu par po dobu 5 min. Barvivo doléváme. Nesmívyschnout úplně !!!

– 3.Opláchneme ve vodě.– 4.Navrstvíme karbolfuchsin za norm.tep. 1-3min.– 5.Vysušíme mezi filt.pap. – 6.Prohlížíme imerzním systémem.

• Výsledek:– Spory zelené, tělo bakterie červené.– U starších kultur můžou být spory samostatně (vypadlé)


44

• Schaeffer – Fultonova metoda:– Za vysoké teploty.– Slouží k znázornění bakteriálních spor.– místo karbolfuchsinu použijeme eosin.– Postup stejný jako u Wirtz – Conklina.

• Výsledek:– Spory zelené,tělo bakterie červené.– U starších kultu můžou být spory samostatně

(vypadlé)


45

• Výsledek barvení podle Schaeffer – Fultona


Documents

Mikroskopický pr kaz infek ních agens Sv telná mikroskopiemikrobiologie.unas.cz/soubory/mikroskopie_tisk.pdf · 19 • Nativní preparát připravíme pouze kápnutím suspenze