J01

Mikroskopický průkaz mikroorganismů

Nativní preparát, barvicí metody

VLLM0421c (jaro 2016)

Osnova

● bezpečnost práce v laboratoři, další pokyny● mikroskop, práce s ním● mikrobiologie, tvary mikrobů● nativní preparát● buněčná stěna, barvící metody

2/48

Úkol 1a: Bezpečnost práce v mikrobiologické laboratoři

● postudujte a podepište Provozní řád praktických cvičení z lékařské mikrobiologie + První pomoc – předepsaný postup při laboratorních nehodách (viz J00)

3/48

Úvodní pokyny

● šatní skříňky pro studenty jsou 1., 2. a 4. od okna

● nepoužívejte 3. skříňku, i kdyby byla otevřená (skříňka studentů střední zdravotnické školy)

● klíče od šatních skříněk nechávejte vždy na háčcích vedle dveří, visí zde i klíček od WC (vracejte na místo po použití toalety)

● vstup studentů do prostor ústavu za praktikárnou je zakázán

4/48

Nakládání s odpady

● malé kousky můžete dát do nádobek na svých stolech

● použité zápalky mají své vlastní krabičky

● větší odpadky vyhazujte do koše vedle umyvadel

● rozbité sklo patří do žlutého kbelíčku vedle koše

● mikroskopické preparáty připravené přímo vámi patří po použití do desinfekce

5/48

Literatura

● protokoly k praktickým cvičením (IS MU) nutné!

● později budete potřebovat Lékařskou mikrobiologii obecnou (2005) a Lékařskou mikrobiologii speciální (2003)

● volitelně Lékařská mikrobiologie – vyšetřovací metody

6/48Foto: archiv MÚ

Podmínky zápočtu

● účast v praktiku by měla být pokud možno stoprocentní

● i přes omluvenou absenci je nutné doplnit si příslušné znalosti, vyplnit protokol a kontrolní otázky

● při více omluvených absencích (> 2) praktikum nutné nahradit v jiné skupině (po předchozí domluvě s daným vyučujícím)

● pro zápočet je také nutno mít vyplněny všechny kontrolní otázky na IS MU

● zápočtový test

7/48

Pokyny k vyplňování protokolů

● obrázky opravdu kreslete (nakreslete koky, nepište „vidím koky“)

● obrázky kreslete barevně, noste pastelky (alespoň červená a modrá)

● kreslete to, co vidíte (pokud se vám koky v mikroskopu dotýkají, kreslete je tak, nekreslete jen obrysy, ale probarvujte)

● pokud nevidíte to, co máte vidět, upozorněte asistenta (!)

● protokoly jsou kontrolovány u zkoušky a mají vliv na výslednou známku!

8/48

Úkol 1b: Mikroskopické techniky v mikrobiologické laboratoři

● seznamte se s prezentací předvádějící používání mikroskopu v mikrobiologii a případně si udělejte poznámky

● vytvořte si „preparát“ pro práci s mikroskopem (např. udělejte křížek fixem na podložní sklíčko)

9/48

Köhlerův princip osvětlení

● standardní postup nastavení optimálního osvětlení

– osvětlení vysoké kvality

– homogenní

– s větším kontrastem

– sníženým množstvím rozptýleného světla

– i když není zdroj osvětlení dokonalý

● roviny v nichž vzniká obraz preparátu jsou dostatečně vzdálené od rovin s rušivými elementy (vlákno žárovky, povrchové plochy optických elementů s nečistotami)

10/48

Špatné vs. dobré nastavení

11/48

Postup

● zapnout mikroskop, vložit vzorek a zaostřit při zcela otevřené aperturní (kondenzorové) i polní (kolektorové) cloně (objektiv 4x nebo 10x)

● upravit intenzitu zdroje světla

● zavřít polní clonu

● zaostřit kondenzorovou čočku tak, aby byla polní clona ostrá (bude vidět modrý a červený lem, zaostřit mezi, popř. blíže k modré)

12/48

Postup (2)

● pomocí centrovacích šroubů vycentrujeme kondenzorovou čočku tak, aby byla polní clona ve středu zorného pole

● otevřeme polní clonu těsně za zorné pole (snižuje přesvětlení, tj. pozitivně se projeví na kontrastu)

● nastavíme aperturní clonu (většinou ¾ NA objektivu)

● změna objektivu a/nebo vzorku vyžaduje nové nastavení

13/48

Nastavení aperturní clony

● kompromis

– kontrast spolu s hloubkou ostrosti

– rozlišení a barevné podání

● přesvícení (ztráta detailů, mnoho rozptýleného světla)

● optimum: vyšší rozlišení / nižší kontrast

● vysoký kontrast / nižší rozlišení („přeclonění“)

14/48

Špatné vs. dobré nastavení

15/48

Špatné vs. dobré nastavení

16/48

Pracovní postup (přehled)

● zaostřit na vzorek při zcela otevřených clonách

● upravit intenzitu zdroje světla

● zavřít polní (kolektorovou) clonu

● zaostřit kondenzorovou čočku na polní clonu

● vycentrovat kondenzorovou čočku

● otevřít polní clonu těsně za zorné pole

● nastavit aperturní clonu

17/48

Mikrobiologie

● věda studující mikroorganismy (mikroby)

● nebuněčné formy (organismy?):

– priony (infekční prionová bílkovina)

– viry (a bakteriofágy – viry bakterií)

● buněčné organismy:

– Bacteria

– Archea

– Eucarya (eukaryotní organismy)● jednobuněčné● mnohobuněčné

18/48

Lékařská mikrobiologie

● věda zabývající se mikroorganismy, které jsou medicínsky významné pro člověka (např. původci infekcí, přirozená mikroflóra atp.)

● zabývá se studiem a identifikací mikroskopických, růstových, biochemických i genetických vlastností

19/48

bakterie bakteriologie

mikromycety (plísně a kvasinky)

mykologie

(řasy) (algologie)

parazité● prvoci● helminti● členovci

parazitologie● protozoologie● helmintologie● entomologie

viry virologie

Morfologie vybraných klinicky významných mikroorganismů

● viry, vláknité houby a paraziti až v jiných prakticích

● bakterie:– koky, ve dvojicích (diplokoky), v řetízcích a ve shlucích

– tyčinky rovné či zahnuté (vibria), případně několikrát zahnuté (spirily), krátké nebo dlouhé, tvořící až vlákna či rozvětvená vlákna; konce mohou být oblé či špičaté; tyčinky můžou být různě uspořádané

– kokobacily (též kokotyčinky)

– spirochety – tenké spirálovité bakterie

– pleomorfní (beztvaré) bakterie, například mykoplasmata (nemají buněčnou stěnu, takže nemají tvar)

20/48

Morfologie vybraných klinicky významných mikroorganismů (2)

● kvasinky:– oválné buňky, dlouhé cca 5 – 10 μm (tzn. větší než

bakterie)

– někdy pučící, někdy tvořící vlákna (pseudomycelia)

21/48Foto: archiv ústavu, převzato z www.medmicro.info

Morfologie vybraných klinicky významných mikroorganismů (3)

22/48

Vzorek vs. kmen

vzorek● odebráno pacientovi,

přichází na vyšetření do laboratoře

● kusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...)

● stěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle v transportním médiu

● někdy pracujeme s celým vzorkem, jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů

23/48

kmen● čistá kultura („výpěstek“)

jednoho druhu mikroba

● kmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě

● Kochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie

Přímé vs. nepřímé metody

přímé● hledáme mikroba, jeho

část či jeho produkt (produktem může být například nějaký bakteriální jed – toxin)

– přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem (močí, krví, výtěrem z krku atp.)

– identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu

24/48

nepřímé● hledáme protilátky

● protilátka není součástí ani produktem mikroba (produkt makroorganismu, odezvou na činnost mikroba)

Přímé metody – přehled

25/48

Metoda Průkaz ve vzorku

Identifikace kmene

Mikroskopie ano ano

Kultivace ano ano

Biochemická identifikace

ne ano

Průkaz antigenu ano ano

Pokus na zvířeti ano v praxi ne

Molekulární metody ano v praxi ne*

*netýká se molekulární epidemiologie (sledování příbuznosti kmenů)

Mikroskopie

● pozorujeme mikroby, v případě vzorku i buňky hostitelského organismu (epitelie, leukocyty apod.)

● nativní preparát – velké a/nebo pohyblivé mikroby (parazity, houby, pohyblivé bakterie)

● nativní preparát v zástinu (hlavně spirochety)

● fixované a barvené preparáty – barvení podle Grama, podle Giemsy, podle Ziehl-Neelsena (použití pro různé skupiny bakterií, hub či parazitů)

● elektronová mikroskopie – u virů; spíše pro výzkum než pro běžný průkazu

26/48

Mikroskopie vzorku a kmene

27/48Foto: O. Zahradníček

Hlavní mikroskopické metody v klin. mikrobiologii

28/48

Sušení a fixace

Krycí sklíčko

Imerzní systém

Nativní preparát

NE ANO NE

Nativní zástinový preparát

NE ANO ANO

Barvené preparáty

ANO NE ANO

Příprava mikroskopického preparátu

vzorek● tekutý vzorek na podložní

sklíčko kápneme

● nátěr na špejli buď rozmícháme ve fyziologickém roztoku, nebo (pouze u barvených preparátů) přímo natřeme na sklíčko

29/48

kmen● kápneme na podložní

sklíčko kapku fyziolog. roztoku

● vyžíháme mikrobiologickou drátěnou kličku v plameni

● po zchladnutí (!) nabereme trochu hmoty bakterií

● hmotu rozmícháme v připravené kapce

Příprava nativního preparátu

● kapku, ve které je vzorek či rozmíchaný kmen, nesušíme

● přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme objektivy, které zvětšují např. 4×, 10× či 40×.

● nepoužíváme imerzní olej (!)

30/48

Úkol 2: Příprava nativního preparátu ze vzorku a z kultury

● Úkol 2a: Plastové zkumavky obsahují výtěry rozmíchané v médiu. Kápněte na sklíčko, kapku překryjete sklíčkem a pozorujte epitelie, popř. leukocyty, a mezi nimi mikroby.

● Úkol 2b: Provádíte pouze s kmenem X, je to kvasinka. Vyžíhanou kličkou naberete, rozmícháte, kličku opět vyžíháte, kapku překryjete sklíčkem a pozorujte (uvidíte pouze kvasinky).

● výsledky zakreslete a popište

31/48

Úkol 2: Ukázka nativního preparátu C. A. T.

32/48

● epiteliální bb. s adherovanými bakteriálními buňkami (malé tečky); pacientka s bakteriální vaginózou

Buněčná stěna bakterií

● grampozitivní

– mechanicky odolné

– buněčná stěna silná a jednoduchá

● gramnegativní

– chemicky odolné

– buněčná stěna tenčí a složitější

● Gramem se nebarvící bakterie

33/48

Buněčná stěna bakterií: peptidoglykan

34/48

Buněčná stěna bakterií: Gram pozitivní (G+)

35/48

Buněčná stěna bakterií: Gram negativní (G–)

36/48

Gramovo barvení

37/48

Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní

Krystal. violeť obarví se fialově obarví se fialově

Lugolův roztok vazba se upevní upevní se méně

Alkohol neodbarví se odbarví se

Safranin zůstanou fialové obarví se červeně

Gramovo barvení

● G+ bakterie

– tlustší vrstva peptidoglykanu mureinu

– pevněji váže krystalová (genciánová) violeť

– vazbu upevníme Lugolovým roztokem

– neodbarví se alkoholem

– výsledná barva fialová

● G– bakterie

– odbarví se alkoholem

– dobarví se na červeno safraninem (nebo karbolfuchsinem)

38/48

Bakterie nebarvící se Gramem

● mykobakteria– acidorezistentní, stěna je hydrofobní

– nebarví se vůbec

● mykoplasmata– nemají buněčnou stěnu vůbec

– cytoplasma se barví slabě na červeno

– velice špatně viditelná (nejen kvůli špatné barvitelnosti, ale i malé velikosti)

● spirochety– G– typ buněčné stěny, ale jsou velmi tenké

– Gramovo barvení se u nich také nepoužívá

39/48

Gramovo barvení: další buňky

● kvasinky– barví se fialově (jako G+)

– specifická buněčná stěna (jiná než bakterie), která se jen chová jako G+ BS

● lidské buňky– barví se většinou červeně

(jádra mohou být i trochu do modra)

● artefakty– různá vlákna, buněčná drť, artefakty vzniklé při barvení

– možná záměna za bakterie (!)40/48

Úkol 3a: Příprava fixovaného preparátu

● na sklíčko kápněte dvě malé kapky fyziologického roztoku

● vyžíhejte kličku a nechte zchladnout

● kličkou opatrně naberte hmotu mikrobů (kmeny A – E)

– jednou naberte tolik, aby nabraná hmota nebyla viditelná, do druhé kapky dejte hmoty více

● rozmíchejte v kapce

● kličku opět vyžíhejte a uložte zpět do stojanu

● kapku nechte uschnout

● sklíčko se zaschlou kapkou fixujte rychlejším protažením plamenem, a to třikrát

41/48

Úkol 3a: Gramovo barvení

● krystalová violeť: (20 –) 30 sekund

● (opláchnout vodou – lze vynechat)

● Lugol. roztok: (20 –) 30 sekund

● (opláchnout vodou – lze vynechat)

● Alkohol: do viditelného výstupu barviva (cca 15 – 20 sekund)

● opláchnout vodou – nezbytné!!!

● Safranin: 60 sekund

● opláchnout vodou

● osušit filtračním papírem (stačí papír z obou stran přiložit 42/48

Úkol 3b: Pozorování vzorku sputa obarveného podle Grama

● prohlédněte si předložené preparáty při zvětšení 1000x (použijte imerzi)

● zakreslete výsledek pozorování, popište i případné artefakty

● sklíčka po prohlédnutí nevyhazujte (!)

43/48

Úkol 4a: Další mikroskopické metody

● jednoduché barvení:– nouzové řešení, znázorňuje tvar velikost a uspořádání

mikrobů

– barvíme methylenovou modří (cca 2 minuty)

● Giemsovo barvení:– pro některé prvoky, hlavně Trichomonas vaginalis a

Plasmodium sp. (původci malárie)

● barvení dle Ziehl-Neelsena:

– pro acidorezistentní bakterie, zejména Mycobacterium tuberculosis, ale také Actinomyces sp. a Nocardia sp.; barví se i někteří prvoci (kokcidie)

44/48

Úkol 4a: Další mikroskopické metody (2)

● Gomoriho trichrom:

– pro střevní jednobuněčné parazity (Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica atd.)

● barvení alciánovou modří:

– na polysacharidové hmoty v bakteriálním biofilmu

● zástinová mikroskopie:

– zvláštní případ nativního preparátu, vhodný zvláště u spirochet

● fluorescenční barvení:

– fluorescenční barviva; nutno odlišit od imunofluorescence

45/48

Úkol 4b: Barvení pouzder dle Burriho

● v barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí dobarveno tuší

● mikroskopista pak tuší pouzdro tam, kde se nic neobarvilo

46/48

pathmicro.med.sc.edu

Praktické poznámky

● objektivy se utírají zásadně gázou (jednou použitá gáza se vyhodí a nepoužívá znovu)

● mikroskopický stolek lze otřít buničitou vatou; s benzínem, pokud je třeba (po použití se vyhodí)

● pokud pracujete s imerzí, očistěte imerzní objektiv gázou s benzínem

● případně takto očistěte i další objektivy, pokud jste je znečistili

● mikroskop vypněte a zakryjte

47/48

Po tomto cvičení byste měli umět:

● pracovat s mikroskopem

● vysvětlit obor zájmu lékařské mikrobiologie

● orientovat se ve tvarech a možných uspořádání mikrobů

● připravit nativní preparát vzorku i kmene

● znát nejrůznější barvící metody

● nabarvit preparát podle Grama a vyhodnotit jej

48/48