ILLUMINA PROPRIETARYパーツ番号 15031827改訂 A2011年 12月

MiSeq®SampleSheetQuickReferenceGuide(MiSeq®サンプルシートクイックリファレンスガイド)

FOR RESEARCH USE ONLY

Introduction (はじめに) 3

Setting Up the Sample Sheet (サンプルシートのセットアップ) 5

Sample Sheet Parameters (サンプルシートパラメーター) 7

Analysis Workflow (解析ワークフロー) 12

Technical Assistance (テクニカルサポート )

本書および本書の内容は Illumina, Inc. (Illumina) が所有権を有する知的財産であり、顧客が契約の下で使用する

ことを意図したものです。本書に記載されたシステムの操作以外の目的での使用は意図されていません。Illumina

の事前の書面による許可なく、目的や方法を問わず、本書およびその内容を使用または配布、通信、開示、また

は複製することを禁じます。

本システムやそのすべての構成部品が正常に動作するためには、経験を積んだオペレータが本書の手順に厳密

かつ明示的に従う必要があります。 本システムまたはその構成部品を操作する前に、本書の内容を熟読し、完全

に理解する必要があります。

本システムまたはその構成部品を操作する前に、本書の熟読や完全な理解を怠り、本書の記載に従わない場合、

装置またはその部品が損傷したり、装置またはその部品を操作するオペレータが怪我をしたりする恐れがあります。

また、Illumina, Inc. は、その特許権、登録商標権、著作権、または慣習法上の権利もしくはその他の類似の権利の

下でのいかなる許諾も付与しません。Illumina, Inc. は、予告なく、本書に記載されたあらゆる手順、製品、またはそ

の部品を変更する権利を有します。発行日の時点で、本書の内容については可能な限り完全かつ正確であるよう

に万全を期しておりますが、Illumina は保証または適合性を黙示するものではなく、本書に含まれる情報に起因し

て発生したいかなる損害についても一切責任を負いかねます。

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Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iSelect, MiSeq, Nextera, Sentrix,

SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, パンプキンオレンジ色, および Genetic Energy ストリーミングベースデザイン

は Illumina, Inc. の登録商標または商標です。ここに含まれるその他すべてのブランドおよび名称の所有権はそれ

ぞれの所有者に帰属します。

Introduction(は

じめに)

MiSeqサンプルシートクイックリファレンスガイド 3

Introduction (はじめに)

サンプルシートは、シーケンスランをセットアップ、実行、および分析するために必要な情報を保持するコンマ区切り値 (*.csv) ファイルです。

ランを開始する前に、Setup Option (オプションのセットアップ) で指定した、装置制御コンピュータ内のロケーション、または、ネットワーク上のロケーションに、サンプルシートをコピーします。。新しいサンプルシートを追加するには、Manage Files (ファイルの管理)機能を使用します。詳細については、『MiSeq System User Guide (MiSeq システムユーザーガイド)』を参照してください。

ランの開始時に、ソフトウェアはサンプルシートをランフォルダのルートにコピーします。

ラン終了時に、サンプルシートはセカンダリ解析のために、MiSeq® Reporter 解析ソフトウェアによって使用されます。

Illumina Experiment Managerサンプルシートを作成するには、Experiment Manager を使用できます。 Experiment Managerはウィザードベースのアプリケーションであり、表示される手順に従うだけで、ランに対する解析ワークフローに基づいてサンプルシートを作成することが可能です。

Experiment Manager により、サンプルプレートのパラメーター (サンプル ID やデュアルインデックスなど) と、以下のライブラリー調製プロトコールの 96 ウェルプレートに該当するその他のパラメーターを記録する機能が提供されます。

} Nextera

} TruSeq DNA

} TruSeq RNA

} Small RNA

} TruSeq カスタムアンプリコン

Experiment Manager を使用すると、サンプルプレートパラメーターをサンプルシートにインポートできます。

Experiment Manager は、あらゆる Windows プラットフォームで実行できます。ExperimentManager は、Illumina の Web サイト (http://www.illumina.com) からダウンロードできます。MiSeq サポートページにアクセスし、[Downloads] をクリックしてください。ダウンロードするには、MyIllumina アカウントが必要となります。

Sample Sheet Template (サンプルシートテンプレート )サンプルシートテンプレートは、Excel や Notepad (メモ帳)で開いたり編集したりすることが可能です。サンプルシートテンプレートは、Illumina の Web サイト (http://www.illumina.com) からダウンロードできます。MiSeq サポートページにアクセスし、[Downloads] をクリックしてください。ダウンロードするには、MyIllumina アカウントが必要となります。

注意

サンプルシートのフィールドには、カンマ、スペース、またはその他の無効な文字を使用しないでください。フィールド内にカンマが含まれていると、ソフトウェアではサンプルシートを正しく読み取ることができません。Illumina では、Illumina Experiment Managerを使用してサンプルシートを正しく作成することを推奨します。

4 パーツ番号 15031827改訂 A

Naming the Sample Sheet (サンプルシートの名前付け)ラン前のチェックの実行時に、ソフトウェアでは、前のランセットアップ手順で装置にロードされた試薬カートリッジに関連するサンプルシートを自動的に検索します。そのため、Illumina では、ランに使用する試薬カートリッジのバーコード番号をサンプルシート名にすることを推奨します (形式:試薬カートリッジのバーコード番号+ *.csv拡張子)。バーコード番号は、カートリッジラベルのバーコードの下に記載されています。

Setting

Upthe

Sam

pleSheet(サ

ンプルシートのセットアップ)

MiSeqサンプルシートクイックリファレンスガイド 5

SettingUp theSample Sheet (サンプルシートのセットアップ)

注意

Illumina では、シーケンスランに使用する試薬カートリッジのバーコード番号をサンプルシート名にすることを推奨します。 バーコード番号は、カートリッジラベルに記載されています。

1 試薬カートリッジのバーコード番号に csv拡張子を付ける形で、サンプルシートに名前を

付けます。 この例では、サンプルシート名はMS0001082-50.csvのようになります。

図 1 試薬カートリッジラベル

2 Illumina Experiment Manager またはサンプルシートテンプレートを使用して、サンプル

シートを装置外で作成します。必要に応じて、実験者名、プロジェクト名、実験名、および

日付も入力してください。

3 適切な解析ワークフロー (Resequencing、Amplicon、Metagenomics、DenovoAssembly、

SmallRNA、または LibraryQC) を入力します。この際、スペースを入力しないように注意し

てください。各ワークフローの詳細については、下の表を参照してください。

4 ランに対するケミストリーを指定します。

• デュアルインデックスランに対しては、「amplicon」と入力します。

• その他のすべてのランに対しては、このフィールドを空白のままにするか、または

「default」を入力します。

5 各リードに対するサイクル数を入力します。

注意

インデックスランの場合、[Data] セクションで各サンプルのインデックス配列を含める必要があります。 Index1 のパラメーターに対しては、i7 のインデックス配列を記入してください。 Index2 のパラメーター (アンプリコンケミストリーに固有) に対しては、i5 のインデックス配列を入力してください。

6 実施する解析ワークフローに固有な残りのサンプルシートセクションへの入力を完了させ

ます。 各サンプルには一意のサンプル ID (SampleID) が必要です。 サンプル名

(Sample_Name) は同じでもかまいません。

解析ワークフロー Manifests SiteReports Data

Resequencing 該当なし オプション 必須:SampleID、GenomeFolder

オプション:Index、Index2

Amplicon 必須 オプション 必須:SampleID、Manifest

オプション:Index、Index2、GenomeFolder

DenovoAssembly 該当なし 該当なし 必須:SampleID

6 パーツ番号 15031827改訂 A

解析ワークフロー Manifests SiteReports Data

オプション:Index、Index2、GenomeFolder

SmallRNA 該当なし 該当なし 必須:SampleID、Contaminants、miRNA、RNA

オプション:Index、Index2、GenomeFolder

Metagenomics 該当なし 該当なし 必須:SampleID

オプション:Index、Index2

LibraryQC 該当なし 該当なし 必須:SampleID、GenomeFolder

オプション:Index、Index2

注意

TruSeq カスタムアンプリコンサンプルシートの適切なインデックス配列の組み合わせについては、『TruSeq Custom Amplicon Library Preparation Guide (TruSeq カスタムアンプリコンライブラリー調製ガイド)』を参照してください。

Nextera DNA サンプルシートの適切なインデックス配列の組み合わせについては、『Nextera DNA Sample Preparation Guide (Nextera DNA サンプル調製ガイド)』を参照してください。

7 [Setup Options] で指定したネットワークの場所にサンプルシートをコピーするか、または

USBフラッシュドライブと、[Welcome] 画面からアクセスできる [Manage Files]機能を使用

して、装置にサンプルシートをコピーします。

詳細については、『MiSeq システムユーザーガイド』を参照してください。

Sam

pleSheetP

arameters

(サンプルシートパラメーター)

MiSeqサンプルシートクイックリファレンスガイド 7

Sample SheetParameters (サンプルシートパラメーター)

サンプルシートは、[Header]、[Reads]、[Manifests]、[Data] など、セクション別に整理されます。セクションの見出しでは、大文字と小文字が区別されます。その他のすべてのフィールドでは、大文字と小文字が区別されません。

図 2 Excel で開いたサンプルシートの例

ランに対してサンプルシートのセクションがすべて適用されるわけではありません。適用セクションは、ランに固有の解析ワークフローによって異なります。

Header (ヘッダー)サンプルシートの [Header]セクションには、ランに関する情報を含めます。 余分なフィールドは無視されます。

パラメーター 説明

InvestigatorName 実験者名

ProjectName プロジェクト名

ExperimentName 実験名

Date 実験日

Workflow 必須

解析ワークフロー名 (Resequencing、Amplicon、DenovoAssembly、SmallRNA、Metagenomics、または LibraryQC) を正しく入力します。詳細については、12 ページの「Analysis Workflow (解析ワークフロー)」を参照してください。

Illumina Experiment Manager を使用する場合は、ドロップダウンリストからワークフローを選択します。

Chemistry このフィールドにより、ランに固有のレシピを構築するために使用されるレシピフラグメントが識別されます。 このフィールドを空白にした場合、システムではデフォルトのレシピフラグメントを使用します。

オプション: TruSeq RNA ライブラリーまたは TruSeq DNA ライブラリーに対しては、このフィールドを空白のままにし、デフォルト設定を使用できます。

必須: デュアルインデックスを使用するすべてのワークフロー (特にNexteraおよび TruSeq カスタムアンプリコン) で必須フィールドです。このフィールドには「amplicon」を入力してください。

8 パーツ番号 15031827改訂 A

Reads (リード )[Reads]セクションでは、各リードのシーケンスサイクル数を指定します。

パラメーター 説明

リード 1 に対するサイクル数 ターゲットシーケンスのリードの長さ。

インデックスリードに対するサイクル数は、[Data] セクションで定義したインデックス配列によって示されます。

リード 2 に対するサイクル数 ターゲットシーケンスのリードの長さ。

注意

インデックスリードに対するサイクル数は、[Data] セクションで定義したインデックス配列によって示されます。

Manifests (マニフェスト )TruSeq カスタムアンプリコンライブラリーのシーケンスに対する Amplicon 解析ワークフローの場合、サンプルシートのこのセクションは必須です。その他の解析ワークフローを使用する場合は、このセクションに入力する必要はありません。

パラメーター 説明

マニフェストファイル名 カスタムアッセイ (CAT) に対して Illumina によって提供されるマニフェストファイルの名前。マニフェストファイルはマニフェストフォルダ内に存在します。

マニフェスト名を入力する際には、ファイル拡張子 (*.txt) を含めないでください。

マニフェストは複数指定することが可能です (カスタム CATに対して 1つ、コントロール CATに対して 1つ)。 個々のマニフェストは、サンプルシートの [Manifests] セクションでA および Bとして定義されます。

マニフェストファイルは、[Manage Files] 機能を使用して指定の場所にロードします。詳細については、『MiSeq System User Guide (MiSeq システムユーザーガイド)』を参照してください。

図 3 複数のマニフェストが指定されているサンプルシートの例

Sam

pleSheetP

arameters

(サンプルシートパラメーター)

MiSeqサンプルシートクイックリファレンスガイド 9

SiteReports (SiteReport)サンプルシートのこのセクションは、Resequencing解析ワークフローと Amplicon 解析ワークフローによって使用されます。

パラメーター 説明

SiteReport インプットファイル名

[SiteReports] セクションの各行は、SiteReport インプットファイルの名前です。 特定の染色体における位置をこのファイルで指定すると、その位置で見つかった遺伝子型がレポートされます。 これはユーザーが生成するファイルです。

インプットファイルは、各ランに対して複数使用することが可能です。SiteReport インプットファイルは、サンプルシートと同じフォルダ場所に存在する必要があります。

SiteReport インプットファイルはカンマ区切り値 (*.csv) ファイルで、以下のルールが適用されます。

• 最初の行はカラム名である。 必須カラムは、Position (位置) とChromosome (染色体) です。

• ユーザー定義のその他のカラムは、指定の位置に対して生成される解析レポートに付け足される。

SiteReport インプットファイル名を入力する際には、ファイル拡張子(*.csv) を含めないでください。

Data (データ)このセクションでは、1 行につき 1 つのサンプルに関する情報を入力します。 このセクションには少なくとも 1 つのサンプルを含める必要があります。 このセクションでは、解析ワークフローごとに異なるカラムが必要となります。カラムの順序は重要ではありません。

パラメーター 説明

SampleID 必須

通常ではこれはバーコードですが、任意の値を指定することもできます(ただし、固有でなければならない)。

Sample_Name オプション

これは、レポートWeb ページで使用されます。

Index シングルインデックスまたはデュアルインデックスでのマルチサンプルアッセイに対しては必須です。

ヌクレオチドシーケンス: 有効な文字は A、C、G、T、および N で、N は任意の塩基に相当します。 i7 のインデックス配列を入力してください。

Index2 デュアルインデックス (Illumina の Nextera サンプル調製シーケンスやTruSeq カスタムアンプリコンシーケンスなど) でのマルチサンプルアッセイに対しては必須です。

ヌクレオチドシーケンス: 有効な文字は A、C、G、T、および N で、N は任意の塩基に相当します。 i5 のインデックス配列を入力してください。

Resequencingワークフローに対するその他のカラム

パラメーター 説明

GenomeFolder 必須

アライメントステップで使用される FASTA ファイルを含んでいるリファレンスゲノムフォルダ。

GenomeFolder には、ネットワークの場所または MiSeq のローカルドライブを指定できます。 最適な結果を実現するには、ローカルハードドライブにゲノムを格納するか、または BaseSpace を使用してください。

10 パーツ番号 15031827改訂 A

パラメーター 説明

GenomeFolder の場所は、FASTA ファイルを含んでいるフォルダにする必 要 が あ り ま す。 ファ イ ル パ ス の 例 は、D:\Illumina\MiSeqReporter\Genomes\PhiX\Illumina\RTA\Sequence\Chromosomes です。

Ampliconワークフローに対するその他のカラム

パラメーター 説明

GenomeFolder 推奨

これは、変異のアノテーションを提供し (可能な場合)、*.bamファイルアウトプットで染色体サイズを設定するために使用されます。

Manifest 必須

このサンプルによって使用されるアッセイ (CAT) に対してマニフェストファイルを指定します。

DenovoAssembly ワークフローに対するその他のカラム

パラメーター 説明

GenomeFolder

(または Genome)

オプション

このフィールドに入力する場合は、ゲノムフォルダへの絶対パスを指定します。

• 入力 され たフォ ル ダ が存在しな い場合、MiSeq Reporterは、GenomePath 構成設定に指定されたゲノム文字列を使用します。

• パスが存在しない場合、MiSeq Reporter では処理を停止します。

SmallRNAワークフローに対するその他のカラム

パラメーター 説明

GenomeFolder オプション

このフィールドに入力した場合、完全リファレンスゲノムに対してクラスターがアラインされます。

Contaminants 必須

コンタミネーションのFASTA ファイルを含んでいるフォルダへのパス。

miRNA 必須

mature miRNA の FASTA ファイルを含んでいるフォルダへのパス。

RNA 必須

small RNA の FASTA ファイルを含んでいるフォルダへのパス。

Library QCワークフローに対するその他のカラム

パラメーター 説明

GenomeFolder 必須

アライメントステップで使用される FASTA ファイルを含んでいるリファレンスゲノムフォルダ。

Sam

pleSheetP

arameters

(サンプルシートパラメーター)

MiSeqサンプルシートクイックリファレンスガイド 11

Settings (設定 )サンプルシートの [Settings] セクションは、オプションで指定します。以下は、このセクションで入力可能なエントリです。

パラメーター 説明

FilterPCRDuplicates 0 または 1 を設定します。 デフォルトは 1 (フィルタリング) です。

1 に設定すると、PCR重複にフラグが付けられ、変異コーリングに使用されなくなります。 重複は、両方のリードでのアライメント位置が完全に同じであるペアエンドリードとして定義されます。

MinQScore 変異コールを行う際のQ値のしきい値を指定します。

OnlyGenerateFastq 0 または 1 を設定します。 デフォルトは 0 です。

1 に設定すると、MiSeq Reporter では FASTQ ファイルを生成し、その後ワークフローを終了します。このオプションは、FASTQ ファイルを処理するために CASAVA または第三者ツールの使用を希望する場合のショートカットとして提供されています。

注意: データをアラインしない場合でも、GenomeFolder に対してパスを指定する必要があります。

Adapter 一部のクラスターは、アダプターからのサンプル DNA とリードベースを超えてシーケンスできます。

アダプターシーケンスをマスクするには、ここでそのアダプターシーケンスを指定します。 アダプターシーケンスをマスクすると、2 次解析における精度と速度が増します。

注意: SmallRNA ワークフローでのアダプターのトリミングは、デフォルトで常に行われます。 また、Illumina の Nextera サンプル調製キットを使用して調製したサンプルに対しては、アダプターのマスキングが推奨されます。

12 パーツ番号 15031827改訂 A

AnalysisWorkflow (解析ワークフロー)

解析ワークフローは、MiSeq の 2 次解析ソフトウェアである MiSeq Reporter によって実行される手順です。2 次解析は、Real Time Analysis (RTA) ソフトウェアによって 1 次解析が完了すると開始します。

MiSeq は、6 つの解析ワークフローをサポートします。ランに対する解析ワークフローは、サンプルシートで指定されます。サンプルシートに解析ワークフローを入力する際には、下の「ワークフロー」カラムに表示されているとおりに名前を入力してください。

ワークフロー アプリケーション アウトプット

ターゲットリシーケンス

入力名:Resequencing

ヒトゲノムの濃縮部分のシーケンス、または大腸菌のような小さなゲノムのシーケンス。

リードはリファレンスに対してアラインされ、変異がレポートされる。

*.bam 形式でアラインされたリード。

*.vcf 形式の変異コール。

アンプリコンシーケンス

入力名:Amplicon

特定のゲノム位置を対象とするプローブからの TruSeq カスタムアンプリコンのシーケンス (最大約 96 サンプルから最大約 384 箇所)。

ゲノムリファレンスは推奨されるが、必須ではない。 リファレンスを含めると、*.bamファイルヘッダーのゲノムサイズが正確になり、dbSNP または遺伝子内での変異のアノテーションが可能になる。

リードは、サンプルシートで指定したマニフェストファイルに対してアラインされる。マニフェストは 2 つ (コントロール用に 1つとサンプル用に1つ) 指定できる。

*.bam 形式でアラインされたリード。

*.vcf 形式の変異コール。

デノボアセンブリ

入力名: DenovoAssembly

ゲノムリファレンスを使用しない、リードからの小さい (< 20 Mb) ゲノムのアセンブリ。

ゲノムリファレンスが含まれる場合、ゲノム位置のリファレンス対コンティグのドットプロットが生成される。

FASTA 形式でのコンティグ。

Small RNA シーケンス

入力名:SmallRNA

miRNA のシーケンス。

リードは、コ ンタミネーション、maturemiRNA、smRNA、ゲノムリファレンスの各順で指定したファイルに対してアラインされる。

各レコードの相対存在度に関するレポート。

メタゲノム解析

入力名:Metagenomics

ゲノムリファレンスはメタゲノム解析ワークフローに対して必須ではない。リードは、MiSeq Reporter ソフトウェアに付属の16S rRNA データのデータベースを使用して分類される。

界から属まで、分類群別のリード分類。

ライブラリー QC

入力名:LibraryQC

DNA ライブラリー の品質管理 (QC:Quality Control) を行ったり、サンプルごとの統計を生成したりするための、リファレンスゲノムのクイックリシーケンス。

サンプル ごとのサマリー統計。

TechnicalAssistance

(テクニカルサポート)

MiSeqサンプルシートクイックリファレンスガイド

Technical Assistance (テクニカルサポート )

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Illumina Web サイト http://www.illumina.com

電子メール techsupport@illumina.com

表 1 Illumina一般問合わせ先情報

地域 問合わせ先番号 地域 問合わせ先番号

北米 1.800.809.4566 イタリア 800.874909

オーストリア 0800.296575 オランダ 0800.0223859

ベルギー 0800.81102 ノルウェー 800.16836

デンマーク 80882346 スペイン 900.812168

フィンランド 0800.918363 スウェーデン 020790181

フランス 0800.911850 スイス 0800.563118

ドイツ 0800.180.8994 イギリス 0800.917.0041

アイルランド 1.800.812949 その他の国 +44.1799.534000

表 2 Illumina カスタマーサポート電話番号

MSDSs (化学物質安全データシート)

化学物質安全データシート (MSDS) は Illumina の Web サイト http://www.illumina.com/msdsでご覧になれます。

Product Documentation (製品マニュアル)

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