İmmünohematolojikTestler - anadoluissagligi.com · 2017. 1. 15. · 10 µL Hasta Kan ı İnkübasyon 37 °C’de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika De ğerlendirme Donör Eritrosit

İmmünohematolojik Testler

Dr. İshak Özel TEKİNZKÜ Tıp Fakültesiİmmünoloji A.D.

Clin Chem Lab Med 2010;48(8):1053–1054Pasqualepaolo Pagliaro

İmmünolog lamba cini

Đmmünohematolojik Testler

�Kan gruplama�Çapraz Karşılaştırma�Antikor tarama�Antikor tanımlama

Serolojik testler:

Ag-Ab birleşmesi tepkimelerinin görülebilir, gözlemlenebilir, ölçülebilir hale getirilmesi temelli tanısal yöntemlerdir.

Aglutinasyon

Hemaglutinasyon

Eritrosit Serolojisi

• Hemaglutinasyon- Lam (slide)- Tüp- Jel Santrifügasyon- Mikroplak yöntemleri

Eritrosit Serolojisi

• RIA• EIA• PCR• Moleküler baskılama• Çoklu analit ölçümleri• ….

Karl Landsteiner

• 1900 yılında ABO kan gruplarını tanımlamasıkan transfüzyonlarında dönüm noktasıdır

• İmmünohematolojik testlerin geliştirilmesi Landsteiner’ın ilk bulgularıyla doğrudan ilgilidir -Eritrositlerin farklı bireylerin serum/plazması ile aglutinasyonu-Bireylerin kanında diğer kan gruplarındaki eritrositleri kümelendiren doğal antikorların varlığı

Eritrosit Transfüzyonu

Plazma Transfüzyonu

Biyolojide Redüksiyonizm

“Karmaşık sistemlerinbasit bileşenleriiçinde analizi”

Eritrositlere İmmün Yanıt

• Allojenik eritrositlerin yıkımı• Otolog eritrositlerin yıkımı• Fetal ve yenidoğan eritrositlerin yıkımı• Transplant dokularının yıkımı

ABO Kan Grup Sistemi

ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklıdır.• Serumda aglutinin varlığı• ABH ag’leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur.• Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt

gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemidir.

ABO-Rh Direkt Gruplama

Numune Hazırlanması( % 0,8’lik Eritrosit

Süspansiyonu )0,5 ml. Diluent-I (1 basım)

50 µL Tam Kan veya 25 µL sediment

İnkübasyon18-25 °C’de 5-10 Dakika

Numune DağıtılmasıHer mikrotüpe 25 µL

% 0.8’lik Eritrosit Süspansiyonu

Santrifüj10 Dakika

Değerlendirme

ABO Karşıt Gruplama

Test Hücrelerinin Hazırlanması

( A1, A2, B, 0,I,II )Hücreler resüspanse edilerek

oda ısısına getirilir

Hücrelerin DağıtılmasıHer mikrotüpe 50 µL

etiketine uyan test hücresi pipetlenir.

Santrifüj10 Dakika

Hasta Serumunun DağıtılmasıHer mikrotüpe 50 µL

hasta serumu veya plazmasıpipetlenir.

İnkübasyon18-25 °C’de 5-10 Dakika

Değerlendirme

Type A1 cells B cells

O + +

A 0 +

B + 0

AB 0 0

ABO Karşıt Gruplama

ISBT Kan Gruplama SistemleriAdı KısaltmaABO ABOMNS MNSP PRh RHLutheran LUKell KELLewis LEDuffy FYKiddJ KDiego DICartwright YTXG XGScianna SCDombrock DOColton COLandsteiner-Wiener LWChido/Rodgers CH/RGHh HKx XKGerbich GECromer CROMKnops KNIndian INOk OKRaph RAPHJMH JMH

Antikor Tarama - Tanımlama

• Antikor Tarama Testi

Eritrosit antijenlerine karşı antikor olup olmadığını saptamak için yapılır

• Antikor Tanımlama Testi

Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkili olduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğini saptamak için yapılır

Antikor Tarama• Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı

• Klinik önem– Antikorun 37oC’de reaktif olması– Hemoliz yapması– Eritrosit yaşam süresini azaltması

DATDirekt Coombs Testi

Reaksiyon

güçlendiriciler

A H G (Anti Human Globülin))

Tüpte DAT

37

Santrifüj10 Dakika Değerlendirme

++++ +++ ++ + - -

Hasta Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması

( % 0,8’lik Eritrosit Süspansiyonu )1 ml. Diluent-II (2 basım)

10 µL Hasta Kanı

Numune DağıtılmasıHer mikrotüpe 50 µL

% 0.8’lik Eritrosit Süspansiyonu

++++ +++ ++ + - -

DAT

DAT POZİTİFLİK• Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş

otoantikorların komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini kaplaması

• Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit yüzeyini kaplaması

• Verici plazmasındaki antikorların alıcıeritrositlerin yüzeyini kaplaması

39

DAT

Antikor Tarama

Hücreler

Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3 farklı donörden alınmış test hücreleri tarama, daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama testlerinde kullanılmalıdır.

IAT

1 2 3

1 damla hücre

+

2 damla hasta serumu� �

ANTİKOR TARAMA (IAT-ET)

Santrifüj10 Dakika

DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.

Hücre vetablonun Lot numarası aynı

olmalıdır.

Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma

++++ +++ ++ + - -


( IP, IIP, IIIP )Hücreler resüspanse edilerek


I II III I II III

İnkübasyon37 °C’de 15 Dakika

I II III I II III

Test Hücrelerinin Hazırlanması( I, II, III )

Hücreler resüspanse edilerekoda ısısına getirilir

Santrifüj10 Dakika



olmalıdır.


++++ +++ ++ + - -

I II III I II III


I II III I II III

Test Hücrelerinin Hazırlanması( I, II, III )

Hücreler resüspanse edilerekoda ısısına getirilir

* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin KartıKullanılır

* *

ANTİKOR TARAMA - CA

IAT Etkileyen Faktörler

• İnkübasyon süresi ve sıcaklık• pH• İyonik konsantrasyon• Antikorun afinite sabiti• Antijen ve antikor oranı

İnkübasyon Süresi ve Sıcaklık• Aglütinasyonun ilk safhasında

veya sensitizasyon fazını etkiler

• Klinik olarak önemli antikorlar, genellikle 30-37°C arasında reaksiyona girer

• Çoğu antikorlar, tuz ve albuminli test ortamlarıkullanıldığı takdirde ortalama 30 dakikalık bir inkübasyon süresi gerektirir

• Zayıf antikorlar için sürenin uzatılması gerekebilir

pH

• 6.8-7.2 fizyolojik pH uygundur

İyonik Güç• Serum fizyolojikli ortamda Na+ (negatif yük

etrafında) Cl- (pozitif yük etrafında) iyonlarıantikor ve antijenin etrafında kümelenir

• Zıt yüklü moleküller arasındaki çekme gücüazalınca antikorun antijenle bir araya gelmesi engellenir

• Düşük iyon gücüne sahip solüsyonlar (LISS) kullanıldığında ortamdaki iyon sayısı azalır,pozitif ve negatif yükler ortaya çıkar

• LISS inkübasyon süresini kısaltır(37°C’de 10-15 dakika)

Antikorun Afinitesi

• Afinite, eritrositin herhangi bir antikora karşıözgül olarak sahip olduğu karakteristik bağlanma özelliğidir

• Genelde denge sabiti ne kadar yüksekse antijen –antikor reaksiyonunun duyarlanma fazında antikorların birleşmesi o kadar yüksektir

Antijen-Antikor Oranı

• Reaksiyon hızı, ortamdaki antikor miktarı ve eritrosit antijenlerinin sayısına bağlıdır

• Antikor miktarını artırmak, test duyarlılığını artırabilir.

• Nadiren, önemli antikor fazlası prozon fenomeninin oluşmasına neden olur.

Test Hücreleri

Tüpte Antikor Tanımlama

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

� 1 damla hücre

+

2 damla hasta serumu� �

ANTİKOR TANIMLAMA - IAT

Santrifüj10 Dakika



olmalıdır.



( 11’li Normal Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek


++++ +++ ++ + - -

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6


++++ +++ ++ + -

7 8 9 10 11

7 8 9 10 11

Santrifüj10 Dakika



olmalıdır.


Adı SoyadıTarih

++++ +++ ++ + - -

1 2 3 4 5 6


7 8 9 10 11

++++ +++ ++ + -


( 11’li Enzimli Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek


1 2 3 4 5

67 8 9 10 11

ANTİKOR TANIMLAMA – ET

Santrifüj10 Dakika



olmalıdır.


Adı SoyadıTarih

++++ +++ ++ + - -

1 2 3 4 5 6


7 8 9 10 11

++++ +++ ++ + -


( 11’li Normal Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek


1 2 3 4 5

6

7 8 9 10 11

* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin KartıKullanılır

**

ANTİKOR TANIMLAMA – CA

Değerlendirme

Antikor Tanımlama

Anti-E

Elüsyon

• Eritrosite bağlı antikorların ayrıştırılıp tanımlanmasına yönelik–Isı ile–Kimyasal yollar ile

Çapraz Karşılaştırma

• ABO ve Rh sistemleri dışında bulunan kan gruplarınedeniyle önemli

• Kan transfüzyonu öncesi yapılmasıgerekir

• Lewis; Lea - Le - Leb • MN; M - N - S - s -

U • P; P1 - P2 - p • Luteren; Lua - Lub • Kell; K - k • Duffy; Fya - Fyb • İi; İ - i


Verici Eritrositi Hasta Serumu

Aglutinasyon yok ~ uyumlu

Aglutinasyon ~ uyumsuz


Hasta Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması


10 µL Hasta Kanı


Santrifüj10 Dakika

Değerlendirme

Donör Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması


10 µL Donör Kanı

Dağıtım

A B D Enz. AHG AHG

Donör E.S. 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL -

Hasta E.S. 50 µL 50 µL 50 µL - - 50 µL

Hasta Serumu - - - 25 µL 25 µL 25 µL

Diluent-I 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL - -


• ABO – Rh uygun kan % 98 uyum• Antikor tarama -tanımlama• Çapraz karşılaştırma• % 2 ek uygunluk

Elektronik Çapraz Karşılaştırma

• Ölçülebilir olanı ölç,

ölçülemeyeni

ölçülebilir hale getir.

Galileo Galilei

• Genomics• Proteomics• Glucomics

Genotip Belirleme

• Fetal kan gruplarının belirlenmesi (YDHH)• Otoantikor varlığı (DAT+)• Yakın dönemde çoklu kan transfüzyonu• Nadir ve zayıf antijen eksprese edenler• Hasta ya da vericide antijen gösterilemediğinde• Antijen negatif kan tiplerinde , çıplak ve yeni

allel tanımlamada • Antikor tanımlama için verici tiplendirmede

• PCR-SSP

• PCR-RFLP

• Taqman

• …

"lab on a chip"

SNP Saptama Sistemleri

DışDeğişkenler

AlgılananKullanışlılık

AlgılananKullanımKolaylığı

Kullanıma KarşıTutum

Kullanım Niyeti

Gerçek sistem kullanımı

Technology Acceptance Model (TAM)

Davis, F. D., Bagozzi, R. P., and Warshaw, P. R. "User Acceptance of Computer Technology: A Comparison of Two Theoretical Models," Management Science, 35, 1989, 982-1003.

Performans beklentisi

Eforbeklentisi

Sosyaletki

KolaylaştırılmışŞartlar

Kullanımniyeti

Kullanımdavranışı

Cinsiyet Yaş DeneyimGönüllükullanım

Venkatesh, V., Morris, M.G., Davis, F.D., and Davis, G.B. “User Acceptance of Information Technology: Toward a Unified View,” MIS Quarterly, 27, 2003, 425-478

Unified Theory of Acceptance and Use of Technology (UTAUT)

Çoklu Analiz Sistemleri

� Birçok biyobelirteç ve hücre içi sinyal sisteminin çoklu saptanması avantajı

� Antijen ya da antikorlar ELISA daki gibi bir zemine sabitlenirse ‘’planar array’’,mikrokürelere sabitlenirse ‘’Süspansiyon ya da bead array’’olarak adlandırılırlar.

Planar Array Bead Array

Array

• Dizi• Nesnelerin sistematik düzenlenmesi• Genellikle satır ve sütünlar kullanılır

Planar Array

• Avantaj:Kompleks setler oluşturabilmek• Problem:

-Antijen üç boyutlu yapısının bozulabilmesi-Sterik engellenme

Bead Array

� Avantaj:Esneklik (Cihaz,taşıyıcı küre…)Sterik engellenme sorunu yok

� Problem:?

Antikor Temelli Protein Array

1.Plak ya da membrana sabitlenmiş antikor arraydeçözünür örneğin inkübasyonu

2. Aynı antijen setine özgül işaretli çözünür antikor eklenmesi

3. Kantitatif sinyal oluşumu

Veri seti

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

Multipleks Kitlerin Avantajları

� Tek örnekte 20’den fazla analitin eş zamanlı ölçümü

� Aynı anda 20’den fazla analitin bireysel karşılaştırılması

� Sadece 25 µl örnek hacmiyle 20’den fazla analit ölçümü

� Geniş standart aralığı� 96-çukurlu plak ya da

tüplerde kolay uygulama� Flow cytometry ve özel

Luminex cihazlarda ortak kullanım

Mikroküreler

1. Antikor kaplı küre

2. Antikor analiti tutar

3. Floresan işaretli raportör antikora bağlanan analite bağlanır

4. Küre ve raportör laser ışıkla sayılır

Laser A

Laser B

Kırmızı lazer küreyi okur

Yeşil lazer hedef miktarını belirler

Yazılım analizi anında gerçekleştirir

1 saatten az sürede 10000 adet sonuçanalizlenir.

Mikrokuyucuklar Mikroaray Mikroküre temelli

xMap

Serolojide teknolojiye paralel ilerlemeler:

– Multipleks ve paralel analizler

Test tüpleri

Teknolojik DeTeknolojik Değğiişşimim

Akan Hücre Ölçer

Örnek girişi

Mikroskopobjektifi

Mikroskopobjektifi

Uyarım filtrebloğu

Emisyon

Filtre

blok

Ön açı saçılımı PMT

Geniş açı saçılımı PMT

Floresan PMT

Floresan PMT

Oynar Ayna

Oküler

Işık kaynağı

Floresan PMT

Emisyon

Filtre

blok

Oynar Ayna3

Oküler

YLaser

Side Scatter (SSC)90° sapma~ Hücre yapıları

Forward Scatter (FSC)

< 10° sapma

~ hücre büyüklüğü

Floresan ve antijen yoğunluğu

• Aynı anda kaç parametre çalışabilirsiniz?

• 60 parametreye ne dersiniz?• Florokromlar ve ilişkili sorunlar da

olmasa

Dr. Olga Ornatsky Dr. Scott D. Tanner

CyTOF™

Mass Cytometry

CyTOF

• Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometer (ICP-TOF MS)-Kompleks matrikslerden stabil izotopların kantitatif ölçümü

CyTOF kütle sitometri şematik gösterimiAnalytical Chemistry, Vol. 81, No. 16, August

15, 2009

O. Ornatsky et al. / Journal of Immunological Methods 361 (2010) 1–20

Antikora metal içeren polimer takılması

KG1a (A) and Ramos (B) hücre serilerininMass Cytometry analizi (Flow-jo yazılımı ile)

O. Ornatsky et al. / Journal of Immunological Methods 361 (2010) 1–20

Konjugat kullanmadan özgül antikor varlığını nasıl gösteririz?

AFM

Atomik Kuvvet Mikroskopu

Moleküler Baskılama

Ağı nereye atacağınızı bilmeniz dileğiyle

Documents

İmmünohematolojikTestler - anadoluissagligi.com · 2017. 1. 15. · 10 µL Hasta Kan ı İnkübasyon 37 °C’de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika De ğerlendirme Donör Eritrosit