Upload
others
View
5
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU ---------------
UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE
SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE
Mémoire Présenté
Par : Pingdwende Kader Aziz BAMOGO
Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées
de l’Université de Ouagadougou
SUR LE THEME:
DEVELOPPEMENT D’OUTILS BIOTECHNOLOGIQUES VIRAUX
POUR LA PRODUCTION DE PROTEINES A FORTE VALEUR
AJOUTEE DANS DES BIOSYSTEMES VEGETAUX.
Soutenu le……………………. devant le jury composé de :
Président : Prof XX, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Prof XX, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou
Dr XX Maître Assistant, Université de Ouagadougou
LABORATOIRE DE VIROLOGIE ET DE
BIOTECHNOLOGIES VEGETALES
N° d’Ordre .............................../LABIOGENE
i
Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester.
Le master en Biologie Moléculaire et en Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires.
Le master BioGeMA est :
Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie
moléculaires Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE
Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité.
Professeur Jacques SIMPORE
Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique
Moléculaire
UFR/SVT - École Doctorale Sciences et Technologie
Université de Ouagadougou – Burkina Faso
ii
Dédicace Je dédie ce mémoire
A mes parents pour tous les sacrifices consentis à mon égard.
A ma fille Lagmègninsgo Jordane, véritable rayon de soleil dans ma vie. Avec tout
1'amour d’un père à sa fille. Et à sa merveilleuse Maman.
A notre grande sœur et seconde mère Wendy BAMOGO. Trouve dans ce document le fruit des sacrifices que tu as consenti depuis notre tendre enfance pour nous vêtir,
nous nourrir et nous scolariser.
iii
Remerciements Toute ma reconnaissances au Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire de Biologie
Moléculaire et de Génétique Moléculaire et coordonnateur du Master BioGeMA. Tout au
long du master et même bien avant vous vous êtes toujours montré disponible, merci pour
votre soutien moral lors de mes moments d’incertitude et pour votre soutien financier.
Je remercie sincèrement Christophe BRUGIDOU et son équipe pour m’avoir fait
confiance en m’offrant la chance de travailler sur ce projet. Merci à mes encadrants Martine
Bangratz, Séverine Lacombe et Drissa Sérémé, vous côtoyer a été une véritable école tant
sur l’apprentissage de la recherche que sur la vie de façon générale. Trouver ici l’expression
de ma reconnaissance et de ma profonde gratitude.
Un merci tout particulier à Dr. Fidèle Tiendrébeogo, pour m’avoir soutenu
quotidiennement durant mes durs moments, pour avoir cru en moi, et de m’avoir encouragé
pour en arriver là. Vous avez créé le chemin qui m’a mené jusqu’ici trouvez là l’expression
de ma profonde reconnaissance.
Le présent travail a été effectué au Centre de Recherches Environnementales et
Agricoles et de Formation de Kamboinsé (CREAF/K), plus précisément au Laboratoire de
Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV), merci au Dr. Korodjouma
OUATTARA, Directeur de l’INERA/K au Dr. Oumar Traoré, Directeur (LVBV), au Dr.
B. James Néya, Responsable du LVBV et codirecteur du Laboratoire Mixte Internationale
(LMI), au Dr. Edgard V. S. Traoré pour ses conseils. Merci aux camarades stagiaires qui
m’ont apporté leurs aides.
Au corps enseignant de l’Université de Ouagadougou en particulier aux enseignant du
Master BioGeMA et à l’équipe du Pr Jacques SIMPORE, merci pour les connaissances
acquises.
Merci à Adama SAWADOGO responsable du Laboratoire du Faso pour son soutien
financier et à toute l’équipe du Laboratoire du Faso.
Merci aux organismes qui soutiennent financièrement C Brugidou, car cela lui à
permis à son tour de me soutenir à ce titre, merci donc à l’institut de recherche pour le
développement (IRD) et au laboratoire Mixte Internationale (LMI Patho-Bios).
En terminant un grand Merci à ma famille à qui je dois beaucoup. A tous mes frères,
sœurs et amis qui, m’ont soutenu, trouvez ici l’expression de ma profonde reconnaissance.
iv
Résumé Les avancées dans les domaines de biotechnologies permettent aujourd’hui la
production de protéines d’intérêt dans les plantes. La capacité de production en protéines
recombinantes chez les plantes est affectée par des mécanismes tels que le gene silencing.
L’expression simultanée de protéines virales suppresseurs de gene silencing de la plante et de
la protéine d’intérêt permet d’améliorer les rendement. L’utilisation d’amplicon viraux permet
aussi d’augmenter le rendement. Aucun outil amplicon utilisable chez les monocotyledones
n’existe à ce jour. Le RYMV (Rice yellow mottle virus) est un candidat de choix pour le
développement de tels outils biotechnologiques utilisables chez le riz.
Nous avons exprimé de façon transitoire via Agrobacterium tumefaciens des feuilles de
Nicotiana benthamiana, une espèce apparentée au tabac des gènes mutants (C3) de
l’inhibiteur de l’alpha amylase (α-AI1) provenant de Phaseolus vulgaris en combinaison avec
un cocktail de suppresseurs de gene silencing, tous sous promoteur 35S. la protéine C3 a été
révélée par Western blot. Nous avons également exprimé dans les feuilles de N. benthamiana
et celles de riz l’outil amplicon RYMV portant le gène codant la PSA (Promastiguote surface
antigene) provenant de Leishmania infantum, protéine particulièrement intéressant de par ses
propriétés vaccinale avérées contre les leishmanioses. La réplication de l’outil amplicon
RYMV a été mise en évidence par RT-PCR chez N. benthamiana. La RT PCR sur les
échantillons de riz n’a pas donnée de résultats concluants quant à l’introduction et / ou la
réplication de l’outil dans le riz.
Nous avons démontré l’expression et l’accumulation de C3 dans les feuilles de N.
benthamiana. Les résultats obtenus laissent entrevoir une possible utilisation de l’outil
RYMV comme amplificateur pour la production de protéines d’intérêt dans les systèmes
plantes.
Mots clés : Protéines recombinantes, Amplicons viraux, Gene silencing , RYMV , cocktail
suppresseur de silencing
vi
Abstract In recent years, advances on biotechnology have lead to the emergence of plants as
bioreactor for the production of molecules of interests. The first crucial advance was the use
of transient expression systems relying on Agrobacterium as a vector to deliver DNA
encoding recombinant proteins directly into plant cells. Moreover, protein production can be
increased by the co-expression of viral proteins displaying suppression of gene silencing
activity. Indeed, presence of such viral proteins in these transient expression systems allows
overcoming the gene silencing defense. Another significant development in this plant
bioreactor field was the coupling of agro-infiltration with delivery of cDNA encoding viral
RNA used as “amplifier” for the protein production: viral amplicon technology. Whereas
several viral biotechnological tools are available for dicots species, only a few of them are
efficient in monocots such as rice. The RYMV appear as a candidate of choice for
implementation of this kind of tools.
We expressed in Nicotiana benthamiana leaves mutant gene (C3) encoding α-amylase
inhibitor-1 (α-AI1) from the common bean, Phaseolus vulgaris, under control of 35S
promoter and a suppressor of gene silencing cocktail. The presence of the C3 protein in N.
benthamiana leaves was identified by western blot. We also expressed in N. benthamiana and
rice leaves RYMV amplicon carrying PSA gene from Leishmania infantum. This protein
displays a very high interest due to its vaccinal properties against leishmanasis deseases .The
replication of RYMV tool was proven by RT-PCR in N. benthamiana leaves. Results on rice
do not allow conclusion about the introduction and / or replication of the RYMV tool.
We demonstrated expression and accumulation of C3 on tobacco leaves. The results show a
possible use of RYMV amplicon for high production of protein of interest in plants.
Key words: Recombinant proteins, viral amplicons, Gene silencing, RYMV, suppressor of
gene silencing cocktail.
vii
Table des matières PRÉFACE DU COORDONNATEUR DU MASTER BIOGEMA ..................................... I
DÉDICACE ........................................................................................................................ II
REMERCIEMENTS ......................................................................................................... III
RÉSUMÉ ........................................................................................................................... IV
ABSTRACT ....................................................................................................................... VI
TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................ VII
LISTE DES FIGURES ...................................................................................................... XI
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................. XII
ABRÉVIATIONS ........................................................................................................... XIII
INTRODUCTION ................................................................................................................1
1. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE .......................................................................................2
1.1. LES PROTÉINES RECOMBINANTES ...................................................................................2
1.1.1. Définition ..............................................................................................................2
1.1.2. Choix de l’hôte d’expression ou système d’expression ...........................................3
1.1.3. Les différents systèmes d’expression .....................................................................3
1.2. LES PLANTES COMME BIORÉACTEUR ..............................................................................4
1.2.1. Les techniques de transformation génétique des plantes .........................................4
1.2.2. Les avantages du système plantes..........................................................................6
1.3 LE « GENE SILENCING » ..................................................................................................9
1.3.1 Quelques protéines majeures du « gene silencing » ............................................... 11
1.3.1.1 RDR ............................................................................................................... 11
1.3.1.2 Dicer .............................................................................................................. 11
1.3.1.3 Argonaute ...................................................................................................... 12
1.3.2. Les suppresseurs viraux de gene silencing............................................................ 13
1.3.2.1 Inhibition de l’activité DICER : Exemple de la protéine P38 du TCV ............. 13
1.3.2.2. Inhibition de l’activité d’agronaute : exemple de la protéine 2b du CMV ....... 15
viii
1.3.2.3. Inhibition de l’activité d’agronaute : exemple de la protéine P0 des Polerovirus
.................................................................................................................................. 15
1.3.2.4. La protéine P1 du RYMV ............................................................................. 15
1.3.2.5. Séquestration des sRNA : exemple de la protéine P19 des tombusvirus ......... 16
1.4. TECHNOLOGIE AMPLICON : DES AMPLICON VIRAUX POUR LA PRODUCTION DE PROTÉINES
RECOMBINANTES DANS LES PLANTES VIA A. TUMEFACIENS ................................................... 17
1.5. LE VIRUS DE LA PANACHURE JAUNE DU RIZ COMME OUTIL AMPLICON ........................... 23
3. MATÉRIELS ET MÉTHODES ..................................................................................... 29
3.1 CADRE D’ÉTUDE ........................................................................................................... 29
3.2 GÉNÉRATION DES VECTEURS D’EXPRESSION DES PROTÉINES D’INTÉRÊTS ........................ 29
3.2.1 La réalisation des constructions génétiques .......................................................... 29
3.2.2 Matériel plasmidique (de départ) : Le vecteur pBin61 ......................................... 31
3.2.3 Extraction d’ADN plasmidique de bactéries Escherichia coli ............................... 32
3.2.4 Transformation génétique d’Agrobacterium tumefaciens par choc thermique ....... 32
3.3. CULTURE BACTÉRIENNE .............................................................................................. 32
3.3.1. Milieux de culture .............................................................................................. 32
3.3.2. Antibiotiques de sélection .................................................................................... 32
3.3.3. Cocktail de suppresseurs de gène silencing .......................................................... 33
3.4 Agroinfiltration .............................................................................................................. 34
3.4.1. Agroinfiltration des feuilles de N. benthamiana .................................................. 35
3.4.2. Agroinfiltration des feuilles de Oryza sativa ....................................................... 35
3.4.2.1. Préparation de l’inoculum portant des vecteurs pUbi .................................... 35
3.4.2.2. Inoculation mécanique des inoculums viraux ................................................ 35
3.5. LE MATÉRIEL VÉGÉTAL ................................................................................................ 36
3.5.1. Plantes de N. benthamiana ................................................................................... 36
3.5.2. Plantes de riz ...................................................................................................... 36
3.6. TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE .................................................................... 37
3.6.1. Extraction des ARNs au TRIZOL ....................................................................... 37
3.6.2. Traitement à la DNAse ....................................................................................... 37
3.6.3. Vérification de la qualité des ARN ....................................................................... 38
3.6.4. Reverse transcription .......................................................................................... 38
3.6.5. Amplification des ADNc par PCR ...................................................................... 39
ix
3.6.6. Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose ............................................................. 41
3.7. TECHNIQUES DE PROTÉOMIQUE .................................................................................... 44
3.7.1. Extraction de protéines de feuilles de N. benthamiana........................................ 44
3.7.2. Détection immunologique des protéines par Western Blot................................... 44
3.7.2.1. Préparation du gel d’acrylamide SDS – PAGE ............................................. 44
3.7.2.2. Préparation des échantillons ......................................................................... 45
3.7.2.3. Dépôts des échantillons ................................................................................ 45
3.7.2.4. Migration ..................................................................................................... 45
3.7.2.5. Transfert ....................................................................................................... 46
3.7.2.6. Révélation .................................................................................................... 46
3.8. DESTRUCTION DES BACTÉRIES RECOMBINANTES ET DES PLANTES TRANSFORMÉES APRÈS
EXPÉRIMENTATION............................................................................................................. 47
4. RÉSULTATS .................................................................................................................. 48
4.1. EXPRESSION DE LA PROTÉINE C3 DANS LES FEUILLES DE N. BENTHAMIANA .................. 48
4.1.1. Production de plants de N. benthamiana à travers le dispositif mis en place au LMI
...................................................................................................................................... 48
4.1.2. Expression transitoire de la protéine C3 dans les feuilles de N. benthamiana........ 49
4.2. EXPRESSION DE L’AMPLICON DANS LES FEUILLES DE N. BENTHAMIANA ET DE RIZ ......... 50
4.2.1. Expression de l’amplicon RYMV dans les feuilles de N. benthamiana ............... 50
4.2.1.1. Qualité des ARN extraits .............................................................................. 52
4.2.1.2. Contrôle de la qualité de la reverse transcription et homogénéisation des
échantillons pour le dépôt de produits PCR ................................................................ 52
4.2.1.3. Niveau d’accumulation des différents construits PSA ................................... 53
4.2.1.4. Effet de la P1 sur l’accumulation de la PSA ................................................... 54
4.2.1.4. Réplication de l’amplicon .............................................................................. 54
4.2.1.5. Amplifications aspécifiques ........................................................................... 55
4.2.2. Expression de l’amplicon dans les feuilles de riz .................................................. 56
4.2.2.1 Qualité des ARN extraits ................................................................................ 57
4.2.2.2. Contrôle de la qualité de la reverse transcription et homogénéisation des
échantillons pour le dépôt de produits PCR ................................................................ 58
4.2.2.3. Détection du signal de la PSA....................................................................... 59
4.2.2.4. Apparition d’amplifications aspécifiques ....................................................... 59
x
5. DISCUSSION ................................................................................................................. 60
5.1. PRODUCTION DE PIEDS DE N. BENTHAMIANA À TRAVERS LE DISPOSITIF MIS EN PLACE AU
LMI .................................................................................................................................. 60
5.2. EXPRESSION TRANSITOIRE DE LA PROTÉINE C3 DANS LES FEUILLES DE N. BENTHAMIANA
......................................................................................................................................... 60
5.3. TEST EXPRESSION AMPLICON DANS LES FEUILLES DE N. BENTHAMIANA ET DE RIZ ......... 61
5.4. EXPRESSION DE L’AMPLICON DANS LES FEUILLES DE RIZ ............................................... 62
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................... 64
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................... 66
ANNEXE .............................................................................................................................. A
xi
Liste des figures Figure 1: Carte simplifié du plasmide Ti natif (Assoumane A. et al., 2006) ...........................5
Figure 2 : Transfert d’un gène d’intérêt via Agrobacterium tumefaciens (Assoumane A. et al.,
2006) ......................................................................................................................................6
Figure 4 ............................................................................................................................... 10
Figure 5: DICER, structure et mode d’action : Représentation schématique des domaines
structuraux RNase. .............................................................................................................. 12
Figure 6 : Structure de la protéine ARGONAUTE (Song et al., 2004) ................................. 12
Figure 8 : Réprésentation schématique de la production de la protéine d’intérêt (Pi) via le
vecteur amplicon dans le biosystème plante. ........................................................................ 18
Figure 9 : Organisation génomique du RYMV. .................................................................... 24
Figure 10 ............................................................................................................................. 25
Figure 11: Description des constructions géniques codant les protéines d’intérêt C3 et PSA.
............................................................................................................................................. 30
Figure 12: Construits amplicon RYMV................................................................................ 30
Figure 13: Vecteur Pbin61 ................................................................................................... 31
Figure 14: Action du cocktail suppresseur de silencing (Lacombe et al., Soumis) ................ 34
Figure 15: Culture des plants de N. benthamiana ................................................................. 36
Figure 16: Pieds d’Oryza sativa agée de 11 jours ................................................................. 36
Figure 17: Broyage d’échantillons ....................................................................................... 37
Figure 18: Quelques matériels de biologie moléculaire ........................................................ 43
Figure 19: Détails du montage de transfert ........................................................................... 46
Figure 20 : Incinérateur ........................................................................................................ 47
Figure 21: Pieds de N. benthamiana aptes à l’agroinfiltration .............................................. 48
Figure 22: Production de C3 dans les feuilles de N.benthamiana. ....................................... 50
Figure 23 : Vérification par électrophorèse des ARN sur gel d’agarose 1% dépôt de 5 µl sur
45 µl ..................................................................................................................................... 52
Figure 24:Amplification PCR du gène eIF1 alpha .............................................................. 53
Figure 25: Amplifcation PCR du gène codant pour la PSA .................................................. 56
Figure 26 : Vérification par électrophorèse des ARN sur gel d’agarose 57
Figure 27: Produits PCR eiF1 .............................................................................................. 58
Figure 28: PCR PSA ............................................................................................................ 59
xii
Liste des tableaux Tableau 1 : Comparaison des différents systèmes d’expression de protéines recombinantes ...8 Tableau 2 : Les Vecteurs Viraux d’insertion de Gène couramment utilisés pour l’expression
transitoire dans les plantes via A.tumefaciens ........................................................................ 20 Tableau 3 : Les Vecteurs Viraux de Substitution de gène couramment utilisés pour
l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens .................................................... 21 Tableau 4 : Les Vecteurs Viraux issus de virus déconstruits couramment utilisés pour
l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens .................................................... 22 Tableau 5 : Les Virus entiers présentant des peptides couramment utilisés pour l’expression
transitoire dans les plantes via A.tumefaciens ........................................................................ 23 Tableau 6: Concentrations finales d'antibiotiques à ajouter au milieu nutritif en fonction de la
souche bactérienne et du plasmide utilisé. ............................................................................. 33 Tableau 7: Ratio de la combinaison suppresseur/ construction d’intérêt ............................... 34 Tableau 8: Mélange réactionnel pour la reverse transcription ............................................... 39 Tableaux 9: Détails sur les différentes amorces .................................................................... 41 Tableau 10 : Les différents traitements utilisés .................................................................... 49 Tableau 11: Les différents traitements utilisés ..................................................................... 51 Tableau 12 : Dosage au Nanodrop 2000 de l’ARN extrait après traitement DNase ............... 52 Tableau 13: les différentes méthodes d’introduction ............................................................ 57 Tableau 14 : Dosage au NanoDrop 2000 de l’ARN extrait après traitement DNase .............. 58
xiii
Abréviations °C : Dégré Celsius 3’nos : terminateur nopaline synthétase 35S : promoteur du virus de la mosaïque du chou fleur ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADN-T : ADN de transfert AGO: ARGONAUTE ARN : Acide RiboNucléique ARNm : ARN messager BET : Bromure d’Ethidium CaMV : Cauliflower mosaic virus : Virus de la mosaïque du chou-fleur cDNA : ADN complémentaire CHO : Chinese Hamster Ovary CMV : Virus de la mosaïque du concombre CP: protein de capside (caot protéine) dbRNA : ARN double brin Dicer : Protéine ressemblant à ribonucléase de type III DLC : DICER-like-protéine DO : densité optique ECL : ElectroChimioLuminescent eIF : eucaryotic initiation factor g :gramma GFP : Green Fluorescent Protein GUS ou uid A : β-glucuronidase h : heure HbsAg : Antigène de l’hépatite B HC-Pro : Helper Component Proteinase HcPro : Composant d’aide au protéinase ( helper component proteinase) hGH : Hormone de croissance HRP : Peroxidase de raifort ( horse radish peroxidase) kDa : Kilo Dalton mAb : Anticorps monoclonal MID : middle Milieu LB : milieu Luria-Bertani mn : minute NLS : Signal de locution nuclé aire nt : Nucléotide ORF: open reading frame PAZ: Piwi/Argonaute/Zwille pBin: Plasmide binaire PCR : Polymerase Chain Reaction PCR: Polymerase chain reaction RdRP ou RDR: RNA dependant RNA polymerase RE : Réticulum Endoplasmique rgs-CaM : regulator of gene silencing–calmodulin-like protein RISC : Complexe d’inactivation génétique induit par ARN RNase : ribonucléase Rpm: Rotation par minute
xiv
RT-PCR : Reverse Transcriptase PCR SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodécyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis sRNA : petit ARN (short RNA) TAE : Tris Acetate EDTA TBSV : Tomato Bushy Stunt Virus TEMED NNNN’-tetramethyl ethylene diamine Tm : Température de fusion TMV Virus de la mosaïque du tabac (tabacco mosaique virus) UV : ultraviolet VPg: Viral protein link to the genome μl : Microlitre
1
Introduction D’importantes avancées ont eu lieu ces dernières années dans les domaines des
biotechnologies et notamment dans l’exploitation des plantes comme bioréacteurs pour la
production de protéines d’intérêt. Ainsi, des vaccins, des protéines d’intérêt pharmaceutique,
industriel ou agricole sont actuellement produits dans des systèmes végétaux (Daniell et al.
2009). L’intérêt majeur de ces systèmes par rapport à d’autres biosystèmes classiquement
utilisés pour la production de protéines recombinantes (les bactéries, les levures ou les
cellules de mammifères) réside en leur relatif faible coût et leur facilité à mettre en place ainsi
qu’en leur faible risque de contamination.
Alors que les travaux initiaux portaient essentiellement sur des plantes transgéniques
exprimant de façon stable la protéine d’intérêt, un effort particulier a été porté sur des
techniques alternatives moins coûteuses en temps et moins contraignantes en terme de
confinement. L’utilisation des plantes comme bioréacteur a ainsi connu des innovations
majeures, la première dans ce domaine a été l’utilisation de technologies basées sur l’emploi
d’Agrobacterium tumefaciens comme vecteur pour délivrer les séquences d’ADN codant les
protéines d’intérêt directement dans les feuilles par infiltration à la seringue : l’agro-
infiltration.
Même si de tels systèmes permettent de produire la protéine d’intérêt en quelques
jours, le rendement peut s’avérer relativement faible. En effet, face à l’introduction d’acides
nucléiques étrangers tels que les transgènes les cellules végétales mettent en place des
mécanismes de défenses parmi lesquels le « gene silencing » visant à dégrader spécifiquement
ces acides nucléiques (Johansen et Carrington, 2001). C’est ainsi qu’est née une autre avancée
majeure dans ce domaine : l’expression simultanée,de protéines virales ayant la capacité de
supprimer le « gene silencing » de la plante avec la protéine d’intérêt que l’on souhaite
produire permet de contourner cette contrainte et améliore ainsi le rendement de production
de la protéine d’intérêt (Voinnet et al., 2003). La dernière avancée significative est
l’utilisation de l’agro-infiltration pour délivrer des ADN codant des ARN viraux utilisés
comme amplificateur : la technologie amplicon. Une fois introduit dans la cellule végétale via
Agrobactérium tumefaciens, le vecteur amplicon modifié avec la séquence d’intérêt se
multiplie entrainant ainsi une production significativement augmentée de la protéine d’intérêt
(Gleba et al., 2007). Cette technologie a été utilisée avec succès pour la production d’un
certain nombre de protéines. Les vecteurs amplicon utilisés jusqu'à présent dérivent
2
principalement du TMV (Tobacco mosaic virus), du PVX (Potato virus X) et de CPMV
(Cowpea mosaic virus) associés à des plantes hôtes telles que le tabac ou Nicotiana
benthamiana. L’utilisation de ces vecteurs est sous le contrôle de brevets. Au jour
d’aujourd’hui aucun vecteur amplicon utilisable chez les monocotylédones (comme le riz)
n’existe. Le Rice yellow mottle virus, ou RYMV, du fait de sa relative petite taille et de la
simplicité de son génome est un candidat de choix pour le développement de tels outils
biotechnologiques utilisables chez le riz. C’est dans ce contexte de recherche appliquée que
s’inscrivent les travaux présentés dans ce manuscrit qui s’articule autour du thème ‘’
Développement d’outils biotechnologiques viraux pour la production de protéines à forte
valeur ajoutée dans des biosystèmes végétaux.’’
1. Revue bibliographique
1.1. Les protéines recombinantes
1.1.1. Définition Les protéines recombinantes sont ainsi qualifiées dans la mesure où elles sont produites à
partir d’un gène se trouvant dans une cellule distincte de celle dont il est originaire. La
protéine, synthétisée par une cellule différente de sa cellule d’origine, est ainsi dite
hétérologue ou recombinante. Au sens large, un système de production adapté à la fabrication
d'une protéine recombinante donnée, est un procédé biotechnologique qui s'appuie
principalement sur :
l'emploi d'un vecteur d'expression (un plasmide ou un virus), jouant le rôle de
transporteur génétique du gène d'intérêt codant pour la protéine recherchée ;
l'utilisation d'une cellule hôte, chargée d'exécuter les instructions fournies par le gène
d'intérêt qui lui est inséré, dans l'objectif de synthétiser la protéine recherchée ;
une phase de production proprement dite permettant de fabriquer les quantités de
protéines souhaitées ;
enfin, une séparation et extraction de la protéine du milieu de culture, suivie par une
purification de celle-ci.
Au sens restreint, un système de production de protéines recombinantes est caractérisé par un
couple constitué d'un vecteur d'expression et d'un hôte (cellule ou organisme).
3
1.1.2. Choix de l’hôte d’expression ou système d’expression Le choix de système d’expression sera en partie dicté par les impératifs économiques,
mais la qualité des protéines recombinantes produites constituera également un paramètre
déterminant, en particulier dans le cas de la production de protéines destinées à être utilisées
chez l’homme. Pour être stable et active in vivo, les protéines doivent subir de multiples
modifications post-traductionnelles. Les principales modifications sont le repliement, le
clivage, l’association des sous-unités, la γ-carboxylation et la glycosylation. Elles se
produisent après ou pendant la traduction de l’ARN messager en une chaîne d’acides aminés
et sont spécifiques du type de cellule considérée. Parmi les modifications souvent requises
pour assurer la fonction et la stabilité de la protéine, ainsi que son adressage vers le lieu où
elle est active, il y a la glycosylation qui est l’une des plus importantes modifications. Hors,
les glycanes associés aux protéines sont extrêmement variables en fonction de l’hôte dans
lequel la protéine d’intérêt est exprimée. Ainsi, la fonctionnalité des protéines recombinantes
est dépendante de l’hôte et de son système de glycosylation.
1.1.3. Les différents systèmes d’expression Actuellement, il existe divers systèmes d’expression voués à la production et à la
purification de protéines recombinantes : la bactérie Escherichia coli, la levure
Saccharomyces cerevisiae et les cellules Chinese Hamster Ovary (CHO) sont les plus
avancées. Les autres systèmes d’expression font l’objet de nombreux travaux et sont de plus
en plus présents dans le domaine des biotechnologies. Parmi ceux-ci, on trouve la levure
Pichia pastoris, les cellules d’insectes, les animaux et les plantes transgéniques. Les plantes
transgéniques sont des systèmes d’expression caractérisés par l’intégration du gène d’intérêt
dans le génome de la plante, ce qui permet une production à long terme de la protéine
d’intérêt. Cependant le principal inconvénient de ce type de système d’expression est que la
mise en place et la caractérisation des lignées transgéniques peuvent prendre plusieurs mois
et le rendement de la production de la protéine est imprédictible, (Fischer and Emans 2000).
De plus, la culture des plantes transgéniques requière des conditions phytosanitaires
spécifiques pour éviter des problèmes écologiques tels que les flux de gènes (Boehm 2007).
Nous ne saurons parler des systèmes d’expression plante sans noter que de nos jours,
des efforts particuliers sont portés sur des techniques alternatives moins couteuses en temps
et moins contraignantes en terme de confinement ; ainsi est née l’expression transitoire. Avec
cette dernière, la protéine d’intérêt est produite seulement en quelques jours.
4
1.2. Les plantes comme bioréacteur L’expansion du marché des protéines recombinantes n’est plus à démontrer, depuis la
fin des années 1990, plus de 280 protéines recombinantes thérapeutiques, dont une vingtaine
d’anticorps monoclonaux, sont commercialisées représentant un chiffre d’affaire estimé à près
de 49 milliards de dollars US en 2006. Ce segment connaît une croissance de 20% par an
contre 7% pour l’industrie pharmaceutique globale et près de 2200 nouvelles protéines
recombinantes sont actuellement en phase clinique (Cadoret et al., 2008 ). L’industrie
pharmaceutique et les sociétés de biotechnologie sont confrontés à un défi majeur : celui de
disposer de systèmes de production de protéines recombinantes qui puissent répondre à leurs
contraintes à la fois en termes de qualité, de quantité produite et de rentabilité. Il existe au
niveau mondial un déficit de capacité de production de ces protéines recombinantes, car les
systèmes actuellement disponibles ne permettent pas de produire la quantité et la qualité à un
coût raisonnable.
Aujourd'hui, les systèmes de production de protéines recombinantes font
essentiellement appel à la culture de cellules animales (les cellules de mammifères). Ce
procédé ainsi que d’autres biosystèmes basés sur les bactéries et les levures restent coûteux et
présentent des risques de vecteur de contamination (pathogènes et prions) d’autant plus qu’ils
ne sont pas facile à implémenter ce qui ne permet pas de couvrir la demande actuelle
grandissante. De plus, le système de production doit être capable de réaliser les modifications
post-traductionnelles, incluant le clivage du peptide signal, l’adressage de la protéine, la
formation des ponts disulfures, et la glycosylation. L'utilisation de plantes pourrait permettre
de palier à cette forte demande en protéines d’intérêt. Le système d’expression constitué par
les plantes est une voie prometteuse pour synthétiser des protéines d’intérêt avec des coûts
réduits (Boehm, 2007). Comme les systèmes eucaryotes, elles sont capables de réaliser toutes
les maturations post-traductionnelles.
1.2.1. Techniques de transformation génétique des plantes Deux familles de techniques sont utilisées pour la transformation génétique de cellules
végétales : l’une fait intervenir des méthodes physiques ou chimique qui permette la
pénétration de l’ADN directement dans les cellules végétales (en utilisant un canon à
particule, le polyéthylèneglycpol, en réalisant la fusion entre les protoplastes et des liposomes
qui sont vésicules artificielles de phospholipides encapsulant l’ADN à transférer ou encore en
faisant appel à des impulsions électriques, l’autre méthode consiste à utiliser les propriétés d’
5
Agrobacterium tumefaciens, l’avantage de cette dernière est que la paroi pectocellulosique
rigide de cellule végétale qui constitue un obstacle au transfert de gène peut eêtre contournée
par l’utilisation des bactéries du genre Agrobactérium.
Le principede la transgénèsepar Agrobactérium repose sur les caractéristiques du
plasmide Ti natif (Figure 1) qu’elle porte qui est alors utilisés comme un vecteur. Le plasmide
natif est responsable de la tumorisation des cellules végétales conduisant ces dernière à
synthétiser des substances qu’agrobactérium n’est pas à mésure de fabriquer toute seule Grace
à une modification génétique le plasmide Ti peut être utilisé. Pour la transgénèse (Figure 2)
les gènes ONC (Auxine Cytokinine et Opine) possède une fonction oncogène pour des
cellules végétales sont supprimés de l’ADN T et sont remplacés par le gène d’intérêt tout en
maintenant les bords droit et gauche de l’ADNT. Ceci à pour effet de désarmer le plasmide
Ti tout en conservant la possibilité le gène de la bactérie vers le noyau de la cellule végétale
par l’intermédiaire des gènes VIR. Le gène d’intérêt introduit dans le plasmide Ti désarmé
sera transféré dans le noyau de la cellule végétale il fait alors partie du patrimoine génétique
de la cellule qualifiée alors de plante transgénique. Cependant pour être qualifiée trangénique
il faut que toutes les cellules de la plante possèdent le trangène si non il s’agit d’une plante
chimère.
Figure 1: Carte simplifiée du plasmide Ti natif (Assoumane A. et al., 2006)
6
Figure 2 : transfert d’un gène d’intérêt via Agrobacterium tumefaciens (Assoumane A. et al., 2006)
1.2.2. Les avantages du système plantes Même si les rendements de protéines produites sont souvent encore limités dans les
systèmes d'expression végétaux (Ma et al., 1995), la capacité de production dans les plantes
est quasiment illimitée puisqu'elle dépend exclusivement des surfaces mises en culture
(Negrouk et al., 2005). Ainsi un "bioréacteur" végétal permettra d'obtenir jusqu'à 20 kg de
protéines recombinantes par hectare (Austin et al., 1994). Enfin, le principal avantage des
plantes par rapport aux systèmes traditionnels de culture de cellules de mammifères en
fermenteur, est que la production de protéines recombinantes serait jusqu'à 500 fois moins
coûteuse. Outre ces deux points, le système de production de protéines hétérologues par les
plantes présente d’autres avantages (Giddings et al., 2000 ; Yusibov and Rabindran, 2008) :
Les cellules végétales étant des cellules eucaryotes, elles disposent d’un système
permettant dans de nombreux cas de produire des protéines complexes ayant des
propriétés équivalentes aux protéines humaines. Elles sont en effet capables
d’effectuer toutes les modifications post-traductionnelles requises pour obtenir une
molécule bioactive. La production d’immunoglobulines dans les cellules végétales est
7
un bon exemple : ces dernières sont capables de synthétiser correctement, et
d’assembler les chaines polypeptidiques lourdes et légères constituant un anticorps.
Il n’existe pas, en l’état actuel des connaissances, de pathogènes végétaux capables
d’infecter l’homme et l’animal, éliminant ainsi le risque par exemple d’infection ou de
contamination virale par les protéines produites par les plantes, à la différence des
protéines produites par les cellules de mammifères ou d’animaux transgéniques. La
sécurité phytosanitaire est donc assurée.
Le niveau actuel des biotechnologies végétales permet de cibler de façon spécifique
les tissus dans lesquels s’exprimera la protéine d’intérêt. En particulier, dans le cas du
maïs, la protéine peut être ciblée dans les grains, permettant un stockage efficace et
une bonne stabilité de la protéine d’intérêt.
Enfin, la capacité de régénération et la pérennité du végétal sont des qualités qui
entrent en compte pour la production de protéines recombinantes. La luzerne, par
exemple, est un végétal bien adapté à la production de protéines recombinantes, en
raison de la facilité de son bouturage.
Les avantages et les inconvénients des différents systèmes de production, en termes de
coûts, de productivité, de sécurité et d’authenticité sont résumés dans le tableau ci après
(Tableau 1)
8
Tableau 1 : Comparaison des différents systèmes d’expression de protéines recombinantes
Systèmes de production
Cout de
production
Cout
d’extraction purification
Temps de
production
Capacité de production
Qualité
Cout de stockage
Glycosylation
Risques de
contaminations
Bactérie Faible Moyen Court Elevé, Centaines de mg/L
Médiocre Modéré (-20°C)
Aucune Endotoxines
Levures
Moyen
Faible
Moyen
Elevé,
200 mg/L
Moyenne
Modéré (-20°C)
Incorrecte
Risques faibles
Baculovirus/
Cellules d’insectes
Moyen
Faible
Court
Moyen, 10 à 100
mg/L
Bonne
Cher (N2)
Différences
majeures
Risques faibles
Cellules de
mammifères
Elevé
Faible
Long
Moyen,
Qq dizaines mg/L
Très
Bonne
Cher (N2)
Correcte
Virus, prions et ADN
oncogénique
Animaux
transgéniques
Elevé
Elevé
Très long
Très élevé,
Qq g/L
Très
Bonne
Cher
Correcte
Virus, prions et ADN
oncogénique
Cultures cellulaires végétales
Moyen
Faible
Moyen
Moyen
Bonne
Modéré
Différences mineures
Risques faibles
Plantes
transgéniques
Très faible
Elevé
Long
Très élevé 600mg/kg
Mat fraiche
Bonne
Peu cher
(T°C ambiante)
Différences mineures
Risques faibles
Fischer and Emans, 2000 ; Ma et al., 2003 ; Dingermann, 2008
9
1.3 Le « Gene silencing » La capacité de production en protéines recombinante chez les plantes est affectée par
des mécanismes endogènes de l’hôte tel que le « gène silencing ». Le gene silencing est un
mécanisme de régulation de l’expression des gènes spécifiques de leur séquence. C’est un
mécanisme majeur impliqué dans de nombreux processus comme la succession des étapes
développementales d’un organisme, le maintien de l’intégrité du génome, les réponses à
l’environnement et la défense contre les pathogènes, notamment les virus. Il n’a pourtant été
découvert que très récemment. Ses effets ont été observés pour la première fois sur des plants
de pétunia en 1990. Les expérimentations désireuses de renforcer la couleur des pétales ont
voulu induire une surexpression du gène codant pour la chalcone synthase dans ces plantes.
Etonnamment, le résultat de l’introduction de ce gène impliqué dans la biosynthèse des
anthocyanes dans ces plantes est l’extinction complète de l’expression du transgène et du
gène endogène conduisant au blanchiment des pétales, (Napoli et al., 1990) ( voir figure 3).
Au cours de l’évolution, les plantes ont développé un mécanisme de défense
permettant de se protéger contre les infections virales. Lorsque les ARN viraux sont présents
en quantité trop importante dans une cellule, un système de régulation spécifique appelé
«gene silencing » se met en place. Le gene silencing intervient dans les systèmes plantes de
production de protéines recombinantes. En effet, la surexpression de gènes chez les plantes
transgéniques s’apparente à la présence surnuméraire de certains ARN. En effet, ce
mécanisme se met en place en présence d’ARN viral dans la plante, mais aussi en présence
d’ARN étranger (Vaucheret and Fagard, 2001), notamment sous contrôle d’un promoteur
fort. Dans les plantes transformées, l’inactivation post-transcriptionnelle correspond à la
dégradation spécifique des ARN messagers (ARNm) codés par le transgène par la production
massive d’ARN double brin (ARNdb) sous l’action d’une RNA dépendante RNA polymérase.
L'ARNdb est dégradé par une nucléase de type Rnase III appelée DICER en petites molécules
d'ARN de 21 à 23 nucléotides (nt) de long appelés généralement « sRNA » pour short RNA,
qui vont servir de guide à un complexe multi-enzymatique : un complexe protéique
« effecteur » appelé RISC ( pour RNA induced silencing complexe) qui va dégrader tous les
ARN messagers homologues (Pfeffer et al., 2003). Le transgène est alors éteint (figure 4).
L’activité majeure de la protéine AGO est le clivage des RNA simples brins reconnus par
complémentarité de séquence avec le sRNA qu’elles portent.
10
Figure 3: Première mise en évidence du « gene silencing » (Napoli et al., 1990) Des plants de pétunia (A) ont été transformés par le gène de la chalcone synthèse (CHS) sous promoteur 35S.le transgène est cibler par le mécanisme de gene silencing. Les sRNA produits permettent également la reconnaissance du gène CHS endogène. Au lieu d’obtenir un renforcement de la coloration dû a une sur- accumulation des anthocyanes, les fleurs deviennent blanches, avec un patron d’expression spécifique à chaque plante (B-E)
Figure 4: Schéma du « gene silencing »
ARNm étranger
sRNA 21-24nt
AGO
11
1.3.1 Quelques protéines majeures du « gene silencing »
1.3.1.1 RDR Les RDR ou RNA polymérase RNA dépendante (RdRP) existent en nombre variable selon
l’espèce de plante considérée. En guise d’illustration, chez Arabidopsis thaliana, on en
compte six nommées RDR1, RDR3, RDR6, RDR3a, RDR3b, RDR3c (Voinnet 2008). Ces
enzymes utilisent l’ARNsimple brin comme matrice pour synthétiser le brin complémentaire,
produisant ainsi un ARN double brin, substrat de Dicer. Il semble exister des liens particuliers
entre certaines RDR et certaines Dicer. Une colocalisation a déjà pu être mis en évidence (Li
et al., 2006)
1.3.1.2 Dicer L’enzyme Dicer est responsable de la synthèse des sRNA. Le nombre de gènes codant
pour cette protéine varie selon l’organisme. Par exemple, chez Arabidopsis thaliana il existe
quatre protéines homologues de Dicer appelées DCL1 à DCL4 (pour Dicer-like protein, Dicer
étant le nom attribué à une protéine isolée de la drosophile par Bernstein et al en 2001).
Chacune de ces protéines produit des sRNA d’une taille spécifique. DCL1 et DCL4
produisent des sRNA de 21 nucléotides, DCL2 de 22nt et DCL3 forme des sRNA de 24nt,
tous ayant des fonctions particulières.
Les protéines DCL sont des RNase de classe III (Hammond, 2005). A ce titre, elle
porte toutes les domaines fonctionnels suivants: un domaine de liaison à l’ARN double brin
(DRB), deux domaines RNase III (identifiés chez tous les homologues de DICER connus à ce
jours), un domaine hélicase et un domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) retrouvé, comme
son nom l’indique, sur la protéine ARGONAUTE (Figure 5). La structure tridimensionnelle
de la protéine induit la formation d’un « dimère interne » des deux domaines RNase III ;
placés face à face, avec un léger décalage, ils permettent le clivage simultané des deux brins
de l’ARN, produisant une extrémité 3’ sortante de deux nucléotides, les sRNA produits ont
une extrémité 5’ monophosphate et une extrémité 3’OH. Le domaine PAZ reconnait l’ARN
double brin au niveau de son extrémité clivée caractéristique. Sa distance relative au domaine
RNase III est responsable de la spécificité de longueur des sRNA produit par chaque enzyme
.Ces données ainsi que des expériences utilisant un ARN double brin dont l’extrémité est
bloqué artificiellement (Zhang et al., 2002) indique que Dicer pourrait agir préférentiellement
à partir d’une extrémité de son substrat.
12
Figure 5: DICER, structure et mode d’action : Représentation schématique des domaines structuraux RNase. La disposition légèrement décalée des sites catalytique de part et d’autre du mRNA double brin conduit à la formation d’extrémité 3’ sortante de deux nucléotides, la distance eentre le domaine PAZ et les sites de clivage calibre précisement la taille des sRNA produit par chaque DICER ( hammond 2007)
RNase IIIa RNase IIIb DRB Hélicase PAZ
1.3.1.3 Argonaute Comme pour l‘enzyme Dicer, le nombre de représentant de la famille argonaute
diffère d’un organisme à un autre. Arabidopsis thaliana a dix gènes Argonaute nommés
AGO1 à AGO10. C’est un mutant d’AGO1 chez Arabidopsis thaliana qui a donné son nom à
cette famille. En effet, le phénotype d’une plante déficiente dans ce gène rappelle la
morphologie d’une pieuvre, Argonauta argo. La famille de protéine AGO est subdivisée en
trois groupes en fonction de leurs liens phylogénétiques et de la nature des sRNA qu’elles
fixent.
Les protéines AGO ont une taille d’environs 100 kDa. Elles possèdent un domaine N-
terminal variable, un domaine PAZ, un domaine MID (pour middle), un domaine PIWI et une
extrémité C-terminal conservée. Le domaine PAZ, similaire à celui des protéines Dicer
reconnait l’extrémité 3’ du sRNA simple brin alors que le domaine MID en fixe l’extrémité 5’
(figure 6).
Figure 6 : structure de la protéine ARGONAUTE (Song et al., 2004)
13
La fonction majeure des protéines Argonaute est de cliver les ARN simple brin
reconnus par complémentarité de séquence avec le sRNA qu’elles portent, cette activité
endonucléasique est dite « slicer ». Longtemps considérée comme une particularité des
protéines animales, l’inhibition de la traduction a été récemment démontrée chez les plantes
(Broderson et al., 2008). L’inactivation du messager pourrait s’opérer avant même l’initiation
de la traduction, par compétition entre la protéine Argonaute et les facteurs d’initiation pour la
liaison à la coiffe.
1.3.2. Les suppresseurs viraux de gene silencing Le mécanisme de gene silencing étant un moyen de lutte antiviral efficace et
spécifique chez les plantes, la plupart, sinon tous les phytovirus ont développé des protéines
capables de protéger l’intégrité du génome viral en inhibant ce mécanisme. Ces protéines
varient d’une espèce à l’autre, voire d’un virus à l’autre du point de vue de leur séquence mais
aussi et surtout, de leur mode d’action. Ainsi, chaque protéine dite « suppresseur » va pouvoir
cibler une ou plusieurs étapes du silencing, inhibant le gene silencing antiviral mais aussi
souvent d’autres voies du silencing fondamentales au développement de la plante. Il est
question ici de présenter quelques étapes différentes du gene silencing auxquelles s’attaquent
des suppresseurs viraux connus.
1.3.2.1 Inhibition de l’activité DICER : Exemple de la protéine P38 du TCV
La protéine P38 est une protéine multifonctionnelle dont le rôle premier est structural
puisque P38 est la protéine de capside du TCV. Elle est impliquée dans le mouvement
systémique du virus (Hacker et al., 1992) et est l’éliciteur de la résistance « gène pour gène »
chez un écotype d’Arabidopsis thaliana (Kachroo et al., 2000). Son activité suppresseur de
silencing a été découverte par Qu et al (2003). En effet, son expression abolit la synthèse de
sRNA dans un système Nicotiana benthamiana, une plante apparentée au tabac présentant un
gene silencing artificiel contre le gène rapporteur GFP. Ce système consiste en l’introduction
transitoire d’un cDNA codant la GFP dans les feuilles de plantes transformées de façon
stable par le gène de la GFP. L’introduction exogène d’une nouvelle construction GFP induit
le mécanisme de gene silencing dirigé contre l’inducteur lui-même mais aussi contre le
transgène GFP ce qui conduit à l’extinction de la fluorescence verte dans le patch
d’introduction de l’inducteur. La présence d’une protéine ayant une activité suppresseur de
14
silencing dans le patch d’induction empêche le gene silencing contre la GFP de se mettre en
place. Dans ce cas, le patch maintien sa fluorescence verte. Cette méthode dite de « patch
test » a été développée par Voinnet et al 1998 (figure 7) et est largement utilisé par
l’ensemble de la communauté scientifique s’intéressant aux suppresseurs de gene silencing.
P38 agit au niveau de l’activité Dicer (Qu et al., 2003). Les résultats obtenus par Qu et al.,
suggèrent que P38 pourrait lier les ARN double brin, entrant ainsi en compétition avec les
protéines Dicer en soustrayant leur substrat. Ainsi la production des sRNA en serait affectée
et la stabilité des ARN double brin augmentée.
Figure 7 : « patchs test » Cette technique est l’une des plus largement utilisée dans la recherche de l’activité de suppression d’une protéine virale. On utilise une plante de N benthamiana expriment le transgène GFP sous la dépendance d’un promoteur 35S qui fluoresce en vert sous UV. Par la méthode d’agroinfiltration, on introduit le transgène 35S-GFP. Cela provoque probablement une accumulation du transcrit reconnu comme une aberration par la plante ce qui conduit à la mise en place du gene silencing contre le transgène agroinfiltré et le transgène constitutif. On peut également utiliser une construction qui après transcription formera une structure en tige boucle dont la séquence correspond à tout ou partie du gène de la GFP (hpGF pour « harpin » correspondant à la portion 5’ de la GFP). Le patch corespondant à la zone infiltrée devient rouge sous UV : la GFP n’est plus exprimée, on ne visualise plus que la chlorophylle. Quelques jours plus tard, le système est établi et la plante devient complètement rouge. Si on co-infiltre avec les constructions 35S GFP ou hpGF (une construction codant pour une protéine capable d’inhibé localement le gene silencing), le patch devient vert.
15
1.3.2.2. Inhibition de l’activité d’argonaute : exemple de la protéine 2b du CMV
Des expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que 2b interagit avec AGO1
in vivo. Cette interaction est spécifique et prendrait place au niveau du domaine PAZ d’AGO.
La protéine virale bloquerait directement l’activité slicer de AGO1 en interagissant avec son
domaine PAZ (Zhang et al., 2006). Comme AGO est un effecteur du complexe RISC, 2b
permettrait de préserver l’intégrité du génome viral tout en perturbant les voies du silencing
endogènes de la plante.
1.3.2.3. Inhibition de l’activité d’argonaute : exemple de la protéine P0 des Polerovirus
La plupart des suppresseurs viraux de gene silencing interagissent soit avec l’ARN
double brin soit avec des duplex sRNA (Lakatos et al., 2006). Parmi les suppresseurs faisant
exception, on note la protéine 2b des Cucumovirus (Zhang et al., 2006) qui se lie sur la
protéine effecteur AGO1 et l’inactive (Morel et al., 2002, Qi et al., 2005), la protéine P38 du
TCV qui inhibe l’activité Dicer et la protéine P0 de gene silencing des Polerovirus (famille
des Luteoviridae).
La protéine P0 est codée par la F box des Polerovirus (Pazhouhandeh et al., 2006) elle cible
sur AGO1 le domaine PAZ et d’autres séquences qui lui sont adjacentes en amont et entraine
sa dégradation. Les protéines de la F box sont des éléments des complexes ubiquitine ligases
E3 qui marquent les protéines pour une dégradation via le protéosome. (Petroski et al., 2005).
P0 inhibe localement le gene silencing, cette activité devrait contribuer à une restriction du
virus dans le phloème dans le cas des virus du groupe des Polérovirus.
1.3.2.4. La protéine P1 du RYMV La protéine P1 du RYMV présente une activité de suppression de gene silencing à
efficacité variable selon l’origine de l’isolat viral. Cette activité de suppression de la P1 est
associée à une importante réduction de l’accumulation des sRNA de 21 et 24nt. La P1 s’est
révélée augmenter le gene silencing systémique dans les pieds de Nicotiana benthamiana
(Lacombe et al., 2010). Dans le riz, la P1 induit une dérégulation de la voie endogène des
sRNA dépendant de DCL4 alors que les autres voies endogènes ne sont pas affectées. La
protéine P1 du RYMV présente des effets multiples à la fois sur le gene silencing exogène et
endogène, pas seulement des activités de suppression mais aussi des activités en faveur du
16
gene silencing. Cela suggère que la protéine P1 joue un rôle clef dans le maintien de
l’équilibre entre les mécanismes de défenses et de contre-défenses afin d’assurer une
multiplication efficace du virus et un maintien de l’intégrité de l’hôte (Lacombe et al., 2010)
1.3.2.5. Séquestration des sRNA : exemple de la protéine P19 des Tombusvirus
Un des suppresseurs le mieux caractérisé est la protéine P19 provenant du Tomato
Bushy Stunt Virus (TBSV) (Qiu et al., 2002). La protéine P19 des tombusvirus intervient
dans le mouvement à longue distance du virus et a d’abord été caractérisée, comme de
nombreux suppresseurs, comme étant un « facteur de pathogénicité ». Depuis, il a été montré
que la protéine P19 est capable de lier des sRNA double brin in vitro et in vivo (Chapman et
al., 2004 à; Dunoyer et al.,2004) mais n’a qu’une faible affinité pour les sRNA simple brin
de grande taille ce qui suggère que sa fonction est d’inhiber le chargement du complexe
RISC. La protéine agit sous forme d’homodimère et est capable de fixer de manière très
spécifique des sRNA double brin de 21 nucléotides.
Plusieurs stratégies peuvent être adoptées pour éviter le phénomène de gène silencing,
en exprimant par exemple simultanément au gène d’intérêt un suppresseur de silencing.
L’expression simultanée de protéines virales ayant la capacité de supprimer le gene silencing
de la plante et de la protéine d’intérêt permet ainsi d’améliorer le rendement de production de
la protéine d’intérêt (Voinnet et al., 2003). Un des meilleurs suppresseurs caractérisé est la
protéine P19 provenant du Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) (Qiu et al., 2002). Ce
suppresseur, coexprimé avec une protéine recombinante a permis d’augmenter de plus de 50
fois le niveau d’expression de la protéine d’intérêt (Voinnet et al., 2003). La protéine HC-Pro
(Helper Component Proteinase) est capable de bloquer la production (Mallory et al., 2001 ;
Ma et al., 2008). Un autre gène a été mis en évidence, le gène rgs-CaM chez le tabac. Il code
pour une protéine liant le calcium capable d’inhiber le « gene silencing » et interagit avec HC-
Pro dans le mécanisme de suppression du gene silencing.
17
1.4. Technologie amplicon : des amplicon viraux pour la production de protéines recombinantes dans les plantes via A. tumefaciens
Dans le passé, le faible rendement d’expression de protéines recombinantes dans les
plantes constituait un frein. De ce fait, la plus part des activités de recherches dans ce domaine
se sont focalisées sur le développement de systèmes d’expression améliorés afin d’augmenter
les rendements. Initialement conçu pour l’étude des mécanismes fondamentaux qui se
déroulent lors de l’infection virale de la plante, les virus recombinants se sont révélés comme
des moyens d’atteindre des hauts rendements de part leur capacité d’intense et de rapide
réplication. (Gleba et al., 2005). Le principe consiste en l’intégration de la séquence codant
une protéine d’intérêt dans le vecteur amplicon reproduisant l’ARN d’un virus. Une fois
introduit dans la cellule végétale via Agrobactérium tuméfaciens, le vecteur amplicon modifié
avec la séquence d’intérêt se multiplie entrainant ainsi une production significativement
augmentée de la protéine d’intérêt (Gelba et al., 2007). Grâce à une amélioration de la
compréhension fondamentale des virus de plantes, de l’interaction virus-plante, du gene
silencing et de sa suppression et de la technique d’agroinfiltration, plusieurs avancées
majeures ont eu lieu dans le domaine du développement de systèmes d’expression basés sur
les virus de plante ces deux dernières décennies. Comme résultat, les vecteurs viraux de
plantes sont de nos jours utilisés en routine pour l’expression à haut rendement de vaccins,
d’anticorps et d’autres protéines d’intérêts dans toute la plante (Zhang et al., 2000). Deux
méthodes sont utilisées pour la réplication virale du gène d’intérêt dans la plante:
L’inoculation directe avec les transcrits viraux ou bien avec le virus recombinant entier et
l’usage de A.tumefaciens pour délivrer le vecteur viral aux cellules de la plante. Appliquer
directement le virus à la plante conduit à une faible efficacité de l’infection et de ce fait à un
faible rendement de protéines (Gleba et al., 2007). La meilleure méthode pour transférer
efficacement l‘amplicon viral est l’utilisation de A. tumefaciens. Lorsque la technique
d’agroinfiltration est utilisée, les cDNA copie du génome virale entier ou modifié et la
séquence d’ADN du gène d’intérêt, précédé d’un promoteur fort sont insérés entre le bord
droit et le bord gauche du plasmide Ti désarmés de A. tumefaciens. Durant l’infiltration du
matériel végétal, l’ADN Ti est transféré aux cellules de la plante hôte et délivré dans le noyau
où la réplication du vecteur viral conduit à une surexpression de la protéine d’intérêt. Dans les
feuilles transformées avec les construits amplicon, il y a transcription dans un premier temps
18
du gène de l’amplicon en ARNm. Les ARNm sont traduits par la machinerie cellulaire en
protéines parmi lesquelles on compte l’ARN polymérase-ARN-dépendante virale codée par
un ORF de la construction amplicon. Si elle trouve un environnement cellulaire propice à la
réplication virale, cette dernière permet la transcription du brin négatif du virus pour conduire
à la mise en place de l’ARN viral double brin. Cela aboutira à la multiplication de l’ARN
viral qui prendra le dessus pour l’expression de protéines virales et conduira à la
multiplication du virus donc à la production d’ARN viral génomique et subgénomique non
polyadénylé (figure 8)
Figure 8 : représentation schématique de la production de la protéine d’intérêt (Pi) via le vecteur amplicon dans le biosystème plante.
L’utilisation des vecteurs viraux pour la production de protéines recombinantes a été revue
dans les grands détails (Gleba et al., 2007, Lico et al., 2008). Quatre types de constructions
virales distincts sont utilisées pour la création des amplicons parmi lesquels les vecteurs
d’insertion de gène, les vecteurs de substitution de gène, les vecteurs utilisant les virus
déconstruits et les vecteurs présentant des peptides. Dans les vecteurs d’insertion de gène, le
gène d’intérêt est ajouté dans un nouveau ORF sous le contrôle d’un promoteur tout en
19
laissant les cDNA complet fonctionnel du virus intact (Lico et al., 2008). Dans les vecteurs
viraux de substitution de gène, une séquence endogène du génome viral est remplacée par la
séquence codant la protéine recombinante. Dans la technique de vecteurs déconstruit, le virus
est séparé en différents segments génétiques agissant ensemble comme un virus multipartite
dans lequel seuls les éléments essentiels pour l’expression du gène d’intérêt sont maintenus, et
le gène de la CP (protéine de capside) est remplacé par celui du gène d’intérêt. Dans les
vecteurs viraux présentant des peptides, le gène d’intérêt est fusionné à la CP permettant ainsi
une génération de la particule virale entière, le peptide souhaité est alors ancrer à la surface
de la particule virale.
La comparaison entre les niveaux de production obtenus en utilisant chaque type de
vecteur viral indique que plusieurs facteurs contribuent à la production de la protéine
recombinante. Par exemple, le rendement de protéine recombinante se montre plus dépendant
du type de plante hôte utilisé, du type de promoteur, que l’amplicon soit capable ou non de
mouvement systémique ou qu’un suppresseur de silencing soit ou non utilisé.
La technologie amplicon a été utilisée avec succès pour la production d’un certain
nombre de protéines. Les vecteurs amplicon utilisés jusqu'à présent dérivent principalement
du TMV (Tobacco mosaic virus), du PVX (Potato virus X) et de CPMV (Cowpea mosaic
virus) associés à des plantes hôtes telles que le tabac ou N. benthamiana. (Tableaux 2,
Tableaux 3, Tableaux 4, et Tableaux 5)
20
Tableau 2 : Les Vecteurs Viraux d’insertion de gène couramment utilisés pour l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens Nom du Vecteur APTT
(amplicon-plus targeting
technology)
BCTV-based vector
PVX-based vector
CPMV-based vector
Virus Utilisé PVX (potato virus X)
BCTV (beet curly top
virus)
PVX (potato virus X)
CPMV (Cowpea mosaic
virus) Promoteur Utilisé
Cauliflower mosaic
virus 35S (CaMV 35S)
CaMV 35S, CaMV 35S CaMV 35S
Plante hôte N. tabacum Xanthi; N.
benthamiana; Transgenic
TEV-B plants
N. benthamiana N. benthamiana N. benthamiana
Souche d’Agrobacterium utilisée
GV3101
GV3101 GV3101 LBA4404;C58C1
Protéine Recombinante produite
COPVL1 (Canine oral
papillomavirus LI)
GFP (Green
fluorescent protein)
haFGF (Human acidic
fibroblast growth factor)
GFP (Green
fluorescent protein)
Niveau d’expression (par masse fraiche)
-----
3 fois plus élévé qu’avec le
promoteur 35S CaMV seul
20 ug haFGF par g de feuille
fraiche
-----
Azhakanandam et al.,2007, Liu et al.,2007, Canizares et al., 2006, II Kim et al., 2007,
21
Tableau 3 : Les Vecteurs Viraux de Substitution de gène couramment utilisés pour l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens Nom du Vecteur
TMV launch vector
BYV-based vector
CMViva VMTA (virusmediated
transgene activation)
TRBO (TMV RNA-based rt
overexpression)
TMV-based vector
PVX-based vector
TMV launch vector
Virus Utilisé TMV (Tobacco mosaic virus)
BYV (Beet yellows virus)
CMV (Cucumber
mosaic virus)
TMV (Tobacco
mosaic virus)
TMV (Tobacco mosaic virus)
TMV (Tobacco mosaic virus)
PVX (Potato virus X)
TMV (Tobacco mosaic virus)
Promoteur Utilisé
CaMV35S CaMV 35S Facteur de transcription
introduit par le vecteur viral pour active
GAL4
CaMV 35S CaMV 35S CaMV 35S CaMV 35S
Plante hôte N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana souche
Agrobacterium Utilisé
A. rhizogenes A4
C58 GV2260 EHA105 LBA4404 GV3101 GV3101 GV3101 ------
protéine Recombinante
produite
Protéine cancéreuse du
ppapillomavirus humain (HPV)
GFP; GUS AAT (Alpha-1 -antitrypsin)
GUS;
GFP Antigene de la tuberculosis
Ag85B, ESAT6
GFP Divers antigène pour
vaccin
Niveau d’expression
400 mg par kg de feuille fraiche
25 fois plus élévé si p21est utilisée dans le
vecteur
390 mg AAT par kg de
feuille fraiche
40 ug IA-2ic par g de feuille
fraiche
5.5 mg GFP par g de feuille
fraiche
Environs 800 mg par kg de feuille fraiche
-----
0.5 g par kg de feuille fraiche
Lindbo, 2007a, Lindbo, 2007b, Dorokhovet al., 2007, Komarova et al., 2006, Hullet al 2005, Sudarshana et al., 2006, Chiba et al., 2006, Plesha et al., 2007, Musiychuk et al., 2007, Chichester et al., 2007, Massa et al 2007. * P21 protéine suppresseur de silencing du Beet yellows virus (BYV)
22
Tableau 4 : Les Vecteurs Viraux issus de virus déconstruits couramment utilisés pour l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens Nom du Vecteur
magnlCON magnlCON magnlCON magnlCON magnlCON magnlCON CPMV-based vector
Virus utilisé TMV (Tobacco
mosaic virus)
TMV (Tobacco
mosaic virus)
TMV (Tobacco
mosaic virus)
TMV (Tobacco
mosaic virus)
TMV (Tobacco
mosaic virus)
TMV (Tobacco mosaic virus);
PVX (Potato virus
X)
CPMV (Cowpea mosaic
virus)
Promoteur utilisé
A. thaliana ACT2
A. thaliana ACT2
A. thaliana ACT2
A. thaliana ACT2
A. thaliana ACT2
A. thaliana ACT2;
CaMV 35S
Plante hôte N.benthamiana; N.tabacum; 50 dicot species
N. benthamiana N. benthamiana
N.benthamiana N.benthamiana N.benthamiana N. benthamiana
souche d’ Agrobacterium
utilisée
GV3101 GV3101 GV3101 GV3101 GV3101 ------
LBA4404; AGL-1
Protéine recombinante
produite
GFP hGH (Human growth hormone); GFP
GFP hBsAg (antigene de
surface de l’hepatite B )
antigènes de Yersinia pestis
;
IgG mAb
IgG mAb
Niveau d’expression (par masse de feuille fraiche)
4 g par kg de feuille fraiche
1 mg hGH par g de feuille
fraiche; 5 mg GFP par g de feuille fraiche
------
295 mg par kg de feuille fraiche
1 mg par g de feuille fraiche
0.5 g mAb par kg feuille fraiche
74 mg par kg de feuille fraiche
Santi, et al., 2006, Sainsbury et al., 2008, Giritch et al.,2006, Gils et al.,2005, Marillonnet et al.,2004, Sheludko, et al., 2007, Huang et al., 2008, Huang, et al., 2006, Marillonnet , et al., 2005, Giritch et al., 2006, Gleba et al.,2005
23
Tableau 5 : Les Virus entier présentant des peptides couramment utilisés pour l’expression transitoire dans les plantes via A.tumefaciens
Nom du vecteur TVCV-based vector PVX-based vector
Virus utilisé Tobacco mosaic virus (TMV) with CP from turnip vein clearing
virus (TVCV)
Potato virus X
Promoteur utilisé A. thaliana ACT2 CaMV 35S
Plante hôte N. benthamiana N. benthamiana
souche d’ Agrobacterium utilisée
GV3101 GV3101
protéiné recombinante produite
Protéine A (de la surface du virus)
Peptides du papillomavirus Humain
type 16 E7 et L2
Niveau d’expression (par masse de feuille fraiche)
>3 g par kg -------
Werner et al., 2006, Cerovska et al 2008
Au jour d’aujourd’hui aucun vecteur amplicon utilisable chez les monocotylédones
(comme pour le riz) n’existe. Le virus de la panachure jaune du riz (RYMV pour Rice yellow
mottle virus) est un candidat de choix pour le développement d’un tel outil biotechnologique.
En effet, la simplicité de son génome ainsi que la grande connaissance fonctionnelle des
protéines associées représentent des atouts majeurs pour le développement de tels outils
amplicons.
1.5. Le virus de la panachure jaune du riz comme outil amplicon L'agent pathogène de la panachure jaune du riz reconnu par le Comité international de
taxonomie des virus (ICTV) sous le nom d'espèce Rice Yellow Mottle Virus (acronyme :
RYMV) appartient au genre des Sobemovirus (Hull et Fargette, 2005). Le RYMV est un
virus facilement transmissible par contact au champ et par inoculation mécanique au
laboratoire. Il est transmis par plusieurs espèces d'insectes (Kouassi et al, 2005), et il l’est
aussi par les mammifères (Sarra et Peters 2003). Par ailleurs, la transmission par le vent et les
pratiques culturales ont été aussi démontrées (Traoré et al., 2006a). Les hôtes naturels du
RYMV sont les deux espèces de riz cultivées (Oryza. glaberrima et Oryza. sativa) et
24
plusieurs espèces de riz sauvages. La gamme d'hôtes du virus est très limitée et comprend
uniquement les espèces de la famille des poacées.
L’acide nucléique viral est un ARN monocaténaire d’environ 4450 nucléotides, de
polarité positive. L'organisation du génome des Sobemovirus a été récemment mise à jour
avec l'identification d'un nouveau cadre ouvert de lecture (ORF) (Ling et al., 2013). Par
conséquent, le génome du RYMV est organisé en cinq cadres ouverts de lecture (figure 9).
L’ORF1, situé à l'extrémité 5' du génome, code pour la protéine P1 impliquée dans le
mouvement du virus dans la plante et joue ainsi un rôle important dans l’infection (Bonneau
et al, 1998). ). Cependant, elle n’est pas indispensable à la réplication du RYMV. La protéine
P1 est capable de supprimer l'extinction post-transcriptionnelle des gènes (ou silencing) chez
Nicotiana benthamiana ou chez le riz (Voinnet et al. 1999). L’ORF2a code pour une
polyprotéine, clivée par la suite pour donner une sérine protéase et une protéine virale liée au
génome (VPg). La VPg est impliquée dans la virulence et détermine la capacité à contourner
les gènes de résistance (Hebrard et al., 2006; Pinel-Galzi et al., 2007). Elle est également
impliquée dans l'adaptation du RYMV à l’infection des espèces de riz asiatique ou africaine
(Thiemele et al., 2010). L’ORF 2b, code pour l'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRP).
L’ORF3 code pour la protéine de capside (CP) par l'intermédiaire d'une molécule d'ARN
subgénomique, laquelle est un ARN messager à fort potentiel de traduction. En plus de son
rôle de protection du génome virale, la CP est impliquée dans la propagation du virus dans la
plante (Brugidou et al., 1995). L'extrémité 3 'de l'ARN viral n’est pas polyadénylée tandis
que l'extrémité 5' est lié de façon covalente à la VPg (Viral protein genome-linked,) (Hull,
1988; Hull et Fargette, 2005). Le rôle fonctionnel de l’ORFX n’est pas entièrement connu,
mais il semble contrôler la mise en place d'une infection systémique (Ling et al., 2013).
Figure 9 : Organisation génomique du RYMV. Cinq cadres ouverts de lecture (ORF) sont cartographiés sur le génome d’ARN~4450nt. Les ORF et les protéines correspondantes sont comme suit: ORF1 (P1), ORFX, ORF2a (protéase et VPg), ORF 2b (RdRp) et ORF3 (protéine de capside) (Ling et al, 2013).
25
De façon générale, pour construire un virus recombinant réplicatif, il faut d’abord
identifier un gène non essentiel à la réplication, ou conditionnellement nécessaire et remplacer
ce gène non essentiel par le « transgène ». Dans le cas de l’utilisation du RYMV comme
virus réplicatif ou outil amplicon, l’ORF1 codant pour la protéine P1 et l’ORF3 codant pour
la protéine de capside sont des ORF non essentiel à la réplication du virus. Pour la mise en
place de l’outil amplicon l’un ou l’autre de ces deux ORF peut être remplacé par le transgène.
Nous avons privilégié l’ORF3 compte tenu de fort potentiel de traduction (Figure 10).
L’ORF2b et ORF3 se chevauchant, le remplacement de l’ORF3 par le gène d’intérêt conduit à
une protéine fusion contenant la protéine d’intérêt fusionné avec l’extrémité N terminale codé
par la partie chevauchante ORF2b / ORF3.
Figure 10: L’outil amplicon RYMV. L’ORF 3 codant pour la protéine de capside est remplacé par le gène d’intérêt. La protéine d’intérêt sera en fusion car l’ORF2b et l’ORF3 sont chevauchant.
Comme exemples de protéines d’intérêt nous présenterons ici la PSA (Promastigote
surface antigen) de Leishmania infantum agent responsable de la leishmaniose chez l’homme
et l’animal et la C3 une protéine d’intérêt agronomique qui présente une activité d’inhibition
de l’alpha amylase de plusieurs ravageurs du coton et du café, l’amylase étant d’un rôle
majeur pour le mécanisme de digestion chez ces insectes.
Les leishmanioses représentent l'une des six maladies parasitaires majeures et sont
considérées, à ce titre, comme prioritaires par l'Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S).
Le gène de la PSA, codant pour des facteurs de virulence ou de pathogénicité (antigènes) chez
Leishmania infantum , est utilisable pour produire de tels facteurs chez les plantes via un outil
amplicon afin d'élaborer des compositions vaccinales contre les leishmanioses. La production
de cette protéine dans un système eucaryote plante apparait comme un nouveau moyen pour
la production d’un vaccin pour la prévention des leishmanioses chez l'animal et chez l'homme
26
en ce sens que sa production dans des systèmes procaryotes tel que Escherichia coli n’a pas
donnée de résultats concluants.
Anthonomus grandis cause de sévères dommages sur le coton (Haynes et Smith,
1992). Hypotheneumus hampei est responsable sur le café d’une perte annuelle de revenus
d’environ 500 millions de dollars (Barbosa et al., 2010). Oliveira-Neto et al., (2003) ont
démontré qu’ au champ, il y a une activité importante de l’alpha amylase dans le tube digestif
des insectes adultes et des larves. Dias et al. (2005) suggèrent que l’alpha amylase soit une
cible pour le contrôle du charançon A grandis chez le coton à travers une stratégie
biotechnologique. La protéine C3 identifier chez Phasoelus vulgaris présente une activité
d’inhibition de l’alpha amylase. Un gène muté de cette protéine présentant une activité
d’inhibition de l’alpha amylase significativement augmentée inhiberait l’activité amylase de
ces ravageurs et permettrait leur contrôle comme le suggèrent Dias et al. De plus, la protéine
C3 étant originaire d’un plante, cela laisse penser qu’un biosystème plante comme système
d’expression de cette protéine permettrait son expression sous une forme active.
Au regard des connaissances sur les gènes de PSA et de C3, des systèmes d’expression
basés sur les plantes seraient indiqués pour l’expression de PSA et de C3 fonctionnelles et
cela de façon rapide et à faible cout.
27
2. Objectifs du mémoire
L’objectif de cette étude est la mise en place et la validation de système de production
basée sur les plantes des deux protéines qui nous intéressent ici : la protéine PSA et la
protéine C3. Nous chercherons à déterminer si la protéine C3 peut être produite dans un
système plante. Pour la protéine PSA nous nous attacherons dans un premier temps à mettre
en place l’outil amplicon RYMV dans un hôte classiquement utilisé pour ce genre
d’approche, Nicotiana benthamiana. Nous nous intéresserons ensuite à l’hôte riz. Il s’agira de
mettre au point les techniques les plus efficaces pour l’introduction de l’outil amplicon dans
les feuilles de riz. Différents méthodes d’introduction ainsi que différents génotypes de riz
seront considérés. Il s’agira ensuite de valider la méthode d’une part en évaluant la
production de la protéine d’intérêt C3 et d’autre part en caractérisant la multiplication virale.
La protéine C3 d’intérêt agronomique a une activité insecticide contre des ravageurs de la
culture du coton et du café.
L’étude se situe dans le cadre des projets de recherche importants de l’équipe de C.
Brugidou, en collaboration ici avec des chercheurs de l’INERA plus précisément dans le
contexte d’un projet trilatéral Burkina France Brésil. Nos activités de recherche ne consistent
pas en l’implémentation de plantes transgéniques en Afrique mais en la mise en place d’un
système de production transitoire de protéines d’intérêt rapide à faible coût à grande échelle
et dans des conditions de sécurité adéquate pour des partenaires notamment les Brésiliens,
pour qui si l’efficacité de la C3 est prouvée établirons des plantes transgéniques au Brésil. Le
Brésil est un important producteur de café et de coton, cultures pour lesquelles la C3 peut être
un produit de biotechnologie pour le contrôle des ravageurs. Une mutagénèse aléatoire sur le gène codantune protéine provenant de Phaseolus
vulgaris présentant des propriétés d’inhibition de l’alpha amylase a donné 108 variantes de
forme du gène. Trois mutants alpha AIC3, alphaA11 et alpha AIG4 ont montré une
augmentation d’activité d’inhibition hautement significative par rapport à la forme sauvage de
l’alpha amylase chez A. grandis (Oliveira-Neto, et al., 2004). La C3 étant une protéine
végétale, sa production dans un biosystème végétal devrait donner une protéine sous forme
fonctionnelle. L’idée ici est donc de cribler des variantes de C3 issues de la mutagénèse
aléatoire à travers un dispositif permettant de les produire rapidement et à faible coût afin
d’identifier la variante de C3 présentant la meilleure activité d’inhibition de l’alpha amylase
pour guider a terme la production et l’implémentation au Brésil de plantes transgéniques
produisant la forme proteique C3 la plus adaptés. L’outil amplicon RYMV une fois mis en
28
place, permettra une production significativement augmentée non seulement des deux
protéines concernées dans cette étude mais aussi et d’autres protéines d’intérêts dans des
systèmes plantes. L’étude présentée ici initie cette mise en place.
29
3. Matériels et méthodes
3.1 Cadre d’étude L’étude a été réalisée en serre et en laboratoire dans les installations de la station de
recherche de l'INERA basée à Kamboinsé , Centre de Recherches Environnementales,
Agricoles et de Formation (CREAF) de Kamboinsé. Le CREAF, d’une superficie de 230 ha
est situé à 12 km au Nord de Ouagadougou sur l'axe routier Ouagadougou-Kongoussi-Djibo.
Les coordonnées géographiques de la station de Kamboinsé sont Latitude : 12° 28 Nord,
Longitude : 1° 32 Ouest, Altitude : 296 m. Les échantillons étaient constitués de feuilles de riz
(Oryza sativa) et de Nicotiana benthamiana, une espèce apparentée au tabac qui ont été
prélevées 5 jours après introduction du transgène dans les plantes. A leur arrivée au
laboratoire, elles ont été conservées dans un congélateur (-80°C). Les analyses ont été faites
sur la plateforme de Biologie Moléculaire et de Protéomique du LMI (Laboratoire Mixte
Internationale) Patho-Bios (www.patho-bios.com/) hébergée au Laboratoire de Virologie et
de Biotechnologie Végétale (LVBV) situé à l’INERA de Kamboinsé (CREAF).
3.2 Génération des vecteurs d’expression des protéines d’intérêts
3.2.1 La réalisation des constructions génétiques Les gènes d’intérêt dans cette étude sont : un gène muté de l’inhibiteur de l’alpha
amylase qui code pour une protéine à activité insecticide identifiée chez Phaseolus vulgaris,
et le gène de la PSA codant pour l’antigène de surface du promastigote de Leishmania
infantum, agent responsable de la leishmaniose (Figure 11).
Le génome du RYMV a servi à la mise en place de l’outil amplicon dans notre étude. Pour les
tests de fonctionnalité le gène de la PSA est substitué à celui de la capside du virus
(Figure 12). Le gène d'intérêt seul ne pouvant pas s'exprimer dans la cellule végétale, il est
inséré dans des constructions génétiques appelées plasmides.
Les séquences de régulation ajoutées aux trangènes dans cette étude sont d’une part soit le
promoteur35S (pour l’agroinfiltration dans le tabac) ou le promoteur ubiquitine « UBI » (pour
l’agroinfiltration dans le riz) situés en amont des gènes d’intérêts, et d’autre part une séquence
terminateur située en aval, elle signale la fin de la séquence codante. D'autres séquences
peuvent être ajoutées pour notamment cibler le lieu d'accumulation de la protéine dans la
plante. Dans notre cas, nous avons utilisé le peptide de rétention KDEL fusionné au gène de
la C3, qui permet son adressage dans le réticulum endoplasmique (RE) .On a également la
30
présence d’une étiquette histidine (TAG) pour la détection et la purification de la protéine
après la production.
Il convient de noter la présence dans les construits utilisés de gènes marqueurs permettent de
repérer et de sélectionner les cellules ayant intégrées le gène d'intérêt. Il s'agit dans cette
étude de gènes de résistance aux antibiotiques.
Figure 11: description des constructions géniques codant les protéines d’intérêt C3 et PSA. La séquence codant C3 et celle codant la PSA sont encadrées en amont par le promoteur 35S (35S) et en aval par le terminateur 3’nos (NOS).
A
B
C
Figure 12: Construits amplicon RYMV. A : L’ORF 3 codant la CP du virus est remplacé par la partie C terminale de la PSA, l’ORF1 codant la protéine P1 est délété. B : L’ORF 3 codant la CP du virus est remplacé par la partie C terminale de la PSA, l’ORF1 codant la protéine P1 n’est pas délété. Les construits A et B sont encadrés en amont par un promoteur 35S et en aval par le terminateur 35S. B : construction idem à celle B à la différence que cette dernière destinée à être utilisée chez le riz est de ce fait encadré par le promoteur Ubi et un terminateur.
31
Tous ces fragments portant les gènes d'origines différentes, gènes d'intérêt, gènes marqueurs
et signaux, sont intégrés dans des plasmides binaires. On obtient ainsi la construction
génétique qui est multipliée puis utilisée pour l'étape de transformation.
3.2.2 Matériel plasmidique (de départ) : Le vecteur pBin61 Le vecteur pBin61 est dérivé du vecteur pBin19 (Bevan, 1984). Il possède le gène de
résistance à la kanamycine, permettant de sélectionner les bactéries portant les séquences
bordantes gauche et droite (left border et right border) du plasmide Ti mais contient en plus
entre ces bordures une cassette de clonage composée du promoteur 35S du CaMV et du
terminateur 35S du CaMV flanquant un site multiple de clonage (Bendahmane et al., 1999)
(Figure 13).
Figure 13: Vecteur Pbin61
Les construits de départ sont disponibles au LMI dans des Escherichia coli. En effet, les
souches Escherichia coli supportent l’amplification et la propagation des plasmides binaires
32
contenant le transgène d’intérêt. Sur les plasmides, en dehors de l’ADN-T, se trouve un gène
conférant la résistance à la kanamycine, permettant de sélectionner les bactéries
recombinantes.
3.2.3 Extraction d’ADN plasmidique de bactéries Escherichia coli Après 24 heures de culture des bactéries dans un milieu LB (composition en annexe 1.2) sous
agitation à 37°C, les bactéries sont culotées par centrifugation (12 000 rpm pendant 5
minutes). Les plasmides sont extraits à l’aide du kit (High Purify Plasmid Miniprep Kit de
NéoBiotech). L'ADN plasmidique est élué dans 50 μl d’eau autoclavée.
3.2.4 Transformation génétique d’ Agrobacterium tumefaciens par choc thermique
Cette technique est utilisée pour transformer les souches bactériennes agrocompétentes
(annexe 2) d’Agrobacterium tumefaciens. Pour chaque transformation, sur un aliquot
d’Agrobacterium tumefaciens chimio-compétente conservé à - 80°C, 5 μl de miniprep de
plasmide sont ajoutés. Le tube contenant le mélange est décongelé lentement dans la glace.
Un choc thermique de 5 minutes est alors réalisé en plongeant le tube dans un bain-marie à
37°C, puis en le transférant immédiatement dans la glace durant 2 mn. 1 ml de milieu YEP
(annexe 1.3) est ajouté et le tube est mis à incuber à 28-30°C pendant 3h30 mn. Pour terminer,
la suspension est étalée sur un milieu LB solide (en boîte de pétri) contenant les antibiotiques
adéquats après centrifugation 2 mn à 12 000trs/mn et élimination de 800 μl du surnageant.
3.3. Culture bactérienne
3.3.1. Milieux de culture Les souches bactériennes sont cultivées sur différents milieux de culture : le milieu LB
(Luria-Bertani) pour les souches d’Escherichia coli et les souches d’ Agrobacterium
tumefaciens transformées, et le milieu YEP (Vervli et et al., 1975) pour les souches non
transformées d’ Agrobacterium tumefaciens. Les milieux solides sont obtenus par ajout de 15
g/L d’agar avant autoclavage 20 minutes à 120°C.
3.3.2. Antibiotiques de sélection Les antibiotiques sont utilisés pour la sélection d’une souche bactérienne recombinante
particulière, à la concentration finale indiquée dans le tableau 6 après dilution de leur solution
stock préalablement filtrées à 0,2 μm. Les antibiotiques sont toujours ajoutés au milieu après
autoclavage. Dans le cas des milieux solides, ils sont ajoutés lorsque le milieu est en surfusion
(environ 50°C) juste avant de le couler dans les boîtes de pétri.
33
Tableau 6: Concentrations finales d'antibiotiques à ajouter au milieu nutritif en fonction de la souche bactérienne et du plasmide utilisés.
Souche Plasmide Résistance Escherichia coli pBin Kanamycine (stock 50 mg/ml-final 50ug/ml)
Agrobacterium tumefaciens C58C1
……. Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml) Tetracycline (stock 100mg/ml- final 50ug/ml)
GV3101
……. Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml) Tetracycline ( stock 100mg/ml- final 50ug/ml)
EHA 105 ……. Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml) GV3101 pBin Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml)
Kanamycine (stock 50 mg/ml-final 50ug/ml) EHA 105 pBin Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml)
Kanamycine (stock 50 mg/ml-final 50ug/ml) EHA 105 pBin Rifampicine (stock 16mg/ml-final 50ug/ml)
Kanamycine (stock 50 mg/ml-final 50ug/ml)
3.3.3. Cocktail de suppresseurs de gene silencing Face à l’introduction d’acides nucléiques étrangers tels que les acides nucléiques
viraux ou les transgènes dans leur génome, les plantes réagissent par le phénomène de gène
silencing (Figure 14). Pour contourner ce mécanisme de défense, plusieurs protéines virales
ont acquis des fonctions diverses de suppression de gene silencing et de ce fait ont été
nommées « suppresseurs de silencing ». L’effet inhibiteur des protéines virales sur le gène
silencing a été exploité pour améliorer l’expression de protéine d’intérêts dans les plantes.
Une combinaison de différents suppresseurs viraux de gene silencing agissant à
différents niveaux de la voie du silencing permet d’atteindre ce but (Figure 14). La protéine
P19 du Tomato bushy stunt virus (TBSV) a été choisie car classiquement utilisée pour
l’augmentation de l’expression de gène (Garabagi, al., 2012, Lombardi, al., 2009, Voinnet
2003). Elle agit en se liant sélectivement au sRNA de 21nt empêchant leur incorporation sur
le complexe AGO1-RISC. La protéine P1 du Rice Yellow Mottle Virus (RYMV) agit sur les
sRNA de 24 nt et empêche fortement leur accumulation (Hamilton et al., 2002, Voinnet al.,
2002, Lacombe, S et al., 2010). Le suppresseur P0 des Beet western yellows virus (BWYMV)
est également choisi car agissant sur des éléments de la voie du silencing autre que les sRNA.
P0 agit directement avec AGO1 entrainant sa dégradation de ce fait empêche la formation
d’un complexe RISC fonctionnel (Baumberger et al., 2007, Bortolamiol et al., 2007).
34
Les gènes codant ces différentes protéines suppresseur de silencing sont insérés
respectivement dans le vecteur d’expression binaire pBin. Les vecteurs ainsi générés sont
utilisés pour transformer des souches d’Agrobacterium tumefaciens. Les agrobactéries portant
les transgènes d’intérêt sont alors infiltrées dans les feuilles de N. benthamiana en
combinaison avec ce cocktail de suppresseur selon le ratio v:v (construction d’intérêt :
cocktail de suppresseur) (tableau 7)
Figure 14: action du cocktail suppresseur de silencing (Lacombe et al., Soumis)
Tableau 7: ratio de la combinaison suppresseurs/ construction d’intérêt
Transgène porté par l’agrobactérie Transgène d’intérêt P19 P0 P1 Volume d’inoculum (ml) 12 4 4 4
3.3.4. Agroinfiltration L'agroinfiltration est une méthode de transformation des cellules végétales permettant
le transfert d'un ou plusieurs gènes d'intérêt. Cette méthode est nommée ainsi car elle
implique l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens (agro-) introduit de manière
mécanique dans une plante hôte (-infiltration). Lorsque l'agroinfiltation est pratiquée sur des
organes non-reproducteurs (généralement les feuilles) elle résulte en l'expression transitoire
du gène introduit. Celui-ci n'est donc pas transféré à la génération suivante. L'agroinfiltration
35
permet l'expression de gènes recombinants plus rapidement que les méthodes de
transformation des plantes traditionnelles puisqu'elle n'exige pas le développement de
lignées stables.
3.4.1. Agroinfiltration des feuilles de N. benthamiana Les agrobactéries recombinantes sont cultivées en milieu LB additionné des
antibiotiques adéquat à 28°C jusqu’à DO 600 nm égale à 0.5. Elles sont alors centrifugées à
4000 g puis resuspendues dans un même volume de MgCl2 10 mM additionné d’
acétosyringone à 100 µM. Le mélange est laissé à l’obscurité, à température ambiante durant
4-6 Heures ou une nuit. Ensuite on procède à l’agro-infiltration des feuilles de N.
benthamiana à l’aide d’une seringue.
3.4.2. Agroinfiltration des feuilles de Oryza sativa Les feuilles de riz de part leur structure ne se prêtent pas facilement à la technique de
l’infiltration à la seringue. Pour introduire les constructions d’intérêt dans les feuilles de riz
plusieurs méthodes ont été élaborées. L’inoculation directe de l’amplicon dans les feuilles de
riz via Agrobactérium a été réalisée en optimisant les conditions de croissance des plantules
de riz de façon à obtenir les feuilles les plus tendres possible (11ème jour après semis). Nous
avons également inoculé un virus « sauvage » dans le but de favoriser la réplication de
l’amplicon (virus chimérique).
3.4.2.1. Préparation de l’inoculum portant des vecteurs pUbi Les précultures d’agrobactéries ayant subit 48h de croissance en milieu liquide LB à
28 °C sous agitation sont étalées sur des boites AB (composition à mettre en annexe 11) (200
µl par boite), puis incubées pendant 3 jours à 28-30°C. Après développement des bactéries sur
la boite AB qui forment alors une pâte visqueuse sur la totalité de la surface de la boite, les
agrobactéries sont raclées à l’aide d’une spatule plate et transférées dans une solution de
MgCl2 10 mM additionnée d’acétosyringone à 200µM. Le mélange est vortexé (figure 14) ou
fortement secoué jusqu’à homogénéisation. La DO est ajustée à 0,5 puis la solution est
laissée à température ambiante pendant au moins une heure avant l’inoculation.
3.4.2.2. Inoculation mécanique des inoculums viraux Les inoculums viraux correspondent soit à du virus RYMV Ci4 (isolat Côte d’ivoire)
purifié ou soit à des feuilles de N. benthamiana exprimant des constructions amplicon
utilisées comme source d’inoculum . Les inoculums sont préparées dans du tampon phosphate
additionné d’une pincée de carborundum. La méthode d’inoculation par friction manuelle a
été utilisée : le doigt est trempé dans l’inoculum puis on frotte la dernière feuille dégainée.
36
Après inoculation, nous avons procédé à une coupure de la partie apicale de la feuille inoculée
pour ainsi l’identifier..
3.5. Le matériel végétal
3.5.1. Plantes de N. benthamiana N. benthamiana une espèce apparentée au tabac a été utilisée pour les essais
d’expression transitoire des protéines d’intérêt. Les graines de N. benthamiana sont semées
en terreau (Terreau multi usage JARDINOVA) et placées en chambre de culture 12h de
lumière, 12h d’obscurité à 24 °C (Figure 15). Deux semaines après semis, les jeunes plants de
N. benthamiana sont repiqués individuellement dans des pots. Après trois semaines ils ont été
utilisés pour l’expression transitoire de la protéine d’intérêt.
Chambre de culture
Pieds de N. benthamiana
âgés de 2 semaines
Repiquage des pieds de N.
benthamiana
Figure 15: culture des plants de N. benthamiana
3.5.2. Plantes de riz Trois variétés de riz espèce Oryza sativa disponibles au laboratoire de virologie et de
biotechnologie végétal (LVBV) ont été utilisées. Ces variétés ont été choisies en fonction de
leur comportement par rapport au RYMV qui est le virus candidat pour le développement de
l’outil amplicon. Deux d’entre elles sont sensibles au virus , il s’agit d’ IR 64 et BG 90-2 et la
variété Digang est résistante au RYMV. 11 jours après semis, les plants de riz ont été utilisés
pour les tests d’introduction de l’outil amplicon (Figure 16).
Figure 16: Pieds d’Oryza sativa agée de 11 jours
37
3.6. Techniques de biologie moléculaire
3.6.1. Extraction des ARNs au TRIZOL Les ARN totaux sont extraits des tissus végétaux à l’aide de TRIzol ou TRI reagent
(annexe 4). Il s’agit d’une solution monophasique de phénol et d'isothiocyanate de
guanidinium qui solubilise simultanément la matière biologique et dénature les protéines.
Après solubilisation, l'addition de chloroforme provoque une séparation des phases aqueuses
et organiques. Les protéines demeurent dans la phase organique, l’ADN à l'interface, et les
ARN restent dans la phase aqueuse. Par conséquent, l'ARN, l'ADN et les protéines peuvent
être purifiés à partir d'un seul échantillon (d'où le nom TRIzol).
Des mortiers et des pilons sont préalablement stérilisés à 120°C pendant 2 h, ensuite
placés à -80°C pendant une nuit. Les échantillons stockés à -80 °C sont broyés dans les
mortiers froids et repris dans un tube eppendorf de 2 ml (Figure 17) dans lequel on ajoute
1000 μl de TRIzol stocké à 4°C. Le mélange est homogénéisé au vortex. Ensuite 200 μl (1/5
du volume de TRIzol) de chloroforme froid sont ajoutés puis le tout a été homogénéisé, le
mélange est maintenu dans la glace pendant 5 mn. Une centrifugation à 14000 rpm pendant
15 mn à 4°C, a été conduite afin de séparer la phase aqueuse (supérieure) de la phase
organique. Ce surnageant a été transféré dans un nouveau tube Rnase free de 1,5 ml, à
laquelle de l’isopropanol froid (le même volume que le surnageant prélevé) est ajouté. Les
tubes sont alors placés à -20°C pendant une nuit. Le mélange est ensuite centrifugé à 14000
rpm durant 10 mn à 4° C. Le culot contenant l’ARN est lavé à l’éthanol 75% froid puis
récupéré par centrifugation (12000rpm pendant 5 mn toujours à 4°C). Le culot est séché
environ 20 mn sous la hotte puis repris dans 40 μl d’eau Rnase free.
Figure 17: Broyage d’échantillons
3.6.2. Traitement à la DNAse Avant la reverse transcription, les ARN extraits sont traités à la DNase pour éviter
toute contamination avec de l’ADN. Pour ce faire, à 8 μl d’ARN on ajoute 1 μl de DNAse
38
(Promega) et 1μl de tampon DNase 10X. L’ensemble est incubé à 37°C pendant 30 mn. A la
fin de l’incubation, 1μl d’EDTA 50 mM est ajouté suivie d’une deuxième incubation à 65°C
pendant 10min pour stopper la réaction. La concentration en ARN est ensuite mesurée avec
le NanoDrop 2000.
3.6.3. Vérification de la qualité des ARN Pour vérifier si les ARN ne sont pas dégradés, les solutions d’ARN sont migrées sur
un gel agarose 1 % contenant du bromide d’éthidium. Pour se faire, 5 µl d’ARN + 5 µl de
H2O + 3 µl de FDE (composition en annexe 5) sont déposés sur le gel. Après migration à
100 Volts pendant 10 minutes, les ARN sont visualisés sous UV.
3.6.4. Reverse transcription Les ARNs ont été retro-transcrits en ADNc en utilisant la transcriptase reverse M-
MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Rnase H Minus selon les recommandations du
fournisseur Promega. Afin de mettre en évidence une réplication de l’outil amplicon RYMV
deux types de synthèse d’ADNc ont été réalisés. La première avec des amorces oligo dT (10
μM) uniquement. Et la seconde en utilisant un mélange des amorces oligo dT (10 μM) et P3
(10 μM) spécifique de la PSA (figure 8 plus haut dans la partie synthèse biliographique).
L’amorce reverse P3 s’hybride sur l’ARN au niveau de la séquence de PSA permettant ainsi
la mise en évidence la réverse transcription spécifique de l’amplicon.
Le mélange d’ARN et d’amorces est incubé à 70°C pendant 10 mn ce qui permet
d’une part une dénaturation des ARN qui prennent alors une forme linéaire et d’autre part une
hybridation des amorces sur les molécules d’ARN. 5 μl du mélange ARN-amorce est prélevé
et ajouté à 20 μl de mix RT (tableau 8). L’ensemble est porté à 42°C pendant 60 min pour la
réaction de reverse transcription proprement dite. A cette température, la reverse transcriptase
est à son optimum d’activité et permet la synthèse d’ADNc. 2.5 μl ADNc sont utilisés pour
la réaction de PCR.
39
Tableau 8: mélange réactionnel pour la reverse transcription Concentration
initiale Concentration
finale Volume
H20 12,75
dNTP 10 mM 400 µM 1
Tampon RT M-MLV RT RNase
Promega
5X 1X 5
RNase Inhibitor Promega
40 U/µl 1U/µl 0,5
M-MLV RT RNase H Minus DNA
polymerase Promega
200 U/µl 4 U/µl 0,75
3.6.5. Amplification des ADNc par PCR La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR est une méthode d’amplification génique in
vitro. Elle permet d'obtenir, à partir d'une faible quantité d’acide nucléique (quelques
picogrammes), d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur
définie. Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double
brin d'ADN. Chaque réaction met en œuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les
extrémités 3’ pointent l'une vers l'autre. Elles définissent alors, en la bornant, la séquence à
amplifier. La méthode consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme
matrice pour les étapes suivantes. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est
exponentielle. Les amplifications PCR ont été conduites dans un thermocycler (Bio Rad)
Afin de disposer d’un contrôle interne de la quantité d’ARN, une PCR de 35 cycles a été
effectué avec les amorces eIF1α Forward et eIF1α Reverse (tableau 9). Ces amorces
amplifient un gène de ménage exprimé de façon constitutif dans les cellules végétales. Le
gène Eif1α code pour un facteur d’élongation impliqué dans la synthèse des protéines
(Sturzenbaum and Kille 2001). Après amplification, 14 μl de produit PCR eIF1α est déposé
sur un gel agarose 1.5% contenant du bromide d’éthidium et observé sous UV.
40
Les amorces PSA8 et P3 (Tableau 8) sont utilisées pour une amplification PCR de 25 cycles
afin de mettre en évidence les différents niveaux de transcription du gène de la PSA. Ces
amorces ont été choisies à partir de la région C-terminale du gène de la PSA. Les volumes
d’échantillons ajustés grâce à la PCR eIF1α sont déposés sur un gel agarose 1.5% contenant
du bromide d’éthidium. Les amplifications PCR-PSA sont alors observées sous UV.
De façon générale, les réactions sont réalisées dans un volume de 50 μl contenant : 10 μM de
chaque amorce sens et antisens (Reverse et Forward), 10 mM de dNTP, 10μl de tampon
d’activité polymérase 5X, 0.2 μl (200 U/µl) de Taq DNA polymerase et de 2.5 μl d’ADNc
matrice. La réaction débute par une étape de dénaturation de l’ADN à 94°C pendant 5 mn.
Cette étape permet de : déshybrider les ADNc double brin, d’éliminer les structures
secondaires, d’homogénéiser le milieu réactionnel par agitation thermique et de dénaturer
d’autres enzymes qui pourraient être dans la solution. Elle est suivie de 25 à 35 cycles
comprenant chacun une étape de dénaturation (94°C pendant 30 secondes), une étape
d’hybridation (58°C pendant 30 secondes) et une étape d’élongation (72°C pendant 45
secondes). L'hybridation des amorces au niveau des séquences complémentaires des ADN
matrices s’effectue à une température optimale permettant un appariement spécifique. Cette
dernière dépend de la température de fusion Tm (c’est la température à laquelle la moitié de
l’ADN est sous forme monobrin et l’autre moitié sous forme double brin.) des deux amorces
déterminée par leur longueur, leur teneur en base purique, et la concentration en ion Na du
milieu réactionnel.
Pour un oligonucléotide de taille comprise entre 14 et 20 nucléotides, le calcul du Tm
est : Tm = (wA+xT) x 2 + (yG+zC) x 4 où w, x, y et z sont le nombre de nucléotides A, T, G
et C respectivement.
Pour un fragment plus long (plus de 20 nucléotides), le calcul recommandé du Tm est: Tm =
81,5 + 16,6(log10 (Na+)) + 0,41(%G + %C) - (675/N). Où N est le nombre total de
nucléotides et (Na+) la concentration en sodium du milieu d’hybridation.
Si la température du milieu réactionnel est supérieure au Tm, l’ADN et l’oligonucléotide ne
s’hybrideront pas. Ils resteront sous forme monobrin. Si la température est égale (en pratique
légèrement inférieure) au Tm, il y aura hybridation spécifique, c’est à dire à l’endroit de la
séquence cible qui est complémentaire de l’oligonucléotide. Si la température est très
inférieure au Tm, il y aura hybridation sur la séquence complémentaire mais aussi hybridation
non spécifique, c’est à dire à des endroits de la séquence cible qui ne sont pas parfaitement
complémentaires à l’amorce.
41
L’étape d'élongation permet la synthèse du brin complémentaire par la Taq DNA polymerase
à 72°C. Ce brin est fabriqué à partir des dNTPs libres présent dans le milieu réactionnel. La
durée de cette étape dépend de la longueur de l’amplicon. Une fois ce premier cycle terminé,
le second commence et ainsi de suite jusqu’à atteindre le nombre de cycles nécessaires pour
l’amplification désirée.
La PCR débute à 94°C pendant 5 mn pour dénaturer l’échantillon et activer l’enzyme. La
dénaturation est suivie des cycles d'amplification (30 secondes à 94°C, 30 secondes à la
température d’hybridation des amorces, puis 45 seconde à 72°C), avant de terminer par 10
minutes à 72°C (élongation finale). Les amorces utilisées sont décrit dans le tableau suivant:
Tableaux 9: Détails sur les différentes amorces Amorces Séquence Amplicon Tm
eIF1 F (tabac) 5’- CCTTGGTCAGCTAGAAGAGGCA-3 650 pb 58°C
eIF1 R (tabac) 5’- AGTAGCTCACCAATTAGACGGA-3’ eIF1 F (riz) 5’- GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’
400 pb 58°C eIF1 R (riz) 5’- AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT -3’
PSA8 5’- TGCTGGTGCGGACTGC-3’ 196 pb 58°C
P3 5’- CAGGCACGTCTTCTCGTCCGTC -3’
Oligo dT (20) 5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
3.6.6. Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose L'électrophorèse en gel d'agarose est une méthode en biologie moléculaire pour
séparer l'ADN ou l'ARN en fonction de leur taille. Cette technique est basée sur la séparation
des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette
séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles
se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.
Le premier facteur affectant la migration est la longueur de la molécule d'ADN : la séparation
se fait en fonction de sa taille. Toutefois la conformation de l'ADN est aussi importante. Pour
éviter les problèmes liés à cette conformation, seul l’ADN linéaire est séparé sur ce gel (ADN
amplifié par PCR ou encore de l'ADNc). L'augmentation de la concentration d'agarose dans
un gel réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragment d'ADN de plus petite
taille.
42
Selon la taille des produits d’amplification PCR et pour une meilleure résolution les
produits PCR sont séparés sur un gel d’agarose 1.5% contenant du bromure d’ethidium (BEt).
Nous n’avons pas eu avant le dépôt des échantillons d’ADN à additionner du tampon de
charge car le tampon d’activité polymérase 5X fait également office de tampon de charge.
Lors de la migration, le gel d’agarose, immergé dans du tampon TAE 0,5X (annexe 6), est
soumis à un champ électrique de 100 V (environ 10V/cm) pendant 20 minutes. La taille
approximative des produits PCR est déterminée grâce à un marqueur de taille ayant migré sur
le gel en même temps que les échantillons (1kb DNA ladder de Promega).
La méthode de révélation utilisée est la révélation au bromure d'éthidium ou BEt. Il
s’agit d’un intercalant couramment utilisé comme marqueur d'acide nucléique en biologie
moléculaire. Lorsqu'il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec
une couleur rouge-orangée plus intense lorsqu'il est lié à l'ADN. Après migration des produits
PCR dans le gel contenant du bromure d’éthidium, les ADNc amplifiés sont observés sous
UV (λ = 254 nm).
43
Vortex Centrifugeuse
Table UV Cuve d’électrophorèse
Thermocycleurs
Figure 18: Quelques matériels de biologie moléculaire
44
3.7. Techniques de protéomique
3.7.1. Extraction de protéines de feuilles de N. benthamiana Les tubes sont préparés la veille et placés à -20°C. Les feuilles de N. benthamiana
récoltées et conservées au -80°C sont broyés dans des mortiers stériles préalablement lavés à
l’eau de Javel et passés pendant 2 h au four à 120°C. Les échantillons sont broyés de manière
à obtenir la poudre la plus fine possible et sont rapidement récupérés dans les tubes froids.
200 à 400 μl de tampon d’extraction sont ensuite ajoutés. Le mélange est centrifugé (figure 18
plus haut) à 4°C à 12000 rpm pendant 30 mn. Le surnageant contenant la fraction protéique
est récupéré dans un nouveau tube et conservé au -20°C.
3.7.2. Détection immunologique des protéines Par Western Blot Le western blot est une technique permettant de détecter une protéine spécifique dans
un échantillon donné. Elle utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions
dénaturantes pour séparer les protéines, selon leur taille. Les protéines sont ensuite transférées
du gel sur une membrane. Celle-ci est incubée avec un anticorps spécifique de la protéine
d'intérêt. Il est possible grâce à cette technique de détecter la présence d'une protéine dans un
extrait et d'évaluer sa taille apparente.
La technique de l'électrophorèse permet de séparer les protéines selon leurs poids
moléculaires apparents et consiste en la migration de protéines dénaturées chargées placées
sous l'influence d'un champ électrique, ceci se faisant au travers d'un gel de polyacrylamide en
présence de sodium dodécylSulfate (SDS). On parle alors de SDS-PAGE : SDS
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.
3.7.2.1. Préparation du gel d’acrylamide SDS – PAGE Le réseau de polyacrylamide est formé par polymérisation de monomère d'acrylamide
en présence de petite quantité de bis acrylamide (NN'méthylène-bisacrylamide) laquelle
polymérisation est catalysée par deux agents chimiques que sont l’ammonium persulfate 10
% (10g dans 100ml) et le TEMED. Le taux de réticulation, qui correspond à la porosité du
gel, dépend de la concentration et du ratio acrylamide/bis-acrylamide. Nous avons utilisé un
gel à 15% d’épaisseur 1,5 mm pour notre analyse .Le gel SDS – PAGE est formé de deux
compartiments : le gel de concentration qui est à 5%, les échantillons se concentrent jusqu'à
obtention de zones protéiques très fines et le gel de séparation à 15 % où a lieu la séparation
proprement dite de la protéine étudiée (C3). Le passage de l'une à l'autre se fait avec un
changement de pH caractérisé par l’utilisation de deux Tris HCl différent le Tris HCl 1.5 M
pH 8.8 pour le running gel et le Tris HCl 1 M pH 6.8 pour le stacking gel et par
45
l’augmentation de concentration en acrylamide du gel (5% ET 15%). Du SDS 20% est
additionnée à chaque type de gel à un volume de 50 µl et 15 µl respectivement pour le
running gel et le stacking gel. Après avoir fait le montage des plaques, le running gel est
bien mélanger sur un agitateur magnétique puis il est rapidement coulé à l’aide d’une
pipette. On recouvre ensuite le gel coulé de butanol-1 pour écraser les bulles d’air formées à
l’interface gel-air et favoriser une bonne polymérisation. Après 30 mn d’attente, le butanol
est entièrement enlevé à l’aide d’un papier Watmann. On mélange bien le stacking gel qui est
coulé sur le running gel. Enfin un peigne servant à la formation des puits de dépôt est
délicatement placé dans le stacking gel. Après 30 mn d’attente le gel est prêt et peut être
utilisé pour la migration il peut aussi être conservé à 4°C jusqu’au lendemain. L’ensemble des
réactifs utilisés se trouve au LMI à 4°C. (Composition des gels en annexe 10)
3.7.2.2. Préparation des échantillons 30 μl d’échantillon protéique sont additionnés de 10μl tampon de charge 4X (annexe
12). Ce tampon donne une densité à l'échantillon lui permettant d'être déposé facilement au
fond des puits. L’ensemble est porté à 100 °C pendant 5 à 10 mn pour être dénaturé. Après
dénaturation les tubes sont rapidement mis dans la glace.
3.7.2.3. Dépôts des échantillons Le tampon de migration 1X est préparé à partir du TG SDS 10X. Le gel est ensuite
mis dans la cuve rempli du tampon de migration, cela permet au gel de prendre la même
température que le tampon. Le peigne est délicatement enlever. Les échantillons sont pulsés
puis déposer délicatement dans les puits. Dans le premier puits est déposé le marqueur de
taille (Prestained Protein Molecular Weight Marker de Euromedex)
3.7.2.4. Migration Le gel est mis à migrer en cuve d’électrophorèse dans le tampon de migration TG
SDS 1X (annexe 8). Une migration à 80 Volts est d’abord effectuée puis une fois les
protéines dans le gel de migration, le voltage est augmenté jusqu’à 100V pendant 1h30.
46
3.7.2.5. Transfert Le principe du transfert est le même que l'électrophorèse. Les protéines, après
séparation, sont toujours entourées de SDS et donc sous l'influence d'un champ électrique, les
protéines vont migrer de la cathode vers l'anode. Un « sandwich » est effectué avec 4 papiers
watmann, 2 éponges + la membrane de nitrocellulose coupés à la taille de du gel (Figure 19).
« Le sandwich » est mis dans la cuve contenant le tampon de transfert (annexe 12). Le
transfert est effectué pendant 1H à 100 Volts et au froid (4°C). On se base sur le marqueur de
taille coloré présent initialement sur le gel pour observer l’état du transfert.
Anode (+)
Cathode (-)
Figure 19: détails du montage de transfert
3.7.2.6. Révélation Après le transfert, la membrane est récupérer et déposée dans une petite boîte
d’environ 20 ml de contenance. On procède au Blocage de la membrane avec du lait de
commerce écrémé (3%) dilué dans du TBSt pH 7,5 (annexe 13) 1h sous agitation. La solution
de blocage est retirée puis la membrane est incubée avec un 1er anticorps pendant 1h sous
agitation, un anticorps anti C3 produit dans du lapin cet anticorps à été conçu pour reconnaitre
la fraction beta de la protéine C3. Avant incubation, l’anticorps est dilué 1/2000 dans une
nouvelle solution de blocage. La solution de blocage contenant l’anticorps anti C3 est ensuite
vidée et la membrane est rinc 6 fois pendant 5 mn avec du TBSt pH 7,5. On procède ensuite à
l’incubation pendant 1h avec le 2ème anticorps conjugué dilué dans du tampon de blocage.
L'anticorps secondaire est un anti-IgG de lapin commercial (sigma) qui est conjugué de
manière covalente à la HRP ((HorseRadish Peroxidase). Son activité enzymatique pourra être
Sens de migration
47
détectée sur un film radiographique. Au bout d’une heure la membrane est rincée 6 fois
pendant 5 mn avec du TBSt pH 7,5 puis récupérée et déposée sur un film transparent. La
membrane est recouverte de 2 ml de solution de détection / membrane (ECL Prime Western
Blotting Detection Reagent) et enveloppée dans le film transparent. A l’obscurité un film
radiographique est déposé sur la membrane en prenant soin de noter sur la membrane
l’échelle de taille correspondant au marqueur. 5 min après le film radiographique est
récupéré . puis trempé successivement dans le révélateur et le fixateur durant 30 sec. Le film
est ensuite rincé à l’eau et analysé après séchage..
3.4. Destruction des bactéries recombinantes et des plantes transformées après expérimentation Après prélèvement des feuilles transformées, les pieds de riz et de N. benthamiana sont
arrachés et incinérés (Figure 20). Après l’agroinfiltration, le reste de bactéries recombinantes
est récupéré dans une bouteille en verre puis autoclavé à 120°C pendant 2h. Après
refroidissement de l’eau de javel est additionné et le tout est jeté à l’évier.
Figure 20 : Incinérateur
48
4. Résultats
4.1. Expression de la protéine C3 dans les feuilles de N. benthamiana Cette manipulation a pour objectif de déterminer si la protéine C3 peut être produite et
s’accumuler dans un système plante. Cette protéine étant originaire d’une plante ( Phasoelus
vulgaris), son expression dans un système plante parait adaptée. Un cocktail de suppresseur
de gene silencing optimisé est co-infiltré dans les feuilles de N. benthamiana dans le but de
bloquer au mieux le mécanisme ce défense de la plante. Un peptide KDEL est fusionné au
gène de la C3, dans l’optique de permettre son adressage dans le Réticulum Endoplasmique
(RE) afin d’augmenter potentiellement le rendement.
4.1.1. Production de plants de N. benthamiana à travers le dispositif mis en place au LMI
N. benthamiana une espèce apparentée au tabac est classiquement utilisée pour les essais
d’expression transitoire de protéines d’intérêt. Les graines de N. benthamiana sont semées en
terreau (Terreau multi usage JARDINOVA fabriqué en France EMB 44179B) et placées en
chambre de culture (12h de lumière, 12h d’obscurité à 24 °C). Deux semaines après semis, les
jeunes plants de N. benthamiana sont repiqués individuellement dans des pots. Après trois
semaines , ils sont utilisés pour l’expression transitoire de la protéine d’intérêt. Les conditions
de culture mises en place au cours du stage ont permis d’obtenir des pieds de N. benthamiana
qui présentent une croissance végétative assez satisfaisante. Les pieds de N. benthamiana
issus du dispositif se sont bien prêtés à l’agroinfiltration (Figure 21) tant en terme de facilité
et d’efficacité d’infiltration.
Pieds de N. benthamiana de cinq semaines
Agroinfiltration d’une
feuille de N.benthamiana
Patch formé lors d’une
agroinfiltration
Figure 21: Pieds de N. benthamiana aptes à l’agroinfiltration
49
4.1.2. Expression transitoire de la protéine C3 dans les feuilles de N. benthamiana
Deux clones indépendant correspondant à un même mutant du gène inhibiteur de
l’alpha amylase de Phaseolus vulgaris sont insérés dans des constructions pBin sous un
promoteur 35S ; 35S :: C3.1 et 35S :: C3.2. Les gènes de ces deux clones sont fusionnés à un
peptide KDEL pour l’adressage de la protéine dans le RE. Une construction pBin vide est
utilisée comme contrôle négatif. Chaque construction est infiltrée dans les feuilles de plantes
de N. benthamiana âgées de 5 semaines en combinaison avec le cocktail de suppresseur
(35S :: P19 + 35S :: P0 + 35S :: P1) sous un ratio suppresseurs : construction de 1 :1 (V :V) (
Figure 10). Deux feuilles par plante et quatre plantes par traitement sont utilisées. Les tissus
infiltrés sont prélevés 5 jours après infiltration.
Tableau 10 : Les différents traitements utilisés Traitement 1 pBin vide + P19+ P0+P1
Traitement 2 C3.1 + P19+P0+P1
Traitement 3 C3.2 + P19+P0+P1
Les protéines de tissus infiltrés sont extraites selon le protocole décrit dans la section
matériel et méthode. Les protéines sont séparées selon leur taille par migration en gel SDS-
PAG puis visualisées par coloration du gel au bleu de coomasie, (Figure 22). La protéine
d’intérêt produite est également mise en évidence par une approche basée sur
l’immunodétection par western blot (Figure 22).
L’analyse SDS-PAGE des extraits de protéine des tissus infiltrés avec les deux clones
de la C3 fait apparaitre une bande apparente de 28 kDa, taille comparable à la protéine C3
native. La révélation de cette bande protéique par un anticorps anti C3 confirme
l’accumulation de C3 dans les feuilles de N.benthamiana traitées. En plus de la bande
apparente correspondant à la protéine d’intérêt, on observe sur le gel SDS-PAGE deux
fractions protéiques d’environs 14 et 19 kDa. Pour ce qui est de ces deux fractions
protéiques, l’immunodétection par western blot ne met en évidence que la seule bande de 14
kDa. En ce qui concerne l’échantillon correspondant au témoin pBin aucune bande apparente
aux tailles de 28, 19 et 14 kDa n’est discernable sur le gel SDS-PAGE. De plus l’analyse
Western blot par anticorps dirigé contre la protéine C3 qui est plus spécifique qu’une
50
coloration au bleu de coomassie ne révèle aucune bande d’expression pour le contrôle.
(Figure 22)
L’ensemble de ces résultats indique clairement que la protéine C3 a été produite et
s’accumule dans les feuilles de N. benthaminana exprimant les constructions C3 dans les
conditions utilisées ici.
Gel acrylamide SDS-PAGE 15 %coloré au bleu de coomassie
Film radiographique: Détection de C3 avec un Ac anti C3
Figure 22: production de C3 dans les feuilles de N.benthamiana. Les premières lignes représentent le marqueur. Les lignes pBin correspondent aux témoins négatifs et les lignes C3.1 et C3.2 aux échantillons tests. A gauche on a la séparation des extraits protéiques par SDS-PAGE 15% colorées au leu de coomassie. Les bandes protéiques sont observées. A droite on a la photo de la détection spécifique de la C3 à l’aide d’un anticorps anti C3. La taille des bandes d’intérêt est indiquée dans les flèches
4.2. Expression de l’amplicon dans les feuilles de N. benthamiana et de riz
4.2.1. Expression de l’amplicon RYMV dans les feuilles de N. benthamiana N. benthamiana n’est pas un hôte naturel du RYMV sur lequel on s’est basé pour la
construction de l’outil amplicon mais est une espèce classiquement utilisée pour la
production de protéines recombinantes car se prêtant bien à l’agroinfiltration. L’objectif de
cette partie est de déterminer si l’amplicon RYMV est capable d’initier une réplication lorsqu’
il est exprimé de façon transitoire dans les feuilles de N. benthamiana . Pour se faire la partie
C-terminale de la PSA est insérée dans 3 types de construction amplicon sous promoteur
35S :
50kD
34kD
26kD
19kD
28 kDa
19 kDa
14 kDa
28 kDa
14 kDa
35kD
25kD
15kD
10kD
pBin C3.1 C3.2 pBin C3.1 C3.2
51
- 35S :: amplicon PSA : cette construction est délétée de l’ORF1 codant la protéine P1 et de
l’ORF3 codant la CP,
- 35S : P1 amplicon PSA : cette construction est délestée de l’ORF3 codant la CP.
- Une construction 35S ::PSA sans environnement amplicon est utilisée comme contrôle
caractérisant l’expression sous la dépendance du promoteur 35S seulement.
Une construction pBin vide est utilisée comme contrôle négatif. Chaque construction est
infiltrée dans les feuilles de N. benthamiana agées de 5 semaines en combinaison avec le
cocktail de suppresseur (P19 + P0 + P1) sous un ratio suppresseurs : construction 1 :1 (v : v)
(tableau 11). Deux feuilles par plante et quatre plantes par traitement sont utilisées. Les tissus
infiltrés sont prélevés cinq jours après infiltration.
Tableau 11: Les différents traitements utilisés Traitement 1 pBIN + P19+ P0+P1
Traitement 2 35S: PSA + P19+P0+P1
Traitement 3 35S:amplicon PSA + P19+P0+P1
Traitement 4 35S P1 amplicon PSA + P19+P0+P1
L’ARN a été extrait selon le protocole d’extraction au TRIzol puis traité à la DNAse
selon les recommandations du fournisseur (RQ1, Promega).
Deux types de reverse transcription se différenciant par les oligonucléotides utilisés sont
effectués à l’aide de la RT MLV (promega). Une première reverse transcription est effectuée
avec l’oligodT. La solution de cDNA obtenue représente la population d’ARNm polyA. En
cas de réplication de l’amplicon viral, les ARN viraux ne sont pas représentés dans cet
échantillon puisqu’ils ne sont pas polyadénylés. La deuxième reverse transcription est
effectuée avec une combinaison d’oligodT et d’amorce P3 spécifique de la séquence de la
PSA et par conséquent de l’ARN viral. La population de cDNA ainsi obtenue représente les
ARNm poly A ainsi que les ARN viraux en cours de réplication non polyadénylé mais portant
la séquence de la PSA.
Un gène endogène connu pour présenter une expression constitutive, le gène eIF1 sert de
contrôle interne puisque la RT-PCR sur ce gène doit être similaire pour chaque échantillon.
L’accumulation d’ARN portant la partie PSA est évaluée par PCR avec les 2 amorces PSA8
et P3.
52
4.2.1.1. Qualité des ARN extraits La migration des ARN totaux extrait au TRIzol sur un gel agarose 1% (Figure 23)
ainsi que le dosage au Nanodrop 2000 (tableau 12) ont montré que les ARN étaient de bonne
qualité. Pour tous les quatre échantillons, de claires bandes correspondant aux ARN
ribosomaux 28S et 18S ont été observées après migration sur gel contenant du bromide
d’éthidium . L’observation de la fluorescence sous rayons UV montre que lesARN extraits
n’ont pas été dégradés (Figure 23).
N° Echantillon 1 pBIN 2 35S :: PSA 3 35S:: amplicon PSA 4 35S:: P1 amplicon PSA
Figure 23 : Vérification de la qualité et la quantité des ARN extraits par électrophorèse des ARN sur gel d’agarose 1% dépôt de 5 µl sur 45 µl
Tableau 12 : Dosage au Nanodrop 2000 de l’ARN extrait après traitement DNase N° Echantillon Concentration en ARN A260 A280 A260/280 1 pBIN 909,6ng/µl 22,739 14,105 1,61 2 35S Cterm PSA 993ng/µl 24,824 15,587 1,59 3 35S: amplicon Cterm 817ng/µl 20,425 12,703 1,61 4 35S: P1 amplicon Cterm 502ng/µl 12,549 7,953 1,58
* A260 = absorbance à 260 nm * A280 = absorbance à 280 nm
4.2.1.2. Contrôle de la qualité de la reverse transcription et homogénéisation des échantillons pour le dépôt de produits PCR
L’amplification du gène eiF1α par PCR a servi de contrôle interne pour la reverse
transcription mais aussi d’indicateur de la quantité de produit PCR à déposer sur le gel afin de
mettre tous les échantillons dans les mêmes conditions. La présence d’une bande à la taille
attendue (650 pb) pour chaque échantillon indique que la reverse transcription a bien eu lieu
(Figure 24). Par ailleurs, pour tous les échantillons, on observe également que ces produits
d’amplification présentent une intensité sensiblement égale (Figure 24). Cela montre que les
1 2 3 4
28S
18S
53
quantités de produits PCR déposés ont permis de mettre les échantillons dans les mêmes
conditions c'est-à-dire qu’on est parti d’une quantité comparable d’ARN totaux de départ pour
chaque échantillons.
N° Echantillon 1 pBIN 2 35S Cterm PSA 3 35S: amplicon Cterm 4 35S: P1 amplicon Cterm
Figure 24: RT-PCR eIF1α. RT-PCR effectuée sur chacun des échantillons de cDNA produit à partir d’un oligonucleotide oligodT (partie haute) ou un mélange d’oligodT et d’oligonucleotide P3 (partie basse). L’identité des échantillons est notée dans le tableau, la taille du produit d’amplification est indiquée.
4.2.1.3. Niveau d’accumulation des différents construits PSA Quand les transcrits de l’amplicon sont exprimés de façon transitoire dans les feuilles
de N. benthamiana, le gène de l’amplicon est d’abord transcrit en ARNm polyadénylé sous
l’effet du promoteur 35S. Si le processus de réplication a lieu, l’ARNm non polyadénylé
complémentaire est synthétisé grâce à l’ARN-polymerase-ARN-dépendant qui utilise l’ARN
génomique comme modèle pour la synthèse du brin complementaire. De nouveaux ARN
génomique et subgénomique sont synthétisés conduisant à une accumulation d’ARN viral non
polyadénylé dans la cellule. Dans le cas de réplication, on retrouve donc dans les cellules
exposées au construit amplicon deux types d’ARN PSA ; les ARN PSA issus de la
transcription sous 35S qui sont poly A et ceux issus de la réplication du virus non poly A. De
façon générale, aussi bien sur la reverse transcription effectuée avec les oligodT que sur celle
1 2 3 4
1 2 3 4
Oligo dT
Oligo dT + P3
650 pb
650 pb
54
effectuée avec une combinaison d’oligodT et d’amorce P3 spécifique de l’ARN viral,
l’amplification du gène PSA a montré des bandes à la bonne taille (192 pb) pour tous les
échantillons sous environnement PSA par contre, sur l’échantillon 1 (témoin négatif) ,
aucune bande n’a été révélée à cette taille (Figure 25). L’échantillon 2 (35S :: PSA) présente
l’intensité de bande la plus élevée après migration des produits PCR sur gel d’agarose
contenant du BEt alors que l’intensité de fluorescence pour les échantillons représentant les
amplicons (3 et 4) s’est montrée très faible. L’intensité de la fluorescence étant
proportionnelle à la concentration de cDNA cible (cDNA PSA) contenue dans l’échantillon et
par conséquent de la quantité de ARN de PSA polyadénylé et viral non polyadénylé
accumulée dans les feuilles de N. benthamiana, on peut donc conclure que dans l’échantillon
2 où il n’y a que des ARN polyadénylé il y eu plus d’accumulation de ARN PSA que dans les
échantillons 3 et 4. Ces deux échantillons sont sous environnement amplicon. L’accumulation
des ARN PSA sans l’outil amplicon RYMV est donc plus importante lorsqu’ils sont
exprimés dans les cellules de N. benthamiana.
4.2.1.4. Effet de la P1 sur l’accumulation de la PSA Non indispensable à la réplication du RYMV la protéine P1 est capable de supprimer
l'extinction post-transcriptionnelle des gènes et est impliquée dans le mouvement du virus
dans la plante. Elle joue ainsi un rôle important dans l’infection (Bonneau et al, 1998). La
présence du gène codant cette protéine sur un des construits est supposée mettre le virus
recombinant dans les conditions propices d’infection. Sur les pieds de N. benthamiana
soumis aux construits sous environnement amplicon (35S :: amplicon PSA (3) et 35S :: P1
amplicon PSA (4)), l’intensité des bandes est sensiblement identique (Figure 25). La P1 n’a
donc pas eu d’effet majeur sur la réplication du virus dans les cellules de N. benthamiana ce
qui s’est traduit par une accumulation des ARN de PSA similaire à celle observée avec le
construit délété de la P1 que ce soit pour les cDNA oligodT ou oligodT + P3.
4.2.1.4. Réplication de l’amplicon Dans les feuilles transformées avec les construits amplicon, il y a transcription dans un
premier temps du gène de l’amplicon en ARNm sous l’effet du promoteur 35S. Les ARNm
sont traduits par la machinerie cellulaire en protéine parmi lesquelles on compte l’ARN
polymérase-ARN-dépendante virale codée par l’ORF2b de la construction amplicon. Si elle
trouve un environnement cellulaire propice à la réplication virale, cette dernière permet la
transcription du brin négatif du virus pour conduire à la mise en place de l’ARN viral double
brin. Cela aboutira à la multiplication de l’ARN viral qui prendra le dessus pour l’expression
55
de protéines virales et conduira à la multiplication du virus donc à la production d’ARN viral
génomique et subgénomique non polyadénylé (Figure 8 plus haut dans la partie revue
bibliographique). En conséquence, la présence d’ARN viral non polyadénylé indiquera que la
réplication de l’amplicon a bien lieu. L’hypothèse ici est que la présence d’ARN viral non
polyadénylé rend compte de la réplication de l’amplicon dans les feuilles infiltrées. Pour
vérifier cela on compare l’amplification du gène de PSA sur les populations de cDNA issus
de la reverse transcription avec oligo dT représentant les ARNm à celle issue de la reverse
transcription oligo dT+P3 représentant les ARNm ainsi que les ARN viraux non polyA si ils
existent. Cette comparaison pour le contrôle 35S : PSA présente une même intensité pour les
deux types de reverse transcription ce qui est en accord avec le fait que dans cet échantillon
l’ensemble des ARN PSA sont polyA. L’intensité d’amplification sur les échantillons cDNA
issus de la RT oligo dT + P3 est plus élevée comparativement à celle des échantillons cDNA
issu de la RT oligo dT pour les échantillons 3 et 4 sous environnement amplicon (figure 25).
Au regard du profil du contrôle 35S :: PSA pour les deux type de reverse transcription
(similarité des amplifications des deux retrotranscriptions), cette disparité importante de
niveau d’amplificationn’est pas le fait de l’usage de l’amorce P3 mais tient surtout du fait
d’une augmentation d’ARN de PSA retro transcrit dans les construits amplicon. Cela
témoigne de la présence spécifique d’ARN de PSA non polyA dans les échantillons
amplicons. Ce qui suggère que l’outil amplicon RYMV a pu initier une réplication lorsqu’il a
été exprimé de façon transitoire dans les feuilles N. benthamiana.
4.2.1.5. Amplifications aspécifiques Il est également à noter la présence d’une amplification aspécifique (Figure 25) sur les
produits PCR oligodT + P3 autour de 250 pb. Cette amplification que l’on retrouve sur tous
les échantillons sous environnement PSA (échantillons amplicon ou non) est aussi présente
sur le témoin négatif. Les amorces PSA8/P3 se seraient donc hybridées à d’autres séquences
que celle cible de la PSA.
56
N° Echantillon 1 pBIN 2 35S Cterm PSA 3 35S: amplicon Cterm 4 35S: P1 amplicon Cterm
Figure 25: RT-PCR PSA RT-PCR effectuée sur chacun des échantillons de cDNA produit à partir d’un oligonucleotide oligodT (partie haute) ou un mélange d’oligodT et d’oligonucleotide P3 (partie basse). L’identité des échantillons est notée dans le tableau, la taille du produit d’amplification est indiquée.
4.2.2. Expression de l’amplicon dans les feuilles de riz Nous avons démontré plus haut qu’il y a eu une réplication de l’amplicon dans cellule
de N. benthamiana mais cette réplication n’est pas efficace en termes de rendement. Le
RYMV infecte le riz comme hôte naturel, ce qui nous conduit à l’hypothèse selon laquelle
l’outil amplicon RYMV s’il est exprimé dans son hôte naturel pourrait retrouver des
conditions propices à sa réplication. Pour cela plusieurs techniques d’introduction de l’outil
amplicon dans les feuilles de riz ont été considérées en prenant en compte différents
génotypes de riz (des variétés sensibles et tolérantes). Cela permet du même coup d’identifier
le type de variété qui se prête le mieux à l’introduction de l’outil. Dans ce cas nous avons
utilisé une construction amplicon contenant l’ORF1 codant la P1, la construction étant sous
promoteur Ubi. (Figure 12 du matériel et méthodes)
Les tests d’introduction de l’outil ont été effectués sur trois types de variété de riz ;
deux variétés sensibles IR 64 et BG-92.1 et une variété tolérante appelé Digang. Quatre
méthodes d’introduction ont été utilisées (Tableau 13). Les ARN totaux ont été extraits au
TRIzol puis nous avons effectué une reverse transcription avec une combinaison d’oligodT et
d’amorce P3 spécifique de l’ARN viral, cette dernière au cours de réplication du virus
1 2 3 4
1 2 3 4
Oligo dT
Oligo dT + P3
192 pb
192 pb
57
n’étant pas polyA la combinaison d’amorce permet la détection des ARN PSA poly A issus
de transcription guidée par le promoteur Ubi et des ARN PSA non poly A issu d’une
éventuelle réplication de l’outil amplicon.
Tableau 13: les différentes méthodes d’introduction Méthode Description de la method
Méthode A Agroinfiltration directe
Méthode B Inoculation avec du RYMV (1µg/ml) puis agroinfiltration 3 jours après
Méthode C Inoculation avec du RYMV (1µg/ml) puis inoculation mécanique 3 jours
après
Méthode D Inoculation avec du RYMV (1µg/ml) puis utilisation de feuille de tabac
comme source d’inoculum * le virus Ci4 (dilué 10 8) est inoculé à l’ensemble des pieds de riz contenu dans un pot
4.2.2.1 Qualité des ARN extraits La migration des ARN totaux extraits au Trizol sur un gel agarose 1% (Figure 26)
ainsi que le dosage au NanoDrop 2000 (tableau 14) ont montré que les ARN étaient de bonne
qualité. Pour tous les sept échantillons de riz, de claires bandes correspondants aux ARN
ribosomaux 28S et 18S ont été observés après migration sur gel contenant du bromide
d’éthidium. L’observation de la fluorescence sous rayons UV montre que les ARN extraits
n’ont pas été dégradés
N° Echantillon
3 C- : échantillon de riz jamais mis
en contacte avec la PSA
4 Variété Digang, méthode A
5 Variété IR 64, méthode B
6 Variété BG, méthode C
7 Variété IR 64, méthode D
8 Variété Digang, méthode D
9 Variété Digang, méthode D
Figure 26 : Vérification par électrophorèse de la qualité et la quantité des ARN sur gel d’agarose dépôt de 5 µl sur 45 µl
3 4 5 6 7 8 9
28s
18S
58
Tableau 14 : Dosage au NanoDrop 2000 de l’ARN extrait après traitement DNase
*3 : échantillon de riz jamais exposé à la PSA * 4, 5, 6, 7, 8, et 9 : échantillons de riz test ayant été exposé à la PSA
* Les échantillons 1 et 2 respectivement eau et miniprep de PSA ne figure pas dans ce tableau. * A260 = absorbance à 260 nm * A280 = absorbance à 280 nm
4.2.2.2. Contrôle de la qualité de la reverse transcription et homogénéisation des échantillons pour le dépôt de produits PCR
Les bandes obtenues pour l’amplification eIF1 sur tous les échantillons témoignent de
la qualité et de la quantité de l’ARN extrait (Figure 27). Cela signifie également que la
retrotranscription de l’ARN en ADNc s’est bien déroulée et les populations de cDNA sont
comparables entre elles en termes de quantité d’ARN initial.
N° Echantillon 1 Eau 2 C+ :miniprep de PSA
3 C- : échantillon de riz jamais mis
en contacte avec la PSA
4 Variété Digang, méthode A
5 Variété IR 64, méthode B
6 Variété BG, méthode C
7 Variété IR 64, méthode D
8 Variété Digang, méthode D
9 Variété Digang, méthode D
Figure 27: Produits PCR eiF1
N° Méthode Concentration A260 A280 A260/ A280 3
325,8ng/µl 8,145 4,51 1,81
4 A 1243,4ng/µl 31,084 16,861 1,84 5 B 2185,2ng/µl 54,631 26,962 2,03 6 C 1785,4ng/µl 44,634 22,383 1,99 7 D 1794,1ng/µl 44,853 29,075 1,54 8 D 623,8ng/µl 15,594 10,007 1,56 9 D 1243,9ng/µl 31,098 16,479 1,89
400 pb
750pb 500pb 200pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9
RT Oligo dT + P3
59
4.2.2.3. Détection du signal de la PSA L’amplification PSA sur les échantillons test n’a révélé aucune bande à la taille
attendue. Le témoin 2, témoin positif qui est une extraction plasmidique de PSA montre une
claire bande à 192 pb. Dans le témoin eau (1) il n’y a aucune bande, ce qui indique l’absence
de contamination. Pour le témoin 3, un échantillon de riz exposé à la construction
pUBi ::vide, nous n’avons pas non plus observé de bande à la bonne taille. Au regard de ces
observations, techniquement, nous ne sommes pas arrivés à détecter une réplication de
l’amplicon dans le riz. (Figure 28)
4.2.2.4. Apparition d’amplifications aspécifique L’analyse de la PCR PSA sur RT Oligo dT + P3 des échantillons de riz, laisse voir des
amplifications aspécifiques aussi bien sur l’échantillon de riz exposé au vecteur vide que sur
les échantillons exposés au vecteur contenant l’outil amplicon portant le gène d’intérêt
(Figure 28). Les échantillons 3, 4, 5, et 6 présentent deux bandes aspécifiques. Ces
échantillons sont issus d’une reverse transcription réalisée à 42°C. Sur les trois derniers
échantillons à savoir les échantillons 7 ,8 et 9, nous avons voulu éliminer les amplifications
aspécifiques en augmentant la température à 52°C ce qui a eu pour résultat la diminution du
nombre d’amplifications non spécifiques.
Figure 28: PCR PSA
N° Echantillon 1 Eau 2 C+ :miniprep de PSA
3 C- : échantillon de riz jamais mis
en contacte avec la PSA
4 Variété Digang, méthode A
5 Variété IR 64, méthode B
6 Variété BG, méthode C
7 Variété IR 64, méthode D
8 Variété Digang, méthode D
9 Variété Digang, méthode D
1 2 3 4 5 6 7 8 9
RT Oligo dT + P3
750 pb 500 pb 400 pb
625 pb 400 pb 192 pb
60
5. Discussion
5.1. Production de pieds de N. benthamiana à travers le dispositif mis en place au LMI Les plantes appartenant au genre Nicotiana tel que N. benthamiana sont très utilisées
pour la production de protéine d’intérêt particulièrement pour leur haut rendement en
biomasse et leur facilité de croissance. Elles se prêtent à une transformation transitoire ou
stable par un transgène sous un promoteur 35S à l’aide d’ A. tumefaciens. Cela aboutit à une
importante accumulation de protéines d’intérêts. Cependant, pour être utilisé comme système
de culture, les pieds de N. benthamiana demandent des conditions de cultures particulières
(température, humidité, photopériodisme…). Au vue des résultats obtenus, on peut dire que
le dispositif mis en place au cours du stage dans la chambre de culture a permis d’obtenir des
plants dans les conditions requises.
5.2. Expression transitoire de la protéine C3 dans les feuilles de N. benthamiana L’expression et l’accumulation de la protéine C3 ont été prouvées à travers cette étude.
Le gel SDS-PAGE ainsi que le western blot ont révélé une hétérogénéité en terme de taille
des protéines exprimées. Nos résultats sont en accord avec ceux de Moreno et al (1989) qui
ont montré que la maturation de la protéine native de l’inhibiteur de l’ α-amylase des
phaseolus aboutissait à son clivage en deux polypeptides de 19 et 14 kDa. Aussi dans les pois
transgéniques exprimant α-AI1, trois polypeptides ont été observés par immunoblot
(Schroeder et al., 1995). Par ailleurs Obiro et al (1995) ont montré que la protéine native de
l’inhibiteur de l’ α-amylase dans plusieurs plantes transgéniques, peut être clivée en plusieurs
polypeptides du fait des variations dans leur glycosylation ou de la transformation des
glycanes. Un exemple nous a été donné par Altabella et al (1990) qui ont mis en évidence par
immunodétection 11 polypeptides dans des graines de tabac transgéniques transformés avec le
gène de α-AI1. Nous ne saurons parler de l’hétérogénéité des tailles des protéines observées
lors de l’expression de la C3, sans noter que les travaux de Sawada et al (2002) ont montré
que même chez P. vulgaris (espèce d’où est issu le gène de α-AI1 natif) les sous-unités α et β
de α-AI1 ne sont pas toujours glycosylées de la même façon.
La bande de 28 kDa révélée par Western blot et sur le gel SDS-PAGE correspond
parfaitement en terme de taille à la protéine non maturée. Cette dernière, étant en fusion
61
avec le peptide KDE, est retenue dans le RE, la maturation de la C3 a pourtant lieu dans
l’appareil de Golgi après passage de la protéine dans le RE qui constitue son site
d’adressage. Dans le cadre notre étude, la protéine retenue dans le RE reste immature
puisqu’elle est normalement maturée après le RE. L’addition d’un peptide KDEL au
construit C3 ne serait pas une stratégie adaptée car elle conduirait à l’obtention de protéine
C3 immature donc potentiellement non fonctionnelle. La mise en évidence des fractions de
19 et 14 kDa montre que la rétention ne s’est pas effectuée à 100%, ces fractions étant le
résultat de la modification post-traductionnelle d’une partie de la protéine native non
retenue.
Sur le gel SDS-PAGE, le profil de protéines des échantillons exprimant les clones de la
C3 a révélé trois polypeptides caractéristiques autours de 28, 19 et 14 kDa or
l’immunodétection n’a montré que les bandes de 28 et 14 kDa. Cela se justifie par le fait
que l’anticorps anti C3 utilisé pour l’immunodétection a été conçu à partir d’un peptide de la
sous-unité β de la C3. Pour cette raison, il a permis la reconnaissance de la fraction β sur la
protéine immature correspondant à la bande de 28 kDa. Les fractions de C3, non retenues
dans le site d’adressage, subissent dans l’appareil de Golgi leur maturation qui consiste en
un clivage en deux pour donner les fractions α et β. L’anticorps étant dirigé contre la
fraction β, dès lors que le clivage a lieu, seul cette fraction β est reconnue ce qui explique la
révélation de deux bandes lors de l’immunodétection comparativement à trois bandes mises
en évidence après coloration du gel SDS-PAGE au bleu de coomassie. La présence de deux
bandes β pourrait s’expliquer par différentes formes de glycosylation comme cela a été
fréquemment décrit dans la littérature (Sawada et al., 2002). La bande de 19 kDa
correspondant à la fraction α n’a pas d’affinité avec l’anticorps et de ce fait n’est pas
détectée dans l’immunoblot.
5.3. Test expression amplicon dans les feuilles de N. benthamiana et de riz La comparaison de l’amplification PSA des échantillons amplicon 3 et 4 (Figure 25)
issus des reverses transcriptions « oligo dT + P3 et oligo dT » a montré une réplication de
l’amplicon dans les cellules de N. benthamiana car la différence de l’intensité de
l’amplification entre les reverses transcriptions oligo dT et oligo dT + P3 est due à la
présence d’ARN non polyadénylés dans ce dernier et donc à la mise en exergue de la
réplication du virus dans les échantillons amplicon. L’amplicon a initié une réplication
lorsqu’on l’a exprimé de façon transitoire dans les cellules de N. benthamiana. Cependant
62
lorsqu’on appose le niveau d’accumulation d’ARN des échantillons 3 et 4 à celui de
l’échantillon 2 (échantillon sous environnement non amplicon caractérisant l’expression sous
la dépendance du promoteur 35S seulement), il s’avère que l’accumulation sous la
dépendance de l’amplicon est moins importante que l’accumulation sous le contrôle du
promoteur 35S uniquement (Figure 25). Cela suggère que l’amplicon dans N. benthamiana
n’est pas l’outil le plus efficace pour améliorer l’accumulation de protéines d’intérêt. Cela se
justifie en ce sens que l’outil viral RYMV dans N. benthamiana se situe dans un contexte non
hôte. Son hôte naturel étant le riz, dans N. benthamiana les conditions propices à sa
réplication ne seraient pas réunies. D’où l’intérêt de passer sur le riz pour réaliser une
expression transitoire. Il convient également de noter que l’expression en premier lieu de la
protéine d’intérêt via l’outil amplicon dans N. benthamiana est une étape importante pour le
test de fonctionnalité de l’outil en ce sens que N. benthamiana est classiquement utilisée pour
ce genre d’approche, en raison de ses feuilles qui se prêtent bien à l’agroinfiltration. La
protéine P1 n’est pas nécessaire à la réplication du RYMV mais est capable de supprimer
l'extinction post-transcriptionnelle des gènes et est impliquée dans le mouvement du virus
dans la plante. Elle joue ainsi un rôle important dans l’infection (Bonneau et al, 1998). La
présence du gène codant cette protéine sur un des construits est supposée mettre le virus
recombinant dans les conditions propices. Cependant aucune différence significative n’a été
observée dans l’accumulation d’ARN entre le construit amplicon codant en plus du gène
d’intérêt la P1 et celui délété de la P1. La P1 n’a donc pas eu d’effet majeur sur le pouvoir de
réplication du virus dans N. benthamiana.
Même si elle est faible, la réplication de l’outil observée sur les feuilles de N.
benthamiana, suggère que ces feuilles peuvent être utilisées comme source d’inoculum pour
passer sur d’autres plantes tel que le riz et amorcer potentiellement une réplication.
5.4. Expression de l’amplicon dans les feuilles de riz L’analyse de la PCR PSA sur la RT Oligo dT+P3 des échantillons de riz, ne permet
pas de conclure quant à la réplication de l’outil dans le riz (Figure 28). Cela nous conduit aux
hypothèses suivantes : est-ce qu’il y eu introduction de l’outil amplicon des cellules de
feuilles de riz via Agrobactérium tumefasciens ? Cette question s’appuie sur le fait que les
feuilles de riz n’étant pas tendres, elles se prêtent difficilement à l’agroinfiltration, c’est dire
ici que l’application de cette technique sur le riz n’est pas des plus adaptées. La deuxième
question à laquelle nous arrivons est ainsi : est-ce que la réplication typique de l’amplicon a-
elle eu lieu ? En effet pour chacun des échantillons testés, aucune amplification correspondant
63
à celle attendue n’a été observée. Notre troisième question nous emmène à la mise en cause de
la spécificité des amorces P3et PSA8 utilisées pour l’amplification du gène d’intérêt. En effet,
ces dernières n’amplifient aucune séquence à la taille attendue mais amplifient deux autres
séquences inattendues à 650 et 400 pb. Cela suggère qu’elles reconnaitraient d’autres
séquences sur le génome du riz.
Dans les méthodes d’introduction B, C, et D, du virus Ci4 a d’abord été inoculé avant
de procéder à l’introduction proprement dite de l’outil. Ce virus inoculé devrait servir de
« helper » pour amorcer et soutenir la réplication du virus chimérique. Il convient de noter
que des symptômes du RYMV ont été observés 10 jours après inoculation du virus Ci4, ce qui
laisse penser que l’inoculation a bien marché. On peut donc se demander si dans les
échantillons 5, 6, 7 et 8 (Figure 28 partie résultat) l’apport de l’outil a lieu à un moment ou le
virus Ci4 était bien en activité dans le point d’inoculation . Si l’amplicon est apporté à un
moment où le virus n’est pas actif ou n’est pas présent, cela reviendrait à se retrouver dans un
contexte d’un apport sans virus.
64
Conclusion et perspectives
Les travaux menés au cours de mon stage ont permis la production de la protéine
d’intérêt agronomique C3. Le peptide KDEL qui a été flanqué à la construction C3 a permis
la rétention de la protéine dans le RE. Cependant cette rétention entrave la maturation post-
traductionnelle de la protéine qui devrait s’effectuer après le site de rétention dans l’appareil
de Golgi (Santino et al., 1992) et permettre l’obtention de protéines fonctionnelles. Exprimer
la C3 à l’aide d’une construction sans KDEL est une perspective qui permettra d’obtenir
davantage de protéines matures et ainsi de procéder à des tests de fonctionnalité des protéines
ainsi obtenues transitoirement dans les feuilles de N. benthamiana.
Les premiers tests portant sur l’utilisation de l’outil amplicon dans N. benthamiana se
sont révélés assez concluant en ce sens qu’une réplication de l’amplicon a pu être mise en
évidence chez N. benthamiana. Cependant, il faut noter que l’amplicon dans N. benthamiana
ne s’est pas montré comme un outil efficace pour augmenter significativement
l’accumulation d’ARN de PSA par rapport à une construction plus classique tel que le gène
d’intérêt sous promoteur fort 35S. Ceci donne un regain d’intérêt à la nécessité de mettre en
place la technique d’introduction de l’outil amplicon la plus efficace dans son hôte naturel
qu’est le riz chez qui le virus chimérique pourrait trouver un environnement plus favorable à
sa réplication.
Chez le riz, les résultats du transfert de l’outil ne se sont pas montrés concluant. Aucun
signal de réplication n’a pu être mis en évidence. Cependant plusieurs hypothèses donnent
l’espoir de pouvoir améliorer la production d’une protéine d’intérêt avec l’outil amplicon par
son introduction chez son hôte naturel qu’est le riz.
Parmi ces espoirs on compte la co-introduction de l’outil et d’un second virus qui
jouera le rôle de « helper ». Ceci nécessite de déterminer le pattern spacio-temporel du virus
helper afin d’introduire l’amplicon dans le bon tissus et au bon moment c'est-à-dire lorsque le
virus helper est présent et actif. Ainsi, le virus chimérique issu de l’expression de l’amplicon
se retrouverait dans des conditions propices à sa réplication en recrutant les protéines
nécessaires que le virus helper aurait déjà produites.
Par ailleurs aussi bien chez le riz que chez N. benthamiana, on a remarqué la présence
d’amplifications non spécifiques ce qui laisse entrevoir une affinité non optimum des amorces
65
P3 et PSA8 utilisées pour l’amplification PSA dans cette étude. La définition d’autres
amorces pour l’amplification du gène de la PSA en portant plus d’attention sur leur spécificité
serait une solution pour la détection spécifique de la PSA.
La transformation de feuilles de riz via Agrobacterium n’étant pas aisée, il serait
intéressant de prendre en compte d’autres tissus de riz plus propices à l’introduction de
l’amplicon via Agrobactérium telles que les suspensions cellulaires de riz en culture liquide.
En effet, les cultures de suspension cellulaire de riz présentent une meilleure possibilité
d’une transformation efficace via Agrobactérium ce qui pourrait contribuer à l’introduction
efficace de l’outil dans le riz.
L’expression et l’accumulation de la protéine d’intérêt ayant été démontrées dans
cette étude, on pourra envisager la production d’autres protéines d’intérêts tels que des
anticorps ou des vaccins à travers de tels systèmes d’expressions « plantes » qui tiendront
compte de la sécurité biologique.
66
Références bibliographiques Altabella T, Chrispeels MJ: Tobacco plants transformed with the Bean α-AI1gene express
an inhibitor of insect alpha-amylase in their seeds. Plant Physiology 1990, 93:805-810.
Assoumane, A., Rekima, S., Tap, J. (2006). Les plantes trangénique pour la production de
molécules à effets therapeutiques Université Pierre et marie curie – Paris VI M2GGB - Master
2eme année mention biologie moléculaire et cellulaire Spécialité génétique Parcours
professionnel Génétique et Gestion de la Biodiversité
Austin, S., Bingham, E. T., Koegel, R. G., Mathews, D. E., Shahan, M. N., Straub, R. J.
andBurgess, R. R. (1994). "An overview of a feasibility study for the production of
industrialenzymes in transgenic alfalfa." Annals of the New York Academy of Sciences 721:
234-244.
Azhakanandam, K.; Weissinger, S. M.; Nicholson, J. S.; Qu, R. D.; Weissinger, A. K.
Amplicon-plus targeting technology (APTT) for rapid production of a highly unstable vaccine
protein in tobacco plants. Plant Molecular Biology 2007, 63, (3),
393-404.
Baumberger, N., Tsai, C.H., Lie, M., Havecker, E. and Baulcombe, D.C., (2007) The
Polerovirus silencing suppressor P0 targets ARGONAUTE proteins for degradation. Curr.
Biol., 17, 1609-1614.
Bendahmane, A., Kanyuka, K. and Baulcombe, D.C., 1999. The Rx gene from potato
controls separate virus resistance and cell death responses. Plant Cell 11, 781-92.
Bevan, M., 1984. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res
12, 8711-21.
Boehm, R. (2007). Bioproduction of therapeutic proteins in the 21st century and the role of
plants and plant cells as production platforms. Biology of Emerging Viruses: Sars, Avian and
67
Human Influenza, Metapneumovirus, Nipah, West Nile, and Ross River Virus. 1102: 121-
134.
Bonneau, C., Brugidou, C., Chen, L., Beachy, R. N., Fauquet, C. M. (1998). Expression of
the rice yellow mottle virus P1 protein in vitro and in vivo and its involvement in virus spread.
Virology 244, 79-86.
Bortolamiol, D., Pazhouhandeh, M., Marrocco, K., Genschik, P. et al., (2007) The
Polerovirus F box protein P0 targets ARGONAUTE1 to suppress RNA silencing. Curr.
Biol., 17, 1615-1621.
Brugidou, C., Holt, C., Ngon, A. Y. M., Zhang, S., Beachy, R. N. & Fauquet, C. M.
(1995). Synthesis of an infectious full-length cDNA clone of Rice yellow mottle virus and
mutagenesis of the coat protein. Virology, 206, 108-115.
Cadoret, J. P., Bardor, M., Lerouge, P., Cabigliera, M., Henriquez, V. and Carlier, A.
(2008). "Microalgae as cell factories producing recombinant commercial proteins." Les
microalgues: Usines cellulaires productrices de molecules commerciales recombinantes 4(4):
375-382.
Canizares, M. C ; Liu, L.; Perrin, Y.; Tsakiris, E.; Lomonossoff, G. P. A bipartite system
for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants. Plant
Biotechnology Journal 2006, 4, (2), 183-193.
Daniell H, Singh ND, Mason H, Streatfield SJ. (2009) Plant-made vaccine antigens and
biopharmaceuticals. Trends Plant Sci., 14:669-679.
Dias, S.C., Franco, O.L., Magalhães, C.P., Oliveira-Neto, O.B., Laumann, R.A., Figueira,
E.L., Melo, F.R., Grossi-de-Sa, M.F., 2005. Molecular cloning and expression of an alpha-
amylase inhibitor from rye with a potential for controlling insect pests. Protein Journal 24,
113–123
Diaz-pendon, J.A., Li, F. Li, W.X and Ding, S.W. (2007). Suppression of antiviral
silencing by cucumber mosaic virus 2b protein in Arabidopsis is associated with drastically
68
reduced accumulation of three classes of viral small interfering RNAs. Plant cell,19, 2053-
2063
Dingermann, Theo (2008). "Recombinant therapeutic proteins: Production platforms and
challenges." Biotechnol. J. 3: 90-97.
Dorokhov, Y. L.; Sheveleva, A. A.; Frolova, O. Y.; Komarova, T. V.; Zvereva, A. S.;
Ivanov, P. A.; Atabekov, J. G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves.
Tuberculosis 2007, 87, (3), 218-224.
Dunoyer, P., Lecellier, C.H., parizotto; E.A., Himber C. and Voinnet, O. (2004). Probing
the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA
silencing. Plant cell, 16(5), 1235-50.
Fischer, R. and Emans, N. (2000). "Molecular farming of pharmaceutical
proteins."Transgenic Research 9(4-5): 279-299.
Garabagi, F., Gilbert, E., Loos, A., McLean, M.D. et al., (2012) Utility of the P19
suppressor of gene-silencing protein for production of therapeutic antibodies in Nicotiana
expression hosts. Plant Biotechnol J., 10, 1118-1128.
Giddings, G., Allison, G., Brooks, D. and Carter, A. (2000). "Transgenic plants as factories
for biopharmaceuticals." Nat Biotechnol 18(11): 1151-5.
Gils, M.; Kandzia, R.; Marillonnet, S.; Klimyuk, V.; Gleba, Y. High-yield production of
authentic human growth hormone using a plant virus-based expression system. Plant
Biotechnology Journal 2005, 3, (6), 613-620.
Giritch, A.; Marillonnet, S.; Engler, C ; van Eldik, G.; Botterman, J.; Klimyuk, V.;
Gleba, Y. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with
noncompeting viral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 2006,103, (40), 14701-14706.
69
Gleba Y, Klimyuk V, Marillonnet S. (2007) Viral vectors for the expression of proteins in
plants. Curr Opin Biotechnol., 18:134-141.
Gleba, Y.; Klimyuk, V.; Marillonnet, S. Magnifection - a new platform for expressing
recombinant vaccines in plants. Vaccine 2005, 23, (17-18), 2042-2048.
Hacker, D. L., Petty, L. T. D., Wei and Morris T. J (1992). Turnip crinkle virus gene requires for RNA replication and virus movement. Virology 186, 1_8.
Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L. and Baulcombe, D. (2002) Two classes of short
interfering RNA in RNA silencing. EMBO J., 21, 4671-4679.
Haynes, J.W., Smith, J.W., 1992. Longevity of laboratory reared boll weevils (Coleoptera:
Curuculionidae) offered honey bee collected pollen and plants unrelated to cotton. Journal of
Economic Entomology 27, 366–374.
Hebrard, E., Pinel-Galzi, A., Bersoult, A., Sire, C. & Fargette, D. (2006). Emergence of a
resistance-breaking isolate of Rice yellow mottle virus during serial inoculations is due to a
single substitution in the genome-linked viral protein VPg. Journal of General Virology, 87,
1369-1373.
Huang, Z.; LePore, K.; Elkin, G.; Thanavala, Y.; Mason, H. S. High-yield rapid
production of hepatitis B surface antigen in plant leaf by a viral expression system. Plant
Biotechnology Journal 2008, 6, (2), 202-209.
Huang, Z.; Santi, L.; LePore, K.; Kilbourne, J.; Arntzen, C. J.; Mason, H. S. Rapid, high-
level production of hepatitis B core antigen in plant leaf and its immunogenicity in mice.
Vaccine 2006, 24, (14), 2506-2513.
Hull, R. & Fargette, D. (2005). Sobemovirus. In C. Fauquet, M. A. Mayo, J. Maniloff, U.
Desselberger & L. A. Ball (Eds).Virus Taxonomy: Eighth Report of the International
Committee on Taxonomy of Viruses (pp. 885-890). San Diego, CA: Elsevier Academic Press.
London. V
70
Hull, R. (1988). The sobemovirus group. In: R. Koening (Ed). The Plant Viruses: Polyhedral
Virions with Monopartite RNA Genomes (pp. 113-146). Plenum Press, New York
II Kim, K.; Sunter, G.; Bisaro, D. M.; Chung, I. S. Improved expression of recombinant
GFP using a replicating vector based on Beet curly top virus in leafdisks and infiltrated
Nicotiana benthamiana leaves. Plant Molecular Biology 2007, 64, (1-2), 103-112.
Johansen, L.K., and Carrington, J.C. (2001). Silencing on the spot: Induction and
suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.
Plant Physiol. 126, 930–938.
Kachroo, P., Yoshioka, K., Shal, J., Dooner, H, K., and klessg, D, F (2000). Resistance to
the turnip crinkle virrus in Arabidopsis is regulated by two host genes is salicylic acid
dependant but NPR1, ethylene and jasmonate independent. Plant cell 12, 677_690
Komarova, T. V.; Skulachev, M. V.; Zvereva, A. S.; Schwartz, A. M.; Dorokhov, Y. L.;
Atabekov, J. G. New viral vector for efficient production of target proteins in plants.
Biochemistry-Moscow 2006, 71, (8), 846-850.
Kouassi, N. K., N’guessan, P., Albar, L., Fauquet, C. M. & Brugidou, C. (2005).
Distribution and characterization of Rice yellow mottle virus: a threat to African farmers.
Plant Disease, 89, 124-133.
Lacombe, S., Bangratz, M., Vignols, F. and Brugidou, C. (2010) The rice yellow mottle
virus P1 protein exhibits dual functions to suppress and activate gene silencing. Plant J.,
61, 371-382.
Lakatos, L., Csorba, T., Pantaleo, V., Chapman, E.J., Carrington, J.C., Liu, Y.-P.,
Dolja, V., Calvino, L.F., Lopez-Moya, J.J., and Burgyan, J. (2006). Small RNA binding is
a common strategy to suppress RNA silencing by several viral suppressors. EMBO J. 25, 876–
884.
Lico, C ; Chen, Q.; Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants.
Journal of Cellular Physiology 2008, 216, (2), 366-377.
71
Lindbo, J. A. High-efficiency protein expression in plants from agroinfectioncompatible
Tobacco mosaic virus expression vectors. Bmc Biotechnology 2007.
Lindbo, J. A. TRBO: A high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-Based overexpression
vector. Plant Physiology 2007,145, (4), 1232-1240.
Ling, R., Pate, A. E., Carr, J. P. & Firth, A. E. (2013). “An Essential Fifth Coding ORF in
the Sobemoviruses.” Virology, 446, 397-408.
Liu, J. Y.; Ma, P. D.; Sun, Y.; Yang, M. Y.; Yang, L. P.; Li, Y. X.; Wu, Y. F.; Zhu, X. J.;
Wang, X. Z. Expression of human acidic fibroblast growth factor in Nicotiana benthamiana
with a potato-virus-X-based binary vector. Biotechnology and Applied Biochemistry 2007,
48,143-147.
Ma, J. K., Drake, P. M. and Christou, P. (2003). "The production of recombinant
pharmaceutical proteins in plants." Nat Rev Genet 4(10): 794-805.
Ma, J. K., Hiatt, A., Hein, M., Vine, N. D., Wang, F., Stabila, P., van Dolleweerd, C.,
Mostov, K. and Lehner, T. (1995). "Generation and assembly of secretory antibodies in
plants."Science 268(5211): 716-9.
Marillonnet, S.; Giritch, A.; Gils, M.; Kandzia, R.; Klimyuk, V.; Gleba, Y. In planta
engineering of viral RNA replicons: Efficient assembly by recombination of DNA modules
delivered by Agrobacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 2004,101, (18), 6852-6857.
Marillonnet, S.; Thoeringer, C ; Kandzia, R.; Klimyuk, V.; Gleba, Y. Systemic
Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient
expression in plants. Nature Biotechnology 2005, 23, (6), 718-723.
Morel, J.B., Godon, C., Mourrain, P., Beclin, C., Boutet, S., Feuerbach, F., Proux, F.,
72
and Vaucheret, H. (2002). Fertile hypomorphic ARGONAUTE (ago1) mutants impaired in
posttranscriptional gene silencing and virus resistance. Plant Cell 14, 629–639.
Moreno J, Chrispeels MJ: A lectin gene encodes the alpha-amylase inhibitor of the common
bean. Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86(20):7885-7889.
Napoli, C., Lemieux, C. and Jorgensen, R (1990). ‘’ introduction of a chimeric chalcone
synthase gene into Petunia results in reversible co-supperssion of homologous gene in trans.’’
Plant cell,2, 279-289
Negrouk, V., Eisner, G., Lee, H. I., Han, K. P., Taylor, D. and Wong, H. C. (2005).
"Highlyefficient transient expression of functional recombinant antibodies in lettuce." Plant
Science 169(2): 433-438.
Obiro WC, Zhang T, Jiang B: The nutraceutical role of the Phaseolus vulgaris alpha-
amylase inhibitor. The British Journal of Nutrition 2008, 100(1):1-12.
Oliveira-Neto, O.B., Sckenckel, R.G.M., Grossi-de-Sa, M.F., (2004). Effects of soybean
Kunitz trypsin inhibitor in the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). Phytochemistry 65,
81–89
Pazhouhandeh, M., Dieterle, M., Marracco, K., Lechner, E., Berry, B., Brault, V.,
Hemmer, O., Kretsch, T., Richards, K.E., Genschik, P., and Ziegler-Graff, V. (2006). F-
box like domain in the polerovirus protein PO is required for silencing suppressor function.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 1994–1999.
Petroski, M.D., and Deshaies, R.J. (2005). Function and regulation of Cullin-RING
ubiquitin ligases. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6,9–20
Pfeffer, S., Richards, K. and Jonard, G. (2003). "L'extinction de gènes chez les plantes
révèle un mécanisme de défense antiviral surmonté par les phytovirus = Gene silencing."
Virologie 7(5): 353-366.
Pinel-Galzi, A., Rakotomalala, M., Sangu, E., Sorho, F., Kanyeka, Z., Traore, O. &
73
Fargette, D. (2007). Theme and variations in the evolutionary pathways to virulence of an
RNA plant virus species. Public Library of Science, Pathogen. 3, 1761-1770.
Qi, Y., Denli, A.M., and Hannon, G.J. (2005). Biochemical specialization within
Arabidopsis RNA silencing pathways. Mol. Cell 19, 421–428.
Qiu, W., Park, J. W. and Scholthof, H. B. (2002). "Tombusvirus P19-mediated suppression
of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence
pathogenicity." Molecular Plant-Microbe Interactions 15(3): 269-280.
Qu, F., Ren, T. and Morris, T.J (2003). The caot proten of turnip crinkle virussuppresses
posttranscriptional gene silencing at an early initiation step. J. Virol., 77,511-522
Sainsbury, F.; Lavoie, P. O.; D'Aoust, M. A.; Vezina, L. P.; Lomonossoff, G. P.
Expression of multiple proteins using full-length and deleted versions of cowpea mosaic virus
RNA-2. Plant Biotechnology Journal 2008, 6, (1), 82-92.
Santi, L.; Giritch, A.; Roy, C. J.; Marillonnet, S.; Klimyuk, V.; Gleba, Y.; Webb, R.;
Arntzen, C. J.; Mason, H. S. Protection conferred by recombinant Yersinia pestis antigens
produced by a rapid and highly scalable plant expression system. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 2006,103, (4), 861-866.
Santino A, Daminati MG, Vitale A, Bollini R (1992) The a-amylase inhibitor of bean seed:
two step proteolytic maturation in the protein storage vacuoles of the developing cotyledon.
Physiol Plant 85: 425-432
Sarra, S. & Peters, D. (2003). Rice yellow mottle virus is transmitted by cows, donkeys, and
grass rats in irrigated rice crops. Plant Disease, 87, 804-808.
Sawada S, Takeda Y, Tashiro M: Primary structures of alpha- and beta subunits of alpha-
amylase inhibitors from seeds of three cultivars of Phaseolus beans. Journal of Protein
Chemistry 2002, 21(1):9-17.
74
Schroeder HE, Gollasch S, Moore A, Tabe LM, Craig S, Hardie DC, Chrispeels MJ,
Spencer D, Higgins TJV: Bean alpha-Amylase lnhibitor Confers Resistance to the Pea
Weevil (Bruchus pisorum) in Transgenic Peas (Pisum sativum). Plant Physiology 1995,
107:1233-1231. 1239.
Sheludko, Y. V.; Sindarovska, Y. R.; Gerasymenko, I. M.; Bannikova, M. A.; Kuchuk,
N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium
mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering 2007, 96, (3), 608-614.
Song, J.J., Smith S.K., Hannon G.J and Joshua-tor l. (2004) Cristal structure of argonaute
and its implication for RISC slicer activity. Science, 305 (5689) 1434-7.
Thiémélé, D., Boisnard, A., Ndjiondjop, M-N., Chéron, S., Séré, Y., Aké, S., Ghesquière,
A., Albar, L. (2010). Identification of a second major resistance gene to Rice yellow mottle
virus, RYMV2, in the African cultivated rice species O. glaberrima. Theoretical and Applied
Genetics 121:169-179. DOI: 10.1007/s00122-010-1300-2.
Traore, O., Pinel, A., Hebrard, E., Gumedzoe, M. Y. D., Fargette ,DFargette, D., Traore,
A. S. & Konate, G. (2006a). Occurrence of resistance-breaking isolates of Rice yellow mottle
virus in West and Central Africa. Plant Disease, 90, 259-263.
Voinnet O, Rivas S, Mestre P, Baulcombe D. (2003) An enhanced transient expression
system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy
stunt virus. Plant J., 33:949-956.
Voinnet, O., Pinto, Y.M. and baulcombe, D.C. (1999). Suppression of gene silencing: a
general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 96, 14147-14152
Werner, S.; Marillonnet, S.; Hause, G.; Klimyuk, V.; Gleba, Y. Immunoabsorbent
nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 2006,103, (47), 17678-17683.
Yusibov, V. and Rabindran, S. (2008). "Recent progress in the development of plant derived
75
vaccines." Expert Rev Vaccines 7(8): 1173-83.
Zhang, G. C ; Leung, C ; Murdin, L.; Rovinski, B.; White, K. A. In planta expression of
HIV-1 p24 protein using an RNA plant virus-based expression vector. Molecular
Biotechnology 2000,14, (2), 99-107.
Zhang, H., Kolb, F.A., Brondani, V., Billy E. and Filipowicz, W.(2002). Human Dicer
preferentially cleaves dsRNA at their termini without a requirement for ATP, EMBO, 21 (21),
5875-5885
Zhang, X., Yuan, Y.R., Pei, Y., Lin, S.S., Tuschl, T., Patel, D.J and Chua, N.H. (2006)
cucumber mosaic virus encoded2b suppressor inhibits Arabidopsis Argonaute1 cleavage
activity to counter plant defense. Genes Dev., 20 (23),3255-68
A
Annexe 1. Composition du milieu de culture bactérienne
1.2 Composition du milieu LB
composant Quantité (g/L)
Tryptone 10
Yeast Extract 5
NaCl 10
1.3 Composition du milieu YEP
composant Quantité (g/L)
Tryptone 10
Yeast Extract 10
NaCl 5
Les milieux solides sont obtenus par l’ajout de 20 g/L d’Agar avant autoclave.
1.4 Milieu AB pour la croissance des agrobactéries
Tampon AB (stock 20X)
K2HPO4 60g/l (12g pour 200ml)
KH2PO4 20g/l (4g pour 200ml)
Autoclaver
Sels AB (stock 20X)
NH4Cl 20 g/l (4g pour 200ml)
MgSo4,7H2O 6 g/l (1.2g pour 200ml)
KCl 3 g/l (0.6g pour 200ml)
CaCl2 0,20g/l (0.04g pour 200ml)
FeSO4,7H2O 50 mg/l ( 10mg pour 200ml)
Autoclaver et conserver à 4°C
B
Pour 1 L de milieu AB, mélanger 5 g de glucose, 15g de difco bacto agar et 900ml d’eau
bidistillée et autoclaver. Ajouter ensuite 50 ml de tampon AB autoclavé et 50ml de sels
AB. Ajouter les antibiotiques appropriés à la souche et couler les boîtes de Pétri.
2. Preparation de bactéries agrocompétantes
Inoculer 5 ml de YEP Rifampicine 5ul stock 50 mg/ml et gentamicine 10ul 10mg/ml
avec la souche GVM3101
Incuber O/N à 30°
Le lendemain matin :
Inoculer 50 ml de YEP Rif/genta avec 2 ml de culture O/N. incuber à 30°C sous
agitation pendant environs 4h jusqu’à DO à 600nm = 0.8.
Pendant ce temps, refroidir dans un bac à glace, la solution de CaCl2 10 mM et des
tubes eppendorf vides (10 à 12 tubes).
Centrifuger à 3000 rpm pendant 10mn.
Reprendre délicatement le culot de bactéries dans 1 ml de C aCl2 10Mm.
Aliquoter en 100 ul par tubes eppendorf. Flash freeze dans de l’éthanol technique.
Conserver à -80°C.
3. Préparation des antibiotiques
Toutes les solutions « mères » d’antibiotiques sont stockées à -20°C et protégées de la lumière.
KANAMYCINE
Préparation de la Kanamycine à 10 mg/ml dans de l’eau. Stérilisation par filtration à 0,22 µm. Utilisation à 50 µg/ml
RIFAMPICINE
Préparation de la rifampicine à 16 mg/ml dans du DMSO. Utilisation à 50 µg/ml
TETRACYCLINE Préparation de la Tétracycline à 5 mg/ml dans de l’éthanol. Ne pas stériliser. Utilisation à 10 µg/ml
C
4. Trizol « maison »
0,8 M Guanidine thiocyanate (118,16 g)
0,4 M Ammonium thiocyanate (76,12g)
0,1 M Sodium Acétate pH5 (33,4ml de Sodium Acétate stock à 3 pH5)
50 ml Glycérol 50%
qsp H20 620 ml
Autoclaver
Ajouter 380 ml de phénol saturé
5. FDE
10 ml formamide déionisé
200 µl 0.5 M EDTA pH 8
10 mg xylène cyanol FF
10 mg bleu de bromophénol
6. TAE 50X Tris base 242 g Acide acétique glacial 57,1 ml EDTA 0,5 M pH 8 100 ml Eau qsp 1 L Autoclaver Utiliser à 0,5X, diluer la solution mère dans de l’eau distillée
7. dNTP 10mM dATP 100 mM 50 µl dCTP 100 mM 50 µl dGTP 100 mM 50 µl dTTP 100 mM 50 µl Eau 300 µl
8. Tampon de migration
Pour 1 litre de solution 10X
250 mM Tris base 30.285 g
2.5 M glycine 187.67 g
Tampon de migration 1X = 100 ml de 10X + 5ml SDS 20% qsp 1 Litre
D
9. Tampon d’extraction des protéines. 50 ml
Composant Quantité
Tris HCl pH 7.5 1 ml
NaCl 292 mg
Na2 EDTA, 2H2O 186 mg
D glucose 225 mg
Triton X 100 50 µl
EGTA 95 mg
Glycerol 2.5 ml
DTT 250 µl
Inhibiteur de protéase 250 µl
E
10. Volume gel SDS-PAGE
Gels de 1,5 mm épaisseur 1 gel 15% 2 gels 15%
RUNNING GEL A 15 % (10ml/gel)
Acrylamide Bis-acrylamide 40 % (4°C)
Tris HCl 1.5 M pH 8.8 (4°C)
SDS 20 %
Ammonium Persulfate 10 % (10g dans
100ml)
Temed (4°C)
H20
3,75 ml
2,6 ml
50 µl
100µl
10 µl
3,49 ml
7,5 ml
5,2 ml
100 µl
200 µl
20 µl
6,98 ml
STACKING GEL A 5 % (3 ml)
Acrylamide Bis-acrylamide 40 % (4°C)
Tris HCl 1 M pH 6.8 (4°C)
SDS 20 %
Ammonium Persulfate 10 %
Temed (4°C)
H20
375 µl
375 µl
15 µl
30 µl
3 µl
2,25 ml
750 µl
750 µl
30 µl
60 µl
6 µl
4,5 ml
11. Tampon de transfert
Pour 1 litre
Tris base 2.42 g
Glycine 11.26 g
Méthanol 200 ml
F
12. Bleu de charge 4X
Pour 10 ml
200 mM Tris HCl pH 6.8 2 ml (1 M)
400 mM DTT 0.716 g
8 % SDS 4 ml (20 %)
0.4.1 % Bleu bromophénol 40 mg
40 % Glycérol 4 ml
13. TBSt pH 7.5
Pour 1 litre
20 mM tris base 2.423 g
75 mM NaCl 3.146 g
2,5 mM MgCl2, 6H2O 0.508 g
pH 7.5 avec HCl
Tween 20 0.05 % (à rajouter extemporanément