MOLEKULARNA IMUNOGENETIKA

MOLEKULARNA MOLEKULARNA IMUNOGENETIKAIMUNOGENETIKA

Molecular ImmunogeneticMolecular Immunogenetic

UVODUVOD

• Molekularna imunogenetika je moderna Molekularna imunogenetika je moderna naučna disciplina koja se bavi naučna disciplina koja se bavi izučavanjem molekularne osnove izučavanjem molekularne osnove imunog sistema, odnosno gene koji imunog sistema, odnosno gene koji kodiraju odbrambene imunoglobulinske kodiraju odbrambene imunoglobulinske proteinske komplekse ili antitijela, kao i proteinske komplekse ili antitijela, kao i gene koji kodiraju receptore T limfocita. gene koji kodiraju receptore T limfocita.

UVODUVOD

• Kao što je poznato, imunološki ili odbrambeni Kao što je poznato, imunološki ili odbrambeni sistem čovjeka posjeduje dvije vrste limfocita sistem čovjeka posjeduje dvije vrste limfocita (B i T) koji su zaduženi za ćelijski, odnosno (B i T) koji su zaduženi za ćelijski, odnosno humoralni imunitet.humoralni imunitet.

• B limfociti stvaraju imunoglo–bulinske B limfociti stvaraju imunoglo–bulinske makromolekule ili antitijela. Antitijela na makromolekule ili antitijela. Antitijela na površini ćelije služe kao receptor za antigene, površini ćelije služe kao receptor za antigene, a funkcija im je efektorska ako se izlučuju iz a funkcija im je efektorska ako se izlučuju iz ćelije.ćelije.

• T limfociti također pomažu stvaranje antitijela T limfociti također pomažu stvaranje antitijela ali imaju efektorsku i regulacijsku ulogu.ali imaju efektorsku i regulacijsku ulogu.

UVODUVOD

• Određene specifične mutacije imunoglobulinskih Određene specifične mutacije imunoglobulinskih gena (Ig-gena), uzrokuju poremećaj u imunom gena (Ig-gena), uzrokuju poremećaj u imunom sistemu a također mogu biti osnov za nastanak sistemu a također mogu biti osnov za nastanak određenih bolesti (limfoidni tumori), čije su određenih bolesti (limfoidni tumori), čije su dijagnosticiranje i terapija izuzetno potpomognute dijagnosticiranje i terapija izuzetno potpomognute korištenjem vrhunskih dostignuća molekularno-korištenjem vrhunskih dostignuća molekularno-bioloških metoda. Činjenica je dakle, da je bioloških metoda. Činjenica je dakle, da je molekularna biologija kao vodeća nauka 21 vijeka molekularna biologija kao vodeća nauka 21 vijeka već odavno ušla u molekularne analize osnova već odavno ušla u molekularne analize osnova ljudskih bolesti, pa je na nivou informacijskih ljudskih bolesti, pa je na nivou informacijskih makromolekula DNA i RNA došlo do zadivljujućih makromolekula DNA i RNA došlo do zadivljujućih otkrića funkcioniranja i ekspresije gena zaduženih otkrića funkcioniranja i ekspresije gena zaduženih za imuni sistem čovjeka. za imuni sistem čovjeka.

UVODUVOD

• Unutar DNA svake ćelije postoji određeni Unutar DNA svake ćelije postoji određeni ograničeni broj informacija a ona je opet ograničeni broj informacija a ona je opet sposobna da sintetiše antitijela ogromne sposobna da sintetiše antitijela ogromne receptorske raznolikosti, pa je bilo sasvim receptorske raznolikosti, pa je bilo sasvim opravdano pitanje kako je to uopće moguće. opravdano pitanje kako je to uopće moguće.

• Odgovor na to pitanje dala je Odgovor na to pitanje dala je molekularna molekularna bi–ologijabi–ologija. Za to je odgovoran specifični . Za to je odgovoran specifični genetički mehanizam rekombinacije i genetički mehanizam rekombinacije i somatskih mutacija gena odgovornih za somatskih mutacija gena odgovornih za kodiranje komponenti antitijela i receptora T kodiranje komponenti antitijela i receptora T limfocita. limfocita.

HROMOSOMSKI Ig-GENSKI LOKUSIHROMOSOMSKI Ig-GENSKI LOKUSI

• Svi ovi H i L polipeptidni lanci kodirani su Svi ovi H i L polipeptidni lanci kodirani su od strane specifičnih gena koji su od strane specifičnih gena koji su pozicionirani u slije–dećim hromosomskim pozicionirani u slije–dećim hromosomskim genskim lokusima:genskim lokusima:

• H (jedan lokus) → 14.H (jedan lokus) → 14. hromosom hromosom čovjeka → pozicija q32.3čovjeka → pozicija q32.3

• L (dva lokusa) L (dva lokusa) → → 2.2. hromosom čovjeka → pozicija hromosom čovjeka → pozicija

p12 → kapa lanacp12 → kapa lanac → → 22. hromosom čovjeka → pozicija q11 22. hromosom čovjeka → pozicija q11

→ lambda lanac.→ lambda lanac.

HROMOSOMSKI Ig-GENSKI LOKUSIHROMOSOMSKI Ig-GENSKI LOKUSI

• Na osnovu navedenog lako se može Na osnovu navedenog lako se može zaključiti da postoje dvije vrste gena zaključiti da postoje dvije vrste gena odgovornih za sintezu polipeptidskih odgovornih za sintezu polipeptidskih komponenti imunoglobulinskih komponenti imunoglobulinskih makromo–lekula, a to su:makromo–lekula, a to su:

• Varijabilni geni (V-geni)Varijabilni geni (V-geni)

• Konstantni ili stabilni geni (C-geni)Konstantni ili stabilni geni (C-geni)

VARIJABILNI GENIVARIJABILNI GENI

• V-geniV-geni odgovorni za kodiranje teških lanaca odgovorni za kodiranje teških lanaca Ig molekula. Ig molekula.

Raspoređeni su u tri specifična genska područja:Raspoređeni su u tri specifična genska područja:

• varijabilno područje sa V-genskim varijabilno područje sa V-genskim elementima, elementima,

• područje raznolikosti sa D-genskim područje raznolikosti sa D-genskim elementima ielementima i

• područje povezivanja sa J-genskim područje povezivanja sa J-genskim elementima. elementima.


• Ovi genski odsječci imaju sposobnost Ovi genski odsječci imaju sposobnost spajanja i preuređivanja u procesu spajanja i preuređivanja u procesu formiranja aktivnog V-gena. formiranja aktivnog V-gena.

• Za ovo preuređivanje je odgovoran Za ovo preuređivanje je odgovoran enzim enzim rekombinaza,rekombinaza, koji ima sposobnost koji ima sposobnost prepoznavanja specifičnih nukleotidnih prepoznavanja specifičnih nukleotidnih sekvenci iza svakog V- genskog odsječka. sekvenci iza svakog V- genskog odsječka.

• Postoji oko 100-200 genskih odsječaka V-Postoji oko 100-200 genskih odsječaka V-gena (područje od 2500 kb na 14. gena (područje od 2500 kb na 14. hromosomu čovjeka).hromosomu čovjeka).


KONSTANTNI GENIKONSTANTNI GENI

• C-geni Ig–H polipeptidskih lanaca određuju C-geni Ig–H polipeptidskih lanaca određuju mjesto raspoređivanja antitijela u mjesto raspoređivanja antitijela u određenom tkivu (IgG prolaze kroz određenom tkivu (IgG prolaze kroz posteljicu, a IgA izlaze na površinu posteljicu, a IgA izlaze na površinu sluznica) ili pak neke efektorske funkcije sluznica) ili pak neke efektorske funkcije (IgM aktivira komplement a IgE inicira (IgM aktivira komplement a IgE inicira degranulaciju mastocita).degranulaciju mastocita).

•


• C-L humani geni su: Vκ, Jκ, J, Cκ i Cλ. C-L humani geni su: Vκ, Jκ, J, Cκ i Cλ. Konstantni kapa gen ima pet J Konstantni kapa gen ima pet J genskih odsječaka dok D genski genskih odsječaka dok D genski odsječci ne postoje.odsječci ne postoje.

• V gen najbliži Cκ genu ima suprotan V gen najbliži Cκ genu ima suprotan smjer transkripcije u odnosu na smjer transkripcije u odnosu na njega. njega.


• C-H geni (Cμ, Cγ, Cα i Cε) na svom C-H geni (Cμ, Cγ, Cα i Cε) na svom kraju imaju S-sekvencu zaduženu za kraju imaju S-sekvencu zaduženu za gensko prekopčavanje (engl. Switch) gensko prekopčavanje (engl. Switch) u procesu preuređivanja gena, dok u procesu preuređivanja gena, dok ovu sekvencu nema samo Cδ-gen.ovu sekvencu nema samo Cδ-gen.

• Kod čovjeka ima 11 C-H gena koji Kod čovjeka ima 11 C-H gena koji zauzimaju region od 200 kb.zauzimaju region od 200 kb.


• Konstantni lambda geni su specifični Konstantni lambda geni su specifični po tome što svaki od njih ima po tome što svaki od njih ima pridružen po jedan J-genski odsje–pridružen po jedan J-genski odsje–čak.čak.

• Često se među njima nalaze i Često se među njima nalaze i pseudogeni koji se inače označavaju pseudogeni koji se inače označavaju sa φ .sa φ .




MOLEKULARNI OSNOV DIVERZITETA MOLEKULARNI OSNOV DIVERZITETA IMUNOGLOBULINSKIH IMUNOGLOBULINSKIH MAKROMOLEKULAMAKROMOLEKULA

• Mnoge nepoznanice u vezi Mnoge nepoznanice u vezi diverziteta molekula antitijela i diverziteta molekula antitijela i mehanizama odgovornih za taj mehanizama odgovornih za taj fenomen, bile su rješene nakon što fenomen, bile su rješene nakon što su geni koji ih kodiraju bili klonirani i su geni koji ih kodiraju bili klonirani i karakterizirani. karakterizirani.


• Bitnu ulogu u tom procesu formiranja Bitnu ulogu u tom procesu formiranja kompletnih aktivnih Ig-gena imaju kompletnih aktivnih Ig-gena imaju enzimatski kompleksi DNA enzimatski kompleksi DNA rekombinaze, koje imaju svojstvo da rekombinaze, koje imaju svojstvo da prepoznaju, isje–caju i prespajaju prepoznaju, isje–caju i prespajaju specifične DNA sekvence.specifične DNA sekvence.


• Funkcionalni Ig-geni ne egzistiraju kao oni Funkcionalni Ig-geni ne egzistiraju kao oni u "germ-line" DNA, nego se somatski u "germ-line" DNA, nego se somatski kreiraju tokom sazrijevanja prekursorskih kreiraju tokom sazrijevanja prekursorskih B-limfocita u zrele ćelije. B-limfocita u zrele ćelije.

• Tokom toga procesa, Ig-geni se fizički Tokom toga procesa, Ig-geni se fizički reorganiziraju putem trans–lokacija i reorganiziraju putem trans–lokacija i finalnog povezivanja genskih segmenata u finalnog povezivanja genskih segmenata u kompletne kodirajuće sekvence za H i L kompletne kodirajuće sekvence za H i L polipeptidske lance. polipeptidske lance.


• Ovi enzimi prepoznaju sasvim Ovi enzimi prepoznaju sasvim određene nukleotidne sekvence, koje određene nukleotidne sekvence, koje se nalaze blizu Ig-gena. se nalaze blizu Ig-gena.

• Ig-genski elementi se dakle, somatski Ig-genski elementi se dakle, somatski rearanžiraju na mnoštvo različitih rearanžiraju na mnoštvo različitih kombinacija, tako da se radi u stvari kombinacija, tako da se radi u stvari o kodirajućim Ig-genskim o kodirajućim Ig-genskim sekvencama visoko varijabilnog nivoasekvencama visoko varijabilnog nivoa


• Strukturalni diverzitet imunoglobulinskih Strukturalni diverzitet imunoglobulinskih makromolekula je uglavnom determinisan makromolekula je uglavnom determinisan različitim procesima modifikacije specifičnih različitim procesima modifikacije specifičnih DNA sekvenci u i oko kodirajućih regiona DNA sekvenci u i oko kodirajućih regiona gena koji kodiraju kompletne molekule gena koji kodiraju kompletne molekule antitijela. antitijela.

• Radi se o Radi se o konsensus heptamer i konsensus heptamer i nonamer sekvencama nonamer sekvencama koje se nalaze koje se nalaze proksimalno i distalno u odnosu na proksimalno i distalno u odnosu na kodirajući region Ig-gena. kodirajući region Ig-gena.


• Ove sekvence odvojene su sa po Ove sekvence odvojene su sa po 23 i 12 23 i 12 bp spacer sekvencibp spacer sekvenci. .

• Označene su kao Označene su kao rekombinacijske rekombinacijske signalne sekvence (RSS).signalne sekvence (RSS).

• 12 bp znači jedan zavoj DNA heliksa, a 23 12 bp znači jedan zavoj DNA heliksa, a 23 bp dva puna zavoja . bp dva puna zavoja .

• Zbog toga su RSS označene kao Zbog toga su RSS označene kao "one-"one-turn" (imaju 12bp spacer sekvencu) i turn" (imaju 12bp spacer sekvencu) i "two-turn" (sa 23 bp spacer "two-turn" (sa 23 bp spacer sekvencom).sekvencom).


• U "germ–line" DNA konfiguraciji, exoni koji U "germ–line" DNA konfiguraciji, exoni koji kodiraju određene elemente antitijela su kodiraju određene elemente antitijela su uniformno pozicionirani blizu one-turn i uniformno pozicionirani blizu one-turn i two-turn RSS. two-turn RSS.

• Tokom procesa rearanžiranja DNA genski Tokom procesa rearanžiranja DNA genski segmenti koji su u susjedstvu one-turn segmenti koji su u susjedstvu one-turn RSS se uvijek spajaju sa genskim RSS se uvijek spajaju sa genskim segmentima koji se nalaze blizu two-turn segmentima koji se nalaze blizu two-turn RSS. RSS.



• Drugim riječima za gensko Drugim riječima za gensko rearanžiranje karakteristično je rearanžiranje karakteristično je 12/23 povezivanje12/23 povezivanje..

• Svaki H i L varijabilni exon ima 3' Svaki H i L varijabilni exon ima 3' vezanu RSS. Svaki H, L i J (joining) vezanu RSS. Svaki H, L i J (joining) exon ima 5' vezanu RSS. Svaki H, D exon ima 5' vezanu RSS. Svaki H, D (diversity) exon ima obje RSS (diversity) exon ima obje RSS sekvence vezane za 5' i 3' krajevesekvence vezane za 5' i 3' krajeve


• U procesu genskog rearanžiranja, U procesu genskog rearanžiranja, spajaju se samo exoni koji su vezani spajaju se samo exoni koji su vezani za RSS i to sistemom 12/23 za RSS i to sistemom 12/23 (one-turn/two-turn) prekopčavanja. Na (one-turn/two-turn) prekopčavanja. Na primjer, exoni vezani za 3' –one-turn primjer, exoni vezani za 3' –one-turn RSS, rekombinuju se samo sa exonima RSS, rekombinuju se samo sa exonima vezanim za 5'-one-turn RSS i obrnuto.vezanim za 5'-one-turn RSS i obrnuto.


• U početnoj fazi toga složenog U početnoj fazi toga složenog procesa, kompleksni en–zimi procesa, kompleksni en–zimi rekombinaze prave prekid u DNA i to rekombinaze prave prekid u DNA i to na mjestu exon/RSS, isjecaju na mjestu exon/RSS, isjecaju intervenirajuće ili intronske sek–intervenirajuće ili intronske sek–vence između dva exona, čiji se vence između dva exona, čiji se krajevi nakon toga spajaju čineći tzv. krajevi nakon toga spajaju čineći tzv. "coding joint" sekvencu."coding joint" sekvencu.


• Zahvaljujući izvjesnom stupnju Zahvaljujući izvjesnom stupnju fleksibilnosti u povezivanju exona, fleksibilnosti u povezivanju exona, manipulacijom dva identična exona, može manipulacijom dva identična exona, može se dobiti na kraju više coding-joint se dobiti na kraju više coding-joint sekvenci. sekvenci.

• Dakle, stvaraju se multiple kodirajuće Dakle, stvaraju se multiple kodirajuće sekvence na VL-JL, Vh-Dh i Dh-Jh sekvence na VL-JL, Vh-Dh i Dh-Jh exon/exon spojnim mjestima.exon/exon spojnim mjestima.


• Proces njihovog rekombinovanja sa Proces njihovog rekombinovanja sa konstantnim genima omogućena je konstantnim genima omogućena je time što C geni imaju S-sekvence za time što C geni imaju S-sekvence za prekopčavanje, izuzev Cδ. Stvaranje prekopčavanje, izuzev Cδ. Stvaranje V-D-J genskih odsječaka omogućava V-D-J genskih odsječaka omogućava ekspresiju Cμ i Cδ gena i sintezu ekspresiju Cμ i Cδ gena i sintezu specifičnih teških imunoglobulinskih specifičnih teških imunoglobulinskih lanaca μ i δ. lanaca μ i δ.


• Nakon toga slijedi preuređivanje L Nakon toga slijedi preuređivanje L gena (κ i λ) te sinteza lakih lanaca gena (κ i λ) te sinteza lakih lanaca koji se kombinuju sa već postojećim koji se kombinuju sa već postojećim teškim lancima stvarajući IgM i IgD teškim lancima stvarajući IgM i IgD molekule. molekule.

• Karakteristično je da se radi o Karakteristično je da se radi o istovremenoj ekspresiji varijabilnih i istovremenoj ekspresiji varijabilnih i konstantnih imunoglobulinskih gena. konstantnih imunoglobulinskih gena.


• Sada već funkcionalni Vh gen može Sada već funkcionalni Vh gen može se rekombinovati preko S-sekvenci se rekombinovati preko S-sekvenci sa ostalim Ch genima koji je imaju, a sa ostalim Ch genima koji je imaju, a to su γ, ε i α čime je omogućeno to su γ, ε i α čime je omogućeno dizajniranje IgG, IgE i IgA molekula.dizajniranje IgG, IgE i IgA molekula.


• Množenjem broja V, D i J genskih Množenjem broja V, D i J genskih odsječaka ili elemenata dobijen je iznos od odsječaka ili elemenata dobijen je iznos od oko 6x10³ što označava broj mogućih oko 6x10³ što označava broj mogućih kombinacija za Vh gene a slična je si–kombinacija za Vh gene a slična je si–tuacija i sa VL genima.tuacija i sa VL genima.

• Ukupan broj kombinacija se uvećava s Ukupan broj kombinacija se uvećava s obzirom na činjenicu da vezno mjesto za obzirom na činjenicu da vezno mjesto za antigen tvore uparivanjem laki i teški antigen tvore uparivanjem laki i teški imunoglobu–linski lanci.imunoglobu–linski lanci.



• To direktno određuje afinitet To direktno određuje afinitet sintetisanih antitijela. sintetisanih antitijela.

• Izgleda da B-limfociti imaju Izgleda da B-limfociti imaju mehanizam koji omogućava reali–mehanizam koji omogućava reali–zaciju hipermutacija, odnosno zaciju hipermutacija, odnosno naknadno rearanžiranje već naknadno rearanžiranje već preuređenih V gena.preuređenih V gena.


• Ovakve mutacije specifične su za Ovakve mutacije specifične su za genska područja odgovorna za genska područja odgovorna za kodiranje regi–ona imunoglobulina kodiranje regi–ona imunoglobulina specificiranih za vezivanje sa specificiranih za vezivanje sa antigenom, a vrlo rijetko izvan toga antigenom, a vrlo rijetko izvan toga regiona .regiona .


• Osim ovoga procesa genske Osim ovoga procesa genske rekobinacije, na stu–panj diverziteta rekobinacije, na stu–panj diverziteta imunoglobulinskih makromolekula imunoglobulinskih makromolekula imaju uticaj i somatske mutacije koje imaju uticaj i somatske mutacije koje se dešavaju u specifičnim genskim se dešavaju u specifičnim genskim lokusima DNA B-limfocita, a nakon lokusima DNA B-limfocita, a nakon stimulacije nekim antigenom. stimulacije nekim antigenom.

GENI ZA RECEPTORE T-LIMFOCITAGENI ZA RECEPTORE T-LIMFOCITA

• Receptori T-limfocita se također Receptori T-limfocita se također sastoje od konstantnog i varijabilnog sastoje od konstantnog i varijabilnog područja a postoje dvije receptorske područja a postoje dvije receptorske kombinacije:kombinacije:

• α-β heterodimer i α-β heterodimer i

• γ-δ hetero–dimerγ-δ hetero–dimer..

GENI ZA RECEPTORE T-GENI ZA RECEPTORE T-LIMFOCITALIMFOCITA

• Geni koji kodiraju α, β, γ i δ proteine recep–tora Geni koji kodiraju α, β, γ i δ proteine recep–tora humanih T-limfocita smješteni su na sljedećim humanih T-limfocita smješteni su na sljedećim hromosomoma:hromosomoma:

• α (alfa) gen → 14. hromosom → pozicija q11α (alfa) gen → 14. hromosom → pozicija q11

• δ (lambda) gen → 14. hromosom → pozicija q11δ (lambda) gen → 14. hromosom → pozicija q11

• β (beta) gen → 7. hromosom → pozicija q35β (beta) gen → 7. hromosom → pozicija q35

• γ (gama) gen → 7. hromosom → pozicija p15γ (gama) gen → 7. hromosom → pozicija p15


• Za preuređivanje gena za T-Za preuređivanje gena za T-limfocitne receptore odgovoran je isti limfocitne receptore odgovoran je isti sistem genetskog rearanžiranja bazi–sistem genetskog rearanžiranja bazi–ran na DNA rekombinazama kao što ran na DNA rekombinazama kao što je za imunoglo–bulinske gene.je za imunoglo–bulinske gene.

• Heptamerne i nonamerne RSS sek–Heptamerne i nonamerne RSS sek–vence su identične a važi pravilo vence su identične a važi pravilo 12/23 vezivanja.12/23 vezivanja.


• Poremećaji koji nastaju zbog greške u Poremećaji koji nastaju zbog greške u procesu normalnog preuređivanja varijabilnih procesu normalnog preuređivanja varijabilnih imunoglobulin–skih gena, mogu biti uzrokom imunoglobulin–skih gena, mogu biti uzrokom nekih teških oboljenja. nekih teških oboljenja.

• Te genetičke aberacije mogu se desiti i u B i u Te genetičke aberacije mogu se desiti i u B i u T lim–focitima. Radi se u stvari o T lim–focitima. Radi se u stvari o translokacijama kada dolazi do stvaranja translokacijama kada dolazi do stvaranja nenormalnih himernih gena čijom nenormalnih himernih gena čijom ekspresijom nastaju neuobičajeni fuzionisani ekspresijom nastaju neuobičajeni fuzionisani genski transkripti.genski transkripti.

•


• Najčešće na mjestu gdje se genski odsječ–Najčešće na mjestu gdje se genski odsječ–ci V-D-J trebaju pravilno rearanžirati dođe ci V-D-J trebaju pravilno rearanžirati dođe do vezi–vanja nekog drugog segmenta do vezi–vanja nekog drugog segmenta hromosoma.hromosoma.

• To se obično dešava na mjestima koja su To se obično dešava na mjestima koja su vrlo blizu moćnog promotora ili pojačivača vrlo blizu moćnog promotora ili pojačivača transkripcije (enhancera). Takvi transkripcije (enhancera). Takvi translocirani ili premješteni geni nazivaju translocirani ili premješteni geni nazivaju se funkcionalni onkogeni. se funkcionalni onkogeni.


• Za npr. Burkitov limfom Za npr. Burkitov limfom karakteristični su c-myc onkogeni, za karakteristični su c-myc onkogeni, za folikularni limfom Bcl-2 onkogeni, a folikularni limfom Bcl-2 onkogeni, a za akutne T-limfoblastne leukemije za akutne T-limfoblastne leukemije rhombotin geni. rhombotin geni.


• Dakle, postoje hromozomalni Dakle, postoje hromozomalni poremećaji specifični za tumore B-poremećaji specifični za tumore B-limfocita (Burkitov limfom, folikularni limfocita (Burkitov limfom, folikularni limfom) i tumore T-limfocita limfom) i tumore T-limfocita (Leukemija T-limfocita). (Leukemija T-limfocita).


• U osnovi akutne limfoblastične U osnovi akutne limfoblastične leukemije je poremećaj gena koji leukemije je poremećaj gena koji kodiraju receptore T-ćelija.kodiraju receptore T-ćelija.

• Molekularno-biološkim istraživanjima Molekularno-biološkim istraživanjima došlo se do novih spoznaja o došlo se do novih spoznaja o molekularnoj molekularnoj osnovi limfoidnih osnovi limfoidnih tumora tako da danas postoji više tumora tako da danas postoji više tipova.tipova.


Tipovi limfoidnih tumora su:Tipovi limfoidnih tumora su:

• Burkit tip – t(8;14), t(8;22)Burkit tip – t(8;14), t(8;22)

• Hiperdiploidija tip – više od 46 Hiperdiploidija tip – više od 46 hromosomahromosoma

• TEL/AML1 tip – t(12;21)TEL/AML1 tip – t(12;21)

• E2A/PBX1 tip – t(1;19)E2A/PBX1 tip – t(1;19)


• MLL/AF4 tip – t(4;11)MLL/AF4 tip – t(4;11)

• BCR/ABL tip – t(9;22 )BCR/ABL tip – t(9;22 )

• Hipodiploidija tip – manje od 46 Hipodiploidija tip – manje od 46 hromosomahromosoma

• ALL-T ćelija – t(14q11)ALL-T ćelija – t(14q11)


• Kao što se može vidjeti nekim Kao što se može vidjeti nekim translokacijama nastaju specifični translokacijama nastaju specifični fuzionisani himerni geni pa su po toj fuzionisani himerni geni pa su po toj osnovi i takvi tipovi tumora i označeni. osnovi i takvi tipovi tumora i označeni.

• Danas je hematolozima od izuzetnog Danas je hematolozima od izuzetnog značaja u terapeutskom i prognostičkom značaja u terapeutskom i prognostičkom smislu važno da što prije saznaju o kojim smislu važno da što prije saznaju o kojim se fuzijama gena radi.se fuzijama gena radi.


• To je omogućeno upo–trebom To je omogućeno upo–trebom fluorescentne IN SITU hibridizacijske fluorescentne IN SITU hibridizacijske tehnike (FISH) i PCR metoda tehnike (FISH) i PCR metoda (Polymerase chain reaction ili (Polymerase chain reaction ili lančana reakcija polimeraze).lančana reakcija polimeraze).


• Metodologija podrazumjeva Metodologija podrazumjeva ekstrakciju RNA uzo–raka krvi, ekstrakciju RNA uzo–raka krvi, sintezu cDNA reverznom sintezu cDNA reverznom transkripcijom, PCR amplifikaciju ili transkripcijom, PCR amplifikaciju ili kopiranje velikog broja spe–cifičnih kopiranje velikog broja spe–cifičnih nukleotidnih sekvenci, te detekciju nukleotidnih sekvenci, te detekciju PCR pro–dukata agaroznom gel PCR pro–dukata agaroznom gel elektroforezom.elektroforezom.


• Metod koji ima najveći nivo Metod koji ima najveći nivo senzitivnosti i specifičnosti je senzitivnosti i specifičnosti je svakako svakako PCRPCR. .

• Njegova senzitivnost u analizi break-Njegova senzitivnost u analizi break-point fuzijskih regiona je 10¯³ ili point fuzijskih regiona je 10¯³ ili jedna leukemična ćelija među 10³ jedna leukemična ćelija među 10³ normalnih ćelija.normalnih ćelija.


• Upotrebom Multiplex-RT-PCR metoda Upotrebom Multiplex-RT-PCR metoda u čijoj osnovi je upotreba specifično u čijoj osnovi je upotreba specifično dizajniranih primera, moguće je dizajniranih primera, moguće je pretraživati preko 28 translokacija ili pretraživati preko 28 translokacija ili preko 80 break-point mjesta ili preko 80 break-point mjesta ili različitih mRNA splice varijanti.različitih mRNA splice varijanti.


• Već 1984. godine molekularni biolozi Već 1984. godine molekularni biolozi uspjeli su dizajnirati rekombinantna uspjeli su dizajnirati rekombinantna antitijela. Uspjeli su da kon–stantne antitijela. Uspjeli su da kon–stantne gene za teške lance gene za teške lance imunoglobulinskih mole–kula miša, imunoglobulinskih mole–kula miša, zamjene sa kodirajućim regionom za zamjene sa kodirajućim regionom za Naze Staphyloccocus aureus.Naze Staphyloccocus aureus.


• Hibridni antitijelo-nukleaza gen bio je Hibridni antitijelo-nukleaza gen bio je inserciran u odgovarajuće ekspresione inserciran u odgovarajuće ekspresione vektore. vektore.

• Nova rekombinantna antitijela imala su Nova rekombinantna antitijela imala su enzi–matsku aktivnost jer su bila sposobna enzi–matsku aktivnost jer su bila sposobna da izvrše digestiju DNA molekula. da izvrše digestiju DNA molekula.

• Danas se vrše intenzivna istraživanja Danas se vrše intenzivna istraživanja upotrebe rekombinantnih antitijela u svrhu upotrebe rekombinantnih antitijela u svrhu antikancer terapije.antikancer terapije.

AKTUELNA PROBLEMATIKA AKTUELNA PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA U OBLASTI ISTRAŽIVANJA U OBLASTI MOLEKULARNE IMUNOGENETIKEMOLEKULARNE IMUNOGENETIKE

• Aktuelna istraživanja u oblasti molekularne Aktuelna istraživanja u oblasti molekularne imu–nogenetike u svijetu, fokusirana su imu–nogenetike u svijetu, fokusirana su pretežno na istraživanja kontrole razvoja B-pretežno na istraživanja kontrole razvoja B-limfocitnih ćelija od–govornih za sintezu limfocitnih ćelija od–govornih za sintezu imunoglobulinskih makromo–lekula, regulaciju i imunoglobulinskih makromo–lekula, regulaciju i kontrolu ekspresije imunoglo–bulinskih gena, kontrolu ekspresije imunoglo–bulinskih gena, DNA metilaciju i embriogenezu, rearanžiranje DNA metilaciju i embriogenezu, rearanžiranje Ig-gena i somatske hipermutacije imu–Ig-gena i somatske hipermutacije imu–noglobulinskih gena.noglobulinskih gena.


• Sve ovo je omogućeno upo–trebom Sve ovo je omogućeno upo–trebom odgovarajućih metoda kao što su gen-odgovarajućih metoda kao što su gen-transfer tehnologija i transfekcija. transfer tehnologija i transfekcija. Studije regulacije rearan–žiranja Studije regulacije rearan–žiranja imunoglobulinskih gena imunoglobulinskih gena podrazumjevaju ispi–tivanje uloge podrazumjevaju ispi–tivanje uloge individualnih genetičkih elemenata u individualnih genetičkih elemenata u diferencijaciji B-limfocita i njihovom diferencijaciji B-limfocita i njihovom sazrijevanju. sazrijevanju.


• Izuzimajući ćelije imunog sistema, u svim Izuzimajući ćelije imunog sistema, u svim ostalim ćelijama organizma čovjeka Ig geni ostalim ćelijama organizma čovjeka Ig geni su u inaktivnom stanju, dakle, nisu su u inaktivnom stanju, dakle, nisu funkcionalni. funkcionalni.

• Kada prekursorski B-limfociti dostignu Kada prekursorski B-limfociti dostignu stupanj funkcionalnosti u smislu produkcije stupanj funkcionalnosti u smislu produkcije antitijela, u njima se aktivira vlastiti enzi–antitijela, u njima se aktivira vlastiti enzi–matski sistem za rearanžiranje matski sistem za rearanžiranje imunoglobulinskih gena. imunoglobulinskih gena.

AKTUELNA PROBLEMATIKA AKTUELNA PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA U OBLASTI ISTRAŽIVANJA U OBLASTI MOLEKULARNE IMUNOGENETIKEMOLEKULARNE IMUNOGENETIKE• Uglavnom, svako rearanžiranje dovodi do Uglavnom, svako rearanžiranje dovodi do

stva–ranja seta funkcionalnih Ig gena u stva–ranja seta funkcionalnih Ig gena u određenom B-limfocitu.određenom B-limfocitu.

• Molekularna imunogenetika istražuje tako–đer, Molekularna imunogenetika istražuje tako–đer, mehanizme somatskih hipermutacija kojim se mehanizme somatskih hipermutacija kojim se povećava afinitet Ig- molekula za određeni povećava afinitet Ig- molekula za određeni antigen.antigen.

• Somatski hipermutacijski procesi Somatski hipermutacijski procesi omogućavaju leukemičnim ćelijama da omogućavaju leukemičnim ćelijama da izbjegnu terapijske efekte usmjerene na izbjegnu terapijske efekte usmjerene na njihove Ig- molekule. njihove Ig- molekule.


• Neobično je značajno ući u suštinu Neobično je značajno ući u suštinu kontrolnih mehanizama odgovornih kontrolnih mehanizama odgovornih za rearanžiranje Ig-gena. za rearanžiranje Ig-gena.

• Interesantno je da B-limfociti mogu Interesantno je da B-limfociti mogu osjetiti u svom procesu sazrijevanja osjetiti u svom procesu sazrijevanja da li je neophodno izvršiti dodatno da li je neophodno izvršiti dodatno rearanžiranje Ig gena. rearanžiranje Ig gena.


• Intenzivno se istražuje struktura i Intenzivno se istražuje struktura i funkcija poja–čivača procesa funkcija poja–čivača procesa transkripcije imunoglobulinskih gena transkripcije imunoglobulinskih gena ili enhancera, te uloga metilacije DNA ili enhancera, te uloga metilacije DNA molekula u rearanžiranju i ekspresiji molekula u rearanžiranju i ekspresiji Ig-gena. Ig-gena.


• Potencijali trans–genetike i embrionske Potencijali trans–genetike i embrionske tehnologije omogućavaju izučavanje svih tehnologije omogućavaju izučavanje svih ovih vrlo važnih molekularnih aspekata ovih vrlo važnih molekularnih aspekata imunoglobulinskih gena kod transgenskih imunoglobulinskih gena kod transgenskih životinja, uključujući i imunoglobulinske životinja, uključujući i imunoglobulinske specifične rekombinaze, njihovu funkciju i specifične rekombinaze, njihovu funkciju i osjetljivost Ig–gena na njihovu aktivnost .osjetljivost Ig–gena na njihovu aktivnost .

ZAKLJUČAKZAKLJUČAK

• Mogućnost identificiranja i analiziranja Ig-Mogućnost identificiranja i analiziranja Ig-varijabilnih genskih regiona, može varijabilnih genskih regiona, može obezbjediti informacije relevantne za bolje obezbjediti informacije relevantne za bolje razumjevanje tumora B-limfocita. razumjevanje tumora B-limfocita.

• Rekombinacija tri genetičke komponente Rekombinacija tri genetičke komponente koje određuju konformaciju teškog koje određuju konformaciju teškog imunoglobulinskog lanca, te stvaranje Vh-imunoglobulinskog lanca, te stvaranje Vh-Dh-Jh transkripcijske jedinice je za–ista Dh-Jh transkripcijske jedinice je za–ista jedinstvena osobina B-limfocita. jedinstvena osobina B-limfocita.


• Varijabilnost imu–noglobulinskih Varijabilnost imu–noglobulinskih genskih sekvenci također omogu–genskih sekvenci također omogu–ćavaju VL-JL rekombinacija, somatske ćavaju VL-JL rekombinacija, somatske mutacije, te izotipsko prekopčavanje. mutacije, te izotipsko prekopčavanje.

• Bilo kakva greška u ovim procesima Bilo kakva greška u ovim procesima može da inicira nastanak tumorskih može da inicira nastanak tumorskih B-limfocita te dovode do bolesti kao B-limfocita te dovode do bolesti kao što su limfomi ili pak leukemija. što su limfomi ili pak leukemija.


• Molekularno-biološkim metodama Molekularno-biološkim metodama moguće je danas, u savremenoj moguće je danas, u savremenoj medicini, analizirati navedene medicini, analizirati navedene genske sekvence, pratiti efikasnost genske sekvence, pratiti efikasnost terapij–skog procesa te prognostičku terapij–skog procesa te prognostičku procjenu.procjenu.


Danas se ko–riste sljedeće metode:Danas se ko–riste sljedeće metode:

• ekstrakcija RNA ili DNAekstrakcija RNA ili DNA

• sinteza cDNAsinteza cDNA

• PCR amplifikacija Vh genaPCR amplifikacija Vh gena

• PCR amplifikacija C genaPCR amplifikacija C gena

• KloniranjeKloniranje

• Sekvenciranje PCR produkataSekvenciranje PCR produkata


• PCR amplifikacija Vh gena koristi se PCR amplifikacija Vh gena koristi se za analizu tumorskih Vh gena. za analizu tumorskih Vh gena.

• Kao target amplifikacijske sekvence Kao target amplifikacijske sekvence koriste se cDNA ili gDNA (genomska koriste se cDNA ili gDNA (genomska DNA) te specifični Vh leader i DNA) te specifični Vh leader i konsenzus Jh primeri, a izvode se konsenzus Jh primeri, a izvode se dvije separatne PCR amplifikacije.dvije separatne PCR amplifikacije.


• Amplifikacija C genskih sekvenci se Amplifikacija C genskih sekvenci se koristi u cilju detekcije tumor-derived koristi u cilju detekcije tumor-derived izotipskih varijanti a koristi se cDNA izotipskih varijanti a koristi se cDNA kao ishodna za specifičnu amplifikaciju.kao ishodna za specifičnu amplifikaciju.

• Amplificirani produkti se mogu Amplificirani produkti se mogu purificirati te klo–nirati u p-GEM-T purificirati te klo–nirati u p-GEM-T vektore te izvršiti transfekcija u JM109 vektore te izvršiti transfekcija u JM109 bakterijske sojeve.bakterijske sojeve.


• Sekvenciranje Vh i C Sekvenciranje Vh i C imunoglobulinskih specifi–čnih imunoglobulinskih specifi–čnih nukleotidnih genskih sekvenci nukleotidnih genskih sekvenci moguće je izvršiti upotrebom dideoxy moguće je izvršiti upotrebom dideoxy chain terminacijskog metoda te chain terminacijskog metoda te korištenjem M13-20 reverznih korištenjem M13-20 reverznih primera.primera.


• Molekularne analize fuzionisanih Molekularne analize fuzionisanih genskih trans–kripata koji nastaju genskih trans–kripata koji nastaju nakon specifičnih translokacija nakon specifičnih translokacija odnosno hromosomskih aberacija, odnosno hromosomskih aberacija, upotrebom multi–plex-RT-PCR upotrebom multi–plex-RT-PCR metoda, koriste se u cilju praćenja metoda, koriste se u cilju praćenja minimuma rezidualne bolesti kod minimuma rezidualne bolesti kod nekih oboljenja kao što je leukemija. nekih oboljenja kao što je leukemija.


• Nakon svega predhodno navedenog, Nakon svega predhodno navedenog, može se sa sigurnošću zaključiti da je može se sa sigurnošću zaključiti da je molekularna biologija postala izuzetno molekularna biologija postala izuzetno važan segment u imunogenetici te da se važan segment u imunogenetici te da se danas savremena medicina, uopće, ne danas savremena medicina, uopće, ne može zamisliti bez molekularne biologije može zamisliti bez molekularne biologije koja je prodrla duboko u proces koja je prodrla duboko u proces analiziranja humanih bolesti na nivou analiziranja humanih bolesti na nivou informacijskih makromolekula DNA i informacijskih makromolekula DNA i RNA.RNA.

Documents

MOLEKULARNA IMUNOGENETIKA