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PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domnguez Ortiz 1. Polgono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712

http://www.vircell.com

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G/M1015: Prueba inmunoenzimtica indirecta para determinar anticuerpos IgG y/o IgM frente a Mycoplasma pneumoniae en suero humano. 96 tests.

INTRODUCCIN:

M. pneumoniae produce neumona atpica primaria con mayor frecuencia en nios y adolescentes. El aislamiento en cultivo de M. pneumoniae es complejo, por lo que el diagnstico se suele realizar por mtodos serolgicos. Puede detectarse IgM a M. pneumoniae una semana despus de la aparicin de los sntomas e IgG a partir de la segunda semana. Sin embargo no en todos los pacientes (especialmente en caso de reinfecciones) aparece IgM. Un 56% de los enfermos mayores de 40 aos presentan slo respuesta de IgG en el curso de la enfermedad, mientras que los nios dan generalmente respuesta de IgM. Los anticuerpos IgM son un buen marcador de enfermedad aguda porque persisten slo durante 3-4 meses, sin embargo los anticuerpos IgG se mantienen durante aos tras la infeccin. El mtodo serolgico ms clsico ha sido la reaccin de fijacin de complemento (RFC), aunque actualmente se utilizan sobre todo ELISA e IFI.

FUNDAMENTO DEL MTODO:

Mtodo de ELISA basado en la reaccin de los anticuerpos de la muestra con el antgeno unido a la superficie de poliestireno. Las inmunoglobulinas no unidas por reaccin con el antgeno son eliminadas en el proceso de lavado. En un paso posterior la globulina anti-humana reacciona con el complejo antgeno-anticuerpo, y la que no se une es eliminada por los lavados; la unida reacciona con el sustrato (TMB), para dar una reaccin coloreada azul, que cambia a amarillo tras la adicin de la solucin de parada.

CARACTERSTICAS:

Todos los reactivos a excepcin de la solucin de lavado vienen listos para su uso. Las soluciones de dilucin de muestras y de conjugado estn coloreadas como ayuda a la realizacin de la tcnica. No se precisa dilucin previa de la muestra. Los pocillos son individuales, por lo que slo se consumen tantos pocillos como pruebas se van a realizar.

CONTENIDO DEL KIT:

1 VIRCELL MYCOPLASMA PNEUMONIAE PLATE: 1 placa con 96 pocillos recubiertos con antgenos solubles en detergentes (conteniendo protena P1) de M. pneumoniae, cepa FH (ATCC 15531). 2 VIRCELL SERUM DILUENT: 25 ml de diluyente para sueros: tampn fosfatos con estabilizante de protenas, con Proclin y coloreado de azul. Listo para su uso.

3G VIRCELL IgG POSITIVE CONTROL: 500 l de suero control positivo para IgG con Proclin. 3M VIRCELL IgM POSITIVE CONTROL: 500 l de suero control positivo para IgM con Proclin. 4G VIRCELL IgG CUT OFF CONTROL: 500 l de suero cut off para IgG con Proclin. 4M VIRCELL IgM CUT OFF CONTROL: 500 l de suero cut off para IgM con Proclin. 5G VIRCELL IgG NEGATIVE CONTROL: 500 l de suero control negativo para IgG con Proclin. 5M VIRCELL IgM NEGATIVE CONTROL: 500 l de suero control negativo para IgM con Proclin. 6G VIRCELL IgG CONJUGATE: 15 ml de una dilucin de globulina anti-IgG humana conjugada con peroxidasa, con Proclin y coloreada de naranja. Lista para su uso. 6M VIRCELL IgM CONJUGATE: 15 ml de una dilucin de globulina anti-IgM humana conjugada con peroxidasa, con Proclin y coloreada de naranja. Lista para su uso. 7 VIRCELL TMB SUBSTRATE SOLUTION: 15 ml de solucin de sustrato: tetrametilbenzidina (TMB). Listo para su uso. 8 VIRCELL STOP REAGENT: 15 ml de solucin de parada: cido sulfrico 0,5 M. 9 VIRCELL WASH BUFFER: 50 ml de solucin de lavado (concentrado 20x): tampn fosfatos con TweenR-20 y con Proclin.

Conservar entre 2 y 8C y comprobar la fecha de caducidad.

Material necesario no contenido en el kit: Pipeta de precisin para dispensar 5 y 100 l. Pipeta multicanal de precisin para dispensar 100 l. Lavador de placas de ELISA. Incubador/bao termostatizado. Espectrofotmetro de placas de ELISA con filtro de 450 nm y filtro de referencia de 620 nm. Agua destilada. Alternativamente procesador automtico de ELISA. Para las pruebas de IgM, sorbente de IgG humana (ref. Vircell S001).

CONSERVACIN:

Conservar entre 2 y 8C. No utilizar los componentes del kit despus de la fecha de caducidad. La caducidad indicada ser vlida siempre que los componentes se mantengan cerrados y conservados entre 2 y 8C.

CONSERVACIN Y ESTABILIDAD DE LOS COMPONENTES UNA VEZ ABIERTOS:

COMPONENTE ESTABILIDAD Solucin de lavado diluida (1x) 4 meses a 2-8C Resto de componentes Fecha indicada en envase a 2-8C

ESTABILIDAD Y USO DE LOS REACTIVOS:

Usar todos los reactivos en condiciones aspticas para evitar contaminaciones microbianas. No permitir el secado de la placa entre los lavados y la adicin de los reactivos. La solucin de sustrato es fotosensible. Evitar la exposicin directa a la luz y desechar si presenta coloracin azul. La solucin de sustrato no debe entrar en contacto con oxidantes como soluciones de hipoclorito ni con algunos metales. Evitar el contacto con partes metlicas o componentes metlicos de equipos o instrumentos sin antes haber comprobado su compatibilidad. Utilizar slo la cantidad de solucin de lavado, sustrato, diluyente de sueros y conjugado necesarias para la realizacin de la prueba. No devolver a los viales el exceso sobrante.

MYCOPLASMA PNEUMONIAE ELISA IgG/IgM

Sustrato incoloro

Producto coloreado

Globulina anti- IgG/IgM humana

IgG/IgM humana anti-M. pneumoniae

Antgeno de M. pneumoniae

Peroxidasa

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PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domnguez Ortiz 1. Polgono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712

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VIRCELL, S.L. no se responsabiliza de la inadecuada utilizacin de los reactivos contenidos en el kit.

RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES:

1. Este producto es slo para diagnstico in vitro y est destinado al uso por personal sanitario cualificado.

2. Usar slo componentes del kit. No mezclar los componentes de diferentes kits o fabricantes. Slo las soluciones de lavado, sustrato, parada y diluyente de sueros son compatibles con los equivalentes en otras referencias y lotes de ELISA VIRCELL.

3. Utilizar puntas de pipeta diferentes y limpias para cada fase del ensayo. Utilizar slo material limpio y preferentemente desechable.

4. No utilizar en caso de deterioro del envase. 5. No pipetear con la boca. 6. El diluyente para sueros, placa, conjugados y controles de este equipo

contienen material de origen animal. Los controles contienen adems material de origen humano. Aunque los sueros control del equipo son sometidos a controles de ausencia de HBsAg y anticuerpos frente a VIH y Hepatitis C, es necesario manejar los controles y muestras del paciente como potencialmente patgenos. Los pocillos contienen antgeno de M. pneumoniae inactivado, no obstante, deben manejarse con precaucin. Ningn mtodo actual puede asegurar por completo la ausencia de stos u otros agentes infecciosos. Todo el material debe ser manipulado y desechado como potencialmente infeccioso. Observe la regulacin local en materia de residuos clnicos.

7. La solucin de sustrato puede ser irritante para piel y mucosas. En caso de contacto con esta solucin lavar la superficie afectada con agua y solicitar asistencia mdica. Para ms informacin, solicite la hoja de seguridad del producto.

8. Para la utilizacin del producto en sistemas automticos de anlisis se recomienda una evaluacin previa. VIRCELL dispone de juegos de muestras para su ensayo en paralelo con el mtodo manual. Estos juegos pueden ser solicitados con tal finalidad. Asimismo, es posible la consulta de un listado de sistemas automatizados aprobados para su utilizacin con la gama de productos ELISA VIRCELL.

9. Durante los perodos de incubacin, un adecuado sellado de las placas con la lmina adhesiva que se suministra evita la desecacin de la muestra y garantiza la repetitividad de los resultados.

10. Para determinacin de anticuerpos IgM, este producto ha sido diseado para su uso conjunto y exclusivo con SORBENTE de IgG humana VIRCELL (ref. Vircell S001).

TOMA DE MUESTRA:

La sangre debe extraerse en condiciones aspticas mediante tcnicas de venipuntura por personal experimentado. Se recomienda el uso de tcnicas aspticas o estriles para evitar la contaminacin de la muestra. Los sueros deben mantenerse refrigerados entre 2 y 8C si se van a procesar dentro de los 7 das siguientes a la toma, pero si el procesamiento se va a prolongar deben congelarse a -20C, evitando las congelaciones y descongelaciones innecesarias. No utilizar sueros hiperlipmicos, hemolizados o contaminados. Los sueros que presenten partculas pueden ser clarificados por centrifugacin. Pueden utilizarse muestras de suero o plasma indistintamente.

PREPARACIN DE LOS REACTIVOS:

El nico reactivo que es necesario preparar con antelacin a la realizacin de la prueba es la solucin de lavado. Para ello completar hasta 1 litro con agua destilada un vial de 50 ml de solucin de lavado concentrada (20x). Si aparecen cristales durante la conservacin de la solucin concentrada, calentar a 37C antes de diluirlo. Una vez preparada conservar entre 2 y 8C.

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:

1.-Ajustar una estufa/bao de agua a 371C. 2.-Sacar todos los reactivos 1 hora antes de la realizacin del test para que alcancen la temperatura ambiente, evitando sacar la placa del envase. 3.-Agitar todos los componentes. 4.-Sacar el nmero de pocillos 1 necesarios para el nmero de sueros que se van a procesar, ms otros cuatro pocillos, uno para el control positivo,

uno para el control negativo y dos para el suero cut off. Colocar el resto de los pocillos en el sobre y volver a cerrarlo. 5.-Para determinacin de anticuerpos IgG aadir 100 l de diluyente de muestras 2 a todos los pocillos que se vayan a emplear. Aadir 5 l de las muestras, 5 l del control positivo 3G, 5 l del suero cut off 4G (en duplicado) y 5 l del control negativo 5G en los pocillos correspondientes. En el caso de la realizacin manual del mtodo, se agitar la placa en un agitador (2 minutos) para garantizar una mezcla homognea de los reactivos. Si no es posible asegurar esta agitacin, debe hacerse una predilucin de la muestra en tubo o placa aadiendo el doble del volumen de diluyente de muestras 2 y de muestra. Homogenizar con la pipeta y trasvasar seguidamente 105 l de cada muestra ya diluida a los pocillos 1. 6.-Para determinacin de anticuerpos IgM aadir 25 l de sorbente IgG (ref. Vircell S001) a todos los pocillos que se vayan a emplear, excepto a los pocillos donde se dispensen los controles. Aadir 5 l de las muestras y seguidamente 75 l de diluyente de muestras 2 a todos los pocillos empleados. Para la preparacin de los pocillos de los controles, aadir 100 l de diluyente de muestra 2, y seguidamente 5 l del control positivo 3M, 5 l del suero cut off 4M (en duplicado), y 5 l del control negativo 5M en los pocillos correspondientes. En el caso de la realizacin manual del mtodo, se agitar la placa en un agitador (2 minutos) para garantizar una mezcla homognea de los reactivos. Si no es posible asegurar esta agitacin, debe hacerse una predilucin de la muestra en tubo o placa aadiendo el doble del volumen de los reactivos y de muestra. Homogenizar con la pipeta y trasvasar seguidamente 105 l de cada muestra ya diluida a los pocillos 1. 7.-Tapar mediante lmina adhesiva e incubar en estufa/bao durante 45 minutos a 371C. 8.-Retirar la lmina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solucin de lavado 9, asegurndose que no quedan restos de solucin de lavado. 9.-Aadir inmediatamente 100 l de conjugado IgG 6G o IgM 6M a todos los pocillos. 10.-Tapar mediante lmina adhesiva e incubar en estufa/bao durante 30 min. a 371C. 11.-Retirar la lmina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solucin de lavado 9, asegurndose que no quedan restos de solucin de lavado. 12.-Aadir inmediatamente 100 l de solucin de sustrato 7 a todos los pocillos. 13.-Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, en la oscuridad. 14.-Aadir inmediatamente 50 l de solucin de parada 8 a todos los pocillos. 15.-Valorar espectrofotomtricamente a 450/620 nm, antes de 1 hora de acabado el ensayo.

CONTROL DE CALIDAD INTERNO:

Cada lote se somete a control de calidad interno antes de su liberacin asegurando el cumplimiento del protocolo de validacin por el usuario mediante especificaciones ms estrictas. Los resultados de control final de cada lote estn disponibles. La correlacin del material de control se asegura mediante ensayos paralelos frente a paneles de sueros de referencia internamente validados.

PROTOCOLO DE VALIDACIN POR EL USUARIO:

Cada ensayo debe utilizar control positivo, negativo y cut off. Su utilizacin permite la validacin de la prueba y el equipo. Las densidades pticas (D.O.) de los controles deben estar en los rangos siguientes. En caso contrario se desechar la prueba.

CONTROL D.O. CONTROL POSITIVO >0,9 CONTROL NEGATIVO 0,55

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INTERPRETACIN DE RESULTADOS:

Calcular la media de las D.O. del suero cut off. ndice de anticuerpos=(D.O. de la muestra/media de D.O. del suero cut off) x 10

INDICE INTERPRETACIN 11 Positivo

Las muestras con resultados dudosos deben ser vueltas a analizar y/o solicitar una nueva muestra para confirmacin de los resultados. Las muestras con ndices inferiores a 9 se considera que no tienen anticuerpos especficos frente a M. pneumoniae IgG o IgM, segn el procedimiento empleado. Las muestras con ndices superiores a 11 se considerar que tienen anticuerpos especficos frente a M. pneumoniae IgG o IgM, segn el procedimiento empleado.

LIMITACIONES DEL MTODO:

1.-Este mtodo est diseado para ser utilizado con suero humano. 2.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensin del folleto de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para obtener resultados fiables, en particular el correcto pipeteo de muestras y reactivos, lavados y tiempos de incubacin. 3.-Los resultados de las muestras deben ser valorados junto con la sintomatologa clnica y otros procedimientos diagnsticos. El diagnstico definitivo debe realizarse mediante tcnicas de aislamiento. 4.-El test no indica el lugar de la infeccin. No pretende sustituir al aislamiento. 5.-La ausencia de un aumento significativo en el nivel de anticuerpos no excluye la posibilidad de infeccin. 6.-Las muestras recogidas muy pronto en el transcurso de una infeccin pueden no tener niveles detectables de IgG. En esos casos se recomienda realizar un ensayo para determinacin de IgM u obtener una segunda muestra transcurridos entre 14 y 21 das para ser ensayado en paralelo con la muestra original con el fin de determinar una seroconversin. 7.-Los resultados obtenidos en la deteccin de IgG en neonatos deben ser interpretados con precaucin, ya que las IgG maternas son transferidas pasivamente de la madre al feto antes del nacimiento. La determinacin de IgM es mejor indicador de infeccin en nios menores de 6 meses. 8.-Los resultados de determinacin de anticuerpos de una muestra nica no deben ser usados para el diagnstico de una infeccin reciente. Se deben recoger muestras pareadas (aguda y convaleciente) para ser ensayadas paralelamente y determinar seroconversin o un incremento significativo en el nivel de anticuerpos. 9.-Para la determinacin de IgM se debe realizar la tcnica utilizando sorbente de anticuerpos IgG humanos ya que de otro modo se pueden obtener resultados falsos positivos por la presencia de factor reumatoide o resultados falsos negativos por exceso de anticuerpos IgG.

PRESTACIONES

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD:

Determinacin IgG: Se ensayaron 85 muestras de suero con MYCOPLASMA PNEUMONIAE ELISA IgG/IgM frente a un equipo ELISA (EIA MYCOPLASMA IgG) de otra casa comercial (BIOWHITTAKER) para determinacin IgG. Los resultados discrepantes se resolvieron mediante un test de inmunofluorescencia. Determinacin IgM: Test 1: Se ensayaron 70 muestras frente a un kit de aglutinacin de partculas (SERODIA-MYCO II) de otra casa comercial (FUJIREBIO INC.) para determinacin IgM. Test 2: Se ensayaron 73 muestras frente a un kit ELISA (PLATELIA M. PNEUMONIAE IgG) de otra casa comercial (BIO-RAD) para determinacin IgM. Test 3: Se ensayaron 80 muestras de suero con MYCOPLASMA PNEUMONIAE ELISA IgM frente a un kit ELISA (MYCOPLASMA PNEUMONIAE IgM EIA) de otra casa comercial (ANILabsystem) para determinacin IgM. Se obtuvieron los siguientes resultados:

N MUESTRAS SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD IgG 85 98% 97%

IgM (1) 70 97% 97% IgM (2) 73 88% 100% IgM (3) 80 97% 92%

Los valores indeterminados fueron suprimidos de los clculos finales

PRECISIN INTRAENSAYO:

DETECCIN IgG Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente 10 veces cada uno en un nico ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo idnticas, obteniendo los resultados:

SUERO N % C.V. CP 10 2,13 CN 10 10,64 CO 10 5,87

C.V. Coeficiente de variacin

DETECCIN IgM Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente 10 veces cada uno en un nico ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo idnticas, obteniendo los resultados:

SUERO N % C.V. CP 10 5,87 CN 10 9,95 CO 10 5,60

C.V. Coeficiente de variacin

PRECISIN INTERENSAYO:

DETECCIN IgG Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente durante 5 das consecutivos y por 2 operadores diferentes, obteniendo los siguientes resultados:

SUERO N % C.V. CP 10 2,20 CN 10 8,32 CO 10 4,71

C.V. Coeficiente de variacin

DETECCIN IgM Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente durante 5 das consecutivos y por 2 operadores diferentes, obteniendo los siguientes resultados:

SUERO N % C.V. CP 10 4,39 CN 10 10,28 CO 10 6,31

C.V. Coeficiente de variacin

REACCIN CRUZADA E INTERFERENCIAS:

Se ensayaron 6 muestras caracterizadas positivas frente a bacterias del grupo sindrmico (Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae y Coxiella burnetii) para determinacin IgG e IgM. Se realiz un ensayo IgM a 2 muestras positivas frente a factor reumatoide. Las muestras ensayadas dieron resultados negativos, demostrando la reaccin especfica del ensayo sin reaccin cruzada o interferencias ocasionadas por los agentes descritos.

OTROS ESTUDIOS DE INTERFERENCIAS:

Se realiz un ensayo ELISA para determinacin de anticuerpos IgG e IgM a 15 sueros con anticuerpos antinucleares y 25 sueros con factor reumatoide previamente caracterizados frente a 4 kits ELISA diferentes (3 antgenos virales y un antgeno bacteriano). Para determinacin IgM los sueros fueron tratados con sorbente anti-IgG. Se demostr la eficacia del tratamiento con sorbente para evitar interferencias en IgM ocasionadas por factor reumatoide en un 100% y en un 96% para anticuerpos antinucleares. Se ha comprobado la eficacia del sorbente recomendado para evitar la aparicin de falsos negativos por exceso de IgG.

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SMBOLOS UTILIZADOS EN EL PRODUCTO:

Producto para el diagnstico in vitro

Fecha de caducidad

8C

2C Conservar entre 2-8C

Contiene suficiente para pruebas

Lote

Referencia (catlogo)

Consultar instrucciones de uso

pocillos

BIBLIOGRAFA:

1. Aubert, G., B. Pozzetto, O. G. Gaudin, J. Hafid, A. D. Mbida, and A. Ros. 1992. Evaluation of five commercial tests: complement fixation, microparticle agglutination, indirect immunofluorescence, enzyme-linked immunosorbent assay and latex agglutination, in comparison to immunoblotting for Mycoplasma pneumoniae serology. Ann Biol Clin (Paris) 50:593-7. 2. Busolo, F., E. Tonin, and G. A. Meloni. 1983. Enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections. J Clin Microbiol 18:432-5. 3. Clyde, W. A. Jr. 1993. Clinical overview of typical Mycoplasma pneumoniae infections. Clin Infect Dis 17 Suppl 1:S32-6. 4. Dussaix, E., A. Slim, and P. Tournier. 1983. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and complement fixation test for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. J Clin Pathol 36:228-32. 5. Hirschberg, L., A. Krook, C. A. Pettersson, and T. Vikerfors. 1988. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae specific immunoglobulin M. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 7:420-3. 6. Jacobs, E., A. Bennewitz, and W. Bredt. 1986. Reaction pattern of human anti-Mycoplasma pneumoniae antibodies in enzyme-linked immunosorbent assays and immunoblotting. J Clin Microbiol 23:517-22. 7. Lieberman, D., P. Shvartzman, D. Lieberman, M. Ben-Yaakov, Z. Lazarovich, S. Hoffman, R. Mosckovitz, B. Ohana, M. Leinonen, D. Luffy, and I. Boldur. 1998. Etiology of respiratory tract infection in adults in a general practice setting. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 17:685-9. 8. Thacker, W. L. and D. F. Talkington. 2000. Analysis of complement fixation and commercial enzyme immunoassays for detection of antibodies to Mycoplasma pneumoniae in human serum. Clin Diagn Lab Immunol 7:778-80. 9. Uldum, S. A., J. S. Jensen, J. Sondergard-Andersen, and K. Lind. 1992. Enzyme immunoassay for detection of immunoglobulin M (IgM) and IgG antibodies to Mycoplasma pneumoniae. J Clin Microbiol 30:1198-204. 10. Wreghitt, T. G. and M. Sillis. 1985. A micro-capture ELISA for detecting Mycoplasma pneumoniae IgM: comparison with indirect immunofluorescence and indirect ELISA. J Hyg (Lond) 94:217-27.

Para cualquier aclaracin o consulta, contactar con: customerservice@vircell.com

REVISADO: Diciembre-10

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RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DE TRABAJO

5 lavados con solucin de lavado 9

6G 100 l de conjugado 6M

5 lavados con solucin de lavado 9

100 l de sustrato 7

50 l de solucin de parada 8

45 min. a 37C

30 min. a 37C

20 min. a temperatura ambiente en oscuridad

Lectura a 450/620 nm

DILUCIN PARA IgG

100 l de diluyente de muestras 2

5 l de las muestras y controles 3G 4G 5G

DILUCIN PARA IgM MUESTRAS

25 l de sorbente 5 l de las muestras

75 l de diluyente de muestras 2

CONTROLES 100 l de diluyente de muestras

2 5 l de los controles

3M 4M 5M