Tallinna Reaalkool

Neurl1 valgu tuumatranspordi mehhanismide uurimine

Uurimistöö

Jaan Toots

11.A

Juhendajad: Mari Sepp

Kersti Veskimets

Tallinn 2012

Sisukord

Sissejuhatus ................................................................................................................................ 4  

Kasutatud lühendid ..................................................................................................................... 5  

1.   Kirjanduse ülevaade ............................................................................................................ 7  

1.1.   Ubikvitiinligaas Neuralized .......................................................................................... 7  

1.1.1.   Ubikvitiinligaasid .................................................................................................... 7  

1.1.2.   Notch signaalirada .................................................................................................. 9  

1.1.3.   Neuralized’i roll Drosophila melanogaster’is ...................................................... 13  

1.1.4.   Neuralized’i homoloogid imetajates ..................................................................... 14  

1.1.4.1.  Neurl geenide avaldumine ............................................................................... 15  

1.1.4.2.  Neurl1 funktsioonid ........................................................................................ 15  

1.1.4.3.  Neurl1 valgu lokalisatsioon ............................................................................. 16  

1.2.   Valkude transport tuuma ja tsütoplasma vahel ........................................................... 16  

1.2.1.   Tuumapoorid ......................................................................................................... 17  

1.2.2.   Tuumalokalisatsioonisignaalid ............................................................................. 18  

1.2.3.   Valkude eksport tuumast ....................................................................................... 19  

2.   Töö eesmärk ...................................................................................................................... 20  

3.   Materjalid ja metoodika ..................................................................................................... 21  

3.1.   Kasutatud plasmiidid .................................................................................................. 21  

3.2.   Restriktsioon ............................................................................................................... 21  

3.3.   DNA geelelektroforees ja fragmentide puhastamine geelist ...................................... 21  

3.4.   Ligatsioon ................................................................................................................... 22  

3.5.   Transformatsioon ........................................................................................................ 22  

3.6.   Plasmiidse DNA mini- ja midipreparatsioon .............................................................. 22  

3.7.   Rakukultuurid ............................................................................................................. 23  

3.8.   Transfektsioon ............................................................................................................ 24  

3.9.   Immuunotsütokeemia ja mikroskoopia ...................................................................... 24  

4.   Tulemused ......................................................................................................................... 26  

4.1.   Potentsiaalsete NLS-de muteerimine EGFP ja Neurl1 NHR1 domeeni sisaldavas

ühendvalgus .......................................................................................................................... 26  

4.2.   Potentsiaalsete NLS-de muteerimise mõju EGFP ja Neurl1 NHR1 domeeni sisaldava

ühendvalgu lokalisatsioonile HEK293 rakkudes .................................................................. 28  

4.3.   Potentsiaalsete NLS-de muteerimise mõju EGFP ja Neurl1 NHR1 domeeni sisaldava

ühendvalgu lokalisatsioonile primaarsetes neuronites ......................................................... 30  

5.   Arutelu ............................................................................................................................... 33  

Kokkuvõte ................................................................................................................................ 35  

Kasutatud kirjandus .................................................................................................................. 36  

Resümee .................................................................................................................................... 38  

Abstract (Study on Nuclear Transport Mechanisms of Neurl1 Protein) .................................. 39  

Sissejuhatus

Eelmise sajandi lõpupoolel, siis kui inimkond hakkas esmakordselt laiendama oma teadmiste

piire süvitsi elu toimemehhanismide suhtes, tuvastati esimesi geene ka molekulaarsel tasemel.

Juba üle kolme aastakümne tagasi leiti grupp geene, mille väljalülitamise korral kärbses

tekkis organismis embrüonaalse arengu käigus liiga palju närvirakke. Need mutatsioonid

lõppesid surmaga. Üks neist geenidest sai tuntuks kui Neuralized.

Käesolevas uurimistöös antakse ülevaade Neuralized geenist, räägitakse sellest, mis on teada

ja mis on veel vaja välja uurida.

Kirjanduse ülevaate esimeses osas kirjeldatakse geeni Neuralized ja temaga seotud

mehhanisme rakus. Üldised teadmised sellest geenist ei ole kusjuures veel üldsegi

laiaulatuslikud – avaldatud on vaid suurusjärgus sada artiklit. Ülevaate teises osas

tutvustatakse lähemalt valkude transporti tuuma ja tsütoplasma vahel.

Eksperimentaalse osaga tehakse väike, aga loodetavasti vajalik samm vastava imetajate valgu

Neuralized-like-1 funktsioonide kirjeldamiseks. Uuritakse valgu rakus paiknemise

mehhanisme, täpsemalt järjestusi, mis võivad vastutada mingil määral valgu sisenemise eest

rakutuuma. Näidatakse, kas eelnevalt välja pakutud potentsiaalsed

tuumalokalisatsioonisignaalid (järjestused, mis üldjuhul vastutavad valgu tuuma jõudmise

eest) valgu N-terminaalses osas, on tõepoolest vajalikud selle valguosa sisenemiseks

rakutuuma. Varasemad tulemused Neuralized-like-1 valgu tuumatranspordi mehhanismide

osas ei ole olnud lõplikud.

Uurimistöö eduka valmimise eest sooviksin ma kõige rohkem tänada oma juhendajat TTÜ

Geenitehnoloogia instituudi teadur Mari Seppa, kelle õpetussõnadeta poleks olnud võimalik

ükski laboris läbi viidud töödest ning kelle sisulise selgitamise ja nõustamiseta poleks üldse

midagi paberile jõudnud. Juhendaja Tallinna Reaalkoolis õpetaja Kersti Veskimets oli see,

kes muuhulgas võimaldas mul üldse seda uurimistööd tegema asuda. Lõpuks soovin tänada

kõiki kaasa aidanud inimesi TTÜ Geenitehnoloogia instituudi molekulaarbioloogia õppetoolis

professor Tõnis Timmuski poolt juhitud uurimisgrupis.

5

Kasutatud lühendid

BSA – veise seerumi albumiin (bovine serum albumine)

DLL – Delta-sarnane ligand (Delta-like)

DSL – Delta-Serrate-Lag2

ECN – Notch’i ekstratsellulaarne domeen (extracellular Notch)

EDTA – etüleendiamiintetraetaanhape

EGFP – roheline fluorestseeruv valk (enhanced green fluorescent protein)

ER – endoplasmaatiline retiikulum

FBS –veise loote seerum (fetal bovine serum)

GDP – guanosiindifosfaat

GFAP – gliia fibrillaarne happeline valk (glial fibrillary acidic protein)

CPEB3 – tsütoplasmaatilise polüadenülatsiooni elementi siduv valk 3 (cytoplasmic

polyadenation element-binding protein 3)

GTP – guanosiintrifosfaat

HBSS – Hank's balanced salt solution

HECT – E6-AP C-terminusega homoloogne domeen (Homologous to the E6-AP carboxyl

terminus)

HEK293 – inimese embrüonaalsest neerust eraldatud rakuliin (human embryonic kidney)

ICN – Notch’i intratsellulaarne domeen (intracellular Notch)

IgG – immuunoglobuliin G

LB-sööde – Luria-Bertani sööde

MAP2 – mikrotuubulitega seotud valk 2 (microtubule-associated protein 2)

MEM – Minimum Essential Medium Eagle

Mib – Mindbomb

Neur – Neuralized

Neurl –Neuralized-sarnane valk (Neuralized-like)

NHR – Neuralized homology repeat

NES – tuuma ekspordi signaal (nuclear export signal)

NLS – tuumalokalisatsioonisignaal (nuclear localization signal)

6

NPC – tuumapoorikompleks (nuclear pore complex)

PBS – fosfaat-puhverdatud soolalahus (phosphate buffered saline)

RING – Really Interesting New Gene

RZD – RING tsinksõrm domeen (RING zinc finger domain)

TAE – Tris-atsetaat-EDTA puhver

Tris – 2-amino-2-hüdroksümetüül-propaan-1,3-diool ehk tris(hüdroksümetüül)atsetaat

7

1. Kirjanduse ülevaade

1.1. Ubikvitiinligaas Neuralized

Neuralized (neur) avastati äädikakärbses Drosophila melanogaster olulise geenina

närvisüsteemi arengus. Seal on see Notch signaaliraja asendamatu komponent, muutes

väljalülitatuna võimatuks organismi korrektse embrüonaalse arengu. Notch signaalirada on

pea kõigile hulkraksetele omane rakkudevaheline signaliseerimissüsteem, muuhulgas on ta ka

üks olulisimaid raku saatuse määrajaid. Selle signaalirajaga seotult on avastatud Neuralized’i

funktsioon E3 ubikvitiinligaasina.

1.1.1. Ubikvitiinligaasid

Igas rakus toimuvad keemilised reaktsioonid, enamus neist on seotud valkudega. Valke

sünteesitakse pidevalt, nende poolt katalüüsitud reaktsioonid ongi elu alustalad. Teisisõnu on

valkude sünteesimine raku üks olulisimaid ülesandeid oma jätkuva eksistentsi tagamisel.

Valkude tootmine algab geneetiliselt materjalilt, DNAlt, ning lõpeb töövalmis valguga. Selge

on see, et valgud ei püsi igavesti, neid on vaja ka lagundada. Seda teevad enamasti

proteasoomid (suured valgukompleksid, mis oma proteaasidest koosneva funktsionaalse

keskmega lagundavad valke lühikesteks oligopeptiidideks) või ka lüsosoomid. Sealjuures on

muidugi oluline teada, milliseid proteiine lagundada tuleks.

Ubikvitiin on väike valk (joonis 1), mis on levinud eukarüootsete organismide pea kõigis

kudedes (sellest tuleneb ka nimetus inglise keelest sõnast ubiquitous (kõikjal olev)).

Ubikvitiini kovalentne sidumine märgistatava valguga suunab viimase lagundamisele

proteasoomis. Samas võib ubikvitiiniga märgistamine omada ka mõnda muud tähendust – see

sõltub lisatavate ubikvitiinide arvust ja lisamise viisist. (Alberts et al. 2008, 393-394)

Ubikvitineerimise protsess algab ubikvitiini sidumisest ubikvitiini aktiveeriva ensüümi E1

külge (joonis 2). See toimub ATP kaasabil, tekib kõrge energiaga tioester side ensüümi

tsüsteiini kõrvalahela ja ubikvitiini C-terminuse vahel. C-terminuseks nimetatakse vaba

karboksüülhappega lõppevat valgu otsa, valgu teist otsa nimetatakse vaba aminorühma järgi

N-terminuseks; valgusüntees toimub N-terminuselt C-terminuse suunas. Järgmise sammuna

8

kantakse ubikvitiin üle mõnele ubikvitiini konjugeerivale ensüümile E2, samuti tsüsteiini

külge. Lõpuks, koostöös konkreetselt märklaud-valguga seonduva E3 ensüümiga

(ubikvitiinligaas) moodustub E2-E3 kompleks, mis liidabki substraadi mõnele lüsiinile

ubikvitiini. (Alberts et al. 2008, 393-394)

Joonis 1. Ubikvitiini skemaatiline kujutus. Siniselt on kujutatud α-heeliksid, roheliselt β-lehed. Eraldi on välja toodud lüsiinid, kuna lüsiinide kaudu moodustuvad ubikvitiinahelad. Olulisemad neist on lüsiin 48 ja lüsiin 63 kaudu moodustuvad ahelad. Allikas: Wikimedia Commons

Olenevalt markeerimise eesmärgist võib substraadiga toimuda see protsess ainult ühe korra,

sel juhul on tegemist monoubikvitineerimisega. Kui aga valgu mitmele erinevale lüsiinile

liidetakse ubikvitiin, siis on tegemist multiubikvitineerimisega ning see märgistab

transmembraanse proteiini endotsütoosiks ehk liikumiseks raku sisse endosoomi,

membraaniga ümbritsetud rakusisese ruumi moodustumise abil. Kolmanda variandina võib

toimuda ka polüubikvitineerimine, kus ubikvitiine lisatakse üksteise külge, moodustades

niiviisi valgu külge pika lineaarse ubikvitiinide ahela (joonis 2). Kui polüubikvitineerimisel

toimub ubikvitiinidevaheliste sidemete moodustumine lüsiin 48 1 kaudu, näitab see

proteasoomi poolt lagundamisele määramist, kui aga lüsiin 63 kaudu, siis on ubikvitiinahelal

teistsugune tähendus. Leviku poolest silmapaistvamaiks neist neljast võimalikust

ubikvitineerimise viisist peaks pidama lüsiin 48 kaudu polüubikvitineerimist ehk

proteolüütilist rada. Samas on tasub meeles pidada, et üldiselt võib ubikvitineerimine omada

väga erinevaid tähendusi. (Ibid., 393-394)

1 Aminohappejäägi positsioon valgus, lugedes N-terminaalsest otsast

9

Joonis 2. Ubikvitineerimine ja polüubikvitiinahela teke. Esmalt seotakse ubikvitiin (Ub) ATP abil ensüümi E1 tsüsteiini (välja on toodud tioolrühm) külge, moodustub tioester side ning vabaneb AMP ning pürofosfaat ioon (PPi). Seejärel kantakse ubikvitiin üle ensüümile E2, mis moodustab kompleksi ensüümiga E3. Kompleks seob ubikvitiini substraadi mõne lüsiini külge (näidatud kõrvalahel ja selle sidet moodustav aminorühm), protsess võib korduda polüubikvitiinahela moodustumiseks. Allikas: Wikimedia Commons

1.1.2. Notch signaalirada

Hulkraksete organismide olemasoluks on vajalik, et toimuks rakkudevaheline suhtlus. Kuid

rakk-rakk suhtlus ei ole lihtsalt keemiliste signaalide edasiandmine, sellega on seotud ka

komplekssed intratsellulaarsed mehhanismid, mis reguleerivad signaalide saatmist ja

vastuvõtmisest tulenevaid muutusi. Esimesed keerulisemad hulkraksed organismid tekkisid

Maale alles 2,5 miljardit aastat pärast esimesi tänapäevastele sarnanevaid prokarüoote, ehk

ongi selle arengu hilisuse üks olulistest põhjustest rakkudevahelise suhtluse keerukus.

Rakkudevaheline suhtlus toimub kahe komponendi, retseptorite ja signaalmolekulide kaudu.

Retseptorid on enamasti transmembraansed valgud. Signaalmolekulide puhul on rohkem

võimalusi:

• transmembraansed valgud, mis seonduvad kõrvaloleva raku retseptoritega

(jukstakriinne süsteem),

10

• rakkudevahelisse ruumi vabanevad signaalmolekulid, kus need mõjutavad kõiki

lähedalolevaid rakke (parakriinne süsteem),

• vereringesse sekreteeritavad hormoonid, mis levivad üle kogu organismi (endokriinne

süsteem),

• neurotransmitterid, mida vabastavad neuronid mööda aksonit tulnud elektrilise

signaali tulemusena sünapsisse (sünaptiline signaliseerimine). (Alberts et al. 2008,

879-883)

Notch signaalirada on evolutsiooniliselt kõrgelt konserveerunud rakkudevahelise

signaliseerimise süsteem, millel on oluline roll rakkude saatuse määramisel ning mustrite

tekkel kudede arengus. Notch’i kaudu signaliseerimine võib olla kõige laialdasemalt

kasutatav signaalirada loomade arengus. Tema tuntuim roll on Drosophila närvisüsteemi

arengus, kus võrdse arengupotentsiaaliga epiteelrakkudest koosnevas kogumis inhibeerib

neuroniks saav rakk ümbritsevatel rakkudel sama arengusuuna ning neist tekivad selle asemel

epidermaalsed rakud. See protsess, lateraalne inhibitsioon, toimib jukstakriinse süsteemi

kaudu, mille aktiveerib transmembraanne signaalvalk Delta neuroniks saava raku pinnal.

Signaaliraja mittetöötamisel arenevad ka naaberrakud neuroniteks ning epidermaalse koe

arvelt tekib suur kogus liigseid neuroneid. See on organismile surmav. (Ibid., 946-947)

Joonis 3. Notch’i ja Delta vahendatud lateraalne inhibitsioon närvirakkude arengus Drosophila’s. Epiteelrakkudest koosnevas kogumis esineb areneva närviraku pinnal rohkem Delta-ligandi, mis seostudes naaberrakkude Notch-retseptoriga takistab nende neuraalset arengut. Allikas: Molecular Biology of the Cell

11

Signaalid kõrvutiolevate rakkude vahel Notch-retseptori ning äädikakärbse Delta või

imetajate Delta-sarnaste-ligandide (DLL) abil reguleerivad raku saatuse otsuseid paljudes

kudedes. Tihti vahendab Notch signaalirada lateraalset inhibitsiooni erinevalt

diferentseerunud rakkude tekkeks kudedes. Teistel juhtudel võib see töötada ka vastupidiselt,

suunates ümbritsevaid rakke hoopis kindlasse arengusuunda. Üldiselt ongi raske leida

rakkude arengurada, milles Notch signaalirada ei osaleks. (Alberts et al. 2008, 946-947)

Notch on transmembraanne proteiin, mis vajab funktsioneerimiseks proteolüütilist töötlemist

(joonis 4). Ta käitub kui latentne geeni regulaatorvalk (ehk aktiveerib kindla inaktiivse geeni

transkriptsiooni tuuma sisenedes), olles seega osa vastavast äärmiselt lineaarsest signaalirajast

raku pinna ja tuuma vahel. Notch retseptori tootmisel biosünteesis (joonis 4a) lõigatakse see

Golgi kompleksis, tekkiv heterodimeer transporditakse raku pinnale toimiva retseptorina

(joonis 4b). Naaberraku pinnal oleva Delta valguga seondumisel (joonis 4c) toimub kaks

järgmist lõikamist, esmalt ekstratsellulaarse proteaasi poolne ning seejärel γ-sekretaasi poolne

lõige transmembraanses osas (joonis 4d). Vabanenud Notch’i rakusisene osa liigub tuuma

aktiveerimaks vastavate märklaudgeenide transkriptsiooni (joonis 4e). (Ibid., 946-947)

Notch ja Delta on mõlemad glükoproteiinid ja nende interaktsiooni reguleerib Notch’i

glükosüleerimine (joonis 4b). Fringe perekonna valgud on glükosüültransferaasid, mis lisavad

sahhariide O-seoselise (valguga mõne aminohappe hapniku kaudu seostunud) oligosahhariidi

otsa. Notch’i glükosüleerimine muudab Notch’i spetsiifikat ligandide suhtes, võimaldades

ligand-retseptor signaliseerimist erinevalt kohandada (joonis 4c). (Ibid., 946-947)

Notch-retseptori aktiveerimiseks on vajalik ligandi ubikvitineerimine ja endotsütoos, selle

eest vastutavad E3 ubikvitiinligaasid Neuralized ja Mindbomb (Mib; avastatud Danio rerio’s)

(Weinmaster, Fischer 2011).

12

Joonis 4. Notch signaalirada. (a) Notch retseptori intratsellulaarne ja ekstratsellulaarne osa sünteesitakse ühe tervikuna (pre-Notch). Sünteesile järgnevalt transporditakse Notch endoplasmaatilisest retiikulumist (ER) Golgi kompleksi. (b) Golgi kompleksis toimub Notch’i glükosüleerimine Fringe perekonna valkude poolt ning esimene lõikus (S1) Furin-like konvertaasi poolt. Selle tulemusena tekib heterodimeerne retseptor mittekovalentselt seotud domeenidega, mis transporditakse plasmamembraanile. (c) Lähtuvalt Fringe’i poolt tehtud modifikatsioonidest seostub retseptor DSL (Delta (DLL)–Serrate–Lag2) ligandidega. Jagged on Serrate valgule vastav valk imetajates. Selle protsessi juures on olulised ka E3 ubikvitiinligaasid Mindbomb (Mib) ja Neuralized-like (Neurl). (d) Ligandiga seostumise tagajärjel toimuvad kaks lõikust, esmalt lõikus rakuvälises osas metalloproteaasi poolt (S2) ning seejärel viimane lõige γ-sekretaaskompleksi poolt (S3), mis vabastab rakusisese osa. (e) Intratsellulaarne domeen (ICN) liigub rakutuuma, kus ta aktiveerib märklaudgeenide transkriptsiooni. (f) Märklaudgeenide transkriptsiooni tulemusena inhibeeritakse enamasti mõnede teiste geenide transkriptsiooni, närvisüsteemi näites on nendeks neuraalset diferentseerumist soodustavad geenid. (g) Toimub ka ICN-i lagundamine vastavalt erinevatele regulatsioonisüsteemidele. Allikas: Grabher et al. 2006

p300

NEURL

CDK8

SEL10

MIB

Ligand endocytosis+ degradation

pre-Notch ICN

Fringe Furin

Glycosylation S1 cleavage

pre-Notch ICN

ICNICN

ICN

OFUT1

Fucosylation + ER exit

Heterodimerization

dnMAMLNRARP

MINT

MAML

CoA

CSL

ICN

CSL

Cd25Cdkn1aDeltexHes1NrarpPtrca

CoR

Nucleus

Ubiquitylation + proteosome degradation

ER

Golgi

Notch

ICNNotch

Fringe

Jagged

DLL Deltex?

!-secretasecomplex

Numb

GSI

ADAMproteinase

S2 cleavageS3 cleavage

Sending cell

Receiving cell

a

b

c

e

f

g

d

Figure 2 | The Notch signalling pathway. a | The intracellular and extracellular domains of the Notch receptor are synthesized as a single protein (pre-Notch). O-fucosyltransferase1 (OFUT1) functions as a chaperone and is required for the transport of pre-Notch from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi apparatus and for fucosylation of glycosylated serine and threonine residues of the extracellular domain within the Golgi141. b | Glycosylation of these residues is carried out by members of the Fringe family (radical, manic and lunatic). A Furin-like convertase cleaves pre-Notch into the extracellular and intracellular domain (S1 cleavage). This results in a heterodimeric receptor with non-covalently associated domains that is transported to the plasma membrane. c | The readout of receptor–ligand interaction is determined by the specific Fringe modifications that were introduced earlier in the Golgi, which affect sensitivity to the DSL (Delta (DLL)–Serrate–Lag2) ligands. Additionally, the E3 ubiquitin ligases, Mindbomb (MIB) and Neuralized-like (NEURL) promote the turnover of the ligand and therefore contribute to productive ligand–receptor interactions. d | Ligand binding initiates two successive proteolytic cleavages (S2 and S3). The first, mediated by an ADAM (a disintegrin and metalloproteinase domain) proteinase, occurs in the extracellular domain. S2 cleavage allows access of the !-secretase complex, which is responsible for the second proteolytic cleavage (S3), which occurs within the transmembrane domain and liberates the intracellular domain (ICN)131,142,143. e | The ICN translocates to the nucleus, where it interacts with the IPT (immunoglobulin-like fold, plexins and transcription factors)-domain-containing CSL transcription factor. Docking of the ankyrin-repeat domain of Notch to the Rel-homology region of the CSL protein generates a composite binding surface for the recruitment of Mastermind-like proteins (MAML)144,145 (S. Blacklow, personal communication). f | These interactions convert CSL from a transcriptional repressor to an activator by displacing co-repressors (CoR) and histone deacetylases and recruiting histone acetyltransferases. MAML in turn recruits additional co-activators (CoA), such as p300 (REFS 70,103,146–148). A few transcriptional targets of Notch have been identified and include Hes1 (Hairy/enahncer of split), pre-T-cell-receptor-" (Ptrca), Deltex (DTX1), Nrarp (Notch-regulated ankyrin-repeat protein), Cdkn1a and Cd25. Known regulators of Notch signalling include Numb, NRARP, MINT (MSX2-interacting nuclear target) and Deltex. Numb suppresses Notch signalling, possibly by preventing nuclear localization and targeting the ICN for degradation through the E3 ligase Itch149,150. Deltex is a positive regulator of Notch in Drosophila 151 but can inhibit Notch signalling in mammals69. An alternative CSL-independent pathway has been described in which Notch signalling is mediated through Deltex118. g | The stability of nuclear ICN is regulated through its PEST (polypeptide enriched in proline, glutamate, serine and threonine) domain. Binding of MAML to p300 and cyclin-dependent kinase 8 (CDK8) promotes hyperphosphoryla-tion of the ICN PEST domain to facilitate ubiquitylation, probably by members of the SEL1 (also known as FBW7) family of E3 ligases and the Itch E3 ligase, which target the ICN to the proteosome152,153. dnMAML, dominant-negative MAML.

R E V I E W S

NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 6 | MAY 2006 | 351

© 2006 Nature Publishing Group

13

1.1.3. Neuralized’i roll Drosophila melanogaster’is

Neuralized on vajalik Notch signaaliraja korrektseks toimimiseks äädikakärbses. Näidatud on,

et tegemist on RING (Really Interesting New Gene) tsinksõrm domeeni (RZD) sisaldava E3

ubikvitiinligaasiga. Domeeniks nimetatakse osa valgust, mis võib eksisteerida ja

funktsioneerida iseseisvalt. Domeenid on tihti pakitud ja stabiilsed sõltumatult ülejäänud

valgust. RZD on tsingi iooni(de)ga seotud struktuurne domeen. E3 ubikvitiinligaase ongi

kahte tüüpi, HECT (domeen C-terminuses, muuhulgas seovad seda tüüpi E3

ubikvitiinligaasid ubikvitiini vaheastmena ka enda külge) või RING domeeniga. (Lai 2002)

Neur avastati üle kolme aastakümne tagasi kui üks kuuest lookusest, mille funktsioon on

vajalik suunamaks ektodermi (välimine kolmest rakukihist varajases embrüonaalses arengus)

närvisüsteemiks areneva osa rakke neuraalse arengusuuna asemel epidermaalsele suunale.

Need lookused, tuntud kui neurogeensed geenid, sisaldavad Notch signaaliraja

põhikomponente. (Ibid.)

Notch signaaliraja aktiveerimiseks on ainulaadselt vajalik ligandi transport tagasi signaali

saatva raku sisemusse (Weinmaster, Fischer 2011). Neur on Drosophila’s vajalik Delta

endotsütoosiks ja lagundamiseks. In vitro on näidatud, et Neur viib läbi Delta

monoubikvitineerimist, mida peetaksegi just endotsütoosi signaaliks (Lai et al. 2001).

Neuralized’i üldine mõju Notch signaalirajale on siiski ebaselge. Delta aktiveerib

naaberrakkudes Notch’i, aga võib ka autonoomselt inhibeerida Notch signaali vastuvõtmist

rakusiseselt. On välja pakutud, et Neur võib käituda vastupidiselt Delta inhibeerivale

funktsioonile Notch signaali vastuvõtvas rakus, soosides seega rakus Notch signaaliraja

aktiveerumist. (Lai 2002)

Delta kõrgenenud ekspressioon viib Notch-retseptori aktiveerimiseni naaberrakkudes ja

takistab Notch’i aktiveerimist signaali saatvas rakus. Seda viimast regulatoorset protsessi

nimetatakse cis-inhibitsiooniks ja see on oluline selleks, et Notch’i aktivatsioon toimuks vaid

signaali vastuvõtvas rakus. Muuhulgas on Notch-retseptori cis-inhibitsioon oluline

mehhanism raku saatuse määramisel Drosophila tiival ja silmas. Nendes kahes protsessis ei

ole Delta-poolseks Notch-retseptori cis-inhibitsiooniks vajalik ubikvitineerimine, kuna rakud

ilma Neur’ita ei saa aktiveerida Notch’i naaberrakkudes, samas aga saab Delta rakusiseselt

14

cis-inhibeerida Notch-retseptorit. Kuigi tõenäoliselt ei osale Neur signaali vastuvõtmises, võib

siiski Neur üleekspressioon represseerida cis-inhibitsiooni – võimalik, et Delta

plasmamembraanilt eemaldamise ja lagundamise tõttu. Seega on võimalik, et Neur reguleerib

signaali vastuvõtvates rakkudes Notch aktivatsiooni muutes cis-inhibitsiooniks saadaval oleva

Delta-ligandi hulka. (Weinmaster, Fischer 2011)

Neur’i puudumisel koguneb Delta-ligand raku pinnale, kuid ei suuda aktiveerida Notch

signaali. Ligandi endotsütoosi vajaduse põhjused on aga jäänud vaieldavaks, selle

kirjeldamiseks on kaks võimalikku mudelit, mis muuhulgas ei ole ka üksteist välistavad.

Üheks neist on võimalus, et endotsütoosi abil toimub ligandi taastöötlemine ja tagasi raku

pinnale viimine, kuid tulemused on näidanud, et tõenäoliselt ei ole tegemist Notch signaaliraja

põhikomponendiga, vaid see paistab olevat spetsiifiline Notch signaliseerimisele polaarsetes

rakkudes. Teiseks mudeliks on mehhanism, et ligandi ubikvitineerimise tulemusena toimuv

endotsütoos avaldab Notch retseptorile mehhaanilist pinget, mis on vajalik rakuvälise osa

eraldumiseks ja Notch’i intratsellulaarse osa vabanemiseks. Seda Notch’i ekstratsellulaarse

domeeni transendotsütoosi (naaberraku pinnal oleva valgu endotsütoos, antud juhul Notch’i

rakuvälise osa endotsütoos signaali saatvasse rakku) kirjeldavat mudelit toetab muuhulgas ka

tulemus, et signaali saatva raku endosoomides on koos esinenud Delta ja Notch’i

ekstratsellulaarne domeen. Lisaks sellele on ka teada, et Notch’i proteolüütiline lõikamine

nõuab valgus suuri konformatsioonilisi muutusi, mille põhjustajaks mudelijärgne

mehhaaniline pinge olekski. Hetkel teadaoleva põhjal võibki öelda, et Neur/Mib-sõltuv

ligandi endotsütoos rakendab retseptorile tõmbejõudu, mille tulemusena aktiveerub

signaliseerimine. (Ibid.)

1.1.4. Neuralized’i homoloogid imetajates

Drosophila’s täidavad Notch signaalirajas ubikvitiinligaasid Neur ja Mib1 sarnaseid

funktsioone. Imetajate homoloogid neist valkudest seevastu ei ole funktsionaalselt

võrdväärsed. Ainult Mib on Notch signaalirajas vajalik nii kärbses kui ka imetajates. Neur

homoloogid imetajates, Neurl1 ja Neurl2, ei ole kumbki asendamatud Notch signaaliraja

toimimiseks. Seega, kuigi reeglina on homoloogsetel valkudel erinevates organismides

sarnane roll, on alust arvata, et Neur homoloogid imetajates on veel täpselt selgitamata

funktsioonidega. (Ibid.)

15

1.1.4.1. Neurl geenide avaldumine

Neurl1 avaldub peamiselt närvisüsteemis ja skeletilihastes, omandades kõrgeimad tasemed

täiskasvanud organismides. Närvisüsteemis avaldub Neurl1 neuronites ja Neurl1 mRNA on

lokaliseerunud dendriitidesse, mis viitab rollile sünaptiliste funktsioonide reguleerimisel

(Timmusk et al. 2002). Neurl1 geenilt toodetakse alternatiivse mRNA splaissingu tulemusena

kahe erineva N-terminusega valku, üks on ekspresseeritud närvisüsteemis, teine lihastes,

samas ülejäänud struktuur on identne: kaks NHR (Neuralized Homology Repeat) domeeni,

millele järgneb RZD C-terminuses (joonis 5; Ibid.). Neurl2 avaldub embrüonaalse arengu ajal

ajus ja mõnedes mitteneuraalsetes kudedes ning mRNA tasemed langevad märgatavalt

sünnijärgselt. Hipokampuse neuronites jääb Neurl2 mRNA dendriitidest eemale (Rullinkov et

al. 2009).

1.1.4.2. Neurl1 funktsioonid

Neurl1 deletsioon viib erinevate arenguliste defektideni, kuid tema funktsioone on vähe

kirjeldatud.

Tsütoplasmaatilise polüadenülatsiooni (RNA molekulile adenosiinmonofosfaatidest koosneva

polü(A) saba lisamine) elementi siduv valk 3 (CPEB3) on lokaalse valgusünteesi regulaator.

Hiljuti avaldatud tulemuste kohaselt aktiveerib Neurl1 läbi ubikvitineerimise CPEB3. Selle

valgu aktiveerimine viib hipokampuse neuronite kultuurides uute dendriitide kasvuni ning

kahe teatava valgu hulga suurenemiseni, mis on vajalikud sünaptilise plastilisuse jaoks.

Sünaptiline plastilisus on võime reguleerida sünapsi tugevust kahe neuroni vahel ning on

seega üks õppimise ja mälu alustalasid. Saadud tulemused on viidanud mudelile, mille

kohaselt Neurl1-sõltuv ubikvitineerimine võimaldab hipokampuse plastilisust ja

hipokampusest sõltuvat mälu, muutes CPEB3 aktiivsust ning reguleerides lokaalset

valgusünteesi ning sünapside moodustumist. (Pavlopoulos et al. 2011)

Tegelikkuses ei ole midagi lõplikku Neurl1 kohta teada, tema funktsioone on suhteliselt vähe

kirjeldatud. Üks oluline osa valgu toime uurimisel on teadmine, kus valk rakus asub ja oma

funktsioone täidab. Seda teades oleks juba võimalik täpsemalt uurida interaktsioone teiste

valkudega ning jõuda tulemusteni tema rolli põhjalikuma kirjeldamise osas.

16

1.1.4.3. Neurl1 valgu lokalisatsioon

Üldiselt on arvata, et Neur perekonna valgud lokaliseeruvad tsütoplasmas ja

plasmamembraanil, kuid on näidatud ka, et Neurl1 liigub tuuma ja tsütoplasma vahel

(Timmusk et al. 2002). Tuumas võib Neurl1 valk talitleda ka kui transkriptsiooniline

repressor, mille funktsioone vahendavad NHR domeenid (Ibid.). Neurl2 valk on peamiselt

tsütoplasmaatilise lokalisatsiooniga (Rullinkov et al. 2009).

Professor T. Timmuski laboris viidi läbi uuring Neurl1 valguga interakteeruvate valkude

identifitseerimiseks. Oodatult tehti kindlaks interaktsioon mõnede Delta-like perekonna

valkudega, kuid selgus ka interaktsioon tuumaimpordis osaleva valguga Importiin-α3.

Sealjuures selgus ka, et Neurl1 ei ubikvitineeri Importiin-α3 valku. Lisaks leiti

bioinformaatilisel analüüsil potentsiaalsed tuumalokalisatsioonisignaalide (NLS) ja tuuma

ekspordi signaali (NES) järjestused Neurl1 valgus (joonis 5). (Taal 2011)

Joonis 5. Neurl1 valgu skemaatiline esitus ja aminohappeline järjestus potentsiaalsete NLS-de juures. Valgul on vastavalt koele, kus ta ekspresseerub kaks võimalikku N-terminust, lihastele (M) või ajule (B) spetsiifiline. Neurl1 koosneb kahest Neuralized Homology Repeat domeenist, NHR1 ja NHR2, mille vahele jääb domeene ühendav vaheregioon. C-terminuses on valgul RING tsinksõrm domeen (RZD). Looduslikult esineva metsiktüüpi (wt ehk wildtype) valgu arvatavad NLS-d muudeti mittefunktsionaalseks missense mutatsioonide (punktmutatsioonid, mille tulemusena koodon kodeerib mõnd teist aminohapet) sisseviimisega (aminohappeline järjestus on toodud ühetäheliste sümbolite abil), lüsiini (K) ja arginiini (R) jäägid asendati alaniinidega (A). (Taal 2011)

1.2. Valkude transport tuuma ja tsütoplasma vahel

Eukarüootne rakk jaguneb erinevateks organellideks ning piirkondadeks. Seeläbi on

võimalikud funktsionaalselt erinevad keskkonnad raku sees. Eukarüootse raku

kompartmentaliseeritusega kaasneb ka vajadus reguleerida valkude paiknemist rakus,

muuhulgas on reguleeritud ka valkude transport tuuma ja tsütosooli vahel.

17

Rakutuum on ümbritsetud kahe kontsentrilise membraaniga (joonis 6), sisemise

tuumamembraaniga, mis seob kromatiini ja tuuma lamiini, valgulist struktuuri, mis toetab

tuumaümbrist, ja välimise tuumamembraaniga, mis on ühtne ER membraaniga ning kuhu

sarnaselt ER-ga kinnituvad ribosoomid. Nende membraanide vahele jääb perinukleaarne

ruum, mis on ühtne ER luumeniga (endoplasmaatilise retiikulumi sisemise osaga).

Joonis 6. Tuumaümbris koosneb sisemisest ja välimisest tuumamembraanist, mille vahele jääb perinukleaarne ruum, tuumaümbris moodustab ühtse struktuuri ER membraani ja luumeniga. Tuumaümbrist läbib arvukalt tuumapoorikomplekse. Sisemise tuumamembraani külge kinnitub ka tuuma struktuuri hoidev tuuma lamiin. Allikas: Molecular Biology of the Cell

Tsütosooli ja tuuma vahel toimub pidev kahesuunaline ainete transport. Tuuma on vaja

transportida paljusid tsütosoolis toodetavaid valke – muuhulgas histoone, DNA ja RNA

polümeraase, geenide regulaatorvalke ja RNA-d töötlevaid valke. Tuumast eksporditakse

näiteks tRNA-d, mRNA-d ja valmis ribosoome. Paljude valkude lokalisatsiooni määrab

tasakaal tuuma ja tuumast välja transportimise vahel.

1.2.1. Tuumapoorid

Ainete transport tuuma ja tsütosooli vahel toimub suurte tuumamembraani läbivate

struktuuride, tuumapoorikomplekside (NPC) abil. NPC-d loomarakkudes koosnevad umbes

18

30 erinevast NPC valgust ning on molekulmassiga ligikaudu 125 MDa2. Keskmiselt on

imetajate rakus tuumaümbrises kolm kuni neli tuhat NPC-d. (Alberts et al. 2008, 704-712)

Iga NPC-d saavad läbida erinevad ained mõlemas suunas. Väikesed veeslahustuvad

molekulid läbivad tuumapoore suhteliselt vabalt, passiivse difusiooni abil. Tuumaümbris on

sisuliselt vabalt läbitav väikestele molekulidele molekulmassiga kuni 5 kDa. Suuremad

valgud difundeeruvad aeglasemalt ning proteiinid, mille molekulmass on suurem kui 60 kDa,

praktiliselt ei sisene tuuma difusiooni abil. Sellised valgud saavad seega tuuma siseneda vaid

aktiivse transpordi teel. (Ibid., 704-712)

1.2.2. Tuumalokalisatsioonisignaalid

Suurematel valkudel on tuuma pääsemiseks vajalik vastava signaali olemasolu. Kindlaks on

tehtud, et selle eest vastutavad positiivselt laetud lüsiini- ja arginiinirikkad lühikesed

aminohappelised järjestused valkudes. Need järjestused on tuumalokalisatsioonisignaalid

(NLS). NLS-id võivad valgus paikneda peaaegu igal pool ning on suhteliselt sõltumatud

ülejäänud valgust. NLS järjestuste abil võib läbi NPC-de transportida väga suuri

makromolekule, enamasti ka nende struktuuri sealjuures muutmata. Piisab lausa ühest NLS-st

kogu valgukompleksi kohta, et sel oleks võimalik tuuma siseneda. (Ibid., 704-712)

Siiski NLS-st üksi ei piisa veel valgu tuuma lokaliseerumiseks. Selleks on ka vajalikud

erinevad transpordiretseptorid, mis vahendavad valkude tuumatransporti. Üldiselt kuuluvad

need valgud perekonda, mida nimetatakse karüoferiinideks. Transport toimub sealjuures veel

ka Ran GTPaaside abil. Ran-GTP ja Ran-GDP omavaheline konverteerimine

tuumatranspordil tekitab nende ainete jaoks kontsentratsioonigradiendi tuuma ja tsütosooli

vahel. See koos konversioonil saadaoleva energiaga võimaldabki transportida valke kindlas

suunas. Karüoferiinid on aga seevastu vajalikud valgu kui sellise transpordiks. Ühed

karüoferiinidest on importiinid, mis vahendavad NLS järjestust sisaldava valgu ja NPC

valkude seondumist. Üks selline üsna palju uuritud valk on Importiin-α. (Sorokin et al. 2007)

Samas ei ole NLS-d tingimata vajalikud valgu tuuma sisenemiseks. See võib toimuda ka

mõne teise valguga koos (läbi kompleksi moodustamise). Lisaks ei ole ka veel sugugi kõik

2 1 Da (dalton) = 1 g/mol

19

NLS järjestused kirjeldatud, paljudel valkudel on selleks tavalisest erinevad signaalid.

(Alberts et al. 2008, 704-712)

1.2.3. Valkude eksport tuumast

Ka valkude ekspordiks tuumast on vajalik teatava signaaljärjestuse olemasolu. Siinkohal on

tegemist tuuma ekspordi signaaliga (NES), mis koosneb lühikestest hüdrofoobsetest leutsiini-

või isoleutsiinirikastest järjestustest. Eksport tuumast toimub impordiga sarnase mehhanismi

abil, ainult vastassuunas. Paljud valgud sisaldavad nii NLS-e kui ka NES-e, mis tähendab, et

nad liiguvad pidevalt edasi-tagasi tuuma ja tsütosooli vahel. Selle kiiruse reguleerimisega on

seega ka võimalik muuta valgu lokalisatsiooni. Nii toimubki näiteks mõningate

geeniregulaatorvalkudega. (Ibid., 704-712)

20

2. Töö eesmärk

Omandamaks täpsemat arusaamist Neurl1 rollist imetajates, tegemaks kindlaks selle

funktsioone rakus, on vaja näidata, milliste valkudega see interakteerub. Valgu

tundmaõppimisel on aga oluline ka teadmine, kus see oma funktsioone täidab. Neurl1 valgu

lokalisatsiooni tuumas on näidanud Timmusk et al. (2002). Tuuma ja tsütoplasma vahel

liikumise mehhanismi pole aga senini Neurl1 jaoks kindlaks tehtud. Kuigi Taal (2011) leidis,

et Neurl1 valgu NHR1 domeenis asuvad järjestused on sarnased NLS konsensusega, pole

teada, millist rolli omavad identifitseeritud arvatavad NLS järjestusted in vivo. Nagu Taal

(2011) näitas, siis kahe NHR1 domeenis oleva potentsiaalsete NLS järjestuste missense

mutatsioonid ei takistanud täispika Neurl1 valgu lokaliseerumist tuuma. See tulemus koos

mõlema NHR domeeni osalise lokalisatsiooniga tuumas viitas sellele, et nii Neurl1 NHR1 kui

ka NHR2 sisaldavad järjestusi, mis on piisavad terve valgu tuumaimpordiks. Seetõttu on

Neurl1 tuumatranspordi mehhanismide täpsemaks selgitamiseks vajalik uurida mõlemaid

NHR domeene eraldi. Käesoleva töö eesmärgiks on teha kindlaks kas ja millist rolli mängivad

arvatavad NLS järjestused Neurl1 NHR1 domeeni transpordis tuuma.

21

3. Materjalid ja metoodika

3.1. Kasutatud plasmiidid

Antud töös on kasutatud eelnevalt kirjeldatud plasmiide pEGFP (Clontech), pEGFP-NLS

(Sepp et al. 2011), pCDNA-Neurl1-Flag-NLSmut (Taal 2011) ja pEGFP-Neurl1-NotIdel

(Timmusk et al. 2002).

3.2. Restriktsioon

Restriktsioon on DNA järjestusspetsiifiline lõikamine restriktaasensüümide poolt. Kõiki

plasmiide lõigati sobivate restriktaasidega, kasutades tootja poolt soovitatud puhvreid

(Fermentas). Restriktsioonid viidi läbi 37°C juures, mahus 10 µl, kasutades 1 µg DNAd ja 2-

2,5 U3 restriktaasi. Reaktsioonil lasti toimuda üks tund kuni üleöö, pärast mida hoiustati

vajadusel 4°C juures.

3.3. DNA geelelektroforees ja fragmentide puhastamine geelist

Restriktsiooni produktidele lisati 1/5 mahust laadimispuhvrit (10 mM Tris-HCl, 0,15% orange

G, 60% glütserool, 60 mM EDTA, pH=7,6) ning need lahutati elektroforeetiliselt 1,5%

agaroosgeelis TAE puhvris (40 mM Tris-atsetaat, 1 mM EDTA, pH=8,3). DNA fragmentide

visualiseerimiseks ultraviolettvalguses lisati geeli 100 ng/ml etiidiumbromiidi. DNA

fragmentide pikkuse hindamiseks kasutati GeneRuler™ 1 kb markerit (Fermentas). Vajalikud

fragmendid lõigati geelist ning puhastati vastavalt UltraClean™ 15 DNA Purification Kit

(Mobio) protokollile, mis on lühidalt kirjeldatud järgnevalt. Geelile lisati 3 ruumala ULTRA

SALT lahust (naatriumjodiidi vesilahus) ning inkubeeriti 55°C juures, selle käigus lõhub NaI

agaroosi kooshoidvad vesiniksidemed, mille tulemusena geel lahustub. Seejärel lisati ULTRA

BIND lahust 5 µl + 1 µl iga µg saadava DNA kohta; lahus on silikageeli (ränidioksiid)

suspensioon vees, mis seob soolalahuse keskkonnas endaga DNA järgneva 5 minutise

inkubatsiooni käigus. Järgnevalt tsentrifuugiti silikageel (koos DNAga) põhja ning eemaldati

3 1 U on kogus ensüümi, mis restrikteerib 1 µg DNAd 1 tunni jooksul 37°C juures 50 µl testpuhvris

22

supernatant, soolalahuse ja geeli jääkidest puhastamiseks lisati 1 ml ULTRA WASH/EtOH

lahust (lahja Tris ja naatriumkloriidi lahus segatud võrdse ruumala etanooliga), kus silikageel

resuspendeeriti ning korduvalt tsentrifuugiti ja eemaldati supernatant. Lõpuks resuspendeeriti

silikageel vees (kasutatud ULTRA BIND lahuse ruumalast kaks korda suuremas ruumalas),

järgnenud inkubatsiooni käigus toatemperatuuril liikus DNA lahusesse, misjärel tsentrifuugiti

silikageel põhja ning supernatant (koos DNAga) kanti uude tuubi.

3.4. Ligatsioon

Ligatsioon on kahe kokkusobivate otstega DNA molekuli kovalentne sidumine. DNA

fragmendid ligeeriti toatemperatuuril ööpäev 10 µl ligatsioonipuhvris (Fermentas). Kasutati

2,5 U T4 DNA ligaasi (Fermentas) ning 10-25 ng DNAd. Vektori ja inserdi vahekord oli 1:4.

Ligaasi inaktiveerimiseks inkubeeriti segu 10 min 65°C juures.

3.5. Transformatsioon

Transformatsioon on geneetilise materjali viimine bakterirakku, mille tulemusena hakkab see

koos bakteriga paljunema. Transformatsiooniks kasutati kompetentseid Escherichia coli

(Novagen) rakke. 24 µl rakkude kohta kasutati 2,5 µl ligatsioonisegu. Rakke inkubeeriti jääl 5

minutit, pärast mida teostati 30-sekundiline kuumašokk 42°C juures. Rakke hoiti 2 minutit

jääl, lisati 500 µl SOC söödet (2% trüptoon (w/v), 0,5% pärmiekstrakt (w/v), 8,6 mM NaCl,

2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4, 20 mM glükoos) ning seejärel inkubeeriti loksutil 50 minutit

37°C juures. Rakud tsentrifuugiti põhja 16100 g juures 10 sekundit, eemaldati ~420 µl

supernatanti ning rakud resuspendeeriti järelejäänud 100 µl. Suspensioon külvati kanamütsiini

(50 µg/ml) sisaldavatele LB tardsöötmega (1% trütoon (w/v), 0,5% pärmiekstrakt (w/v), 170

mM NaCl, 1,5% agar) plaatidele ning inkubeeriti üleöö 37°C juures, pärast mida hoiustati

temperatuuril 4°C.

3.6. Plasmiidse DNA mini- ja midipreparatsioon

Plasmiidse DNA minipreparatsiooniks kasvatati üksikutest kolooniatest inokuleeritud rakke

24 tundi 30°C juures kanamütsiini (30 µg/ml) sisaldavas 2 ml LB-söötmes (1% trütoon (w/v),

0,5% pärmiekstrakt (w/v), 170 mM NaCl). Seejärel viidi kultuurid üle 1,5 ml tuubidesse,

tsentrifuugiti 16100 g juures 30 sekundit rakud põhja, aspireeriti supernatant, rakud

suspendeeriti 200 µl E1 lahuses (50 mM Tris, 10 mM EDTA), mis sisaldas RNaas A-d (100

23

µg/ml). Järgnevalt lisati bakterite lüüsimiseks 200 µl E2 lahust (200 mM NaOH, 1% SDS

(w/v)), tuubi inverteeriti ning inkubeeriti 5 minutit toatemperatuuril, rakuosade sadestamiseks

lisati 200 µl E3 lahust (3 M kaaliumatsetaat). Pärast 5 minutit 16100 g juures tsentrifuugimist

kanti supernatant (koos seal sisalduva DNAga) uude tuubi, milles oli 1 ml 96% etanooli, segu

vortex’iti ning DNA sadestamiseks tsentrifuugiti 16100 g 5 minutit. Supernatant aspireeriti

ning sadet pesti 200 µl 70% etanooliga, tsentrifuugiti 16100 g 3 minutit. Pärast järgnevat

aspireerimist ja kuivatamist (et vabaneda etanoolijääkidest) lahustati DNA 30 µl TE-s (10

mM Tris, 1 mM EDTA).

Plasmiidse DNA midipreparatsiooniks kasvatati rakke üleöö loksutil 37°C juures

kanamütsiini (30 µg/ml) sisaldavas LB-söötmes (100 ml) ning DNA puhastamiseks kasutati

JetStar Plasmid Purification Kit’i (Genomed). Seejärel mõõdeti saadud lahuses DNA

kontsentratsioon spektrofotomeetriliselt ning lahuseid lahjendati kontsentratsioonini 1 µg/µl.

3.7. Rakukultuurid

HEK293 (inimese embrüonaalsed neerurakud) rakke kasvatati MEM (Minimum Essential

Medium Eagle) söötmes (PAA), millele oli lisatud 10% FBS (veise loote seerum; PAA), 100

U/ml penitsilliini (PAA) ja 0,1 mg/ml streptomütsiini (PAA) 37°C juures 5% CO2

kontsentratsiooniga keskkonnas. Rakud külvati 48-kaevukesega plaatidele, millesse oli

asetatud katteklaasid. Rakkude klaasile kinnitumise soodustamiseks töödeldi katteklaasid

eelnevalt 0,02 µg/µl polü-l-lüsiiniga (Sigma), inkubeeriti 30 minutit ning pesti 3 korda veega.

Roti primaarsete neuronite kultuuride valmistamiseks kasutati embrüonaalse arengu 22. päeva

embrüosid, millest eraldati suuraju poolkerad ning sealt omakorda vajalik ajukoor. Vastavat

ajuosa töödeldi esmalt 0,25% trüpsiini lahusega (37°C 20 minutit), pesti 1 ml HBSS-iga

(Hank's balanced salt solution; 0,137 M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM

KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, 4,2 mM NaHCO3), töödeldi 1 ml DNaas I lahusega

(0,25 µg/ml DNaas I, 12 mM MgSO4 HBSS-is) 5 minutit 37°C juures ning pesti HBSS-iga.

Rakususpensiooni saamiseks tritureeriti kudet Pasteuri pipetiga 1 ml trüpsiini inhibiitori

lahuses (0,1% trüpsiini inhibiitor, 1% BSA (veise seerumi albumiin) HBSS-is) 12 korda.

Tsentrifuugiti 15 s 700 g juures suuremad koetükid põhja, supernatant kanti üle uude tuubi.

Tritureeriti veel 3 korda ning tsentrifuugiti uuesti. Supernatant kanti uude tuubi ning rakud

tsentrifuugiti põhja 1400 g juures 5 minutit. Supernatandi eemaldamise järel rakud

suspendeeriti NeuroBasal A söötmes (Gibco), millele oli lisatud 100 U/ml penitsilliini (PAA),

24

0,1 mg/ml streptomütsiini (PAA), 1 mM Glutamax (L-alanüül-L-glutamiin dipeptiid

0,00425% NaCl lahuses; Gibco) ja söötmelisand B27 (Gibco). Rakke kasvatati 48-

kaevukesega plaatidel polü-l-lüsiiniga töödeldud katteklaasidel 37°C juures 5% CO2

kontsentratsiooniga keskkonnas. Ööpäeva möödudes lisati söötmesse gliiarakkude

paljunemise takistamiseks mitoosi inhibiitor 5-fluoro-2’-deoksüuridiin (10 µM).

3.8. Transfektsioon

Transfektsioon on geneetilise materjali viimine (eukarüootsesse) rakku mitteviraalsel teel.

HEK293 rakkude transfektsiooniks kasutati 0,25 µg DNAd ja 1:2 suhtes ehk 0,5 µl LipoD293

reagenti (SignaGen) 20 µl MEM söötmes. LipoD293 on lisanditega liposoomidel põhinev

DNA transfektsiooni võimaldav reagent, liposoomidel põhineva transfektsiooni käigus

viiakse DNA rakku liposoomi (vesilahuses lipiididest iseeneslikult moodustuva väikese

vesiikuli) sisemuses. Transfektsioonisegusid inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril enne

rakkudele lisamist.

Neuronite transfektsiooniks eemaldati neilt sööde, see asendati ühe kaevukese kohta 100 µl

NeuroBasal A-ga. Transfektsiooniks kasutati 0,5 µg DNAd ja 1 µl (1:2 suhe) Lipofectamine

2000 (Invitrogen) reagenti 20 µl NeuroBasal A-s. Lipofectamine 2000 reagenti inkubeeriti 5

minut toatemperatuuril 10 µl NeuroBasal A-s enne DNA-ga segamist, transfektsioonisegu

inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril enne rakkudele lisamist. Viie tunni möödudes

aspireeriti transfektsioonisegu rakkudelt ning pandi tagasi enne transfektsiooni eemaldatud

sööde.

3.9. Immuunotsütokeemia ja mikroskoopia

Rakkude fikseerimiseks eemaldati neilt sööde ning lisati 200 µl 4% paraformaldehüüdi lahus

fosfaatpuhverdatud isotoonilises soolalahuses (PBS), inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril,

misjärel pesti rakke 3 korda PBS-ga. Neutraliseerimiseks lisati 200 µl 50 mM

ammooniumkloriidi PBS-s, inkubeeriti 10 minutit toatemperatuuril, pesti 2 korda PBS-ga.

Seejärel inkubeeriti rakkude permeabiliseerimiseks 15 minutit toatemperatuuril lisatud 200 µl

0,5% Triton X-100 lahuses PBS-s ja pesti 3 korda PBS-ga. Blokeerimiseks lisati 200 µl 2%

BSA ja 0,1% naatriumnitriidi lahust PBS-s. Selles lahuses jäeti rakud seisma 4°C juurde.

25

Primaarse antikehaga töötluseks valmistati lahjendused 0,2% BSA-PBS lahuses. Rakke

inkubeeriti 100 µl lahuses 1 h toatemperatuuril. Seejärel pesti rakke seondumata antikeha

eemaldamiseks 3 korda 0,1% Tween 20 lahusega PBS-s, kokku 15 minutit. Järgnevalt

töödeldi rakke sekundaarse antikehaga, rakkudele lisati 100 µl antikeha lahjendust 0,2%

BSA-PBS lahuses, inkubeeriti 1 h toatemperatuuril, kaitstes valguse eest. Pärast seondumata

antikeha eemaldamiseks 0,1% Tween 20 lahusega PBS-s 3 korda pesemist (kokku 15 minutit)

jäeti rakud seisma PBS-s 4°C juures. Seejärel pesti rakke veelkord PBS-ga ning kord mQ

veega. Katteklaasid rakkudega asetati alusklaasidele DAPI-t sisaldava Prolong Gold reagendi

(Molecular Probes) tilkadele, lasti kuivada ning säilitati pimedas.

HEK293 rakkude puhul visualiseeriti β-tubuliin, üks mikrotuubuleid moodustavatest

valkudest, mis paikneb tsütoplasmas. Primaarse antikehana kasutati hiires valmistatud β-

tubuliini vastaseid monokloonseid immuunoglobuliin G (IgG) antikehi lahjenduses 20 ng/ml

(Developmental Studies Hybridoma Bank), sekundaarsena kitses valmistatud hiire IgG

vastaseid fluorofooriga Alexa 568 konjugeeritud antikehi lahjendusega 1:2000 (Molecular

Probes).

Neuronite puhul visualiseeriti MAP2, üks mikrotuubulitega seotud perekonna

tsütoplasmaatiline valk. Selleks kasutati primaarse antikehana küülikus valmistatud MAP2

vastaseid polükloonseid IgG antikehi lahjendusega 1:200 (Chemicon), sekundaarsena kitses

valmistatud küüliku IgG vastaseid fluorofooriga Alexa 568 konjugeeritud antikehi

lahjendusega 1:2000 (Molecular Probes). Gliiarakkude märgistamiseks kasutati ühe neile

rakkudele omase valgu, GFAP (gliia fibrillaarne happeline proteiin) vastaseid hiires

valmistatud IgG primaarseid antikehi lahjendusega 1:800 (Chemicon) ning kitses valmistatud

hiire IgG vastaseid Alexa 488 konjugeeritud sekundaarseid antikehi lahjendusega 1:2000

(Molecular Probes).

Preparaate vaadati fluorestsentsmikroskoopidega, analüüs toimus Zeiss LSM Duo

konfokaalmikroskoobiga.

26

4. Tulemused

4.1. Potentsiaalsete NLS-de muteerimine EGFP ja Neurl1 NHR1 domeeni sisaldavas ühendvalgus

Neurl1 NHR1 potentsiaalsete NLS-de uurimiseks valmistasime vastava muteeritud arvatavate

NLS järjestustega valku kodeeriva konstrukti. Selleks kasutasime eelnevalt olemasolevaid

konstrukte pCDNA-Neurl1-Flag-NLSmut, mis kodeerib täispikka Neurl1 valku, milles

potentsiaalsed NLS-d on muteeritud (joonis 5 ja 7A), ja pEGFP-Neurl1-NotIdel, mis kodeerib

EGFP ja Neurl1 NHR1 domeeni sisaldavat ühendvalku (joonis 7B). Kasutasime sellist EGFP

ühendvalku visualiseerimise võimaldamiseks ning välistamaks valgu passiivset difusiooni

tuuma. EGFP (27 kDa) üksi liigub passiivselt tuuma, kuid ühendvalgu puhul takistab seda üle

50 kDa suurune molekulmass. Konstrukti pEGFP-Neurl1-NotIdel-NLSmut (joonis 7C)

valmistamiseks restrikteerisime pCDNA-Neurl1-Flag-NLSmut konstrukti restriktaasidega

PstI ja AatII, geelelektroforeetiliselt eraldatud fragmentidest kasutasime 578 aluspaari (bp)

pikkust fragmenti (joonis 7D), mis vastas Neurl1 muteeritud arvatavate NLS-dega NHR1

domeeni kodeerivale järjestusele. pEGFP-Neurl1-NotIdel konstruktist kasutasime ülejäänud

osa, mis sisaldas vajalikke järjestusi replikatsiooniks ja selektsiooniks bakterites. Selle

saamiseks oli vaja sooritada kaks lõikust, üks neist restriktaasidega PstI ja EheI saamaks 3363

bp fragmenti ning teine restriktaasidega AatII ja EheI 1473 bp fragmendi saamiseks (joonis

7E). Viimasel juhul lisasime vajaliku fragmendi paremaks eristamiseks reaktsiooni

restriktaasi SacI. Puhastasime vajalikud fragmendid geelist ja segasime need kokku

ligatsioonisegus. Ligatsiooniseguga transformeerisime Escherichia coli baktereid, saadud

ühest rakust üles kasvanud kolooniates oleva plasmiidse DNA eraldasime minipreparatsiooni

abil. Kolooniatest 1-6 saadud DNA ning võrdlusena ka pEGFP-Neurl1-NotIdel konstrukti

lõikasime Eco52I ja BglII restriktaasidega ning analüüsisime tekkinud fragmente

geelelektroforeesil (joonis 7F). pEGFP-Neurl1-NotIdel lõikamisel saime oodatavad 3406 bp

ja 2013 bp fragmendid (foreesipildidl on näha lisaks ka osaliselt lõpuni lõikumata fragmente).

Soovitud mutatsioone sisaldava konsktrukti puhul lõikub 2013 bp fragment veel 259 bp ja

1754 bp fragmendiks. Nende olemasolust lähtuvalt sisaldasid soovitud konstrukti kloonid 1 ja

6 (näeme ka mõlema puhul ka 2013 bp fragmenti, kuid taas on tegemist vaid osaliselt

27

28

lõikunud fragmendiga fragmendiga). Klooni 1 kasvatasime üles suures mahus ja eraldasime

plasmiidse DNA midipreparatsioonil ning viisime kontrolliks läbi restriktsioonanalüüsi ja

geelelektroforeesi nii esialgse pEGFP-Neurl1-NotIdel vektoriga kui ka kloonist 1 eraldatud

konstruktiga. Selleks lõikasime neid PstI restriktaasiga ja eristamiseks ka Eco52I

restriktaasiga (joonis 7G). Oodatult lõikas PstI mõlemaid konstrukte samamoodi (4751 bp +

668 bp). Eco52I lineariseeris pEGFP-Neurl1-NotIdel (5419 bp) ning lõikas mutatsioone

sisaldava konstrukti oodatult kaheks fragmendiks (3665 bp + 1754 bp, lisaks on näha ka

osaliselt lõikumata 5419 bp fragment). Kokkuvõttes olime saanud pEGFP-Neurl1-NotIdel-

NLSmut konstrukti, mille korrektsust kinnitas ka sekveneerimine.

4.2. Potentsiaalsete NLS-de muteerimise mõju EGFP ja Neurl1 NHR1 domeeni sisaldava ühendvalgu lokalisatsioonile HEK293 rakkudes

Metsiktüüpi ja mutantse EGFP-Neurl1-NHR1 valgu lokalisatsiooni määramiseks

transfekteerisime HEK293 rakkudesse vastavalt pEGFP-Neurl1-NotIdel ja pEGFP-Neurl1-

NotIdel-NLSmut konstruktid ning viisime läbi immuunotsütokeemilise analüüsi. Võrdluseks

kasutasime ka EGFP ja EGFP-NLS kodeerivaid konstrukte. Fluorestsentsmikroskoopia

näitas, et EGFP lokaliseerus nii tsütoplasmasse kui ka tuuma (oma väikese suuruse tõttu),

EGFP-NLS lokaliseerus oodatavalt pea täielikult tuuma. Nii metsiktüüpi kui ka muteeritud

järjestustega EGFP-Neurl1-NHR1 valk lokaliseerusid nii tuumas kui ka tsütoplasmas (joonis

8). Mutantse EGFP-Neurl1-NHR1 valgu korral täheldasime vähesel määral ka

tsütoplasmaatiliselt agregeerunud vormi (joonisel 8 NLSmut 2), selliseid rakke muude

valkude üleekspressiooni korral ei esinenud. Saadud tulemustest järeldasime, et arvatavate

Joonis 7. Neurl1 NHR1 lokalisatsiooni mehhanismide selgitamiseks kasutatud konstrukti valmistamine. (A-C) Konstruktide skemaatilised esitused. (D) pCDNA-Neurl1-Flag-NLSmut lõigati PstI ja AatII restriktaasidega. (E) pEGFP-Neurl1-NotIdel lõigati ühe fragmendi (2752-696) jaoks PstI ja EheI ning teise (1278-2752) saamiseks AatII, EheI ja SacI restriktaasidega. Mõlema konstrukti restriktsioonisegudes olevate DNA fragmentide lahutamiseks viidi läbi geelelektroforees; noolega on näidatud igast geelist kasutatud fragment. (F) Ligatsiooniseguga transformeeritud bakterite üksikute kolooniate plasmiidse DNA määramiseks see restrikteeriti ning fragmentide lahutamiseks viidi läbi geelelektroforees. Võrdluseks kasutati pEGFP-Neurl1-NotIdel konstrukti. Välja on toodud pEGFP-Neurl1-NotIdel-NLSmut omased fragmendid. (G) Restriktsioonanalüüsi põhjal kolooniast 1 midipreparatsiooni käigus puhastatud DNA (pEGFP-Neurl1-NotIdel-NLSmut konstrukti) võrdlus esialgse pEGFP-Neurl1-NotIdel vektoriga. Kõigis elektroforeesides kasutatud markeri (geelis esimesel rajal) DNA fragmentide pikkused on toodud piltide vasakul äärel aluspaarides.

29

NLS järjestuste missense mutatsioonid ei takista Neurl1 valgu NHR1 domeenil rakutuuma

sisenemast HEK293 rakkudes.

Joonis 8. Arvatavad NLS järjestused ei ole vajalikud Neurl1 NHR1 lokalisatsiooniks tuuma HEK293 rakkudes. HEK293 rakke transfekteeriti EGFP, tuntud NLS-ga seotud EGFP, EGFP-Neurl1-NHR1 ja EGFP-Neurl1-NHR1-NLSmut kodeerivate konstruktidega. Uuritavate valkude lokalisatsiooni visualiseeriti lisatud EGFP fluorestsentsi järgi. Rakkude tsütoplasma visualiseeriti β-tubuliiniga (üks valkudest, mis moodustavad mikrotuubuleid, tsütoskeleti osi) seonduvate antikehade abil, rakkude tuumad muudeti nähtavaks DNA värvimisel DAPI-ga. Negatiivse kontrollina näitasime ka, et EGFP-le vastavat signaali ei esine transfekteerimata rakkudes ning sekundaarne antikeha, mida kasutati β-tubuliini visualiseerimiseks ei seostu mittespetsiifiliselt otse rakkudega. EGFP ekspresseerus üle kogu raku, NLS-ga seotud EGFP oli lokaliseerunud tuuma, EGFP-Neurl1-NHR1-wt oli lokaliseerunud nii tuuma kui ka tsütoplasmasse, EGFP-Neurl1-NHR1-NLSmut esines kas üle kogu raku, olles tuumas ja tsütoplasmas (tüüp 1), või harva agregeerunult tsütoplasmas (vähesel määral ka tuuma lokaliseerunud) (tüüp 2).

30

4.3. Potentsiaalsete NLS-de muteerimise mõju EGFP ja Neurl1 NHR1 domeeni sisaldava ühendvalgu lokalisatsioonile primaarsetes neuronites

Et Neurl1 on ekspresseeritud närvirakkudes, analüüsisime potentsiaalsete NLS-de

muteerimise mõju ka neuronites. Selleks valmistasime roti primaarsete neuronite kultuurid.

Teatavasti ei koosne neuraalne kude ainult neuronitest, et teha kindlaks saadud kultuurides

kasvavate rakkude tüüpe viisime läbi immuunotsütokeemilise analüüsi, kus värvisime

gliiarakke ja neuroneid markervalkude järgi. Selleks kasutasime vastavalt gliiarakkudes

ekspresseeritud GFAP-ga ja neuronites ekspresseeritud MAP2-ga seonduvaid antikehi.

Mikroskoopiast selgus, et kultuuris esines vaid üksikuid gliiarakke ning enamikus oli tegemist

neuronitega (joonis 9A).

Transfekteerisime roti primaarsetesse neuronitesse analüüsiks samuti pEGFP-Neurl1-NotIdel

ja pEGFP-Neurl1-NotIdel-NLSmut konstruktid. Võrdluseks uuritud EGFP ja EGFP-NLS

lokaliseerusid oodatavalt, EGFP üle kogu raku ja EGFP-NLS pea täielikult tuuma. Neuronite

puhul lokaliseerus muteeritud NLS järjestusega EGFP-Neurl1-NHR1 valk sarnaselt

metsiktüüpi ühendvalguga, mõlemad olid nii tsütoplasmas kui ka tuumas (joonis 9B). Samuti

võis täheldada ka siin EGFP-Neurl1-NHR1-NLSmut valgu agregeerumist osades neuronites

(joonisel 9B NLSmut 2). Agregeerunud mutante esines harva, aga samas suhteliselt tihemini

kui HEK293 rakkude puhul. Need tulemused näitasid, et arvatavate NLS järjestuste

muteerimine ei takista Neurl1 valgu NHR1 domeeni transportimist tuuma primaarsetes

neuronites.

31

32

Joonis 9. Neuronites lokaliseerub Neurl1 NHR1 tuuma ka siis kui arvatavad NLS järjestused on muteeritud. (A) Rakukultuuris visualiseeriti gliiarakud GFAP-ga seonduvate antikehade abil, MAP2 valgu abil visualiseeriti neuronid ning DAPI-ga DNA värvimise abil rakutuumad. Tulemused näitasid, et rakukultuuris on vaid üksikuid gliiarakke. (B) Primaarsetesse neuronitesse transfekteeriti EGFP, EGFP-NLS, EGFP-Neurl1-NHR1-wt ja EGFP-Neurl1-NHR1-NLSmut kodeerivad konstruktid. Valgud visualiseeriti nende osaks oleva EGFP abil, neuronite tsütoplasma jaoks kasutati MAP2 kaudu visualiseerimist ja tuum visualiseeriti DNA-ga seonduva DAPI abil. Negatiivse kontrollina näitasime, et transfekteerimata rakkudes ei esine EGFP-le vastavat signaali ning MAP2 visualiseerimiseks kasutatud sekundaarne antikeha ei seondu mittespetsiifiliselt raku ühegi osaga. Primaarsetes neuronites esines EGFP üle kogu raku, EGFP-NLS oli enamuses lokaliseerunud tuuma, EGFP-Neurl1-NHR1-wt üle kogu raku ning EGFP-Neurl1-NHR1-NLSmut esines samuti tuumas ja tsütoplasmas (1). Väikese, aga märgatavama osa moodustasid neuronite puhul tsütoplasmas agregeerunud EGFP-Neurl1-NHR1-NLSmut valguga rakud (2). Samas neiski oli näha vähesel määral esinemist tuumas.

33

5. Arutelu

Eelnevalt on näidatud, et NHR1 arvatavad NLS järjestused ei ole vajalikud Neurl1 valgu

lokalisatsiooniks rakutuumas (Taal 2011). Käesolevas uurimistöös üritasime täpsemalt uurida

Neurl1 valgu tuumatranspordi mehhanisme. Näitasime, et arvatavad NLS järjestused valgu

NHR1 domeenis ei ole vajalikud ka iseseisva NHR1 domeeni lokalisatsiooniks tuumas.

Mõlemates kasutatud rakkudes, HEK293 rakkudes ja roti primaarsetes neuronites

lokaliseerusid nii metsiktüüpi kui ka mutantne EGFP ja NHR1 ühendvalk osaliselt tuuma.

Algsele hüpoteesile vastava mudeli kohaselt arvatavad NLS järjestused tõepoolest käituvad

NLS järjestustena ning on vajalikud NHR1 domeeni tuumatranspordil. Selle kohaselt

võimaldab nende muteerimisel terve Neurl1 valgu tuumalokalisatsiooni NHR2 domeen.

Saadud tulemustest võime aga järeldada, et NHR1 domeen sisaldab seni tundmatuid

järjestusi, mis võimaldavad sellel siseneda tuuma. Arvatavate NLS järjestuste mittevajalikkus

ei näita otseselt, et tegemist pole NLS järjestustega – võimalik on ka, et NHR1 domeenis on

mitu struktuuri, mis võimaldavad valgu sisenemist tuuma. NHR1 domeeni tuuma

lokaliseerumist võivad seega võimaldada identifitseerimata NLS järjestused või võib tuuma

sisenemine toimuda mõne ebastandardsema mehhanismi kaudu. Üheks võimaluseks on see, et

NHR1 domeen siseneb tuuma läbi interaktsiooni teiste NLS-i sisaldavate valkudega.

Mutantse vormi ekspressioonil täheldasime osades rakkudes Neurl1 valgu agregeerumist,

millest saame järeldada, et sisse viidud mutatsioon põhjustab tõenäoliselt mõningaid

struktuurilisi muudatusi NHR1 domeenis. Samas ei ole võimalik saadud tulemuste põhjal teha

lõplikke järeldusi nende võimalike muudatuste iseloomu osas, veelgi enam, teada ei ole nende

seos (või selle puudumine) NHR1 domeeni lokalisatsiooniga rakus.

Üldiselt näitasime seega, et Neurl1 valgu NHR1 domeen ei sisene tuuma ainult arvatavate

klassikaliste NLS järjestuste abil. Neurl1 valgu tuumatranspordi mehhanism on järelduvalt

eelnevalt arvatust keerukam. Interaktsioon Importiin-α3-ga viitab aga samas klassikalisele

NLS järjestuse abil toimuvale tuumatranspordile (Taal 2011). Sellest lähtuvalt võib pakkuda

välja, et NHR1 seondub Importiin-α-ga arvatavatest NLS järjestustest erinevate

34

struktuurielementide kaudu – väide, mida kinnitaks improtiinα3 ja muteeritud NHR1 domeeni

interaktsioon.

Lõplikkusele pretendeeriva Neurl1 tuumatranspordi mehhanismide mudeli koostamine eeldab

tulevikus edasistelt uuringutelt mõlema NHR domeeni analüüsi ning tõenäoliselt arvukalt

eksperimente, et kindlaks teha alad valgus, mis on tõepoolest vajalikud Neurl1

lokalisatsiooniks rakutuumas.

35

Kokkuvõte

Neuralized on oluline valk evolutsiooniliselt konserveerunud Notch signaalirajas.

Drosophila’s on ta vajalik selle signaaliraja korrektseks toimimiseks, imetajates pole tema

homoloogide roll aga veel selge.

Eelnevalt on näidatud, et Neurl1 lokaliseerub osaliselt rakutuumas ja interakteerub

klassikalises tuumaimpordi rajas osaleva valguga improtiin-α3. Lisaks on tuvastatud

arvatavad tuumalokalisatsioonisignaalid (NLS) valgu N-terminaalses osas paiknevas NHR1

domeenis, mis aga ei ole vajalikud terve Neurl1 valgu sisenemiseks rakutuuma. Käesoleva

uurimistöö eesmärgiks oli selgitada Neurl1 valgu tuumatranspordi mehhanisme, uurida

lähemalt arvatavate NLS järjestuste olulisust valgu tuumatranspordis.

Uurimistöö eksperimentaalse osa raames valmistati EGFP ja mutantset Neurl1 NHR1

ühendvalku kodeeriv plasmiidne konstrukt ning transfekteeriti see HEK293 rakkudesse ja roti

primaarsetesse neuronitesse; järeldusi võimaldas teha võrdlus EGFP ja metsiktüüpi Neurl1

NHR1 ühendvalguga. Tsütokeemilise analüüsi tulemusena selgus, et need samad arvatavad

NLS järjestused ei ole siiski vajalikud ka üksiku NHR1 domeeni tuuma sisenemiseks. Nii

HEK293 rakkudes kui ka roti primaarsetes neuronites lokaliseerusid mõlemad, metsiktüüpi ja

mutantne ühendvalk osaliselt tuuma. Saadud tulemustest lähtuvalt siseneb Neurl1 tõenäoliselt

tuuma klassikalise tuumatranspordi mehhanismi abil, kuid interaktsioone seda vahendavate

valkudega (sh improtiin-α3-ga) võimaldavad seni tuvastamata struktuurielemendid. Samas ei

ole välistatud ka oodatust kardinaalselt erinevad mehhanismid.

36

Kasutatud kirjandus

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2008). Molecular

Biology of the Cell. Fifth Edition. Garland Science.

Grabher, C., von Boehmer, H., Look, A. T. [joonis 4] (2006). Notch 1 activation in the

molecular pathogenesis of T-cell acute lymphoblastic leukaemia. Nature Reviews Cancer 6:

347-359.

Lai, E. C. (2002). Protein degradation: four E3s for the Notch pathway. Current Biology 12:

R74-R78.

Lai, E. C., Deblandre, G. A., Kintner, C., Rubin, G. M. (2001). Drosophila Neuralized is a

ubiquitin ligase that promotes the internalization and degradation of Delta. Developmental

Cell 1: 783-794.

Pavlopoulos, E., Trifilieff, P., Chevaleyre, V., Fioriti, L., Zairis, S., Pagano, A., Malleret, G.,

Kandel, E. R. (2011). Neuralized1 activates CPEB3: A function for nonproteolytic ubiquitin

in synaptic plasticity and memory storage. Cell 147: 1369-1383.

Rogerdodd. Wikimedia Commons. [joonis 2] Loetud:

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ubiquitylation.svg, 8. veebruar 2012.

—. Wikimedia Commons. [joonis 1] Loetud:

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ubiquitin_cartoon-2-.png, 8. veebruar 2012.

Rullinkov, G., Tamme, R., Sarapuu, A., Laurén, J., Sepp, M., Palm, K., Timmusk, T. (2009).

Neuralized-2: Expression in human and rodents and interaction with Delta-like ligands.

Biochemical and Biophysical Research Communications 389: 420-425.

37

Sepp, M., Kannike, K., Eesmaa, A., Urb, M., Timmusk, T. (2011). Functional diversity of

human basic helix-loop-helix transcription factor TCF4 isoforms generated by alternative 5'

exon usage and splicing. PLoS One 6, 7: e22138.

Sorokin, A. V., Kim, E. R., Ovchinnikov, L. P. (2007). Nucleocytoplasmic transport of

proteins. Biochemistry 72: 1439-1457.

Taal, K. (2011) Nuclear transport of Neuralized-1 is mediated via interaction with Importin a3

(Kpna3). Magistritöö. Tallinn.

Timmusk, T., Palm, K., Belluardo, N., Mudò, G., Neuman, T. (2002). Dendritic localization

of mammalian neuralized mRNA encoding a protein with transcription repression activities.

Molecular and Cellular Neuroscience 20: 649-668.

Weinmaster, G., Fischer, J. A. (2011). Notch ligand ubiquitylation: what is it good for?

Developmental Cell 21: 134-144.

38

Resümee

Neuralized on geen, mis avastati üle kolme aastakümne tagasi ühena neurogeensete geenide

grupist. Need geenid on äädikakärbses (Drosophila melanogaster) vajalikud korrektseks

närvisüsteemi arenguks ning isegi ühe puudumine viib organismi surmani. Tänapäeval on

teada, et kärbses on need osa evolutsiooniliselt kõrgelt konserveerunud Notch signaalirajast.

Samas on Neuralized’i homoloogide roll imetajates jäänud selgusetuks.

Eelnevalt on näidatud, et ühel imetajate homoloogil, Neuralized-like-1 (Neurl1), võib olla roll

tuumas transkriptsioonilise repressorina. Näidatud on, et Neurl1 liigub tuuma ja tsütoplasma

vahel. Siiski ei ole teada selle tuumatranspordi mehhanismid. Aminohappelise järjestuse

põhjal on leitud kaks arvatavat NLS (tuumalokalisatsioonisignaal) järjestust valgu NHR1

(Neuralized Homology Repeat 1) domeenis. Teisalt on aga näidatud, et need järjestused ei ole

vajalikud terve valgu lokalisatsiooniks tuuma.

Käesolevas uurimistöös valmistati EGFP (roheliselt fluorestseeruv valk) ja Neurl1 NHR1

ühendvalku kodeeriv konstrukt, kus arvatavad NLS järjestused asendati mutantsetega.

Metsiktüüpi ja mutantset EGFP-Neurl1-NHR1 ühendvalku kodeerivad konstruktid

transfekteeriti HEK293 rakkudesse ja roti primaarsetesse neuronitesse.

Fluorestsentsmikroskoopiast selgus, et mõlemates rakkudes lokaliseerusid nii metsiktüüpi kui

ka mutantne EGFP-Neurl1-NHR1 ühendvalk osaliselt tuuma. Järelikult ei ole arvatavad NLS

järjestused vajalikud ka üksiku NHR1 domeeni tuuma lokaliseerumiseks.

Seega on tõenäoline, et kuigi Neurl1 siseneb tuuma klassikalise tuumatranspordi mehhanismi

abil, siis interakteeruvad seda vahendavad valgud hetkel identifitseerimata järjestustega.

Samas ei saa välistada, et Neurl1 valgu tuumatransport toimub mõne täiesti erineva

mehhanismi kaudu. Lõplikumaks Neurl1 valgu tuumatranspordi mehhanismide

kirjeldamiseks on vajalik täiendav uurimine.

39

Abstract (Study on Nuclear Transport Mechanisms of

Neurl1 Protein)

Neuralized is a gene discovered over three decades ago, one in a group collectively known as

neurogenic genes, which are necessary for the correct embryonic development of the nervous

system. Consequently, the deficit of even one neurogenic gene has been discovered to be

lethal. It is now known that these genes function in an evolutionally highly conserved cellular

signalling pathway known as Notch. However, these studies were only carried out in

Drosophila melanogaster, in mammals the role of Neuralized homologues has remained

somewhat elusive.

Previous research has shown that one of its mammalian homologues, Neuralized-like-1

(Neurl1) may have a role in the nucleus as a transcriptional repressor. It has been

demonstrated that Neurl1 shuttles between the nucleus and cytoplasm. Nonetheless, it is

important to ascertain the means of its nuclear transport. Results precursory to the given

research have shown two putative NLS (nuclear localization signal) sequences in the protein’s

NHR1 (Neuralized Homology Repeat 1) domain; however, it has also been demonstrated that

these sequences are not necessary for the nuclear localization of the protein as a whole.

In the given study a construct coding EGFP tagged Neurl1 NHR1 protein with mutated

putative NLS sequences was created. Constructs coding EGFP-Neurl1-NHR1 wild type and

mutant proteins respectively were transfected into HEK293 cells and primary rat neurons.

Cytochemistry revealed that in both cell types both EGFP-Neurl1-NHR1 wild type and

mutant proteins partially localized in the nucleus. According to these results the

aforementioned putative NLS sequences are not necessary for the nuclear localization of the

separate NHR1 domain.

Considering the above, the classical nuclear transport pathway is, for Neurl1, most probably

mediated by interactions of transport proteins with currently unidentified sequences in the

Neurl1 protein. Nevertheless, the possibility that the nuclear transport of the protein might

occur via an entirely unknown mechanism cannot be disregarded. Further research is required

to establish any conclusive description of the nuclear transport pathway of Neurl1 protein.