ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN

INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG

HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62.42.01.21

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

Công trình được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà

2. PGS.TS. Lê Văn Sơn

Phản biện 1: ……………………………………….

Phản biện 2: ………………………………………..

Phản biện 3: ……………………………………….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường

Họp tại TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI

NGUYÊN

Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2017

Có thể tìm hiều luận án tại:

1. Thư viện Quốc gia Việt Nam

2. Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên

3. Thư viện Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

Các bài báo

1. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng

Hà, Lê Văn Sơn (2014), “Nghiên cứu biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ

hợp trong vi khuẩn cherichi coli Ro ett -g mi , Tạp chí ho học - Đại

học uốc gi Hà Nội, 30(6S-A), tr. 101-107.

2. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Gi ng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích

Ngọc, Lê Văn Sơn (2014), “Interleukin 7 và v i trò trong hệ thống miễn

dịch ở người , Tạp chí ho học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên,

118(04), tr. 153-156.

3. Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn

(2015), “Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin 7 phục vụ chuyển

gen trong hệ thống thực vật , Tạp chí ho học và Công nghệ - Đại học

Thái Nguyên, 134(04), tr. 25-28.

4. Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn

(2017), “Biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong dòng tế bào thuốc

lá BY-2 , Tạp chí Công nghệ Sinh học, 15(01), tr. 1-8.

5. Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn

(2017), “Biểu hiện tạm thời protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá

(Nicotiana benthamiana domin) bằng phương pháp Agro-Infiltr tion , Tạp

chí Sinh học, 39(02), tr. 232-238, doi: 10.15625/0866-7160/v39n2.9000.

Trình tự gen đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế

6. Hoang, N. H., Ha, C. H., Ngoc, P. B. and Son, L. V. (2017), IL7 human

gene is optimized genetic codes which will be expressed in plants,

GenBank: MF170526.1

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Interleukine là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín

hiệu đƣợc tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò

quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn

dịch ở ngƣời phụ thuộc chủ yếu vào các interleukine, thiếu hụt

interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và thiếu hụt miễn dịch.

Interleukine 7 (hIL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự

tăng trƣởng của các dòng tế bào B và T. Đây là những dòng tế bào có chức

năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con ngƣời, cũng là đích tấn công

của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con ngƣời.

Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học đƣợc

sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị nhƣ các loại hormone, enzyme

tái tổ hợp... Trƣớc đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein

này chủ yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do

nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế,

giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con ngƣời,

nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp đƣợc đặt ra một cách

cấp thiết.

Trong những thập niên gần đây, với những bƣớc tiến lớn trong

lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn

khó khăn nhƣ trƣớc nhờ phƣơng pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện

nay phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng rộng rãi không những để tổng

hợp một số loại protein làm thuốc nhƣ insulin, hormone v.v…. mà còn

để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn

chế hoặc con đƣờng tổng hợp hoá học gặp khó khăn.

Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang đƣợc

quan tâm nghiên cứu vì những ƣu điểm vƣợt trội so với các hệ thống

biểu hiện khác nhƣ chúng có thể sinh trƣởng trên môi trƣờng tƣơng đối

2

đơn giản, protein đƣợc tiết ra môi trƣờng nhiều hơn phần tích luỹ trong

tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ

hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con ngƣời hơn so với các

protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh

và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở ngƣời.

Nhằm mục đích nâng cao chất lƣợng điều trị bệnh theo hƣớng

sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phƣơng pháp

nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và hIL-7 nói riêng một

cách tối ƣu. Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với

phƣơng pháp khả thi, chúng tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài

luận án: “Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong

hệ thống nuôi cấy thực vật”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định đƣợc hệ thống nuôi cấy thực vật biểu hiện tối ƣu

protein hIL-7 tái tổ hợp.

Thu nhận và tinh sạch đƣợc protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống

nuôi cấy thực vật.

3. Nội dung nghiên cứu

Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hiện ở hệ thống thực

vật.

Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp

phù hợp với các hệ thống nuôi cấy thực vật.

Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực

vật: huyền phù, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.

Phân tích, kiểm tra và đánh giá chất lƣợng hIL-7 tái tổ hợp thu

đƣợc qua hệ thống nuôi cấy thực vật.

4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án

4.1. Ý nghĩa lý luận

3

Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về biểu

hiện, sản xuất protein tái tổ hợp dùng trong y học ở thực vật thông qua

biến đổi mã di truyền và các hệ thống nuôi cấy thực vật.

Nội dung luận án có thể đƣợc sử dụng làm tài liệu giảng dạy,

tham khảo cho giảng viên và sinh viên các trƣờng khối khoa học tự

nhiên nói chung và sinh học nói riêng.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Luận án cung cấp quy trình biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ở

các hệ thống nuôi cấy dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, cây thuốc lá

chuyển gen trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích

nuôi cấy thu sinh khối tế bào.

Bƣớc đầu đánh giá đƣợc hoạt tính sinh học của protein hIL-7

tái tổ hợp thu đƣợc sau khi tinh sạch ở các hệ thống nuôi cấy, là tiền đề

cho các nghiên cứu sâu hơn.

5. Đóng góp mới của luận án

Luận án đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector biểu hiện

protein hIL-7 ở tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.

Đã biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế

bào BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen. Trong đó, protein biểu hiện

cao nhất ở cây thuốc lá chuyển gen 5 ngày tuổi với hàm lƣợng 36,7

ng/µg protein tan tổng số, có hoạt tính sinh học cao.

Đây là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam và trên thế giới

về biểu hiện protein hIL-7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật.

6. Cấu trúc của luận án:

Luận án có 157 trang kể cả tài liệu tham khảo đƣợc chia thành

các chƣơng, phần: Mở đầu (3 trang), Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu (25

trang); Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (24 trang);

Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu (48 trang); Chƣơng 4: Bàn luận kết quả

nghiên cứu (8 trang); Kết luận và đề nghị (1 trang); Các công trình

4

công bố liên quan đến luận án (1 trang); Summary (3 trang); Tài liệu

tham khảo (26 trang); Phụ lục (7 trang). Luận án có 10 bảng; 39 hình và

tham khảo 175 tài liệu.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo và tổng kết 175 tài liệu, trong đó có 8 tài

liệu tiếng Việt, 164 tài liệu tiếng Anh và 3 địa chỉ trang web về 3 vấn đề

cơ bản liên quan: (1). Vai trò của cytokine và interleukine 7 trong hệ

miễn dịch ở ngƣời; (2). Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại

cytokine tái tổ hợp trong y học; (3). Nghiên cứu biểu hiện hIL-7 tái tổ

hợp trong hệ thống vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ và cây thuốc lá.

Interleukine là một trong các nhóm chính của cytokine, đóng vai

trò quan trọng nhất trong hệ miễn dịch của con ngƣời. Chúng có chức

năng điều hoà miễn dịch, bao gồm cả phát triển tế bào, sự trƣởng thành,

di chuyển và bám dính. Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích hoạt các

phản ứng miễn dịch của cơ thể (Chad et al., 2010). Interleukine 7 gồm

một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lƣợng phân tử 17,4 kDa và

đƣợc ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu nối

disulfide nội phân tử (Yoseph et al., 2016). Ở ngƣời, gen hIL-7 có kích

thƣớc 33Kb, gồm có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị

trí 8q21.13.

Hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ

hợp đang mở ra một hƣớng điều trị tích cực mới trong y học. Hàng loạt

các cytokine khác nhau đã đƣợc nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm

trong điều trị lâm sàng nhƣ: hIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF,

hIL-11 và EPO (Kwon et al., 2003). Các loại cytokine có vai trò quan

trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, do đó các

hƣớng nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng điều trị của cytokine

nhƣ là một tác nhân dƣợc lý hoặc đích tác động đang đƣợc quan tâm

nghiên cứu. Chính vì lý do đó nên yêu cầu cấp bách đặt ra là phải hoàn

5

thiện các quy trình hệ thống thu nhận cytokine tái tổ hợp nói chung và

interleukine 7 nói riêng, phục vụ trong y học.

Các hệ thống biểu hiện protein thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ: hệ

thống vi khuẩn, hệ thống biểu hiện tế bào huyền phù BY2, hệ thống

biểu hiện rễ tơ và hệ thống biểu hiện tạm thời ở thực vật. Trong đó, các

hệ thống biểu hiện ở thực vật thể hiện khả năng ƣu việt hơn so với các

hệ thống khác do: khả năng tạo sinh khối, khả năng thu nhận protein tái

tổ hợp, ít tốn công chăm sóc v.v… Đặc biệt là các mầm bệnh, virus

thực vật không phải là đối tƣợng gây bệnh cho con ngƣời, nên rất phù

hợp để biểu hiện các loại protein tái tổ hợp của ngƣời phục vụ trong y

học

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. V T LI U

Luận án sử dụng dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum

L. Cv Bright Yellow 2), cây thuốc lá N. benthamiana và N. tabacum

K326 do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học

cung cấp.

Các chủng vi khuẩn E. coli DH-5α, A. tumefaciens, A.

rhizogenes, E.coli Rosetta-gami B của Viện Công nghệ sinh học, Viện

Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt nam cung cấp. Tế bào 2E8 do

Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp. Các vector: pK7WG2D.1,

pCB301, pRTRA 35S-TBAG-100xELP, pENTRTM

221/cal nhận từ

Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Hóa chất, các bộ KIT đƣợc sử dụng của các hãng Fermentas,

Invitrogen, Merck, Sigma, Promega… Các loại enzyme sử dụng của hãng

Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…Các thí nghiệm trong

nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực

6

vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm về

Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam. Luận án hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại và

Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học

Thái Nguyên.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ƣu biểu hiện

protein ở thực vật

Khai thác trình tự nucleotide và trình tự mRNA. Tiến hành thay

các codon hiếm trong gen hIL-7 bằng các codon phổ biến trong thực

vật. Thêm trình tự cmyc, histag, các vị trí nhận biết enzyme giới hạn

vào trình tự. Sử dụng BioEdit kiểm tra trình tự nucleotide và trình tự

acid amin trƣớc và sau khi đổi mã.

2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp

Trong nội dung luận án, chúng tôi thiết kế các vector chuyển

gen: (1). pET32c(+)/IL7; (2). pENTR221/cal/IL7; (3).

pK7WG2D.1/cal/IL7; (4). pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP; (5).

pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.

2.3.3. Phƣơng pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc

lá BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá

Phƣơng pháp chuyển gen vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2 và rễ

tơ thuốc lá và cây thuốc lá đƣợc thực hiện gián tiếp thông qua A.

tumefaciens và A. rhizogene theo phƣơng pháp của Topping (1998)

2.2.4. Nhóm phƣơng pháp phân tích dòng chuyển gen

2.2.4.1. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen

Các chỉ tiêu sinh lý của các dòng tế bào chuyển gen BY2 và rễ tơ

chuyển gen đƣợc đánh giá thông qua các chỉ số khối lƣợng tƣơi và khối

lƣợng khô đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng l ng. Quá trình đánh giá đƣợc

7

thực hiện theo phƣơng pháp của Phạm Bích Ngọc năm 2009 (Ngoc et al.,

2009).

2.2.4.2. Phân tích dòng chuyển gen b ng thuật sinh h c phân t

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR, xác

định protein tái tổ hợp bằng lai miễn dịch Western blot. Phân tích biểu

hiện protein bằng điện di protein theo Laemmli (1970) và Western blot.

Định lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng ELISA theo phƣơng pháp của

Sun và cs (2006). Protein đƣợc tinh sạch theo phƣơng pháp IMAC và

mITC và đƣợc đánh giá hoạt tính sinh học bằng dòng tế bào 2E8.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ƣu biểu hiện ở thực vật

Sử dụng trình tự gen hIL-7 đƣợc công bố trên Ngân hàng Gen

có mã số: J04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở thực vật

(Codon Usage Database) cùng với phần mềm Codon Optimization 2.0

để loại b và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen hIL-7

bằng các codon phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành

phần và trật tự các acid amin. Sử dụng công cụ Graphical Codon Usage

Analyzer kiểm tra mức độ phù hợp của các codon trên gen hIL-7 trƣớc

và sau cải biến mã di truyền. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại b

trình tự ATTTA trên gen hIL-7 đƣợc cho là gây bất ổn trong quá trình

phiên mã mRNA (Hood et al, 2002), kết hợp sử dụng phần mềm của

Invitrogen để giảm thiểu sự hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp.

Kết quả chúng tôi đã thay đổi thành công mã di truyền của gen

hIL-7 với độ tƣơng đồng nucleotide so với trình tự gen gốc là 63,6 %,

độ tƣơng đồng acid amin là 100%. Ngoài ra, các trình tự nhận biết của

enzyme giới hạn NcoI, SacI, HindIII, các trình tự nucleotide mã hóa

cho protein c-myc và epitope his-tag đƣợc thêm vào đầu 5’ và 3’ của

gen hIL-7. Trình tự nucleotide sau khi tối ƣu có kích thƣớc 536bp,

8

đƣợc đặt tổng hợp tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và đƣợc nhân

dòng trong vector pBSK/IL7.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi huẩn, dòng

tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7

Sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI và HindIII để cắt đồng thời

vector tách dòng pBSK/IL7 và vector pET32c(+) để tạo đầu dính sole,

sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.5.A)

Kết quả ở hình 3.5.A cho thấy ở đƣờng chạy 1 thu đƣợc băng

có kích thƣớc khoảng 5,9 kb tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của

vector pET32c(+); tại đƣờng chạy 2 xuất hiện 2 băng có kích thƣớc

khoảng 2,9 kb và 0,53 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pBSK

và gen hIL-7. Ghép nối gen interleukin 7 vào vector pET32c(+) sẽ thu

đƣợc vector tái tổ hợp pET32c(+)/IL7 có kích thƣớc khoảng 6,43 kb và

đƣợc nhân dòng trong E.coli DH5α. Kiểm tra sự có mặt của vector

pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp bằng colony PCR với cặp mồi IL7_F và

IL7_R và bằng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn NcoI và HindIII.

Kết quả trên hình 3.5.B và 3.5.C; ở đƣờng chạy 1 hình 3.5.B

xuất hiện một băng đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 0,53 kb, còn ở đƣờng

chạy 1 hình 3.5.C xuất hiện hai băng có kích thƣớc khoảng 0,53 kb và

5,9 kb. Các kết quả này chứng t vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 đã

đƣợc thiết kế thành công. Cấu trúc này sẽ đƣợc biến nạp vào vi khuẩn

E.coli rosetta gami B để biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp.

9

A B C

Hình 3.3. Hình ảnh điện di

các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pET32c(+)/IL7

(A). Kết quả điện di sản phẩm cắt mở vòng pET32c(+)(đường chạy

1) và vector pBSK/IL7 (đường chạy 2) bằng cặp enzyme NcoI và

HindIII; (B). Kết quả điện di sản phẩm colony PCR pET32c(+)/IL7

bằng cặp mồi IL7_F và IL7_R, (-). Đối chứng âm (pET32c(+)), (+).

Đối chứng dương (pBSK/IL7); (C). Kết quả diện di sản phẩm cắt

vector pET32c(+)/IL7 bằng enzyme cắt giới hạn NcoI và HindIII; M.

Thang DNA chuẩn 1kb.

3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7

Các bƣớc thiết kế vector pENTR221/cal/IL7 tƣơng tự nhƣ mục

3.2.1. Sử dụng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII để tạo đầu dính cho

gen hIL-7 và vector pENTR221 để thực hiện phản ứng lai ghép, chúng

tôi đã thiết kế thành công vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7.

3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7

Chúng tôi thực hiện phản ứng LR giữa plasmid tiếp nhận

pENTR221/cal/IL7 và vector đích pK7WG2D.1 để tạo vector

pK7WG2D.1/cal/IL7 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Gateway. Kết quả chúng

tôi đã thiết kế thành công vector pK7WG2D.1/cal/IL7.

3.2.4. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

10

Các bƣớc thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-

100xELP tƣơng tự nhƣ mục 3.2.1. Sử dụng enzyme BamHI để tạo đầu

dính giữa gen hIL-7 và vector pRTRA, chuẩn bị cho phản ứng lai ghép

với enzyme xúc tác T4 ligase. Vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-

100xELP đƣợc dòng hóa trong E.coli DH5α và A.tumefaciens.

3.2.5. Thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301

đƣợc xử lý đồng thời bằng enzyme cắt giới hạn HindIII và tiến hành lai

ghép dƣới sự xúc tác của enzyme T4 ligase. Kết quả chúng tôi đã thiết

kế thành công vector chuyển gen pCB301/IL7.

3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp

3.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn

Tiến hành nuôi cấy tế bào E. coli rosetta-gami B chứa plasmid

tái tổ hợp trong hai môi trƣờng LB chọn lọc có bổ sung IPTG với các

nồng độ 0,2; 0,4; 0,6 mM ở hai mức nhiệt độ 280C và 37

0C.

Kết quả phân tích protein thể hiện trên hình 3.15, tại các đƣờng

chạy protein của các dòng E. coli rosetta-gami B mang plasmid

pET32c(+)/IL7 cảm ứng IPTG xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 37

kDa tƣơng ứng với kích thƣớc protein hIL-7 dung hợp với Thiodedoxin

(Trx.tag), trình tự mã hóa cmyc-tag và his-tag. Trong khi đó, dòng đối

chứng nuôi cấy ở 370C (đƣờng chạy 1) và nuôi cấy ở 28

0C (đƣờng chạy

5) không biểu hiện protein này.

11

Chúng tôi xử lý các mẫu protein bằng DTT ở các nồng độ và

nhiệt độ khác nhau, sau đó tiến hành lai miễn dịch Western blot để xác

định chính xác protein biểu hiện có đúng là protein mong muốn. Độ

nhạy của phản ứng lai Western blot đƣợc đánh giá bằng đối chứng

dƣơng là protein tái tổ hợp scFv có trình tự c-myc với nồng độ xác định

là 50 ng/µl. Ngoài ra, chúng tôi có thể định lƣợng đƣợc lƣợng protein

hIL-7 có trong mẫu khi so sánh mầu sắc các vạch mẫu với vạch đối

chứng dƣơng. Kết quả thể hiện trên hình 3.16 cho thấy trên các màng

lai, ở đƣờng chạy protein số 2, 3, 4, 5, 6, 7 đều xuất hiện một băng màu

đậm, rõ nét có kích thƣớc đúng nhƣ tính toán lý thuyết, trong khi ở

dòng đối chứng không có protein này.

Hình 3.16. Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan bằng Western blot

(-). Đối chứng âm: mẫu protein không cảm ứng IPTG; 1. Mẫu protein

không xử lý DTT; 2, 3, 4, 5, 6, 7: mẫu protein xử lý DTT ở các điều

Hình 3.15. Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7

từ vi khuẩn E. coli Rosetta gami B nuôi ở 37oC và 28

oC

1 - 4: Nuôi cấy 370C; 1: không bổ sung IPTG, 2: 0,6 mM IPTG, 3: 0,4

mM IPTG, 4: 0,2 mM IPTG; 5 - 8: Muôi cấy 280C; 5: không bổ sung

IPTG, 6: 0,6 mM IPTG, 7: 0,4 mM IPTG, 8: 0,2 mM IPTG; M: thang

protein chuẩn (Fermentas)

12

kiện khác nhau; (+). Đối chứng dương: 150 ng protein scFv; M. Thang

chuẩn protein (Fermentas).

3.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2

Sử dụng các dòng BY2 chuyển gen và một dòng không chuyển

gen (đối chứng âm) sau 12 ngày nuôi cấy để tách protein tan tổng số,

điện di trên gel 12,6% SDS polyacrylamide và tiến hành phản ứng

Western blot để đánh giá chất lƣợng protein thông qua protein c-myc,

phát hiện sự có mặt của protein hIL-7 bằng kháng thể kháng c-Myc. Độ

nhạy của phản ứng Western blot đƣợc đánh giá bằng đối chứng dƣơng

là protein tái tổ hợp scFV có gắn đuôi c-Myc.

Kết quả thể hiện trên hình 3.24 cho thấy, các băng protein ở các

đƣờng chạy rõ, sắc nét chứng t protein thu đƣợc khá sạch, ít bị đứt

gãy. Các dòng BY2 chuyển gen hIL-7 số 2, 3, 32 xuất hiện băng

khoảng 23 kDa. Trong khi đó, dòng số 13, 39 không xuất hiện băng

protein hIL-7 mặc dù kết quả kiểm tra bằng PCR cho kết quả dƣơng

tính; điều này có thể do hiện tƣợng gen chuyển không hoạt động (Sun

et al., 2006).

Hình 3.24. Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp

trong các dòng tế bào huyền phù BY2 bằng Western blot

M. Thang protein chuẩn; (+). Đối chứng dương (protein scFv 150 ng); (-

). Đối chứng âm (dòng tế bào BY2 hoang dại); 1 - 5: các dòng tế bào BY2

13

chuyển gen; Phản ứng lai sử dụng kháng thể anti c- myc

Từ những kết quả trên cho thấy, chúng tôi đã thiết kế và biểu

hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong tế bào huyền phù BY2.

Chúng tôi sử dụng kỹ thuật ELISA để đánh giá gián tiếp mức độ

biểu hiện của protein hIL-7 trong các dòng BY2 chuyển gen dƣơng tính

khi kiểm tra bằng Western blot. Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp gắn

đuôi c-myc đƣợc tính toán dựa trên phƣơng trình đƣờng chuẩn của

protein scFv gắn đuôi c-myc. Kết quả thể hiện trên hình 3.25.

Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp tích luỹ trong các tế bào

huyền phù chuyển gene BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg

protein tan tổng số. Tuy nhiên, mức độ tích luỹ protein hIL-7 tái tổ hợp

còn khá thấp so với protein tổng số.

Hình 3.25. Biểu đồ so sánh hàm lượng

hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2 chuyển gen

2,25

3 3,25

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Dòng 2 Dòng 3 Dòng 32

Hàm

lƣợng hIL

-7

(ng/μg protein tổng số)

Dòng BY2 chuyển gen

14

Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp tích lũy trong các tế bào

huyền phù chuyển gen BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg

protein tan tổng số.

3.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen

Chúng tôi sử dụng A.rhizogenes ATCC15834 để chuyển vector

pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mảnh lá thuốc lá để cảm ứng tạo rễ tơ chuyển

gen. Sau qua trình chọn lọc, kiểm tra trên môi trƣờng chứa kháng sinh

và kỹ thuật PCR, đã chọn đƣợc những dòng rễ tơ sinh trƣởng, phát triển

tốt mang gen chuyển để đánh giá biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp.

Sử dụng kỹ thuật Western blot để phân tích sự biểu hiện của

protein hIL-7 ở 5 dòng rễ tơ chuyển gen. Kết quả thể hiện trên hình

3.30

Kết quả kiểm tra cho thấy, các dòng rễ tơ chuyển gen mã hóa

protein hIL-7 đều xuất hiện một băng kích thƣớc khoảng 23 kDa, tƣơng

ứng với kích thƣớc protein hIL-7 gắn thêm c-myc và histag theo tính toán

lý thuyết. Trong khi ở đƣờng chạy đối chứng âm là dòng rễ tơ không

chuyển gen không xuất hiện băng protein. Điều này cho thấy gen mã hóa

protein hIL-7 đã đƣợc chuyển và biểu hiện thành công trong rễ tơ thuốc

lá.

15

Hình 3.30. Kết quả biểu hiện protein hIL-7 các dòng rễ tơ bằng Western blot

M. Thang protein chuẩn; 1 - 5: dòng rễ tơ chuyển gen; (+). Đối chứng

dương (protein scFv 150 ng), (-). Đối chứng âm: dòng rễ tơ không chuyển

gen. Phản ứng lai sử dụng kháng thể kháng c-myc

Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp ELISA để xác định hàm lƣợng

protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng rễ tơ chuyển gen. Kết quả thể

hiện ở hình 3.31 cho thấy, hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp thu nhận

từ các dòng rễ tơ chuyển gen dao động từ 17,84 ng/µg đến 23,3 ng/µg

23,3

20 22

19,93

17,84

0

5

10

15

20

25

30

Dòng 1 Dòng 2 Dòng 3 Dòng 4 Dòng 5

Hàm

lƣợng hIL

-7

(ng/μg protein tổng số)

Dòng rễ tơ chuyển gen

Hình 3.31. Biểu đồ so sánh hàm lượng

protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển gen

16

protein tan tổng số. Trong đó, biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp cao

nhất là dòng 1, đạt 23,3 ng/µg protein tan tổng số, thấp nhất là dòng 5,

đạt 17,84 ng/µg protein tan tổng số. Đặc biệt, hàm lƣợng protein hIL-7

tái tổ hợp biểu hiện ở dòng 2 và dòng 4 không có sự khác biệt đáng kể.

3.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng

phương pháp Agro-infiltration

Chúng tôi sử dụng chủng A.tumefaciens C58C1/pGV2260

mang vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP để biểu hiện tạm

thời protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng phƣơng pháp

Agro-infiltration. Sau 6 ngày biến nạp, tiến hành thu lá và bảo quản ở -

80oC.

Để kiểm tra sự biểu hiện của protein hIL-7 tái tổ hợp, chúng tôi

tiến hành tách chiết protein tổng số và đo nồng độ theo phƣơng pháp

của Bradford (1976), sau đó sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western

blot trên các vị trí biểu hiện tạm thời ở lá non, lá bánh tẻ và lá già.

Hình 3.35. Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7

trong lá thuốc lá bằng Western blot

M. Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); 1. Lá non, 2.

Lá bánh tẻ, 3. Lá già; (-). Đối chứng âm (lá thuốc lá không chuyển gen)

Kết quả thể hiện trên hình 3.35 cho thấy ở các đƣờng chạy 1, 2, 3

xuất hiện một băng có kích thƣớc khoảng 64 kDa tƣơng ứng với kích

thƣớc protein hIL-7 tái tổ hợp có gắn thêm protein cmyc, histag và ELP;

17

trong khi ở đƣờng chạy đối chứng âm, cây thuốc lá không chuyển gen

không xuất hiện băng này.

3.3.4.4. Phân tích định lượng và tinh sạch protein hIl-7 tái tổ hợp

Sau khi biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong

thuốc lá, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein bằng phƣơng pháp sắc ký

ion cố định kim loại (niken) để tinh sạch và định lƣợng protein hIL-7

tái tổ hợp. Đây là phƣơng pháp hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp

liên kết với his-tag. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên lý histidine tạo

phức hợp với các kim loại hoá trị II (niken) ở nồng độ pH trung tính. Sự

tƣơng tác của protein liên kết his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng

độ pH. Protein đích sau khi liên kết với cột tinh sạch, sẽ đƣợc hoà tan

thu lại bằng cách giảm pH dung dịch hoặc tăng nồng độ của đệm ion

hoặc nồng độ của đệm EDTA hoặc imidazole.

Sau khi tinh sạch, chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của protein

hIL-7 tái tổ hợp bằng điện di SDS-PAGE và phƣơng pháp lai miễn dịch

Western blot. Kết quả thể hiện trên hình 3.34 cho thấy, chúng tôi chỉ

thu đƣợc một băng protein có kích thƣớc khoảng 64 kDa, đúng theo

tính toán lý thuyết.

Hình 3.36. Kết quả tinh sạch và định lượng

protein hIL-7 bằng phương pháp IMAC

(A). Điện di SDS-PAGE: 1A. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A.

Dịch chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3A. Protein hIL-7 sau tinh

64

18

sạch

(B). Kết quả Western blot: 1B. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B.

Dịch chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3B. Protein hIL-7 sau tinh

sạch

(C). Định lượng protein hIL-7 bằng western blot và sử dụng phần mềm

ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200

ng/giếng, 5C. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C.

protein hIL-7 sau tinh sạch (30 µg protein tổng số/giếng).

Sau khi tinh sạch theo phƣơng pháp IMAC, nồng độ protein

tổng số đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp của Bradford và protein

hIL-7 đƣợc định lƣợng bằng phần mềm ImageJ trên màng lai. Kết quả

thu đƣợc 27,86 ng/µg protein tan tổng số. So sánh với một số nghiên

cứu biểu hiện protein tạm thời khác thì sự biểu hiện của protein hIL-7

trong cây thuốc lá N. Benthamiana của chúng tôi là tƣơng đối cao. Kết

quả này cho thấy hiệu quả của phƣơng pháp biểu hiện tạm thời và tinh

sạch protein hIL-7 từ cây thuốc lá N. benthamiana trong thời gian ngắn,

dễ thực hiện. Để có thể thu đƣợc protein hIL-7 tái tổ hợp với hàm lƣợng

cao hơn, chúng tôi tiếp tục định lƣợng và tinh sạch bằng phƣơng pháp

mITC dựa trên đặc tính của sự gắn kết giữa ELP với protein đích hIL-7.

Chúng tôi sử dụng 100 gam lá thuốc lá đã đƣợc biến nạp bằng

phƣơng pháp agroinfiltration để tinh sạch thu nhận protein hIL-7 tái tổ

hợp theo phƣơng pháp mITC.

Kết quả trên hình 3.37 cho thấy, ở đƣờng chạy 3 xuất hiện 2

băng có kích thƣớc khoảng 64 kDa và 130 kDa (trạng thái dimer) của

protein có gắn đuôi ELP; còn ở đƣờng chạy 2 là dịch chiết protein ra

kh i màng lọc sau khi đƣa dịch protein thô ban đầu qua màng không

xuất hiện băng protein nào, điều này chứng t protein IL7 có gắn đuôi

ELP đã đƣợc giữ lại trên màng lai không bị rửa trôi cùng các protein

khác. Ở đƣờng chạy số 1 là dịch chiết sau khi rửa màng bằng nƣớc

19

milipore-Q lạnh ở nồng độ ion thấp chỉ có một băng protein có kích

thƣớc khoảng 64 kDa tƣơng ứng với kích thƣớc protein hIL-7 tái tổ hợp

theo tính toán.

Bảng 3.9. Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 bằng phương pháp mITC

Dịch chiết

protein

Protein

tổng số (mg)

Protein

tái tổ hợp (mg)

Hiệu suất

thu hồi (%)

Độ tinh

sạch (%)

Dịch thô

trƣớc tinh sạch 1634,7 38,3 100 X

Dịch hIL-7

đã tinh sạch 45,8 36,7 95,82 86,3

Từ kết quả xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi

protein hIL-7 bằng phƣơng pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh sạch đạt

86,3%. Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số là

Hình 3.37. Kết quả tinh sạch protein hIL-7 bằng phương pháp mITC

M. Thang protein chuẩn; 1. Protein hIL-7 tinh sạch sau khi rửa

màng bằng nước lạnh; 2. Dịch chiết ra khỏi màng sau khi đưa dịch

thô qua màng; 3. Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh sạch

20

2,34%, kết quả này tƣơng đƣơng với những nghiên cứu trƣớc đó về hàm

lƣợng protein tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số: 2% (Lamphear et

al., 2004), (Streatfield et al., 2002); 2,2% (C.H.Ha et al, 2015); 3% (Gil,

2001).

Hình 3.38. Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng Western blot

1. Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước khi tinh sạch (30 µg/giếng);

2. Protein hIL-7 tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh;

3, 4, 5, 6. Đối chứng dương với các nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng.

Phƣơng pháp gắn kết ELP vào protein đích t ra có nhiều ƣu

điểm nhƣ dễ dàng thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp nhờ tính chất

đặc biệt của ELP, đồng thời hàm lƣợng protein tái tổ hợp thu đƣợc

thƣờng khá cao. Shoj và cộng sự (2009) đã thu nhận đƣợc 200 mg HA/kg

lá tƣơi, Mortimer và cộng sự (2012) cũng thu nhận đƣợc 675 mg HA/kg

lá tƣơi khi sản xuất kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 bằng

phƣơng pháp này. Trong nghiên cứu biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp

gắn kết ELP, chúng tôi cũng đã thu nhận đƣợc 36,7 ng/µg protein tan

tổng số. Kết quả này cho thấy sự biểu hiện tạm thời của protein hIL-7 tái

tổ hợp trong cây thuốc lá N. benthamiana khá cao, là cơ sở để chúng tôi

21

tiến hành sản xuất lƣợng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ cho nghiên

cứu và ứng dụng trong y học.

3.4. Đánh giá hoạt tính sinh h c của protein hIL-7 tái tổ hợp

Để đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 chúng tôi sử

dụng mẫu protein hIL7 biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá bằng phƣơng

pháp agro-infiltration ở các nồng độ hIL-7 là: 0,125 µg/ml; 0,25 µg/ml;

0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 1,5 µg/ml; 2 µg/ml; 2,5 µg/ml đối với khả năng hoạt

hoá tế bào 2E8. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.10 và hình

3.39.

Bảng 3.10. Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng protein interleukin 7

Nồng độ protein hIL-7 Mức độ hoạt hóa tế bào 2E8

(%)

0,125 µg/ml 35,7

0,25 µg/ml 45,3

0,5 µg/ml 53,3

1 µg/ml 63,8

1,5 µg/ml 73,6

2 µg/ml 82,5

2,5 µg/ml 79,3

Giá trị ED50 (g/ml) 0,35

0

20

40

60

80

100

0.125 0 .25 0 .5 1 1 .5 2 2 .5

Protein IL-7 ở

thực vật

Hình 3.39. Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein IL-7

22

Qua bảng 3.10 và hình 3.39 cho thấy, protein hIL-7 tái tổ hợp

đƣợc biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá đã thể hiện hoạt tính sinh học

trong việc hỗ trợ sinh trƣởng và hoạt hoá dòng tế bào 2E8, với khả năng

hoạt hóa đạt 82,5% so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 không bổ

sung hIL-7 vào môi trƣờng nuôi cấy). Ở các nồng độ chất thử hIL-7

tăng dần, % hoạt hóa tế bào của mẫu cũng tăng theo, cho thấy hoạt tính

sinh học của mẫu thử khá ổn định; trong đó, khả năng hoạt hóa cao nhất

tại nồng độ 2 µg/ml là 82,5%. Sau đó khả năng hoạt hóa của các mẫu

không tăng mà lại giảm đi, điều này có thể đƣợc giải thích do protein

hIL-7 khi ở liều lƣợng cao có thể gây ức chế cho sự sinh sản và hoạt

hóa tế bào, thậm chí gây chết cho tế bào.

Qua kết quả trên, có thể bƣớc đầu khẳng định protein hIL-7 tái

tổ hợp có khả năng thể hiện hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở

ra khả năng sản xuất lƣợng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ trong y

học nhằm đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho con ngƣời.

Chƣơng 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Biểu hiện protein interleukin 7 trong E.coli rosetta-gami B

Trong nội dung nghiên cứu của luận án, chúng tôi sử dụng vector

pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp để biểu hiện protein hIL-7 trong vi khuẩn E.coli

Rosetta-gami B dƣới sự điều khiển của promoter T7lac và nhờ hoạt tính

của T7 RNA polymerase của tế bào chủ đƣợc biến đổi bởi phage T7.

Chủng rosetta-gami B mang plasmid pRARE mã hoá cho các tRNAs hiếm

trong chủng K-12 đột biến trxB/gor có khả năng tăng cƣờng sự hình thành

các cầu nối disulfide trong tế bào chất kết hợp với vector biểu hiện pET32c

có chứa đoạn DNA mã hoá cho oligo-histidine (His-tag) hỗ trợ việc phát

hiện và tinh chế protein hIL-7 nhằm thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp có

cấu trúc giống tự nhiên để kiểm tra hoạt động của gen hIL-7 tái tổ hợp

trƣớc khi chuyển vào các hệ thống nuôi cấy thực vật.

23

Khi đƣợc biểu hiện, protein hIL-7 sẽ dung hợp với protein

Thiodedoxin (Trx.Tag) trong pET32c(+) để tăng cƣờng khả năng cuộn, gấp

và biểu hiện dạng tan giúp cho việc thu nhận và tinh sạch protein hIL-7 dễ

dàng.

Khi có quá nhiều protein đƣợc tạo ra thì sẽ hình thành các thể vùi

trong vi khuẩn. Đây là những tinh thể đậm đặc của các protein cuộn gấp sai

không thể hoạt động chức năng. Vì lý do đó, nên chúng tôi sử dụng hệ

thống biểu hiện pET, đây là một trong hai hệ thống biểu hiện thƣờng đƣợc

sử dụng ở E. coli để kiểm soát quá trình biểu hiện protein. Các dòng vector

pET có promoter T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site) và trình tự

kết thúc T7. Việc phiên mã từ promoter T7/lac đòi h i phải có T7 RNA

polymerase. Tế bào chủ E. coli có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase,

nhƣng bị protein lac operon, lacI ức chế kìm hãm biểu hiện gen này. Khi

IPTG đƣợc bổ sung trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp, sẽ cảm ứng

giải phóng lacI ra kh i operator của lac operon và quá trình phiên mã đƣợc

bắt đầu. T7 RNA polymerase đƣợc tạo ra và bám vào promoter T7/lac và

protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất. Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi

đã xác định đƣợc hàm lƣợng IPTG tối ƣu là 0,4mM ở điều kiện nhiệt độ

37oC cho khả năng sản xuất protein hIL-7 tái tổ hợp tốt nhất.

Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã tiến hành thiết kế

vector biểu hiện bao gồm cả trình tự mã hóa protein hIL-7 và trình tự mã

hóa cho thiodedoxin tạo ra protein dung hợp có kích thƣớc khoảng 37kDa

và gần 80 kDa (trạng thái dimer), giúp tăng cƣờng khả năng cuộn gấp tạo

cấu trúc không gian của protein hIL-7 và tăng khả năng tiết ra môi trƣờng

ngoại bào, giúp cho việc thu nhận protein đơn giản hơn.

Tuy nhiên, khi biểu hiện những loại protein sinh vật nhân chuẩn,

đặc biệt là protein ở ngƣời sẽ có những hạn chế nhất định, đặc biệt là ở E.

coli thƣờng lẫn với lipopolysaccharide, một loại nội độc tố ở ngƣời. Vì

vậy, nhiều hệ thống khác đã đƣợc nghiên cứu để thay thế hệ thống biểu

24

hiện ở vi khuẩn, trong đó có các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở

thực vật.

4.2. Biểu hiện protein interleukin 7 trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ

Sử dụng tế bào huyền phù thực vật nhƣ một mô hình sản xuất

các protein tái tổ hợp trong quy mô phòng thí nghiệm ngày càng trở nên

phổ biến. Đặc biệt, protein sản xuất từ dòng tế bào BY-2 có chứa N-

liked glycan có cấu trúc tƣơng tự trong tế bào động vật, điều này làm

tiền đề cho việc thu nhận protein tái tổ hợp có cấu trúc và hoạt tính sinh

học giống tự nhiên.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ

hợp đƣợc biểu hiện trong dòng tế bào BY-2 chỉ đạt 2,25 - 3,25 ng/g

protein tan tổng số, tƣơng đƣơng 0,225 - 0,335% protein tan tổng số.

Hàm lƣợng biểu hiện này còn thấp so với một số nghiên cứu biểu hiện

protein khác trong hệ thống BY-2 nhƣ: P.B. Ngọc (2009) biểu hiện

protein thaumatin I trong tế bào BY2 cho thấy protein thaumatin I tái tổ

hợp tiết ra khoảng 1,024 g/ml môi trƣờng nuôi cấy; La Việt Hồng

(2015), hàm lƣợng protein miraculin tái tổ hợp biểu hiện trong hệ thống

huyền phù BY-2 dao động từ 1,13 - 3,10 ng/g protein tan tổng số, Đào

Thị Sen (2016), hàm lƣợng protein GP5 tái tổ hợp thu nhận đƣợc qua hệ

thống BY2 đạt 3,4% protein tổng số.

4.3. Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 ở cây thuốc lá

Phƣơng pháp này có lợi thế về mức độ biểu hiện protein tái tổ

hợp cao hơn rất nhiều so với phƣơng pháp khác, cũng nhƣ thời gian sản

xuất protein nhanh hơn, không bị ảnh hƣởng bởi vị trí gắn gen trong tế

bào thực vật, đặc biệt không gặp phải vấn đề an toàn sinh thái nhƣ

phƣơng pháp tạo cây chuyển gen.

Trong nghiên cứu của luận án, để tránh gặp phải hiện tƣợng

RNAi có thể làm giảm hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp, chúng tôi đã

biểu hiện đồng thời cả protein đích interleukin 7 và protein hỗ trợ Hc-

25

Pro của virus khoai tây Y nhằm chống lại hiện tƣợng câm gen ở thực

vật bằng cách ngăn cản sự phân giải mRNA và RNA sợi đôi, từ đó

giảm lƣợng siRNA hoặc phá h ng chức năng cắt của enzyme cắt sợi

đôi Dicer và RISC [176]. Kết quả, chúng tôi đã thu đƣợc protein hIL-7

tái tổ hợp biểu hiện ở lá cây thuốc lá với hàm lƣợng khá cao.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1. Mã di truyền của gen hIL-7 đƣợc thay đổi phù hợp với hệ

thống biểu hiện ở thực vật với độ tƣơng đồng nucleotide so với trình tự

gen hIL-7 gốc là 63,6 % và độ tƣơng đồng acid amin là 100%.

2. Đã thiết kế thành công các cấu trúc vector chuyển gen

pET32c(+)/IL7; pENTR221/cal/IL7; pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA

35S/IL7-histag-cmyc-100xELP; pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP

phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế

bào huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá để biểu hiện protein

hIL-7 tái tổ hợp.

3. Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp cao nhất đạt 36,7 ng/µg

protein tan tổng số ở hệ thống biểu hiện tạm thời; thấp nhất đạt 2,25

ng/µg protein tan tổng số trong hệ thống nuôi cấy tế bào BY2.

4. Hoạt tính sinh học của protein hIL-7 thu nhận qua hệ thống

biểu hiện tạm thời đạt 82,5% ở nồng độ 2 µg/ml.

2. Đề nghị

1. Tiếp tục thử nghiệm protein hIL-7 tái tổ hợp đã tinh sạch ở

mức độ động vật thí nghiệm và trên lâm sàng nhằm đánh giá sâu hơn

hoạt tính sinh học của protein hIL-7 trƣớc khi sản xuất trên quy mô lớn.

2. Nghiên cứu tối ƣu các hệ thống biểu hiện dòng tế bào BY2,

rễ tơ thuốc lá nhằm tận dụng các ƣu điểm của từng hệ thống để nâng

cao hiệu suất sản xuất protein hIL-7. Đồng thời nghiên cứu biểu hiện

26

trên một số loài thực vật khác để làm phong phú nguồn nguyên liệu

tổng hợp protein hIL-7 tái tổ hợp.