NGHIÊN CỨU CỤ THỂ VỀ CHẤT LỎNG SIÊU TỚI HẠN

Siêu tới hạn ( SFE ) là phương pháp chiết sử dụng 1 dạng dung

môi đặc biệt. Dung môi này ở trạng thái siêu tới hạn, được tạo ra ở

một nhiệt độ và áp suất lớn hơn điểm tới hạn .

Ở trạng thái siêu tới hạn, dung môi này:

- Không còn ở thể lỏng ( do nhiệt độ cao )

- Nhưng vẫn chưa thành thể khí ( do áp suất cao )

- Có độ nhớt thấp hơn phase lỏng ( dể xâm nhập vào mẫu )

- Có khả năng chuyển khối lớn hơn phase khí ( chiết xuất

được cạn kiệt hoạt chất )

Dung môi thông dụng nhất: Dioxytcarbon CO2 ( không phân

cực ) điểm siêu tới hạn ở 310C/73 atm nên dể đạt , dể duy trì. Dể

áp dụng ở quy mô công nghiệp, không cháy nổ, an toàn, thân thiện

với môi trường.

Lưu chất siêu tới hạn được ứng dụng trong rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực khác nhau như trong lĩnh vực môi trường, thực

phẩm, trong công nghiệp, trong y học…

Ứng dụng của dung môi siêu tới hạn

- Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn: (supercritical fluid extraction

- SFE) Chất lỏng siêu tới hạn được sử dụng để trích ly các hợp

chất dầu dễ bay hơi, các hợp chất thơm và các nguyên liệu thô ban

đầu trong ngành mỹ phẩm (như nước hoa) đồng thời ko gây hại

cũng như biến đổi mùi của nước hoa. Trong phòng thí nghiệm,

CO2 siêu tới hạn được sử dụng như một dung môi trích ly. Chẳng

hạn như xác định tổng hàm lượng hydrocacbon thu hồi từ mẫu

rắn, chất cặn, bụi tro và nhiều cái khác cũng như kiểm tra các

hydrocacbon vòng thơm PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbon)

trong chất rắn và thải rắn. Dòng siêu tới hạn cũng áp dụng để trích

ly hàm lượng hydrocacbon trong nước.

- Cắt phân đoạn (supercritical fluid fractionation – SFF): từ hỗn

hợp lỏng. Ngày nay người ta ứng dụng để ly trích hương liệu từ

dịch nhiều thành phần được chưng cất. Hoặc dùng để tách lipid

phân cực hay những polyme.

- Sắc ký lỏng siêu tới hạn (Prerarative scale supercritical fluid

chromatography- PSFC): dùng để tách phân đoạn sau cùng gồm

những chất có cấu trúc rất giống nhau.

- Được sử dụng như một polymer dạng xốp : CO2 siêu tới hạn

được sử dụng trong polymer dạng xốp. CO2 siêu tới hạn được xử

lý cùng với polymer ở trạng thái ổn định sau đó giảm áp suất và

nhiệt độ thì CO2 sẽ nhanh chóng giãn ra và để lại các lỗ xốp trong

polymer tạo thành polymer xốp. Các nhà nghiên cứu vẫn đang tiến

hành sản xuất polymer xốp với kích thước lỗ xốp ở dạng vi tế bào

đi từ CO2

- CO2 siêu tới hạn được sử dụng tăng cường khả năng thu hồi dầu

trong giai đoạn kết thúc quá trình thu hồi.

- Phản ứng (supercritical fluid reactions – SFR): lưu chất siêu tới

hạn có thể xúc tác các phản ứng tổng hợp, nhất là phản ứng

hydrogen hóa.

- Làm khô và sạch : CO2 siêu tới hạn cũng được dùng để làm sạch

quần áo thay cho PCE (perchloroethylene) hay là nước . Phương

pháp mới này đã được phát hiện và thương mại hoá bởi tiến sĩ

Joseph DeSimone,và các chuyên gia và kỹ sư hoá học ở trường

North Carolina State University và University of North Carolina,

Chapel Hill.

Nghiên cứu chiết tách một số chế phẩm thiên nhiên có

giá trị kinh tế cao bằng CO2 lỏng ở trạng thái siêu tới hạn

1 Đối tượng nghiên cứu

1.1Lá chè xanh, Camellia sinensis (L.) Kuntze, Theaceae

Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu là chè thành phẩm

mua của công ty xuất nhập khẩu Hà Nội.

Đặc điểm nguyên liệu: Sản phẩm mua được là “Chè xanh loại

F”, thành phần chủ yếu từ lá 3 và 4, mảnh chè có kích thước 0,5

- 1,5 mm. Độ ẩm nhỏ hơn 4,5 % theo quy định đối với “Chè

xanh loại F” của công ty

1.2 Hoa bưởi, Citrus maxima (Burn.) Merrill, Rutaceae

Đặc điểm nguyên liệu: Hoa bưởi ở dạng bắt đầu hé nở, các cáng

hoa được giữ nguyên vẹn, mẫu hoa ít dập nát để tránh mất tinh

dầu, độ ẩm trung bình 78,4 %.

1.3 Rễ Vetiver, Vetiveria zizanioides (L.) Nash., Poaceae

Đặc điểm nguyên liệu: Rễ Vetiver sau khi thu hoach xử lý bằng

cách phơi trong bong râm mát. Chiều dài của rễ từ 20-30cm, rêz có

màu nâu hơi ngả trắng.

1.4 Hoa Nhài, Jasminum sambac (L.) Ait., Oleaceae

Đặc điểm nguyên liệu: Hoa bắt đầu hé nở, cánh hoa được giữ

nguyên vẹn không bị dập nát.

2 Thiết bị và phương pháp nghiên cứu

2.1 Nghiên cứu kỹ thuật chiết mẫu thực vật bằng SCO2

a/ Thiết bị SFT-250

Hình 2.1: Ảnh chụp thiết bị SFT-250

b/ Nguyên lý hoạt động

Chu trình trạng thái của CO2 trong quá trình chiết

Mẫu được sơ chế và nghiền rồi cho vào bình chiết. Bình chiết

được lót

Màng lọc cả phần đỉnh và phần đáy để tránh việc các hạt nhỏ

có thể lọt vào đường ống dẫn dung môi.

Khí CO2 từ bình khí (45 - 55 bar) được dẫn qua cột than

hoạt tính và qua màng lọc parafin để loại bỏ tạp chất và tách nước.

Sau đó, khí CO2 được đưa vào hóa lỏng tại thiết bị làm lạnh, nhiệt

độ CO2 sau khi ngưng tụ khoảng 00C. Trước khi dưa vào bình

chứa, CO2 lỏng có thể được trộn them các dung môi hỗ trợ khác

như etanol, methanol…để tạo thành dung môi mới theo yêu cầu

công nghệ. Khí CO2 lúc ban đầu trong bình chứa ở trạng thái I

(hình 2.3), thường là áp suất trong khoảng 45-55bar, nhiệt độ 12-

200C. Khi được hạ nhiệt độ ở điều kiện dẳng áp từ trạng thái 1

sang trạng thái 2 là trạng thái CO2 ở thể lỏng trong bình chứa CO2

lỏng. CO2 ở dạng lỏng có thể pha trộn với dung môi dễ dàng.

Quan trọng hơn là có thể sử dụng bơm cao áp để nén lên áp suất

cao và điều chỉnh lưu lượng vào thiết bị thuận lợi.

Từ bình chứa, CO2 lỏng được bơm qua van điều chỉnh lưu

lượng vào bộ phận trao đổi nhiệt để điều chỉnh tỷ trọng và độ nhớt

phù hợp với yêu cầu công nghệ. Dòng CO2 lỏng từ trạng thái 3

được giữ ở điều kiện đẳng áp và tăng nhiệt độ dần dần để chuyển

CO2 lỏng sang trạng thái siêu tới hạn 4.

Trong suốt quá trình chiết, nhiệt độ và áp suất của bình chiết

luôn luôn được điều chỉnh để giữ ổn định. Quá trình chiết nguyên

liệu thực vật bằng CO2 siêu tới hạn có thể thực hiện liên tục hoặc

gián đoạn tùy theo yêu cầu công nghệ.

Kết thúc quá trình tách chiết, dịch chiết được dẫn vào bình phân

tách. Tại đây quá trình tách chất tan ra khỏi dung môi thành những

phân đoạn riêng được thực hiện bằng cách thay đổi các thong số

áp suất và nhiệt độ. từ trạng thái 4 trở về trạng thái 5 là quá trình

giảm áp. Khi dịch chiết vào bình tách (5-1) để tạo các phân đoạn

khác nhau thì có thể chọn các giá trị áp suất P và nhiệt độ thích

hợp.

c/ Tối ưu hóa các điều kiện công nghệ chiết bằng CO2 theo

quy hoạch hóa thực nghiệm

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm

của quá trình chiết xuất:

-Tình trạng mẫu: thời gian bảo quản mẫu trước khi chiết, kích

thước mảnh nguyên liệu của mẫu

-Nồng độ co-solvent trong CO2

- Thời gian của quá trình tiến hành chiết xuất

- Tỷ lệ theo khối lượng giữa dung môi SCO2 và nguyên liệu

thực vật

3. Chiết xuất Quercetin bằng CO2 siêu tới hạn

Quercetin được nghiên cứu bởi Caltagirone rằng quercetin và

apigenin ức chế sự tăng trưởng, việc xâm lấn và tiềm năng di căn

của khối u ác tính. Quercetin có tiềm năng để trở thành một liệu

pháp hóa trị ung thư tuyến tiền liệt như báo cáo của Xing (2001).

Flavonols này cũng được xem là có chức năng chống oxy hóa. Có

hai nhóm chất chống oxy hóa chính: tổng hợp và tự nhiên. Một

trong các xu hướng quan trọng nhất trong ngành công nghiệp thực

phẩm hiện nay là nhu cầu tìm về và sử dụng các chất chống oxy

hoá tự nhiên. Chúng an toàn hơn, ít tác dụng phụ và ít độc tính hơn

các chất chống oxy hoá tổng hợp.

Củ hành chứa rất nhiều quercetin glucosides (quercetin-3,4'-

diglucoside và quercetin-4'-monoglucoside). Lớp vỏ ngoài cùng

của củ hành chuyển sang màu nâu và khô trong quá trình già đi, và

các glycosides của quercetin chuyển dạng thành quercetin tự do.

Herrmann (1976) cũng cho rằng trong củ hành khô chứa chủ yếu là

dạng quercetin tự do hơn là dạng glycoside. Theo Bilyk er al.

(1984) thì lớp vỏ khô phía ngoài có nhiều quercetin hơn lớp bên

trong ở tất cả tám giống hành được nghiên cứu. Giống cao nhất

chứa tới 34,15g quercetin/ kg vỏ hành khô. Các giống khác chứa từ

1,14 – 16,53g quercetin/kg [11].

Chiết xuất flavonols từ mô hành trong các nghiên cứu ở trên

được thực hiện bằng cách chiết với dung môi methanol. Nhưng

trong công nghiệp vấn đề phát sinh với kỹ thuật này là phải loại bỏ

dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý chất thải

methanol, độc tính của methanol còn lẫn trong sản phẩm,…. Do

đó, phương pháp chiết quercetin một cách nhanh chóng, rẽ tiền và

ít độc tính là một yêu cầu cấp thiết. Chiết xuất bằng chất lỏng siêu

tới hạn có nhiều lợi thế hơn các phương pháp tách chiết dung môi

lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải thiện, tự động hóa

và thân thiện với môi trường.

Phương pháp này được thực hiện tại đại học bang Michigan của

Mỹ năm 2003, sử dụng CO2 làm chất lỏng siêu tới hạn.

3.1 Nguyên liệu và chất chuẩn:

- Carbon dioxide công nghiệp (CO2, BOC gases, Murray Hill,

NJ) được sử dụng như một chất lỏng siêu tới hạn (SF).

- Hành đỏ và hành vàng được lấy từ các trang trại Muck (Đại

học bang Michigan, East Lansing, MI). Để bảo vệ nguyên liệu

trong giai đoạn nghiên cứu hành được lưu trữ tại – 20oC.

- Ethyl alcohol mua từ Pharmco (Brookfield, CT).

- Phosphoric acid 86,3% cung cấp bởi J.T. Baker (Phillisburg,

NJ).

- Quercetin chuẩn được cung cấp bởi Sigma (St Louis, MO).

3.2 Trang thiết bị:

. Sơ đồ thiết bị chiết quercetin bằng Carbon Dioxide siêu tới hạn.

Chú thích: 1. Bình chứa CO2

2. Máy nén cao áp

3. Bình chứa khí nén

4,7. Máy đo áp suất

5,10 Điều khiển áp suất phía trước

8. Piston bơm,

9. Hệ thống cung cấp nhiệt

11. Van micrometering

12. Nơi thu mẫu

13. Đồng hồ đo thể tích khí

TC: temperature control (điều khiển nhiệt độ)

3.3 Quá trình chiết xuất:

Chuẩn bị mẫu: lớp vỏ củ hành được bốc tách bằng tay, loại bỏ

những phần hư hỏng và cắt thành mảnh nhỏ khoảng 0,5 0,5 inch.

Quy trình chiết xuất: áp suất và nhiệt độ được cài đặt ở 5700 psi

và 40oC. Phải mất từ 25 – 30 phút để đạt được các điều kiện trên.

Bình chiết được gia nhiệt 24h trước khi lấy dịch chiết để thống

nhất thời gian chiết giữa các mẫu.

Hành tây thái nhỏ và ethanol 5% (nồng độ phân tử so với tổng

số mol CO2 sử dụng để tạo áp lực cho hệ thống) được thêm vào

bình trước khi nó được đóng lại. Máy bơm được cài đặt 5 ml/phút.

Khi các điều kiện mong muốn đạt tới, các van micrometering

được mở, CO2 tương đương 15 L khí nén (khoảng 4% tổng số CO2

chiếm thể tích bên trong bình chiết) đi qua khay để lấy mẫu (nhanh

nhất có thể để duy trì chế độ tĩnh), sau đó các van micrometering

được đóng lại, thay các chai thuỷ tinh đựng mẫu mới. Quá trình

này kéo dài khoảng thời gian từ 10-18 phút. Sau đó, mẫu tiếp theo

được lấy một lần nữa với việc mở van micrometering. Mỗi mẫu

chiết 10 lần và chiết với 5 mẫu khác nhau.

Các thông số sắc ký:

- Pha động: dung dịch acid phosphoric [0,5% (v/v)] - methanol

(2:3 (v/v))

- Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 280 nm

- Thời gian phân tích: 10-15 phút cho mỗi mẫu

Quercetin tự do đã được chiết xuất từ vỏ củ hành đỏ và vàng, bằng

cách sử dụng CO2 siêu tới hạn như một dung môi và ethanol như

một chất mang.

3.4 Kết quả

Bảng 2.1. Kết quả chiết quercetin của giống hành vàng và giống hành

đỏ.

Mẫu

số

Thời

gian

Nồng

độ

Tổng

lượng

Tỉ lệ µg

Querce

số g

quercet

Khối

lượng

%

Ethano

chiết

(phú

t)

(µg/

ml)

querce

tin (µg)

tin

/ Lít

CO2

in/ kg

vỏ hành

vỏ

hành

l (nồng

độ

phần

mol)

Hành đỏ

1 145 0,037 313 2,09 0,027 11,8 7,09

2 143 0,037 323 2,09 0,027 13,9 7,78

3 152 0,035 291 1,94 0,023 12,8 6,80

4 152 0,029 287 1,91 0,024 10,5 7,78

5 157 0,029 226 1,51 0,019 12,0 7,78

Trung

bình150 0,034 288 1,91 0,024 12,2 7,45

Hành vàng

1 156 0,015 193 1,27 0,022 8,6 7,69

2 151 0,016 201 1,32 0,025 8,1 7,69

3 159 0,020 225 1,46 0,023 9,6 8,17

4 164 0,020 149 0,99 0,018 5,8 7,69

5 150 0,014 101 0,67 0,012 8,2 7,69

Trung

bình156 0,017 174 1,14 0,020 8,1 7,79

Quercetin tự do đã được chiết xuất từ vỏ củ hành đỏ và vàng,

bằng cách sử dụng CO2 siêu tới hạn như một dung môi và ethanol

như một chất mang. Khối lượng quercetin tự do và thể tích ethanol

thu được trong mỗi ống thu tỷ lệ thuận với nhau.

Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp thay thế cho

phương pháp chiết rắn -lỏng thông thường để chiết quercetin. Tuy

nhiên, trong tương lai cần chú ý nhiều hơn các hợp chất tương tự

khác có trong hành có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và

hiệu suất chiết.

4. Chiết xuất Quercetin bằng nước siêu tới hạn

Phương pháp này được thực hiện tại đại học Ewha womans Hàn

Quốc năm 2010, sử dụng nước làm chất lỏng siêu tới hạn.

4.1 Nguyên liệu và thiết bị:

Chuẩn bị mẫu thử: củ hành tây được lấy từ Uiseong,

Gyeongsangbuk-do, Hàn Quốc, chỉ những củ có bao phủ bên ngoài

lớp vỏ màu da cam mới được sử dụng. Vỏ củ hành tây được sấy

khô với không khí nóng ở 60oC trong 10 giờ và sau đó cắt thành

miếng (<10 mm) sử dụng một máy trộn tốc độ cao (Blender

7012S, Waring Co., Torrington, CT, USA). Tất cả các mẫu được

lưu trữ trong tủ lạnh duy trì ở 4oC. Các mảnh vỏ hành và

diatomaceous earth (DE, tảo cát trái đất) (ASE® Prep DE,

DIONEX Co., Sunnyvale, CA, USA) được pha trộn và cho vào tế

bào chiết thép không gỉ 34 ml (DIONEX Co.) có chứa giấy lọc

cellulose (30 mm, DIONEX Co.) như ở hình 2.5.

Thiết bị: trình bày ở hình 2.5.

Hình 2.5. Sơ đồ chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn

4. 2Quá trình chiết xuất:

Chiết bằng nước siêu tới hạn:

Việc chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng một dung môi

nhanh (100 ASE, Công ty DIONEX) với nước Milli-Q (MR-

RO800, Công ty TNHH Mirae ST, An Dương, Hàn Quốc) như là

dung môi duy nhất. Vỏ hành tây (1-2 g) và DE được trộn tỷ lệ hỗn

hợp giữa 0,5:3,5 và 02:02. Quá trình chiết xuất được thực hiện như

hình 2.5.

Mẫu này được nạp vào tế bào chiết thép không gỉ và điền đầy

dung môi trong khoảng 1 phút, tăng áp suất trong 5 phút. Sau khi

áp suất đạt 90 bar, tế bào chiết được cung cấp nhiệt (tượng trưng

cho thời gian chiết xuất) trong khi áp suất được duy trì ở 90-131

bar, nhiệt độ chiết xuất từ 100-190oC.

Tế bào chiết này có thể được rữa sạch dung môi qua các đường

bơm mẫu trong vòng 30s. Việc rữa tế bào chiết được thực hiện

khoảng 1-2 phút giữa các lần chiết xuất với khí nitơ.

Dịch chiết được thu vào một lọ thủy tinh (40-50 ml) đã biết khối

lượng.

4.3 Kết quả chiết xuất bằng nước siêu tới hạn:

Hiệu quả chiết của SWE được đánh giá bằng cách so sánh khối

lượng quercetin chiết được (mg/g vỏ củ hành) và % quercetin chiết

được của từ vỏ củ hành qua các lần chiết. SWE được thực ở nhiệt

độ là 165oC, thời gian 15 phút, tỷ lệ hỗn hợp vỏ củ hành và DE là

1,5:2,5 cho kết quả như bảng sau:

Bảng 2.2. Hiệu suất chiết và độ phục hồi của SWE

Số lần

chiét

Năng suất (mg/g vỏ củ

hành)aĐộ phục hồi (%)b

1 16,29 ± 0,75 92,40

2 1,28 ± 0,11 7,26

3 0,06 ± 0,02 0,34

4 Ndc 0

5 Nd 0

Tổng 17,63 ± 0,87 100

cộnga Năng suất (mg/g vỏ củ hành). Mỗi thí nghiệm được thực hiện

3 lần, dữ liệu thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch

chuẩnb Độ phục hồi (%) = năng suất/ tổng lượng quercetin chiết

được bởi SWEc Không phát hiện

Ngoài ra, thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE

được so sánh với nguyên liệu ban đầu (Bảng 2.3)

Bảng 2.3. Thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE

và nguyên liệu vỏ củ hành ban đầu.

ChấtVỏ củ

hành

Chiết xuất của

SWEa

Carbohydrate (%)

Protein (%)

Lipids (%)

Ash (%)

Moisture (%)

Quercetin (mg/g vỏ củ hành)

Quercetin-40-glucoside (mg/g

onion skin)

Kempherol (mg/g vỏ củ hành)

Isorahmnetin (mg/g vỏ củ hành)

47,63 ±

0,87b

3,98 ± 0,44

5,22 ± 0,59

7,10 ± 0,61

4,81 ± 0,42

17,63 ±

0,87

3,72 ± 0,09

0,88 ± 0,23

13,24 ± 0,62

1,14 ± 0,19

1,68 ± 0,12

2,10 ± 0,076

9,42 ± 1,63

16,29 ± 0,75

3,15 ± 0,60

0,68 ± 0,13

0,54 ± 0,09

0,58 ± 0,11

Rutin (mg/g vỏ củ hành)0,74 ± 0,18

0,93 ± 0,15a SWE được thực ở nhiệt độ là 165oC, thời gian 15 phút, tỷ lệ hỗn

hợp vỏ củ hành và DE là 1,5:2,5b Dữ liệu thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Kết quả trên cho thấy các thành phần hóa học của chiết xuất

SWE giảm đáng kể so với nguyên liệu ban đầu. Tuy nhiên, đối với

flavonoid, chiết xuất bao gồm một lượng lớn quercetin (16,29 ±

0,75 mg/g vỏ củ hành), một lượng nhỏ quercetin-4’-glucoside

(3,15 ± 0,60 mg/g vỏ củ hành), và có dấu vết chất flavonoid khác.

Kết quả này chỉ ra rằng quercetin và quercetin-4’-glucoside chiếm

khoảng 99% tổng lượng flavonoid có trong chiết xuất và khoảng

92,40% tổng lượng quercetin so với nguyên liệu ban đầu. Các kết

quả trong nghiên cứu này chứng minh rằng SWE là một phương

pháp rất hiệu quả để chiết flavonol quercetin và do đó nước siêu

tới hạn là giải pháp tuyệt vời để thay thế dung môi hữu cơ, góp

phần nâng cao hiệu quả chiết xuất và thân thiện với môi trường.