Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản

8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản

http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-dinh-luong-dong-phan-doi-quang-cua-atenolol-bang 1/97

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜ NG ĐẠI HỌC DƯỢ C HÀ NỘI

NGÔ MINH THÚY

NGHIÊN CỨ U ĐỊNH LƯỢ NGĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA

ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢ C HỌC

HÀ NỘI 2014

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜ NG ĐẠI HỌC DƯỢ C HÀ NỘI

NGÔ MINH THÚY

NGHIÊN CỨ U ĐỊNH LƯỢ NG

ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦAATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢ C HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤTMÃ SỐ: 60 72 04 10

Ngườ i hướ ng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều AnhTh.S NCS Tạ Mạnh Hùng

HÀ NỘI 2014





LỜ I CẢM Ơ N

Vớ i lòng kính trọng và biết ơ n sâu sắc, em xin gửi lờ i cảm ơ n tớ i PGS.TS.

Nguyễn Thị Kiều Anh - Phòng Quả n lý khoa họ c - Trườ ng Đại họ c Dượ c Hà N ội,

Th.S NCS. Tạ Mạnh Hùng - Việ n Kiể m nghiệ m thuố c Trung ươ ng, đã tận tình

hướ ng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.

Em xin gửi lờ i cảm ơ n đến Th.S Vũ Ngân Bình và các thầy cô, anh/ chị kỹ

thuật viên tại Bộ môn Hóa phân tích và độ c chấ t- Trườ ng Đại họ c Dượ c Hà N ội

cũng như ban lãnh đạo và toàn thể anh/ chị cán b, công nhân viên tại Labo Hóa –

Việ n Kiể m nghiệ m an toàn vệ sinh thự c phẩ m quố c gia đã tạo đi!u kiện t"t nh#t v!

cơ s$ vật ch#t để em hoàn thành luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơ n các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học

và các thầy cô giáo Trườ ng Đại học Dư% c Hà Ni đã truy!n đạt cho em nh&ng kiến

th'c, kinh nghiệm quý báu trong su"t thờ i gian em học tập tại trườ ng.

Cu"i cùng, em xin cảm ơ n gia đ ình và bạn bè, nh&ng ngườ i luôn đng viên,

khích lệ và tạo đng lực cho em trong su"t quá trình học tập và thực hiện đ! tài.

Hà Ni, ngày 1 tháng 10 năm 2014

Học viên

DS. Ngô Minh Thúy





MỤC LỤC

L(I C)M *N

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CH+ VIẾT T,T

DANH MỤC CÁC B)NG

DANH MỤC CÁC HÌNH V- VÀ Đ. TH/

Đ0T VẤN Đ1 ............................................................................................................... 1

CH2*NG 1: T3NG QUAN .......................................................................................... 3

1.1. T3NG QUAN V1 ATENOLOL ............................................................................. 3

1.1.1. Tính ch#t .......................................................................................................... 3

1.1.2 Dư% c lý và cơ chế tác d4ng ............................................................................... 3

1.2 T3NG QUAN V1 K5 THU6T ĐIỆN DI MAO QU)N ......................................... 5

1.2.1 Khái niệm ......................................................................................................... 5

1.2.2 Nguyên lý c7a quá trình điện di mao quản ........................................................ 6

1.2.3 Điện di mao quản vùng ..................................................................................... 7

1.3 VÀI NÉT V1 PHÂN TÍCH Đ.NG PHÂN QUANG H8C ..................................... 9

1.3.1 Đ9ng phân quang học ....................................................................................... 9

1.3.2 Phươ ng pháp phân tách đ9ng phân đ"i quang ................................................... 9

1.3.2.1 Phươ ng pháp phân tách đ9ng phân đ"i quang gián tiếp .................................. 9

1.3.2.2 Phươ ng pháp phân tách đ9ng phân đ"i quang trực tiếp .................................. 10

1.3.3 : ng d4ng điện di mao quản (CE) trong phân tích đ9ng phân quang học ........... 12

1.4 TÁCH Đ.NG PHÂN ĐỐI QUANG B;NG CE S< DỤNG CYCLODEXTRINLÀM TÁC NHÂN CH8N L8C ĐỐI QUANG ............................................................. 13

1.4.1 T=ng quan v! cyclodextrin ................................................................................ 13

1.4.2 Tách đ9ng phân đ"i quang b>ng CE sử d4ng cyclodextrin là tác nhân chọn lọcđ"i quang ................................................................................................................... 15

1.5 MỘT SỐ NGHIÊN C: U PHÂN TÍCH Đ.NG PHÂN ĐỐI QUANG C?AATENOLOL .................................................................................................................. 16

1.5.1 Nghiên c'u trong nướ c ..................................................................................... 16

1.5.2 Nghiên c'u trên thế giớ i ................................................................................... 17





CH2*NG 2: ĐỐI T2@NG VÀ PH2*NG PHÁP NGHIÊN C: U ............................... 20

2.1 ĐỐI T2@NG NGHIÊN C: U, HÓA CHẤT, TRANG THIẾT B/ ............................ 20

2.1.1 Đ"i tư% ng nghiên c'u ...................................................................................... 20

2.1.2 Hóa ch#t, trang thiết bị ...................................................................................... 20

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN C: U .................................................................................... 21

2.2.1 Hoàn thiện phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol b>ngđiện di mao quản ....................................................................................................... 21

2.2.2 ThAm định phươ ng pháp phân tích .................................................................... 21

2.2.3 : ng d4ng .......................................................................................................... 22

2.3 PH2*NG PHÁP NGHIÊN C: U ............................................................................ 22

2.3.1 ChuAn bị các dung dịch chuAn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc ........ 22

2.3.2 Khảo sát và lựa chọn đi!u kiện điện di ............................................................ 23

2.3.3 ThAm định phươ ng pháp phân tích .................................................................... 24

2.3.4 : ng d4ng .......................................................................................................... 26

2.3.5 Phươ ng pháp xử lý s" liệu................................................................................. 27

CH2*NG 3: KẾT QU) NGHIÊN C: U....................................................................... 28

3.1 KH)O SÁT VÀ LB A CH8N ĐI1U KIỆN ĐIỆN DI .............................................. 28

3.1.1 Lựa chọn dung dịch điện ly n!n ........................................................................ 28

3.1.2 Lựa chọn bướ c sóng phát hiện .......................................................................... 29

3.1.3 Lựa chọn ct mao quản ..................................................................................... 29

3.1.4 Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản .............................................. 30

3.1.5 Lựa chọn n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang................................................. 33

3.2 THCM Đ/NH PH2*NG PHÁP PHÂN TÍCH ......................................................... 35

3.2.1 Xác định hàm lư% ng đ9ng phân R, S-atenolol trong chuAn atenolol racemic ..... 35

3.2.2 Đ phù h% p hệ th"ng ........................................................................................ 36

3.2.3 Đ đDc hiệu ....................................................................................................... 37

3.2.4 Khoảng n9ng đ tuyến tính ............................................................................... 38

3.2.5 Đ chính xác ..................................................................................................... 41





3.2.6 Đ đúng ............................................................................................................ 42

3.3 : NG DỤNG

3.3.1 Đ/NH L2@NG CÁC Đ.NG PHÂN ĐỐI QUANG C?A ATENOLOL TRONGMỘT SỐ CHẾ PHCM ................................................................................................... 44

3.3.2 ĐÁNH GIÁ ĐỘ HÒA TAN CÁC Đ.NG PHÂN C?A ATENOLOL TRONGCHẾ PHCM VIÊN NÉN ............................................................................................... 45

CH2*NG 4: BÀN LU6N ............................................................................................. 47

KẾT LU6N VÀ KIẾN NGH/ ........................................................................................ 53

TÀI LIỆU THAM KH)O





DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AGP Acid E1-glycoprotein

BGE ( Background Electrolyte ) Dung dịch điện ly n!n

BSA ( Bovine Serum Albumine ) Albumin huyết thanh bò

CE ( Capillary Electrophoresis ) Điện di mao quản

CGE (Capillary Gel Electrophoresis) Điện di mao quản gel

CZE (Capillary Zone Electrophoresis) Điện di mao quản vùng

F-CD Beta cyclodextrin

CM-F-CD Carboxymethyl betacyclodextrin

DM-F-CD Dimethyl beta cyclodextrin

EOF ( Electro-osmotic flow ) Dòng điện thAmHP-F-CD Hydroxypropyl beta

cyclodextrinHPLC ( High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lGng hiệu năng cao

HSA ( Human Serum Albumine ) Albumin huyết thanh ngườ i

MEKC (Micellar Electrokinetic Chromatography) Sắc ký điện đng mixen

Rs (Resolution) Đ phân giải

RSD ( Relative Standard Deviation ) Đ lệch chuAn tươ ng đ"i

SD (Standard Deviation) Đ lệch chuAnSĐK S" đăng ký

tm Thờ i gian di chuyển

TRIS Tris (Hydroxymethy)amimomethan





DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính ch#t c7a mt s" CD tự nhiên............................................................... 14

Bảng 3.1 Xác định hàm lư% ng các đ9ng phân trong chuAn atenolol racemic .............. 35

Bảng 3.2 Đ phù h% p hệ th"ng .................................................................................. 36

Bảng 3.3 ChuAn bị dãy dung dịch chuAn atenolol racemic ......................................... 39

Bảng 3.4 Quan hệ gi&a n9ng đ và diện tích pic c7a atenolol racemic ....................... 39

Bảng 3.5 Quan hệ gi&a n9ng đ và diện tích pic c7a S-atenolol ................................. 40

Bảng 3.6 Quan hệ gi&a n9ng đ và diện tích pic c7a R-atenolol ................................ 40

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá đ lDp lại trên mẫu Atenolol STADA 50 mg ................... 41

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá đ chính xác trung gian trên mẫu Atenolol STADA

50mg ........................................................................................................................ 42Bảng 3.9 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại vớ i S-atenolol ........................................ 43

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại vớ i R-atenolol ..................................... 43

Bảng 3.11 Kết quả định lư% ng mẫu chế phAm viên nén ch'a atenolol ....................... 44

Bảng 3.12 Kết quả định lư% ng các đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol trong mẫu thử hòa tan ....................................................................................................................... 46





DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công th'c c#u tạo c7a Atenolol .................................................................. 3

Hình 1.2 Sơ đ9 hệ th"ng điện di mao quản ................................................................ 6

Hình 1.3 Sự hình thành dòng EOF ............................................................................. 7

Hình 3.1 Điện di đ9 khi sử d4ng các dung dịch điện ly n!n khác nhau ....................... 28

Hình 3.2 Điện di đ9 c7a dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi sử d4ng vớ i cácmao quản khác nhau .................................................................................................. 30

Hình 3.3 Điện di đ9 c7a dung dịch chuAn atenolol racemic $ 3 điện thế sử d4ng ...... 32

Hình 3.4 Đ9 thị biểu diHn sự ph4 thuc c7a thờ i gian di chuyển các đ9ng phânquang học c7a atenolol vào giá trị điện thế sử d4ng ................................................... 32

Hình 3.5 Điện di đ9 dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi thay đ=i n9ng đ tác

nhân chọn lọc đ"i quang ............................................................................................ 34Hình 3.6 Điện di đ9 mẫu placebo .............................................................................. 37

Hình 3.7 Điện di đ9 mẫu atenolol racemic chuAn ....................................................... 37

Hình 3.8 Điện di đ9 mẫu atenolol STADA ................................................................ 37

Hình 3.9 Điện di đ9 mẫu S-atenolol ........................................................................... 38

Hình 4.1 Vị trí tươ ng tác liên kết hydro ..................................................................... 49





- 1 -

ĐẶT VẤN Đ

Hiện nay, trong đi!u trị trên lâm sàng đã sử d4ng ngày càng nhi!u các thu"c

có ch'a hoạt ch#t là các dạng đ9ng phân quang học tinh khiết, giúp nâng cao hiệu

quả đi!u trị, giảm li!u dùng và hạn chế đư% c nhi!u tác d4ng không mong mu"n so

vớ i khi dùng thu"c có ch'a hoạt ch#t $ dạng hIn h% p racemic. Ví d4: levofloxacin

(đ9ng phân tả tuy!n c7a ofloxacin) có tác d4ng kháng khuAn mạnh g#p hàng ch4c

đến hàng trăm lần dextrofloxacin (đ9ng phân h&u tuy!n c7a ofloxacin) [4], hoDc

dexchlorpheniramin maleat (đ9ng phân h&u tuy!n c7a chlorpheniramin maleat) là

mt thu"c kháng Histamin H1 dùng đi!u trị dị 'ng có tác d4ng mạnh g#p hai lần

chlorpheniramin maleat (dạng racemic) vớ i cùng li!u lư% ng do dạng đ9ng phân tả

tuy!n không có tác d4ng, cho phép li!u dùng chJ còn mt nửa [3], lamivudin có haiđ9ng phân đ"i quang có tác d4ng trên HIV tươ ng đươ ng nhau, nhưng đ9ng phân (-)

lamivudin có đc tính trên tế bào th#p hơ n so vớ i đ9ng phân (+) lamivudin [18].

Trong cuc s"ng hiện đại ngày nay, xu hướ ng các bệnh tiểu đườ ng, r"i loạn

lipid máu, các bệnh tim mạch ngày càng tăng nhanh. ĐDc biệt, vớ i nhóm thu"c tim

mạch thờ i gian đi!u trị thườ ng kéo dài, do đó việc sử d4ng thu"c $ dạng đ9ng phân

quang học tinh khiết lại càng có ý ngh K a quan trọng. Atenolol là dẫn ch#t c7a

aryloxypropanolamin, có tác d4ng chLn chọn lọc trên th4 thể F1- adrenergic dùng

đi!u trị tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính =n định, nh9i máu cơ tim sớ m (trong

vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nh9i máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên th#t [2].

Vớ i mt carbon b#t đ"i trong phân tử, atenolol là hIn h% p racemic c7a hai đ9ng

phân đ"i quang: S-atenolol và R-atenolol. Mt s" nghiên c'u đã ch'ng minh và chJ

ra r>ng S-atenolol có vai trò chính chLn beta giao cảm khi dùng atenolol dạng hIn

h% p racemic, đ9ng thờ i đc tính cũng th#p hơ n so vớ i dạng R-atenolol [20], [25],

[26]. Do đó việc sản xu#t và sử d4ng đ9ng phân S-atenolol ngày càng đư% c quantâm nhi!u hơ n. Đi!u này đòi hGi phải xây dựng phươ ng pháp phân tách và định

lư% ng đư% c tMng dạng đơ n đ9ng phân trong hIn h% p racemic c7a atenolol.





- 2 -

Trong nh&ng năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản (Capillary

Electrophoresis - CE) là phươ ng pháp hóa lý đư% c các nhà phân tích lựa chọn trong

l K nh vực tách các đ9ng phân quang học vớ i nhi!u lý do: hiệu lực tách cao, lư% ng

mẫu sử d4ng ít, dung môi sử d4ng trong quá trình phân tích chJ là dung dịch đệm dođó không ảnh hư$ ng đến môi trườ ng, việc tách các đ9ng phân quang học có thể đạt

đư% c khi chJ cần thêm mt lư% ng nhG tác nhân chọn lọc đ"i quang (chiral selector)

vào dung dịch điện ly n!n [8].

Tại Việt Nam, việc áp d4ng kỹ thuật điện di mao quản trong phân tích kiểm

nghiệm vẫn còn hạn chế. Để nâng cao năng lực kiểm tra ch#t lư% ng thu"c c7a hệ

th"ng kiểm nghiệm cũng như hi nhập vớ i xu hướ ng phát triển c7a ngành Dư% c trên

thế giớ i, chúng tôi thực hiện đ! tài: “Nghiên cứ u đị nh l ượ ng đồ ng phân đố i quang

củ a Atenolol bằ ng đ iệ n di mao quả n”. Vớ i hai m4c tiêu:

1. Hoàn thiện và thAm định phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a

atenolol b>ng điện di mao quản.

2. : ng d4ng phươ ng pháp này định lư% ng và đánh giá đ hòa tan các đ9ng

phân đ"i quang c7a atenolol trong mt s" chế phAm có ch'a atenolol trên thị

trườ ng ph4c v4 công tác kiểm nghiệm.





- 3 -

CHƯƠ NG 1. T!NG QUAN

1.1. T!NG QUAN V ATENOLOL

Công th'c c#u tạo

OHN

OHH

CH3

CH3

H2N

O

và đ9ng phân đ"i quang.

Hình 1.1: Công th" c c#u tạo c$a Atenolol

Công th'c phân tử: C14H22N2O3.

Kh"i lư% ng phân tử: 266,3.

Tên khoa học:

2-[4-[(2 RS )-2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenyl]acetamid.

1.1.1. Tính ch#t

Atenolol có các tính ch#t sau [1], [3], [21]:

• Bt kết tinh màu trắng hoDc gần như trắng, hơ i tan trong nướ c, tan trong ethanol,

methanol, khó tan trong methylen clorid.

• Điểm chảy: 152oC đến 155oC.

• Góc quay cực (dung dịch 0,10 g atenolol trong 10,0 ml nướ c) tM -0,10o đến

+0,10o.

• Cực đại h#p th4 (dung dịch trong methanol): 225; 275; 283 nm.

• pKa: 9,6.

• Log P: hệ s" phân b" (n-octanol/ đệm phosphat) 0,008 (pH 7,0); 0,052 (pH 8,0).

1.1.2. D%& c lý và c' ch( tác d)ng

a) Tác d)ng và c' ch( tác d)ng

Atenolol thuc nhóm chLn chọn lọc trên th4 thể F1- adrenergic, có tác d4ng

ch"ng tăng huyết áp. Thu"c có tác d4ng làm giảm lực co cơ và giảm tần s" tim.

Atenolol không có tác d4ng =n định màng. Atenolol tan trong nướ c, do đó ít th#m

vào hệ thần kinh trung ươ ng.





- 4 -

Ði!u trị atenolol sN 'c chế tác d4ng c7a catecholamin khi gắng s'c và căng

thOng tâm lý, dẫn đến làm giảm tần s" tim, giảm cung lư% ng tim và giảm huyết

áp.

Ði!u trị atenolol không làm tăng hoDc làm tăng r#t ít s'c cản c7a mạchngoại biên. P li!u đi!u trị, tác d4ng co cơ trơ n phế quản c7a atenolol kém hơ n so

vớ i nh&ng thu"c chLn th4 thể beta không chọn lọc. Tính ch#t này cho phép đi!u

trị cả nh&ng ngườ i có bệnh hen phế quản nhL hoDc bệnh ph=i tắc nghNn khác.

Atenolol ít ảnh hư$ ng đến giải phóng insulin và chuyển hóa carbohydrat.

B$ i vậy, atenolol có thể dùng đư% c cho ngườ i đái tháo đườ ng. P ngườ i tăng

huyết áp, atenolol làm giảm mt cách có ý ngh K a huyết áp cả $ tư thế đ'ng lẫn tư

thế n>m.

Ðể đi!u trị tăng huyết áp, nếu cần, có thể kết h% p atenolol vớ i thu"c ch"ng

tăng huyết áp khác, ch7 yếu là thu"c l% i niệu và/hoDc thu"c giãn mạch ngoại

biên [2].

Mt s" nghiên c'u so sánh tác d4ng gi&a các đ9ng phân quang học c7a

atenolol:

* Nghiên c'u so sánh tác d4ng giảm nhịp tim c7a atenolol racemic và R-

atenolol, S-atenolol so vớ i giả dư% c trên ngườ i tình nguyện sau khi tập thể d4c

do Stoschitzky K. và cng sự thực hiện cho th#y tác d4ng giảm nhịp tim sau khi

u"ng 100 mg atenolol racemic tươ ng đươ ng vớ i u"ng 50 mg S- atenolol, trong

khi không th#y tác d4ng giảm nhịp tim sau khi u"ng 50 mg R- atenolol [25],

[26].

* Theo nghiên c'u c7a McCoy R. và cng sự khi tiến hành thử nghiệm trên

ngườ i, S-atenolol có tác d4ng 'c chế chọn lọc F1-adrenergic hơ n khoảng 40 lần

và có ít tác d4ng ph4 như loạn nhịp, đánh tr"ng ngực so vớ i R- atenolol [20].

b) D%& c *+ng h,c Sau khi u"ng thu"c đạt n9ng đ t"i đa trong huyết tươ ng trong vòng tM 2 -

4 giờ . Sinh khả d4ng x#p xJ 45%, nhưng có sự khác nhau tớ i 3 - 4 lần gi&a các

ngườ i bệnh. Thể tích phân b" là 0,7 lít/kg. Atenolol chJ đư% c chuyển hóa mt

lư% ng nhG. Phần lớ n li!u thu"c dùng đư% c bài tiết qua thận dướ i dạng không





- 5 -

thay đ=i. Nửa đờ i trong huyết tươ ng c7a thu"c tM 6 - 9 giờ đ"i vớ i ngườ i lớ n có

ch'c năng thận bình thườ ng. Nửa đờ i trong huyết tươ ng c7a thu"c tăng lên đ"i

vớ i ngườ i có ch'c năng thận giảm và không bị ảnh hư$ ng b$ i bệnh gan.

c) Ch- *ịnh Tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính =n định, nh9i máu cơ tim sớ m (trong

vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nh9i máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên th#t.

d) Ch.ng ch- *ịnh

S"c tim, suy tim không bù trM, bl"c nh K - th#t đ II và đ III, chậm nhịp tim

có biểu hiện lâm sàng. Không đư% c dùng kết h% p vớ i verapamil.

e) Dạng thu.c và hàm l%& ng

• Viên nén 25 mg, 50 mg và 100 mg.

• Thu"c tiêm t K nh mạch 5 mg/10 ml [2].

Mt s" chế phAm ch'a atenolol dạng racemic trên thị trườ ng như viên nén

Tenormin 50 mg và 100 mg (Astra-Zeneca), Atenolol Stada 50 mg (Công ty TNHH

Liên doanh Stada Việt Nam), Tenocar 50mg, Teginol 50 mg (Công ty c= phần

Dư% c Hậu Giang); thu"c tiêm Tenormin 5 mg.

1.2 T!NG QUAN V K/ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN

1.2.1 Khái ni0m

Điện di là hiện tư% ng di chuyển c7a tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán

trong ch#t điện giải khi có dòng điện đi qua. Cation di chuyển v! phía cực âm

(catod), anion di chuyển v! phía cực dươ ng (anod). Các phần tử không tích điện

không bị hút v! phía hai điện cực.

Điện di mao quản (CE) là mt kỹ thuật tách các ch#t trong mao quản silica

dài 25 - 100 cm, đườ ng kính trong 25 - 100 Qm, đườ ng kính ngoài 300 - 400 Qm.

Điện thế mt chi!u áp vào hai đầu mao quản 10 - 30 kV (cườ ng đ điện trườ ng có

thể đến 500 V/cm) tạo ra quá trình chia tách, các ch#t phân tích đư% c phát hiện khi

di chuyển v! mt đầu mao quản nhờ mt detector thích h% p [1], [6].





- 6 -

Hình 1.2: S' *1 h0 th.ng *i0n di mao qu2n

1.2.2 Nguyên lý c$a quá trình *i0n di mao qu2nQuá trình vận hành c7a CE điển hình vớ i mao quản silica ch'a dung dịch

đệm làm việc, thì nhóm silanol (SiOH) $ trên thành trong c7a mao quản sN giải

phóng ion hydrogen (H+) vào dung dịch đệm và b! mDt thành mao quản sN tích điện

âm ngay cả $ pH r#t th#p. Cation hay các ch#t hòa tan tích điện dươ ng mt phần

trong môi trườ ng bị hút t K nh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên mt lớ p

điện kép để cân b>ng điện tích và tạo nên mt hiệu điện thế $ vùng sát thành mao

quản gọi là thế Zeta (R).

Khi áp thế vào mao quản, các cation trong lớ p điện kép khuếch tán sN di

chuyển v! phía catod. Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo cả kh"i dung

dịch trong mao quản đi v! catod. Sự chuyển đng c7a kh"i dung dịch trong mao

quản silica dướ i tác d4ng c7a lực điện trườ ng đư% c gọi là dòng điện thAm (electro-

osmotic flow - EOF).

Điện tích b! mDt trong c7a thành mao quản ph4 thuc ch7 yếu vào pH c7a

dung dịch đệm làm việc, do đó trị s" EOF thay đ=i theo pH. P pH th#p, nhóm

silanol nói chung có đ ion hóa th#p và dòng EOF nhG. P pH cao hơ n, nhóm silanol

bị ion hóa nhi!u hơ n và dòng EOF tăng.





- 7 -

Hình 1.3: S3 hình thành dòng EOF

Ngoài pH dung dịch đệm, dòng EOF sN thay đ=i khi:

• Lực ion c7a dung dịch tăng lên, làm giảm thế Zeta nên dòng EOF giảm.

• Trong mt s" trườ ng h% p, các dung môi h&u cơ như methanol hay acetonitril

đư% c cho thêm vào dung dịch đệm để dH hòa tan ch#t phân tích, h>ng s" điện

môi c7a dung dịch điện di giảm xu"ng kéo theo sự giảm c7a EOF.

Detector đư% c đDt v! phía đầu catod c7a mao quản. Dòng EOF thườ ng lớ n

hơ n linh đ điện di. Do vậy, ngay cả anion cũng bị đAy v! phía catod và detector.

Khi sử d4ng đệm phosphat pH 7,0 $ mao quản không có lớ p bao, thông thườ ng

trình tự xu#t hiện các ch#t tan trong điện di đ9 là các cation, các ch#t trung tính và

các anion.

Hiện nay, có 5 loại điện di mao quản ch7 yếu:

• Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) còn gọi là

điện di dung dịch tự do hay điện di mao quản dòng tự do.

• Sắc ký mixen điện đng, còn gọi là sắc ký điện đng mixen (micellar

electrokinetic chromatography - MEKC).

• Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE).

• Điện di mao quản hi t4 đOng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF)

• Điện di mao quản đOng t"c (capillary isotachophoresis - CITP) [1], [6].

1.2.3 Đi0n di mao qu2n vùng

Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách đư% c kiểm soát b>ng sự khác

nhau v! linh đ tươ ng đ"i c7a tMng thành phần trong mẫu thử hoDc dung dịch thử.





- 8 -

Linh đ là hàm s" c7a điện tích ch#t phân tích và kích thướ c trong đi!u kiện nh#t

định c7a phươ ng pháp. Chúng đư% c t"i ưu hóa b>ng cách kiểm soát các thành phần

c7a đệm, pH và lực ion.

Điện di mao quản vùng sử d4ng nguyên lý c7a điện di và điện thAm để táchcác tiểu phân tích điện. Linh đ điện di c7a ion (µep), đư% c biHu diHn b>ng phươ ng

trình:

µ ep= q/(6 πηr)

Trong đó: q là điện tích c7a ion, η là đ nhớ t dung dịch và r là bán kính c7a

ion hydrat hóa. TM m"i liên hệ này suy ra, ch#t phân tích kích thướ c nhG, điện tích

lớ n có linh đ lớ n. Ch#t phân tích kích thướ c lớ n, điện tích nhG có linh đ th#p.

T"c đ di chuyển c7a mt ion ( νi), tính b>ng cm/s, đư% c biểu thị b>ngphươ ng trình: ν i = µep (V/L)

Trong đó: µep là linh đ điện di, V là điện thế đDt và L là chi!u dài (cm) t=ng

cng c7a mao quản.

T"c đ c7a EOF ( νeo), tính b>ng cm/s, đư% c biHu diHn b>ng phươ ng trình:

ν eo = µeo (V/L)

Trong đó: µeo là linh đ dòng EOF (cm2 /V.s).

Thờ i gian di chuyển (tm), tính b>ng giây, cần thiết cho ch#t tan di chuyển trêntoàn b chi!u dài hiệu d4ng (l) c7a mao quản (tM đầu vào đến detector), tm đư% c

biểu thị b>ng hệ th'c sau:

t m= l/E.( µep+ µeo)= lL/V.( µep+ µeo)

Trong đó: E là cườ ng đ điện trườ ng (E = V/L)

Hiệu lực c7a hệ th"ng điện di đư% c biểu thị b>ng s" đK a lý thuyết (N), đư% c

tính b>ng phươ ng trình:

N = ( µep+ µeo)El/2D

Trong đó: D là hệ s" khuếch tán c7a ch#t hòa tan (cm2 /s) và các ký hiệu

khác đư% c định ngh K a như trên.





- 9 -

Đ phân giải (R) c7a hai ch#t hòa tan đư% c rửa giải kế tiếp nhau, có thể xác

định b>ng phươ ng trình:

Trong đó: µ ep1 và µ ep2 là linh đ c7a hai ch#t hòa tan,ep µ là linh đ trung

bình c7a hai ch#t tan và các ký hiệu khác đư% c định ngh K a như trên [1], [6].

1.3. VÀI NÉT V PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC.

1.3.1. Đ1ng phân quang h,c

Đ9ng phân là nh&ng h% p ch#t khác nhau có cùng mt công th'c phân tử.

Đ9ng phân quang học là hiện tư% ng đ9ng phân có liên quan đến sự khác nhau v!

góc quay c7a mDt phOng ánh sáng phân cực.

Dạng đ9ng phân quang học đơ n giản nh#t xu#t hiện trong trườ ng h% p khi

h% p ch#t có thể t9n tại dướ i hai dạng đ9ng phân lập thể có c#u tạo không ch9ng khít

lên nhau đư% c. Ngoài sự khác biệt trong c#u trúc phân tử theo kiểu như sự khác biệt

gi&a bàn tay phải và bàn tay trái, còn t#t cả các tính ch#t lý học thông thườ ng c7a

các đ9ng phân đó là gi"ng nhau, trM khả năng quay mDt phOng ánh sáng phân cực

theo nh&ng góc b>ng nhau nhưng ngư% c chi!u.

Ch#t có khả năng làm quay mDt phOng c7a ánh sáng phân cực mt góc E nào

đó, ngườ i ta gọi ch#t đó là ch#t hoạt quang (hoạt đng quang học). HIn h% p racemic

có ch'a s" phân tử b>ng nhau c7a mIi dạng đ"i quang, đ quay cực t=ng cng do

đó b>ng không [5].

1.3.2. Ph%' ng pháp phân tách *1ng phân *.i quang

1.3.2.1 Ph%' ng pháp phân tách *1ng phân *.i quang gián ti(p

Phươ ng pháp này dựa trên mt phản 'ng hóa học gi&a hai đ9ng phân đ"i

quang vớ i mt h% p ch#t b#t đ"i tạo thành hIn h% p hai đ9ng phân lập thể nhưng

không đ"i quang trướ c khi đư% c phân tách b>ng điện di. Đư% c thể hiện như sơ đ9:

(R,S)-C + (S)-D [(R)-C-(S)-D] + [(S)-C-(S)-D]

Trong đó:

( ) ( )[ ]2

1

21 / 18,0 eoepepep DV R µ µ µ µ +−=





- 10 -

C: HIn h% p racemic cần phân tích

D: Thu"c thử b#t đ"i

R-, S- tươ ng 'ng là đ9ng phân quay phải và đ9ng phân quay trái.

HIn h% p thu đư% c có thể đư% c tách b>ng GC và HPLC. V! nguyên tắc, cóthể dùng CE để phân tích hIn h% p trên, sử d4ng dung dịch điện ly n!n không chọn

lọc đ"i quang, b$ i các thành phần trong hIn h% p có tính ch#t lý hóa khác nhau.Tuy

nhiên phươ ng pháp này r#t khó áp d4ng trong CE. So vớ i phươ ng pháp phân tách

trực tiếp thì phươ ng pháp gián tiếp này có mt s" như% c điểm sau đây:

• T"n thờ i gian xử lý mẫu.

• Cần có các nhóm hoạt đng hóa học trong c#u trúc như nitơ , hydroxyl,

carboxylic.• Phải sử d4ng thu"c thử b#t đ"i r#t tinh khiết vì sự có thêm mt ch#t đ"i

quang sN tạo ra thêm hai đ9ng phân lập thể không đ"i quang n&a và gây

khó khăn cho quá trình phân tích.

• Hai đ9ng phân trong hIn h% p racemic cần phân tích phải phản 'ng vớ i

cùng m'c đ và t"c đ.

• Đáp 'ng c7a detector vớ i hai dẫn xu#t tạo thành phải tươ ng đươ ng nhau.

• Đi!u kiện phản 'ng phải thích h% p để tránh sự chuyển dạng lập thể c7a

thu"c thử b#t đ"i, đ9ng phân quang học c7a ch#t phân tích và dẫn xu#t

đ9ng phân lập thể không đ"i quang.

Thông thườ ng, không phải dH dàng để giải quyết t#t cả các v#n đ! trong quá

trình thực nghiệm như mô tả $ trên. Tuy nhiên, phươ ng pháp gián tiếp có thể đư% c

áp d4ng trong nh&ng trườ ng h% p mà phươ ng pháp trực tiếp không thể áp d4ng đư% c

hoDc khi cần tăng đ nhạy. Phươ ng pháp gián tiếp trong CE ch7 yếu đư% c áp d4ng

cho phân tách đ9ng phân quang học c7a acid amin [15].

1.3.2.2 Ph%' ng pháp phân tách *1ng phân *.i quang tr3 c ti(p

Phươ ng pháp phân tách trực tiếp đư% c áp d4ng thành công trong CE cho việc

tách đ9ng phân đ"i quang c7a mt s" nhóm h% p ch#t, ch7 yếu là dư% c ch#t.

Các đ9ng phân quang học r#t gi"ng nhau v! tính ch#t lý hóa nên áp d4ng các

phươ ng pháp thông thườ ng không đem lại kết quả. Tuy nhiên, các đ9ng phân này có





- 11 -

khả năng tươ ng tác khác nhau vớ i mt s" ch#t đDc biệt, gọi là tác nhân chọn lọc đ"i

quang. Khi có mDt trong hệ th"ng phân tích, chúng sN tươ ng tác vớ i hIn h% p đ9ng

phân quang học. Quá trình tách đ9ng phân này đạt đư% c do sự khác nhau v! năng

lư% ng tươ ng tác c7a tác nhân chọn lọc đ"i quang vớ i mIi đ9ng phân.

Tác nhân chọn lọc đ"i quang hoDc có thể đư% c thêm vào dung dịch điện ly

n!n hoDc đư% c gắn lên thành mao quản, hoDc đư% c c" định hay gắn lên các hệ gel

để tạo mt môi trườ ng chọn lọc đ"i quang mà tươ ng tác vớ i hai đ9ng phân đ"i

quang trong su"t quá trình điện di dựa trên sự hình thành ph'c đ9ng phân lập thể

không đ"i quang tạm thờ i. Các ph'c tạm thờ i di chuyển v! phía detector vớ i vận t"c

khác nhau chJ khi chúng có h>ng s" b!n khác nhau. Các tươ ng tác tươ ng đ"i yếu

tham gia vào quá trình hình thành đ9ng phân lập thể không đ"i quang g9m liên kếthydro, tươ ng tác kS nướ c, liên kết T-T, lưỡ ng cực - lưỡ ng cực. Đ tinh khiết quang

học c7a tác nhân chọn lọc đ"i quang trong phươ ng pháp tách trực tiếp không phải là

mt yếu t" quan trọng như trong phươ ng pháp tách gián tiếp; trên thực tế, các tạp

ch#t chJ ảnh hư$ ng đến đ phân giải và đã đư% c chJ ra r>ng kết quả tươ ng đ"i t"t có

thể thu đư% c b>ng cách sử d4ng tác nhân chọn lọc đ"i quang có ch'a tớ i 10% đ9ng

phân đ"i quang còn lại [15], [16], [22].

Các tác nhân chọn lọc đ"i quang có bản ch#t hóa học khá đa dạng và đư% cchia thành các nhóm chính sau [11]:

− Nhóm 1: có bản ch#t protein (albumin huyết thanh (HSA, BSA), E1- acid

glycoprotein – AGP, ovalbumin trong tr'ng gà…), cyclopeptid, mt s"

kháng sinh macrocyclic glycopeptid (vancomycin, teicoplanin, avoparcin,

tubocuracin…) đã đư% c dùng để tách nhi!u đ9ng phân đ"i quang.

− Nhóm 2: Các oligosaccharid không vòng và dẫn ch#t polysaccharid. Mt s"

phân tử hay dùng như dẫn ch#t maltose, lactose, sucrose, amylose, cellulose.− Nhóm 3: Ch#t chọn lọc đ"i quang dựa trên c#u trúc tạo thành mt “h"c”

chọn lọc đ"i quang (chiral cavity). G9m các cyclodextrin (CD) và dẫn ch#t

(F – CD, dẫn ch#t sulfat hóa, alkylhydroxy hóa c7a F - CD), ether vòng,

polymer.





- 12 -

− Nhóm 4: ch#t chọn lọc đ"i quang dựa trên tươ ng tác gi&a nhóm cho điện tử T

và nhóm nhận điện tử T (ch#t chọn lọc kiểu Pirkle).

− Nhóm 5: Trao đ=i ligand (ion đ9ng tạo ph'c vớ i nhóm hoạt quang).

Trong các nhóm ch#t chọn lọc đ"i quang $ trên, nhóm cyclodextrin đDc biệt

là F-cyclodextrin và dẫn xu#t c7a chúng đư% c sử d4ng rng rãi nh#t, có khả năng

tách đ9ng phân quang học r#t mạnh, cho kết quả t"t trên hầu hết các nhóm dư% c

ch#t hoạt quang ph= biến [12].

Sử d4ng các tác nhân chọn lọc đ"i quang kể trên, nhi!u phươ ng pháp tách đã

đư% c sử d4ng để phân tích các đ9ng phân đ"i quang, ch7 yếu dựa trên các quá trình

sắc ký (như sắc ký lGng, sắc ký khí, sắc ký lGng siêu tớ i hạn) và điện di. Trong đó,

hai kỹ thuật ph= biến nh#t hiện nay đư% c áp d4ng để phân tích các đ9ng phân đ"iquang là sắc ký lGng hiệu năng cao và điện di mao quản [19]. Phươ ng pháp HPLC

có ba kỹ thuật để tách các đ9ng phân quang học trong hIn h% p racemic:

Sử d4ng ch#t tạo dẫn xu#t hoạt quang.

Sử d4ng pha đng ch'a tác nhân chọn lọc hoạt quang và pha t K nh không hoạt

quang thông thườ ng.

Sử d4ng ct tách chọn lọc (chiral stationary phases): Tác nhân chọn lọc hoạt

quang đư% c h#p ph4 hoDc liên kết vớ i pha t K nh.Trong đó kỹ thuật sử d4ng ct pha t K nh hoạt quang là phươ ng pháp đư% c sử

d4ng ph= biến nh#t do tính tiện l% i, nhanh chóng và chính xác, nhi!u ct đư% c

thươ ng mại hóa nhưng chi phí r#t đắt. Phươ ng pháp CE cũng đư% c sử d4ng khá ph=

biến trong phân tách đ9ng phân quang học vớ i nhi!u ưu điểm và chi phí kinh tế

hơ n.

1.3.3 Ứ ng d)ng CE trong phân tích *1ng phân quang h,c.

Điện di mao quản là kỹ thuật ngày càng đư% c áp d4ng rng rãi hơ n trong

phân tích đ9ng phân đ"i quang. CE là mt kỹ thuật b= sung cho HPLC, đDc biệt đ"i

vớ i việc phân tích h% p ch#t phân cực và tích điện. Các ch#t chọn lọc hoạt quang sử

d4ng trong điện di mao quản chính là các ch#t chọn lọc đ"i quang đư% c sử d4ng các

pha t K nh c7a HPLC. Tuy nhiên trong phươ ng pháp điện di mao quản, các ch#t chọn





- 13 -

lọc đ"i quang đư% c hòa tan vào dung dịch điện ly n!n (BGE) và tạo ph'c ch#t

không đ"i quang (diastereomeric complexes) vớ i các đ9ng phân R, S c7a ch#t phân

tích. TM các tính ch#t điện di khác nhau c7a các ph'c này khiến chúng có thể tách

khGi hIn h% p racemic.2 u điểm c7a phươ ng pháp CE cho phép đi!u chJnh linh hoạt đi!u kiện phân

tích để t"i ưu hóa kết quả, đ đDc hiệu cao và thờ i gian phân tích ngắn, giá thành

phân tích cũng giảm đi nhi!u so vớ i phươ ng pháp HPLC sử d4ng ct sắc ký có gắn

ch#t chọn lọc hoạt quang đắt ti!n, đ9ng thờ i lư% ng mẫu sử d4ng ít giúp tiết kiệm

hóa ch#t phân tích [27].

Việc tách đ9ng phân đ"i quang b>ng CE có thể đư% c thực hiện b>ng phươ ng

pháp gián tiếp hoDc trực tiếp. Các phươ ng pháp trực tiếp thuận l% i hơ n các phươ ng

pháp gián tiếp do sự đơ n giản và tính sUn có c7a mt loạt các tác nhân chọn lọc đ"i

quang như cyclodextrins (CDs), ether vòng đư% c tetracarboxylat hóa và kháng sinh

tạo ph'c l9ng vớ i các đ9ng phân đ"i quang. Trong s" đó, CD là tác nhân chọn lọc

đ"i quang đư% c sử d4ng ph= biến nh#t. Ngoài các CD tự nhiên, các dẫn xu#t CD

khác nhau đã đư% c thươ ng mại hóa và chúng mang lại đ chọn lọc cao trong tách

đ9ng phân đ"i quang. Bên cạnh cơ chế tạo ph'c l9ng, các cơ chế khác dùng để tách

đ9ng phân đ"i quang g9m trao đ=i ph"i tử, tươ ng tác ái lực (ví d4: việc sử d4ng

protein, kháng sinh là tác nhân chọn lọc đ"i quang), và tươ ng tác mixen (ví d4: sử

d4ng các b! mDt tự nhiên hay t=ng h% p là tác nhân chọn lọc đ"i quang)[17].

Mt s" nghiên c'u dùng phươ ng pháp CE sử d4ng CM-F-CD làm tác nhân

chọn lọc đ"i quang trong phân tích đ9ng phân quang học như phân tách

chlorpheniramin maleat, amlodipin, lamivudin, ofloxacin [7], [12].

1.4.TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE S4 DỤNG

CYCLODEXTRIN LÀ TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG.

1.4.1

T5ng quan về Cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) là oligosaccharid mạch vòng, g9m các đơ n vị D-(+)-

glucose liên kết vớ i nhau b>ng liên kết E-(1,4)-glucosid và đư% c tạo ra tM phản 'ng

th7y phân tinh bt b>ng enzym. MDc dù trong thực tế, có nh&ng CD hình thành tM 6





- 14 -

lên đến 12 đơ n vị D-(+)-glucose đã đư% c phân lập, tuy nhiên chJ CD có 6,7,8 đơ n vị

D-(+)-glucose (tươ ng 'ng vớ i E, F, V-CD) là đư% c sử d4ng ph= biến.

Hình dạng c7a CD đư% c mô phGng như mt hình nón c4t rIng vớ i mt

khoang tươ ng đ"i kS nướ c, có thể lưu gi& ch#t phân tích và mDt ngoài thân nướ c dosự có mDt c7a các nhóm hydroxyl (vị trí 2, 3 và 6 c7a glucopyranose). Vành rng

hơ n có ch'a các nhóm hydroxyl th' c#p đ"i quang, trong khi vành hLp hơ n ch'a

nhóm hydroxyl sơ c#p không đ"i quang. Tính ch#t hóa lý c7a CD đư% c trình bày

trong bảng 1.1.

B2ng 1.1 Tính ch#t c$a m+t s. CD t3 nhiên

Tính ch#t

Loại CD

6 7 8

S. *' n vị glucose 6 7 8

S. nhóm hydroxyl 18 21 24

Tr,ng l%& ng phân t9 972 1135 1297

Đ%: ng kính trong c$a khoang (nm) 0,47-0,52 0,60-0,64 0,75-0,83

Đ%: ng kính ngoài c$a khoang (nm) 1,46 ± 0,05 1,54 ± 0,04 1,75 ± 0,04

Th; tích khoang (nm3) 0,176 0,346 0,510

Đ+ tan trong n%< c = 250C (g/100ml) 14,50 1,82 23,20

Giá trị pKa cho nhóm hydroxyl 12,1-12,6 12,1-12,6 12,1-12,6

Các nhóm hydroxyl có mDt trên vành c7a CD có thể dH dàng đư% c thay thế

b$ i các phản 'ng hóa học để có đư% c các dẫn xu#t CD vớ i các m'c đ thế khác

nhau, các thành phần CD biến đ=i ph4 thuc vào mt s" thông s" như đi!u kiện





- 15 -

phản 'ng, loại và tW lệ thu"c thử…Mt s" lư% ng lớ n các dẫn xu#t c7a CD hiện đang

đư% c sử d4ng trong CE để phân tích đ9ng phân đ"i quang như dẫn xu#t methyl,

hydroxyethyl, hydroxypropyl, acetyl hóa không tích điện và các dẫn xu#t

methylamino, sulphobutylether, carboxymethyl, sulfat, photphat hóa tích điện. Cácdẫn xu#t c7a CD có thể biểu hiện tính ch#t r#t khác so vớ i nh&ng CD tự nhiên, có

thể đư% c sử d4ng dH dàng để cải thiện đ chọn lọc trong tách đ9ng phân đ"i quang,

ví d4 như tăng đ tan, tăng khả năng tạo ra các liên kết th' c#p khác nhau, ti!m

năng trong phân tích nh&ng h% p ch#t không tích điện, m'c đ kị nướ c khác nhau

c7a h"c kị nướ c. Ví d4, so sánh F - CD và DM - F- CD, có thể th#y r>ng sự có mDt

c7a các nhóm methoxy làm tăng hoDc đ sâu hoDc đ tan c7a tác nhân chọn lọc đ"i

quang. Nhóm thế tích điện hoDc không tích điện thay thế cho nhóm hydroxyl trên

c#u trúc CD có thể r#t có ích cho t"i ưu phươ ng pháp CE. Trong thực tế, đ9ng phân

không tích điện có thể đư% c chuyển đến detector như ch#t phân tích tích điện do sự

hình thành ph'c l9ng vớ i dẫn xu#t c7a CD có nhóm thế tích điện. Hơ n n&a sự

chuyển đng c7a tác nhân chọn lọc đ"i quang theo hướ ng ngư% c lại vớ i ch#t phân

tích là đi!u kiện lý tư$ ng để đạt đư% c đ phân giải t"t vì làm tăng sự khác biệt v!

linh đ gi&a ch#t phân tích tự do và ch#t phân tích trong ph'c l9ng [14], [19].

1.4.2 Tách *1ng phân *.i quang b>ng CE s9 d)ng Cyclodextrin là tác nhân

ch,n l,c *.i quang

Nhi!u dẫn xu#t CD đã đư% c phát triển để tăng khả năng hòa tan trong nướ c

và để thay đ=i hình dạng khoang. Tách đ9ng phân đ"i quang b>ng CZE vớ i CD là

tác nhân chọn lọc đ"i quang lần đầu tiên đư% c giớ i thiệu b$ i Fanali và là kỹ thuật

thành công nh#t trong s" các kỹ thuật để tách đ9ng phân đ"i quang c7a CE; s"

lư% ng các bài báo mô tả kỹ thuật này gia tăng đáng kể [24].

Trong cơ chế tạo ph'c l9ng, h% p ch#t l9ng khít vào khoang CD vớ i toàn b

phân tử hoDc vớ i phần kS nướ c c7a phân tử; do đó, loại CD có vai trò r#t quan trọngtrong quá trình tách. Tươ ng tác kS nướ c vớ i mình khoang kS nướ c không đ7 để cho

phép tách các đ9ng phân đ"i quang, liên kết yếu gi&a các nhóm nhóm thế vớ i trung

tâm b#t đ"i c7a ch#t phân tích và các nhóm hydroxyl th' c#p và / hoDc sơ c#p c7a

CD đóng vai trò trong nhận dạng đ"i quang [14], [15], [24].





- 16 -

CD là mt h% p ch#t trung hòa v! điện và do đó chúng di chuyển vớ i t"c đ

c7a dòng EOF trong CZE. Khi mt ch#t tan tích điện đư% c l9ng vào khoang c7a

CD, ph'c l9ng tạo thành có điện tích gi"ng vớ i ch#t tan tự do nhưng kh"i lư% ng

phân tử tăng lên, và do đó linh đ điện di th#p hơ n so vớ i ch#t tan tự do. Trong táchđ9ng phân đ"i quang, các đ9ng phân có linh đ điện di đ9ng nh#t và các đ9ng phân

trong ph'c l9ng có thể có linh đ tươ ng tự nhau. Vì vậy, nguyên tắc c7a CZE sử

d4ng CD là tác nhân chọn lọc đ"i quang (CD - CZE) để tách đ9ng phân đ"i quang

là sự khác biệt gi&a các h>ng s" b!n c7a ph'c l9ng tạo ra gi&a các đ9ng phân đ"i

quang vớ i CD. Đ9ng phân tạo ph'c l9ng b!n hơ n thì có linh đ hiệu d4ng th#p hơ n.

Linh đ hiệu d4ng là linh đ trung bình hoDc biểu kiến c7a ch#t tan trong đi!u kiện

thử nghiệm, nhưng trong hầu hết các trườ ng h% p, chúng ta sử d4ng đơ n giản là linh

đ [24].

Phân tách đ9ng phân đ"i quang có thể bị ảnh hư$ ng b$ i các yếu t" như: loại

và n9ng đ CD, pH, thành phần c7a BGE, nhiệt đ mao quản, hiệu điện thế…[14]

1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨ U PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA

ATENOLOL.

1.5.1. Nghiên c" u trong n%< c.

Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn LAu, NguyHn Thị Thu Hi!n, NguyHnThị Ki!u Anh [9], đã tách và định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol b>ng

phươ ng pháp sắc ký lGng hiệu năng cao sử d4ng:

• Ct Chirex 3022 ((S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(E-

naphtyl)ethylamine) kích thướ c 4,0 x 250 mm; 5 Qm.

• Pha đng: n-hexan/ 1,2 dicloromethan/ methanol / acid trifluoroacetic tW lệ

57,5/35/7,5/0,2 (v/v/v/v).

• Bướ c sóng phát hiện: 229 nm.• Thể tích tiêm mẫu: 20 QL.

• T"c đ dòng: 1 ml/ phút.

• N9ng đ ch#t phân tích: 0,05 mg/ml (racemic).





- 17 -

Nghiên c'u tách đ9ng phân đ"i quang sử d4ng HPLC đòi hGi phải sử d4ng

ct sắc ký r#t đắt ti!n (pha t K nh có gắn tác nhân chọn lọc đ"i quang) và mIi loại ct

chJ sử d4ng đư% c vớ i mt s" nhóm dư% c ch#t hoạt quang nh#t định, đ9ng thờ i

phươ ng pháp này tiêu hao nhi!u dung môi do lư% ng pha đng sử d4ng lớ n, dungmôi h&u cơ đc hại gây ô nhiHm môi trườ ng.

Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn LAu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình,

NguyHn Thị Ki!u Anh [10], đã tách và định tính các đ9ng phân c7a atenolol

b>ng phươ ng pháp điện di mao quản vớ i đi!u kiện phân tích:

• Ct mao quản silica nung chảy: 60 cm (50 cm) x 75 Qm.

• Dung dịch điện ly n!n: TRIS 50 mM, CM-F-CD 8 mM, pH 4,0.

• Nhiệt đ: 20

0

C.• Điện thế: 16 kV

• Chế đ tiêm mẫu: 50 mbar x 3s.

• Bướ c sóng phát hiện: 194 nm.

• N9ng đ ch#t phân tích: 0,1 mg/ml hay 100 ppm atenolol racemic.

Nghiên c'u này có thờ i gian phân tích các đ9ng phân khá dài khoảng 30

phút, và mớ i sơ b tách, định tính các đ9ng phân này. Chúng tôi sN tiếp t4c nghiên

c'u phát triển, hoàn thiện phươ ng pháp để 'ng d4ng vào định lư% ng các đ9ng phân

quang học c7a atenolol.

1.5.2 Nghiên c" u trên th( gi< i.

Mt s" nghiên c'u định lư% ng đ9ng phân quang học c7a Atenolol đã đư% c

công b" trên thế giớ i.

Nghiên c'u c7a Santoro M.I [23], sử d4ng đi!u kiện sắc ký như sau:

• Ct sắc ký hoạt quang: Chiralcel OD (250 x 4,6 mm; 10 Qm).

• Pha đng: Hexan - ethanol - diethylamine = 75: 25: 0,1.

• T"c đ dòng: 0,7 ml/ phút.


Nghiên c'u c7a Eaga M.C [13], sử d4ng đi!u kiện sắc ký như sau:

• Ct sắc ký hoạt quang: Chiral AGP (150 x 4,0 mm; 5 Qm).





- 18 -

• Pha đng: Dung dịch đệm phosphat 10 mM ( pH 7,0 ) - methanol = 95: 5.

• T"c đ dòng: 0,9 ml/ phút.


Trong hai nghiên c'u phân tách đ9ng phân quang học c7a atenolol dùngphươ ng pháp HPLC sử d4ng pha t K nh hoạt quang, nghiên c'u c7a Santoro M.I thờ i

gian lưu các đ9ng phân quang học c7a atenolol khoảng 10 và 12 phút, nghiên c'u

c7a Eaga M.C có thờ i gian lưu 8 và 9 phút. Tuy nhiên, phươ ng pháp sắc ký pha

thuận dùng ct Chiracel OD chi phí r#t đắt ti!n, trong khi dùng phươ ng pháp sắc ký

pha đảo dùng ct Chiral AGP khi phân tích atenolol racemic tM chế phAm viên nén

pic các đ9ng phân quang học c7a atenolol chưa tách khGi nhau hoàn toàn.

Nghiên c'u c7a Wei Wang, Jiande Lu, Xiaoyun Fu, Yaozu Chen [28], sử d4ngđi!u kiện điện di như sau:

• Ct mao quản silica nung chảy, chi!u dài t=ng cng 50 cm, chi!u dài hiệu

d4ng 45 cm, đườ ng kính trong 50 Qm.

• Tiêm mẫu 3psi x 1s.

• Điện thế 18 kV.

• Nhiệt đ mao quản 250C.

• Bướ c sóng phát hiện : 214 nm.• Dung dịch điện di: đệm H3PO4-Triethanolamin 100mM; pH 3,1; n9ng đ

CM-F-CD 7,8 mg/ml.

Nghiên c'u c7a Wuhong Li, Changhai Liu, Guangguo Tan, Xinrong Zhang,

Zhenyu Zhu, Yifeng Chai [29] sau khi khảo sát và lựa chọn, đưa ra đi!u kiện

điện di như sau:

• Ct mao quản silica nung chảy, chi!u dài t=ng cng 48,5 cm, chi!u dài

hiệu d4ng 40 cm, đườ ng kính trong 50 Qm.

• Tiêm mẫu: 50 mbar x 3s.

• Hiệu điện thế: 24 kV.

• Nhiệt đ mao quản: 20oC

• Bướ c sóng phát hiện : 214 nm.





- 19 -

• Dung dịch điện di: Tris 50mM và CM-F-CD 8 mM, đư% c đi!u chJnh b>ng

acid phosphoric tớ i pH 4,0.

• Dung dịch chuAn g"c: hòa tan trong dung dịch đệm Tris 50 mM $ n9ng

đ 10 mM. Dung dịch phân tích đư% c chuAn bị b>ng cách pha loãng dungdịch chuAn g"c vớ i đệm Tris tớ i n9ng đ 0,2 mM. T#t cả các dung dịch

đư% c lọc qua màng lọc 0,22 Qm.

Trong hai nghiên c'u phân tách đ9ng phân quang học c7a atenolol dùng

phươ ng pháp CE, nghiên c'u c7a Wei Wang và cng sự có thờ i gian di chuyển

các đ9ng phân quang học c7a atenolol khoảng 40 phút, nghiên c'u c7a Wuhong

Li và cng sự có thờ i gian di chuyển khoảng 18 phút. Thờ i gian di chuyển c7a

các đ9ng phân quang học c7a atenolol khá dài chưa phù h% p cho công tác kiểmnghiệm thực tế.





- 20 -

CHƯƠ NG 2. ĐỐI TƯỢ NG VÀ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.1.ĐỐI TƯỢ NG NGHIÊN CỨ U, HÓA CHẤT, TRANG THIẾT BỊ

2.1.1.Đ.i t%& ng nghiên c" u

* Chế phAm viên nén có ch'a Atenolol 50 mg (dạng racemic):- Viên nén Atenolol STADA 50 mg, SĐK: VD-12619-10, s" lô: 051113, hạn dùng:

04/11/18, nhà sản xu#t: công ty TNHH liên doanh STADA-VN.

- Viên nén Tenormin 50 mg, SĐK: VN-1585-06, s" lô: KD508, hạn dùng: 25/03/18,

nhà sản xu#t: Astra-Zeneca, Anh qu"c.

* Mẫu placebo: ch'a các thành phần tá dư% c c7a viên do công ty STADA cung c#p

g9m: tinh bt ngô, tinh bt ti!n h9 hóa, lactose monohydrat, povidon K25, natri

laurylsulfat, colloidal silica khan, magnesi stearat.2.1.2.Hóa ch#t, trang thi(t bị

a) Hóa ch#t, ch#t chu?n.

• Ch#t chuAn Atenolol (racemic) c7a Viện Kiểm nghiệm thu"c Trung ươ ng,

hàm lư% ng: 100,17%, đ Am: 0,11% , s" kiểm soát: 0102093.

• ChuAn S-atenolol, hãng sản xu#t Sigma – Aldrich, Mỹ, hàm lư% ng 99%, s"

lô 021M4620V.

• Carboxymethyl-F-cyclodextrin (CM-F-CD), dạng mu"i natri c7a Sigma-

Aldrich, Mỹ

Hóa ch#t, dung môi đạt tiêu chuAn tinh khiết phân tích c7a Merck KGaA, Đ'c.

• Natri hydroxyd

• Tris (hydroxymethyl amino methan (Tris)

• Acid phosphoric 85%

• Acid hydrocloric

• Methanol

b) Trang thi(t bị

• Máy điện di mao quản Agilent, model: G1600AX, s" seri: DE1603499, c7a

Agilent, Mỹ.





- 21 -

• Ct mao quản silica nung chảy, có vG bao polyimid loại có chi!u dài hiệu

d4ng 48,5 cm và 64,5 cm , đườ ng kính trong 50 Qm c7a hãng Agilent.

• Máy thử đ hòa tan Logan UDT 804, Mỹ

• Máy quang ph= UV-VIS SHIMADZU 1800, Nhật Bản.• Máy đo pH (744 pH meter), c7a Metrohm, Th4y Sỹ.

• Cân phân tích Mettler Toledo AL2004, d= 0,1 mg và XS105DU, d=0,01 mg,

Th4y Sỹ.

• Máy siêu âm Ultrasonic LC 30, hãng cung c#p: Elma, Đ'c

• Máy c#t nướ c hai lần Hamilton WSC/4D, Anh.

• Hệ th"ng lọc nướ c siêu sạch Labostar-1, hãng sản xu#t Siemens, Đ'c.

• Màng lọc cellulose acetat vớ i kích thướ c lI lọc 0,2 Qm c7a Sartorius, Đ'c.• B lọ nhựa đựng mẫu và nắp đậy.

• Các d4ng c4 chính xác: các pipet chính xác vớ i thể tích khác nhau, bình định

m'c vớ i thể tích khác nhau.

• Các d4ng c4 khác: c"c có mG, gi#y lọc, phHu th7y tinh…

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨ U

2.2.1.Hoàn thi0n ph%' ng pháp *ịnh l%& ng *1ng phân *.i quang c$a atenolol

b>ng *i0n di mao qu2n.• Lựa chọn dung dịch điện ly n!n.

• Lựa chọn bướ c sóng phát hiện.

• Lựa chọn ct mao quản.

• Lựa chọn hiệu điện thế.

• Lựa chọn n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang.

2.2.2.Th?m *ịnh ph%' ng pháp phân tích.

• Xác định hàm lư% ng đ9ng phân (R), (S)-atenolol trong chuAn atenololracemic.

• Đ phù h% p hệ th"ng.

• Khoảng n9ng đ tuyến tính.

• Đ đDc hiệu.





- 22 -

• Đ lDp lại.

• Đ đúng.

2.2.3. Ứ ng d)ng:

* Định l%& ng các *1ng phân *.i quang c$a atenolol trong m+t s. ch( ph?m cóch" a atenolol trên thị tr%: ng.

* Đánh giá *+ hòa tan các *1ng phân quang h,c c$a atenolol trong ch( ph?m

viên nén.

2.3.PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.3.1.Chu?n bị các dung dịch chu?n, dung dịch m@u và các dung dịch làm vi0c.

• Dung dịch đệm Tris 50mM: cân khoảng 1,51 g Tris vào c"c có mG, hòa tan b>ng

nướ c, chuyển vào bình định m'c 250 ml, b= sung nướ c tớ i vạch, lắc đ!u.• Dung dịch điện di Tris 50 mM ch'a CM-F-CD 8mM, pH 4,0: pha dung dịch

đệm Tris 50 mM, đi!u chJnh b>ng acid phosphoric đDc tớ i pH 4,0. Cân chính xác

khoảng 0,0616 g CM-F-CD cho vào bình định m'c 5 ml, b= sung dung dịch đệm

Tris 50 mM, pH 4,0 tớ i vạch, lắc đ!u.

• Dung dịch NaOH 1 N: cân khoảng 4 g NaOH cho vào c"c có mG, hòa tan trong

100 ml nướ c, lắc đ!u.

• Dung dịch NaOH 0,1 N: L#y 10 ml dung dịch NaOH 1 M, pha loãng và vMa đ7

thành 100 ml, lắc đ!u.

• Dung dịch chuAn g"c atenolol 1000 ppm: cân chính xác khoảng 25 mg chuAn

atenolol racemic vào bình định m'c 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm

Tris 50 mM, siêu âm 15 phút, sau đó b= sung dung dịch đệm vMa đ7. Bảo quản $

4o C, tránh ánh sáng. Các dung dịch phân tích đư% c chuAn bị b>ng cách pha

loãng dung dịch chuAn g"c b>ng dung dịch đệm Tris 50 mM đến n9ng đ yêu

cầu trướ c khi phân tích.

• Dung dịch thử:

- Định lư% ng (chế phAm viên nén atenolol 50 mg): cân chính xác 20 viên tính

kh"i lư% ng trung bình viên, nghi!n mịn. Cân lư% ng bt viên tươ ng 'ng vớ i

khoảng 25 mg atenolol cho vào bình định m'c 25 ml, thêm khoảng 20 ml đệm





- 23 -

Tris, siêu âm 15 phút, sau đó b= sung dung dịch đệm vMa đ7, lọc thu l#y dịch

lọc. L#y 0,5 ml dịch lọc cho vào bình định m'c 5 ml, b= sung dung dịch đệm

Tris 50 mM đến vạch, lắc đ!u.

- Thử đ hòa tan: Lọc dung dịch sau khi thử đ hòa tan qua màng lọc 0,2 Qmtrướ c khi phân tích.

• Dung dịch placebo: cân khoảng 0,1 g bt mẫu placebo cho vào bình định m'c

25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris, siêu âm 15 phút, sau đó b= sung

dung dịch đệm vMa đ7, lắc đ!u sau đó lọc thu l#y dịch lọc. L#y 0,5 ml dịch lọc

cho vào bình định m'c 5 ml, b= sung dung dịch đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc

đ!u.

T#t cả các dung dịch đ!u đư% c lọc qua màng lọc 0,2 Qm trướ c khi tiêm.

2.3.2. Kh2o sát và l3 a ch,n *iều ki0n *i0n di

Tác giả Đinh Thị Thanh và cng sự [10] đã khảo sát các yếu t" ảnh hư$ ng

tớ i quá trình điện di g9m: lựa chọn dung dịch điện ly n!n, loại tác nhân chọn lọc đ"i

quang, pH dung dịch đệm, hiệu điện thế và n9ng đ atenolol trong mẫu phân tích.

Dựa vào kết quả c7a đ! tài này, chúng tôi đưa ra đi!u kiện điện di áp d4ng cho

nghiên c'u như sau:

• Phươ ng pháp đư% c tiến hành trên hệ th"ng điện di mao quản vớ i detector

mảng diod. Nhiệt đ mao quản 200C. Tiêm mẫu 50 mbar x 3s. N9ng đ

atenolol racemic trong mẫu phân tích khoảng 100ppm (kl/tt) (tươ ng 'ng vớ i

khoảng 50ppm mIi đơ n đ9ng phân).

• Xử lý mao quản mớ i: Trướ c khi sử d4ng lần đầu tiên, ct mao quản mớ i

đư% c rửa sạch vớ i methanol trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid

hydrocloric 0,1 M trong 15 phút, và dung d ịch NaOH 1M trong 30 phút.

• Hàng ngày, vào thờ i điểm đầu ngày các mao quản đư% c rửa sạch b>ng dung

dịch NaOH 0,1 M 15 phút, nướ c 5 phút, và vớ i dung dịch điện ly n!n (BGE)

15 phút.

• Gi&a mIi lần chạy, chươ ng trình luyện ct (preconditioning) đư% c thực hiện

vớ i nướ c trong 1 phút, dung dịch NaOH 0,1 M trong 2 phút, nướ c 2 phút, và

BGE 2 phút.





- 24 -

• Thờ i điểm cu"i ngày, mao quản đư% c rửa vớ i dung dịch NaOH 0,1 M trong

20 phút, nướ c 20 phút, sau đó th=i khí 3 phút.

a) L3 a ch,n dung dịch *i0n ly nền

Tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) sử d4ngdung dịch điện ly n!n lần lư% t là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0, ch'a

CM-F-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, ch'a CM-F-CD 8 mM.

Dựa vào tín hiệu trên điện di đ9 thu đư% c, lựa chọn dung dịch điện ly n!n

thích h% p.

b) L3 a ch,n b%< c sóng phát hi0n

Tiến hành quét ph= dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong

Tris 50 mM vớ i bướ c sóng tM 190 đến 225 nm. Dựa vào ph= h#p th4 tìm bướ c sóng

tại đó đ h#p th4 c7a atenolol là cực đại.

c) L3 a ch,n c+t mao qu2n

Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt)

vớ i đi!u kiện điện di trên, sử d4ng các ct mao quản khác nhau.

d) L3 a ch,n hi0u *i0n th( áp vào hai *Au mao qu2n

Sau khi lựa chọn đư% c ct mao quản chúng tôi tiến hành khảo sát lại hiệu

điện thế áp vào hai đầu mao quản. Thay đ=i hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản

tM 15 đến 30 kV (XE= 5 kV) và tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn hiệu điện thế phù

h% p.

e) L3 a ch,n n1ng *+ tác nhân ch,n l,c *.i quang

Tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm vớ i đi!u kiện

điện di đã lựa chọn $ trên và thay đ=i n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang CM-F-

CD tM 6 mM đến 10 mM. Dựa vào tín hiệu trên điện di đ9 thu đư% c, lựa chọn n9ng

đ CM-F-CD thích h% p.

2.3.3 Th?m *ịnh ph%' ng pháp phân tích

Sau khi khảo sát, lựa chọn đư% c đi!u kiện điện di tiến hành thAm định để

đảm bảo phươ ng pháp xây dựng đư% c là phù h% p. Các tiêu chí cần thAm định bao

g9m: đ phù h% p c7a hệ th"ng, đ đDc hiệu, khoảng n9ng đ tuyến tính, đ lDp lại

và đ đúng c7a phươ ng pháp.





- 25 -

Đ+ phù h& p h0 th.ng

Đánh giá đ phù h% p hệ th"ng là phép thử nh>m đánh giá đ =n định c7a

toàn hệ th"ng phân tích bao g9m b$ i các yếu t" như: máy móc, thiết bị, cách tiến

hành phân tích, mẫu thử…Các thông s" đư% c sử d4ng để đánh giá đ phù h% p c7a hệ th"ng bao g9m đ

phân giải Rs gi&a các pic c7a đ9ng phân S và R-atenolol và đ lệch chuAn tươ ng đ"i

(RSD) c7a các đáp 'ng phân tích khi tiêm mẫu lDp lại. Yêu cầu các giá trị thờ i gian

di chuyển, diện tích pic c7a mIi đ9ng phân có RSD Y 2 %, Rs > 2.

Tiến hành tiêm lDp lại 6 lần cùng mt dung dịch chuAn atenolol racemic 100

ppm trong cùng đi!u kiện điện di.

Đ+ *Bc hi0u

ChuAn bị mẫu placebo, mẫu thử và mẫu chuAn atenolol racemic 100 ppm,

mẫu S- atenolol 50 ppm và tiến hành điện di vớ i các đi!u kiện đã chọn đư% c $ trên.

Yêu cầu trên điện di đ9 pic c7a các đ9ng phân phải tách hoàn toàn so vớ i pic c7a

ch#t tạp. Trên điện di đ9 c7a mẫu placebo, tại thờ i điểm 'ng vớ i pic c7a R-/S-

atenolol không đư% c có pic xu#t hiện. Thờ i gian di chuyển và hình dáng pic trên

điện di đ9 c7a mẫu thử và mẫu chuAn phải như nhau.

Kho2ng n1ng *+ tuy(n tính

Để đảm bảo phép định lư% ng cho kết quả chính xác, cần xác định khoảng

n9ng đ mà $ đó có sự tươ ng quan tuyến tính gi&a đáp 'ng phân tích (diện tích pic)

vớ i n9ng đ ch#t phân tích.

Triển khai điện di dãy dung dịch chuAn atenolol racemic có n9ng đ tM 40

ppm đến 140 ppm. M"i tươ ng quan gi&a diện tích pic và n9ng đ ch#t phân tích

đư% c biểu diHn b>ng phươ ng trình h9i quy tuyến tính và hệ s" tươ ng quan h9i quy.

Đườ ng h9i quy có dạng gần như đườ ng thOng và hệ s" tươ ng quan h9i quy x#p xJ 1.

Đ+ chính xácĐ chính xác c7a mt phươ ng pháp phân tích là m'c đ th"ng nh#t gi&a các

kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích đư% c tiến hành lDp đi lDp lại nhi!u lần trên

cùng mt mẫu đ9ng nh#t. Đ chính xác đư% c biểu thị b>ng đ lệch chuAn tươ ng đ"i

(RSD). Nghiên c'u cần tiến hành đánh giá đ lDp lại và đ chính xác trung gian.





- 26 -

− Đ lDp lại: Cùng đi!u kiện thí nghiệm trong khoảng thờ i gian ngắn (như

trong cùng mt ngày)

− Đ chính xác trung gian: Cùng phòng thí nghiệm, thực hiện $ các ngày khác

nhau và/ hoDc ngườ i phân tích khác nhau và/hoDc trên thiết bị khác nhau.Tiến hành điện di xác định n9ng đ atenolol trong 6 mẫu thử đc lập có n9ng

đ khoảng 100 ppm. Đánh giá đ lDp lại c7a kết quả thu đư% c thông qua đ lệch

chuAn tươ ng đ"i RSD, yêu cầu RSD Y 2%.

Đ+ *úng

Đ đúng c7a phươ ng pháp là m'c đ gần sát c7a kết quả phân tích vớ i giá trị

thực c7a mẫu đã biết.

Tiến hành: Thêm chuAn vào các mẫu placebo $ các m'c n9ng đ 80%,

100%, 120% n9ng đ định lư% ng. Tiến hành điện di dung dịch thêm chuAn, dựa

vào diện tích pic c7a các dung dịch này và đườ ng chuAn ta tính % tìm lại lư% ng ch#t

chuAn thêm vào. Đ đúng c7a phươ ng pháp tại mIi n9ng đ phải n>m trong khoảng

tM 98 % đến 102 % [17].

2.3.4 Ứ ng d)ng

* Định l%& ng các *1ng phân *.i quang c$a atenolol trong m+t s. ch( ph?m có

ch" a atenolol trên thị tr%: ng.

Tiến hành điện di các mẫu chuAn atenolol racemic và mẫu thử. Dựa vào diện

tích pic c7a mẫu thử và mẫu chuAn, hàm lư% ng atenolol racemic c7a mẫu chuAn để

xác định hàm lư% ng tMng đ9ng phân atenolol trong mẫu thử.

Hàm lư% ng atenolol, C14H22N2O3, phải đạt đư% c tM 90,0 đến 110,0% so vớ i

lư% ng ghi trên nhãn [1].

* Đánh giá *+ hòa tan các *1ng phân quang h,c c$a atenolol trong ch( ph?m

viên nén.

Tiến hành thử đ hòa tan các chế phAm viên nén Tenormin 50 mg vàAtenolol STADA 50 mg $ môi trườ ng dung dịch HCl 0,1 N, sau đó định lư% ng các

đ9ng phân đ"i quang đư% c hòa tan trong tMng c"c thử b>ng phươ ng pháp đã xây

dựng, tM đó rút ra nhận xét sự giải phóng và hòa tan các đ9ng phân đ"i quang c7a

atenolol trong các chế phAm viên nén [1].





- 27 -

2.3.5 Ph%' ng pháp x9 lý s. li0u

Tính toán và xử lý th"ng kê s" liệu trên phần m!m Microsoft Excel 2007.

Mt s" công th'c tính toán các giá trị th"ng kê như sau:

* Giá trị trung bình∑=

=

n

i

i xn

x1

1

* Đ lệch chuAn SD −∑=

n

i

i x1

( x

(vớ i n là s" phép thử; x là giá trị thực nghiệm th' i)

* Đ lệch chuAn tươ ng đ"i: RSD (%) = 100%

* Công th'c tính kết quả:

Hàm lư% ng atenolol trong viên (mg/viên):

HL S m C 1%RhmS m 1000 m!"#$Z

TJ lệ thu h9i (%):

% &h C'(

C)' 100%

Trong *ó:

Sth: diện tích pic c7a atenolol trong mẫu thử (mAU.s).

Sc: diện tích pic c7a atenolol trong mẫu chuAn (mAU.s).

mc: kh"i lư% ng mẫu chuAn (g).

mth: kh"i lư% ng mẫu thử (g).

Cc: hàm lư% ng atenolol racemic khan trong ch#t chuAn (100,17%).

%Rh: hàm Am c7a ch#t chuAn (0,11%).

m : kh"i lư% ng trung bình viên (g).CTH: N9ng đ thu h9i (ppm).

CLT: N9ng đ lý thuyết (thêm vào) (ppm).





- 28 -

CHƯƠ NG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U

3.1. KHẢO SÁT VÀ LC A CHỌN ĐIU KIỆN ĐIỆN DI

3.1.1 L3 a ch,n dung dịch *i0n ly nền.

Nh>m giảm dâng cao đườ ng n!n, chúng tôi tiến hành điện di sử d4ng dungdịch điện ly n!n là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0 so vớ i dung dịch đệm

Tris 50 mM, pH 4,0 đã đư% c lựa chọn $ nghiên c'u trướ c [10].

Tiến hành điện di theo đi!u kiện: ct mao quản chi!u dài t=ng cng 48,5 cm,

chi!u dài hiệu d4ng 40,0 cm, đườ ng kính trong 50 Qm; nhiệt đ mao quản 200 C,

tiêm mẫu 50 mbar x3s, điện thế 25 kV, dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm

(kl/tt) sử d4ng dung dịch điện di lần lư% t là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH

4,0, ch'a CM-F-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, ch'a CM-F-CD

8 mM.

Kết quả điện di đ9 thu đư% c như sau.

a)

b)

Hình 3.1 Đi0n di *1 khi s9 d)ng các dung dịch *i0n ly nền khác nhau.

a) Đ0m phosphat 50 mM b) Đ0m Tris 50 mM

min1 2 3 4 5 6 7 8

mAU

0

10

20

30

40

50

60

DAD1 D, Sig=194,2 Ref=off (ATENOLOL\130518000356.D)

A r e

a : 2 1 7

. 7 1

6 . 5

9

A r e

a : 2 2 1

. 2 5

7 . 0

5 7

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70


A r e

a : 2 6 1

. 8 8

7 . 6

0 5

8 . 1

2 9





- 29 -

NhDn xét:

TM kết quả $ hình 3.1, nhận th#y khi dùng dung dịch đệm phosphat 50 mM

thì đườ ng n!n nhiHu, pic bị ch[ ngọn. Trong khi sử d4ng dung dịch đệm Tris thì

đườ ng n!n =n định và các pic gọn, tách nhau hoàn toàn. Do đó chúng tôi lựa chọndung dịch đệm Tris 50 mM là dung dịch điện ly n!n cho nghiên c'u tiếp theo.

3.1.2 L3 a ch,n b%< c sóng phát hi0n

Tiến hành quét ph= dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong

Tris 50 mM vớ i bướ c sóng tM 190 đến 225 nm. Dựa vào ph= h#p th4 tìm bướ c sóng

tại đó đ h#p th4 c7a atenolol là cực đại.

K(t qu2:

Tại bướ c sóng 194 nm, đ h#p th4 c7a atenolol trong dung dịch Tris 50 mMlà cực đại. Do đó, lựa chọn bướ c sóng phát hiện cho nghiên c'u định lư% ng atenolol

tiếp theo là 194 nm.

3.1.3 L3 a ch,n c+t mao qu2n

Theo tác giả Đinh Thị Thanh và cng sự [10], khi sử d4ng ct mao quản có

chi!u dài t=ng cng 60,0 cm, chi!u dài hiệu d4ng 50,0 cm, đườ ng kính trong 75 Qm

thì thờ i gian phân tích mẫu khá dài (thờ i gian luyện ct- rửa ct gi&a 2 lần phân tích

liên tiếp là 16 phút, thờ i gian phân tích mẫu khoảng 30 phút). Do đó, chúng tôi khảo

sát lựa chọn mt s" ct mao quản khác nh>m giảm thờ i gian phân tích mẫu và nhiHu

đườ ng n!n so vớ i nghiên c'u trướ c.

Tiến hành điện di dung dịch atenolol racemic chuAn 100 ppm (kl/tt) vớ i đi!u

kiện điện di: nhiệt đ mao quản 200 C, tiêm mẫu 50 mbar x3s, điện thế 25 kV, dung

dịch điện di Tris 50 mM, pH 4,0, ch'a CM-F-CD 8 mM, sử d4ng các ct mao quản

silica nung chảy, có vG bao polyimid vớ i các thông s" ct như sau:

Mao

qu2n

Chiều dài t5ng c+ng

(cm)

Chiều dài hi0u d)ng

(cm)

Đ%: ng kính trong

(Em)1 64,5 56,0 50

2 48,5 40,0 50So sánh tín hiệu thu đư% c để lựa chọn ct phù h% p cho nghiên c'u tiếp theo.

D& liệu điện di đ9 thu đư% c như sau.





- 30 -

a)

b)

Hình 3.2 Đi0n di *1 c$a dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi s9 d)ng v< i

các mao qu2n khác nhau.

a) Mao qu2n 1; b) Mao qu2n 2

NhDn xét:

TM kết quả $ hình 3.3, nhận th#y khi dùng mao quản 1 có chi!u dài hiệu

d4ng 56,0 cm thì đườ ng n!n nhiHu và thờ i gian di chuyển c7a các đ9ng phân c7a

atenolol khá dài (trên 35 phút), trong khi sử d4ng mao quản 2 có chi!u dài hiệu

d4ng 40,0 cm thì điện di đ9 thu đư% c có đườ ng n!n =n định và thờ i gian di chuyển

c7a các đ9ng phân đư% c rút ngắn lại (hơ n 9 phút) và đ phân giải vẫn đạt yêu cầu.

Như vậy, chúng tôi lựa chọn ct mao quản s" 2 có chi!u dài t=ng cng 48,5 cm,

chi!u dài hiệu d4ng 40,0 cm, đườ ng kính trong 50 Qm cho nghiên c'u tiếp theo.3.1.4 L3 a ch,n hi0u *i0n th( áp vào hai *Au mao qu2n

Thay đ=i hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản tM 15 đến 30 kV (XE= 5 kV)

và tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) vớ i các đi!u

kiện điện di: ct mao quản chi!u dài t=ng cng 48,5 cm, chi!u dài hiệu d4ng 40,0

min5 10 15 20 25 30 35 40

mAU

-30

-20

-10

0

10


A r e

a : 2 6 2

. 1 8

3 5 . 5

3 2

A r e

a : 2 7 2

. 3 5 4

3 8 . 7

0 2

min2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 D, Sig=194,4 Ref=360,100 (ATENOLOL\130518000569.D)

A r e a :

2 6 6

. 5

9 . 2

7

A r e a :

2 7 2

. 3 8

9 . 8

3





- 31 -

cm, đườ ng kính trong 50 Qm; nhiệt đ mao quản 200 C, tiêm mẫu 50 mbar x3s, dung

dịch điện di Tris 50 mM, pH 4,0, ch'a CM-F-CD 8 mM, tM d& liệu điện di đ9 thu

đư% c lựa chọn điện thế sử d4ng phù h% p. Điện di đ9 thu đư% c như sau.

a)

b)

c)

min5 10 15 20 25

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140


A r e a :

2 4 1

. 4 0

2 6 . 5

8 8

A r e a :

2 4 6

2 8 . 0

1 5

min2 4 6 8 10 12

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160


A r e a :

3 5 8

. 4 8 2

1 2 . 2

6 6

A r e a :

3 6 2

. 9

1 3 . 2

0 2

min2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200


A r e a :

2 6 6

. 5 3

9 . 2

7

A r e a :

2 7 2

. 3 8 5

9 . 8

3





- 32 -

d)

Hình 3.3 Đi0n di *1 c$a dung dịch chu?n atenolol racemic = 3 *i0n th( s9 d)ng

a) 15 kV; b) 20 kV; c) 25 kV; d) 30 kV

Hình 3.4 Đ1 thị bi;u diễn s3 ph) thu+c c$a th: i gian di chuy;n các *1ng phân

quang h,c c$a atenolol vào giá trị *i0n th( s9 d)ng

NhDn xét:

TM kết quả trên hình 3.4, nhận th#y vớ i giá trị hiệu điện thế tM 15-25 kV thì

các đ9ng phân đ!u đư% c tách ra t"t. P điện thế 15kV, thờ i gian di chuyển c7a các

đ9ng phân kéo dài khoảng 26,5 và 28,0 phút, đườ ng n!n nhiHu. P điện thế 20kV,thờ i gian di chuyển c7a các đ9ng phân rút ngắn xu"ng còn 12,3 và 13,2 phút, đườ ng

n!n còn bị nhiHu ít. Trong khi đó $ điện thế 25 kV, thờ i gian di chuyển c7a các

đ9ng phân rút ngắn xu"ng còn hơ n 9 phút và đườ ng n!n =n định. Khi điện thế sử

d4ng tăng lên 30 kV (giá trị tớ i hạn c7a thiết bị) thì các đ9ng phân di chuyển ra sớ m

min2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200


A r e a :

2 6 9

. 2 6 1

8 . 0

6 8

A r e a :

2 7 6

. 4

8 . 8

3 5

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20 25 30 35

Tm

(phút)

Đi0n th( (kV)

S-atenolol

R-atenolol





- 33 -

hơ n khoảng 8 phút, nhưng các pic bị xen ph7 và chân pic doãng rng. Do đó chúng

tôi lựa chọn điện thế 25 kV để thực hiện cho các nghiên c'u tiếp theo.

3.1.5 L3 a ch,n n1ng *+ tác nhân ch,n l,c *.i quang

Tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) vớ i đi!ukiện điện di: ct mao quản chi!u dài t=ng cng 48,5 cm, chi!u dài hiệu d4ng 40,0

cm, đườ ng kính trong 50 Qm; nhiệt đ mao quản 200 C, tiêm mẫu 50 mbar x3s, điện

thế 25 kV, dung dịch điện di Tris 50 mM, pH 4,0, ch'a CM-F-CD có n9ng đ tM 6

mM đến 10 mM. D& liệu điện di đ9 thu đư% c như sau.

a)

b)

min2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70


min2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 D , Sig=194,4 Ref=360,100 (ATENOLOL\130518000569.D)

A r e a :

2 6 6

. 5 3

9 .

2 7 9

A r e a :

2 7 2

. 3 8 5

9 .

8 3 4





- 34 -

c)

Hình 3.5 Đi0n di *1 dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi thay *5i

n1ng *+ tác nhân ch,n l,c *.i quanga) CM-7-CD 6 mM b)CM-7-CD 8 mM c)CM-7-CD 10 mM

NhDn xét:

TM kết quả trên hình 3.5, nhận th#y khi n9ng đ CM-F-CD b>ng 6 mM thì

hai đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol chưa tách khGi nhau, khi n9ng đ tăng lên 8

mM thì hai pic đã tách khGi nhau hoàn toàn và khi tăng n9ng đ lên 10 mM thì hai

pic tách khGi nhau nhưng lại kéo dài thờ i gian di chuyển và tiêu hao nhi!u ch#t chọn

lọc đ"i quang đắt ti!n. Do đó, chúng tôi lựa chọn n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i

quang CM-F-CD 8 mM cho nghiên c'u tiếp theo.

Qua kết quả khảo sát chúng tôi đã hoàn thiện đư% c đi!u kiện phân tích như sau:

Ct mao quản silica nung chảy: 48,5cm×50µm i.d (chi!u dài hiệu d4ng 40,0 cm)

N9ng đ atenolol racemic trong mẫu phân tích: 100ppm (kl/tt)

Dung dịch điện ly n!n: TRIS 50mM, CM-F-CD 8mM, pH 4,0 (đi!u chJnh pH

b>ng acid phosphoric đDc).

Nhiệt đ mao quản duy trì $ 200C.

Điện thế sử d4ng 25 kV.

Chế đ tiêm mẫu 50mbar×3s.

Bướ c sóng phát hiện 194 nm.

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

200


A r e a :

6 4 4

. 2 3 4

1 1 .

7 3 7

A r e a :

6 4 9

. 6 3 3

1 3 .

1 6 9





- 35 -

3.2 THFM ĐỊNH PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH

3.2.1. Xác *ịnh hàm l%& ng *1ng phân R, S-atenolol trong chu?n atenololracemicChuAn bị mẫu:

- Dung dịch chuAn S-atenolol (chuAn S-atenolol hàm lư% ng 99%).

Kh"i lư% ng cân(mg)

T=ng thể tích pha loãng(ml)

N9ng đ dung dịch chuAnS-atenolol (ppm)

4,86 100 48,11

- Dung dịch chuAn atenolol racemic.

Tiến hành điện di các mẫu theo đi!u kiện đã lựa chọn. Kết quả xác định hàmlư% ng các đ9ng phân trong chuAn atenolol racemic đư% c trình bày trong bảng 3.1.

Như vậy, chuAn atenolol racemic c7a Viện Kiểm nghiệm thu"c Trung ươ ng

có thành phần g9m 48,72% S-atenolol và 51,28% R-atenolol.B2ng 3.1 Xác *ịnh hàm l%& ng các *1ng phân trong chu?n atenolol racemic

Dung dịchChuAn

S-atenolol

ChuAnracemic

1

ChuAnracemic

2

ChuAnracemic

3

Diện tích pic S-atenolol (mAU.s) 262,3 267,0 266,6 265,8

T=ng n9ng đ atenolol racemic(ppm)

100,86 100,46 99,66

N9ng đ S-atenolol (ppm) 48,11 48,97 48,90 48,75

N9ng đ R-atenolol (ppm) 51,89 51,56 50,91TW lệ (%) S-atenolol trong chuAn racemic 48,55 48,67 48,92

TW lệ (%) S-atenolol trung bình 48,72

TW lệ (%) R-atenolol trong chuAn racemic 51,45 51,33 51,08

TW lệ (%) R-atenolol trung bình 51,28

Kh"i lư% ng cân(mg)

T=ng thể tích pha loãng(ml)

N9ng đ dung dịch chuAnatenolol racemic (ppm)

25,20 250 100,86

25,10 250 100,46

24,90 250 99,66





- 36 -

3.2.2 Đ+ phù h& p h0 th.ng

Tiến hành tiêm lDp lại 6 lần cùng mt dung dịch chuAn atenolol racemic 100

ppm trong cùng đi!u kiện điện di.

Kết quả đ phù h% p hệ th"ng đư% c thể hiện trong bảng 3.2.B2ng 3.2 Đ+ phù h& p h0 th.ng

STT

S-atenolol R-atenolol Đ+ phân

gi2i

(Rs)tm

(phút)

Di0n tích pic

(mAU.s)

tm

(phút)

Di0n tích pic

(mAU.s)

1 9,39 272,1 9,92 276,1 2,66

2 9,37 264,1 10,04 274,3 2,66

3 9,26 262,8 9,91 265,2 3,21

4 9,41 263,7 10,08 268,3 3,00

5 9,28 267,3 9,85 270,3 2,46

6 9,22 266,2 9,76 269,5 2,42

Trung

bình 9,32 266,03 9,92 270,62 2,74

RSD

(%)0,85 1,28 1,20 1,47

NhDn xét:

Kết quả trong bảng 3.2 cho th#y, RSD (%) đ"i vớ i thờ i gian di chuyển và

diện tích pic c7a hai đ9ng phân S-atenolol và R-atenolol đ!u n>m trong khoảng cho

phép, nhG hơ n 2%. Đ9ng thờ i đ phân giải gi&a hai đ9ng phân đ!u lớ n hơ n 2. Đi!unày ch'ng tG hệ th"ng điện di phù h% p cho việc định lư% ng các đ9ng phân đ"i

quang c7a atenolol.





- 37 -

3.2.3 Đ+ *Bc hi0u

Tiến hành điện di lần lư% t dung dịch placebo, dung dịch chuAn atenolol

racemic, dung dịch thử atenolol chuAn bị tM viên nén Atenolol STADA 50 mg, dung

dịch chuAn S-atenolol trong cùng mt đi!u kiện.Kết quả thu đư% c như sau:

Hình 3.6 Đi0n di *1 m@u placebo

Hình 3.7 Đi0n di *1 m@u atenolol racemic chu?n

Hình 3.8 Đi0n di *1 m@u atenolol STADA

min2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

100

150

200


min2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200


A r e a :

2 6 6

. 5 3

9 . 2

7

A r e a :

2 7 2

. 3 8

9 . 8

3

min2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200


A r e a :

2 6 7

. 4 3 3

9 . 3

4 9

A r e a :

2 7 3

. 1 2 9

9 . 9

6 3





- 38 -

Hình 3.9 Đi0n di *1 m@u S-atenolol

NhDn xét:

Trên điện di đ9 c7a mẫu placebo không xu#t hiện pic $ thờ i điểm xu#t hiện

pic cả $ mẫu chuAn và mẫu thử.

Thờ i gian di chuyển c7a pic trên điện di đ9 c7a mẫu thử tươ ng 'ng vớ i thờ i

gian di chuyển c7a pic trên điện di đ9 mẫu chuAn.

Thờ i gian di chuyển c7a đ9ng phân S-atenolol là khoảng 9,3 phút tươ ng 'ng

vớ i đ9ng phân di chuyển ra trướ c trên điện di đ9 mẫu atenolol racemic chuAn và

atenolol STADA (mẫu thử).

Như vậy phươ ng pháp có đ đDc hiệu đáp 'ng quy định.

3.2.4 Kho2ng n1ng *+ tuy(n tính

Tiến hành điện di dãy dung dịch chuAn atenolol racemic có n9ng đ tM 40

ppm đến 140 ppm. Dãy dung dịch chuAn atenolol đư% c chuAn bị b>ng cách pha

loãng dung dịch chuAn g"c atenolol 1000 ppm b>ng dung dịch đệm Tris 50mM như

bảng 3.3.

Kh"i lư% ng chuAn mch = 25,1 mg. N9ng đ chuAn g"c 1004,6 ppm.

Tiến hành phân tích b>ng chươ ng trình điện di đã xây dựng, kết quả đư% c

trình bày trong bảng 3.4; 3.5; 3.6.

min2 4 6 8

mAU

0

50

100

150

200

250


9 . 3

0 0





- 39 -

B2ng 3.3 Chu?n bị dãy dung dịch chu?n atenolol racemic

STTTh; tíchchu?n

g.c (El)

Đ0mTris 50

mM(ml)

N1ng *+ atenolol

racemic (ppm)

N1ng *+ S-atenolol

(ppm)

N1ng *+ R-atenolol

(ppm)

1 200

VMa đ7 5ml

40,18 19,58 20,60

2 300 60,28 29,37 30,91

3 400 80,37 39,16 41,21

4 500 100,46 48,94 51,52

5 600 120,55 58,73 61,82

6 700 140,64 68,52 72,12

B2ng 3.4 Quan h0 tuy(n tính giG a n1ng *+ và di0n tích pic c$a atenolol racemic

N9ng đ atenolol racemic

(ppm)40,18 60,28 80,37 100,46 120,55 140,64

T=ng diện tíchhai pic (mAU.s)

214,1 322,6 423,4 540,2 642,2 750,0

Phươ ng trình h9i quy tuyến tính y=5,34x - 0,725

Hệ s" tươ ng quan tuyến tính r= 0,9998

y = 5.34x - 0.725

R² = 0.999

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 20 40 60 80 100 120 140 160





- 40 -

B2ng 3.5 Quan h0 tuy(n tính giG a n1ng *+ và di0n tích pic c$a S-atenolol

N9ng đ S-atenolol(ppm)

19,58 29,37 39,16 48,94 58,73 68,52

Diện tích pic

(mAU.s) 106,4 160,4 209,3 266,6 318,7 371,3Phươ ng trình h9i quy tuyến tính y=5,42x + 0,029


B2ng 3.6 Quan h0 tuy(n tính giG a n1ng *+ và di0n tích pic c$a R-atenolol

N9ng đ R-atenolol (ppm)

20,6 30,91 41,21 51,52 61,82 72,12

Diện tích pic(mAU.s) 107,7 162,2 214,1 273,6 323,5 378,7

Phươ ng trình h9i quy tuyến tính y=5,264x - 0,755


y = 5.420x + 0.029

R² = 0.999

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 10 20 30 40 50 60 70 80

y = 5.264x - 0.755

R² = 0.999

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 10 20 30 40 50 60 70 80





- 41 -

NhDn xét:

TM đ9 thị cho th#y có m"i quan hệ tuyến tính chDt chN gi&a n9ng đ atenolol

racemic và S-atenolol vớ i diện tích pic tươ ng 'ng c7a chúng trong khoảng n9ng đ

tM 20 ppm đến 70 ppm. Đườ ng h9i quy có dạng đườ ng thOng vớ i hệ s" tươ ng quan rđ!u lớ n hơ n 0,997 (hay R2 \ 0,995). Chúng tôi lựa chọn n9ng đ mIi đ9ng phân đ"i

quang atenolol là 50 ppm làm n9ng đ định lư% ng.

3.2.5 Đ+ chính xác

a. Đ+ lBp lại

Đ lDp lại c7a phươ ng pháp đư% c xác định trên 6 phép thử song song trên

cùng mt mẫu vớ i cùng mt đi!u kiện điện di, trong cùng mt ngày.

ChuAn bị dung dịch mẫu thử và mẫu chuAn như chJ dẫn $ m4c 2.3.1.

Kết quả khảo sát đ lDp lại trên mẫu thử đư% c trình bày trong bảng 3.6.

NhDn xét:

Vớ i đi!u kiện điện di đã lựa chọn, kết quả định lư% ng các đ9ng phân c7a

Atenolol đ!u có RSD < 2% . Như vậy, phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân Atenolol

trong chế phAm có đ lDp lại đáp 'ng quy định.

B2ng 3.7 K(t qu2 *ánh giá *+ lBp lại trên m@u Atenolol STADA 50 mg

STTKh.i

l%& ng cân(g)

S-atenolol R-atenolol T5ng hàml%& ng

(mg/viên)Di0n tích

pic(mAU.s)

Hàml%& ng

(mg/viên)

Di0n tíchpic

(mAU.s)

Hàml%& ng

(mg/viên)

Atenolol STADA 50 mg (* 0,15010 g)

1 0,0775 270,4 24,10 274,4 25,15 49,252 0,0742 265,6 24,72 273,0 26,14 50,86

3 0,0760 269,1 24,45 274,9 25,70 50,15

4 0,0754 268,1 24,56 272,2 25,65 50,205 0,0781 270,1 23,88 276,6 25,16 49,04

6 0,0747 266,5 24,64 273,2 25,98 50,62

Chu?n 25,2 mg 267,0 273,2Trung bình 24,39 25,63 50,02

RSD (%) 1,35 1,59 1,46





- 42 -

b. Đ+ chính xác trung gian.

Tiến hành phân tích xác định hàm lư% ng các đ9ng phân c7a atenolol trong

mẫu thử Atenolol STADA 50 mg trong nh&ng ngày tiếp theo. So sánh kết quả 6 lần

phân tích đánh giá đ lDp lại vớ i 3 lần phân tích đc lập đư% c thực hiện khác ngàytrên cùng mẫu chế phAm. Kết quả xác định hàm lư% ng các đ9ng phân quang học c7a

atenolol trong mẫu thử đư% c trình bày $ bảng 3.7.

NhDn xét:

Qua 9 lần phân tích thực nghiệm, kết quả định lư% ng các đ9ng phân c7a

atenolol đ!u có RSD < 2% . Như vậy, phươ ng pháp định lư% ng các đ9ng phân c7a

atenolol trong chế phAm thể hiện đ chính xác trung gian t"t.

B2ng 3.8

K(t qu2 *ánh giá *+ chính xác trung gian trên m@u Atenolol STADA 50 mg

STTKh.il%& ngcân (g)

S-atenolol R-atenolol T5ng hàml%& ng

(mg/viên)Di0n tích

pic(mAU.s)

Hàml%& ng

(mg/viên)

Di0n tíchpic

(mAU.s)

Hàml%& ng

(mg/viên)

K(t qu2 *ánh giá *+ lBp lại1 0,0775 270,4 24,10 274,4 25,15 49,252 0,0742 265,6 24,72 273,0 26,14 50,86

3 0,0760 269,1 24,45 274,9 25,70 50,154 0,0754 268,1 24,56 272,2 25,65 50,205 0,0781 270,1 23,88 276,6 25,16 49,046 0,0747 266,5 24,64 273,2 25,98 50,62

K(t qu2 phân tích *+c lDp khác ngày7 0,0751 266,5 24,45 272,0 25,59 50,048 0,0739 265,5 24,75 270,4 25,85 50,609 0,0745 265,7 24,57 272,5 25,84 50,41

Chu?n 25,1 mg 266,6 273,6Trung bình 24,46 25,67 50,13

RSD (%) 1,18 1,32 1,233.2.6 Đ+ *úng

Tiến hành thAm định đ đúng theo phươ ng pháp mẫu tự tạo, thêm chính xác

chuAn atenolol racemic vào mẫu placebo. Lư% ng ch#t chuAn thêm vào $ 3 m'c n9ng

đ tươ ng đươ ng 80%, 100%, 120% n9ng đ định lư% ng. MIi m'c n9ng đ g9m có





- 43 -

3 mẫu đc lập. Xác định phần trăm n9ng đ tìm lại đư% c c7a mIi đ9ng phân so vớ i

lư% ng cho vào ban đầu.

B2ng 3.9 K(t qu2 *ánh giá kh2 nHng tìm lại v< i S-atenolol

STT

N1ng *+ chu?natenolol

racemic thêm(Eg/ml)

N1ng *+ chu?n S-atenolol

thêm(Eg/ml)

Di0n tíchpic S-

atenolol(mAU.s)

N1ng *+ S-atenolol tìmlại (Eg/ml)

TI l0 thuh1i (%)

1 79,73 38,84 210,3 38,80 99,88

2 80,69 39,31 214,0 39,48 100,42

3 80,37 39,16 213,5 39,39 100,59

4 99,66 48,55 261,9 48,32 99,51

5 100,86 49,14 264,6 48,81 99,34

6 100,46 48,94 264,4 48,78 99,667 119,59 58,27 312,8 57,71 99,04

8 121,03 58,97 317,8 58,63 99,43

9 120,55 58,73 316,6 58,41 99,45

Trung bình 99,70

RSD (%) 0,51

B2ng 3.10 K(t qu2 *ánh giá kh2 nHng tìm lại v< i R-atenolol

STT

N1ng *+

chu?natenolol

racemic thêm(Eg/ml)

N1ng *+

chu?n R-atenolol

thêm(Eg/ml)

Di0n tíchpic R-atenolol(mAU.s)

N1ng *+ R-atenolol tìmlại (Eg/ml)

TI l0 thuh1i (%)

1 79,73 40,88 213,3 40,66 99,46

2 80,69 41,38 218,2 41,59 100,53

3 80,37 41,21 216,0 41,18 99,91

4 99,66 51,11 270,0 51,44 100,64

5 100,86 51,72 275,5 52,48 101,47

6 100,46 51,52 270,5 51,53 100,037 119,59 61,33 322,6, 61,43 100,16

8 121,03 62,07 325,1 61,90 99,74

9 120,55 61,82 320,1 60,95 98,60

Trung bình 100,06

RSD (%) 0,80





- 44 -

NhDn xét:

Kết quả trong bảng cho th#y, tW lệ tìm lại c7a các đ9ng phân c7a atenolol tM

98,60% đến 101,47% đ!u n>m trong khoảng cho phép tM 98% đến 102%. Như vậy

phươ ng pháp định lư% ng cho đ đúng t"t khi định lư% ng các đ9ng phân c7aatenolol.

3.3 Ứ NG DỤNG

3.3.1 ĐỊNH LƯỢ NG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL

TRONG MỘT SỐ CHẾ PHFM.

Trong nghiên c'u này, chúng tôi áp d4ng phươ ng pháp đã xây dựng để định

lư% ng các đ9ng phân c7a atenolol trong mt s" chế phAm trên thị trườ ng $ dạng

viên nén. ChuAn bị mẫu:

- Mẫu chuAn : dung dịch chuAn atenolol racemic có n9ng đ khoảng 100 ppm.

- Mẫu thử: TM các chế phAm viên nén trên thị trườ ng, pha mẫu thử có n9ng đ

atenolol tươ ng đươ ng mẫu chuAn.

Tiến hành điện di các mẫu theo đi!u kiện đã chọn, mIi mẫu thử tiến hành 3

lần và tính kết quả trung bình. Kết quả thu đư% c như sau:

B2ng 3.11 K(t qu2 *ịnh l%& ng m@u ch( ph?m viên nén ch" a atenolol

SttKh.il%& ngcân (g)

Di0n tích pic(mAU.s) Hàm l%& ng(mg/viên) T5ng kh.il%& ng

(mg/viên)

Hàml%& ng sov< i

nhãn(%)

S(-) R(+) S(-) R(+)

Atenolol STADA 50 mg (+ 0,15010 g)

1 0,0761 264,7 277,8 24,02 25,93 49,95

2 0,0754 267,1 272,2 24,46 25,65 50,11

3 0,0757 266,4 274,2 24,30 25,73 50,03

100,06Trung bình 24,26 25,77 50,03





- 45 -

Tenormin 50 mg (+ 0,21392 g)

4 0,1070 267,3 273,0 24,59 25,83 50,42

5 0,1073 265,9 276,1 24,39 26,05 50,436 0,1066 266,1 271,3 24,57 25,77 50,34

Trung bình 24,52 25,88 50,40 100,80

Chu?n

7 0,0252 267,0 273,2

NhDn xét:Kết quả trong bảng cho th#y, hai chế phAm đem định lư% ng đ!u đạt yêu cầu

v! hàm lư% ng tM 90,0 đến 110,0% so vớ i lư% ng ghi trên nhãn và đ!u ch'a atenolol

dạng racemic.

3.3.2 ĐÁNH GIÁ ĐỘ HÒA TAN CÁC ĐỒNG PHÂN CỦA ATENOLOL

TRONG CHẾ PHFM VIÊN NÉN.

Tiến hành thử đ hòa tan các chế phAm viên nén Tenormin 50 mg và

Atenolol STADA 50 mg $ môi trườ ng dung dịch HCl 0,1 N, sau đó định lư% ng các

đ9ng phân đ"i quang đư% c hòa tan trong tMng c"c thử b>ng phươ ng pháp đã xây

dựng, tM đó rút ra nhận xét sự giải phóng và hòa tan các đ9ng phân đ"i quang c7a

atenolol trong các chế phAm viên nén.

Thiết bị: Kiểu cánh khu#y.

Môi trườ ng hòa tan: 500 ml dung dịch HCl 0,1 N.

T"c đ quay: 50 vòng/ phút.

Nhiệt đ: 370C ± 0,5 0C

Thờ i gian l#y mẫu: 45 phút.





- 46 -

B2ng 3.12 K(t qu2 *ịnh l%& ng các *1ng phân *.i quang c$a atenolol trong

m@u th9 hòa tan

Stt

Di0n tích pic(mAU.s)

L%& ng hoạtch#t gi2iphóng

(mg/viên)T5ng kh.i

l%& ng(mg/viên)

L%& ngS-

atenololhòa tanso v< inhãn(%)

L%& ngR-

atenololhòa tanso v< inhãn(%)

L%& ng

atenololhòa tanso v< inhãn(%)S(-) R(+) S(-) R(+)

Atenolol STADA 50 mg

1 247,5 253,0 22,65 24,36 47,01 90,58 97,46 94,02

2 248,5 254,9 22,74 24,55 47,28 90,95 98,19 94,57

3 260,2 266,6 23,81 25,67 49,48 95,23 102,70 98,96

4 267,0 272,7 24,43 26,26 50,69 97,72 105,05 101,385 267,3 276,2 24,46 26,60 51,06 97,83 106,40 102,11

6 265,1 276,4 24,26 26,62 50,87 97,02 106,47 101,75

Trung bình 94,89 102,71 98,80

RSD(%) 3,51 3,92 3,71

Tenormin 50 mg

1 255,2 259,0 23,35 24,26 47,61 93,40 97,04 95,22

2 257,1 262,6 23,52 24,60 48,12 94,09 98,39 96,24

3 269,6 277,7 24,67 26,01 50,68 98,67 104,05 101,364 264,2 272,3 24,17 25,51 49,68 96,69 102,02 99,36

5 270,0 278,8 24,70 26,11 50,82 98,82 104,46 101,64

6 265,1 274,9 24,26 25,75 50,00 97,02 103,00 100,01

Trung bình 96,45 101,49 98,97

RSD(%) 2,35 3,03 2,69

Chu?n(mc =0,0250 g)

1 266,4 273,9

NhDn xét:

Kết quả trong bảng 3.10 cho th#y, sự giải phóng và hòa tan các đ9ng phân

quang học c7a atenolol trong hai chế phAm Atenolol STADA 50 mg và Tenormin

50 mg là cao, x#p xJ 99%.





- 47 -

CHƯƠ NG 4. BÀN LUẬN

Hiện nay, s" lư% ng hoạt ch#t có tính ch#t hoạt quang đang lưu hành trên thị

trườ ng dư% c phAm thế giớ i chiếm mt tW lệ r#t lớ n và đang không ngMng tăng lên.

Việc sử d4ng dạng đ9ng phân quang học tinh khiết thay cho hIn h% p racemic manglại nhi!u l% i ích đã đư% c khoa học ch'ng minh. Bên cạnh việc đưa vào sản xu#t và

sử d4ng các dạng đ9ng phân tinh khiết, đ9ng thờ i cũng đDt ra yêu cầu phải có

phươ ng pháp phân tích xác định đư% c thành phần, hàm lư% ng c7a các đ9ng phân

hoạt quang này.

Phươ ng pháp phân tách các đ9ng phân quang học đư% c sử d4ng nhi!u nh#t

hiện nay là phươ ng pháp sắc ký lGng hiệu năng cao HPLC và phươ ng pháp điện di

mao quản CE sử d4ng tác nhân chọn lọc đ"i quang (chiral selector). Phươ ng pháp

điện di mao quản (CE) đã và đang đư% c nghiên c'u, 'ng d4ng trong phân tích các

đ9ng phân quang học ngày càng nhi!u vớ i mt s" ưu điểm vư% t tri hơ n so vớ i

HPLC đó là: vận hành thiết bị đơ n giản, thờ i gian phân tích nhanh nhưng vẫn đạt đ

phân giải cao, t"n r#t ít hóa ch#t, thu"c thử cho xử lý mẫu và chạy máy. ĐDc biệt,

CE không cần phải sử d4ng ct sắc ký chọn lọc đ"i quang đắt ti!n như HPLC do chJ

cần cho thêm tác nhân chọn lọc đ"i quang vào dung dịch điện di. MDt khác, CE cho

phép thay đ=i linh hoạt loại và n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang, thể tích mẫu

nhG cho phép sử d4ng các thu"c thử đắt ti!n do đó r#t thuận l% i trong quá trình sàng

lọc tác nhân chọn lọc đ"i quang, đi!u kiện điện di và t"i ưu hóa phươ ng pháp

[14],[15].

Trên thế giớ i, nghiên c'u v! phân tích các đ9ng phân quang học b>ng CE

đư% c nhi!u nhà khoa học quan tâm. Vớ i r#t nhi!u tác nhân chọn lọc đ"i quang khác

nhau tạo ra nhi!u cơ chế phân tách như cyclodextrin, protein, polysaccharid, kháng

sinh glycopeptid…Tại Việt Nam, các công trình nghiên c'u v! phân tách các đ9ng

phân quang học chưa nhi!u, s" lư% ng hoạt ch#t đư% c nghiên c'u chiếm tW lệ nhG.Mt s" nghiên c'u như phân tích đ9ng phân đ"i quang c7a chlorpheniramin maleat,

amlodipin, lamivudin, propranolol, ofloxacin. ĐDc biệt s" lư% ng các công trình

nghiên c'u sử d4ng phươ ng pháp CE r#t ít, do thực tế thiết bị điện di mao quản

chưa đư% c trang bị nhi!u và s" lư% ng thu"c $ dạng đ9ng phân tinh khiết đư% c sử





- 48 -

d4ng chưa nhi!u, tập trung ch7 yếu $ các dư% c ch#t đi!u trị bệnh tim mạch

(propranolol, amlodipin), ch"ng virus (lamivudin), kháng sinh (ofloxacin).

Atenolol thuc nhóm thu"c đi!u trị bệnh tim mạch, công th'c c#u tạo c7a

atenolol có mt carbon b#t đ"i trong phân tử do đó t9n tại dướ i hai dạng đ9ng phânquang học (R,S). Nhi!u nghiên c'u đã ch'ng minh r>ng trong hai đ9ng phân quang

học này, đ9ng phân S-atenolol đóng vai trò ch7 yếu trong tác d4ng dư% c lý và có

đc tính th#p hơ n so vớ i đ9ng phân R-atenolol. Do đó trong thực tế đòi hGi phải sản

xu#t và đưa vào sử d4ng dạng đơ n đ9ng phân S-atenolol để nâng cao hiệu quả đi!u

trị bệnh trên lâm sàng. Đ9ng thờ i cũng yêu cầu phải xây dựng đư% c phươ ng pháp

phân tách và định lư% ng đư% c tMng dạng đơ n đ9ng phân trong hIn h% p racemic c7a

atenolol.

Tác giả Đinh Thị Thanh và cng sự [10] đã nghiên c'u khảo sát các yếu t"

ảnh hư$ ng đến quá trình điện di và đưa ra đi!u kiện điện di như sau:

• Ct mao quản silica nung chảy: chi!u dài t=ng cng 58,5 cm, chi!u dài

hiệu d4ng 50 cm, đườ ng kính trong 75 Qm.

• Dung dịch điện di: Tris 50 mM, CM-F-CD 8 mM, pH 4,0.

• Nhiệt đ: 200C.

• Hiệu điện thế: 16 kV.

• Chế đ tiêm mẫu: 50 mbar x 3s.


• N9ng đ ch#t phân tích: 100 ppm (kl/tt) atenolol racemic.

Vớ i đi!u kiện điện di như trên, đ9ng phân S-atenolol di chuyển ra trướ c,

đ9ng phân R-atenolol di chuyển ra sau. Đi!u đó có thể đư% c giải thích b>ng cơ chế

tạo ph'c l9ng (inclusion complexation) gi&a hai đ9ng phân c7a atenolol vớ i tác

nhân chọn lọc đ"i quang CM-F-CD.





- 49 -

Hình 4.1: Vị trí t%' ng tác liên k(t hydro[29].Cơ chế tạo ph'c l9ng gi&a các đ9ng phân quang học c7a atenolol và CM-F-CD:

Đ9ng phân R-atenolol có 3 vị trí có tươ ng tác liên kết hydro vớ i CM-F-CD

(vị trí 1, 2, 3), trong khi đó đ9ng phân S-atenolol chJ có mt vị trí có tươ ng tác liên

kết hydro (vị trí 3). Do đó ái lực c7a đ9ng phân R-atenolol vớ i CM-F-CD lớ n hơ n

c7a đ9ng phân S-atenolol dẫn đến sự tạo ph'c l9ng c7a đ9ng phân R-atenolol b!n

hơ n. Và cu"i cùng dẫn đến linh đ điện di c7a đ9ng phân R-atenolol th#p hơ n và di

chuyển ra sau đ9ng phân S-atenolol [29].Nghiên c'u c7a tác giả Đinh Thị Thanh và cng sự [10], đã đưa ra đư% c đi!u

kiện điện di để tách, định tính và sơ b định lư% ng các đ9ng phân đ"i quang c7a

atenolol. Tuy nhiên, nghiên c'u này có thờ i gian phân tích mẫu khá dài (thờ i gian

luyện ct- rửa ct gi&a 2 lần phân tích liên tiếp là 16 phút, thờ i gian phân tích mẫu

khoảng 30 phút), đườ ng n!n bị nhiHu. Do đó s" lư% ng mẫu phân tích đư% c không

nhi!u chưa đáp 'ng đư% c yêu cầu sản xu#t và kiểm định mẫu trên thực tế.

Nghiên c'u c7a chúng tôi kế thMa nghiên c'u trên và tiếp t4c hoàn thiện

phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol b>ng điện di mao quản.

Sau khi nghiên c'u và làm thực nghiệm, chúng tôi đã hoàn thiện phươ ng pháp định

lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol trong chế phAm b>ng điện di mao quản.

Nghiên c'u c7a chúng tôi sử d4ng ct mao quản có chi!u dài hiệu d4ng 40 cm,

Vị trí 1

Vị trí 2

Vị trí 3

T%' ng tác kị n%< c





- 50 -

đườ ng kính trong 50 Qm, và sử d4ng điện thế áp vào hai đầu mao quản là 25 kV,

thờ i gian phân tích mẫu đư% c rút ngắn hơ n r#t nhi!u (thờ i gian luyện ct là 7 phút,

thờ i gian phân tích mẫu khoảng 10 phút) đ9ng thờ i đườ ng n!n mẫu =n định t"t.

So vớ i phươ ng pháp HPLC c7a tác giả NguyHn Thị Thu Hi!n và cng sự [9],phươ ng pháp CE chúng tôi xây dựng đư% c có mt s" ưu điểm hơ n như: vận hành

thiết bị CE đơ n giản, thờ i gian phân tích nhanh (thờ i gian chạy mẫu b>ng CE

khoảng 10 phút so vớ i 17 phút b>ng phươ ng pháp HPLC) nhưng vẫn đạt đ phân

giải cao, t"n r#t ít hóa ch#t, thu"c thử cho xử lý mẫu và chạy máy. Dung dịch cho

chạy máy chJ là dung dịch đệm nên an toàn cho ngườ i vận hành máy và môi trườ ng.

Trong khi HPLC sử d4ng mt lư% ng dung môi, hóa ch#t lớ n chạy máy, đDc biệt là

sự có mDt c7a dung môi h&u cơ (n-hexan; 1,2 dicloromethan; methanol; acid

trifluoroacetic) vMa đắt ti!n và cũng r#t đc hại, gây ô nhiHm môi trườ ng ảnh hư$ ng

trực tiếp tớ i s'c khGe ngườ i làm phân tích. ĐDc biệt, phươ ng pháp CE không cần

phải sử d4ng ct sắc ký hoạt quang đắt ti!n như phươ ng pháp HPLC (sử d4ng ct

Chirex 3022 (S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(E-naphtyl)ethylamin) do chJ

cần cho thêm tác nhân chọn lọc đ"i quang vào dung dịch điện di n!n (BGE). MDt

khác, CE cho phép thay đ=i linh hoạt loại và n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang

khi khảo sát chọn đi!u kiện điện di so vớ i phải sử d4ng nhi!u ct sắc ký hoạt quang

thươ ng mại hóa, do mIi loại ct đư% c gắn mt loại pha t K nh hoạt quang chJ thích

h% p cho phân tách mt s" đ9ng phân quang học nh#t định.

MDt khác, phươ ng pháp HPLC khó áp d4ng trong việc định lư% ng các đ9ng

phân quang học c7a atenolol trong phép thử đ hòa tan. Do trong phép thử hòa tan

sử d4ng môi trườ ng hòa tan có dung môi nướ c là dung dịch HCl 0,1 N, trong khi

phươ ng pháp định lư% ng b>ng HPLC mẫu ch'a atenolol phải hòa tan trong dung

môi methanol và pha loãng b>ng pha đng (có ch'a dung môi h&u cơ n-hexan, 1,2

dicloromethan, methanol và acid trifluoroacetic). Như vậy, theo phươ ng phápHPLC để định lư% ng đư% c các đ9ng phân c7a atenolol sau thử hòa tan cần bướ c

chiết chuyển các đ9ng phân này tM pha dung dịch nướ c (dung dịch acid HCl 0,1 N)

sang pha dung môi h&u cơ (pha đng) r9i mớ i tiêm vào hệ th"ng sắc kí. Quá trình

này khá ph'c tạp và có thể có nh&ng sai s" trong quá trình xử lý mẫu. Phươ ng pháp





- 51 -

CE có thể sử d4ng ngay sau khi thử hòa tan mẫu mà không qua quá trình xử lý,

chiết mẫu này. Do đó có thể tiết kiệm đư% c thờ i gian và chi phí cho quá trình phân

tích mẫu.

Kết quả nghiên c'u c7a chúng tôi có thờ i gian di chuyển các đ9ng phân c7aatenolol tươ ng đươ ng vớ i nghiên c'u sử d4ng ct pha t K nh hoạt quang Chiracel OD

c7a Santoro M.I [23] khoảng 10 phút, các pic tách nhau hoàn toàn. So sánh vớ i các

nghiên c'u dùng phươ ng pháp CE c7a Wei Wang [28] và Wuhong Li [29], kết quả

thờ i gian di chuyển các đ9ng phân c7a atenolol đư% c rút ngắn hơ n khá nhi!u, song

đ phân giải vẫn đạt yêu cầu cho phép thử định lư% ng. Đi!u này r#t thuận l% i cho

công tác kiểm soát trong quá trình sản xu#t cũng như kiểm tra ch#t lư% ng dư% c

phAm trên thực tế.

Chúng tôi đã tiến hành thAm định phươ ng pháp phân tích vớ i các tiêu chí: đ

phù h% p hệ th"ng, đ đDc hiệu-chọn lọc, khoảng n9ng đ tuyến tính, đ chính xác

g9m đ lDp lại và đ chính xác trung gian, đ đúng. Kết quả các tiêu chí cần thAm

định đ!u đạt yêu cầu v! thAm định phươ ng pháp phân tích.

• Đ phù h% p hệ th"ng.

Giá trị đ lệch chuAn tươ ng đ"i RSD (%) đ"i vớ i thờ i gian di chuyển và diện

tích pic c7a hai đ9ng phân S-atenolol và R-atenolol đ!u n>m trong khoảng cho

phép, nhG hơ n 2%. Đ9ng thờ i đ phân giải gi&a hai đ9ng phân đ!u lớ n hơ n 2

(min= 2,42; max=3,21). Do đó, hệ th"ng điện di phù h% p cho việc định lư% ng

các đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol.

• Đ đDc hiệu-chọn lọc.

Trên điện di đ9 c7a mẫu placebo không xu#t hiện pic $ thờ i điểm xu#t hiện

pic cả $ mẫu chuAn và mẫu thử. Thờ i gian di chuyển c7a pic trên điện di đ9 c7a

mẫu thử tươ ng 'ng vớ i thờ i gian di chuyển c7a pic trên điện di đ9 mẫu chuAn.

Thờ i gian di chuyển c7a đ9ng phân S- atenolol tươ ng 'ng vớ i đ9ng phân di

chuyển ra trướ c trên điện di đ9 mẫu atenolol racemic chuAn và atenolol thử.

• Khoảng n9ng đ tuyến tính.

Có m"i quan hệ tuyến tính chDt chN gi&a n9ng đ atenolol racemic và S-

atenolol vớ i diện tích pic tươ ng 'ng c7a chúng trong khoảng n9ng đ tM 20 đến





- 52 -

70 ppm. Đườ ng h9i quy có dạng đườ ng thOng vớ i hệ s" tươ ng quan r đ!u lớ n

hơ n 0,995.

• Đ chính xác.

Đ chính xác trong ngày và khác ngày có đ lệch chuAn tươ ng đ"i RSD (%)đ!u đạt yêu cầu vớ i đ9ng phân S-atenolol lần lư% t là 1,35% và 1,23%, vớ i đ9ng

phân R-atenolol lần lư% t là 1,59% và 1,39%, đ!u nhG hơ n 2%. Giá trị RSD (%)

đạt đư% c tươ ng đươ ng vớ i nghiên c'u dùng phươ ng pháp HPLC c7a tác giả

NguyHn Thị Thu Hi!n [9] là 1,32% đ"i vớ i đ9ng phân S-atenolol.

• Đ đúng.

TW lệ tìm lại c7a các đ9ng phân c7a atenolol tM 98,60% đến 101,47% đ!u

n>m trong khoảng cho phép tM 98% đến 102%.Như vậy phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol mà

chúng tôi xây dựng đạt các tiêu chuAn c7a mt phươ ng pháp định lư% ng, có thể áp

d4ng để định lư% ng các đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol trong chế phAm.

Chúng tôi đã 'ng d4ng phươ ng pháp này vào định lư% ng hai chế phAm viên

nén trên thị trườ ng là Atenolol STADA 50 mg và Tenormin 50 mg, kết quả hàm

lư% ng c7a atenolol racemic so vớ i hàm lư% ng ghi trên nhãn lần lư% t là 100,06% và

100,80%, đ!u đạt yêu cầu v! hàm lư% ng tM 90% đến 110% theo Dư% c điển Việt

Nam IV.

Chúng tôi cũng sơ b đánh giá đ hòa tan các đ9ng phân đ"i quang c7a

atenolol trong hai chế phAm viên nén Atenolol STADA 50 mg và Tenormin 50 mg

trong môi trườ ng dung dịch HCl 0,1 N. Kết quả cả hai chế phAm đ!u giải phóng và

hòa tan t"t, x#p xJ 99%.





- 53 -

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Sau khi thực hiện đ! tài, chúng tôi đưa ra mt s" kết luận :(1) Đã hoàn thiện phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol b>ng

điện di mao quản. Phươ ng pháp tiến hành đơ n giản, thờ i gian phân tích nhanh,

t"n ít dung môi, hóa ch#t, ít đc hại, thân thiện vớ i môi trườ ng, vớ i đi!u kiện c4

thể như sau:

• Kiểu điện di: Điện di mao quản vùng (CZE).

• Ct mao quản: Ct Agilent HPCE có chi!u dài t=ng cng 48,5 cm, chi!u

dài hiệu d4ng 40 cm, đườ ng kính trong 50Qm.

• Hiệu điện thế: 25kV.

• Nhiệt đ ct: 20oC.


• Dung dịch điện di: Tris 50 mM đư% c đi!u chJnh tớ i pH 4,0 b>ng acid

H3PO4 đDc, ch'a CM-F-CD 8mM.

• Tiêm mẫu: 50mbar 3s.

• Xử lý mao quản mớ i: Trướ c khi sử d4ng lần đầu tiên, ct mao quản mớ iđư% c rửa sạch vớ i methanol trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid

hydrocloric 0,1 M trong 15 phút, và dung dịch NaOH 1M trong 30 phút.

• Hàng ngày, vào thờ i điểm đầu ngày các mao quản đư% c rửa sạch b>ng

dung dịch NaOH 0,1 M 15 phút, nướ c 5 phút, và vớ i dung dịch điện ly

n!n (BGE) 15 phút.

• Gi&a mIi lần chạy, chươ ng trình luyện ct (preconditioning) đư% c thực

hiện vớ i nướ c trong 1 phút, dung dịch NaOH 0,1 M trong 2 phút, nướ c 2

phút, và BGE 2 phút.

• Thờ i điểm cu"i ngày, mao quản đư% c rửa vớ i dung dịch NaOH 0,1 M

trong 20 phút, nướ c 20 phút, sau đó th=i khí 3 phút.





- 54 -

Phươ ng pháp xây dựng đư% c đạt yêu cầu v! thAm định phươ ng pháp phân

tích vớ i các tiêu chí: đ phù h% p hệ th"ng, đ đDc hiệu-chọn lọc, đ chính xác và

đ đúng. Khoảng n9ng đ tuyến tính vớ i mIi đơ n đ9ng phân là tM 20 ppm – 70

ppm (kl/tt), hệ s" tươ ng quan r = 0,9998.(2) Đã 'ng d4ng phươ ng pháp xây dựng đư% c để định tính, định lư% ng các đ9ng

phân quang học c7a atenolol trong mt s" chế phAm viên nén trên thị trườ ng và

cho kết quả định lư% ng đạt yêu cầu hàm lư% ng theo Dư% c điển Việt Nam IV.

Đ9ng thờ i bướ c đầu đánh giá đư% c đ hòa tan các đ9ng phân c7a atenolol trong

hai chế phAm viên nén theo quy định c7a Dư% c điển Việt Nam IV.

KIẾN NGHỊ

Sau khi thực hiện đ! tài này, chúng tôi có mt s" đ! xu#t như sau:

Vớ i các trung tâm kiểm nghiệm và các phòng kiểm nghiệm c7a cơ s$ sản xu#t:

• Nên cân nhắc việc trang bị máy điện di mao quản vì đây là phươ ng pháp có

ưu điểm như tiến hành đơ n giản, t"n ít dung môi, hóa ch#t, ít đc hại.

• Nghiên c'u thử nghiệm và áp d4ng phươ ng pháp tách đ9ng phân đ"i quang

c7a atenolol b>ng điện di mao quản để đưa vào tiêu chuAn cơ s$ .

Vớ i Hi đ9ng Dư% c điển:

Nghiên c'u và cân nhắc việc b= sung phươ ng pháp định tính, định lư% ng

đ9ng thờ i phân đ"i quang c7a atenolol b>ng điện di mao quản vào chuyên

luận riêng.

Tiếp t4c nghiên c'u 'ng d4ng điện di mao quản vào trong đánh giá các tiêu

chuAn ch#t lư% ng khác đ"i vớ i chế phAm ch'a atenolol.





TÀI LIỆU THAM KH)O

Tài li0u ti(ng Vi0t

1. B Y tế (2009), Dượ c đ iể n Việt Nam IV , Nhà xu#t bản Y học, Hà Ni, tr.72-73.

2. B Y tế (2009), Dượ c thư Quố c gia Việt Nam IV , Nhà xu#t bản Y học, Hà Ni,

tr.160-162.

3. B Y tế (2007), Hóa Dượ c t ậ p 1, Nhà xu#t bản Y học, Hà Ni, tr.126-237.

4. B Y tế (2007), Hóa Dượ c t ậ p 2, Nhà xu#t bản Y học, Hà Ni, tr.100.

5. B Y tế (2007), Hóa hữ u cơ t ậ p 1, Nhà xu#t bản Y học, Hà Ni, tr.66.

6. B Y tế (2007), Hóa phân tích t ậ p 2, Nhà xu#t bản Y học, Hà Ni, tr.225-247.

7. Lê Đ ình Chi (2011), Báo cáo k ế t quả khoa học công nghệ đề tài phân tích một

số đồng phân đố i quang có tính chấ t d ượ c lý chọn lọc khác nhau của

chlorpheniramine, dexchlorpheniramine, amlodipine và lamivudine,Viện

Kiểm nghiệm thu"c Trung ươ ng, Hà Ni

8. Lê Thị Thu Cúc, NguyHn Ngọc Vinh (2009),”: ng d4ng các tác nhân đ"i quang

hydroxyalkyl betacyclodextrin trong phân tích đ9ng phân quang họcpropranolol b>ng phươ ng pháp điện di mao quản”, T ạ p chí Dượ c học, tập

404(s" 12), tr.21-25.

9. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn LAu, NguyHn Thị Thu Hi!n, NguyHn Thị Ki!u Anh

(2013),”Nghiên c'u tách các đ9ng phân quang học c7a atenolol b>ng sắc ký

lGng hiệu năng cao vớ i mt s" pha t K nh đ"i quang”, T ạ p chí nghiên cứ u

d ượ c và Thông tin thuố c, 6, 218-224.

10. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn LAu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình, NguyHn Thị

Ki!u Anh (2013), “Bướ c đầu nghiên c'u định lư% ng đ9ng phân đ"i quang

c7a atenolol b>ng phươ ng pháp điện di mao quản”, T ạ p chí kiể m nghiệm

thuố c, 11(42), 14-19.





.

Tài li0u ti(ng Anh

11.B. Chankvetadze, G. Blaschke (2001), “Enantioseparations in capillary

electromigration techniques: recent developments and future trends”,

Journal of Chromatography A, 906, pp. 309-363.

12.British pharmacopoeia 2007, pp.499-923.

13.Eaga M.C, et al (2010), “New chiral reverse phase HPLC method for

determination of atenolol enantiomers in pharmaceutical formulations”,

International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research,

vol.4 (1), pp.22-26.

14.Fanali S. (2000),”Enantioselective determination by capillary electrophoresis

with cyclodextrins as chiral selectors”, Journal of Chromatography A, 875,

89-122.

15.Fanali S. (1996),”Identification of chiral drug isomers by capillary

electrophoresis”, Journal of Chromatography A, 735, 77-121.

16.I. Bechet, P. Paques, M. Fillet, P. Hubert, J. Crommen (1994), “Chiralseparation of basic drugs by capillary zone electrophoresis with

cyclodextrin additives”, Electrophoresis, 15(1), pp.818-823.

17.International Conference on Harmonisation (1996), Validation of Analytical

Procedures Methodology.

18.J.A.V Coates, N. Cammack, H.J Jenkinson, I.M Mutton, B.A Pearson, R.

Storer, J.M Cameron, C.R Penn, Antimicrobial agents and chemotherapy,

36, tr.202-205,1992.

19.M. Blanco, I. Valverde (2003), “Choice of chiral selector for enantioseparation

by capillaryelectrophoresis”, Trends in Analytical Chemistry, 22(7+8), pp.

428-439





20.McCoy R. (1994),”Pharmacodynamics of racemic and S-(-)-atenolol in

humans”, Journal of Clinical Pharmacology, Vol.34 (8), pp. 816-822.

21.Merck Research Laboratories (2006), The Merck Index 14th.

22.Peterson T.E (1993), “Separation of drug stereoisomers by capillary

electrophoresis with cyclodextrins”, Journal of Chromatography A, 630

353-361.

23.Santoro M.I, Cho H.S (2000), “Enantiomeric separation and quantitative

determination of atenolol in tablets by chiral high-performance liquid

chromatography”, Drug development industrial pharmacy, vol. 26(10), pp.

1107-1110.

24.Shigeru Terabe, Koji Otsuka, Hiroyuki Nishi (1994), “Separation of

enantiomers by capillary electrophoretic techniques”, Journal of

Chromatography A, 666, 295-319.

25.Stoschitzky K., et al (1998),”Racemic beta-blockers – fixed combinations of

different drugs”, Journal of Clinical and Basic Cardiology, vol. 1(1), pp.

15-19.

26.Stoschitzky K., et al (1993),”Stereoselective features of (R)- and (S)-atenolol:

Clinical pharmacological, pharmacokinetic, and radioligand binding

studies”, Chirality, vol. 5(1), pp. 15-19.

27.Subramanian G. (2001), Chiral separation techniques: A practical approach

second, completely revised and updated edition, WILEY-VCH, Germany.

28.Wei Wang, Jiande Lu, Xiaoyun Fu, Yaozu Chen (2001),”Carboxymethyl-F-

Cyclodextrin for chiral separation of basic drugs by capillaryelectrophoresis”, Analytical Letters, 34(4), pp. 569-578.

29.Wuhong Li, Changhai Liu, Guangguo Tan, Xinrong Zhang, Zhenyu Zhu,

Yifeng Chai (2012), “Molecular Modeling Study of Chiral Separation and





Recognition Mechanism of F- Adrenergic Antagonists by Capillary

Electrophoresis”, International Journal of Molecular Sciences, 13, 710-

725.





PHỤ LỤC





1. ĐIỆN DI ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU





=====================================================================

Acq. Operator : THUY

Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 8

Injection Date : 7/17/2014 3:47:01 PM

Acq. Method : C:\CHEM32\1\METHODS\CE\ATE811M.M

Last changed : 7/17/2014 3:35:53 PM by THUY

Analysis Method : C:\CHEM32\1\DATA\ATENOLOL\130518000569.D\DA.M (ATE811M.M)


Method Info : ATENOLOL

Sample Info : 50mM Tris, pH 3.996, CMCD 8mM 25kV, 50mbar/3s,Atenolol,

20 C.

2 4 6 8

mAU

0

50

100

150

200


A r e a :

2 6 5

. 4

9 .

2 8 6

9

8 3 4

2 4 6 8

kV

0

5

10

15

20

HPCE1 V, Voltage (ATENOLOL\130518000569.D)

=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================

Sorted By : SignalArea Calculation Mode : Measured Area

Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000

Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

a File C:\CHEM32\1\DATA\ATENOLOL\130518000569.D

ple Name: Atenolol

rument 1 7/31/2014 9:53:34 AM THUY Page 1 of





Signal 1: DAD1 D, Sig=194,4 Ref=360,100

Peak MigTime measured Width Area Height Area

mobility

# [min] [cm²/Vs] [min] [mAU*s] [mAU] %

----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 9.286 0.000 0.2100 265.41013 21.06380 49.8910

2 9.834 0.000 0.2536 266.57037 17.51638 50.1090

Totals : 531.98050 38.58017

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================

Final Summed Peaks Report=====================================================================


*** End of Report ***


ple Name: Atenolol






=====================================================================






(modified after loading)


Last changed : 7/18/2014 1:16:44 PM by THUYMethod Info : ATENOLOL

Sample Info : 50mM Tris, pH 3.996, CMCD 8mM 25kV, 50mbar/3s, Placebo,

20 C.

2 4 6 8 10 1

mAU

0

50

100

150

200


2 4 6 8 10 1

kV

0

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================

Sorted By : Signal

Area Calculation Mode : Measured Area

Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000


No peaks found

=====================================================================

Summed Peaks Report


ple Name: Placebo

rument 1 7/18/2014 1:18:13 PM THUY Page 1 of





=====================================================================








Last changed : 7/18/2014 2:04:58 PM by THUYMethod Info : ATENOLOL

Sample Info : 50mM Tris, pH 3.996, CMCD 8mM 25kV, 50mbar/3s, S ate 20

C.

2 4 6 8

mAU

0

50

100

150

200


9 .

3 0 0

2 4 6 8

kV

0

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================

Sorted By : Signal


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000



ple Name: S ate








mobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 9.300 0.000 0.1607 375.62268 27.69670 100.0000

Totals : 375.62268 27.69670

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================

Final Summed Peaks Report

=====================================================================




ple Name: S ate






=====================================================================






Analysis Method : C:\CHEM32\1\DATA\ATENOLOL\130518000608.D\DA.M



Sample Info : 50mM Tris, pH 3.996, CMCD 8mM 25kV, 50mbar/3s, Atenolol

STD, 20 C.

2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200


A r e a :

2 6 7

. 4 3 3

9 .

3 4 9

A r e a :

2 7

9 .

9 6 3

2 4 6 8 10

kV

0

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000



ple Name: Atenolol STD








mobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 9.349 0.000 0.2319 267.43347 19.22102 49.4732

2 9.963 0.000 0.2834 273.12918 16.06252 50.5268

Totals : 540.56265 35.28354

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================

Final Summed Peaks Report=====================================================================










2. ĐIỆN DI ĐỒ

KHẢO SÁT KHOẢNG NỒNG ĐỘ TUYẾN TÍNH





=====================================================================







Last changed : 7/15/2014 10:33:42 AM by THUY



100ppm, 20 C.

2 4 6 8

mAU

0

20

40

60

80100

120

140


A r e a :

2 6 6

. 6 7 5

8 .

6 0 5

A r e a

9 .

1 4 8

2 4 6 8

kV

0

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000



ple Name: ate 100 ppm








mobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 8.605 0.000 0.1537 266.67517 28.91209 49.3564

2 9.148 0.000 0.1836 273.63019 24.83393 50.6436

Totals : 540.30536 53.74602

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================


=====================================================================










=====================================================================










, 20 C.

2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200


A r e a :

3 7 1

. 2 7 2

1 0 .

2 4 0

1 1

1 7 0

2 4 6 8 10

kV

0

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000



ple Name: Atenolol








mobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 10.240 0.000 0.3184 371.27249 19.43187 49.5012

2 11.170 0.000 0.4126 378.75409 15.29827 50.4988

Totals : 750.02658 34.73014

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================


=====================================================================




ple Name: Atenolol






=====================================================================









Sample Info : 50mM Tris, pH 3.996, CMCD 8mM 25kV, 50mbar/3s,Atenolol

120 ppm, 20 C.

2 4 6 8

mAU

0

10

20

3040

50

60


A r e a :

3 1 8

. 7 0 1

8 .

6 5 4

A r e a :

3 2

9 .

2 9 2

2 4 6 8

kV

0

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000











mobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 8.654 0.000 0.2060 318.70081 25.78617 49.6281

2 9.292 0.000 0.2464 323.47766 21.88113 50.3719

Totals : 642.17847 47.66730

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================


=====================================================================










=====================================================================



Injection Date : 7/10/2014 10:01:18 AM






Sample Info : 50mM Tris, pH 3.996, CMCD 8mM 25kV, 50mbar/3s, Ate 40 p

pm, 20 C.

2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40


A r e a :

1 0 6

. 4

8 .

7 9 0

9

4 0 3

2 4 6 8

kV

0

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000











mobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 8.790 0.000 0.1410 106.41573 12.57778 49.7004

2 9.403 0.000 0.1617 107.69884 11.10371 50.2996

Totals : 214.11457 23.68149

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================


=====================================================================










=====================================================================










pm, 20 C.

2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

50


A r e a :

1 6 0

. 3 9 5

7 .

6 9 9

A r e a :

1 6 2

. 1 9 7

8 .

1 6 6

2 4 6 8

kV

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000











mobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 7.699 0.000 0.1447 160.39511 18.47349 49.7207

2 8.166 0.000 0.1766 162.19687 15.30437 50.2793

Totals : 322.59198 33.77787

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================


=====================================================================










=====================================================================










pm, 20 C.

1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

10

20

30

40

50


A r e a :

2 0 9

. 3 3 9

7 .

3 7 7

A r e

7 .

7 9 4

1 2 3 4 5 6 7

kV

5

10

15

20


=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000











mobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 7.377 0.000 0.1493 209.33878 23.36200 49.4333

2 7.794 0.000 0.1856 214.13847 19.22924 50.5667

Totals : 423.47725 42.59125

=====================================================================

Summed Peaks Report

=====================================================================


=====================================================================


=====================================================================










3. ĐIỆN DI ĐỒ

Ứ NG DỤNG ĐỊNH LƯỢ NG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ

HÒA TAN CÁC ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA

ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM VIÊN NÉN.





=====================================================================








(modified after loading)Method Info : ATENOLOL


100ppm, 20 C.

m2 4 6 8 10

mAU

0

20

40

60

80

100120

140


A r e a

: 2 6 4

. 6 9 8

8 . 9

5 7

A r e a

: 2 7 7

. 8 1 3

9 . 6

2 3

=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================

Sorted By : Signal


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000




mobility# [min] [cm²/Vs] [min] [mAU*s] [mAU] %

----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 8.957 0.000 0.1593 264.69760 27.69395 48.7912

2 9.623 0.000 0.1904 277.81281 24.31980 51.2088

Totals : 542.51041 52.01375

=====================================================================

Summed Peaks Report








=====================================================================










, 20 C.

m2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200


A r e a

: 2 7 0

. 9 6 8

8 . 5

0 8

A r e a

: 2 7 4

. 5 9 2

9 . 0

1 1

=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================

Sorted By : Signal


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000





----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 8.508 0.000 0.1785 270.96829 25.29836 49.6679

2 9.011 0.000 0.2247 274.59229 20.36909 50.3321

Totals : 545.56058 45.66746

=====================================================================

Summed Peaks Report


ple Name: Atenolol TEN






=====================================================================








Last changed : 8/12/2014 9:56:01 AM by THUY(modified after loading)


Sample Info : 50mM Tris, pH 3.996, CMCD 8mM 25kV, 50mbar/3s,Atenolol

100 ppm, 20 C.

m2 4 6 8 10

mAU

0

10

20

30

40

50


A r e a : 2

6 9 . 5 9 1

9 . 3

3 9

A r e a :

2 7 7 .

6 7

1

0 . 0

7 9

=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================

Sorted By : Signal


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000



Peak MigTime measured Width Area Height Areamobility


----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 9.339 0.000 0.1822 269.59055 24.66550 49.2619

2 10.079 0.000 0.2296 277.66965 20.15739 50.7381

Totals : 547.26019 44.82289

=====================================================================








=====================================================================










STD, 20 C.

m2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

100

150

200


A r e a

: 2 6 6

. 9 5 2

9 . 3

0 3

A r e a

: 2 7 2

. 7 1 1

1 0 . 0

4 8

=====================================================================

Area Percent Report

=====================================================================

Sorted By : Signal


Multiplier : 1.0000

Dilution : 1.0000





----|-------|----------|-------|----------|----------|--------|

1 9.303 0.000 0.2097 266.95248 21.21535 49.4665

2 10.048 0.000 0.2919 272.71072 15.57271 50.5335

Totals : 539.66321 36.78807

=====================================================================

Summed Peaks Report








4. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI

QUANG CỦA ATENOLOL BẰNG CE





Quy trình phân tích đồng phân đối quang của atenolol bằng CE

1. Phạm vi áp dụng

Phân tích đồng phân đối quang của atenolol trong chế phẩm thuốc.

2. Thiết bị, hóa chất, thuốc thử

2.1 Thiết bị

− Máy điện di mao quản đượ c trang bị detector PDA.

− Cân phân tích có độ chính xác tớ i 0,1 mg.

− Thiết bị xử lý nướ c tinh khiết bằng trao đổi ion và siêu lọc 0,2 µm.

− Máy đo pH.

−

Các thiết bị thí nghiệm cần thiết khác (dụng cụ thủy tinh chính xác cấp A, máy lắc

siêu âm, bộ lọc dung môi…)

− Các thiết bị phân tích sử dụng trong quá trình nghiên cứu đều đượ c hiệu chuẩn và

sử dụng theo đúng các quy định của ISO/IEC 17025 và GLP.

2.2 Hóa chất, thuốc thử

−

Hóa chất tinh khiết phân tích: carboxymethyl-β-cyclodextrin, dạng muối natri, acid

phosphoric 85%, natri hydroxyd.

−

Chất đối chiếu atenolol racemic.

−

Chất đối chiếu S-atenolol.

3. Điều kiện phân tích

− Cột mao quản có chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40 cm, đườ ng

kính trong 50µm.

− Hiệu điện thế: 25kV.

−

Nhiệt độ cột: 20oC.

− Bướ c sóng phát hiện: 194 nm.

− Dung dịch điện di: Tris 50 mM đượ c điều chỉnh tớ i pH 4,0 bằng acid H3PO4 đặc,

chứa CM-β-CD 8mM.

− Tiêm mẫu: 50mbar 3s.





− Xử lý mao quản mớ i: Trướ c khi sử dụng lần đầu tiên, cột mao quản mớ i đượ c rửa

sạch vớ i methanol trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid hydrocloric 0,1 M

trong 15 phút, và dung dịch NaOH 1M trong 30 phút.

−

Giữa mi lần chạy, chư! ng trình luyện cột (preconditioning) đượ c th"c hiện vớ i

nướ c trong 1 phút, dung dịch NaOH 0,1 M trong 2 phút, nướ c 2 phút, và BGE 2

phút.

− Dung dịch chuẩn atenolol racemic: cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn atenolol

racemic vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris 50 mM,

siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm v#a đủ. Hút chính xác 0,5 ml dung

dịch thu đượ c, pha loãng bằng dung dịch đệm Tris thành 5 ml, lọc qua màng lọc 0,2

µm.

− Dung dịch thử: Cân lượ ng bột viên tư! ng ứng vớ i khoảng 25 mg atenolol cho vào

bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml đệm Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ

sung dung dịch đệm v#a đủ, lọc thu lấy dịch lọc. Lấy 0,5 ml dịch lọc cho vào bình

định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc đều.

4. Tiến hành

Tiến hành điện di riêng biệt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Ghi lại đáp ứng

pic trên điện di đồ. $ánh giá k ết quả phân tích bằng cách so sánh đáp ứng (diện tích,

thờ i gian di chuy%n) của các pic trên điện di đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn,

lượ ng cân mẫu thử, hàm lượ ng và lượ ng cân chuẩn, độ pha loãng của dung dịch chuẩn

và dung dịch thử.


Documents

Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản