nghiªn cøu ¸p dông c«ng nghÖ vi sinh hiÖn ®¹i ®Ó s¶n xuÊt ... · giµu axit amin vµ enzym tõ nguån thø phÈm n«ng nghiÖp vµ thuû h¶i s¶n ë qui m« b¸n c«ng

bé khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖn n«ng nghiÖp vµ c«ng nghÖ sau thu ho¹ch

b¸o ço tæng kÕt ®Ò tµi KHCN cÊp nhµ n−íc

nghiªn cøu ¸p dông c«ng nghÖ vi sinh hiÖn ®¹i ®Ó s¶n xuÊt chÕ phÈm axit amin

vµ enzym tõ nguån thø phÈm n«ng nghiÖp vµ h¶i s¶n ë quy m« b¸n c«ng nghiÖp

m∙ sè: kc.04.20

chñ nhiÖm ®Ò tµi: pgs.ts nguyÔn thïy ch©u

5980 23/8/2006

hµ néi - 2006

1

Danh s¸ch nh÷ng ng−êi tham gia thùc hiÖn ®Ò tµi

Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1

1/ §Ò tµi nh¸nh: “Sö dông kü thuËt hiÖn ®¹i trong chän t¹o çc chñng gièng vi sinh vËt”

PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1, chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

TS. §inh Duy Kh¸ng5

NCS. §ç thÞ Ngäc HuyÒn1

Th.S. Vò Kim Thoa1

KS. NguyÔn Ngäc HuyÒn1

CN. NguyÔn ThÞ H−¬ng Trµ1

Th.S. Bïi ThÞ H−¬ng1

2/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt axit amin L-lysin”

PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1, chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

Th.S. Vò Kim Thoa1

KS. NguyÔn Ngäc HuyÒn1

KS. TrÇn V¨n Tu©n

3/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt axit amin L-methionin”

Th.S. Bïi ThÞ H−¬ng1, chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

CN. Vò ThÞ H−¬ng1

CN. NguyÔn TuÊn1

KS. §ç Minh Trung1

4/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzym phytaza”

NCS. §ç ThÞ Ngäc HuyÒn1, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

CN. NguyÔn ThÞ Hång Hµ1

KS. Lª Thiªn Minh1

CN. §ç TÊt Thñy1

5/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzym pectinaza”

KS. Tr−¬ng Thanh B×nh1 , Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1, ®ång chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

CN. Lª Thanh H−¬ng1

2

CN. NguyÔn Ngäc Linh1

CN. §ç ThÞ Thu HiÒn1

6/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzym mananaza”

PGS. TS. §Æng ThÞ Thu2, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

NCS. §ç Biªn C−¬ng2

KS. Phïng ThÞ Thñy2

7/§Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt thÞt qu¶ cµ phª lªn men lµm thøc ¨n

gia sóc”

CN. NguyÔn ThÞ H−¬ng Trµ1, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1, ®ång chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

KS. Ng« TÊt Trung1

CN. §ç TÊt Thñy1

KS. L©m Tó Minh1

8/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men lactic çc phÕ phô phÈm cña t«m

b»ng çc chñng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n ch¨n nu«i”

GS. Lª V¨n LiÔn3, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

KS. Ph¹m Ngäc UyÓn3

KS. Ph¹m ThÞ Thµnh3

KS. Ph¹m ThÞ Thoa3

9/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men b· døa b»ng vi khuÈn Lactobacillus

lµm thøc ¨n cho bß s÷a”

ThS. NguyÔn Giang Phóc3, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

CN. Bïi ThÞ Thu HuyÒn3

CN. NguyÔn Thµnh Long3

KS. NguyÔn V¨n Dòng3

KS. V−¬ng TuÊn Thôc3

KS. NguyÔn V¨n Lý3

CN. NguyÔn §×nh Phóc3

CN. NguyÔn V¨n Ph−¬ng3

3

10/§Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men men lactic çc phÕ phô phÈm cña

ç b»ng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n ch¨n nu«i”

KS. L−¬ng V¨n ChÝnh4, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh

CN. TrÇn Kh¸nh V©n4

KS. Lª V¨n Huyªn4

1: ViÖn C¬ ®iÖn N«ng nghiÖp vµ c«ng nghÖ sau thu ho¹ch 2: ViÖn C«ng nghÖ sinh häc- C«ng nghÖ Thùc phÈm, Trưêng §¹i häc B¸ch khoa Hµ néi 3: ViÖn Ch¨n nu«i Quèc Gia 4: ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp 5: ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc- Trung t©m Khoa häc Tù nhiªn vµ C«ng nghÖ Quèc gia

4

PhÇn I: Më ®Çu Tõ nhiÒu n¨m nay viÖc tËn dông çc phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp vµ sö dông chóng

mét çch cã hiÖu qu¶ ®a ®−îc çc nhµ khoa häc vµ c«ng nghÖ trªn thÕ giíi hÕt søc quan

t©m ®i s©u nghiªn cøu vµ ®· ®¹t ®−îc rÊt nhiÒu thµnh tùu trong vÊn ®Ò nµy. C«ng nghÖ

sinh häc ®ãng mét vai trß hªt søc quan träng trong viÖc tËn dông çc phÕ phô phÈm n«ng

nghiÖp ®Ó t¹o ra çc s¶n phÈm cã gi¸ trÞ kinh tÕ vµ gi¸ trÞ dinh d−ìng cao nh»m sö dông

chóng mét çch cã hiÖu qu¶, tr¸nh t×nh tr¹ng l·ng phÝ vµ g©y « nhiÔm m«i tr−êng.

Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, nhê chÝnh s¸ch ®æi míi cña §¶ng vµ nhµ n−íc, ngµnh

n«ng nghiÖp n−íc ta ®· cã nh÷ng b−íc tiÕn bé râ rÖt. S¶n l−îng l−¬ng thùc còng nh− çc

n«ng s¶n kh¸c ®· t¨ng mét çch ®¸ng kÓ. S¶n l−îng lóa g¹o ®¹t gÇn 34 triÖu tÊn, ®−êng

®¹t gÇn 1 triÖu tÊn, dõa 500.000 tÊn, s¶n l−îng døa lµ 50 triÖu tÊn. Cµ phª ®¹t 500.000 tÊn.

S¶n l−îng çc n«ng s¶n nµy t¨ng kÐo theo s¶n l−îng çc phÕ phô phÈm cña chóng còng

t¨ng theo. Cô thÓ: s¶n l−îng çm g¹o trong n¨m 1999- 2000 lµ 1.7 triÖu tÊn, l−îng çm m×

lµ 150 ngh×n tÊn, thÞt qu¶ cµ phª kho¶ng 1,5 triÖu tÊn, rØ ®−êng 450 ngh×n tÊn, b· døa 10

triÖu tÊn, b· døa sau Ðp 200000 tÊn, phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n kho¶ng 500 ngh×n tÊn.

Do ch−a cã biÖn ph¸p tËn dông mét çch khoa häc thÞt qu¶ cµ phª, b· døa ®· g©y «

nhiÔm m«i tr−êng vµ trë thµnh nçi nhøc nhèi cña ng−êi d©n vïng chÕ biÕn çc n«ng s¶n

nµy. ViÖc nghiªn cøu vµ triÓn khai çc c«ng nghÖ sinh häc ®Ó tËn dông çc phÕ phô phÈm

nµy nh»m t¹o ra çc s¶n phÈm dinh d−ìng cao vµ cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao phôc vô chÕ biÕn

thùc phÈm vµ ch¨n nu«i lµ mét vÊn ®Ò cÊp thiÕt cña ngµnh n«ng nghiÖp còng nh− cña çc

çn bé lµm c«ng t¸c nghiªn cøu vÒ c«ng nghÖ sinh häc ViÖt Nam.

Thùc tÕ cho thÊy rØ ®−êng ë n−íc ta hiÖn nay chñ yÕu míi chØ ®−îc sö dông ®Ó s¶n

xuÊt cån. Trong khi ®ã, cã rÊt nhiÒu s¶n phÈm cã thÓ s¶n xuÊt ®−îc tõ rØ ®−êng ®Ó ®¸p øng

nhu cÇu cuéc sèng cña nh©n d©n ta song vÉn ch−a triÓn khai ®−îc. §Æc biÖt çc axit amin

nh− Lysin, Methionine lµ nh÷ng chÊt cã thÓ s¶n xuÊt tõ rØ ®−êng nh−ng ta vÉn ph¶i nhËp

ngo¹i víi sè l−îng vµi tr¨m tÊn/n¨m trÞ gi¸ nhiÒu chôc tØ ®ång. V× vËy, viÖc nghiªn cøu

c«ng nghÖ s¶n xuÊt çc axit amin lysine, methionine lµ rÊt cÇn thiÕt ®Ó ®a d¹ng ho¸ çc

s¶n phÈm sau ®−êng vµ ph¸t triÓn ch¨n nu«i, d−îc phÈm.

HiÖn nay trong thùc tÕ çm g¹o, çm m× chñ yÕu ®−îc lµm thøc ¨n gia sóc vµ hÇu

nh− ch−a cã s¶n phÈm sinh häc nµo cã gi¸ trÞ ®−îc t¹o ra tõ nguån çm g¹o vµ çm m×.

5

Ngµnh cµ phª ViÖt Nam cã tèc ®é ph¸t triÓn nhanh v−ît bËc so víi 20 n¨m tr−íc ®©y, diÖn

tÝch cµ phª ®· t¨ng 25 lÇn, s¶n l−îng t¨ng 100 lÇn, cã nghÜa lµ n¨ng suÊt ®· t¨ng 4 lÇn, tØ lÖ

vá thÞt qu¶ chiÕm kho¶ng 45% träng l−îng qu¶, trong khi ®ã c«ng nghÖ sau thu ho¹ch

kh«ng ®¸p øng kÞp, g©y nªn nh÷ng tæn thÊt nÆng nÒ vµ g©y « nhiÔm m«i tr−êng. Víi nguån phÕ liÖu thuû h¶i s¶n rÊt lín vµ ®a d¹ng, bao gåm ç kÐm chÊt l−îng,

®Çu vµ vá t«m, çc phô t¹ng, ®Çu, x−¬ng, v©y cña ç t¹o ra tõ çc xÝ nghiÖp ®¸nh b¾t vµ

chÕ biÕn xuÊt khÈu thuû s¶n. Nguån nguyªn liÖu nµy rÊt dÔ dµng vµ nhanh chãng bÞ thèi

háng do t¸c ®éng cña khu hÖ vi sinh vËt ®a d¹ng trong ®iÒu kiÖn khÝ hËu n−íc ta. §©y thùc

sù lµ mét vÊn ®Ò kh«ng nh÷ng lµm mÊt ®i mét nguån protein lín mµ con g©y « nhiÔm m«i

tr−êng nghiªm träng.

Ở n−íc ta l−îng b· c¬m dõa sau Ðp hµng n¨m lªn tíi vµi tr¨m ngh×n tÊn vµ hiÖn

nay chØ ®−îc sö dông lµm ph©n bãn, v× vËy hiÖu qu¶ sö dông ch−a cao. §Æng ThÞ Thu vµ

çc céng t¸c viªn ë trung t©m c«ng nghÖ sinh häc- §¹i häc B¸ch Khoa Hµ Néi ®· b−íc

®Çu tËp trung nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzim mananaza ®Ó n©ng cao gi¸ trÞ sö dông

b· c¬m dõa sau Ðp. §©y lµ mét lo¹i enzim cã ý nghÜa kinh tÕ cao vµ ch−a ®−îc tËp trung

nghiªn cøu s©u ë ViÖt Nam. V× vËy cÇn ®Çu t− cho vÊn ®Ò nµy cÇn ®Çu t− cho vÊn ®Ò nµy

nh»m t×m ®−îc c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzim mananaza ë ViÖt Nam trong thêi gian tíi.

§Ò tµi “Nghiªn cøu ¸p dông c«ng nghÖ vi sinh hiÖn ®¹i ®Ó s¶n xuÊt chÕ phÈm

giµu axit amin vµ enzym tõ nguån thø phÈm n«ng nghiÖp vµ thuû h¶i s¶n ë qui m«

b¸n c«ng nghiÖp” m· sè KC-04-20 thuéc ch−¬ng tr×nh nghiªn cøu khoa häc vµ ph¸t

triÓn c«ng nghÖ sinh häc.

Môc tiªu chung cña ®Ò tµi lµ: TriÓn khai c«ng nghÖ míi cña c«ng nghÖ sinh häc

trong tËn dông phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp vµ thuû h¶i s¶n nh»m s¶n xuÊt çc s¶n phÈm

cã gi¸ trÞ kinh tÕ phôc vô ph¸t triÓn n«ng nghiÖp

Môc tiªu cô thÓ lµ: ¸p dông ®−îc çc kü thuËt vi sinh kinh ®iÓn vµ kü thuËt

sinh häc ph©n tö hiÖn ®¹i trong c«ng t¸c chän t¹o çc chñng gièng vi sinh vËt cã ho¹t

tÝnh cao cho c«ng nghÖ tËn dông phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp nh− rØ ®−êng, çm g¹o, çm

m×, b· døa, thÞt qu¶ cµ phª, b· dõa sau Ðp vµ phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n nh− ç kÐm

chÊt l−îng, ®Çu t«m

6

X©y dùng qui tr×nh c«ng nghÖ thÝch hîp ®Ó s¶n xuÊt çc s¶n phÈm cã gi¸ trÞ cao

nh− axit amin L- lysin, L-methionine, çc enzym phytaza, pectinaza, mannanaza, çc

thøc ¨n lªn men tõ çc phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp vµ phÕ phÈm thuû h¶i s¶n lµm thøc

¨n ch¨n nu«i

X©y dùng ®−îc m« h×nh c«ng nghÖ thiÕt bÞ thÝch hîp ®Ó s¶n xuÊt çc s¶n phÈm

nh− axit amin L-lysin, L-methionine, çc enzym phytaza, pectinaza, mannanaza, çc

thøc ¨n lªn men tõ phô phÕ phÈm n«ng nghiÖp vµ thuû h¶i s¶n lµm thøc ¨n ch¨n nu«i

§Ò tµi ®−îc thùc hiÖn trong 30 th¸ng tõ th¸ng 9 n¨m 2002 ®Õn th¸ng 3 n¨m 2005

víi tæng sè kinh phÝ lµ 2.700 triÖu ®ång tõ ng©n s¸ch SNKH cña Nhµ n−íc. D−íi ®©y lµ

mét sè th«ng tin chung vÒ ®Ò tµi:

Chñ nhiÖm ®Ò tµi:

Hä tªn : NguyÔn Thïy Ch©u

Häc hµm, häc vÞ : PGS. TS Chøc danh khoa häc: NCVC

§iÖn tho¹i CQ: 04.9342487

E.Mail: [email protected]

§Þa chØ c¬ quan: ViÖn C¬ ®iÖn C«ng nghiÖp vµ C«ng nghÖ sau thu ho¹ch Hµ Néi

C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi: ViÖn c¬ ®iÖn n«ng nghiÖp vµ C«ng nghÖ sau thu ho¹ch Hµ Néi

§Þa chØ: Sè 4 Ng« quyÒn, Hµ Néi

7

C¬ quan chÝnh phèi hîp thùc hiÖn

TT Tªn tæ chøc §Þa chØ Ho¹t ®éng/®ãng gãp cho ®Ò tµi 1 ViÖn C«ng

nghÖ Sau thu ho¹ch

4 Ng« QuyÒn, Hµ néi.

Chñ tr× ®Ò tµi, Sö dông çc kü thuËt hiÖn ®¹i trong chän t¹o çc chñng gièng vi sinh vËt, nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt çc axit amin L-lysin, L-methionin, çc enzym phytaza, pectinaza, c«ng nghÖ s¶n xuÊt thøc ¨n ch¨n nu«i tõ thÞt qu¶ cµ phª

2 ViÖn Ch¨n nu«i

Thôy Ph−¬ng- Tõ Liªm.

Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men b· døa b»ng vi khuÈn Lactobacillus plantarium vµ Streptococcus lactis lµm thøc ¨n cho bß s÷a.

3 ViÖn Ch¨n nu«i

Thôy Ph−¬ng- Tõ Liªm.

- Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men lactic çc phÕ phô phÈm cña t«m b»ng çc chñng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n ch¨n nu«i

4 ViÖn Di truyÒn N«ng NghiÖp, ViÖn Ch¨n nu«i

Cæ NhuÕ- Hµ Néi

- Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men lactic çc phÕ phô phÈm cña ç b»ng çc chñng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n ch¨n nu«i.

5 ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc vµ C«ng nghÖ thùc phÈm, Tr−êng §¹i häc B¸ch khoa- Hµ néi.

§¹i Cæ ViÖt - Hµ Néi

- Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzym mannanaza ®Ó s¶n xuÊt mano-oligosacharit tõ b· dõa sau Ðp.

1. Néi dung ®Ò tµi:

1. TuyÓn chän bé chñng gièng vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh sinh häc tõ çc nguån

thiªn nhiªn phôc vô cho ®Ò tµi

2. Sö dông çc kü thuËt hiÖn ®¹i trong chän t¹o çc chñng gièng vi sinh vËt bao gåm:

+ Sö dông kü thuËt ®ét biÕn chän t¹o çc chñng Corynebacterrium glutamicum

sinh tæng hîp L- lysin vµ L-methionine cao

8

+ Sö dông kü thuËt sinh häc ph©n tö ®Ò biÓu hiÖn gen m· hãa phytaza ®Ò kh¸ng

nhiÖt trong nÊm men Pichia pastoris

+ T¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen m· hãa bacteriocin tõ chñng tù nhiªn cã tÝnh ®Ò

kh¸ng víi vi sinh vËt g©y bÖnh E. coli, Salmonella...

3. Nghiªn cøu vµ hoµn thiÖn c«ng nghÖ lªn men axit amin L- lysine, L-

methionine, vµ çc enzym phytaza, pectinaza, mannanaza ë qui m« phßng thÝ nghiÖm vµ

qui m« b¸n c«ng nghiÖp 150l/mÎ vµ 1500 l/mÎ

4. Nghiªn cøu qui tr×nh c«ng nghÖ lªn men thÞt qu¶ cµ phª, b· døa, phÕ phô

phÈm thñy h¶i s¶n b»ng çc vi khuÈn lactic

5. Thö nghiÖm vµ ®¸nh gi¸ çc chÕ phÈm s¶n xuÊt ®−îc trªn ®µn gia sóc gia cÇm

2. Danh môc s¶n phÈm KHCN cña ®Ò tµi (hîp ®ång gi÷a Chñ nhiÖm ch−¬ng

tr×nh KC.04 vµ c¬ quan chñ tr× ®Ò tµi)

TT Tªn s¶n phÈm Sè l−îng ChØ tiªu Kinh tÕ - kü thuËt

Ghi chó

1 ChÕ phÈm sinh häc 1.1 ChÕ phÈm axit amin L-

lysin bæ sung vµo thøc ¨n gia sóc cho lîn, gµ.

10 kg ChÕ phÈm L- lysin ®¹t tõ 30-35g/l

1.2 ChÕ phÈm L-methionin bæ sung vµo thøc ¨n gia sóc cho lîn, gµ.

10 kg ChÕ phÈm L-methionin ®¹t tõ 30-35g/l

1.3 ChÕ phÈm enzym pectinaza cho lîn, gµ vµ chÕ biÕn mËt ong

10 kg ChÕ phÈm enzym pectinaza ®¹t kho¶ng 10®v/ml

1.4 ChÕ phÈm enzym mannanaza s¶n xuÊt mano-oligosacharit lµm thøc ¨n cho lîn, gµ

5 kg ChÕ phÈm emzym mannanaza ®¹t tõ 300 - 400 ®v/ml

1.5 ChÕ phÈm enzym phytaza bæ sung vµo thøc n gia sóc cho lîn, gµ.

10kg ChÕ phÈm enzym phytaza ®¹t tõ 80 -85 ®v/g

1.6 ChÕ phÈm thÞt qu¶ cµ phª lªn men lµm thøc ¨n cho bß

10 tÊn 3 % axit lactic vµ 105 vi khuÈn lactic/g chÊt kh«

9

1.7 ChÕ phÈm b· døa lªn men lµm thøc ¨n cho bß

10 tÊn 3 % axit lactic vµ 105 vi khuÈn lactic/g chÊt kh«

1.8 S¶n phÈm lªn men tõ çc phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n lµm thøc ¨n ch¨n nu«i cho gia cÇm, lîn con.

1 tÊn 3 % axit lactic vµ 105 vi khuÈn lactic/g chÊt kh«. ChÕ phÈm cã kh¶ n¨ng t¨ng träng cña gia sóc tõ 15% -20%.

2 Chñng gièng vi sinh vËt 2.1 Çc chñng

Corynebacterium glutamicum Corynebacterium acetoglutamicum Candida tropicalis, Brevibacterium falvum tù nhiªn vµ ®ét biÕn sinh L-lysin, L-methionin cao.

4 chñng Chñng cã ho¹t tÝnh L-lysin ®¹t tõ 30g/l - 35g/l Chñng cã ho¹t tÝnh L-methionin ®¹t tõ 30g/l-35g/l

2.2 Çc chñng nÊm mèc Aspergillus niger sinh pectinaza

2-3 chñng

Chñng cã ho¹t tÝnh pectinaza ®¹t kho¶ng 10®v/ml

2.3 Çc chñng sinh enzym mannanase

2-3 chñng

Chñng cã ho¹t tÝnh mannanaza ®¹t tõ 30- 40 ®v/ ml

2.4 Chñng Aspergillus niger tù nhiªn vµ chñng t¸i tæ h¬p cho ho¹t tÝnh phytaza cao tõ 3-5 lÇn so víi chñng tù nhiªn.

2-3 chñng

Chñng cã ho¹t tÝnh phytaza ®¹t 80-85®v/l

2.5 Çc chñng vi khuÈn Lactobacillus plantarum sinh axit lactic vµ bacteriocin.

2-3 chñng

L−îng bacteriocin ®¹t 50ppm

3 Qui tr×nh c«ng nghÖ: 3.1 Quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n

xuÊt axit amin L-lysin trªn m«i tr−êng rØ ®−êng b»ng c«ng nghÖ lªn men ch×m sôc khÝ.

1 quy tr×nh

Qui m« 1500l/mÎ

3.2 Qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt axit amin L-methionin trªn m«i tr−êng rØ ®−êng b»ng c«ng nghÖ lªn men ch×m sôc khÝ.

1 qui tr×nh

Qui m« 1500l/mÎ

3.3 Qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt 3 qui Qui m« 1500l/mÎ

10

enzym pectinaza, mananaza, phytaza trªn m«i tr−êng thÞt qu¶ cµ phª, b· dõa sau Ðp, çm g¹o b»ng c«ng nghÖ lªn men ch×m sôc khÝ.

tr×nh

3.4 Qui tr×nh c«ng nghÖ lªn men thÞt qu¶ cµ phª, b· døa, phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n b»ng çc vi khuÈn lactic.

4 qui tr×nh

Qui m« 1 tÊn thÞt qu¶ cµ phª/mÎ

3. KÕt qu¶ ho¹t ®éng cña ®Ò tµi

3.1. Tæng quan t×nh h×nh nghiªn cøu trong vµ ngoµi n−íc

3.1.1. Tæng quan vÒ L-lysin

L-lysine b¶n chÊt lµ mét axit amin kh«ng thay thÕ, nghÜa lµ c¬ thÓ ng−êi vµ ®éng

vËt kh«ng tù tæng hîp ®−îc axit amin nµy mµ ph¶i trùc tiÕp thu nhËn tõ nguån bæ sung bªn

ngoµi. Ho¹t tÝnh sinh häc chØ biÓu hiÖn ë d¹ng ®ång ph©n L- lysine míi cã gi¸ trÞ dinh

d−ìng víi ng−êi vµ ®éng vËt. L- lysine ®−îc øng dông réng r·i trong nhiÒu lÜnh vùc nh−:

Sö dông bæ sung vµo thøc ¨n gia sóc lµm t¨ng chÊt l−îng vµ s¶n l−îng thÞt cña ®éng vËt

nu«i. Trong c«ng nghiÖp d−îc phÈm L-lysine ®−îc sö dông nh− mét chÊt dinh d−ìng,

kÝch thÝch sù ¨n ngon miÖng, sö dông nh− mét chÊt cã nguån gèc protein bæ sung trong

qu¸ tr×nh c¾t ®øt c¨n bÖnh "stress” vµ nã còng cã chøc n¨ng chèng nhiÔm trïng m¸u.

Trong c«ng nghiÖp thùc phÈm lµ chÊt bæ sung lµm giÇu thùc phÈm, n©ng cao chÊt l−îng

çc lo¹i h¹t nh− lóa m×, ng«, g¹o bëi nÕu çc s¶n phÈm nµy thiÕu hôt L- lysine th× gi¸ trÞ

dinh d−ìng rÊt thÊp. V× vËy trong thùc phÈm cña con ng−êi nh− thùc phÈm d¹ng chiªn,

thùc phÈm láng, b¸nh m× th−êng ®−îc bæ sung d¹ng muèi L- lysine. Trong c«ng nghiÖp,

L- lysine ®−îc s¶n sinh trong m«i tr−êng dinh d−ìng lªn men bëi çc chñng vi khuÈn

Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, B. lactofermentatum hoÆc còng cã

thÓ thu nhËn tõ dÞch thuû ph©n protein ®éng, thùc vËt.

Trªn thÕ giíi viÖc s¶n xuÊt axit amin ë quy m« c«ng nghiÖp ®· ®−îc b¾t ®Çu tõ n¨m

1908. NhËt B¶n ®· cã lÞch sö trªn 40 n¨m s¶n xuÊt vµ ¸p dông axit amin ë quy m« c«ng

nghiÖp víi s¶n l−îng 90.000 tÊn/n¨m (chñ yÕu hai h·ng c«ng nghiÖp vi sinh khæng lå lµ

"Kiowa Hakko" vµ "Ajinamoto"). ë Ph¸p (h·ng "Eurolysine") cã s¶n l−îng L-lysine ®¹t

kho¶ng 20 000 tÊn/n¨m. N¨m 1983 s¶n l−îng L-lysine trªn toµn thÕ giíi lµ 70 000

tÊn/n¨m nh−ng ®Õn n¨m 2000 ®· t¨ng lªn 600 000 tÊn/n¨m. NhiÒu nhµ m¸y s¶n xuÊt L-

11

lysine cßn ®−îc x©y dùng ë Mü, T©y Ban Nha, çc n−íc céng hoµ thuéc Liªn X« (cò) vµ

Nam T− (cò)...ViÖc gia t¨ng nhanh chãng s¶n l−îng L-lysine trªn thÕ giíi ®ång nghÜa víi

nhu cÇu rÊt lín vÒ s¶n phÈm nµy.

HiÖn nay ë ViÖt Nam nhu cÇu sö dông lysin cho thùc phÈm con ng−êi vµ thøc ¨n

ch¨n nu«i gia t¨ng nhanh chãng. Hµng n¨m chóng ta ph¶i nhËp khÈu 100% L-lysin víi sè

l−îng lín. Trong nh÷ng n¨m qua (1980-1985) TS. Hå S−ëng, ViÖn C«ng nghiÖp Thùc

phÈm, ®· s¶n xuÊt lysin tõ chñng tù nhiªn cã tªn lµ VTP 22( kh«ng cã tªn chi vµ tªn loµi)

ë qui m« 5000l/mÎ, chñng nµy cho s¶n l−îng lysin 30-35g/l. ChÕ phÈm lysin ë d¹ng th« lµ

80% vµ ë d¹ng sÖt lµ 15-20%. TS. Ng« TiÕn HiÓn còng ®· nghiªn cøu lªn men lysin theo

ph−¬ng ph¸p bÒ mÆt. Tuy nhiªn theo nh− lý thuyÕt th× lªn men theo ph−¬ng ph¸p bÒ mÆt

kh«ng cho s¶n l−îng lysin cao so víi ph−¬ng ph¸p lªn men ch×m sôc khÝ. TS. Ng« ThÞ

M¹i vµ céng sù còng ®· nghiªn cøu vÒ lysin, chñng s¶n xuÊt lµ chñng Corynebacterium

glutamicum tù nhiªn lÊy tõ nguån ATCC. Tuy nhiªn th¸ch thøc lín nhÊt víi chóng ta lµ cã

rÊt Ýt nghiªn cøu hoµn chØnh vÒ L-lysine vµ ch−a cã c¬ së nµo triÓn khai s¶n xuÊt L- lysine

quy m« c«ng nghiÖp chÊt l−îng cao, gi¸ thµnh h¹.

Cho ®Õn nay ë nhiÒu n−íc kh¸c nhau hÇu nh− tÊt c¶ çc chñng cã ho¹t tÝnh cao vµ

®−îc øng dông ®Ó s¶n xuÊt axit amin ®Òu lµ çc chñng ®ét biÕn. §Æc biÖt lµ çc vi khuÈn

Corynebacterium, Brevibacterium cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn tèt trong nh÷ng m«i tr−êng chøa

nhiÒu cacbon vµ Ýt nit¬. ë ®©y sù ph¸ vì c©n b»ng gi÷a trao ®æi chÊt cacbon vµ sù ®ång ho¸

nit¬ lµ nguyªn nh©n dÉn ®Õn sù h×nh thµnh axit amin víi sè l−îng lín, v−ît qu¸ xa so víi

nhu cÇu néi t¹i cña tÕ bµo vµ tÝch luü ë tÕ bµo hay tho¸t ra ngoµi m«i tr−êng. HiÖn t−îng

nµy ®−îc gäi lµ siªu tæng hîp axit amin cña vi sinh vËt vµ th−êng lµ do t¸c ®éng cña con

ng−êi b»ng ph−¬ng ph¸p ®ét biÕn g©y ra ®Ó thu ®−îc s¶n phÈm mong muèn.

§Æc ®iÓm cña chñng vi khuÈn sinh L-lysine

Çc chñng vi sinh vËt sinh L-lysine ®−îc dïng trong s¶n xuÊt lµ çc thÓ ®ét biÕn

thuéc çc gièng vi khuÈn C. glutamicum vµ Brevibacterium. NhiÒu chñng ®−îc tuyÓn

chän qua b−íc lµm ®ét biÕn vµ thu ®−îc nh÷ng chñng míi cã ho¹t lùc cao h¬n nhiÒu so

víi chñng nguyªn thuû. §Æc tÝnh cña nh÷ng chñng nµy lµ cÇn biotin víi l−îng cao h¬n

nhiÒu so víi chñng nguyªn thuû sinh axit glutamic, chÞu ®−îc ë nång ®é ®−êng lín tíi

12

20% hoÆc cao h¬n vµ ®Æc biÖt lµ cÇn mét sè axit amin cho sinh tr−ëng, còng nh−

cho sinh tæng hîp L-lysine. Kinoshita ®· thu ®−îc nh÷ng chñng sinh L-lysine theo thø tù

sau: nh÷ng chñng cÇn homoserin (hoÆc hçn hîp threonine + L-methionine) > nh÷ng

chñng cÇn threonine > nh÷ng chñng cÇn isoleucine > nh÷ng chñng cÇn leucine > nh÷ng

chñng cÇn hçn hîp isoleucine + leucine. Trong c«ng nghiÖp th−êng dïng nh÷ng chñng

thuéc çc gièng Micrococcus glutamicus, Brevibacterium vµ C. glutamicum cÇn

homoserin. Çc chñng nµy cã cïng mét con ®−êng tæng hîp L-lysine nh− ë E. coli nh−ng

ph−¬ng thøc ®iÒu hoµ l¹i ®¬n gi¶n h¬n nhiÒu. Mét trong nh÷ng chñng nµy kh«ng cã

enzym L-homoleucinedehydrogenaza.

L-lysine chØ ®iÒu chØnh ng−îc enzym aspactokinaza mµ kh«ng øc chÕ ng−îc enzym

dehydropicolinatsyntetaza.

− Enzym aspactokinaza chÞu øc chÕ ng−îc cña L-lysine vµ threonine.

− Enzym homoserindehydrogenaza chÞu sù øc chÕ ng−îc cña threonine

Gluco

Pyruvat

Oxalaxetat

Aspastat

β – Aspastat – phosphat

Aspastat – β – semialdehyt

(2) (3)

Homoserin

Threonin isoleucin Methionin L-lysin

(1)

13

S¬ ®å 1: S¶n xuÊt L-lysine nhê mét thÓ ®ét biÕn C. glutamicum trî d−ìng homoserin.

Nh÷ng ®−êng chÊm chÊm biÓu thÞ sù øc chÕ bëi s¶n phÈm cuèi cïng. ë chñng

hoang d¹i L-lysine vµ threonine cïng g©y ra mét sù øc chÕ phèi hîp (E) ®èi víi

aspactokinaza (1). Do khuyÕt homoserin dehydrogenaza (2) mµ kh«ng cã sù t¹o thµnh

threonine. Dihydropicolinat – synthase (3) kh«ng mÉn c¶m dÞ lËp thÓ. HËu qu¶ lµ sù øc

chÕ bëi s¶n phÈm cuèi cïng (E) bÞ triÖt tiªu vµ cã sù tæng hîp thõa L-lysine.

Cã ba ph−¬ng ph¸p ®−îc dïng ®Ó lo¹i sù ®iÒu chØnh ng−îc:

• Sö dông chñng ®ét biÕn trî d−ìng cÇn homoserin. Chñng nµy cã thÓ mäc ®−îc

khi trong m«i tr−êng cã threonine vµ L-methionine. Víi nång ®é axit amin nµy thÊp th×

aspactokinaza sÏ kh«ng bÞ øc chÕ vµ L-lysine sÏ t¹o thµnh nhiÒu h¬n.

• Sö dông çc chñng ®ét biÕn mÉn c¶m cao víi threonine. Enzym

homoserindehydrogenaza cã thÓ bÞ øc chÕ bëi nång ®é threonine rÊt thÊp vµ aspactokinaza

cã thÓ sÏ kh«ng bÞ øc chÕ.

• Sö dông çc chñng ®ét biÕn cã kh¶ n¨ng kh¸ng mét chÊt t−¬ng ®ång cña enzym.

Chóng cã enzym aspactokinaza kh«ng bÞ øc chÕ ng−îc bëi L-lysine vµ threonine.

L-lysine lµ mét axit amin thuéc hä aspactat vµ ®−îc tæng hîp qua mét con ®−êng

trao ®æi chÊt ph©n nh¸nh mµ qua ®ã homoserin, L-methionine, threonine vµ isoleucine

còng ®−îc t¹o thµnh. C. glutamicum chØ cã mét aspactokinaza bÞ øc chÕ dÞ lËp thÓ bëi L-

lysine vµ threonine

Mét axit amin riªng lÎ trong kiÓu ®iÒu hoµ nµy kh«ng cã t¸c dông øc chÕ. B»ng

çch sö dông mét thÓ ®ét biÕn cÇn homoserin vµ khuyÕt homoserin dehydrogenaza mµ

threonine kh«ng ®−îc t¹o thµnh. Nhê vËy sù øc chÕ bëi s¶n phÈm cuèi cïng bi triÖt tiªu vµ

con ®−êng sinh tæng hîp dÉn tíi viÖc s¶n xuÊt thõa L-lysine. Mét ®iÒu kiÖn n÷a ®Ó cã sù

tæng hîp L-lysine kh«ng øc chÕ lµ sù cã mÆt cña gen dihydrodipicolinat-syntetaza kh«ng

mÉn c¶m víi s¶n phÈm cuèi cïng. Do ®ã kh«ng xuÊt hiÖn sù øc chÕ bëi s¶n phÈm cuèi

cïng ë nh¸nh L-lysine, nh− vÉn x¶y ra ë çc gièng kh¸c. ë C. glutamicum cã thÓ tæng hîp

thõa L-lysine nhê ®ét biÕn theo kiÓu nµy.

14

MÆc dï phÇn lín axit amin ®−îc s¶n xuÊt tõ ho¸ häc, tæng hîp b»ng ho¸ häc th×

quang häc kh«ng t¸c ®éng ®Õn d¹ng hçn hîp D vµ L. Nh−ng trong sinh ho¸ th× axit amin

d¹ng L lµ quan träng nªn ngµy nay ng−êi ta th−êng s¶n xuÊt axit amin b»ng con ®−êng

sinh tæng hîp. Tuy nhiªn trong s¶n xuÊt c«ng nghiÖp axit amin cÇn ph¸ vì c¬ chÕ ®iÒu

chØnh ®Ó chñng cã kh¶ n¨ng siªu s¶n xuÊt (Chibata, K. Nakayama,K and Esaki 1986.

Biotechnology of amino acid production, vol 24, progress in Industrial Microbiology.

Kodansha).

Mét vÝ dô vÒ s¶n xuÊt L-lysine ë chñng Brevibacterium flavum lµ ®iÒu chØnh sinh

ho¸ cña enzym aspartokinase, l−îng L-lysine d− lµm øc chÕ ng−îc ho¹t ®éng cña enzym

nµy vµ t¹o nªn d¹ng L-lysine t−¬ng ®ång S-aminoethylcysteine (AEC). Tuy nhiªn nÕu sö

dông chñng B. flavum ®ét biÕn ®Ó s¶n xuÊt th× l−îng L-lysine d− kh«ng øc chÕ ng−îc ®Õn

aspartokinase n÷a. §ét biÕn AEC bÒn sÏ dÔ dµng chän vÞ trÝ ®Ó s¶n xuÊt d¹ng ®ét biÕn cña

asspartokinase ë ®iÓm biÕn ®æi kh«ng ph©n biÖt ®−îc AEC hay L-lysine vµ trong øc chÕ

ng−îc L-lysine bÞ khö rÊt nhiÒu. Chñng ®ét biÕn B. flavum cã thÓ s¶n xuÊt h¬n 60g/l L-

lysine.

Mét nh©n tè quan träng kh¸c trong s¶n xuÊt axit amin lµ sù bµi tiÕt. Nãi chung sinh

vËt kh«ng bµi tiÕt axit amin, do cã sù øc chÕ ng−îc hay k×m h·m trong ®ét biÕn bÒn

th−êng kh«ng x¶y ra trong tÕ bµo. ViÖc s¶n xuÊt vµ bµi tiÕt qu¸ møc axit glutamic phô

thuéc vµo tÝnh thÊm cña tÕ bµo. Vi khuÈn C. glutamicum dïng s¶n xuÊt c«ng nghiÖp axit

glutamic cÇn vitamin biotin (lµ nh©n tè cÇn thiÕt trong sinh tæng hîp axit bÐo). ThiÕu hôt

biotin dÉn tíi tæn th−¬ng mµng tÕ bµo vµ d−íi ®iÒu kiÖn néi bµo axit glutamic ®−îc bµi

tiÕt. M«i tr−êng sö dông ®Ó s¶n xuÊt axit glutamic th−¬ng m¹i chøa ®Çy ®ñ biotin trong

giai ®o¹n sinh tr−ëng, sau ®ã biotin bÞ thiÕu hôt vµ bµi tiÕt axit glutamic.

S¬ ®å 2,3 : S¶n xuÊt c«ng nghiÖp L-lysine ë chñng B. flavum

Asspartate

Lysin

øc chÕ ng−îc

ATP ADP

AspartylphosphateAsspartate

semialdehyde Methionine

Threonin Dihydrodipicolinate

Isoleucin

Aspartokinase

15

(2) con ®−êng sinh ho¸ tõ aspartate biÕn ®æi thµnh L-lysine nh−ng L-lysine cã thÓ

bÞ øc chÕ ng−îc ®Õn ho¹t ®éng cña enzym aspartokinase dÉn ®Õn dõng s¶n xuÊt L-lysine.

(3) cÊu tróc L-lysine vµ d¹ng t−¬ng ®ång cña nã S-aminoethylcystein (AEC). AEC

th−êng øc chÕ sinh tr−ëng, nh−ng chñng B. flavum ®ét biÕn AEC bÒn ë vÞ trÝ biÕn ®æi trªn

aspartokinase cña chóng ®−îc sinh tr−ëng vµ s¶n xuÊt qu¸ møc L-lysine do øc chÕ ng−îc

kh«ng kÐo dµi.

HiÖn nay çc nhµ khoa häc ®· sö sông çc kü thuËt ®ét biÕn b»ng ho¸ chÊt

(nitrosoguanidin, raffinate) vµ kü thuËt sinh häc ph©n tö (t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn çc gen

dihydrodipicolinate synthase, aspartate kinase, dihydrodipicolinate reductase) nh»m t¨ng

ho¹t lùc cña çc chñng s¶n xuÊt (Caroline,United State Patent, 1999), (Hungming,

International patent, 2001).

3.1.2. Tæng quan vÒ L-methionin

L-methionin lµ axit amin cã nhãm (-S-) vµ mét nhãm cacboxyl (-COOH) trong

ph©n tö [20,21]. C«ng thøc cña L-methionin nh− sau:

CH3- S- CH2 - CH2 -CH - COOH

NH2

Còng nh− çc axit amin kh¸c, L-methionin cã thÓ chÞu sù chuyÓn amin ho¸ nh−ng

cïng qu¸ tr×nh nµy nã tham gia trong nhiÒu ph¶n øng ho¸ sinh trong c¬ thÓ nhê sù cã mÆt

nhãm metyl (-CH3) trong ph©n tö, nhãm nµy sÏ chuyÓn cho çc hîp chÊt kh¸c.

S-Aminoethylcysteine

HCNH2

NH2

CH2 CH2 CH2 CH2

COOH

CH2

CH2

S CH2

NH2

HCNH2

COOH Lysine

16

L-methionin c«ng thøc ph©n tö lµ C5H11N1O2S, khèi l−îng Mol lµ 149,21. L-

methionin kh«ng hoµ tan tèt trong n−íc.

Con ®−êng sinh tæng hîp L-methionin:

ë E.coli vµ çc loµi hä hµng th× con ®−êng sinh tæng hîp L-methionin ®−îc biÕt tõ

sím. TÊt c¶ çc b−íc trao ®æi chÊt diÔn ra qua 13 gen met gäi lµ çc ®¬n vÞ ®iÒu hoµ met.

ë E.coli gen metA m· ho¸ homoserine succinyl xóc t¸c cho viÖc chuyÓn ho¸ homoserin

thµnh O-acetyl homoserine. Cßn ë C. glutamicum gen metA m· ho¸ homoserine

acetyltransferase vµ nã sö dông acetyl coenzym A nh− chÊt cho acyl.

Tuú thuéc vµo mçi vi sinh vËt, mµ qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ O_acetyl homoserine

thµnh homocysteine cã thÓ x¶y ra theo hai nh¸nh. Brevibacterium flavum chØ sö dông

nh¸nh H2S ®Ó sinh homocysteine. Çc loµi kh¸c sö dông ®−îc c¶ hai con ®−êng. Nh−ng C.

glutamicum th−êng sö dông con ®−êng Cystathionine.

Aspartate

Aspartate phophate

Aspartate semialdehyde

Homoserine

O - Acetyl homoserine

Cystathionine

Homocysteine

L-Methionine

Aspartate kinase

Aspartate sermialdehyde dehydrogenase

Homoserine dehydrogenase

Homoserin acetyltransferase (metA)

Cystathionine gamma - synthase

met C

met E hoÆc met H

Acetyl coA

Cysteine

H2S

met 2

Oxaloacetate

17

S¬ ®å 4: Çc enzym ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh sinh tæng hîp L-methionin

Vai trß sinh häc vµ øng dông L-methionine trong cuéc sèng

L-methionin ¶nh h−ëng lín ®Õn sinh tr−ëng, sù lµm viÖc cña gan, ®iÒu hoµ ho¹t

®éng cña tuyÕn gi¸p, khö ®éc çc chÊt ®éc x©m nhËp vµo c¬ thÓ. L-methionin cßn cã thÓ

thay thÕ ®−îc l−îng cystein cßn thiÕu trong thøc ¨n gia sóc. L-methionin ë møc ®é ®¸ng

kÓ cã thÓ thay thÕ ®−îc vitamin cholin lµ vitamin ®ãng vai trß quan träng trong vç bÐo gia

cÇm vµ lîn. Çc axit amin b¾t buéc ph¶i cã trong thøc ¨n cña tÊt c¶ çc loµi ®éng vËt, trõ

®éng vËt nhai l¹i ®· tr−ëng thµnh. ë çc loµi nhai l¹i nµy, çc axit amin kh«ng thay thÕ

®−îc cung cÊp do çc vi sinh vËt tæng hîp ë d¹ cá. V× vËy, ®èi víi lîn vµ gia cÇm ng−êi ta

®· quan t©m nhiÒu ®Õn c©n ®èi çc axit amin, ®Æc biÖt lµ L-methionin vµ L-lysin trong

thøc ¨n nu«i d−ìng. ViÖc c©n ®èi L-methionin trong khÈu phÇn thøc ¨n cã ý nghÜa quan

träng v× L-methionin lµ mét axit amin chøa l−u huúnh lµ nguån nguyªn liÖu cÇn thiÕt cho

sù sinh tr−ëng. ViÖc nhiÔm mì ë gan lµ mét trong nh÷ng triÖu chøng ®iÓn h×nh nhÊt cña

viÖc thiÕu L-methionin trong khÈu phÇn thøc ¨n, bÖnh nµy cã thÓ ch÷a khái khi khÈu phÇn

thøc ¨n chøa nhiÒu axit amin nµy. Kh«ng ®ñ L-methionin trong thøc ¨n th× qu¸ tr×nh ®Î

trøng, s¾c tè l«ng ë lîn, gµ, vÞt sÏ bÞ c¶n trë. Khi thªm L-methionin th× qu¸ tr×nh nµy trë

l¹i b×nh th−êng. NhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu còng ®· x¸c nhËn vai trß quyÕt ®Þnh cña L-

methionin trong hµng lo¹t çc c«ng tr×nh sinh lý kh¸c. Nã tham gia trong sù trao ®æi selen

vµ cholesterin, trong viÖc h×nh thµnh çc hocmon sinh tr−ëng vµ hocmon adrenotropic ë

phÇn tr−íc cña n·o thuú. L-methionin còng rÊt cÇn thiÕt ®Ó duy tr× tr¹ng th¸i b×nh th−êng

cña hÖ thÇn kinh. L-methionin chøa nhãm chøc l−u huúnh ®Æc biÖt quan träng ®èi víi sóc

vËt non trong qu¸ tr×nh t¨ng tr−ëng. ChÝnh v× vËy mµ ë çc n−íc ph¸t triÓn ®· cã c¬ së s¶n

xuÊt L-methionin ®Ó bæ sung chóng vµo hçn hîp thøc ¨n gia sóc. øng dông cña L-

methionin vµo ch¨n nu«i ®· mang l¹i hiÖu qu¶ kinh tÕ rÊt cao. Hµng lo¹t çc thÝ nghiÖm ë

Liªn X« (cò) vµ çc n−íc cã ngµnh ch¨n nu«i ph¸t triÓn kh¸c chøng minh r»ng khÈu phÇn

thøc ¨n ch¨n nu«i ®−îc bæ sung L-methionin cã t¸c dông sinh häc rÊt m¹nh. ë mét sè

n−íc, ®Ó nu«i bÐo gµ con vµ lîn ng−êi ta lµm giµu hÇu nh− tÊt c¶ çc hçn hîp thøc ¨n b»ng

DL-methionin tæng hîp. Träng l−îng gµ con trong løa tuæi 70 ngµy khi kh«ng cho thªm

L-methionin th× gµ m¸i chØ ®¹t 1206 gam, gµ trèng ®¹t 897 gam. Nh−ng khi cho thªm L-

18

methionin th× gµ m¸i ®¹t 1310 gam, gµ trång ®¹t 1072 gam. Chi phÝ thøc ¨n cho mét ®¬n

vÞ t¨ng träng gi¶m 7% ®Õn 9%. Trong mét thÝ nghiÖm cña Enmison vµ Luis trªn cõu cÇn

2,1gam L-methionin trong mét ngµy ®èi víi cõu cã khèi l−îng 50kg. ë løa tuæi rÊt sím,

gia cÇm cÇn mét l−îng lín çc axit amin chøa l−u huúnh ®Æc biÖt lµ L-methionin ®Ó mäc

l«ng nhanh, v× l«ng vò cã chøa tíi 10% Cistin. §èi víi gia cÇm cßn nhá, cã l−îng l«ng

phñ t−¬ng ®èi lín h¬n trªn mét ®¬n vÞ khèi l−îng, ®ßi hái nhiÒu L-methionin vµ Cistin

h¬n, nã chiÕm 4,5% so víi protein, gµ m¸i lÊy thÞt to cÇn 4%, gµ t©y 3,3%. Lîi Ých cña

viÖc sö dông L-methionin vµo ch¨n nu«i lµ cao nhÊt khi thøc ¨n nghÌo protein.

S¶n xuÊt L-methionin b»ng chñng ®ét biÕn

Chñng ®ét biÕn Brevibacterium flavum tæng hîp L-methionin, s¶n phÈm thu ®−îc ë

d¹ng ®Æc tr−ng ®ång ®¼ng víi L-methionin:

Gièng víi L-methionin, d¹ng ®ång ®¼ng nµy øc chÕ ho¹t ®éng cña homoserin

dehydrogenase vµ do ®ã øc chÕ sinh tr−ëng cña vi khuÈn tù nhiªn. Tuy nhiªn, nÕu sö dông

chñng Brevibacterium flavum ®ét biÕn ®Ó s¶n xuÊt th× l−îng L-methionin d− kh«ng øc

chÕ ng−îc ®Õn homoserin dehydrogenase n÷a, chñng ®ét biÕn Brevibacterium flavum cã

thÓ s¶n xuÊt tèt h¬n [20] . Theo h−íng nµy, ®Çu tiªn cÇn cã chñng bè mÑ ®ét biÕn ®Ó lµm

t¨ng tÇn sè ®ét biÕn. Do s¶n phÈm ®ét biÕn b»ng vËt lý vµ ho¸ häc lµ kh«ng ®Æc hiÖu, cÇn

ph¶i t¸ch nh÷ng ®ét biÕn kh«ng liªn quan, g©y bÊt lîi cho sinh vËt, lµm chËm sù ph¸t triÓn

trong nu«i cÊy hay lµm gi¶m tÕ bµo. Nh÷ng chñng kh«ng mong muèn cã thÓ lo¹i bá bëi

Etionin

CH3

S

CH2

CH2

HCNH2

COOH

Methionin

CH3

S

CH2

CH2

HCNH2

COOH

CH3

S

CH2

CH2

HCNH2

COOH

CH2

19

lai ng−îc chñng ®ét biÕn víi chñng hoang d¹i (lai ng−îc lµ lai tõng chñng víi chñng bè

mÑ tù nhiªn cña nã).

Sö dông kü thuËt sinh häc ph©n tö ®Ó t¨ng s¶n l−îng L-methionin

MÆc dï viÖc t¹o ra çc chñng ®ét biÕn cã kh¶ n¨ng ®Ò kh¸ng víi chÊt ®ång ®¼ng

cña L-methionin ®· kh¾c phôc ®−îc c¬ chÕ øc chÕ ng−îc, tõ ®ã gióp cho s¶n xuÊt L-

methionin t¨ng cao, nh−ng qu¸ tr×nh øc chÕ ng−îc nµy vÉn Ýt nhiÒu cã xu h−íng x¶y ra,

lµm h¹n chÕ sù t¨ng s¶n l−îng L-methionin. ViÖc t¸ch dßng, biÓu hiÖn gen metA b»ng çc

promotor m¹nh ®· gióp kh¾c phôc ®−îc hiÖn t−îng nªu trªn vµ lµm t¨ng ®¸ng kÓ s¶n

l−îng L-methionin.[97]

§Ó t¨ng s¶n l−îng L-methionin, hiÖn nay c«ng nghÖ gen ®· ph©n tÝch ®−îc yÕu tè

lµm t¨ng ho¹t ®éng s¶n sinh L-methionin cña chñng C.acetoglutamicum. Goyon vµ céng

sù 1998 ®· tiÕn hµnh t¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù gen met2 lµ gen m· ho¸ homserin O-

transacetylase, mét trong nh÷ng enzym cña con ®−êng sinh tæng hîp L-methionin, ®©y lµ

ph¸t hiÖn quan träng ®Ó biÕt ®−îc cÊu tróc gen. Trong thêi gian nµy ®· cã nhiÒu ph¸t hiÖn

thó vÞ vÒ con ®−êng aspartat qua ®ã s¶n xuÊt L-methionin. Tuy nhiªn n¨m 1998, Park

cïng céng sù ®· nghiªn cøu metA ë chñng C.acetoglutamicum, gen m· ho¸ cho homoserin

acetyltransferase enzym ®Çu tiªn cña con ®−êng sinh tæng hîp L-methionin tõ homserin.

ViÖc biÕn n¹p mét plasmid mang gen metA vµo chñng C.acetoglutamicum ®· lµm t¨ng

ho¹t tÝnh enzym vµ kh¶ n¨ng biÓu hiÖn s¶n phÈm protein lªn 10 lÇn[26].

Khi s¶n l−îng axit amin thÊp, viÖc khuyÕch ®¹i çc gen sinh tæng hîp axit amin

nhê ph−¬ng ph¸p ADN t¸i tæ hîp sÏ cho s¶n phÈm cã s¶n l−îng cao h¬n vµ hoµn thiÖn

chñng gièng. Kü thuËt nµy ®−îc sö dông ®Ó thiÕt kÕ chñng siªu s¶n xuÊt.

ë n−íc ta , vÊn ®Ò nghiªn cøu vÒ L-methionin lµ rÊt míi mÎ. V× vËy viÖc nghiªn

cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt L-methionin ë ViÖt nam lµ rÊt cÇn thiÕt.

3.1.3. Tæng quan vÒ enzym phytaza

Nh÷ng nghiªn cøu vÒ axit phytic:

Axit phytic lµ mét axit h÷u c¬ trong ph©n tö cã chøa çc gèc phosphat. Nã cã mÆt chñ

yÕu trong h¹t cña çc lo¹i ngò cèc, ®Ëu ®ç vµ h¹t cã dÇu. Ng−êi ta ®· x¸c ®Þnh ®−îc r»ng axit

20

phytic gi÷ vai trß nhÊt ®Þnh vµ cã nh÷ng t¸c ®éng ¶nh h−ëng ®Õn tÝnh chÊt dinh d−ìng cña çc

lo¹i h¹t trªn.

Axit phytic cã c«ng thøc ph©n tö C6H18O24P6 vµ ph©n tö l−îng lµ 660,04. Danh

ph¸p quèc tÕ cña axit phytic ®−îc gäi lµ myo-inositol 1,2,3,4,5,6 – hexakisdihydrogen

phosphate (IUPAC- IUB, 1977) [94]. Thùc tÕ, axit phytic th−êng tån t¹i d−íi d¹ng muèi

cña çc kim lo¹i ho¸ trÞ I, II (th−êng lµ Kali- Magiª- Canxi). Çc muèi nµy ®−îc gäi lµ

phytat vµ chóng ®−îc xem nh− lµ kho dù tr÷ photpho lín trong çc h¹t thùc vËt.

Cã nhiÒu nghiªn cøu vÒ m« h×nh cÊu tróc ph©n tö cña axit phytic nh−ng çc nghiªn

cøu nµy l¹i ®−a ®Õn nh÷ng kÕt luËn rÊt kh¸c nhau. Trong sè çc nghiªn cøu ®ã cã hai

nghiªn cøu tiªu biÓu cña hai nhãm chuyªn gia kh¸c nhau ®−îc biÕt ®Õn nhiÒu h¬n c¶. §ã

lµ nghiªn cøu cña Johnson vµ Tate (1969) b»ng ph−¬ng ph¸p céng h−ëng ®iÖn tõ h¹t nh©n 31P (31P- NMR) vµ nghiªn cøu cña Blank vµ cs (1971) b»ng ph−¬ng ph¸p nhiÔu x¹ tia X.

Tuy nhiªn hai nhãm nghiªn cøu nµy l¹i ®−a ra hai kÕt luËn tr¸i ng−îc nhau.

Theo Johnson vµ Tate th× trong cÊu tróc cña ph©n tö axit phytic cã mét gèc

phosphat ë vÞ trÝ sè 2 (gèc phosphat g¾n víi nguyªn tö C sè 2) n»m theo h−íng trôc th¼ng

®øng cßn çc gèc phosphat ë vÞ trÝ kh¸c th× cã h−íng nghiªng mét gãc so víi ph−¬ng

th¼ng ®øng. Ng−îc l¹i, kÕt luËn cña Blank l¹i cho r»ng çc gèc phosphat 1,3,4,5 vµ 6 n»m

theo h−íng trôc th¼ng ®øng cßn gèc phosphat n»m ë vÞ trÝ sè 2 l¹i nghiªng theo gãc 1/4.

Tuy nhiªn, kÕt luËn vÒ cÊu tróc ph©n tö cña axit phytic theo ph−¬ng ph¸p Johnson

vµ Tate ®−îc nhiÒu sù t¸n ®ång h¬n.

M« h×nh theo kÕt luËn nµy ®−îc m« t¶ ë H×nh 1

1

4

6

23

21

H×nh 1: M« h×nh cÊu tróc ph©n tö axit phytic (myo- inositol hexakisphosphate).

Çc vßng trßn biÓu diÔn çc gèc phosphate, çc nguyªn tö çcbon ®−îc ®¸nh sè tõ 1

®Õn 6

Çc gèc phosphat trong ph©n tö axit phytic cã thÓ bÞ t¸ch ra ë çc pH nhÊt ®Þnh.

B»ng ph−¬ng ph¸p céng h−ëng ®iÖn tõ h¹t nh©n 31P(31P- NMR) vµ ph−¬ng ph¸p ®Þnh ph©n

pH, çc nhµ khoa häc ®· kÕt luËn r»ng sè gèc phosphat bÞ ra t¸ch tuú thuéc vµo kho¶ng

pH cña m«i tr−êng. Hä ®· x¸c ®Þnh ®−îc gi¸ trÞ cña h»ng sè axit pKa khi çc gèc phosphat

cña ph©n tö axit phytic ®−îc t¸ch ra nh− sau: trong m«i tr−êng axit m¹nh mµ pKa = 1,1-

2,1 toµn bé 6 gèc phosphat cña ph©n tö axit phytic ®Òu bÞ t¸ch ra; trong m«i tr−êng axit

yÕu h¬n mµ pKa = 5,7 th× chØ cã mét gèc phosphat bÞ t¸ch ra; trong m«i tr−êng axit yÕu

mµ pKa = 6,8- 7,6 th× cã 2 gèc phosphat bÞ t¸ch ra; cßn khi trong m«i tr−êng axit rÊt yÕu,

pKa = 10- 12 sÏ cã 3 gèc phosphat bÞ t¸ch ra. §iÒu nµy cho thÊy, axit phytic cã nhiÒu kh¶

n¨ng h×nh thµnh hîp chÊt víi çc ion d−¬ng ®a ho¸ trÞ vµ çc protein trong c¬ thÓ v× chóng

cã rÊt nhiÒu kh¶ n¨ng tån t¹i ë çc d¹ng ph©n tö mang ®iÖn tÝch ©m trong mét d¶i pH

réng.

Chøc n¨ng sinh lý cña axit phytic:

Axit phytic ®−îc t×m thÊy nhiÒu trong çc h¹t thùc vËt, ®Æc biÖt lµ h¹t çc lo¹i ngò

cèc vµ h¹t çc lo¹i ®Ëu ®ç. V× trong thµnh phÇn cÊu t¹o nªn ph©n tö axit phytic cã chøa

mét l−îng phospho t−¬ng ®èi lín nªn axit phytic vµ çc muèi cña chóng trong çc h¹t

thùc vËt lµ mét nguån dù tr÷ phospho kh¸ dåi dµo cã thÓ tËn dông nh»m cung cÊp kho¸ng

chÊt cho c¬ thÓ. Axit phytic cßn lµ mét nguån dù tr÷ n¨ng l−îng, nguån myo-inositol

(thµnh phÇn cÊu t¹o nÒn vá ngoµi cña thµnh tÕ bµo) t−¬ng ®èi lín.

Axit phytic trong çc h¹t thùc vËt cã nh÷ng ¶nh h−ëng nhÊt ®Þnh ®Õn ®Æc tÝnh sinh

lý cña h¹t. Nã t¸c ®éng ®Õn tr¹ng th¸i ngñ nghØ cña h¹t do nã chèng l¹i sù oxy ho¸ tù

nhiªn trong qu¸ tr×nh ngñ nghØ(chèng l¹i sù h« hÊp) cña çc h¹t thùc vËt, v× vËy lµm chËm

sù ph¸t triÓn vµ cã thÓ lµm mÊt kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña çc h¹t nµy.

§èi víi ®éng vËt, axit phytic còng cã nh÷ng vai trß tÝch cùc nhÊt ®Þnh. Trong nh÷ng

vai trß ®· ®−îc biÕt ®Õn nh− lµ nguån cung cÊp phospho vµ myo- inositol th× nã cßn ®−îc

coi nh− lµ mét t¸c nh©n chèng ung th− ®−êng ruét vµ ung th− vó ë ®éng vËt. Sù cã mÆt cña

22

axit phytic kh«ng tiªu ho¸ trong ®−êng ruét cã thÓ b¶o vÖ c¬ thÓ nhê kh¶ n¨ng chèng l¹i

sù ph¸t triÓn cña çc khèi u ë trong ruét.

Vµo cuèi thËp kû 80, ®Çu thËp kû 90 ng−êi ta ®· chøng minh ®−îc vai trß gi¸n tiÕp

cña inositol phosphate trong qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vËt chÊt trong tÕ bµo, ®Æc biÖt lµ vai trß

cña inositol - triphosphate. Chóng lµ dÊu hiÖu cña sù di truyÒn tÝnh tr¹ng vµ cã liªn quan

rÊt lín ®Õn sù biÕn ®æi chøc n¨ng cña tÕ bµo ®èi víi c¶ tÕ bµo ®éng vËt vµ thùc vËt.

Ngoµi nh÷ng t¸c ®éng sinh lý nªu trªn, ng−êi ta dù ®o¸n r»ng axit phytic cßn cã thÓ

cã nh÷ng chøc n¨ng ch−a biÕt kh¸c.

HiÖu øng kh¸ng dinh d−ìng cña axit phytic

Mét ®Æc tÝnh bÊt lîi næi bËt nhÊt cña axit phytic ®èi víi c¬ thÓ ®éng vËt lµ hiÖu øng

kh¸ng dinh d−ìng. HiÖu øng nµy t¹o nªn do nguyªn nh©n cÊu tróc bÊt th−êng cña axit

phytic. Khi ph©n tö axit phytic ë d¹ng ph©n ly hoµn toµn, 6 nhãm phosphate cña chóng sÏ

mang tæng ®iÖn tÝch –12. V× vËy, chóng cã nhiÒu kh¶ n¨ng kÕt hîp víi çc ion d−¬ng ho¸

trÞ 1, 2, 3 hoÆc hçn hîp cña çc ion ®ã, h×nh thµnh nªn çc hîp chÊt kh«ng hoµ tan, nªn rÊt

khã tiªu ho¸. Sù h×nh thµnh çc hîp chÊt v« c¬ kh«ng tan trong ®−êng ruét ®· ng¨n c¶n sù

hÊp thô çc kho¸ng chÊt cña c¬ thÓ ®éng vËt. Bëi v× axit phytic khi kÕt hîp víi çc ion kim

lo¹i nh− Fe3+, Mg2+, Ca2+, Zn+ ...sÏ ng¨n c¶n kh¶ n¨ng kÕt hîp cña çc ion kim lo¹i nµy víi

çc axit bÐo kh«ng no lµm gi¶m kh¶ n¨ng tiªu ho¸ thøc ¨n cña ®éng vËt. Nh− vËy, yÕu tè

nµy ®· lµm gi¶m l−îng kho¸ng cÇn thiÕt ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ ®éng vËt qua con ®−êng thøc

¨n mµ lÏ ra c¬ thÓ ®éng vËt cã thÓ hÊp thô ®−îc, do ®ã lµm gi¶m gi¸ trÞ dinh d−ìng cña

nguån thøc ¨n. V× vËy mµ axit phytic ®−îc coi lµ mét yÕu tè kh¸ng dinh d−ìng ë ®éng vËt,

®Æc biÖt lµ çc ®éng vËt cã d¹ dµy ®¬n ng¨n nh− gia cÇm, lîn.

Víi mét sè nguyªn tè vi l−îng, vÝ dô nh− kÏm (Zn) th× gi¸ trÞ dinh d−ìng cña nã

chÞu ¶nh h−ëng rÊt lín bëi axit phytic. Mét vµi thÝ nghiÖm ®· cho thÊy viÖc bæ sung dÇn

dÇn axit phytic vµo trong khÈu phÇn thøc ¨n cña vËt nu«i ®· ¶nh h−ëng ©m tÝnh ®Õn sù hÊp

thô Zn2+ cña c¬ thÓ (c¬ thÓ kh«ng hÊp thô ®−îc Zn2+) vµ tèc ®é t¨ng tr−ëng träng l−îng

cña ®éng vËt thÝ nghiÖm mét çch râ rÖt.

23

Axit phytic cã kh¶ n¨ng kÕt hîp víi protein t¹o thµnh phøc chÊt phytat- protein

trong mét kho¶ng pH rÊt réng. ë pH rÊt thÊp, axit phytic mang ®iÖn tÝch ©m lín do sù

ph©n ly cña toµn bé çc gèc phosphat trong ph©n tö. Trong ®iÒu kiÖn nµy, axit phytic cã

thÓ lµm h¹n chÕ kh¶ n¨ng hoµ tan cña çc protein bëi v× cã sù liªn kÕt ion gi÷a çc gèc

phosphat c¬ b¶n víi çc gèc tù do cña amino axit (L-lysin, histidin, arginin). Trong m«i

tr−êng cã tÝnh axit, axit phytic liªn kÕt chÆt chÏ víi çc protein thùc vËt do ®ã ®iÓm ®¼ng

®iÖn (pI) cña çc protein thùc vËt lóc nµy n»m trong kho¶ng pH = 4 - 5. ë kho¶ng pH = 6 -

8, c¶ axit phytic vµ protein thùc vËt ®Òu mang ®iÖn tÝch ©m. Tuy nhiªn, ë ®iÒu kiÖn nµy

vÉn cã thÓ h×nh thµnh phøc chÊt gi÷a axit phytic vµ çc protein. C¬ chÕ x¶y ra cã thÓ lµ sù

liªn kÕt trùc tiÕp cña axit phytic víi proton ë çc nhãm cuèi cïng α-NH2 vµ ε- NH2 cña

gèc L-lysine tù do hoÆc liªn kÕt qua nh©n tè trung gian lµ mét cation ®a ho¸ trÞ. Còng bëi

liªn kÕt víi protein thùc vËt nªn axit phytic lµm gi¶m kh¶ n¨ng hoµ tan vµ kh¶ n¨ng tiªu

ho¸ cña çc protein nµy do ®ã lµm gi¶m gi¸ trÞ dinh d−ìng cña chóng.

Ngoµi viÖc t¹o phøc chÊt víi çc kho¸ng chÊt vµ çc protein, axit phytic cßn t¸c

®éng ®Õn çc enzym nh− trypsin, pepsin, α- amilaza, β- galactosidaza vµ kÕt qu¶ lµ lµm

gi¶m ho¹t tÝnh cña çc enzym tiªu ho¸ quan träng nµy.

Nguån gèc vµ sù ph©n bè cña axit phytic trong tù nhiªn

Axit phytic th−êng tån t¹i ë d¹ng tiÒn khëi lµ muèi cña çc ion kim lo¹i cã ho¸ trÞ

mét hay nhiÒu hoÆc cã thÓ lµ hçn hîp cña chóng, ch¼ng h¹n nh− hçn hîp muèi Kali –

Magiª trong g¹o, hçn hîp Canxi – Magiª - Kali trong çc h¹t cã dÇu. Çc muèi nµy

th−êng tËp trung ë mét sè vïng nhÊt ®Þnh trong çc h¹t thùc vËt. Axit phytic ®−îc tÝch luü

dÇn trong h¹t tõ khi h¹t non ®Õn khi h¹t tr−ëng thµnh trong suèt qu¸ tr×nh chÝn cïng víi

çc chÊt dù tr÷ kh¸c trong h¹t nh− tinh bét, lipÝt.. Tuy nhiªn, møc ®é tËp trung cña axit

phytic trong çc h¹t thùc vËt kh¸c nhau lµ kh«ng gièng nhau. VÝ dô nh− trong çc lo¹i ngò

cèc, axit phytic ®−îc tÝch luü nhiÒu trong h¹t phÊn cßn ®èi víi çc lo¹i ®Ëu th× axit phytic

®−îc tÝch luü nhiÒu trong çc h¹t tinh thÓ cña chóng. NhiÒu nghiªn cøu cho thÊy r»ng, ë

c©y mét l¸ mÇm nh− lóa, lóa m×... th× trong néi nhò vµ nh©n cña h¹t hÇu nh− kh«ng chøa

phytat mµ l−îng phytat l¹i ®−îc t×m thÊy chñ yÕu trong ph«i vµ trong líp tÕ bµo h¹t phÊn.

24

Ng−îc l¹i, ë c©y hai l¸ mÇm th× l−îng phytat chñ yÕu l¹i n»m trong thµnh phÇn néi nhò

(chiÕm 99%) vµ chØ cã kho¶ng 1% lµ ë trong ph«i (hay mÇm) cña h¹t.

Nh÷ng nghiªn cøu vÒ phytase

Kh¸i niÖm vÒ phytase

Phytase lµ mét enzym xóc t¸c cho ph¶n øng thuû ph©n axit phytic (myo - inositol

hexakisphosphate) thµnh çc myo - inositol phosphate ph©n tö thÊp h¬n vµ çc

monophosphate v« c¬. Trong mét sè tr−êng hîp, ph¶n øng thuû ph©n cã thÓ x¶y ra hoµn

toµn, gi¶i phãng toµn bé çc gèc phosphat trong ph©n tö axit phytic (hay phytat) vµ h×nh

thµnh nªn çc myo - inositol tù do. Phytase cã tªn gäi ®Çy ®ñ, theo quy −íc quèc tÕ lµ:

myo - inositol hexakisphosphat phosphohydrolase. D¹ng phytat lµ mét phøc chÊt cña

phospho víi çc muèi kho¸ng, protein vµ çc enzym trong çc h¹t thùc vËt. Çc d¹ng chÊt

nµy ®−îc coi lµ yÕu tè phi dinh d−ìng. Enzym phytase sÏ gi¶i phãng photpho chøa trong

çc h¹t ngò cèc, h¹t ®Ëu vµ h¹t cã dÇu b»ng çch ph¸ vì cÊu tróc phytat ®ång thêi gi¶i

phãng çc muèi kho¸ng nh− Ca, Mg,...çc axit amin kÕt dÝnh trong ph©n tö phytat.

Ho¹t ®é phytase cña chÕ phÈm enzym ®Æc tr−ng cho kh¶ n¨ng xóc t¸c ph©n gi¶i

hîp chÊt phytat (myo- inositol hexakis phosphate) thµnh çc myo- inositol phosphat ph©n

tö thÊp h¬n vµ çc gèc phosphat v« c¬. Ho¹t ®é phytase ®−îc biÓu thÞ b»ng sè ®¬n vÞ ho¹t

®é trong 1ml (hay 1g) chÕ phÈm.

§Þnh nghÜa ®¬n vÞ ho¹t ®é: Mét ®¬n vÞ ho¹t ®é phytase lµ l−îng enzym xóc t¸c

ph¶n øng thuû ph©n ®Ó gi¶i phãng ra 1µmol phosphat v« c¬ trong thêi gian mét phót tõ

dung dÞch natri - phytat ë 370C, pH = 5,5 vµ trong çc ®iÒu kiÖn cña ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch.

Ph©n lo¹i phytase

Tæ chøc ®Þnh tªn enzym thuéc Héi Ho¸ sinh Quèc tÕ ®· ph©n lo¹i phytase thµnh 2

lo¹i lµ 3- phytase (EC 3.1.3.8) vµ 6- phytase (EC 3.1.3.26). Çch ®Þnh tªn nµy ®−îc dùa

trªn c¬ së xuÊt ph¸t tõ nhãm phosphat ®Çu tiªn ®−îc gi¶i phãng ra tõ ph©n tö phytat khi

enzym xóc t¸c ph¶n øng thuû ph©n. Ng−êi ta thÊy r»ng lo¹i 3- phytase (tøc enzym xóc t¸c

ph¶n øng thuû ph©n hîp chÊt phytat vµ gi¶i phãng ra gèc phosphat ®Çu tiªn ë vÞ trÝ sè 3)

25

th−êng cã ë vi sinh vËt cßn 6- phytase (lµ enzym xóc t¸c ph¶n øng thuû ph©n hîp chÊt

phytat vµ gi¶i phãng ra gèc phosphat ®Çu tiªn ë vÞ trÝ sè 6) cã mÆt chñ yÕu ë trong thùc vËt.

§Æc ®iÓm cÊu t¹o vµ tÝnh chÊt cña enzym phytase

§Æc ®iÓm cÊu t¹o cña phytase

Phytase còng gièng nh− mäi enzym kh¸c cã b¶n chÊt lµ protein. Chóng lµ nh÷ng

ph©n tö cã khèi l−îng tõ 20000 ®Õn 1000000 dalton. KÝch th−íc ph©n tö protein cña

enzym phytase s¶n sinh tõ çc nguån kh¸c nhau th× kh¸c nhau. Ng−êi ta ®· tÝnh to¸n vµ

tiÕn hµnh thÝ nghiÖm x¸c ®Þnh khèi l−îng ph©n tö cña protein phytase thu ®−îc tõ mét sè

nguån kh¸c nhau.

Çc nghiªn cøu ®· cho thÊy r»ng hÇu hÕt çc phytase thu ®−îc tõ çc chñng vi sinh

vËt cho ®Õn nay ®Òu lµ çc enzym ®−îc cÊu t¹o chØ gåm mét ph©n tö. Nh−ng phytase ë

mét sè ®éng vËt vµ thùc vËt th× protein cña chóng l¹i ®−îc cÊu t¹o bëi nhiÒu phÇn nhá, çc

phÇn ®ã ®−îc gäi lµ çc tiÓu ®¬n vÞ. VÝ dô nh− phytase tÝch luü trong çc h¹t ng« ®ang n¶y

mÇm lµ enzym mµ ph©n tö protein cña chóng bao gåm 2 tiÓu ®¬n vÞ cã träng l−îng ph©n

tö b»ng nhau lµ 38 kDa. Cßn phytase ®−îc t¸ch chiÕt tõ ruét cña mét loµi chuét l¹i ®−îc

cÊu t¹o bëi 2 tiÓu ®¬n vÞ lµ 2 b¨ng protein cã khèi l−îng ®−îc x¸c ®Þnh b»ng ph−¬ng ph¸p

®iÖn di trªn gel polyacrylamid (SDS- PAGE) −íc tÝnh kho¶ng 70 vµ 90 kDa. Tuy nhiªn

ng−êi ta ®· x¸c ®Þnh ®−îc r»ng chØ cã tiÓu ®¬n vÞ cã kÝch th−íc 90 kDa lµ cã kh¶ n¨ng

thuû ph©n axit phytic v× hai b¨ng protein nµy biÓu hiÖn cho hai lo¹i enzym kh¸c nhau

t−¬ng øng lµ phosphataza kiÒm tÝnh vµ phytase.Cã mét tr−êng hîp ®Æc biÖt lµ phytase thu

®−îc tõ chñng Klebsiella aerogenes l¹i gåm hai d¹ng kh¸c nhau. D¹ng thø nhÊt cã thÓ coi

lµ d¹ng enzym gèc, cã kÝch th−íc lín mét çch kh¸c th−êng (700 kDa). D¹ng thø hai cã

thÓ lµ mét m¶nh nhá cña enzym gèc, cã khèi l−îng ph©n tö rÊt thÊp chØ kho¶ng 10- 13

kDa nh−ng nã l¹i mang ®Çy ®ñ ho¹t tÝnh cña mét enzym.

TÝnh chÊt cña phytase

C¬ chÕ thuû ph©n axit phytic cña enzym phytase

Khi thuû ph©n axit phytic hay phytat, enzym phytase cã t¸c dông c¾t ®øt çc liªn

kÕt trong ph©n tö axit phytic, phytat. Qu¸ tr×nh c¾t ®øt nµy x¶y ra nhanh hay chËm vµ hoµn

26

toµn hay kh«ng hoµn toµn phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè nh− nhiÖt ®é ph¶n øng, pH ph¶n

øng, l−îng c¬ chÊt vµ l−îng enzym. Ngoµi ra, nã cßn bÞ ¶nh h−ëng bëi çc ion kim lo¹i.

Sau qu¸ tr×nh thuû ph©n, nã sÏ gi¶i phãng çc gèc phosphat, çc myo- inositol vµ

çc muèi kho¸ng. C¬ chÕ thuû ph©n nh− H×nh 2

H×nh 2: Sù thuû ph©n axit phytic b»ng enzym phytase

NhiÖt ®é tèi −u cho sù ho¹t ®éng cña phytase:

Nh×n chung, vËn tèc ph¶n øng do enzym xóc t¸c th−êng t¨ng lªn theo nhiÖt ®é

nh−ng chØ t¨ng lªn trong mét giíi h¹n x¸c ®Þnh mµ ë ®ã, phÇn tö enzym vÉn cßn bÒn vµ

ch−a bÞ biÕn tÝnh. NhiÖt ®é thÝch hîp cho sù ho¹t ®éng cña mçi enzym th−êng t−¬ng ®èi

réng. §èi víi phytase, ng−êi ta ®· nghiªn cøu vµ cho thÊy r»ng chóng cã thÓ ho¹t ®éng

trong kho¶ng 45-750C.

Nh−ng nhiÖt ®é mµ øng víi ho¹t ®é enzym cao nhÊt th−êng chØ tån t¹i mét ®iÓm vµ

nhiÖt ®é ®ã gäi lµ nhiÖt ®é tèi −u cña enzym (topt). NhiÖt ®é tèi −u cña phytase thu ®−îc tõ

çc nguån kh¸c nhau th× còng rÊt kh¸c nhau, d¶i nhiÖt ®é nµy rÊt réng, tõ 37- 770C. Tuy

nhiªn topt cña mét enzym th−êng kh«ng cè ®Þnh mµ cã thÓ thay ®æi tuú theo c¬ chÊt, pH

m«i tr−êng, thêi gian ph¶n øng. Khi nhiÖt ®é n»m ngoµi kho¶ng thÝch nghi, enzym cã thÓ

bÞ v« ho¹t t¹m thêi hoÆc v« ho¹t hoµn toµn. NhiÖt ®é mµ enzym bÞ mÊt ho¹t tÝnh xóc t¸c

OPO3H2

OPO3H2H2O3PO Phytase

H2O3PO

H2O3PO

H2O3PO

H2O3PO H2O3PO OPO3H2

H2O3PO

HO OPO3H2

+ PO4

3-

27

hoµn toµn gäi lµ nhiÖt ®é tíi h¹n. NhiÖt ®é nµy th−êng vµo kho¶ng trªn 700C. ë nhiÖt ®é

tíi h¹n, enzym bÞ biÕn tÝnh, Ýt cã kh¶ n¨ng phôc håi l¹i ho¹t ®é. Ng−îc l¹i, ë nhiÖt ®é d−íi

00C, ho¹t ®é cña enzym tuy bÞ gi¶m nh−ng l¹i cã thÓ t¨ng lªn khi ®−a vÒ nhiÖt ®é b×nh

th−êng.

pH tèi −u cho sù ho¹t ®éng cña phytase:

pH cña m«i tr−êng ¶nh h−ëng râ rÖt ®Õn ph¶n øng enzym v× nã ¶nh h−ëng ®Õn møc

®é ion ho¸ c¬ chÊt, enzym vµ ®é bÒn cña protein enzym. §a sè çc enzym bÒn trong giíi

h¹n pH gi÷a 5 ®Õn 9. §é bÒn cña enzym ®èi víi pH m«i tr−êng còng cã thÓ t¨ng lªn khi

cã c¬ chÊt, coenzym vµ Ca2+... pH tèi −u (pHopt) cho ho¹t ®éng cña phytase thu ®−îc tõ çc

nguån kh¸c nhau rÊt kh¸c nhau. pH thÝch hîp cho ho¹t ®éng cña chóng th−êng vµo

kho¶ng 2,2 ®Õn 8. HÇu hÕt çc phytase tõ vi sinh vËt th−êng cã pHopt n»m trong kho¶ng

hÑp 4,5- 5,6. Tuy nhiªn phytase tõ nÊm, ®Æc biÖt lµ Aspergillus fumigatus l¹i cã kho¶ng

pH tèi −u réng. Cã Ýt nhÊt 80% trong loµi cã ho¹t ®é cùc ®¹i ë pH gi÷a 4 vµ 7,3. Th−êng

th× gi¸ trÞ pHopt cu¶ mét enzym còng kh«ng cè ®Þnh mµ phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè kh¸c

nh− c¬ chÊt, tÝnh chÊt dung dÞch ®Öm, nhiÖt ®é... Qua çc nghiªn cøu cho thÊy, trong cïng

mét ®iÒu kiÖn nhÊt ®Þnh th× pHopt cña phytase cña çc chñng ®−îc t×m thÊy hÇu nh− chØ ë

mét gi¸ trÞ nhÊt ®Þnh, riªng cã hai lo¹i phytase tõ Aspergillus niger NRRL3135 vµ

Citrobacter freundii kh¸c víi çc phytase kh¸c ë ®iÓm lµ chóng cã hai gi¸ trÞ pHopt kh¸c

nhau. Phytase tõ mét sè loµi vi khuÈn thuéc chi Bacillus cã pHopt vµo kho¶ng pH trung

tÝnh (6,5-7,5). Cßn phytase thu ®−îc tõ thùc vËt nh− h¹t ®Ëu vµ phÊn hoa (hoa HuÖ t©y) l¹i

cã pHopt cao h¬n (th−êng kho¶ng 8,0).

Nguån nguyªn liÖu ®Ó thu phytase

Phytase tõ nguån thùc vËt

Phytase cã mÆt phæ biÕn trong giíi thùc vËt, ®Æc biÖt chóng cã thÓ t¸ch chiÕt vµ tinh

chÕ tõ çc lo¹i ngò cèc nh− lóa m×, ng«, lóa m¹ch, g¹o.. vµ çc lo¹i ®Ëu nh−: ®Ëu xanh,

®Ëu Ên ®é, ®Ëu lïn, ®Ëu tr¾ng California. Ho¹t tÝnh phytase còng t×m thÊy trong c©y mï t¹c

tr¾ng, khoai t©y, cñ c¶i, rau diÕp, rau Bina, phÊn hoa HuÖ t©y (hoa loa kÌn).

Phytase tõ nguån ®éng vËt

28

ë ®éng vËt, phytase ®· ®−îc t×m thÊy trong ruét vµ d¹ dµy cña çc loµi ®éng vËt cã

d¹ dµy ®¬n ng¨n nh− lîn vµ gia cÇm. Tuy nhiªn, çc phytase nµy gÇn nh− kh«ng cã ý

nghÜa g× ®èi víi viÖc ph©n gi¶i phytate cã trong thøc ¨n ®−îc ®−a vµo d¹ dµy cña ®éng vËt.

Qua kiÓm tra, ng−êi ta ®· thÊy r»ng nhiÒu lo¹i inositol polyphosphat phosphatase (MIPP)

mang l¹i ho¹t tÝnh phytase ®Òu cã trong hÖ thèng ®−êng ruét cña tÊt c¶ çc con chuét ®em

lµm thÝ nghiÖm nh−ng chñ yÕu tËp trung nhiÒu ë thËn vµ gan cña loµi ®éng vËt nµy. Çc

nhµ khoa häc ®· t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn ®−îc thµnh phÇn inositol polyphosphatate

phosphatase mang ho¹t tÝnh ë gan cña loµi chuét trªn. Mét lo¹i enzym gièng phytase còng

®· ®−îc t×m thÊy ë loµi ®éng vËt nguyªn sinh Paramecium.

Phytase tõ nguån vi sinh vËt

Chóng ta ®· biÕt r»ng enzym nãi chung cã trong tÊt c¶ çc c¬ quan, m« cña ®éng

vËt, thùc vËt còng nh− trong tÕ bµo vi sinh vËt. Nguån vi sinh vËt l¹i v« cïng phong phó vµ

®a d¹ng nªn phytase còng nh− çc lo¹i enzym kh¸c cã thÓ ®−îc sinh ra tõ rÊt nhiÒu loµi vi

sinh vËt kh¸c nhau. Ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn vµ t¸ch ®−îc phytase ë rÊt nhiÒu loµi nÊm mèc,

®Æc biÖt lµ Aspergillus. Cho ®Õn nay ®· ph©n lËp ®−îc trªn 200 loµi vi sinh vËt tõ ®Êt cã

kh¶ n¨ng sinh tæng hîp phytase. PhÇn lín çc vi sinh vËt nµy cho s¶n phÈm phytase néi

bµo, chØ cã kho¶ng 30 loµi trong sè ®ã lµ cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp phytase ngo¹i bµo.

TÊt c¶ çc vi sinh vËt s¶n sinh phytase ngo¹i bµo thuéc lo¹i nÊm mèc, cã 28 loµi thuéc chñng

Aspergillus, chØ cã mét lo¹i tõ Penecillium vµ mét lo¹i tõ Mucor. Trong 28 loµi Aspergillus cã

kh¶ n¨ng sinh tæng hîp phytase ngo¹i bµo ®· ph©n lËp ®−îc cã 21 loµi thuéc nhãm Aspergillus

niger. Çc nghiªn cøu cßn kh¼ng ®Þnh r»ng chñng Aspergillus niger lµ nguån thu phytase ngo¹i

bµo tèt nhÊt. Phytase còng ®−îc ph¸t hiÖn ra ë nhiÒu loµi vi khuÈn kh¸c nhau nh− Aerobacter

aerogenes, Pseudomonas sp, Bacillus subtilis, Klebsiella sp, Bacillus subtilis natto. Vi khuÈn

sinh tæng hîp phytase ngo¹i bµo chØ cã hai loµi ®ã lµ Bacillus vµ Enterobacter. Mét sè nÊm

men nh− Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida... còng cã kh¶ n¨ng

sinh phytase.

MÆc dï phytase rÊt phong phó trong sinh giíi, cã thÓ cã nhiÒu nguån thu kh¸c nhau

song viÖc t¸ch vµ thu chóng, nhÊt lµ t¸ch víi quy m« c«ng nghiÖp lîi vÒ kinh tÕ chØ cã thÓ

tiÕn hµnh trong nh÷ng tr−êng hîp mµ vËt liÖu cã chøa mét l−îng lín enzym còng nh− cho

29

phÐp thu ®−îc enzym víi hiÖu suÊt cao. Trong tay con ng−êi cã ba nguån nguyªn liÖu sinh

häc c¬ b¶n ®Ó t¸ch chiÕt bÊt kú mét lo¹i enzym nµo nãi chung. §ã lµ çc m« vµ c¬ quan

®éng vËt, m« vµ c¬ quan thùc vËt, tÕ bµo vi sinh vËt. Trong çc nguån nguyªn liÖu sinh

häc trªn th× chØ cã nguån nguyªn liÖu vi sinh vËt lµ dåi dµo vµ ®Çy høa hÑn v× viÖc sö dông

vi sinh vËt lµm nguån nguyªn liÖu ®Ó s¶n xuÊt çc chÕ phÈm enzym sÏ kh¾c phôc ®−îc

mäi khã kh¨n vµ h¹n chÕ so víi hai nguån nguyªn liÖu trªn. Thùc tÕ ®· chøng minh tÝnh

−u viÖt vµ kh¶ n¨ng to lín cña çc nguån nguyªn liÖu vi sinh vËt:

- Thø nhÊt, vi sinh vËt lµ nguån nguyªn liÖu v« tËn ®Ó s¶n xuÊt enzym nãi chung vµ

phytase nãi riªng víi mét l−îng lín vµ cã thÓ më réng ®Ó s¶n xuÊt tíi quy m« cÇn thiÕt,

®ång thêi viÖc thu chÕ phÈm còng dÔ dµng.

- Thø hai, tõ vi sinh vËt kh«ng nh÷ng chØ thu ®−îc mét sè l−îng lín çc enzym

kh¸c nhau, mµ tõ mét sè rÊt lín çc vi sinh vËt ®· biÕt lu«n lu«n cã thÓ t×m ®−îc nh÷ng vi

sinh vËt cã phøc hÖ enzym thÝch hîp h¬n nhiÒu víi ®iÒu kiÖn cña s¶n xuÊt. Vi sinh vËt cã

thÓ ®ång ho¸ bÊt kú chÊt nµo trong thiªn nhiªn trong khi ®ã cã rÊt nhiÒu chÊt mµ ®éng vËt

vµ thùc vËt kh«ng thÓ ®ång ho¸ ®−îc. Tuy nhiªn muèn sö dông çc nguån chÊt v« cïng

phong phó ®ã th× tÕ bµo vi sinh vËt ph¶i chøa nh÷ng hÖ enzym cÇn thiÕt cho çc nhu cÇu

kü thuËt kh¸c nhau

- Thø ba, phytase cña vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh rÊt m¹nh (®Æc biÖt lµ phytase tõ nÊm mèc),

v−ît xa ho¹t tÝnh phytase tõ nguån ®éng vËt vµ thùc vËt.

- Thø t−, ho¹t tÝnh cña phytase vµ kh¶ n¨ng sinh tæng hîp phytase cña vi sinh vËt

cµng cao khi g©y nh÷ng biÕn chñng. §iÒu nµy cho phÐp ta cã thÓ thu ®−îc l−îng enzym

lín víi ho¹t tÝnh vµ ®é thuÇn khiÕt cao.

- Thø n¨m, vi sinh vËt sinh s¶n víi tèc ®é nhanh chãng, l¹i cã kÝch th−íc vµ khèi

l−îng nhá nh−ng l¹i cã tû lÖ enzym trong tÕ bµo t−¬ng ®èi lín nªn qu¸ tr×nh s¶n xuÊt chÕ

phÈm enzym kh¸ dÔ dµng, thao t¸c thuËn tiÖn, hiÖu suÊt thu håi cao. Trong mét thêi gian

ng¾n, víi mét quy m« nhá cã thÓ s¶n xuÊt mét l−îng lín chÕ phÈm enzym.

- Cuèi cïng, thøc ¨n ®Ó nu«i vi sinh vËt dÔ kiÕm, rÎ tiÒn nªn sÏ gi¶m chi phÝ trong

qu¸ tr×nh s¶n xuÊt, ®em l¹i hiÖu qu¶ kinh tÕ lín.

30

ChÝnh v× nh÷ng lý do trªn mµ viÖc ®Ò x−íng vµ hoµn chØnh ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt

phytase tõ vi sinh vËt cã mét ý nghÜa rÊt lín. HiÖn nay, trªn thÕ giíi ®· nghiªn cøu s¶n

xuÊt trªn quy m« c«ng nghiÖp phytase ë d¹ng ®¬n chÊt còng nh− chÕ phÈm kü thuËt víi

møc ®é tinh khiÕt kh¸c nhau, th−êng tõ nÊm mèc vµ vi khuÈn.

B¶ng 1: B¶ng tãm t¾t çc phytase thu ®−îc tõ mét sè nguån kh¸c nhau

Nguån gèc Tªn chñng VÞ trÝ

Aspergillus niger NRRL 3135 Ngo¹i bµo

Aspergillus flavus Ngo¹i bµo

Aspergillus terrus Ngo¹i bµo

Aspergillus carneus Ngo¹i bµo

Aspergillus oryzae Ngo¹i bµo

Aspergillus fumigatus Ngo¹i bµo

Mucor sp Ngo¹i bµo

Penicillum sp Ngo¹i bµo

Penicillium caseoicolum Ngo¹i bµo

NÊm mèc

Rhizopus oligosporus Ngo¹i bµo vµ néi bµo

Saccharomyces cerevisiae Ngo¹i bµo

Schwanniomyces castelii Ngo¹i bµo

Khyveromyces fragilis Ngo¹i bµo

Candida tropicalis Ngo¹i bµo

Torulopsis candida Ngo¹i bµo

NÊm men

Debaryomyces castelii Ngo¹i bµo

Bacillus subtilis Ngo¹i bµo

B. subtilis (natto) Ngo¹i bµo

B. amyloliquefaciens Ngo¹i bµo

Echerichia coli Bµo t−¬ng

Klebsiella aerogenes Néi bµo

K. terrigenes Néi bµo K. oxytoca Néi bµo Pseudomonas sp Ngo¹i bµo

Enterobacter sp Ngo¹i bµo

Vi khuÈn

Citrobacter freundii Néi bµo

31

MÇm ng« Néi bµo H¹t ®Ëu t−¬ng vµ çc ®Ëu kh¸c Néi bµo

Thùc VËt

Typha latifolia pootten Néi bµo C¬ ruét cña chuét Néi bµo §éng vËt

Gan chuét TÕ bµo chÊt

øng dông cña phytase

Nh− chóng ta ®· biÕt enzym lµ nh÷ng chÊt xóc t¸c sinh häc cã tÝnh ®Æc hiÖu cao ®èi

víi c¬ chÊt, do tÕ bµo sèng tæng hîp nªn, ®iÒu khiÓn vËn tèc vµ sù chuyÓn ho¸ cña hµng

ngh×n ph¶n øng x¶y ra trong sinh chÊt. Enzym rÊt cã Ých cho con ng−êi trong viÖc nghiªn

cøu vµ sö dông ®Ó gi¶i quyÕt çc vÊn ®Ò quan träng cña khoa häc, c«ng nghiÖp vµ nÒn

kinh tÕ quèc d©n. Trong kho¶ng 20 n¨m trë l¹i ®©y, enzym ®· ®−îc øng dông réng r·i

trong rÊt nhiÒu ngµnh kh¸c nhau nh− trong ho¸ häc, trong y häc, trong c«ng nghiÖp nhÑ vµ

®Æc biÖt trong c«ng nghiÖp thùc phÈm. Do ®ã ë nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi, viÖc s¶n xuÊt çc

chÕ phÈm enzym ®· trë thµnh mét ngµnh c«ng nghiÖp lín. NÒn c«ng nghiÖp s¶n xuÊt chÕ

phÈm enzym ®· cã nh÷ng b−íc tiÕn lín víi tiÕn ®é ph¸t triÓn kh¸ m¹nh mÏ. Cµng ngµy

cµng xuÊt hiÖn nhiÒu nhµ m¸y s¶n xuÊt çc lo¹i chÕ phÈm enzym kh¸c nhau. Enzym

phytase ®−îc t×m thÊy vµ ®· ®−îc chøng minh r»ng chóng cã thÓ ®em l¹i nh÷ng lîi Ých cùc

kú to lín cho nÒn n«ng nghiÖp nãi riªng vµ cho nÒn kinh tÕ nãi chung. ChÝnh v× vËy mµ

con ng−êi ®· kh«ng ngõng khai th¸c nguån lîi nµy vµ ®· ¸p dông phytase trong nhiÒu lÜnh

vùc kh¸c nhau.

øng dông trong n«ng nghiÖp

ViÖc sö dông chÕ phÈm enzym phytase bæ sung vµo thøc ¨n cho ch¨n nu«i ngµy

cµng ®−îc t¨ng c−êng, bëi v× qua çc nghiªn cøu ®· cho thÊy r»ng viÖc bæ sung chÕ phÈm

sinh häc nãi chung vµ chÕ phÈm enzym nãi riªng vµo thøc ¨n cho gia sóc, gia cÇm ®· ®−a

s¶n l−îng lªn rÊt cao víi gi¸ thµnh h¹. Nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ngµnh ch¨n nu«i n−íc ta ®· cã

nhiÒu tiÕn bé ®¸ng kÓ. Cïng víi viÖc nghiªn cøu lai t¹o gièng vµ hoµn thiÖn çc quy tr×nh

ch¨m sãc nu«i d−ìng th× kh©u chÕ biÕn thøc ¨n cho chóng còng lµ mét nh©n tè quyÕt ®Þnh

32

®Õn hiÖu qu¶ trong ch¨n nu«i. ChÝnh v× vËy, ng−êi ta ®· sö dông chÕ phÈm enzym ®Ó bæ

sung vµo thøc ¨n ch¨n nu«i nh»m t¨ng kh¶ n¨ng chuyÓn ho¸ thøc ¨n cña chóng.

RÊt nhiÒu nghiªn cøu ®· chøng minh vai trß t¸c ®éng cña phytase ®èi víi c¬ thÓ

®éng vËt, ®Æc biÖt lµ ®éng vËt cã d¹ dµy ®¬n ng¨n nh− gia cÇm, lîn vµ ç. N¨m 1992,

phytase b¾t ®Çu ®−îc th−¬ng m¹i ho¸ d−íi d¹ng chÕ phÈm ®Ó bæ sung vµo thøc ¨n cña

chóng. Tõ nh÷ng lîi Ých mµ phytase cã thÓ mang l¹i cho con ng−êi ®· khiÕn ngµy cµng cã

nhiÒu øng dông cña lo¹i enzym nµy trªn nhiÒu lÜnh vùc kh¸c nhau. Ng−êi ta ®· kh«ng

ngõng nghiªn cøu nh»m môc ®Ých n©ng cao tÝnh chÊt −u viÖt cña phytase ®Ó nh÷ng øng

dông cña chóng ®¹t hiÖu qu¶ h¬n.

ViÖc sö dông chÕ phÈm phytase ®Ó bæ sung vµo khÈu phÇn thøc ¨n cho vËt nu«i

kh«ng nh÷ng cho phÐp çc vËt nu«i ®ång ho¸ tèt thµnh phÇn phospho s½n cã trong thøc

¨n, t¨ng sù hÊp thu protein vµ çc nguyªn tè kho¸ng mµ cßn gi¶m ®−îc sù « nhiÔm m«i

tr−êng do h¹n chÕ ®−îc l−îng phosphat khã tiªu ®−îc th¶i ra theo ph©n cña ®éng vËt. HiÖu

qu¶ cña viÖc øng dông nµy ®· ®−îc kiÓm ®Þnh . T¹i Mü, ng−êi ta dù tÝnh r»ng nÕu phytase

®−îc sö dông trong thøc ¨n cho tÊt c¶ çc loµi ®éng vËt d¹ dµy ®¬n ng¨n th× sÏ gi¶i phãng

®−îc mét l−îng phospho t−¬ng øng víi gi¸ trÞ 168 triÖu USD vµ lo¹i trõ ®−îc 8,23x104 tÊn

phosphat th¶i ra m«i tr−êng hµng n¨m.

øng dông trong c«ng nghiÖp s¶n xuÊt giÊy

ViÖc nghiªn cøu sù chuyÓn ho¸ cña axit phytic rÊt quan träng trong c«ng nghiÖp

s¶n xuÊt giÊy. Mét lo¹i phytase chÞu nhiÖt ®· ®−îc t×m thÊy vµ ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn r»ng

chóng cã tiÒm n¨ng nh− mét t¸c nh©n sinh häc míi ®Ó lµm gi¶m l−îng axit phytic trong

s¶n xuÊt giÊy. Sù ph©n huû axit phytic nhê enzym cã ®iÓm lîi lµ kh«ng t¹o ra çc chÊt cã

kh¶ n¨ng g©y ung th− vµ çc s¶n phÈm trung gian cã tÝnh ®éc cao. Bëi vËy, viÖc sö dông

phytase trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt giÊy rÊt cã lîi cho m«i tr−êng vµ ®iÒu nµy sÏ gãp phÇn

cho sù ph¸t triÓn cña çc c«ng nghÖ s¹ch trong t−¬ng lai.

3.1.4. Tæng quan vÒ s¶n xuÊt pectinaza trªn thÞt qu¶ cµ phª.

Pectinaza lµ nhãm enzym xóc t¸c sù ph©n c¾t çc hîp chÊt pectin thµnh çc hîp

phÇn kh¸c nhau. Trong hÖ enzym pectinaza ph©n gi¶i pectin gåm nhiÒu nhãm enzym kh¸c

33

nhau, chóng cã khèi l−îng ph©n tö kh¶n 40,4 kDa. Cã nhiÒu çc ph©n lo¹i enzym

pectinaza : dùa vµo tÝnh ®Æc hiÖu cã thÓ ph©n ra enzym ph©n gi¶i pectin vµ ph©n gi¶i axit

pectinic vµ axit pectic. Dùa vµ c¬ chÕ t¸c dông mµ ng−êi ta chia enzym ra thµnh hai lo¹i:

enzym ph©n gi¶I çc liªn kÕt ë trong néi m¹ch vµ enzym ph©n gi¶ çc liªn kÕt á ®Çu m¹ch.

Dùa vµ pH tèi −u cã thÓ chia enzym thµnh enzym pH axit vµ pH kiÒm.

§Æc ®iÓm cÊu t¹o vµ tÝnh chÊt cña enzym pectinaza

Pectinesteraza: Tªn gäi hÖ thèng lµ pectinhydrolaza (m· sè EC3.1.1.11), víi träng

l−îng ph©n tö kh¶ng 41kDa.

Pectinesteraza lµ çc chÊt xóc t¸c thuû ph©n liªn kÕt este trong ph©n tö pectin hoÆc

axit pectinic, kÕt qu¶ l¹o thµnh lµ axit pectinic hoÆc axit pectic vµ r−îu metanol. Khi toµn

bé çc nhãm metoxyl ®Òu bÞ t¸c khái c¬ chÊt th× s¶n phÈm t¹o thµnh lµ metanol vµ axit

polygalaturonic. Sù thuû ph©n chØ xÈy ra ë liªn kÕt este kÒ liÒn víi nhãm -COOH tù do.

S¬ ®å t¸c dông cña pectinesteraza lªn hîp chÊt pectin

pectinesteraza thu ®−îc tõ çc nguån kh¸c nhau th× cã pH tèi −u kh¸c nhau.

Pectinesteraza cña sinh vËt cã pH tèi −u tõ 4,5-5,5 cßn cña chÕ phÈm ®· lo¹i bá enzym

polygalacturonaza cã pH tèi −u tõ 2,0-6,5. Tr¸I l¹i pH tèi −u cña polyesteraza tõ thùc vËt

th−îng ®¼ng cao h¬n lµ 5.0-8,0.

NhiÖt ®é tèi −u cña pectinesteraza tõ nÊm mèc lµ : 30-45oC vµ bÞ v« ho¹t khi ë

nhiÖt ®é 55-62oC, nhiÖt ®é tèi −u cña pectinesteraza tõ thùc vËt th−îng ®¼ng cao h¬n tõ

55-60oC.

Pectinesteraza th−êng ®−îc ho¹t ho¸ bëi çc ion Na, K, Ca vµ Mg. Tr¸i l¹i çc

cation ho¸ trÞ 3 vµ 4 nh− Pb(NO3), Al3(SO4), FeCl3 sÏ k×m h·m t¸c dông cña

pectinesteraza.

COOH COOCH3

34

Polygalacturonaza

Polygalacturonaza cã tªn hÖ thèng lµ poly-α 1,4 galacturonitglucanohydrolaza (m·

sè EC:3.2.1.15). Lµ çc enzym xóc t¸c sù thuû ph©n liªn kÕt 1-4 glucozit trong ph©n tö

pectin [28].

Polygalacturonaza Ýt gÆp trong c©y, Polygalacturonaza chñ yÕu cã ë çc vi sinh vËt,

®Æc biÖt ë nÊm mèc vµ vi khuÈn, th−êng cã träng l−îng ph©n tö kho¶ng 65kDa.

Polygalacturonaza lµ mét phøc hÖ enzym gåm nhiÒu cÊu tö vµ th−êng cã tÝnh ®Æc hiÖu ®èi

víi c¬ chÊt. Çc s¶n phÈm trung gian cña qu¸ tr×nh thuû ph©n pectin Polygalacturonaza

chñ yÕu bÒn v÷ng ë trong vïng pH tõ 4,0-6.0. NhiÖt ®é tèi −u cña ®a sè Polygalacturonaza

n»m trong kho¶n 40 –45oC. ë trong kho¶ng nhiÖt ®é ®ã chóng th−êng bÒn v÷ng, nh−ng sÏ

bÞ v« ho¹t khi nhiÖt ®é lµ 50 ®Õn kho¶ng 55-60oC.

Dùa vµo tÝnh ®Æc hiÖu vµ c¬ chÕ t¸c trªn c¬ chÊt H.Deuel vµ E. Stutz (1958) ®· chia

bèn kiÓu Polygalacturonaza.

Polygalacturonaza

Tªn gäi hÖ thèng polyα 1,4 galacturonic metylesteglucanohydrolaza. Polymetyl

galacturonaza lµ enzym t¸c song lªn axit polygalacturonic ®· ®−îc metoxy ho¸ (tøc

pectin). Çc enzym nµy ®−îc chia thµnh 2 nhãm nhá tuú theo vÞ trÝ liªn kÕt glucozit bÞ c¾t

®øt d−íi sù xóc t¸c cña enzym ë ®Çu m¹ch hay gi÷a m¹ch nh−:

Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I.

Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I cßn gäi lµ enzym polygalacturonaza

dÞch ho¸. §©y lµ enzym xóc t¸c sù thuû ph©n çc liªn kÕt α -1,4 glucozit néi m¹ch cña çc

ph©n tö axit polygalactrunic ®−îc este ho¸ ë møc ®é cao.

Ho¹t tÝnh cña enzym nµy bÞ gi¶m khi cã mÆt cña enzym pectinesteraza trong m«i

tr−êng. Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I rÊt phæ biÕn ë trong çc vi sinh vËt,

®Æc biÖt lµ ë nÊm mèc A. niger, Botrylis cinerea, A awamori.

COOH COOCH3 COOCH3

35

S¬ ®å t¸c dông cña Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I lîp chÊt pectin

+Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III.

Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III cßn lµ enzym polygalacturonaza

®−êng ho¸. §©y lµ enzym xóc t¸c sù thuû ph©n çc kiªn kÕt α 1,4- glucozit ë ®Çu m¹ch ®Ó

t¸ch dÇn dÇn tong gèc axit galacturonic ra khái ph©n tö pectin hay axit pectinic, b¾t ®µu tõ

®Çu kh«ng khö. Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III cã ¸I lôc víi gèc axit

galacturonic ®· metyl ho¸, nghÜa lµ ph©n c¾t çc liªn kÕt α1,4- ë ®Çu m¹ch n»m gi÷a 2 gèc

axit galacturonic cã nhãm –COOCH3.

S¬ ®å t¸c dông cña Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III lªn hîp chÊt pectin

Polygalacturonaza:

Lµ enzym t¸c dông chñ yÕu lªn çc axit pectic vµ axit pectinic. §èi víi nhãm

enzym nµy sù cã mÆt cña pectinesteraza cã t¸c dông thóc ®Èy sù xóc t¸c t¸c cña chóng.

Çc enzym nµy còng ®−îc chia thµnh 2 nhãm nhê trong vÞ trÝ liªn kÕt glucozit bÞ c¾t ®øt.

+ Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza II

Lµ enzym polygalacturonaza dÞch ho¸. Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza

II. Thuû ph©n liªn kÕt α1,4-glucozit ë gi÷a m¹ch cña çc ph©n tö axit pectic hay axit

pectinic, çc enzym nµy chØ t¸c dông khi cã mÆt nhãm –COOH tù do. VÞ trÝ ®øt m¹ch cña

c¬ chÊt ®−îc xö lý s¬ bé b»ng pectinesteraza. §a sè nÊm mèc vµ vi khuÈn lµ nh÷ng vi

sinh vËt tæng hîp ®−îc enzym nµy.

S¬ ®å t¸c dông cña Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza II lªn hîp chÊt pectin

Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza IV.

COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3

COOH COOH COOCH3 COOCH3

36

Enzym nµy xóc t¸c sù thuû ph©n çc liªn kÕt glucozit ë ®Çu m¹ch cña ph©n tö axit

pectic hoÆc axit pectinic. Enzym nµy cã ¸I lùu víi çc liªn kÕt glucâit ë ®Çu m¹ch gÇn víi

nhãm cacboxyl tù do.

S¬ ®å t¸c dông Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza IV lªn hîp chÊt pectin

Transeliminaza

Nhãm enzym Transeliminaza xóc t¸c ph©n c¾t phi thuû ph©n çc liªn kÕt α1,4-

glucozit cña çc hîp chÊt pectin, ®ång thêi t¹o ra nèi ®«i ë trong gèc axit galacturonic

gi÷a nguyªn tö cacbon thø 4 vµ thø 5 (4- dezoxy-5-xetogalacturonic). Khi ®øt liªn kÕt α-

1,4 bëi Transeliminaza th× hydro tõ nguyªn tö cacbon thø 5 cña gèc axit galacturonic nµy

®−îc chuyÓn ®Õn nguyªn tö cacbon thø 1 cña gèc axit galacturonic kh¸c. Ph¶i øng x¶y ra

dÔ dµng trong m«i tr−êng trung tÝnh hoÆc kiÒm yÕu.

Transeliminaza t¸c dông ®−îc trªn pectin còng nh− trªn axit pectic, enzym nµy cã

tÝnh ®Æc hiÖu cao. Dùa vµo c¬ chÕ t¸c dông vµ tÝnh ®Æc hiÖu ®ã ng−êi ph©n ra thµnh çc

Transeliminaza sau:

+ pectin- Transeliminaza: lµ nh÷ng enzym t¸c dông trªn ph©n tö pectin vµ axit

pectinic. Çc enzym nµy cã tªn hÖ thèng lµ poly-α 1,4 galacturonic metyleste

glucanoliaza. Çc enzym cã hai lo¹i:

Endo-pectintranseliminaza I

Exo- pectintranseliminaza III

Polyglacturonat- Transeliminaza: lµ nh÷ng enzym t¸c dông trªn axit pectinic vµ

axit pectic. Nh÷ng enzym nµy cã tªn hÖ thèng lµ poly-α 1,4 D-galacturonic-glucanoliaza.

Çc enzym nµy cã hai lo¹i:

Endo- polyglacturonat- Transeliminaza II

Exo- polyglacturonat- Transeliminaza IV

COOH COOCH COOCH3 COOH COOH COOCH3

37

Transeliminaza tõ nh÷ng nguån kh¸c nhau th× cã c¬ chÕ t¸c dông vµ çc thuéc tÝnh

kh¸c nhau. Transeliminaza tõ nÊm mèc ho¹t ®éng tèi −u ë pH=5,2. Tr¸i l¹i,

Transeliminaza tõ vi khuÈn ho¹t ®éng tèi −u ë pH tõ 7,0-8,5.

Nguån nguyªn liÖu ®Ó thu nhËn enzym pectinaza

Pectinaza cã thÓ ®−îc sinh tæng hîp tõ nÊm mèc, vi khuÈn vµ nÊm men. PhÇn lín

çc chñng vi sinh vËt dïng ®Ó s¶n s¶n xuÊt enzym pectinaza ®Òu lµ vi sinh vËt hiÕu khÝ.

Tuy nhiªn ng−êi ta còng ®· t×m ®−îc nh÷ng vi sinh vËt vèn lµ yÕm khÝ b¾t buéc nh−ung

l¹i cã kh¶n n¨ng sinh tæng hîp enzym pectinaza.

Trong sè çc vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng tæng hîp enzym pectinaza th× nÊm mèc cã kh¶

n¨ng sinh tæng hîp cao nhÊt. Çc chñng Aspergillus, ®Æc biÖt lµ Aspergillus niger, A.

awamori ®· ®−îc øng dông nhiÒu trong s¶n xuÊt. Pectinaza cã thÓ thu nhËn ®−îc tõ nÊm

mèc b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy bÒ mÆt hoÆc nu«i cÊy ch×m sôc khÝ. Tuy nhiªn dï nu«i

cÊy trªn m«i tr−êng láng hay ®Æc th× ngoµi çc thµnh phÇn dinh d−ìng chñ yÕu nh−

cacbon, nit¬, phospho... th× chÊt c¶m øng pectin lµ mét thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong

m«i tr−êng ®Ó nÊm mèc tæng hîp ®Þnh h−íng pectinaza víi sè l−îng vµ ho¹t ®é lín.

Theo t¸c gi¶ Antier P vµ céng sù ®¨ng trªn t¹p chÝ Biotechnol Adv. 1993;11(3):

429-40 chóng ta cã thÓ sö dông nguån nguyªn liÖu cã ®é Èm thÊp nh− thÞt qu¶ cµ phª ®Ó

lªn men s¶n xuÊt pectinaza trªn hÖ thèng lªn men r¾n nh−ng ph¶i c¶i thiÖn chñng A. niger

thÝch øng víi m«i tr−êng lªn men ®Ó cho ho¹t lùc cao. TÇm quan träng ®Æc biÖt lµ dùa trªn

viÖc sö dông 2 hîp chÊt kh¸ng trao ®æi chÊt: 2- deoxy-glucose (DG) vµ 2,4-dinitro-phenol

kÕt hîp víi ethylen glycol ®Ó tuyÓn chän chñng kháe chÞu ®−îc møc ®é xö lý bµo tö b»ng

tia UV. Çc d¹ng ®ét biÕn nh¹y c¶m víi DG l¹i lµm t¨ng hµm l−îng pectinasa. §©y lµ mét

nh©n tè quan träng cã ý nghÜa trong viÖc tuyÓn chän chñng phï hîp víi hÖ thång lªn men

r¾n víi nguån nguyªn liÖu cã ®é Èm thÊp nh− thÞt qu¶ cµ phª.

TÝnh chÊt cña pectinaza tõ Aspergillus niger

Pectinaza ®−îc s¶n xuÊt tõ nÊm mèc Apergillus niger lµ mét chÕ phÈm enzym

th−¬ng m¹i. DÞch enzym th« sau khi t¸ch chiÕt b»ng kÕt tña (NH4)SO4 vµ tinh chÕ b»ng

ph−¬ng ph¸p s¾c ký cét sÏ thu ®−îc enzym ®ång nhÊt. ChÕ phÈm enzm nµy ho¹t ®éng ë

38

pH tèi −u lµ 5.0, nhiÖt ®é tèi thÝch lµ 36oC, æn ®Þnh d−íi 35oC, KÕt qu¶ ph©n tÝch tr×nh tù

axit amin cho thÊy cã 19 lo¹i axit amin trong ph©n tö enzym endo- polygalacturonaza.

Träng l−îng ph©n tö cña enzym nµy kho¶ng 40,4 kDa. §©y lµ enzym dÞch ho¸, xóc t¸c sù

thuû ph©n çc liªn kÕt α1,4- glucozit néi m¹ch cña çc ph©n tö axit polygalacturonic.

Theo t¸c gi¶ Diaz-Godinez G vµ céng sù ®¨ng trªn J Ind Microbiol Biotechnol.

2001 May;26(5):271-5 viÖc s¶n xuÊt exopectinaza b»ng chñng A. niger ®−îc so s¸nh trong

hai hÖ thång lªn men ch×m vµ r¾n. ViÖc thªm sacharoza vµo hÖ thèng lªn men ch×m th× l¹i

øc chÕ qu¸ tr×nh sinh tæng hîp pectinaza. Nh− vËy s¶n l−îng pectinaza lµ kh«ng ®¸ng kÓ

khi lªn men ch×m cã bæ sung sacharoza. Trong khi ®ã ë hÖ thèng lªn men r¾n víi ®é Èm

cao, s¶n l−îng exopectinasa ®¹t ë møc ®é cao khi sö dông sacharoza ®iÒu nµy t−¬ng

®−¬ng víi viÖc t¹o ra nhiÒu sinh khèi vµ kh«ng cã sù øc chÕ qu¸ tr×nh sinh tæng hîp

pectinaza.

øng dông cña enzym pectinaza

Trong hÇu hÕt çc chÕ phÈm pectinaza ®Òu gåm çc phøc hÖ enzym gièng nhau.

Çc chÕ phÈm nµy chØ kh¸c nhau ë møc ®é ho¹t ®éng tû lÖ çc enzym. ChÝnh v× ®iÒu nµy

mµ ng−êi ta sÏ cã h−íng sö dông çc chÕ phÈm kh¸c nhau tuú theo môc ®Ých c«ng nghÖ vµ

tÝnh chÊt cña lo¹i pectin. Çc enzym cã mÆt trong chÕ phÈm pectinaza phô thuéc vai trß

cña chóng trong qu¸ tr×nh c«ng nghÖ mµ ®−îc chia thµnh çc nhãm:

- Enzym quyÕt ®Þnh hiÖu qu¶ t¸c dông cña chÕ phÈm.

- Enzym cã mÆt trong chÕ phÈm còng tèt nh−ng kh«ng b¾t buéc.

- Enzym kh«ng cÇn thiÕt nh−ng cã thÓ cho phÐp cã mÆt mét l−îng kh«ng ®¸ng kÓ

trong chÕ phÈm.

V× vËy ®èi víi mçi qu¸ tr×nh c«ng nghÖ cã thÓ sö dông çc nhãm enzym pectinaza

kh¸c nhau.

T¸c gi¶ Kashyap DR ®· cã bµi viÕt vÒ øng dông cña pectinaza trong lÜnh vùc

th−¬ng m¹i ®¨ng trªn t¹p chÝ Bioresour Technol. 2001 May;77 (3):215-27. T¸c gi¶ ®· chØ

39

ra nh÷ng øng dông cña enzym nµy trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn n−íc qu¶, dÖt sîi, s¶n xuÊt

giÊy, lªn men thÞt qu¶ cµ phª, chiÕt tinh dÇu vµ xö lý n−íc th¶i.

Theo c«ng bè míi ®©y trªn t¹p chÝ Bioresour Technol. 2004 Oct;95 (1):49-52 cña

t¸c gi¶ Bai ZH vµ céng sù ®É ®Ò cËp ®Õn mét øng dông rÊt míi cña enzym pectinaza. Sö

dông dÞch chiÕt cña enzym nµy trong xö lý n−íc th¶i vµ kh¸ng bÖnh ë thùc vËt cho c©y

khoai t©y non vµ d−a chuét. Cñ c¶i ®−êng ®−îc sö dông nh− nguån cacbon vµ n−íc th¶i tõ

viÖc s¶n xuÊt glutamate ®−îc sö dông lµm nguån N vµ H2O cho qu¸ tr×nh lªn men sinh

tæng hîp pectinaza b»ng chñng A. niger.

øng dông pectinaza trong c«ng nghÖ s¶n xuÊt çc chÕ phÈm tõ qu¶

Pectinaza th−êng ®−îc sö dông trong çc ngµnh c«ng nghiÖp thùc phÈm sau:

- S¶n xuÊt r−îu vang - S¶n xuÊt çc mÆt hµng tõ qu¶: n−íc qu¶ c« ®Æc, møt nhõ, møt ®«ng. - S¶n xuÊt n−íc qu¶ vµ ®å uèng kh«ng cån - S¶n xuÊt n−íc gi¶i kh¸t - S¶n xuÊt cµ phª vµ cµ phª hoµ tan

Trong s¶n xuÊt r−îu, viÖc dïng pectinaza kh«ng nh÷ng cho phÐp t¨ng hiÖu suÊt thu

håi n−íc qu¶, tèc ®é läc. Qu¸ tr×nh s¶n xuÊt rót ng¾n mµ r−îu thµnh phÈm cßn cã mïi

th¬m h¬n, trong vµ ¸nh h¬n [67].

Víi s¶n xuÊt n−íc qu¶ ng©m r−îu, nhê sö dông pectinaza mµ thêi gian l¾ng cã thÓ

gi¶m 10-12 ngµy, hiÖu suÊt t¨ng 10-15%, hao phÝ r−îu gi¶m tõ 7% xuèng 2,5%.

Ngoµi çc ngµnh nãi trªn, pectinaza cßn ®−îc dïng trong viÖc s¶n xuÊt çc gel

kh¸c nhau tõ qu¶, cµ phª ®Æc hoÆc pectin cã hµm l−îng metoxy thÊp.

øng dông pectinaza trong ch¨n nu«i.

KhÈu phÇn thøc ¨n cña ®éng vËt th−êng cã hµm l−îng pectin, xenluloza vµ

hemixenlulaza cao. Trong khi ®ã ®éng vËt l¹i chØ cã kh¶ n¨ng tæng hîp rÊt h¹n chÕ çc

enzym cacbonhydrolaza ph©n gi¶i ®−îc tinh bét vµ disaccarit. Trong dÞch tiªu ho¸ ®éng

vËt còng kh«ng cã hemixenlulaza ph©n gi¶i xilan, pectinaza ph©n gi¶i pectin, ligninaza

ph©n gi¶I lignin vµ çc hîp chÊt phøc t¹p kh¸c. §Ó gióp cho ®éng vËt sö dông triÖt ®Ó thøc

40

¨n, ng−êi ta thªm vµo khÈu phÇn cña chóng liÒu l−îng thÝch hîp çc chÕ phÈm enzym

nguån gèc vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh pectinaza cao cïng víi xenlulaza vµ hemixenlulaza.

øng dông pectinaza trong ngµnh c«ng nghiÖp b«ng sîi

Th«ng qua viÖc sö dông enzym lµm ¶nh h−ëng rÊt lín ®Õn qu¸ tr×nh c«ng nghiÖp

dÖt c¶ vÒ m«i tr−êng vµ chÊt l−îng s¶n phÈm. Tr−íc khi sîi ®−îc m¾c vµo khung ®Ó dÖt

thµnh v¶I nã sÏ ®−îc b«i mét líp t¸c nh©n lµm tr¬n ®Ó chèng x¬ x−íc trong qu¸ tr×nh dÖt.

Tr−íc ®©y, çc t¸c nh©n nµy (t¸c nh©n lµm tr¬n sîi) th−êng ®−îc sö dông lµ tinh bét bëi v×

nã cã kh¶ n¨ng t¹o ra líp mµng máng rÊt tèt mµ l¹i cã gi¸ thµnh rÎ. Tr−íc khi v¶i ®−îc

®em ®i nhuém th× viÖc lo¹i bá nh÷ng t¸c nh©n kh«ng ph¶i lµ xenluloza lµ viÖc b¾t buéc

ph¶i lµm. Tr−íc khi t×m ra amylaza, ng−êi ta chØ cã con ®−êng duy nhÊt ®Ó lo¹i bá çc

chÊt nµy lµ sö dông dung dÞch x«®a nãng. Xö lý ho¸ häc kh«ng cã hiÖu qu¶ cao trong viÖc

lo¹i bá tinh bét (chóng ¶nh h−ëng tíi sù b¾t mµu than ch×) vµ tÊt nhiªn kÕt qu¶ lµ ë mét sè

sîi v¶i bÞ mÊt ®i tÝnh xèp tù nhiªn cña sîi v¶i. ViÖc sö dông pectinaza kÕt hîp víi

amylaza, xenlulaza hay çc enzym hemixenlulaza kh¸c sÏ lo¹i bá çc t¸c nh©n trªn mét

çch hiÖu qu¶ vµ lµm gi¶m ®¸ng kÓ viÖc sö dông chÊt ho¸ häc trong c«ng nghiÖp dÖt. KÕt

qu¶ lµ lµm gi¶m l−îng n−íc th¶i vµo m«i tr−êng, gi¶m c«ng lao ®éng vµ t¨ng chÊt l−îng

s¶n phÈm.

Trong sîi cotton cã çc thµnh phÇn kh«ng mong muèn nh− chÊt bÐo, s¸p, protein,

chÊt mµu tù nhiªn. Çc chÊt nµy lµm gi¶m m¹nh sù hÊp thô n−íc cña sîi lµm gi¶m ®«

tr¾ng cña sîi. Trong ®ã pectin ®ãng vai trß nh− mét lo¹i keo sinh häc, phÇn lín n−íc bao

quanh muèi cña pectin liªn kÕt víi s¸p, protein t¹o ra mét mµng ch¾n b¶o vÖ sîi cotton.

Mµng ch¾n nµy sÏ lµm cho sîi b¾t mµu ®ång bé nh−ng l¹i ph¶i dïng mét l−îng n−íc lín

®Ó röa, tèn n¨ng l−îng vµ çc chÊt th¶i ra, ®e do¹ m«i tr−êng sèng.

Do vËy trong nÒn kinh tÕ míi ng−êi ta rÊt quan t©m ®Õn gi¸ thµnh vµ lµm gi¶m t¸c

®éng ®Õn m«i tr−êng. Thuû ph©n b»ng enzym pectinaza ph©n c¾t çc chÊt b¸m vµo lµm

cho sîi ®−îc röa s¹ch b»ng n−íc mµ kh«ng lµm vì hÖ sîi xenlulo. Qu¸ tr×nh nµy gäi lµ

“con ®−êng sinh häc”. Con ®−êng sinh häc lµ mét con ®−êng míi dùa trªn lo¹i bá çc

chÊt bÈn b»ng çch sö dông çc enzym. VÝ dô nh− pectinaza c¾t çc liªn kÕt pectin,

proteaza ph©n c¾t protein. Mét sè chÊt mµu còng ®−îc gi¶i phãng ra trong qu¸ tr×nh nµy lµ

41

tèn Ýt n¨ng l−îng vµ Ýt g©y « nhiÔm m«i tr−êng. Enzym trªn kh«ng lµm ¶nh h−ëng ®Õn

søc bÒn cña sîi do hÖ sîi kh«ng bÞ ph¸ vì. Pectinaza sö dông trong con ®−êng sinh häc

dùa trªn sù lùa chän vÒ pH, nhiÖt ®é, nhu cÇu n¨ng l−îng vµ thêi gian xö lý.

øng dông trong lªn men chÌ vµ cµ phª

Sö dông enzym pectinaza trong qu¸ tr×nh chÕ biÕn chÌ sÏ lµm t¨ng tèc ®é lªn men

cña chÌ vµ pectinaza còng lµm ph¸ bät trong bét chÌ v× nã cã kh¶ n¨ng ph©n huû pectin.

Trong s¶n xuÊt cµ phª, ng−êi ta dïng pectinaza ®Ó t¸ch líp keo trªn bÒ mÆt cña h¹t

cµphª. Tr−íc ®©y ng−êi ta dïng ngay vi sinh vËt ®Ó lµm c«ng viÖc nµy, nh−ng th−êng qu¸

tr×nh x¶y ra kh«ng ®ång ®Ò vµ khã kiÓm tra. HiÖn nay ng−êi ta th−êng dïng çc chÕ phÈm

pectinaza ®Ó c¶i thiÖn chÊt l−îng cµ phª.

Mét sè ®Æc ®iÓm cña nÊm mèc Aspergillus niger

Apergillus niger ®−îc cho lµ loµi vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp pectinaza

tèt. Apergillus niger lµ nÊm mèc cã d¹ng b×nh t−íi hoÆc hoa cóc, cã çc tÕ bµo ch©n, cã

phÇn cuèi phång lªn thµnh mét bäng, trªn bäng mäc çc thÓ b×nh. Trªn thÓ b×nh lµ çc

chuèi bµo tö. Tuy nhiªn, çc loµi kh¸c nhau thuéc chi nµy còng cã nh÷ng ®Æc ®iÓm kh¸c

nhau. Loµi Apergillus niger cã nh÷ng ®Æc ®iÓm riªng biÖt sau:

Apergillus niger ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng Czapek, khi quan s¸t b»ng m¾t th−êng

cã mµu ®en nh¸nh. Chóng ph¸t triÓn chËm h¬n mét sè loµi kh¸c cïng chi trªn m«i tr−êng

nµy. §−êng kÝnh ®¹t ®−îc sau 10-14 ngµy nu«i cÊy ë nhiÖt ®é phßng (24-260 C) lµ 2,5-3

cm, sîi nÊm mäc rÊt khÝt.

Cuèng nang th¼ng ®øng, dµi 1,5-3mm, ®−êng kÝnh 15-20µm.

Bäng cã h×nh gÇn nh− h×nh cÇu, ®−êng kÝnh 45-75µm.

Chóng cã hai hµng thÓ b×nh. ThÓ b×nh cã hai lo¹i tuú thuéc vµo loµi vµ ®é tuæi cña

mò bµo tö.

Bµo tö tr−ëng thµnh cã h×nh cÇu, ®−êng kÝnh 4-5µm, xï x×, kh«ng ®Òu nhau, cã gai

nhá, kh«ng s¾p xÕp ®Òu ®Æn. Mò bµo tö ph¸t t¸n cã ®−êng kÝnh 700-800µm.

S¶n xuÊt pectinaza tõ thÞt qu¶ cµ phª.

42

Theo Ulloa S [ Biological treatment of coffee pulp, Doctor thesis, 2002 ] thÞt qu¶ cµ

phª chøa 6 % pectin, ®©y lµ nguån c¬ chÊt to lín cho s¶n xuÊt pectinaza. Boccas, F.,

Rousos ®· nghiªn cøu s¶n xuÊt pectinaza tõ thÞt qu¶ cµ phª trªn hÖ thèng lªn men r¾n. [ J.

Food Sci. Techol. 31: 22-27 ][67].

ë n−íc ta tõ tr−íc ®©y ®· cã mét sè c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ pectinaza tõ vá b−ëi,

vá chanh. Tuy nhiªn ch−a cã nghiªn cøu nµo vÒ s¶n xuÊt pectinaza tõ thÞt qu¶ cµ phª.

3.1.5. Tæng quan vÒ mannanaza

Mannanase (EC 3.2.1.78) (hay cßn gäi lµ endo-β-1,4- mannanase; 1,4-β-D-

mannan-mannanohydrolase) xóc t¸c thuû ph©n liªn kÕt β-1,4-mannosit cña β-1,4-mannan,

glucomannan vµ galactomannan, chuyÓn çc polyme dÞ thÓ kh¸ phæ biÕn trong tù nhiªn

nµy thµnh çc mannooligosacharit (MOS) vµ mét l−îng nhá mannose.

Mannanase ®−îc øng dông trong nhiÒu ngµnh c«ng nghiÖp kh¸c nhau (giÊy, dÇu

khÝ, thùc phÈm, ch¨n nu«i vµ d−îc phÈm...). Trong ®ã øng dông endo-beta-1,4 -

mannanase trong s¶n xuÊt mannooligosaccharit (MOS) tõ çc phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp

nh− b· dõa hoÆc konjac ®ang lµ mét trong nh÷ng mèi quan t©m cña çc nhµ khoa häc

nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi. Çc mannooligosaccharit ®· ®−îc chøng minh lµ lo¹i prebiotic

tèt cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch sù ph¸t triÓn cña çc vi sinh vËt cã lîi trong hÖ tiªu ho¸. H¬n

h¼n çc prebiotic kh¸c, MOS cßn cã kh¶ n¨ng hÊp phô, øc chÕ trùc tiÕp çc vi sinh vËt

g©y bÖnh ®−êng ruét (Salmonella typhimurium vµ E. Coli), ®ång thêi cßn cã t¸c dông kÝch

thÝch hÖ miÔn dÞch cña c¬ thÓ.

Çc enzym ph©n c¾t mannan vµ c¬ chÕ t¸c dông cña mannanase

Ph©n hñy sinh häc mannan lµ sù kÕt hîp ho¹t ®éng cña nhiÒu lo¹i enzym trong ®ã

mannanase thùc hiÖn nhiÖm vô ph©n c¾t m¹ch chÝnh mannan thµnh çc mannobiose,

mannotriose vµ hçn hîp çc oligosaccarid. Çc s¶n phÈm nµy sau ®ã l¹i ®−îc ph©n c¾t bëi

β-D-mannosidase, β-D-glucosidase vµ acetylesterase.

β-mannosidase (β-D-mannosid mannohydrolase, EC 3.2.1.25) thñy ph©n mannan,

mannan dÞ thÓ vµ mannooligosaccarit gi¶i phãng β-D-mannose b¾t ®Çu tõ ®Çu kh«ng khö.

43

Mét vµi β-mannosidase thuû ph©n liªn kÕt D-Manp-1,4-β-D-Glup trong m¹ch

glucomannan. β-mannosidase cña Tremella fuciformis cã ho¹t lùc lín nhÊt ®èi víi

mannobiose vµ vËn tèc thuû ph©n mannooligosaccarid cña enzym nµy gi¶m khi chiÒu dµi

m¹ch c¬ chÊt t¨ng. β-mannosidase cña Aspergillus niger chØ xóc t¸c ph©n c¾t mannobiose

vµ mannotriose, kh«ng cã t¸c dông ®èi víi mannan. β-mannosidase cña Bacillus sp. cã

ho¹t lùc cao nhÊt khi xóc t¸c thuû ph©n mannotetraose.

β-glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, EC 3.2.1.21) ph©n c¾t liªn kÕt β-D-

glucozit cña cellobiose vµ cellooligosaccarit b¾t ®Çu tõ ®Çu kh«ng khö gi¶i phãng β-D-

glucose. Trong nhiÒu tr−êng hîp, oligosaccarit chøa mannose vµ glucose (s¶n phÈm thuû

ph©n b»ng β-mannanase) lµ c¬ chÊt tèt cña β-glucosidase.

α-galactosidase (α-D-galactosid galactohydrolase, EC 3.2.1.22) xóc t¸c thuû ph©n

liªn kÕt galactozit cã trong çc oligosaccarid chøa galactose còng nh− çc polysaccarid

phøc t¹p kh¸c: galactomannan hay galactoglucomannan. Kh¶ n¨ng thñy ph©n gi¶i phãng

galactose tõ oligosaccarid kh¸c nhau phô thuéc nguån gèc α-galactosidase. Khi chiÒu dµi

m¹ch polysaccarit t¨ng, kh¶ n¨ng thuû ph©n cña α-galactosidase tõ Penicillium

simplicissimum gi¶m trong khi α-galactosidase tõ A. niger t¨ng. α-galactosidase III cña A.

niger cã kh¶ n¨ng thuû ph©n t¸ch galactose tõ galactomannobiose vµ galactomannan trong

khi ®ã α-galactosidase I vµ II cña nÊm mèc nµy kh«ng cã kh¶ n¨ng thuû ph©n bÊt kú

galactomannan nµo.

Acetylesterase (acetylgalactoglucomannanesterase) thuû ph©n liªn kÕt ester gi¶i

phãng axit acetic tõ acetyl galactoglucomannan. Acetylesterase cña Trichoderma reesei

xóc t¸c thuû ph©n gi¶i phãng axit acetic tõ çc oligosaccarid ng¾n hoÆc tõ

galactoglucomannan nÕu nã ®−îc sö dông kÕt hîp víi β-mannanase. Acetylesterase sinh

tæng hîp bëi A. oryzae xóc t¸c thuû ph©n polysaccarid vµ ho¹t ®éng cña nã bÞ k×m h·m

bëi sù cã mÆt cña mannanase. TÝnh ®Æc hiÖu cña acetylesterase ®èi víi acetyl mannan cao

gÊp 10 lÇn ®èi víi acetyl xylan.

44

Mannanse (endo-β-mannanase; β-1,4-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78) ph©n

c¾t liªn kÕt β-1,4-mannosid trong m¹ch mannan thµnh mannobiose, mannotriose vµ hçn

hîp çc oligosaccarit [7]. C¬ chÕ t¸c dông cña mannanase ®−îc minh ho¹ trªn h×nh 2

H×nh 3: C¬ chÕ t¸c dông cña mannanase

CÊu t¹o mannanse

Mannanase cña vi khuÈn −a nhiÖt Thermotoga neapolitana 5068 lµ enzym mét cÊu

tö. Mannanase cña vi khuÈn Pseudomonas cellulose bao gåm 385 axit amin. CÊu tróc

kh«ng gian cña mannanase ®−îc chia thµnh 3 vïng : vïng A tõ prolin 44 ®Õn isoleucin

323, vïng B tõ Leucin 32 ®Õn Tryptophan 360 vµ vïng C tõ Threonin 392 ®Õn Threonin

419. Çc chuçi Arg 39-Lys 43, Arg 324 – Gly 331, Arg 361-Thr 391 vµ Leu 420-Lys 423

cã chøc n¨ng nèi çc vïng trªn víi nhau. Toµn bé ph©n tö mannanse cÊu t¹o bëi 8 chuçi

xo¾n α vµ 8 chuçi β (h×nh 7A).

H×nh 4 : CÊu tróc kh«ng gian (A) vµ t©m ho¹t ®éng (B) cña mannanase 26A

Pseudomonas cellulose

A B

HO

OH

H

HO

HO

HH

H

O

HO OH

H

HO

HO

HHH

O

OO

H

H

HO

HO

HHH

O

HOO

H

H

HO

HO

HH

H

OH

O

HO

OH

H

HOH

O

OHH

H

OH

O

HO

OH

H

HOH

O

OHH

H

OH

Endo-beta-mannanase

45

Mannanse cña Tricoderma reesei bao gåm 344 axit amin t¹o thµnh 16 chuçi β vµ

14 chuçi α ng¾n víi 4 cÇu disulfit: Cys26 vµ Cys29 n»m trªn chuçi xo¾n α1, Cys172 vµ

Cys175 n»m däc theo cuén xo¾n β10-α7, Cys265 vµ Cys272 nèi α11 vµ cuén xo¾n α11-

β13, Cys 284 vµ Cys 334 nèi α12 vµ α13. T©m ho¹t ®éng cña mannanase tõ Tricoderma

reesei n»m trong mét hèc cña ph©n tö enzym vµ enzym cã Ýt nhÊt n¨m miÒn tiÕp xóc víi

c¬ chÊt, mçi miÒn sÏ g¾n víi mét ®¬n vÞ monomer cña chuçi polysaccaritd trong qu¸ tr×nh

xóc t¸c ph¶n øng. Glu169 vµ Glu 276 n¾m trªn r·nh däc theo bÒ mÆt enzym cã vai trß

quan träng trong qu¸ tr×nh xóc t¸c.

T©m ho¹t ®éng cña mannanase 26A Pseudomonas cellulose ®−îc h×nh thµnh tõ sù

kÕt hîp cña çc nhãm chøc cña çc axit amin n»m ë çc chuçi β lµ β4, β5, β7 vµ β8 ( h×nh

3B). §ã lµ Glu-212 vµ Glu-320 lÇn l−ît ë cuèi chuçi β4 vµ cuçi chuçi β7, His-211 vµ Arg-

208 trªn chuçi β4, Asp-283,Tyr- 285 trªn chuçi β5 vµ Trp-360 trªn chuçi β8. Çc axit amin

nµy liªn kÕt víi nhau theo liªn kÕt hydro. Glutamic 212 liªn kÕt víi aspartic 283 qua çc

nhãm caboxyl. Nhãm cacboxyl cña glutamic 320 liªn kÕt víi vßng imidazol cña histidine

211 bëi liªn kÕt hydro. Glutamic 320 liªn kÕt víi nhãm hydroxyl cña tyrosine 285, vµ

nhãm amin cña Arginine 208. Tryptophan 360 cïng liªn kÕt víi glutamic 320.

Çc tÝnh chÊt cña mannanse

Mannanase cã nguån gèc kh¸c nhau cã ®Æc tÝnh kh¸c nhau. §Æc tÝnh cña mét sè

loµi nÊm mèc ®−îc tãm l−îc trong b¶ng 1. Nh×n chung, mannanase cã pH tèi −u t¹i vïng

axit yÕu hoÆc trung tÝnh. NhiÖt ®é tèi −u kh¸ cao, ®é bÒn nhiÖt tèt.

Kh¶ n¨ng thuû ph©n cña mannanase lªn çc c¬ chÊt kh¸c nhau lµ kh¸c nhau, phô

thuéc thµnh phÇn galactose trong ph©n tö. Mannanase thuû ph©n tèt LBG, galactomannan

chØ chøa mét l−îng nhá galactose trong ph©n tö. Guargum, galactomannan cã tû lÖ

galactose cao h¬n bÞ thñy ph©n bëi mannanase víi vËn tèc chËm h¬n nhiÒu.

LBG lµ c¬ chÊt tèt nhÊt cho mannanase cña S. rolfsii, tiÕp ®Õn dõa (mannan) (58%

so víi LBG), guar gum (44%) vµ Konjac mannan (22%); trong khi ho¹t tÝnh thuû ph©n

α-mannan (nÊm men), xylan vµ CMC chØ xÊp xØ 1% so víi LBG. Møc ®é thñy ph©n cá

linh l¨ng (48% galactose), guargum (38% galactose), bét trøng ç ®èi (28% galactose) vµ

46

bét carob-bét gièng s« c« la (24% galactose) bëi mannanase tõ A. niger lÇn l−ît lµ 1, 5, 20

vµ 22% .

Nhãm bªn galactose cña galactomannan còng nh− nhãm acetyl lµm h¹n chÕ thuû

ph©n m¹ch chÝnh. Khi xö lý LBG vµ glucomannan konjac b»ng mannanase cña S. rolfsii,

gi¸ trÞ Km lÇn l−ît lµ 1,81 g/l vµ 0,3 g/l. Së dÜ nh− vËy lµ do m¹ch bªn galactose cña LBG

ng¨n c¶n sù kÕt hîp gi÷a LBG vµ mannanase, cã nghÜa lµ ¸i lùc cña LBG vµ mannanase

thÊp.

B¶ng 2. §Æc tÝnh cña mét sè mannanase Nguån pI Khèi

l−îng ph©n

tö (kDa)

pHopt

topt

(0C) C¬ chÊt S¶n phÈm thuû

ph©n

Aspergillus niger - 42 3,0; 3,8

- guar gum

M2,M3, MxGy

Aspergillus niger 3.7 0 3.5 - cïi dõa M2,M3 Aspergillus niger 3,5 - 3,0 0 Aspergillus tamarii IP 1017-10

- 3 4.5 - LBG M2,M3, GM2

Penecillium kloeckeri NRRL 1017

3,1-3,7 3,2-3,3

8-58 5-32

4.5-5.04,5-5,0

LBG M2,M3, MxGy M2,M3, MxGy

Penecillium purpurogenum 618

4,1 7 5,0 bét dõa (copra)

M, MxGy

Tricoderma reesei RUT C30

5,4 4,6

31 3,5-4,03,5-4,0

cïi dõa (ivory nut)

M2,M3 M2,M3

Çc enzym bÞ k×m h·m bëi ion kim lo¹i nÆng. Mannanase sinh tæng hîp bëi Vibrio

sp. chñng MA 138 bÞ k×m h·m bëi: Ag+, Hg2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Al3+, Fe3+, vµ N-

bromosuccinimid [10]. Mannanase nhuyÔn thÓ Littorina brevicula bÞ k×m h·m bëi Ag+,

Hg2+, Cu2+ vµ N-bromosuccinimid 1mM [116].

47

T−¬ng tù nh− xylanase vµ cellulase, mannanase còng bÞ k×m h·m bëi s¶n phÈm

chÝnh cña qu¸ tr×nh thuû ph©n. Ngay ë nång ®é 90 nM, mannotriose lµm gi¶m ho¹t lùc

mannanase 50%. Mannobiose còng kh¶ n¨ng k×m h·m ho¹t ®éng cña mannanase.

Nguån thu mannanase

Nguån thu mannanase rÊt phong phó. Mannanase cã thÓ t×m thÊy trong h¹t cña çc

thùc vËt trªn c¹n, trong t¶o biÓn, trong c¬ thÓ ®éng vËt kh«ng x−¬ng xèng. Tuy nhiªn, nguån thu

mannanase phong phó, dåi dµo vµ ®ang ®−îc quan t©m nghiªn cøu lµ tõ çc vi sinh vËt.

NhiÒu chung vi sinh vËt có kh¶ n¨ng sinh tæng hîp mannanase. NhiÒu c«ng tr×nh

nghiªn cøu cho cho kÕt luËn r»ng c¶ vi khuÈn, nÊm men, nÊm mèc ®Òu cã kh¶ n¨ng sinh

tæng hîp mannanase. Çc chñng vi khuÈn cã kh¶ n¨ng tæng hîp mannanase lµ :

Aeromonas, Bacillus, Cellulomannan, Enterococcus, Casseliflavus, Pseudomonas,

Streptomyces .. Çc chñng nÊm mèc gåm : Aspergillus niger, A. awamori, Fomes

cennosus, Penicillin, Sclerotium, Trichoderma. Chñng nÊm men : Talacromyces.

Tuú thuéc vµo lo¹i vi sinh vËt (nÊm men, nÊm mèc hay vi khuÈn), ®iÒu kiÖn nu«i

cÊy, thµnh phÇn m«i tr−êng mµ ho¹t lùc enzym thu ®−îc kh¸c nhau. Nh×n chung, vËn tèc

sinh tæng hîp mannanase cña vi khuÈn cao h¬n cña nÊm men vµ nÊm mèc nªn thêi gian

nu«i ng¾n. Tuy nhiªn, ho¹t lùc mannanase trong canh tr−êng nÊm mèc cao h¬n rÊt nhiÒu

so víi canh tr−êng vi khuÈn. Bacillus subtilis 168 sinh tæng hîp mannanase víi vËn tèc

4250 U/ml/giê vµ ®¹t ho¹t lùc lín nhÊt lµ 102 U/ml t¹i giê thø 24. Sclerotium rolfsii CBS

191.92 sinh tæng hîp mannanase víi vËn tèc 3740 U/ml/giê ®¹t ho¹t lùc cao nhÊt 786

U/ml.

Tuú thuéc vµo nhiÒu yÕu tè : thµnh phÇn m«i tr−êng nu«i cÊy, nhiÖt ®é, pH vµ

chñng vi sinh vËt mµ ho¹t ®é mannanase thu ®−îc lµ kh¸c nhau. Nh×n chung, vËn tèc sinh

tæng hîp mannanase tõ vi khuÈn cao h¬n tõ nÊm mèc (vËn tèc sinh tæng hîp mannanase

cña vi khuÈn Bacillus subtilis 168 vµ nÊm mèc Sclerotium rolfsii CBS 191 – 92 t−¬ng øng

lµ 4250 UI / ml vµ 3740 UI / ml.h). song ®a phÇn çc c«ng tr×nh nghiªn cøu ®Òu cho kÕt

qu¶ lµ ho¹t ®é cña mannanase thu ®−îc tõ nÊm mèc cao h¬n rÊt nhiÒu so víi ho¹t ®é cña

mannanase thu ®−îc tõ vi khuÈn ( 786 U / ml sau 8 ngµy nu«i cÊy nÊm mèc Sclerotium

48

rolfsii CBS 191 – 92 theo ph−¬ng ph¸p lªn men ch×m vµ 102 UI / ml sau 1 ngµy nu«i cÊy

vi khuÈn Bacillus subtilis 168). Víi nång ®é mannanase cao trong canh tr−êng nÊm mèc

sÏ t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi vµ gi¶m chi phÝ trong qu¸ tr×nh thu nhËn vµ lµm s¹ch enzym.

øng dông cña mannanse

Enzym thuû ph©n mannan ®−îc dïng trong c«ng nghiÖp thùc phÈm, c«ng nghiÖp

s¶n xuÊt thøc ¨n gia sóc, c«ng nghiÖp d−îc, c«ng nghiÖp s¶n xuÊt giÊy vµ bét giÊy, còng

nh− trong c«ng nghiÖp khai th¸c dÇu má vµ khÝ ®èt.

Trong c«ng nghiÖp d−îc

Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, oligosaccarid lµ mãi quan t©m rÊt lín cña c«ng nghiÖp

d−îc vµ c«ng nghiÖp thùc phÈm. Oligosaccarid ®Æc biÖt lµ oligosacharid dị thÓ nh−

monoologosacharid (MOS) ®ãng vai trß quan träng trong glycoprotein và glycolipid.

Chóng lµ thµnh phÇn cña mµng tÕ bµo t¹i ®ã chóng ®ãng vai trß lµ çc thô thÓ nhËn biÕt

çc vËt l¹ nh− virus, vi khuÈn., x©m nhËp vµo c¬ thÓ. Sö dông endomannanase tõ

Pellicilium purpurogenum ph©n gi¶i b· c¬m dõa ( phÇn cßn l¹i cña dõa sau khi Ðp t¸ch

chÊt bÐo ) ng−êi ta ®· thu nhËn çc galactosylmannooligosaccharit. Gi¸ trÞ sö dông cña

dõa t¨ng, « nhiÔm m«i tr−êng do phÕ phô phÈm cña viÖc Ðp dÇu dõa ®−îc gi¶m thiÓu.

Mannotriose ®−îc s¶n xuÊt hiÖu qu¶ b»ng çch sö dông çc enzym tõ Pellicilinum sau ®ã

®−îc t¸ch bá mannobiose vµ mannose th«ng qua qu¸ tr×nh lªn men bëi nÊm men. Çc nhµ

khoa häc kh¸c ®· thu ®−îc çc MOS kh¸c nhau (tõ 2-9 gèc ®−êng) bao gåm 63 - α - D

– galactosyl - β - D – mannotriose khi dïng mannanase A. niger thñy ph©n galactomannan

Ceratonia siliqua. Trong khi dïng mannanase tõ Tyromyces palustris xö lý

galactomannan cña gç mÒm thu ®−îc 62 - α - D – galactosyl - β - D – mannobiose, dïng

mannanase tõ S.rolfsii lai t¹o 61 - α - D – galactosyl - β - D – mannobiose khi thñy ph©n

galactomannan.

Trong c«ng nghiÖp thùc phÈm

Mannanase ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt cµ phª tan vµ n−íc qu¶ çc lo¹i. Trong qu¸

tr×nh s¶n xuÊt cµ phª tan, dÞch cµ phª ®−îc chiÕt tõ h¹t cµ phª bao gåm arabinogalactan,

49

mannan vµ cellulose chiÕm ®Õn 1/2 khèi l−îng chÊt kh« cña h¹t cµ phª trong ®ã mannan

chiÕm ®Õn 20 ÷ 30%. PhÇn lín mannan nµy cã mÆt trong dÞch chiÕt cµ phª. Do khèi l−îng

phan tö lín, mannan lµm dÞch chiÕt cµ phª rÊt nhít, g©y khã kh¨n vµ tèn n¨ng l−îng cho

qu¸ tr×nh läc vµ sÊy phun. ViÖc sö dông mannanase trong s¶n xuÊt cµ phª tan lµm gi¶m ®é

nhít cña dÞch chiÕt cµ phª tõ ®ã lµm gi¶m n¨ng l−îng tiªu tèn vµ h¹ gi¸ thµnh s¶n phÈm.

MÆt kh¸c, s¶n phÈm thñy ph©n mannan lµ çc lo¹i ®−êng vµ oligosaccarid lµm t¨ng vÞ tù

nhiªn cña s¶n phẩm cµ phª tan. Trªn thùc tÕ, mannanase tõ S.rolfsii ®· ®−îc sö dông ®Ó

thñy ph©n dÞch chiÕt cµ phª Arabica vµ Robusta, hai gièng cµ phª ®−îc trång phæ biÕn

hiÖn nay. §é nhít cña dÞch chiÕt gi¶m ®i mét nöa trong hai giê xö lý b»ng chÕ phÈm

enzym th«. Cïng víi sù gi¶m ®é nhít, hµm l−îng ®−êng khö t¨ng lªn [67].

Trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn çc lo¹i rau qu¶, mannanase cã tiÒm n¨ng øng dông rÊt

lín nh− pectinase. Mannan lµ thµnh phÇn chñ yÕu cña thµnh tÕ qu¶ do vËy nã th−êng lµm

gi¶m n¨ng xuÊt läc vµ lµm t¨ng hµm l−îng cÆn l¬ löng trong s¶n phÈm n−íc qu¶ trong.

ViÖc xö lý qu¶ b»ng mannanase trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt mét mÆt lµm t¨ng n¨ng suÊt läc,

®¶m b¶o ®é trong cña dÞch qu¶, mÆt kh¸c lµm t¨ng hiÖu suÊt thu håi qu¶

Mannanase ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt dÇu dõa tinh khiÕt lµm t¨ng hiÖu suÊt vµ

chÊt l−îng dÇu dõa.

Trong khai th¸c dÇu má vµ khÝ ®èt

Mét lo¹i dÞch cã ®é nhít cao th−êng ®−îc cÊp vµo ®Çu mòi khoan. DÞch nµy chøa

çc h¹t nhá cã nhiÖm vô lÊp ®Çy çc kÏ nøt xuÊt hiÖn do ¸p suÊt thñy tÜnh, gi÷ cho mòi

khoan kh«ng bÞ gÉy d−íi t¸c dông cña ¸p suÊt lín. Çc chÊt cã ®é nhít cao th−êng ®−îc

sö dông lµ galactomannan. §Ó dÇu vµ khÝ ®èt cã thÓ ra khái giÕng, ®é nhít nµy ph¶i ®−îc

lo¹i bá hoÆc lµm gi¶m b»ng çch oxy hãa hoÆc thuû ph©n b»ng enzym. DÞch cã ®é nhít

thÊp nµy sau ®ã ®−îc b¬m ra tr−íc khi qu¸ tr×nh dÉn dÇu vµ khÝ ®èt b¾t ®Çu. Mannanase

®−îc sö dông ®Ó lµm gi¶m ®é nhít cña dÞch nµy.

Trong xö lý m«i tr−êng vµ s¶n xuÊt thøc ¨n gia sóc

Çc phÕ phô phÈm cña c«ng nghiÖp s¶n xuÊt cµ phª, qu¶ cßn chøa rÊt nhiÒu

mannan lµ nguån gèc cacbon rÊt tèt cho s¶n xuÊt mannanase th−¬ng m¹i. ë Mehico, çc

50

nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu qu¸ tr×nh s¶n xuÊt mannanase tõ Tricoderma reesei IMI

192656 nh»m tËn dông, biÕn 600 tÊn phÕ th¶i cµ phª cña nøíc nµy thµnh mannanase [67].

Ngoµi viÖc tËn dông b· th¶i cµ phª, çc nhµ khoa häc t¹i ®¹i häc Autunoma De Querôtaro

s¶n xuÊt mannanase tõ Aspergillus oryzae trªn b· c¬m dõa. Çc chÕ phÈm mannanase nµy

®−îc sö dông trong s¶n xuÊt cµ phª tan vµ trong s¶n xuÊt thøc ¨n gia sóc.

Mannanase ®−îc sö dông ®Ó ph©n c¾t galactomannan cã trong thµnh phÇn thøc ¨n

gia sóc ®Æc biÖt nhiÒu trong çc c©y hä ®Ëu nh− ®Ëu t−¬ng, cá linh l¨ng, thÞt guar. ThÞt

guar lµ phÕ phô phÈm cña c«ng nghiÖp s¶n xuÊt guar gum, chøa nhiÒu axit amin cÇn thiÕt

cho sù ph¸t triÓn cña ®éng vËt. Tuy nhiªn, galactomannan cã trong thÞt qu¶ guar l¹i lµ t¸c

nh©n ph¶n dinh d−ìng: guar gum cã trong thøc ¨n tr−¬ng në lªn trong hÖ tiªu hãa cña

®éng vËt, lµm t¨ng ®é nhít cña khèi thøc ¨n trong hÖ tiªu ho¸, do ®ã lµm gi¶m kh¶ n¨ng

tiªu hãa vµ hÊp thô thøc ¨n. Theo nghiªn cøu cña çc nhµ ch¨n nu«i, chØ cÇn 2 –4%

galactomannan cã trong thøc ¨n lµm gi¶m sù t¨ng tr−ëng cña gµ vµ lµm gi¶m hiÖu qu¶ cña

viÖc sö dông thøc ¨n. ViÖc xö lý thÞt guar gum b»ng mannanase lo¹i bá t¸c dông ph¶n

dinh d−ìng cña galactomannan, gióp tËn dông nguån phÕ th¶i nµy cña c«ng nghiÖp s¶n

xuÊt guar gum thµnh nguån thøc ¨n cho gia sóc cã gi¸ trÞ .

Mannanase ®· ®−îc s¶n xuÊt thµnh chÕ phÈm th−¬ng m¹i nh»m bæ sung vµo phÕ

th¶i c«ng nghiÖp nh− vá ®Ëu t−¬ng, bét ®Ëu t−¬ng, b· c¬m dõa, thÞt qu¶ cä, thÞt qu¶ võng

vµ thÞt qu¶ c¶i dÇu lµm thøc ¨n gia sóc. VÝ dô chÕ phÈm cã tªn lµ Hemicell cña ChemGen

Corporation (Mü) ®−îc thªm vµo thøc ¨n gia sóc lµm t¨ng hiÖu qu¶ sù dông thøc ¨n, t¨ng

l−îng s÷a ®èi víi bß, gi¶m l−îng mì trong lîn, t¨ng sè l−îng vµ chÊt l−îng trøng gµ .

H·ng Enzym Development Corporation còng ®· ®−a ra thÞ tr−êng chÕ phÈm

ECONASE® MANNANSE cã ho¹t ®é mannanase cao ®−îc s¶n xuÊt tõ Tricoderma

longibrachiatum

3.1.6. Tæng quan vÒ bacteriocin

Khái niệm về bacteriocin

Từ lâu, vi khuẩn lactic được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa,

công nghiệp sản xuất axit lactic, trong việc chế biến rau quả và thức ăn gia súc. Vi khuẩn

lactic và vi khuẩn gây thối cùng phát triển. Sau một thời gian vi khuẩn lactic sẽ tích lũy

51

dần axit lactic và do đó làm ngăn cản sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây thối. Dựa vào

mối quan hệ đối kháng đó, các nhà khoa học tìm ra những phương pháp sinh học để bảo

quản thực phẩm. Họ đã nghiên cứu các loài vi khuẩn lactic sinh bacteriocin và coi

bacteriocin như một tác nhân bảo quản sinh học an toàn. Trong Patent US số 4.883,

9/2/1987 của Carlos Gonzales, người ta sử dụng một bacteriocin sản sinh từ Pediecoccus

acidilactici để ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây thối như: Listeria

monocytogenes….trong các thực phẩm như trứng, thịt, cá, sữa….

Bacteriocin có thể được sinh ra từ nhiều chủng vi khuẩn lactic khác nhau. Nhưng

Streptococcus là giồng cho bacteriocin có hoạt lực cao nhất.

Bacteriocin là do vi khuẩn lactic sinh ra có khả năng ức chế mạnh đối với các loại

vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong thực phẩm như E.Coli, Salmonella…

Theo Stephen, A. Morse, 1979, : Bacteriocin là một nhóm chất kháng khuẩn có

nguồn gốc từ vi sinh vật, mang tính đặc hiệu, do vi sinh vật sản sinh ra trong môi trường

và hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển.

Những kết quả nghiên cứu về bacteriocin đều cho thấy bacteriocin là một chất bảo

quản không độc hại. Năm 1969, tổ chức nông nghiệp và thực phẩm (FAO) và tổ chức y tế

thế giới (WTO) đã khuyến cáo sử dụng bacteriocin như một chất bảo quản thực phẩm tự

nhiên không độc hại.

Bản chất bacteriocin là những polipeptid có trọng lượng phân tử khác nhau.

Bacteriocin có đặc tính kháng sinh, nhưng khác với kháng sinh là bacteriocin có tính đặc

hiệu hơn và có tác dụng chọn lọc đối với một số loài hoặc khác loài nhưng có quan hệ

chặt chẽ với chúng.

Theo Vanglenbergh, A.P., 1993, bacteriocin là polipeptid có trọng lượng phân tử

rất nhỏ, có khả năng ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật có nguồn gốc phân loại gần giống

với chủng sinh tổng hợp bacteriocin, có hoạt tính đặc hiệu trong loài có liên quan đến các

loài vi khuẩn và sự hấp thụ vào chỗ nhận đặc hiệu trên vi khuẩn có tính nhạy cảm.

Cấu tạo của bacteriocin

Bacteriocin là một polipeptid mà protein này có trọng lượng phân tử rất khác nhau.

Nó có chứa các gốc khác như: cacbonhydrat, phosphat, lipopolysacharit…Bacteriocin là

52

một polypeptid trong môi trường chúng có cấu trúc ngoại bào. Chúng có thể liên kết một

bên với chất nhận của những vi sinh vật có thể nhận. Bacteriocin cũng có thể gắn kết chặt

chẽ với một bacteriophage khi kiểm tra.

Cấu trúc của bacteriocin

Bacteriocin là một polipeptid được sinh tổng hợp từ nhiều loại vi khuẩn khác nhau

do đó chúng có cấu trúc khác nhau. Các nhà khoa học đã tìm ra được cấu trúc phân tử

bacteriocin được sinh tổng hợp từ Lactococus lactic.

Các bacteriocin có cấu trúc khác nhau nhưng chúng chỉ khác nhau về sự sắp xếp

các axit amin.

Danh pháp của bacteriocin

Bacteriocin là một polipeptid do vi sinh vật tạo ra và có cấu trúc riêng cũng như

nguồn gốc rất khác nhau. Vì vậy, tại Hội nghị khoa học tại Gralia (Bỉ), các nhà khoa học

đã thống nhất phương pháp đặt tên sao cho tên của bacteriocin phải nói rõ nguồn gốc, bản

chất hoá học và hoạt chất của chúng. Nên bacteriocin được đặt tên cụ thể dựa theo loài vi

khuẩn sinh ra chúng.

Ví dụ: Bacteriocin của E.Coli mang thuật ngữ là Colicins

Bacteriocin của Lactobacillus plantarum mang thuật ngữ là Plantaricin

Ngoài ra, một chủng vi sinh vật có thể sinh ra nhiều bacteriocin như vi khuẩn

E.Coli có thể sản sinh ra 20 bacteriocin khác nhau mang tên là Colicins. Vì vậy

người ta phải phân loại từ Colicins A, Colicins B…….Sự phân loại này được bắt

đầu từ Hội nghị khoa học Gralia, người Bỉ báo cáo rằng chất lỏng từ một số chủng

E.Coli có thể kìm hãm sự phát triển của một số chủng cùng loài.

Cơ chế tác động của bacteriocin

Bacteriocin tác động vào các tế bào thuộc pha sinh trưởng lũy thừa. Khi vi sinh vật

trong nuôi cấy được tiếp xúc với thì chúng không thể hợp nhất được C14 leuxin vào

protein và H3 thymidin vào ADN. Do đó dẫn đến sự sinh tổng hợp ADN và phân tử

protein đều bị ngừng lại.

Thời gian cần thiết cho sự ức chế hoàn toàn C14 và H3 vào những chất đồng vị của

chúng, dựa vào nồng độ bacteriocin, dựa vào môi trường nuôi cấy.

53

Tính chất của bacteriocin

Bacteriocin có phạm vi ức chế giới hạn với vi khuẩn Gram dương, Gram âm và vi

khuẩn lactic. Bacteriocin có trọng lượng phân tử khoảng 16.500 Dalton và bị bất hoạt bởi

hỗn hợp với proteaza, papain hoặc α- chymotrypxin và không bị tác động bởi

phospholipaza, lysozym, D-Naza và R-Naza hay ở 1000C.

Bacteriocin là một polipeptid được sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn lactic,

chúng có phổ kháng khuẩn rộng. Trong mấy năm gần đây có hơn 50 loại polipeptid của

bacteriocin đã được tìm ra. Polypeptid của bacteriocin chứa 20-60 amino axit. Chúng có

tính cation và rất ưa nước. Peptid của bacteriocin sản sinh từ chủng vi khuẩn lactic có khả

năng ức chế ở nồng độ thường, nó gây tính thấm ở màng tế bào và làm thoát ra các chất ở

giữa tế bào.

3.1.7. Tæng quan vÒ øng dông c«ng nghÖ sinh häc ®Ó s¶n xuÊt thøc ¨n

ch¨n nu«i tõ thÞt qu¶ cµ phª

§Æc ®iÓm cña thÞt qu¶ cµ phª.

Cµ phª lµ lo¹i c©y c«ng nghiÖp ®−îc trång ë nhiÒu n¬i trªn thÕ giíi, nhÊt lµ çc

n−íc vïng nhiÖt ®íi. Sau khi thu ho¹ch h¹t cµ phª th× thÞt qu¶ cµ phª trë thµnh nguån phÕ

phô phÈm, chóng chiÕm 40% tæng khèi l−îng cña qu¶ cµ phª. §Ó xö lý nguån phÕ phô

phÈm nµy ®ßi hái rÊt nhiÒu yÕu tè nh− c«ng nghÖ, kinh tÕ vµ vÊn ®Ò m«i tr−êng

ThÞt qu¶ cµ phª t−¬i cã ®é Èm tõ 80-85%, ngoµi ra trong thµnh phÇn cña chóng cßn

cã saccaroza, protein, pectin vµ nhiÒu chÊt dinh d−ìng kh¸c. Theo Ulloa Rojas [67] c«ng

bè trong thÞt qu¶ cµ phª cã çc thµnh phÇn chñ yÕu sau: (%khèi l−îng)

N−íc: 76,5-85%; ChÊt bÐo: 1,2-4,9%; ChÊt x¬: 12,8-27,6%; ChÊt tro: 5,0-10,5%;

Pectin: 6,0-6,5%; Xenluloza: 16,5-32,2%; Lignin:12,2-20,5%; Hemixenluloza: 1,0-

11,6%; Cafein: 0,5-1,6%; Tanin: 0,64 %; Polyphenon: 1, 4 %.

§©y lµ ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho vi sinh vËt ph¸t triÓn, lµ nguyªn nh©n g©y thèi r÷a

thÞt qu¶ cµ phª. Trong khi ®ã ng−êi ta chØ tËp trung cho viÖc chÕ biÕn vµ b¶o qu¶n phÇn

h¹t. Ngµnh c«ng nghiÖp kh«ng thÓ ®¸p øng xö lý mét khèi l−îng r¸c th¶i qu¸ lín nµy.

ViÖc t¸ch n−íc ra khái thÞt qu¶ cµ phª rÊt khã thùc hiÖn v× chóng ®ßi hái nhiÒu n¨ng

l−îng, thiÕt bÞ m¸y mãc, ®Çu t− cho c¬ së h¹ tÇng vµ chiÕm diÖn tÝch kho b·i, trong khi

54

mïa vô cµ phª l¹i kÐo dµi tõ 3-5 th¸ng. Do ®ã tõ tr−íc ®Õn nay thÞt qu¶ cµ phª ng−êi ta

th−êng ®em bá ®i cho ®Õn khi môc hoÆc ph¬i kh« råi ®em ®èt. §iÒu nµy ®· lµm l·ng khÝ

nguån nguyªn liÖu cã s½n vµ « nhiÔm m«i tr−êng xung quanh .

ChÝnh v× vËy nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi nh− Brazil, Mexico, phaps, Costarica,

Venezuela v.v.. ®· nghiªn cøu çc gi¶i ph¸p ®Ó tËn dông nguån phÕ phô phÈm nµy lµm

thøc ¨n gia sóc. Perraud Gaime vµ S. Rousos [ Advaces in solid state Fermentation ] ®·

nghiªn cøu ñ chua thÞt qu¶ cµ phª b»ng vi khuÈn Lactobaclillus , Rousos S. Aquiahutl

[Appl.Microbiolol. Biotechnol. 42: 756- 762] ®· ph©n lËp vµ tuyÓn chän çc chñng nÊm

mèc cã kh¼ n¨ng khö cafein. Peraud- Gaime ®· nghiªn cøu hçn hîp çc chñng vi khuÈn

lactic vµ nÊm bÊt toµn trong b¶o qu¶n vµ khö ®éc tè thÞt qu¶ cµ phª [ These des Doctorat,

Universite de Montpellier II, France, 209 p.

3.1.8. Tæng quan vÒ nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men lactic ®Ó s¶n xuÊt thøc

¨n ch¨n nu«i tõ b∙ døa vµ phÕ phô phÈm thñy h¶i s¶n

Trong nh÷ng n¨m qua ngµnh ch¨n nu«i n−íc ta ph¸t triÓn t−¬ng ®èi nhanh, tèc ®é

t¨ng ®µn gia sóc, gia cÇm hµng n¨m lµ 4-4,5%. Trong ®ã ph¸t triÓn ch¨n nu«i bß s÷a ®ang

®−îc ®Æc biÖt quan t©m nh»m tõng b−íc ®¸p øng nhu cÇu vÒ s÷a cho ®êi sèng vµ h¹n chÕ

nhËp khÈu. Tæng ®µn tr©u bß cña c¶ n−íc cã h¬n 7 triÖu, trong ®ã ®µn bß s÷a cã 57000

con . ViÖc s¶n xuÊt, chÕ biÕn vµ t¹o nguån thøc ¨n cho bß s÷a nãi riªng vµ ®¹i gia sóc nãi

chung ®ang ®Æt ra cho ngµnh ch¨n nu«i tr−íc m¾t còng nh− l©u dµi. ThÕ nh−ng, do diÖn

tÝch b·i ch¨n th¶ vµ trång c©y thøc ¨n gia sóc ngµy cµng bÞ thu hÑp cho nªn viÖc sö dông

nguån phô phÈm n«ng nghiÖp lµm thøc ¨n cho gia sóc ®−îc coi lµ mét trong nh÷ng gi¶i

ph¸p tÝch cùc.

Hµng n¨m ë n−íc ta cã h¬n 35 triÖu tÊn phô phÈm n«ng nghiÖp bao gåm r¬m lóa,

c©y ng«, th©n l¸ l¹c, l¸ s¾n, ngän l¸ mÝa, ngän l¸ vµ b· døa... C©y døa ®−îc trång nhiÒu ë

n−íc ta chñ yÕu tËp trung ë çc vïng trung du vµ miÒn nói. DiÖn tÝch trång døa lµ 365396

ha (niªn gi¸m thèng kª 2003), s¶n l−îng kho¶ng 318196 tÊn qu¶ vµ hµng tr¨m ngµn tÊn

bóp ngän l¸ døa vµ b· Ðp qu¶ døa. §©y lµ nguån phô phÈm rÊt tèt cho tr©u bß nh−ng viÖc

thu ho¹ch døa l¹i cã tÝnh thêi vô nªn phÕ th¶i th−êng kh«ng ®−îc chÕ biÕn mµ th¶i ra m«i

55

tr−êng g©y « nhiÔm. C«ng nghiÖp chÕ biÕn qu¶ døa chØ thu ®−îc 25% chÝnh phÈm cßn

75% lµ phô phÈm phÕ th¶i, gia sóc chØ sö dông rÊt h¹n chÕ.

S¶n phÈm chÕ biÕn cña phô phÈm døa chñ yÕu ë d¹ng ñ chua chåi ngän vµ l¸ døa.

Thùc chÊt cña qu¸ tr×nh nµy lµ sù h×nh thµnh cña çc axit h÷u c¬: lactic, acetic, propionic

vµ butyric trong khèi thøc ¨n xanh ®em ñ ®· lµm gi¶m ®é pH cña m«i tr−êng (pH=3,8-

4,5). Sù cã mÆt cña çc chñng vi khuÈn cã s½n trong tù nhiªn hoÆc ®−îc bæ sung lµm cho

qu¸ tr×nh lªn men diÔn ra thuËn lîi nhê sù ph©n gi¶i cacbohydrat trong nguyªn liÖu, t¹o

thµnh axit lactic. Hµm l−îng axit h÷u c¬ t¨ng lµm øc chÕ nÊm nem, nÊm mèc vµ vi sinh

vËt g©y thèi ph¸t triÓn. Do ®ã thøc ¨n ®−îc b¶o qu¶n trong thêi gian dµi. ChÊt l−îng cña

thøc ¨n ñ chua cßn phô thuéc rÊt nhiÒu vµo çc thµnh phÇn ®−êng dÔ tan, chñng lo¹i vµ sè

l−îng vi sinh vËt, thµnh phÇn n−íc chøa trong nguyªn liÖu, ®é yÕm hiÕu khÝ trong qu¸

tr×nh ñ. C«ng tr×nh nghiªn cøu cña NguyÔn B¸ Mïi, Cï Xu©n DÇn (2000) ®· chøng minh

r»ng: chåi, ngän vµ l¸ døa ñ chua ®· lµm t¨ng tû lÖ tiªu ho¸ chÊt h÷u c¬, vËt chÊt

kh«,protein. Tû lÖ tiªu ho¸ cña vá vµ b· døa Ðp cao h¬n chåi vµ l¸ døa 6,6-7,2% , hµm

l−îng chÊt bÐo bay h¬i còng cao h¬n 11,8%.

Theo Madonald vµ céng sù (1995), chÊt l−îng thøc ¨n ñ chua kÐm khi pH m«i

tr−êng >5, hµm l−îng axit butyric cao, axit lactic thÊp (1,2-2,2%). Muller (1978) ®· sö

dông b· døa ñ chua thay thÕ 50% thøc ¨n th« xanh trong khÈu phÇn cña bß cho kÕt qu¶

t¨ng träng tèt, chi phÝ thøc ¨n gi¶m 7-12%. T¸c gi¶ Olubajo (1981) ®· tiÕn hµnh ñ chua

hçn hîp cá Ghine vµ b· døa ®· chøng tá thµnh phÇn b· døa tham gia trong l« ñ cµng t¨ng

tû lÖ pH cµng gi¶m(4,95-4,34) vµ tû lÖ tiªu ho¸ còng t¨ng theo. Tuy nhiªn çc t¸c gi¶ trªn

chØ tiÕn hµnh ñ chua cá xanh b· døa víi muèi mµ ch−a cã sù tham gia cña vi sinh vËt.

Ngµy nay víi sù ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ sinh häc, sù tham gia cña c«ng nghÖ vi sinh vËt

®· ®−îc øng dông nhiÒu trong chÕ biÕn thøc ¨n gia sóc. Çc c«ng tr×nh nghiªn cøu ®Òu

chøng tá lªn men vi sinh vËt ®Ó b¶o qu¶n çc lo¹i thøc ¨n, phÕ phô phÈm ®· lµm t¨ng gi¸

trÞ dinh d−ìng cña chóng, gia sóc tiªu ho¸ tèt h¬n. Rambalt M. (1980) ph©n lËp vµ nu«i

cÊy chñng Lactobacillus tõ s¾n ®Ó b¶o qu¶n s¾n t−¬i vµ ñ chua l¸ s¾n lµm gi¶m ®éc tè cã

trong l¸ s¾n vµ t¨ng mïi vÞ nguyªn liÖu ñ, gia sóc ¨n ®−îc nhiÒu, tiªu ho¸ tèt. Çc nhµ

nghiªn cøu thuéc tr−êng ®¹i häc UAM- Mehico vµ ViÖn nghiªn cøu vµ ph¸t triÓn Ph¸p

(ORS-TOM) ®· sö dông çc chñng vi nÊm kÕt hîp víi çc chñng nÊm men ®· lµm t¨ng

56

kh¶ n¨ng ®−êng ho¸ chÊt x¬ vµ sö dông tèt nguån nit¬ v« c¬ trong qu¸ tr×nh b¶o qu¶n çc

phô phÈm n«ng nghiÖp (b· chuèi, b· mÝa, b· døa, cñ c¶i ®−êng...)

Tãm l¹i viÖc chÕ biÕn vµ sö dông tèt h¬n çc nguån phô phÈm n«ng nghiÖp, phÕ

th¶i cña c«ng nghiÖp chÕ biÕn n«ng s¶n sÏ t¹o thªm khèi l−îng thøc ¨n gia sóc ®¸ng kÓ

phôc vô ch¨n nu«i ®¹i gia sóc. B»ng viÖc bæ sung men vi sinh vËt sÏ lµm t¨ng hiÖu qu¶ lªn

men, gi¸ thµnh h¹, cã lîi cho tiªu ho¸ gia sóc.

PhÇn II - VËt liÖu vµ Ph−¬ng ph¸p

1. VËt liÖu

1.1. Çc chñng vi sinh vËt chuÈn

Chñng Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum vµ

Brevibacterium flavum chuÈn cña Trung t©m gi÷ gièng Quèc gia, Céng hßa SÐc cung cÊp.

Çc vi sinh vËt kiÓm ®Þnh: Bacillus piritylies, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Klebsiella sp do b¶o tµng

Gièng chuÈn vi sinh vËt-Trung t©m C«ng nghÖ Sinh häc cung cÊp.

57

Çc vi khuÈn g©y bÖnh nh−: Salmonella, E.coli, Staphylococus aureus, Bacillus

cereus, Vibrio owaga, Vibrio inaba do ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ häc Trung −¬ng cung cÊp.

Çc chñng Lactobacillus plantarum ph©n lËp tõ d−a c¶i muèi t¹i mét sè chî ë Hµ néi.

Chñng E.Coli DH5α ®−îc sö dông lµm thÓ nhËn trong thÝ nghiÖm biÕn n¹p, chän

dßng vµ nh©n çc plasmid.

Chñng E.Coli BL21 DE3 Star ®−îc sö dông lµm vËt chñ cho biÓu hiÖn gen PLSA.

Chñng P. pastoris X33 lµ chñng nÊm men ®−îc sö dông ®Ó biÓu hiÖn gene phy A.

1.2 . Vector t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn Vector pCRTM 2.1 (h·ng Invitrogen) ®−îc sö dông ®Ó t¸ch dßng vµ nh©n dßng gen

Vector pET-TRX-FuS (pET-TRX Fusion Expression Vector System- H·ng

Invitrogen) ®−îc sö dông cho biÓu hiÖn gen

Vector pPICzα cña h·ng Invitrogen ®−îc sö dông cho biÓu hiÖn gen phyA trong

Pichia pastoris

1. 3. §èi t−îng nghiªn cøu

908 mÉu ®Êt tõ nguån ®Êt mµu mì vµ nghÌo dinh d−ìng thu thËp tõ çc tØnh miÒn

B¾c vµ miÒn Nam ViÖt Nam dïng lµm nguån vËt liÖu cho viÖc ph©n lËp chñng

Corynebacterium glutamicum vµ Corynebacterium acetoglutamicum cã ho¹t lùc L-

Lysine, L-methionin cao

300 mÉu ®Êt gÇn chuång gµ vµ ph©n gµ, chuång tr©u bß dïng lµm nguån vËt liÖu

cho viÖc ph©n lËp vµ tuyÓn chän çc chñng Aspergillus niger vµ Bacillus subtilis sinh

phytaza.

98 mÉu vá cam , chanh, b−ëi, vá thanh long dïng ®Ó lµm nguån vËt liÖu cho viÖc

ph©n lËp vµ tuyÓn chän çc chñng Aspergillus niger sinh pectinaza. TÊt c¶ çc mÉu trªn

®−îc thu thËp tõ çc ®Þa ®iÓm: Hµ Néi, Phó Thä, §µ L¹t, Thanh Ho¸, Vinh, Phó Yªn.....

ThÞt qu¶ cµ phª tõ §¾c l¾c dïng ®Ó lµm nguyªn liÖu cho lªn men sinh pectinaza vµ

lªn men lµm thøc ¨n gia sóc

Aspergillus niger 92 tõ bé s−u tËp cña Phßng Ho¸ sinh vµ Sinh häc ph©n tö , ViÖn

c«ng nghÖ sinh häc vµ c«ng nghÖ thùc phÈm, §¹i häc B¸ch khoa Hµ néi vµ çc chñng vi

sinh vËt ph©n lËp ®−îc tõ çc lo¹i qu¶ háng: xoµi, cam, chuèi, t¸o, quýt cho viÖc sµng läc

çc chñng sinh mannanaza

58

- B· døa cña nhµ m¸y chÕ biÕn døa Tam ®iÖp

- Ç kÐm chÊt l−îng

- PhÕ phô phÈm cña t«m cña Thanh hãa

- Çc chñng vi khuÈn lactic ®−îc ph©n lËp tõ çc mÉu n−íc d−a, cµ muèi, nem

chua, ®Ëu phô, bón...

- Çc mÉu thùc phÈm lªn men nh−: nem chua, s÷a chua, d−a muèi, s÷a t−¬i lÊy ë

çc chî Hµ néi

1 .4. Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ:

1.4.1. Ho¸ chÊt

Çc hãa chÊt chuÈn:

Phytaza chuÈn cña Sigma, USA Pectinaza chuÈn cña Sigma USA Mananaza chuÈn cña Sigma USA Lactate dehydrogenase cña Sigma USA NADH chuÈn cña Sigma 2- ketobutyratesodium salt cña Sigma L- lysine chuÈn, L- methionine chuÈn cña Merck, céng hßa liªn bang §øc Pectin , Merck, céng hßa liªn bang §øc Canxi - phytat, Sigma, USA Mµng thÈm tÝch ( Dialyis membranes ) cña Jurgens Scientific center

Çc hãa chÊt dïng cho ph©n lËp, ph©n lo¹i vi sinh vËt:

Agar (ViÖt Nam)- Axit lactic (ViÖt Nam), Axit citric - Axit axetic

CaCl2, CaCO3, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, Na2HPO4, I2, KI, MgSO4, K2HPO4, - FeSO4.7H2O

NH4NO3, Na2SO4, KCl, FeSO4,, H3BO3, MnSO4.7H2O (Trung Quèc). DÇu thùc vËt,

Sacaroza (ViÖt Nam), Pepton (Trung Quèc).

Çc ho¸ chÊt tinh khiÕt dïng ®Ó t¸ch chiÕt ADN tæng sè, ADN plasmid, ®iÖn di

ADN, cña çc h·ng Sigma, Merk: Tris-HCl (pH 8,8), EDTA, NaCl, β-mercaptoetanol,

59

SDS, kali axetat, natri axetat, ethanol 100%, phenol, clorofom: isoamylalcohol (24:1),

agaroza, NaOH, Ethidium Bromid (EtBr).

Çc ho¸ chÊt dïng cho kü thuËt PCR: 4 lo¹i dNTP vµ Taq-polymeraza cña h·ng

Parkin Elmer, enzym giíi h¹n EcoRI cña h·ng Bio-Labs Anh Quèc; primer.

1.4.2. ThiÕt bÞ

§Ò tµi ®· sö dông çc thiÕt bÞ sau cña phßng vi sinh vËt sau thu ho¹ch, ViÖn C¬

®iÖn n«ng nghiÖp vµ C«ng nghÖ sau thu ho¹ch:

M¸y quang phæ quÐt hai chïm tia Phoenic 200 PC, m¸y ®o pH Ohaus, USA m¸y li

t©m Heltic, Germany, M¸y ®«ng kh« Edwards, Anh quèc, ThiÕt bÞ nh©n ADN cña

BIORAD, USA; thiÕt bÞ ®iÖn di ADN, ®iÖn di protein cña Amersham pharma biotech vµ

nhiÒu thiÕt bÞ kh¸c liªn quan ®Õn ph©n lËp, ph©n lo¹i vi sinh vËt, c«ng nghÖ lªn men, c«ng

nghÖ enzym v.v..

M¸y gi¶i tr×nh tù gen vµ nh÷ng thiÕt bÞ cña phßng thÝ nghiÖm träng ®iÓm c«ng nghÖ

gen cña ViÖn c«ng nghÖ sinh häc, ViÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ ViÖt nam

Çc thiÕt bÞ ph©n tÝch cña Trung t©m kiÓm tra chÊt l−îng n«ng s¶n vµ tiªu chuÈn

hãa,ViÖn c¬ ®iÖn n«ng nghiÖp vµ c«ng nghÖ sau thu ho¹ch

HÖ thèng lªm men ch×m sôc khÝ qui m« 150l/ mÎ vµ 1500 l/ mÎ cña ViÖn c¬ ®iÖn

n«ng nghiÖp vµ c«ng nghÖ sau thu ho¹ch

Çc thiÕt bÞ liªn quan ®Õn c«ng nghÖ vi sinh, c«ng nghÖ hãa sinh cña ViÖn c«ng

nghÖ sinh häc vµ c«ng nghÖ thùc phÈm, Tr−êng ®¹i häc B¸ch khoa Hµ néi

Çc thiÕt bÞ liªn quan ®Õn c«ng nghÖ vi sinh cña phßng vi sinh, ViÖn di truyÒn n«ng

nghiÖp

Çc thiÕt bÞ liªn quan ®Õn c«ng nghÖ vi sinh cña phßng chÕ biÕn thøc ¨n ch¨n nu«i,

ViÖn ch¨n nu«i quèc gia.

1.5. Çc m«i tr−êng nghiªn cøu dïng trong ph©n lËp vµ tuyÓn chän çc vi

sinh vËt cã ho¹t tÝnh sinh häc tõ nguån thiªn nhiªn phôc vô cho ®Ò tµi, gåm:

1.5.1. M«i tr−êng ph©n lËp çc chñng vi khuÈn hä Corynebacterium

• M«i tr−êng chän läc D2

60

Th¹ch 15g, Glucoza 10g, LiCl 5g, §Ëu t−¬ng thuû ph©n 4g, N−íc chiÕt nÊm men

2g, Tris amino- methan. HCl 1,2 g, NH4Cl 1g, MgSO4 0,3g, Polymicin sulfat 10ml, NaN3

10 ml, pH 6,9, 1atm/ 45phót

• M«i tr−êng ph©n lËp chñng nÊm mèc A. niger

M«i tr−êng PDA (Potato-Dextroga- agar-agar) , g/l

N−íc chiÕt khoai t©y 1000 ml, Agar-agar 20 g, Glucoza 20g/l. ChØnh pH 5,5. thanh

trïng m«i tr−êng ë ¸p suÊt 1atm trong 30 phót.

M«i tr−êng tuyÓn chän chñng mèc A. niger sinh tæng hîp pectinaza

M«i tr−êng th¹ch - pectin (g/l)

Pectin 5g, Th¹ch 20g, N−íc 1000 ml. ChØnh pH 5,5, thanh trïng m«i tr−êng ë

1atm trong 45 phót.

M«i tr−êng gi÷ gièng A. niger

M«i tr−êng Czapek (g/l)

K2HPO4 1g, MgSO4.7H2O 0,5g, NaNO3 3g, KCl 0,5g, FeSO4.7H2O 0,01g,

saccaroza 30g, th¹ch 20g. ChØnh pH ®Õn 5,5 thanh trïng ë 1atm trong 30 phót.

• M«i tr−êng ph©n lËp çc chñng A. niger sinh phytaza

M«i tr−êng ph©n lËp Phy1:

N−íc chiÕt khoai t©y 1000 ml, Glucoza 20 g. Natri–phytat 3g/l, pH = 5 – 6; Khö

trïng ë 1at/30 phót

1.5. 2. Çc m«i tr−êng dïng trong lªn men sinh tæng hîp L- lysine, L-

methionin, phytaza, pectinaza, mananaza

• M«i tr−êng lªn men chñng Corynebacterium glutamicum sinh tæng hîp L-lyzin M«i tr−êng L1 (g/l): Glucose(30); NH4Cl(10); Ure(3); KH2PO4 (1);

MgSO4.7H2O(100 mg); FeSO4.7H2O(10 mg); MnSO4.4H2O(8 mg); ®Ëu t−¬ng thuû

ph©n(1); thiamin(0,1 mg); biotin(0,3 mg); pH= 7; M«i tr−êng hÊp 1 at trong 45 phót.

M«i tr−êng L2(g/l): Glucose(100); (NH4)2SO4(45) ; Ure(5); KH2PO4 (1);

MgSO4.7H2O(0,4); FeSO4.7H2O(10 mg); MnSO4.4H2O(100 mg); CaCO3(50);

adenine(100mg); sodium glutamate(100mg) thiamin(0,1 mg); biotin(0,5 mg); pH= 8; M«i

tr−êng hÊp 1 at trong 45 phót.

61

M«i tr−êng L3(g/l): rØ ®−êng( 130); NH4Cl(20); Ure(5); KH2PO4 (1);

MgSO4.7H2O(0,4); FeSO4.7H2O(10 mg); MnSO4.4H2O(8 mg); ®Ëu t−¬ng thuû ph©n (10);

thiamin(0,1 mg); biotin(0,3 mg); pH= 7; M«i tr−êng hÊp 1 at trong 45 phót.

M«i tr−êng L4(g/l): rØ ®−êng (80); NH4Cl(20); Ure(5); KH2PO4 (1);

MgSO4.7H2O(1); (NH4)2SO4(500); ®Ëu t−¬ng thuû ph©n (10); pH= 7; M«i tr−êng hÊp 1 at

trong 45 phót.

• M«i tr−êng lªn men L-methionin

M«i tr−êng nh©n gièng :

MgSO4.7H2O 0,1%, Gluco 10%, (NH4)2SO4 2%, K2HPO40,05%, KH2PO4 0,05%,

FeSO4.7H2O 0,001%, MnSO4.4H2O 0,001%, biotin 100mg/l, CaCO3 2%. pH =7,2.khö

trïng 1atm/40 phót

M«i tr−êng lªn men MT1:

Gluco 10%, K2HPO4 0,1%, MgSO4.7H2O 0,03%, Na2MoO4.2H2O 1mg/l,

MgSO4.7H2O 5mg/l, biotin 1mg/l, amonium nitrate 0,8%, pH=7. khö trïng 1atm/40 phót


RØ ®−êng 100g/l, cystein( 0,75g/l); (NH4)2SO4 5g/l; K2HPO4 4g/l; NaCl 1g/l,;

MgSO4.7H2O 0,2g/l; FeCl3.6H2O 10mg/l; (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,2mg/l; CuSO4.5H2O

0,1mg/l; Na2B4O7.10H2O 0,4mg/l; MnCl2.2H2O 2mg/l, pH 7,0 khö trïng 1atm/40 phót


RØ ®−êng 80g/l; cystein( 0,75g/l); K2HPO4 0,05%; KH2PO4 2%; (NH4)2SO4

0,025%; MgSO4.7H2O 0,001%; MnSO4.4H2O 0,001%; biotin 50µg/l; thiamin

hydrochloride 2mg/l; CaCO3 2%. pH =7,2.khö trïng 1atm/40 phót


Gluco 20g/l; cystein( 0,75 g/l); K2HPO4 0,05%; KH2PO4 2%; (NH4)2SO4 0,025%;

MgSO4.7H2O 0,001%; MnSO4.4H2O 0,001%; biotin 50µg/l; thiamin hydrochloride

2mg/l; CaCO3 2%. pH =7, khö trïng 1atm/40 phót.

• M«i tr−êng lªn men sinh tæng hîp pectinaza

M«i tr−êng nh©n gièng A. niger

62

M«i tr−êng PDA láng: (g/l)

N−íc chiÕt khoai t©y 1000 ml, Glucoza 20 g. ChØnh pH ®Õn 5,5 khö trïng m«i

tr−êng ë 1 atm trong 30 phót.

M«i tr−êng PC1: (%)

ThÞt qu¶ cµ phª 25%, Pectin 2%, Saccaroza 2%, NH4NO3 0,2%, KCl 0,05%,

Na2SO4 0,05%, K2HPO4 0,1%, FeSO4 0,002%, MgSO4.7H2O 0,5%


Çm g¹o 50%, ThÞt qu¶ cµ phª 50%, Glucoza 10g/l, Kho¸ng vi l−îng ( CaCl2

2,5g, CaCO3 5g, (NH4)2SO4 2,5g trong 100 ml n−íc): 1%, (NH4)3PO4 0,7%, N−íc chiÕt

khoai t©y 70%.

M«i tr−êng PC3:( %)

ThÞt qu¶ cµ phª 50%, n−íc chiÕt khoai t©y 45%, Glucoza 2%, K2HPO4 4%,

Na2HPO4 0,2%, FeSO4.7H2O 0,2%, CaCl2 0,02%, (NH4)2SO4 2%, MnSO4.7H2O 0,07%,

H3BO3 0,02%


Glucoza: 1,5%, ThÞt qu¶ cµ phª 50%, N−íc chiÕt khoai t©y 48,5%

M«i tr−êng Glucoza P1 (g/l):

glucoza 15g, Natri phytat 3g, NH4NO3 5g, MgSO4.7H2O 0,5g, KCl 0,5g,

FeSO4.7H2O 0,01g, MnSO4.4H2O 0,01g, Agar 15g, pH = 7 . Khö trïng ë ®iÒu kiÖn 1at /

30 phót. M«i tr−êng nµy dïng ®Ó gi÷ çc gièng vi khuÈn cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp

phytaza.

• M«i tr−êng lªn men sinh tæng hîp phytaza

M«i tr−êng pepton - phytat natri Phy1 (g/l):

Cao men 5g, Pepton 7,5g, N−íc thÞt 125ml, DÞch c¬ b¶n 1ml, K2PO4 5g, Glucoza

5g, Phytat natri 5g, CaCl2:0, 5g, PH = 7. Khö trïng: 1at trong 30 phót.

M«i tr−êng ®Ëu t−¬ng Phy2 (g/l)

§Ëu t−¬ng: 40g, glucoza: 15g, NaNO3 : 5g, MgSO4.7H2O: 0,5g, KCl: 0,5g, K2HPO4:

0,4g, FeSO4.7H2O: 0,1g, N−íc cÊt: 1lÝt, PH = 6,5 – 7. Khö trïng: 1at trong 30 phót.

M«i tr−êng çm lóa m× Phy3 (g/l)

63

Bét ng«: 40g, Glucoza: 15g, NaNO3: 5g, MgSO4.7H2O: 0,5g, KCl: 0,5g, K2HPO4:

0,4g, FeSO4.7H2O: 0,1g, N−íc cÊt: 1 lÝt, PH = 6.5 – 7. Khö trïng: 1at trong 30 phót.

M«i tr−êng bét ng« Phy4 (g/l)

Çm lóa m×: 40g, N−íc chiÕt thÞt: 5g, CaCl2: 2g, K2HPO4: 0,4g, KH2PO4: 0,5g;

NH4NO3: 0,4g, MgSO4.7H2O: 0,2g, N−íc cÊt: 1lÝt, PH = 6,5 – 7. Khö trïng: 1at trong 30 phót.

M«i tr−êng çm g¹o Phy5 (g/l):

Çm g¹o 40g, N−íc chiÕt thÞt 5g, CaCl2 2g, KH2PO4 0,5g, K2HPO4 0,4g, NH4NO3

0,4g, MgSO4.7H2O 0,2g, N−íc cÊt 1lÝt, pH = 6,5 Khö trïng: 1at trong 30 phót.

M«i tr−êng ®Ó t¸ch chiÕt ADN cña çc chñng nÊm mèc sinh phytaza

M«i tr−êng Czapek (g/l): NaNO3 3,0g; K2HPO4 1,0g; MgSO4 .7H2O 1,0g. KCl

0,5g; FeSO4.7H2O 0,2 g. Saccaroza 30,0 g

M«i tr−êng LB (g/l): Tripton 1g; NaCl 1g; Cao nÊm men 1g.

• M«i tr−êng lªn men thÞt qu¶ cµ phª

M«i tr−êng lªn men thÞt qu¶ cµ phª sö dông chñng Neurospora sitophila,

Aspergillus niger:

ThÞt qu¶ cµ phª 70%, çm g¹o 20%, n−íc chiÕt khoai t©y 10%, çc muèi kho¸ng

1% ( CaCl2 2,5g, CaCO3 5g, (NH4)2SO4 2,5g hßa tan trong 100ml n−íc ). pH = 5,5. Khö

trïng m«i tr−êng ë 1atm trong 45 phót.

• M«i tr−êng nu«i cÊy vµ biÕn n¹p ë E.Coli

M«i tr−êng LB (Lauria Betani) (g/l): Cao nÊm men(10), Trypton(10), NaCl(10),

pH 7,4 vµ khö trïng 1atm /30 phót. §èi víi m«i tr−êng th¹ch, cÇn bæ sung 2% agar.

• M«i tr−êng cho nu«i cÊy chñng Lactobacillus plantarum

M«i tr−êng MRS: (g/l)

Pepton 10g; Cao thÞt 10g ; Cao men 5g ; Glucoza 20g ; Tween 80: 1 ml: K2HPO4

2g ; MgSO4.7H2O 0,1g ; MnSO4.4H2O 0,06g ; Acetatnatri 5g; pH = 6,5 – 6,8

1.6. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp çc chñng vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh sinh häc cao

phôc vô cho ®Ò tµi

1.6.1. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp çc chñng Corynebacterium. Glutamicum, C.

acetoglutamicum sinh L- lysin

64

§èi víi çc mÉu ®Êt, c©n 1g ®Êt ®· ®−îc trén ®Òu cho vµo çc èng nghiÖm chøa

9ml m«i tr−êng D2, trén ®Òu mÉu b»ng thiÕt bÞ l¾c minishaker, ®Ó l¾ng ë ®iÒu kiÖn phßng

trong 30 - 60 phót. Hót 20µl dÞch trong ch¶i ®Òu trªn ®Üa th¹ch cã chøa m«i tr−êng chän

läc D2 cho môc ®Ých ph©n lËp C. glutamicum trang ®Òu b»ng que trang thuû tinh. Nu«i

cÊy ë 30 0C sau 36 - 48 giê lÊy ra quan s¸t d−íi kÝnh hiÓn vi vµ b¾t çc khuÈn l¹c ®iÓn

h×nh ®Æc tr−ng cho chñng C. glutamicum vµ C. acetoglutamicum vµo èng nghiÖm (theo

kho¸ ph©n lo¹i cña Bergey)[95] vµ thö ho¹t tÝnh catalaza, lªn men ®−êng glucoza, ph¶n

øng víi gelatin.

1.6.2. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh kh¼ n¨ng sinh tæng hîp L-lysine vµ L-methionine

tõ çc chñng vi khuÈn C. glutamicum vµ C. acetoglutamicum

LÊy mét vßng que cÊy cña mçi chñng vi khuÈn ®· ph©n lËp ®−îc cho vµo mçi èng

nghiÖm cã chøa 6 ml m«i tr−êng L4. TiÕn hµnh lªn men trªn m¸y l¾c 200 v/p, ë 30oC,

trong thêi gian 72 giê. . DÞch sau lªn men ®−îc pha lo·ng 10 lÇn, ly t©m ë tèc ®é 6000 v/

phót trong 10 phót ®Ó lo¹i x¸c tÕ bµo, thu dÞch næi. Hót 0,2 ml dÞch næi vµo èng Ependorf

bæ sung 0,8 ml etanol 100%, trén ®Òu b»ng m¸y vortex, kÕt tña protein b»ng çch ®Ó çc

èng Ependorf chøa mÉu vµo tñ l¹nh -25 0 C trong thêi gian trªn 1 giê. Ly t©m 12000v/15

phót, lo¹i bá cÆn, thu dÞch næi vµ lÊy mÉu nµy ®Ó ph©n tÝch L- lysin theo ph−¬ng ph¸p s¾c

ký giÊy cã so s¸nh víi L- lysin chuÈn.

1.6.3. Ph−¬ng ph¸p ph©n lo¹i çc chñng C. glutamicum vµ C. acetoglutamicum

TiÕn hµnh theo khãa ph©n lo¹i cña Bergey[95]

1.6.4. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp çc chñng Aspergillus niger sinh pectinaza

Xö lÝ mÉu:

§Ó çc mÉu lªn mèc vµ chuÈn bÞ çc èng nghiÖm v« trïng, mçi èng chøa 9 ml n−íc

cÊt khö trïng. Dïng panh c¾t mÉu thµnh miÕng nhá cho vµo mçi èng nghiÖm chøa n−íc

cÊt v« trïng. L¾c mÉu trªn m¸y vortex ®Ó mÉu hoµ tan. Thanh trïng mÉu dÞch trong nåi

çch thuû ë 800C trong 10 phót ®Ó diÖt nh÷ng nhiÔm t¹p kh«ng cã bµo tö. Sau ®ã ®Ó nguéi

råi ®em ph©n lËp.

Hót 200µl hçn dÞch cho vµo mçi ®Üa petri. §æ m«i tr−êng PDA ë nhiÖt ®é 35-400C

vµo ®Üa petri vµ l¾c ®Òu ®Üa cho hçn dÞch vµ m«i tr−êng hoµ ®Òu. §Ó ®«ng m«i tr−êng råi

tiÕn hµnh nu«i mÉu ë 300C trong tñ Êm, sau 72 giê lÊy ra quan s¸t. Sau thêi gian nu«i cÊy

65

tiÕn hµnh quan s¸t mèc trªn ®Üa petri. Chän nh÷ng khuÈn l¹c mäc riªng rÏ cÊy vµo çc èng

nghiÖm th¹ch nghiªng chøa m«i tr−êng PDA. Nu«i mÉu vµo tñ Êm ë 300C trong 48-72 giê,

sau ®ã tiÕn hµnh sµng läc chñng A. niger .

1.6.5. TuyÓn chän chñng cã kh¶ n¨ng sinh pectinaza cao

Ph−¬ng ph¸p sµng läc çc chñng nÊm mèc A. niger cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp

pectinaza ho¹t lùc cao

Nguyªn t¾c cña ph−¬ng ph¸p: Ho¹t tÝnh enzym pectinaza ®−îc ®¸nh gi¸ trªn c¬ së

møc ®é thuû ph©n pectin d−íc t¸c dông xóc t¸c cña enzym th«ng qua ®é lín cña vßng

ph©n gi¶i b»ng dung dÞch chØ thÞ lugol. Pectinaza lµ mét enzym c¶m øng nªn khi ta lªn

men çc chñng A .niger ph©n lËp ®−îc trong çc m«i tr−êng cã pectin th× sÏ sinh

pectinaza, khi ®ã ta sµng läc b»ng ph−¬ng ph¸p ®o vßng ph©n gi¶i.

Çch x¸c ®Þnh:

Çc chñng gièng sau khi ®· ph©n lËp ®−îc ®em lªn men trong m«i tr−êng cã pectin

trong çc èng nghiÖm. Thùc hiÖn lªn men trªn m¸y l¾c ë 300C trong 3 ngµy. M«i tr−êng

th¹ch pectin ®−îc ph©n phèi vµo çc hép petri, dïng khoan nót ®ôc lç trªn ®Üa th¹ch. Hót

100µl dÞch lªn men cho vµo lç th¹ch. ñ çc hép peptri nµy ë 370C, sau 24 giê lÊy ra nhá

dung dÞch chØ thÞ lugol trªn mÆt th¹ch. Sau ®ã x¸c ®Þnh ho¹t tÝnh enzym pectinaza b»ng

çch ®o vßng ph©n gi¶i pectin trªn m«i tr−êng.

Kh¶ n¨ng sinh tæng hîp enzym pectinaza cña çc chñng ®−îc ®¸nh gi¸ th«ng qua

®é lín cña vßng ph©n gi¶i pectin.

1.6.6. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp çc chñng A. niger sinh phytaza

1.6.6.1. Ph−¬ng ph¸p sµng läc çc chñng A. niger cã ho¹t tÝnh sinh phytaza

dùa vµo vßng ph©n gi¶i phytat - natri

Çc chñng Aspergillus niger ph©n lËp ®−îc lªn men trong m«i tr−êng dinh d−ìng

chuÈn pepton –phytat natri. Çc chñng A. niger ®−îc nu«i vµ gi÷ gièng trong èng nghiÖm

th¹ch nghiªng chøa m«i tr−êng PH 2 kho¶ng 48 giê. Lªn men l¾c 3 ngµy ë nhiÖt ®é 30°C.

Ngõng lªn men, dÞch lªn men ®−îc ly t©m víi tèc ®é 4500 vßng/phót trong 15 phót ®Ó lo¹i

66

bá cÆn vµ thu håi dÞch næi. DÞch nµy ®−îc dïng ®Ó ph©n tÝch ho¹t ®é phytaza tõ ®ã tuyÓn

chän ra chñng cã kh¶ n¨ng sinh phytaza tèt nhÊt dùa vµo ho¹t ®é enzym sinh ra tõ çc

chñng nu«i cÊy.

1.6.6.2. Ph−¬ng ph¸p ph©n lo¹i çc chñng Aspergillus phôc vô cho ®Ò tµi

TiÕn hµnh theo khãa ph©n lo¹i cña Rapper and Fenell.

1.6.7. Ph−¬ng ph©p ph©n lËp vi khuÈn lactic dïng trong c«ng nghÖ lªn men

b· døa vµ phÕ phô phÈm thñy h¶i s¶n

M«i tr−êng ph©n lËp: m«i tr−êng MRS cã thµnh phÇn nh− sau: pepton 10g; cao

thÞt 125ml; cao men 25 ml; tween 80 1ml; K2HPO4 2g; axetatnatri (CH3COONa) 5g;

MgSO4. 7H2O 0,1g; MnSO4 0,06g; glucose 20g; pH 6,5-6,8

Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp

Çc mÉu thùc phÈm ®−îc pha lo·ng dÇn tõ 10-3-10-6 nu«i cÊp trong m«i tr−êng

MRS, chän çc khuÈn l¹c cã çc vßng trong do axit sinh ra t¹o thµnh. T¸ch çc khuÈn l¹c

riªng ®Ó gi÷ gièng.

Ph−¬ng ph¸p tuyÓn chän

CÊy v¹ch, çc khuÈn l¹c ®−îc t¸ch ra vµ cÊy vµo m«i tr−êng MRS, ®Ó 370C trong

48 giê ®em quan s¸t, do kÝch th−íc cña vßng trong xung quanh v¹ch cÊy theo ph−¬ng

ph¸p Whittenhing.

Kh¶ n¨ng sinh axit ®−îc ®¸nh gi¸ dùa vµo vßng trong ( D-d, mm). Trong ®ã: D:

§−êng kÝnh vßng trong; d: §−êng kÝnh v¹ch vi khuÈn mäc.

Ph©n lo¹i: Theo khãa ph©n lo¹i Bergey[95].

Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng sinh axit

Kh¶ n¨ng sinh axit cña çc chñng vi khuÈn ®−îc x¸c ®Þnh b»ng ph−¬ng ph¸p chuÈn

®é Therner (0T). 0T ®−îc x¸c ®Þnh b»ng sè ml NaOH 0,1 ml cÇn ®Ó trung hßa hÕt l−îng

axit cã trong 100 ml dung dÞch cÇn x¸c ®Þnh.

Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng sinh kh¸ng sinh Bacteriocin cña çc chñng vi

khuÈn lactic

Ly t©m dÞch nu«i cÊy, lo¹i bá x¸c tÕ bµo, thu dÞch næi chøa bacteriocin, dïng

sunphat amon 65% ®Ó kÕt tña protein cã trong dÞch næi. Ly t©m lo¹i bá dÞch næi, thu kÕt

tña chøa bacteriocin Hßa tan kÕt tña chøa bacteriocin b»ng n−íc cÊt ®óng b»ng thÓ tÝch

67

cña dÞch lªn men ban ®Çu. Sau ®ã dïng dÞch kÕt tña nµy ®Ó thö ho¹t tÝnh diÖt khuÈn víi

çc vi khuÈn kiÓm ®Þnh lµ Salmonella, Shigella, E. coli.

Ph−¬ng ph¸p thö ho¹t tÝnh øc chÕ vi khuÈn g©y bÖnh cña bacteriocin ®−îc t¹o

bëi chñng vi khuÈn lactic

Hót 1 ml dÞch vi khuÈn E. coli cho vµo b×nh tam gi¸c cã chøa 350 ml m«i tr−êng

th¹ch th−êng ®· ®un tan vµ ®Ó nguéi ®Õn 450 C. Ph©n ra hép petri, dïng khoan nót ®ôc lç

trªn ®Üa th¹ch. Hót vµo mçi lç 600 µl dÞch ly t©m cã chøa dÞch bacteriocin, nu«i ë nhiÖt

®é 370 C. Sau 24 giê tiÕn hµnh ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh øc chÕ vi khuÈn E. coli cña bacteriocin.

Ho¹t tÝnh øc chÕ vi khuÈn E. coli cña bacteriocin ®−îc ®¸nh gi¸ gi¸n tiÕp b»ng ®−êng kÝnh

vßng øc chÕ khuÈn l¹c E. coli nu«i cÊy trªn m«i tr−êng th¹ch th−êng.

1.6.8. Çc ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh l−îng axit amin vµ enzym

dïng trong ®Ò tµi

1.6.8.1. Ph−¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh l−îng axit amin L-lyzin

Ph−¬ng ph¸p lªn men thö ho¹t lùc L - lysine cña çc chñng vi khuÈn ®· ph©n lËp Çc chñng vi khuÈn ®−îc tiÕn hµnh lªn men trªn èng nghiÖm çc m«i tr−êng L1,

L2, L3 cã thµnh phÇn nh− ®· miªu t¶ ë trªn. LÊy mét vßng que cÊy vi khuÈn cho vµo mçi

èng nghiÖm cã chøa 6 ml m«i tr−êng. TiÕn hµnh nu«i cÊy trªn m¸y l¾c 200 v/p, ë 30oC,

trong thêi gian 72 giê.

Sµng läc çc chñng sinh L-lyzin b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký giÊy TiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Lumir Macholan vµ céng sù .

Ph−¬ng ph¸p s¾c ký giÊy lµ ph−¬ng ph¸p cã ®é nh¹y cao trong viÖc ph¸t hiÖn ®Þnh

tÝnh çc axit amin. V× thÕ chóng t«i sö dông ph−¬ng ph¸p nµy trong viÖc sµng läc mét sè

l−îng lín çc chñng Corynebacterium glutamicum sinh L-lyzin. Ph−¬ng ph¸p ®−îc tiÕn

hµnh nh− sau:

ChuÈn bÞ dÞch axit amin lµm mÉu chÊm s¾c ký:

DÞch sau lªn men ®−îc pha lo·ng 10 lÇn, ly t©m ë tèc ®é 6000 v/ phót trong 10 phót

®Ó lo¹i x¸c tÕ bµo, thu dÞch næi. Hót 0,2 ml dÞch næi vµo èng Ependorf bæ sung 0,8 ml

etanol 100%, trén ®Òu b»ng m¸y vortex, kÕt tña protein b»ng çch ®Ó çc èng Ependorf

chøa mÉu vµo tñ l¹nh -25 0 C trong thêi gian trªn 1 giê. Ly t©m 12000v/15 phót, lo¹i bá

cÆn, thu dÞch næi vµ lÊy mÉu nµy ®Ó chÊm s¾c ký.

68

ChuÈn bÞ giÊy ch¹y s¾c ký: Sö dông giÊy s¾c ký Watman sè 4, c¾t thµnh thµnh

tõng b¶n cã kÝch th−íc 20x15cm . Ho¹t ho¸ giÊy ë 1200c trong 1,5 giê.

ChuÈn bÞ dung m«i: çc ho¸ chÊt sö dông cho s¾c ký ph¶i thËt tinh khiÕt, kh«ng

mµu hoÆc cã mµu nh¹t, ph¶i b·o hoµ n−íc. HÖ dung m«i ®−îc chuÈn bÞ nh− sau: n-

butanol: n−íc:axit acetic = 4:1:1.

Çch pha: cho n-butanol vµ n−íc vµo tr−íc, l¾c ®Òu, sau ®ã míi cho axit acetic vµo

l¾c ®Òu ®−îc dung m«i ®Ó ch¹y s¾c ký.

Kü thuËt s¾c ký: KÎ mét ®−êng th¼ng çch mÐp d−íi cña giÊy 2cm, trªn ®−êng

th¼ng ®ã chÊm çc mÉu. Mçi mÉu chÊm çch nhau 1,5cm. LÊy 10 µl dÞch næi cña mçi

mÉu chÊm lªn giÊy s¾c ký. ChÊm kÌm theo 3 µl dÞch chuÈn L-lyzin cã nång ®é 1µg/µl ®Ó

lµm ®èi chøng cho viÖc ®Þnh tÝnh L-lyzin cã trong dÞch mÉu. TiÕp theo chÊm phñ lªn mçi

mÉu vÕt chÊm 6µl metyl vµng da cam. Sau ®ã ®Æt b¶n máng vµo b« can cã chøa hÖ dung

m«i (n-Butanol: axit acetic: n−íc): (4:1:1). Khi dung m«i ch¹y ®Õn vÞ trÝ çch mÐp trªn

cña gi©y kho¶ng 2cm, nhÊc ra khái b« can vµ ®Ó kh« tù nhiªn. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký 3

lÇn, sau khi ch¹y xong lÇn 3, phun ®Òu lªn b¶n giÊy ch¹y s¾c ký dung dÞch nihidrin (NIH)

0,1%, ®Ó trong tñ hèt ë ®iÒu kiÖn phßng 10 phót. §Æt b¶n máng vµo tñ sÊy ë 900C/15 phót.

Sau ®ã tiÕn hµnh ®äc kÕt qu¶.

§Þnh l−îng L- lyzin b»ng ph−¬ng ph¸p quang phæ

TiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Vogel vµ Shimura [131]:

ChuÈn bÞ dÞch nghiªn cøu: DÞch lªn men sau khi ly t©m ë tèc ®é 5000 v/ p, trong

10 phót ®Ó lo¹i x¸c tÕ bµo. Hót 0,3 ml dÞch lªn men ®· ly t©m cho vµo èng nghiÖm s¹ch,

bæ sung 0,2 ml HCl 3N vµ 0,5 ml dung dÞch ninhdrin trong methoxyl ethanol. Hçn hîp

mÉu ë trªn ®−îc ®un s«i çch thuû ë 100oC trong 60 phót, sau ®ã lµm l¹nh tíi nhiÖt ®é

phßng, bæ sung 3 ml H3PO4 ®Ëm ®Æc, l¾c ®Òu.

Çch tiÕn hµnh: Lµm mÉu ®èi chøng, mÉu ®èi chøng cã ®Çy ®ñ çc thµnh phÇn nh− trªn

chØ thay dÞch lªn men b»ng n−íc cÊt. TiÕn hµnh ®o ®é hÊp phô mµu ë b−íc sãng 515nm. KÕt qu¶

®o ®é hÊp thô dùa vµo ®−êng cong chuÈn ®· x©y dùng víi L- lyzin chuÈn ë çc nång ®é kh¸c

nhau, tõ ®ã x¸c ®Þnh ®−îc hµm l−îng L-lyzin.

1.6.8.2. Ph−¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh l−îng L-methionin

69

§Þnh l−îng axit amin L-methionin theo ph−¬ng ph¸p cña J.David Rozzell vµ

Jr.Burbank ( United state patent N0 5 885 767 )

Ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng axit amin L- methionin bao gåm çc b−íc sau:

DÞch sau lªn men chøa L- methionin cho ph¶n øng víi thuèc thö methionin

gamma-lyase vµ mét cofactor cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh Schiff base víi L-methionin, sau

ph¶n øng t¹o thµnh 2- ketobutyrat. Theo ph¶n øng cho thÊy: mét mol L-methionin ph¶n

øng víi methionin gamma-lyase t¹o thµnh mét mol 2- ketobutyrat. TiÕn hµnh ®Þnh l−îng

2- ketobutyrat t¹o thµnh tõ ®ã ta sÏ ®Þnh l−îng ®−îc l−îng L-methionin trong dÞch sau lªn

men.

2- ketobutyrat ®−îc ®Þnh l−îng b»ng ph¶n øng oxyho¸ NADH thµnh NAD+ víi sù

cã mÆt cña enzym lactic dehydrogenase, x¸c ®Þnh l−îng NAD+ ®−îc t¹o thµnh b»ng

ph−¬ng ph¸p ®o sù gi¶m ®é hÊp phô ë b−íc sãng 340nm vµ mèi t−¬ng quan gi÷a sù thay

®æi ®é hÊp phô víi l−îng NADH ®· oxy ho¸ thµnh NAD+ theo luËt Beer vµ hÖ sè gi¶m

dÇn cña NADH.

Dung dÞch ®Þnh l−îng 2- ketobutyrat b»ng ph−¬ng ph¸p so mµu ®−îc chuÈn bÞ nh− sau:

§Öm K3PO4 100 mM, pH 8,0. NADH ( cña Sigma) trong n−íc khö ion 5mg/ml

Lactate dehydrogenase (Dung dÞch tinh thÓ tõ c¬ thá trong 3.2M (NH4)2SO4 chøa 9,6 mg

protein/ml, víi ho¹t lùc ®Æc hiÖu trong kho¶ng 800-1200 ®¬n vÞ/mg) cña Sigma

Dung dÞch muèi 2- ketobutyrat ( cña Sigma) trong n−íc khö ion 10mM.

Çch tiÕn hµnh: LÊy 0,97 ml ®Öm K3PO4 cho vµo 30 µl dung dÞch NADH vµ 5µl

dung dÞch lactate dehydrogenase, trén ®Òu, tiÕn hµnh ®o ®é hÊp phô ë b−íc sãng 340nm.

Bæ sung tõ 10 µl ®Õn 150 µl dung dÞch 2- ketobutyrat (®· biÕt nång ®é ë trªn vµo)

®Ó nång ®é cuèi cïng cña 2- ketobutyrat trong dung dÞch n»m trong kho¶ng tõ 0,01mM

®Õn 0,15 mM.

Sö dông hÖ sè ph©n tö gi¶m dÇn 6,200M-1cm-1 vµ çc èng cuvet cã thÓ tÝch 1ml,

réng 1cm. Tæng l−îng 2- ketobutyrat trong cuvet ®−îc tÝnh to¸n theo ®Þnh luËt Beer b»ng

ph−¬ng tr×nh sau:

Nång ®é mM 2- ketobutyrat = Sù thay ®æi ®é hÊp phô ë b−íc sãng 340nm : 6,2.

70

§é chÝnh x¸c cña ph−¬ng ph¸p ®−îc x¸c ®Þnh b»ng phÐp so s¸nh l−îng 2-

ketobutyrat tÝnh to¸n ®−îc b»ng ph−¬ng ph¸p quang phæ cña mÉu thÝ nghiÖm so víi l−îng

2- ketobutyrat ®· cho vµo . KÕt qu¶ ®−îc chØ ra ë b¶ng 1.

B¶ng 1: Nång ®é 2-Ketobut cho vµo vµ cña mÉu thÝ nghiÖm

Nång ®é 2-Ketobutyrate ®· ®−a vµo mÉu thÝ nghiÖm

Nång ®é 2-Ketobutyrate cña mÉu thÝ nghiÖm x¸c ®Þnh ®−îc b»ng ph−¬ng ph¸p

quang phæ 0,01mM 0,02mM 0,04mM 0,08 mM 0,12 mM 0,15 mM

0,01mM 0,02mM 0,04mM 0,077mM 0,115mM 0,155mM

1.6.8.3. Ph−¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh l−îng pectinaza

X¸c ®Þnh ho¹t ®é enzym pectinaza

TiÕn hµnh x¸c ®Þnh ho¹t ®é polygalacturonaza theo ph−¬ng ph¸p trong tµi liÖu ThÝ

nghiÖm ho¸ sinh (§Æng ThÞ Thu, NguyÔn ThÞ Xu©n S©m, T« Kim Anh) (H®Pg).

Ph−¬ng ph¸p nµy dùa trªn c¬ së tÝnh to¸n sè l−îng çc liªn kÕt bÞ thuû ph©n theo sù

gia t¨ng çc nhãm andehit trong mÉu ph¶n øng.

§¬n vÞ ho¹t ®é polygalacturonaza lµ l−îng enzym xóc t¸c thuû ph©n ®−îc 1 micro ®−¬ng

l−îng çc liªn kÕt glucozit trong ph©n tö axit pectic ë 300C trong thêi gian mét phót.

Ho¸ chÊt cÇn dïng

Dung dÞch pectic 1% pH 4,0. Läc qua hai líp v¶i mµn Dung dÞch enzym ph©n tÝch. Dung dÞch Na2CO3 1M (106 g/ lÝt n−íc) Dung dÞch iod 0,1N: Hoµ tan 25g KI trong b×nh 100ml víi l−îng n−íc tèi thiÓu vµ thªm 12,7g Iod. Hoµ

tan iod thªm n−íc ®Þnh møc, gi÷ l¹i trong b×nh tèi nót mµi.

Dung dÞch Na2S2O3 (hyposunfit) 0,05N:

Hoµ tan 12,5g Na2S2O3 trong b×nh ®Þnh møc 1000ml víi n−íc cÊt kh«ng cã CO2,

thªm n−íc cÊt ®Þnh møc (b¶o qu¶n trong b×nh thuû tinh mµu n©u cã èng xiph«ng vµ buret

víi èng clo-canxi n¹p ®Çy v«i)

71

(x¸c lËp nång ®é chuÈn Na2S2O3 b»ng kalibicromat)

Dung dÞch H2SO4 2M :

Pha 200g H2SO4 ®Ëm ®Æc b»ng n−íc cÊt tíi 1l.

Dung dÞch tinh bét tan 1% trong NaCl b·o hoµ (chÊt chØ thÞ mµu):

Cho 1g tinh bét tan vµo b×nh 100 ml + 25 ml dung dÞch muèi NaCl l¾c ®Òu, bæ xung 25

ml dung dÞch NaCl n÷a, nhóng b×nh vµo nåi çch thuû s«i, liªn tôc l¾c ®Òu cho tíi khi hoµ

tan hÕt tinh bét.

Lµm nguéi vµ thªm 10ml dung dÞch ®Öm (dung dÞch chÕ phÈm nÊm mèc ®Öm

acetat pH 4,5. Thªm dung dÞch NaCl tíi v¹ch ®Þnh møc l¾c trén ®Òu hçn hîp(dung dÞch

pha trong ngµy tiÕn hµnh x¸c ®Þnh).

Çch tiÕn hµnh

10ml pectic (300C) + 1-5 ml dung dÞch enzym, tæng thÓ tÝch b»ng 15 ml.

Sau 20 phót thªm vµ çc b×nh mçi b×nh 1,8ml dung dÞch Na2CO3 1M vµ 10ml dung

dÞch iod 0,1N l¾c cÈn thËn çc b×nh ®Ëy nót thuû tinh ®Ó 20 phót trong bãng tèi. Thªm

2ml H2SO4 2 M vµ ®Þnh ph©n l−îng iod d− b»ng dung dÞch Na2S2O3 0,05N víi sù cã mÆt

cña tinh bét tan.

èng kiÓm chøng: Thªm dung dÞch enzym vµo hçn hîp sau khi bæ sung Na2CO3 1M

vµo trùc tiÕp tr−íc khi bæ sung iod.

Khi ®ã ho¹t ®é polygalacturonaza ®−îc x¸c ®Þnh theo c«ng thøc sau

51,3: lµ sè micro ®−¬ng l−îng çc nhãm –CHO t−¬ng øng víi 1ml dung dÞch iod 0,1N.

e: lµ l−îng dung dÞch Iod 0,1N bÞ tiªu tèn cho sù oxi ho¸ nhãm – CHO ®−îc t¹o

thµnh do pectic bÞ thuû ph©n.

t: lµ thêi gian thuû ph©n

m : l−îng enzym ®em thuû ph©n

1.6.8.4. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ho¹t ®é phytaza

TiÕn hµnh x¸c ®Þnh ho¹t ®é phytaza theo ph−¬ng ph¸p cña F.C. Van der Heeft

HdPg= mt

e.

.3,51(U/ml)

72

Nguyên tắc:

Phương pháp dựa trên cơ sở sự thuỷ phân phytat natri (cơ chất phytaza) bằng dịch

chế phẩm phytaza rồi sau đó làm vô hoạt enzym và tạo phản ứng màu bằng hỗn hợp dung

dịch Ammonium heptamolybdate tetrahydate và Ammonium vanadate. Định lượng sản

phẩm -các gốc phosphat vô cơ - được tạo thành trong phản ứng thuỷ phân bằng phản ứng

tạo phức có màu vàng với thuốc thử là hỗn hợp dung dịch trên. Cường độ màu của phức

tạo thành được xác định bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng λ = 415nm. Sau đó

dựa vào đồ thị chuẩn của natri dihydrogenphosphat để tính lượng sản phẩm tương ứng do

enzym xúc tác tạo nên.

Hoạt độ phytaza (tạm ký hiệu là: HđF) của chế phẩm enzym đặc trưng cho khả

năng xúc tác phân giải hợp chất phytat (myo- inositol hexakis phosphate) thành các myo-

inositol phosphat phân tử thấp hơn và các gốc phosphat vô cơ. Hoạt độ phytaza được biểu

thị bằng số đơn vị hoạt độ trong 1ml (hay 1g ) chế phẩm.

∗ Định nghĩa đơn vị hoạt độ: Một đơn vị hoạt độ phytaza là lượng enzym xúc tác

phản ứng thuỷ phân để giải phóng ra 1 µmol phosphat vô cơ trong thời gian 1 phút từ

dung dịch phytat natri ở 370C, pH = 5,5 và trong các điều kiện của phương pháp này.

Hoá chất và dung dịch enzym:

Dung dịch đệm acetate (PH = 5,5):

Hoà tan: 18,1g CH3COONa không ngậm nước tinh khiết dùng cho phân tích,

0,147g CaCl2.2H2O tinh khiết dùng cho phân tích và 1,68ml CH3COOH 100% trong nước

khử ion và thêm nước tới 1lít. pH của dung dịch phải nằm trong khoảng 5,5± 0,05 chỉnh

lại với CH3COOH hoặc NaOH loãng nếu cần.

Dung dịch đệm với acetate với tween 20 (PH = 5,5):

Thêm 100mg tween 20 vào dung dịch đệm acetate (1)

Dung dịch axit nitric loãng:

Đổ từ từ và khuấy 70ml HNO3 65% vào 130ml nước.

73

Dung dịch Ammonium heptamolybdate tetrahydrate:

Hoà tan 100mg (NH4)6Mo7O24.4H2O trong 900ml nước trong bình định mức 1lít,

thêm 10ml NH4OH 25% và thêm nước tới 1lít.

Dung dịch có thể giữ được trong 4 tuần ở nhiệt độ phòng.

Dung dịch Ammonium monovanadate:

Khuấy để hoà tan 2,35g NH4VO3 trong 400ml nước ở 600C, thêm 20ml dung dịch

axit nitric loãng (4) và sau khi làm nguội thêm nước tới 1lít.

Dung dịch có thể giữ được trong 4 tuần ở nhiệt độ phòng.

Dung dịch dừng phản ứng và tạo phức màu:

Trộn 250ml dung dịch ammonium heptamolybdate tetrahydrate (4) và 250ml dung

dịch ammonium monovanadate (5) với 165 ml HNO3 65% trong bình định mức và thêm

nước tới 1lít.

Dung dịch này được chuẩn bị mỗi ngày.

Dung dịch cơ chất natri phytat (PH = 5,5):

Hoà tan 7,03g C6H6O24P6Na12 trong 900 ml dung dịch đệm acetate (1) trong bình

định mức 1lít ở 37oC. Điều chỉnh pH với CH3COOH loãng và thêm dung dịch đệm

acetate tới 1lít.

Dung dịch được chuẩn bị một vài phút trước khi tiến hành phản ứng.

Dung dịch dựng đường chuẩn Natri dihydrogenphosphate:

Dung dịch gốc natri dihydrophosphat có nồng độ 10-3M (1µmol/ml): Cân

15,601mg natri dihydrophosphat, hoà tan trong dung dịch đệm acetate (1) rồi chuyển vào

bình định mức 100ml và thêm acetate cho tới vạch mức.

Từ dung dịch gốc này ta pha dãy dung dịch như sau:

Số ml dịch gốc + số ml đệm acetate → Nồng độ dung dịch cần pha.

74

Dung dịch gốc (10-3M)

(ml)

Dung dịch đệm acetate

(ml)

Nồng độ dung dịch có

được (M)

0,4 3,6 1.10-4

0,8 3,2 2.10-4

1,2 2,8 3.10-4

1,6 2,4 4.10-4

2,0 2,0 5.10-4

2,4 1,6 6.10-4

2,8 1,2 7.10-4

3,2 0,8 8.10-4

3,6 0,4 9.10-4

Dung dịch enzym nghiên cứu:

Chế phẩm enzym thô ở dạng dung dịch lỏng được đem phân tích trực tiếp hoặc có

thể pha loãng bằng dung dịch đệm acetate-tween (2) khi cần thiết.

Cách tiến hành:

a. Dựng đường chuẩn natri dihydrophosphat:

Lấy từ các dung dịch natri dihydrophosphat đã pha loãng trên 2ml cho vào các ống

nghiệm khô rồi cho vào mỗi ống 1ml dung dịch đệm acetate – tween (2) và 2ml dung dịch

tạo phức màu (6).

Làm một mẫu blank (mẫu trống), thay 2ml dung dịch natri dihydrophosphat bằng

2ml nước cất.

Để yên các hỗn hợp phản ứng khoảng 15 phút. Đo cường độ màu của các dung

dịch natri dihydrophosphat với hỗn hợp dung dịch tạo màu bằng máy so màu quang điện

đối ngược với mẫu blank ở bước sóng λ = 415nm.

75

Từ các kết quả độ hấp thụ đo được ta dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ

của dung dịch màu và nồng độ natri dihydrophosphat ta được đồ thị đường chuẩn.

b. Xác định mẫu:

Lấy 2ml dịch enzym mẫu cho vào ống nghiệm khô giữ ổn định ở nhiệt độ 37oC

trong 10 phút rồi cho vào 4ml dung dịch cơ chất phytat – natri (cũng có nhiệt độ ổn định

37oC), lắc đều rồi để phản ứng diễn ra đúng 60 phút. Dừng phản ứng và tạo phức chất có

màu bằng 4ml dung dịch (6), lắc đều và để trong 10 phút. Sau khi lọc qua một lớp giấy

lọc, dịch trong được xác định cường độ màu trên máy so màu quang điện ở bước sóng λ=

415nm. Mỗi mẫu được tiến hành song song 2 thí nghiệm.

1.6.8.5. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ho¹t ®é mannanaza

X¸c ®Þnh ho¹t ®é mannanase : ho¹t ®é ®−îc x¸c ®Þnh víi c¬ chÊt lµ LBG 0,5% pha

trong ®Öm citrat pH = 4. Ph¶n øng enzym ®−îc tiÕn hµnh ë nhiÖt ®é 50oC trong thêi gian 5

phót. L−îng ®−êng khö t¨ng lªn trong dÞch ph¶n øng ®−îc x¸c ®Þnh b»ng ph−¬ng ph¸p DNS.

Mét ®¬n vÞ ho¹t ®é mannanase ®−îc ®Þnh nghÜa lµ l−îng enzym xóc t¸c gi¶i phãng

1µmol mannose trong 1 phót ë ®iÒu kiÖn chuÈn (500C, pH = 4).

1.6.9. Thu håi vµ tinh chÕ mét phÇn L- lysin vµ L- methionin ë qui m« phßng

thÝ nghiÖm vµ ë møc ®é lín

1.6.9.1 Thu håi vµ tinh chÕ mét phÇn L- lysin vµ L- methionin ë qui m« phßng

thÝ nghiÖm

TiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Lumir Macholan vµ céng sù .

1.6.9.2. Thu håi vµ tinh chÕ mét phÇn L- lysin vµ L- methionin ë møc ®é lín

TiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Hyakawa céng sù ( United state patent N0 6211

636 B1 )

DÞch lªn men ®−îc li t©m lo¹i x¸c tÕ bµo b»ng hÖ thèng li t©m liªn tôc 16000 v/phót

.L- lysine hoÆc L-methionine ®−îc thu håi b»ng kÕt tña cån, li t©m thu dÞch næi chøa L-

lysine hoÆc methionine, c« ®Æc dÞch chøa L- lysine hoÆc L-methionine b»ng c« ch©n

kh«ng.

1.6.10. Thu håi vµ tinh chÕ mét phÇn enzym phytaza, pectinaza vµ

mannanaza ë qui m« phßng thÝ nghiÖm vµ ë møc ®é lín

76

TiÕn hµnh theo M.D. Scawen ( Applied protein chemistry edited by R. A. Grant,

Applied Science Publishers LTD, London)[112].

Nguyªn t¾c : Çc enzym thu håi vµ tinh chÕ mét phÇn b»ng çch kÕt tña víi

sunphat amon. ChÊt kÕt tña chøa enzym vµ sunphat amon ®−îc lo¹i muèi b»ng thÈm tÝch

qua mµng celophan.

TiÕn hµnh theo M.D. Scawen ( Applied protein chemistry edited by R. A. Grant,

Applied Science Publishers LTD, London)[112].

1.6.11. Çc ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu ®éng th¸i lªn men sinh tæng hîp çc axit

amin vµ emzym

Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tÝnh chÊt cña enzym pectinaza, phytaza , mannanaza

sinh tæng hîp tõ chñng sinh tæng hîp tõ çc chñng A. niger

Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh tÝnh chÊt chÞu nhiÖt vµ chÞu pH cña çc enzym

pectinaza, mannanaza, phytaza sinh tæng hîp bëi chñng Aspergillus niger ph©n lËp.

Kh¶ n¨ng chÞu nhiÖt, chÞu pH cña çc enzym ®· ®−îc kh¶o s¸t th«ng qua viÖc x¸c

®Þnh ho¹t ®é enzym ë çc nhiÖt ®é , pH ph¶n øng kh¸c nhau

1.6.12. Çc ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men thÞt qu¶ cµ phª, phÕ

phô phÈm thñy h¶i s¶n vµ b· døa lµm thøc ¨n gia sóc

1.6.13. Ph−¬ng ph¸p lªn men phÕ phô phÈm ®Çu t«m b»ng vi khuÈn Lactic

lµm thøc ¨n ch¨n nu«i

Men khëi ®éng lµ chÕ phÈm d¹ng bét vµ hçn dÞch vi khuÈn lactic

PhÕ th¶i t«m ( ®Çu, ch©n, vá, ®u«i, trøng t«m vµ t«m n¸t vôn) tõ chÕ biÕn t«m nân

sÊy kh« cña lµng nghÒ chÕ biÕn thñy s¶n H¶i B×nh, TÜnh gia, Thanh hãa

RØ mËt tõ C«ng ty Cæ phÇn mÝa ®−êng Lam s¬n, Thanh hãa

Bét ng« t¹i thÞ tr−êng tù do

PhÕ th¶i chÕ biÕn t«m nân ®−îc lªn men yÕm khÝ trongb×nh thñy tinh cã n¾p kÝn

hoÆc thïng nhùa cã bæ sung men khëi ®éng víi tû lÖ kh¸c nhau 0,5; 1,0; 1,5% ( d¹ng bét)

vµ 3; 5; 7; 10 % ( d¹ng láng). §o pH cña s¶n phÈm lªn men b»ng m¸y ®o Toledo Thôy sÜ.

Çc axit h÷u c¬ ( lactic, axetic vµ butiric) ®−îc ph©n tÝch b»ng ph−¬ng ph¸p ch−ng

cÊt ph©n ®o¹n Lipper Flig.

77

1.6.14. Ph−¬ng ph¸p lªn men çc phÕ phô phÈm ç lµm thøc ¨n ch¨n nu«i

Ç chÊt l−îng kÐm, ®Çu, v©y, ruét ç...víi l−îng 100 kg ®−îc xay nhá ®em trén

®Òu víi rØ ®−êng 10 kg, bét ng«, bét çm mçi lo¹i 15 kg, sau ®ã bæ sung 10% l−îng gièng

vi khuÈn Lactic ®−îc lªn men sau 24 giê cã sè l−îng tÕ bµo ®¹t kho¶ng 5.109 CFU/ml, bæ

sung thªm bét kho¸ng Premic vµ muèi ¨n. TÊt c¶ hçn hîp nµy ®−îc lªn men ë 320 C trong

tói nilon, sau thêi gian 96 giê kiÓm tra sè l−îng vi sinh vËt, ph©n tÝch l−îng nit¬ tæng sè.

ChÊt l−îng ®¹t tiªu chuÈn ®−îc ®ãng gãi sö dông lµm thøc ¨n ch¨n nu«i. MÉu ®èi chøng

®−îc chÕ biÕn t−¬ng tù víi nguån C, thay thÕ nguån N bÇng bét ç trªn thÞ tr−êng vµ

kh«ng bæ sung vi khuÈn lactic

1.6.15. Ph−¬ng ph¸p lªn men b· døa lµm thøc ¨n cho bß s÷a

TuyÓn chän vµ nh©n gièng vi sinh vËt

Çc gièng nÊm men, nÊm mèc, vi khuÈn ®−îc thu thËp tõ c¬ së gi÷ gièng, ngoµi tù

nhiªn. Ph©n lËp vµ gi÷ gièng theo ph−¬ng ph¸p vi sinh truyÒn thèng.

Nh©n gièng ®a chñng: tiÕn hµnh nh©n gièng nÊm men vµ nÊm sîi tr−íc sau ®ã bæ

sung vi khuÈn vµ sÊy kh« trong nhiÖt ®é thÊp nhá h¬n 600C, t¸n thµnh bét lµm gièng cho

qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm

Ph−¬ng ph¸p lªn men xèp (lªn men bÒ mÆt) sau ®ã lªn men yÕm khÝ. Quy m«

10,100,1000,3000 kg

B¶ng 2: Thµnh phÇn nguyªn liÖu ®Ó lªn men phÕ phô phÈm thñy h¶i s¶n

TØ lÖ nguyªn liÖu (%) CT1 CT2 CT3 B· qu¶ døa Ðp t−¬i 50 60 70 Bét s¾n kh« 40 30 20 Çm m× 8 8 8 Gièng vi sinh vËt 2 2 2

Thö nghiÖm s¶n phÈm trªn gia sóc: TiÕn hµnh t¹i Trung t©mm nghiªn cøu bß vµ

®ång cá Ba v× (Hµ T©y), hé «ng Thùc Sinh tõ th¸ng 4-7/ 2003. Hé «ng S¬n, «ng Kh¸nh thÞ

trÊn Th¸i Hßa, NghÜa §µn, NghÖ An.

Chän bß thÝ nghiÖm, ph©n l« so s¸nh vµ tiÕn hµnh ®æi l« 45 ngµy cho ¨n

78

1.6.16. Ph−¬ng ph¸p lªn men thÞt qu¶ cµ phª lµm thøc ¨n ch¨n nu«i

Khö tanin

Qu¸ tr×nh khö tanin ®−îc tiÕn hµnh tr−íc tiªn.ViÖc khö tanin trªn thÞt qu¶ cµ phª ë

qui m« c«ng nghiÖp ch¼ng h¹n 10 tÊn mÎ ®−îc tiÕn hµnh b»ng viÖc sö dông çc vi khuÈn

Bacillus subtilis tù nhiªn cã trong thÞt qu¶ cµ phª th«ng qua viÖc ®¶o trén ®èng thÞt qu¶ cµ

phª b»ng m¸y ch¼ng h¹n nh− m¸y kÐo cã l¾p bé phËn ®¶o trén. ViÖc ®¶o trén ®−îc tiÕn

hµnh mçi ngµy mét lÇn vµ kÐo dµi tõ 7 ®Õn 8 ngµy.

Khö cafein

Qu¸ tr×nh khö cafein ®−îc tiÕn hµnh theo hai ph−¬ng ph¸p nh− sau:

§èi víi thÞt qu¶ cµ phª chÕ biÕn theo ph−¬ng ph¸p kh«, viÖc khö cafein ®−îc tiÕn

hµnh b»ng viÖc sö dông nÊm thùc phÈm Neurospora sitophila cã ho¹t tÝnh khö cefein,

ph©n gi¶i celluloza ®Ó khö cafein vµ ph©n gi¶i celluloza trªn thÞt qu¶ cµ phª. Qui tr×nh s¶n

xuÊt hçn dÞch nÊm Neurospora sitophila nh− sau:

NÊm Neurospora sitophila ®−îc gi÷ gièng trªn èng th¹ch nghiªng trªn m«i tr−êng

PDA. ViÖc nh©n gièng ®−îc thùc hiÖn b»ng viÖc l¾c trªn b×nh tam gi¸c råi nh©n tiÕp trªn

t¨ng nu«i cÊy ch×m sôc khÝ dung tÝch 150l/ mÎ víi tû lÖ tiÕp gièng lµ 1/ 10.

Sau khi nh©n nu«i hçn dÞch nÊm Neurospora sitophila trªn t¨ng nu«i cÊy ch×m sôc

khÝ, tiÕn hµnh lªn men thÞt qu¶ cµ phª b»ng viÖc bæ sung 10 % hçn dÞch nÊm Neurospora

sitophila vµo m«i tr−êng lªn men thÞt qu¶ cµ phª.

Lªn men thÞt qu¶ cµ phª b»ng nÊm Neurospora sitophila ®· ®−îc tuyÓn chän theo

ph−¬ng ph¸p hiÕu khÝ trong çc tói nilon, thêi gian 4- 5 ngµy ®Õn khi sîi nÊm ph¸t triÓn vµ

kÕt thµnh khèi chÆt trªn thÞt qu¶ cµ phª th× dõng.ThÞt qu¶ cµ phª cã mïi th¬m hÊp dÉn vµ

cã mµu n©u s¸ng.

§èi víi thÞt qu¶ cµ phª chÕ biÕn theo ph−¬ng ph¸p −ít viÖc khö cafein ®−îc tiÕn

hµnh b»ng viÖc sö dông nÊm Aspergillus niger ®· tuyÓn chän cã ho¹t tÝnh khö cafein ®ång

thêi sinh enzym cellulaza vµ pectinaza. Sau khi nh©n nu«i hçn dÞch nÊm Aspergillus niger

trªn t¨ng nu«i cÊy ch×m sôc khÝ , tiÕn hµnh lªn men thÞt qu¶ cµ phª b»ng viÖc bæ sung 10

% hçn dÞch nÊm Aspergillus niger vµo m«i tr−êng lªn men thÞt qu¶ cµ phª.

79

Lªn men thÞt qu¶ cµ phª b»ng nÊm Aspergillus niger®· ®−îc tuyÓn chän theo

ph−¬ng ph¸p yÕm khÝ trong çc tói nilon, thêi gian 9-10 ngµy. ChÕ phÈm thÞt qu¶ cµ phª

cã mïi th¬m hÊp dÉn, kh«ng cßn vÞ ®¾ng ch¸t vµ cã mµu vµng s¸ng.

1.7. Ph−¬ng ph¸p lªn men ch×m sôc khÝ qui m« 150l/mÎ vµ 1500l/mÎ cho s¶n

xuÊt axit amin L- lysine, L-methionin vµ enzym phytaza, pectinaza

Qu¸ tr×nh khö trïng toµn bé hÖ thèng lªn men

Tr−íc khi khö trïng, toµn bé t¨ng lªn men vµ hÖ thèng èng d·n khÝ, dÉn h¬i ®−îc

lµm s¹ch, sau ®ã ®ãng chÆt n¾p t¨ng vµ cho h¬i dÉn trùc tiÕp vµo t¨ng. H¬i dÉn vµo khö

trïng t¨ng ph¶i ®¶m b¶o s¹ch vµ ¸p suÊt nåi h¬i lu«n gi÷ ë 2 atm. ¸p suÊt trong t¨ng khi

khö trïng lµ 1,5 atm, khi b¾t ®µu dÉn h¬i vµo t¨ng th× ph¶i hÐ më tÊt c¶ çc van ®Ó h¬i

®−îc l−u th«ng, ®ång thêi kÕt hîp khö trïng hÖ thèng phin läc khÝ vµ hÖ thèng trôc chÌn

kÝn víi chÕ ®é khö trïng gièng khö trïng t¨ng lµ 1,5 atm. Khi kim ®ång hå trong t¨ng chØ

1,5 atm th× b¾t ®Çu tÝnh giê vµ ¸p suÊt nµy ®−îc gi÷ trong suèt thêi gian khö trïng lµ 1 giê.

Qu¸ tr×nh ®iÒu chÕ m«i tr−êng ë quy m« 150 lÝt/mÎ vµ 1500 lÝt/mÎ

Sau khi kÕt thóc qu¸ tr×nh khö trïng toµn bé hÖ thèng lªn men ta tiÕn hµnh b¬m

lµm nguéi vµ b¬m n−íc vµo t¨ng ®Õn møc 100 lÝt ®èi víi lªn men ë hÖ thèng 150 l/ mÎ vµ

1000 l ®èi víi lªn men ë hÖ thèng 1500 l/ mÎ. C©n ®Çy ®ñ çc hãa chÊt trong thµnh phÇn

m«i tr−êng lªn men vµ bæ sung dÇu ph¸ bät. §ãng n¾p t¨ng vµ më van dÉn h¬i vµo vá t¨ng

®ång thêi bËt çnh khuÊy víi tèc ®é lµ 250 vßng/phót ®Ó ®¶o trén ®Òu m«i tr−êng lªn men.

Khö trïng m«i tr−êng ë 1 atm trong 1 giê. Sau khi khö trïng xong th× ng¾t h¬i vµ b¬m

n−íc tõ bÓ l¹nh ®Ó lµm nguéi m«i tr−êng, khi nhiÖt ®é m«i tr−êng trong t¨ng gi¶m xuèng

cßn 300C th× míi tiÕn hµnh tiÕp gièng.

Qu¸ tr×nh tiÕp gièng

Chñng vi sinh nghiªn cøu ®−îc nh©n gièng trªn m¸y l¾c trªn m«i tr−êng nh©n

gièng sau 24 giê, chñng ®−îc truyÒn gièng vµo t¨ng lªn men 150 lÝt/mÎ vµ 1500 l/ mÎ víi

tû lÖ 7 %- 10 %.

L−îng oxy hßa tan trong m«i tr−êng nu«i cÊy

L−îng oxy hßa tan trong m«i tr−êng lªn men ch×m ®−îc gi÷ ë nång ®é 90 - 100%

tïy vµo thêi çc ®iÓm nu«i cÊy. Nång ®é oxy hßa tan trong t¨ng lªn men ®−îc ®iÒu khiÓn

b»ng hÖ thèng ®iÒu khiÓn oxy hßa tan tù ®éng.

80

NhiÖt ®é lªn men ®−îc ®iÒu khiÓn b»ng hÖ thèng ®iÒu khiÓn nhiÖt ®é ®Õn nhiÖt ®é

thÝch hîp cho tõng lo¹i vi sinh vËt nghiªn cøu.

pH cña m«i tr−êng lªn men ®−îc ®iÒu khiÓn b»ng hÖ thèng ®iÒu khiÓn nhiÖt ®é ®Õn

thÝch hîp cho tõng lo¹i vi sinh vËt nghiªn cøu.

1.8. Ph−¬ng ph¸p g©y ®ét biÕn C. glutamicum tù nhiªn sinh L- lysine b»ng

nitrosoguanidine

Chñng sö dông ®Ó g©y ®ét biÕn lµ chñng C. glutamicum tù nhiªn cã ho¹t tÝnh tæng

hîp L- lysin cao nhÊt trong bé s−u tËp C. glutamicum cña Phßng Vi sinh- ViÖn C¬ ®iÖn

N«ng nghiÖp vµ C«ng nghÖ sau thu ho¹ch.

Ho¹t ho¸ chñng C. glutamicum ®· chän ®Õn ®óng thêi ®iÓm gi÷a pha logarit. §æ

dÞch võa ho¹t ho¸ vµo 2 èng fancol, mçi èng chøa 10ml dÞch. Li t©m dÞch trªn ë

7000v/phót ë 4oC trong 15 phót. Bá dÞch, lÊy cÆn (tÕ bµo kÕt tña)

TÕ bµo kÕt tña trong çc èng fancol ®−îc pha lo·ng víi n−íc cÊt v« trïng cho ®Õn

khi cã ®é hÊp phô lµ 1,0 ( ®o ë b−íc sãng 515nm).

Hçn dÞch tÕ bµo kÕt tña võa pha lo·ng ®−îc ®æ ra hép lång. TiÕn hµnh g©y ®ét biÕn

chñng C. glutamicum theo 2 tr−êng hîp sau:

Xö lý hçn dÞch chñng C. glutamicum tù nhiªn b»ng nitrosoguanidine nång ®é 0,

02; 0,06; 0,1% trong thêi gian 1 phót.

Xö lý chñng C. glutamicum tù nhiªn b»ng nitrosoguanidine nång ®é trong thêi

gian 2 phót.

Sau khi xö lý ®ét biÕn, hçn dÞch chñng C. glutamicum ®−îc ®æ vµo çc b×nh tam

gi¸c 100ml v« trïng ®Ó tiÕn hµnh çc thÝ nghiÖm tiÕp theo.

Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp çc ®ét biÕn thÓ

Sö dông chÊt ®ång ®¼ng víi L- lysin lµ S -(2 aminoetyl) -L- cystein (AEC) ®Ó ph©n

lËp çc ®ét biÕn thÓ cã kh¶ n¨ng ®Ò kh¸ng víi AEC. Çch lµm nh− sau:

Hót 500µl hçn dÞch tÕ bµo chñng C. glutamicum ®· ®−îc xö lý b»ng

nitrosoguanidine ®−îc cho vµo 15 ml m«i tr−êng NA cã bæ sung AEC ë çc nång ®é

0,1mg/ml, 1mg/ml, 10mg/ml, 20mg/ml, 30mg/ml, 40mg/ml, 50mg/ml, 60mg/ml vµ bæ

sung 0,2mg/ml threonin, 0,2mg/ml methionin. Sau ®ã l¾c thËt ®Òu hçn hîp trªn råi ®æ ra

hép lång. Nu«i cÊy çc chñng nµy ë 300C. Sau tõng ngµy chóng t«i quan s¸t çc hép lång

81

nu«i cÊy çc chñng trªn. Khi nµo trªn ®Üa th¹ch thÊy xuÊt hiÖn çc khuÈn l¹c cã vßng

khuÈn l¹c vÖ tinh xung quanh th× chóng t«i b¾t çc khuÈn l¹c nµy vµ hoµ tan chóng vµo 0,1

ml n−íc cÊt v« trïng trong èng ependorf ®Ó lµm çc thÝ nghiÖm tiÕp theo.

1.9. Ph−¬ng ph¸p t¸ch dßng gen dihydrodipicolinate synthase tõ vi khuÈn C. glutamicum

ph©n lËp

1.9.1. Ph−¬ng ph¸p t¸ch ADN tæng sè cña vi khuÈn C. glutamicum

TiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Sambrook. J vµ céng sù. Nu«i çc chñng vi khuÈn

ph©n lËp ®−îc trªn m«i tr−êng LB láng, l¾c trªn m¸y l¾c 200 vßng /phót qua ®ªm ë 370C.

Hót 1,5ml dÞch nu«i cÊy vµo èng eppendorf. Ly t©m 6000 vßng /phót trong 5 phót, thu cÆn

tÕ bµo. Bæ sung 567µl TE (10:1) ®Ó trªn ®¸, vortex.Thªm 30µl SDS 10% ®Ó ë nhiÖt ®é

th−êng, l¾c lªn l¾c xuèng 3 lÇn.Thªm 3µl proteinaza K, trén ®Òu råi ñ ë 37 0C trong 1giê.

Bæ sung 180 µl NaCl 5M, l¾c lªn l¾c xuèng 3 lÇn råi tiÕp tôc ñ ë 650C trong 10 phót. Bæ

sung 800µl chloroform, trén ®Òu t¹o thµnh hçn dÞch sau ®ã ly t©m 10000vßng/10phót.

Thu 600 µl dÞch næi, bæ sung 300µl chloroform vµ 300µl phenol, trén ®Òu råi tiÕp tôc ly

t©m 10.000vßng/10phót, thu 600µl dÞch næi. Bæ sung 600µl chloroform ®Ó lo¹i phenol,

trén ®Òu råi ly t©m 10000vßng/10phót, thu 400µl dÞch næi. Tña ADN b»ng 40µl NaOAC

vµ 1ml cån 100%, ñ ë -200C sau Ýt nhÊt 4h hoÆc qua ®ªm, thu cÆn ADN b»ng çch ly t©m

14000 vßng/ 20 phót.

Röa l¹i c¾n ADN víi 1ml cån 70% b»ng çch tiÕp tôc ly t©m 14000 vßng/ 20 phót. SÊy

kh« c¾n trong m¸y hót ch©n kh«ng. Lo¹i ARN b»ng çch bæ sung 20µlTE-ARNaza vµ ñ ë

37 0C/ 1h.

1.9.2. KhuÕch ®¹i ®o¹n ADN thuéc gen m· hãa dihydrodipcolinate cho sinh tæng hîp

L-lysin b»ng ph¶n øng PCR:

Nguyªn t¾c vµ c¬ chÕ cña ph¶n øng PCR.

Kü thuËt PCR sö dông çc ®Æc ®iÓm cña qu¸ tr×nh sao chÐp ADN. ADN

polymeraza dïng çc ®o¹n ADN m¹ch ®¬n ®Ó lµm khu«n tæng hîp nªn sîi míi t−¬ng hîp

víi nã. ADN polymeraza cÇn cã mét ®o¹n ng¾n ADN m¹ch kÐp (®o¹n måi oligonucleotit

víi chiÒu dµi tèi −u lµ 15-25 nucleotid cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp víi mét ®Çu cña sîi khu«n).

D−íi t¸c dông cña ADN polymeraza m¹ch míi sÏ h×nh thµnh. ADN sö dông trong PCR lµ

82

çc polymeraza chÞu nhiÖt. Çc giai ®o¹n c¬ b¶n trong mét chu kú cña ph¶n øng PCR

gåm:

+ BiÕn tÝnh ADN b»ng nhiÖt ®é 94oC - 95oC.

+ B¾t cÆp: lµ giai ®o¹n måi b¾t cÆp víi sîi khu«n, cÇn nhiÖt ®é 40-70oC, phô thuéc

vµo ®é dµi vµ tØ lÖ %G+C cña mçi måi.

+ Tæng hîp: lµ giai ®o¹n ADN polymeraza tæng hîp sîi ADN míi trªn sîi khu«n.

Mçi chuçi ph¶n øng gåm nhiÒu chu kú nh− vËy nèi tiÕp nhau (30-45 chu kú) sÏ t¹o

®−îc mét l−îng s¶n phÈm PCR cÇn thiÕt.

B¶ng 3: Thµnh phÇn ph¶n øng PCR

Thµnh phÇn ThÓ tÝch (µl) N−íc tinh khiÕt 15,6 §Öm cho Taq 2,5 DNTP 2,5 Taq polimeraza 0,4 Måi xu«i 1 Måi ng−îc 1 ADN khu«n 2 Tæng 25

Chóng t«i dùa vµo tr×nh tù gen DapA cña chñng C. glutamicum ®−îc ®¨ng ký trong

Ng©n hµng D÷ liÖu gen Quèc tÕ ®Ó thiÕt kÕ cÆp måi khuÕch ®¹i gen m· ho¸ enzym

dihydrodipicolinate synthase b»ng kü thuËt PCR. Tr×nh tù ®o¹n måi ®−îc thÊy ë b¶ng 2.3.

B¶ng 4: Çc ®o¹n måi dïng cho khuÕch ®¹i ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap P7 vµ gen Dap

M2 tõ çc chñng C. glutamicum

Gen Tr×nh tù ®o¹n måi

Dap AP8 5'-TGTGGCTTGGGCGATTGTTATGC-3'

Dap AM4 5'-ATTGTCGTTTCCGGCGGTCTCAGC-3'

B¶ng 5: Ch−¬ng tr×nh ch¹y PCR

NhiÖt ®é Thêi gian T¸c dông Sè chu kú

940C 3 phót BiÕn tÝnh 1

940C 1 phót BiÕn tÝnh

83

550C 50 gi©y G¾n måi 720C 1phót 20 gi©y Tæng hîp

30

720C 8 phót Hoµn thiÖn tæng hîp 1

40C 24 giê B¶o qu¶n

LÊy 5µl s¶n phÈm PCR ®Ó kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel agaroza 1%.

1.9.3. G¾n s¶n phÈm PCR vµo vect¬ t¸ch dßng pCR® 2.1

S¶n phÈm PCR ®−îc g¾n trùc tiÕp vµo vect¬ t¸ch dßng nhê enzym nèi T4 - ADN

ligaza ë 14oC (nhiÖt ®é tèi −u cho T4 - ADN ligaza ho¹t ®éng). Thµnh phÇn cña ph¶n øng

®−îc thùc hiÖn theo quy tr×nh trong bé kit TA cloning cña h·ng Invitrogen ®−îc cho ë

b¶ng 6.

B¶ng 6: Ph¶n øng g¾n s¶n phÈm PCR vµo vect¬ t¸ch dßng pCR® 2.1

Thµnh phÇn ThÓ tÝch (µl)

N−íc tinh khiÕt 4

§Öm cho T4 - ligaza 1

S¶n phÈm PCR 2

Vect¬ pCR 2.1 2

T4 - ligaza 1

Tæng 10

Qu¸ tr×nh g¾n ®−îc tiÕn hµnh qua ®ªm ë nhiÖt ®é 140C.

1.9.4. BiÕn n¹p plasmid t¸i tæ hîp vµo E. coli IVNαF'

Sau khi g¾n, s¶n phÈm g¾n ®−îc biÕn n¹p vµo vi khuÈn E. coli IVNαF’. Çc khuÈn

l¹c E. coli chøa vect¬ pCR 2.1 t¸i tæ hîp mang ®o¹n ADN ®Æc hiÖu vµ çc khuÈn l¹c chøa

84

vect¬ t¸i tæ hîp mang ®o¹n ADN chøa gen m· ho¸ L-lysin ®−îc chän läc trªn m«i tr−êng

LB chøa ampixillin vµ X-gal.

Qu¸ tr×nh biÕn n¹p ®−îc thùc hiÖn theo çc b−íc sau:

- LÊy1 èng tÕ bµo kh¶ biÕn tõ tñ l¹nh s©u -850C. C¾m trªn ®¸ kho¶ng 30 phót ®Ó

lµm tan b¨ng.

- Trén kho¶ng 4µl s¶n phÈm sau khi g¾n víi 100µl tÕ bµo kh¶ biÕn. §Ó trong ®¸ 30

phót nh»m t¹o cho hçn hîp cã mét nhiÖt ®é thÊp nhÊt ®Þnh vµ t¹o ®iÒu kiÖn cho vect¬ t¸i

tæ hîp tiÕp cËn tÕ bµo mét çch ®ång ®Òu.

- Sèc nhiÖt ë 420C, 1 phót 30 gi©y, sau ®ã gi÷ hçn hîp nµy trong ®¸ 2 phót.

- Thªm vµo 450µl m«i tr−êng LB láng. L¾c ë 370C, 200 vßng/phót trong 1 giê.

- CÊy tr¶i huyÒn dÞch vi khuÈn ®· biÕn n¹p ra ®Üa petri cã chøa m«i tr−êng LB ®Æc

cã bæ sung ampixilin vµ X - gal. Trang ®Òu cho ®Õn khi kh« mÆt th¹ch, óp ng−îc hép lång,

gãi trong giÊy b¸o v« trïng. Nu«i ë 370C qua ®ªm.

1.9.5. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN plasmid tõ E. coli IVNαF'

Ph−¬ng ph¸p t¸ch ADN plasmit cña Sambrook vµ céng sù [71].

- LÊy mét khuÈn l¹c vi khuÈn chøa plasmid t¸i tæ hîp (khuÈn l¹c tr¾ng) cÊy vµo

2ml m«i tr−êng LB láng cã chøa chÊt kh¸ng sinh ampixilin (nång ®é 100µg/ml). L¾c qua

®ªm ë 370C víi tèc ®é 200vßng/phót. ChuyÓn 1,5ml dÞch nu«i cÊy sang èng Eppendorf.

Ly t©m 5000 vßng/phót trong 10 phót ®Ó thu cÆn tÕ bµo. Bæ sung 150µl dung dÞch ®Öm I.

KhuÊy trén m¹nh b»ng m¸y Vortex ®Ó hßa l¹i tÕ bµo thµnh huyÒn dÞch vi khuÈn thuÇn

nhÊt. Thªm 150µl dung dÞch ®Öm II, nhÑ nhµng ®¶o èng 3 lÇn, sau ®ã ®Ó trong 1-2 phót ë

nhiÖt ®é phßng thÝ nghiÖm råi bæ sung tiÕp 150µl dung dÞch ®Öm III, ®¶o nhÑ èng 2 lÇn.

Thªm 450µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), ®¶o ®Òu mét çch nhÑ nhµng.

Ly t©m ë 14.000 vßng/phót, 15 phót, ë 40C. Hót 400µl dÞch næi chuyÓn sang èng

eppendorf míi, bæ sung 40µl natri axetat (NaOAC) 3M, pH 5,2 vµ 1ml ethanol 100%. §Ó

ADN plasmid tña ë -200C trong kho¶ng thêi gian Ýt nhÊt 3 giê (cã thÓ tña ë -85oC trong 20

®Õn 30 phót). Ly t©m ë 14.000 vßng/phót, trong 20 phót, ë 40C, thu tña. Thªm 600µl

ethanol 70% ly t©m 14.000 vßng/phót trong 20 phót, thu tña ADN. Lµm kh« tña b»ng m¸y

hót ch©n kh«ng (Speed Vac) trong 3 phót. Hßa tan cÆn ADN trong 40µl TE cã ARNaza

85

(nång ®é 100µg/ml). ñ mÉu ë 370C trong 1 giê ®Ó lo¹i bá ARN. Ch¹y ®iÖn di trªn gel

agaroza 1% ®Ó kiÓm tra.

1.9.6.X¸c ®Þnh tr×nh tù axit nucleic cña ®o¹n gen ®· t¸ch dßng

Çc b−íc cña ph−¬ng ph¸p ®−îc tãm t¾t nh− sau:

- Thùc hiÖn ph¶n øng PCR ngoµi çc thµnh phÇn th«ng th−êng cßn bæ sung bèn

lo¹i dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP vµ ddTTP) ®· ®−îc ®¸nh dÊu b»ng thuèc

nhuém huúnh quang.

- §iÖn di s¶n phÈm PCR trªn gen polyacrylamid cã bæ sung ure ®Ó lµm t¨ng ®é

ph©n gi¶i cña gen.

- Dïng tia laze quÐt ®Ó ph¸t hiÖn dideoxynucleotid ®¸nh dÊu.

- Xö lý kÕt qu¶ b»ng phÇn mÒm PC/GENE

Sö dông phÇn mÒm Fasta ®Ó so s¸nh tr×nh tù gen ®· t¸ch dßng ®−îc víi çc tr×nh tù

®· c«ng bè trong Ng©n hµng gen Quèc tÕ.

1.10. T¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù gen m· ho¸ enzym homoserin

acetyltransferase cho sinh tæng hîp axit amin L-methionin tõ chñng

Corynebacterium glutamicum

X¸c ®Þnh sù tån t¹i gen metA tõ çc chñng C. glutamicum ph©n lËp b»ng kü thuËt PCR.

Dùa theo tr×nh tù gen metA ®· c«ng bè [8], chóng t«i sö dông phÇn mÒm PC/gene

®Ó thiÕt kÕ cÆp måi víi tr×nh tù nucleotit nh− sau: (P15: 3’GCGGCTTTGCTGCAAT

CTAGC-5’) and hser M9 (5’-CTGGAAGTTACGGAGGTACATCCG-3’). CÆp måi nµy ®·

®−îc sö dông ®Ó nh©n b¶n gen metA. Ph¶n øng PCR ®−îc tiÕn hµnh víi tæng thÓ tÝch

25µl ®ùng trong èng Eppendorf bao gåm çc thµnh phÇn: n−íc khö ion: 13,6µl, dNTP:

2,5µl, buffer: 2,5µl, primer(nång ®é 10ng/µl): 2µl, enzim Tag-polymeraza (0,5unit):

0,4µl, MgCl2: 2µl, ADN (nång ®é 50ng/µl): 2µl. Çc s¶n phÈm PCR ®−îc ph©n tÝch b»ng

®iÖn di trªn gel agaroza 1%.

T¹o dßng gen metA

TiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Sambrook vµ cs [3]: s¶n phÈm PCR ®−îc g¾n trùc

tiÕp vµo vect¬ t¹o dßng PCRTM 2.1. Thµnh phÇn ph¶n øng g¾n bao gåm: n−íc khö ion:

3µl; Dung dÞch ®Öm g¾n: 1µl; S¶n phÈm PCR:3µl; vect¬ PCRTM2.1: 2µl; T4- ligaza: 1µl.

86

ñ qua ®ªm ë nhiÖt ®é 140C. Sau ®ã biÕn n¹p s¶n phÈm g¾n vµo vi khuÈn E. coli chñng

DH5α. Çc khuÈn l¹c E. coli chøa vect¬ pCRTM 2.1 t¸i tæ hîp ®−îc chän läc trªn m«i

tr−êng LB chøa ampixillin, IPTG (Isopropyl- β-D- Thiogalactopyranoside) vµ X-gal. Sau

®ã t¸ch chiÕt ADN plasmit tõ tÕ bµo vi khuÈn ®· biÕn n¹p, ADN plasmit t¸i tæ hîp ®−îc

kiÓm tra b»ng çch c¾t víi enzym giíi h¹n EcoR I.

Ph©n tÝch tr×nh tù gen metA

Gen metA ®−îc x¸c ®Þnh tr×nh tù theo ph−¬ng ph¸p enzim häc cña Sanger nhê bé kit cña

H·ng Amersham-Pharmacia Biotech víi m¸y ®äc tr×nh tù ADN tù ®éng ALF-Express cña H·ng

Pharmacia. Ph©n tÝch kÕt qu¶ ®−îc tiÕn hµnh víi ch−¬ng tr×nh PC/Gene.

1.11. Ph−¬ng ph¸p t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gene plantaricin SA m· ho¸

bacteriocin trong vi khuÈn E.coli BL21

Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN tæng sè : TiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Sambrook. J vµ

céng sù

KhuÕch ®¹i ®o¹n ADN thuéc gen PLSA m∙ hãa bacteriocin b»ng ph¶n øng PCR:

Gen plantaricin SA ®−îc khuÕch ®¹i b»ng kü thuËt PCR tõ ADN genom cña L

.plantarum víi cÆp måi cã tr×nh tù nh− sau :

PLSA:5‘- AATAACGCATTAAGTTTTGAAC-3’

PLSA :5‘- TGCAAGGAGTGCCCATGC-3’

Ph¶n øng chuçi ®−îc thùc hiÖn nhê m¸y Bio-Rad gen Cycler theo ch−¬ng tr×nh:

940C 3 phót; 940C 1 phót; 600C 45 gi©y;720C 1 phót 30 gi©y (30 chu kú) ,720C 8 phót; 40C.

S¶n phÈm PCR nµy ®−îc g¾n trùc tiÕp vµo vector t¸ch dßng pCRTM 2.1 cña H·ng

Invitrogen, sau ®ã biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli chñng DH5α. Dßng plasmit t¸i tæ hîp ®·

®−îc chän läc, tinh s¹ch vµ gi¶i tr×nh tù gen.

ThiÕt kÕ plasmid vector chøa gen plantaricin SA

Tr×nh tù gene m· ho¸ bacteriocin cña vi khuÈn L.plantataum cã chøa ®o¹n gene

dµi 168 bp. Toµn bé gene plantaricin SA (PLSA) ®−îc ®−a vµo vector pCRTM 2.1 t¹o vect¬

t¸i tæ hîp ký hiÖu lµ pCR-PLSA.

87

ThiÕt kÕ vector biÓu hiÖn trong tÕ bµo E.Coli

Plasmid pCR-PLSA ®−îc sö dông lµm khu«n ®Ó khuÕch ®¹i ®o¹n gen plantaricin

SA m· ho¸ bacteriocin b»ng kü thuËt PCR víi cÆp måi biÓu hiÖn 5’PLSA-Bam vµ

3’PLSA-Xho ®−îc thiÕt kÕ thªm ®iÓm c¾t cña çc enzyme h¹n chÕ Bam HI vµ XhoI.

PLSABam: 5’ -TGGATCCAATAACGCATTAAGTTTTGAAC- 3’ PLSAXho: 5’ - GCTCGAGTGCAAGGAGTGCCCATGC- 3’ S¶n phÈm PCR ®−îc t¹o dßng nhê vector Topo-TA cña H·ng Invitrogen vµ kiÓm

tra l¹i tr×nh tù b»ng m¸y ABI 3100 Avant. Vì đoạn gen PLSA quá nhỏ (168 bp), vì vậy để

biểu hiện được đoạn gen này, chúng tôi đã gắn nó vào vector pET-TRX-FuS (pET-TRX

Fusion Expression Vector System ). §o¹n gen PLSA ®−îc c¾t ra khái vector t¹o dßng

b»ng BamHI vµ XhoI vµ ®Ýnh vµo vector pET-TRX-FuS sau khi vector nµy còng ®−îc xö lý

b»ng BamHI vµ XhoI. S¶n phÈm lai ®−îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E.coli, sau ®ã tiÕn hµnh chän

läc dßng plasmid t¸i tæ hîp vµ c¾t kiÓm tra l¹i b»ng enzym BamHI vµ XhoI.

Vector pET-TRX-FuS-PLSA t¸i tæ hîp mang ®o¹n gen m· hãa Thioredoxin-PLSA-

HisTag ®−îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli chñng biÓu hiÖn BL21 DE3 Star. BiÓu hiÖn ®Ó thu

nhËn protein t¸i tæ hîp ®−îc tiÕn hµnh trong m«i tr−êng LB láng cã bæ sung Kanamycin

vµ c¶m øng b»ng IPTG víi nång ®é cuèi cïng lµ 1mM. Protein t¸i tæ hîp ®−îc kiÓm tra

b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel polyacrylamide.

1.12. Ph−¬ng ph¸p t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gene phy A m· ho¸ phytaza cña

nÊm mèc A. niger trong nÊm men Pichia pastoris

Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN tæng sè TiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p cña Sambrook.

J vµ céng sù.

Ph−¬ng ph¸p t¸ch dßng gen

Gen phyA ®−îc khuÕch ®¹i b»ng kü thuËt PCR víi cÆp måi (PHYAP1,

PHYAP2)

Tªn måi Tm Tr×nh tù måi

KÝch th−íc s¶n phÈm PCR theo

lý thuyÕt

PHYAP1 50 5’GTCACCTCCGGACTGGCAGTCC 3’ 1357 bp

88

PHYAP2 50 5’AGCGAAACACTCCCCCCAATCAC 3’

Ph¶n øng chuçi ®−îc thùc hiÖn nhê m¸y Bio-Rad gen Cycler theo ch−¬ng tr×nh:

960C 3 phót; 960C 1 phót; 500C 45 gi©y;720C 1 phót 30 gi©y (30 chu kú) ,720C 8 phót; 40C.

S¶n phÈm PCR ®−îc khuÕch ®¹i nhê cÆp måi PHYAP1 – PHYAP2. S¶n phÈm PCR

nµy ®−îc g¾n trùc tiÕp vµo vector t¸ch dßng pCR 2.1 – Topo cña H·ng Invitrogen, sau ®ã

biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli chñng DH5α. Dßng plasmit t¸i tæ hîp ®−îc chän läc, tinh

s¹ch vµ gi¶i tr×nh tù gen.

ThiÕt kÕ plasmid vector chøa gene phy A

Tr×nh tù gene phy A m· ho¸ phytaza cña nÊm mèc cã chøa ®o¹n gene theo lý

thuyÕt dµi 1357 bp . Toµn bé gene phy A ®−îc ®−a vµo vector pCR2.1 t¹o vect¬ t¸i tæ

hîp ký hiÖu lµ pCRPA.

ThiÕt kÕ Vector biÓu hiÖn pPICzαPA mang gene phy A

Plasmid pCRPA ®−îc sö dông lµm khu«n ®Ó tæng hîp nªn vïng gene m· hãa phytaza nhê kü thuËt PCR víi hai cÆp måi 5’PA-EcoRI 5’ EcoRI – GGAATTCGTCACCTCCGGACTGGCAGTCC- 3’ vµ 5’ Not – AGCGGCCGCAGCAAAACACTCCGCCC – 3’ ®−îc thiÕt kÕ thªm ®iÓm c¾t cña çc enzym h¹n chÕ EcoRI vµ NotI.

S¶n phÈm PCR vµ vector pPICzα sau khi c¾t b»ng çc enzym h¹n chÕ EcoRI vµ

NotI ®−îc ghÐp nèi víi nhau t¹o nªn plasmid pPIC zαPA chøa gene phy A ®−îc c¾t kiÓm

tra b»ng çc enzyme h¹n chÕ.

BiÓu hiÖn protein t¸i tæ hîp trong nÊm men P. pastoris

P. pastoris X33 lµ chñng nÊm men ®−îc sö dông ®Ó biÓu hiÖn gene phy A.

Plasmid pPICzαPA ®−îc më vßng b»ng enzyme h¹n chÕ SacI (Biolabs), sau ®ã

®−îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo P. pastoris chñng X33 theo ph−¬ng ph¸p xung ®iÖn (GenePulser,

Bio-Rad). Çc thÓ biÕn n¹p ®−îc chän läc trªn m«i tr−êng YPDSZ (m«i tr−êng ®Çy ®ñ

chøa 100 µg/ml kh¸ng sinh Zeocin).

§Ó biÓu hiÖn gen phy A víi chñng P. pastoris t¸i tæ hîp, nÊm men ®−îc nu«i ë

®iÒu kiÖn l¾c æn nhiÖt (200 vßng/phót, 280C) trong m«i tr−êng BMGY (m«i tr−êng ®Çy ®ñ

víi nguån cacbon lµ 2% glycerin) trong kho¶ng thêi gian 16-18 giê. C¶m øng cho viÖc

89

biÓu hiÖn cña gen thùc hiÖn b»ng çch li t©m lo¹i bá m«i tr−êng BMGY råi hoµ cÆn tÕ bµo

vµo m«i tr−êng BMMY (m«i tr−êng c¶m øng víi nguån çcbon lµ 0,5% methanol) ®Ó cã

OD600 cña hçn dÞch tÕ bµo lµ 1. TiÕp tôc nu«i l¾c ë ®iÒu kiÖn ®· nªu trªn, Sau 24, 48 vµ 72

giê kÓ tõ khi c¶m øng, lÊy mÉu ®Ó kiÓm tra kh¶ n¨ng biÓu hiÖn cña gen. Sau mçi lÇn lÊy

mÉu, methanol ®−îc bæ sung ®Ó duy tr× nång ®é trong m«i tr−êng lµ 0,5%.

MÉu c¶m øng ®−îc ly t©m ®Ó lo¹i bá cÆn tÕ bµo. Protein ngo¹i bµo trong dÞch næi

®−îc kÕt tña b»ng trichloracetic acid (TCA). Protein t¸i tæ hîp ®−îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di

trªn gel polyacrylamid 12,5% (theo ph−¬ng ph¸p cña Laemmli , 1970).

Thö ho¹t tÝnh cña chñng nÊm men P. pastoris t¸i tæ hîp

Ly t©m 1ml dÞch nu«i cÊy trªn m«i tr−êng BMMY cã bæ sung phytat natri sau 3

ngµy cña chñng nÊm men P. pastoris t¸i tæ hîp vµ chñng nÊm men P. pastoris chuÈn ë

13000v/p trong 10 phót. Hót 600µl dÞch næi cña mçi chñng nhá vµo çc lç cã cïng kÝch

th−íc trªn m«i tr−êng LB ®Æc cã bæ sung phytat natri, ñ trong ë 370C qua ®ªm. Sau ®ã lÊy

ra quan s¸t, nÕu cã xuÊt hiÖn vßng ph©n gi¶i phytat natri quanh lç th¹ch ®iÒu ®ã chøng tá

r»ng chñng nÊm men P.pastoris t¸i tæ hîp ®· mang gen phyA

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. TUYỂN CHỌN BỘ CHỦNG GIỐNG VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH SINH

HỌC TỪ CÁC NGUỒN THIÊN NHIÊN PHỤC VỤ CHO ĐỀ TÀI

1.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG CORYNEBACTERIUM SINH AXIT AMIN L-LYSIN

1.1.1. Sự phân bố các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp L-lysin từ đất ở các

tỉnh miền Bắc Việt Nam

Đất là môi trường thuận lợi cho hầu hết các chủng vi sinh vật phát triển. Có thể nói

đất là cái nôi chính cho vi sinh vật sinh sản và phát triển. Vì thế chúng tôi tiến hành phân

lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp L-lysin từ đất ở các tỉnh miền Bắc Việt

Nam. Số chủng phân bố trong đất ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam được trình bày ở bảng 1.

Bảng 1. Sự phân bố của các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp L-lysin trong mẫu đất phân lập ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam

90

Địa điểm lấy mẫu

Số mẫu đất phân lập

Số chủng có khả năng sinh tổng hợp L-lysin

Tỷ lệ số chủng phân lập/số mẫu phân lập (%)

Hà Nội 190 30 15,78

Hải Phòng 48 20 41,66

Nam Định 64 22 34,37

Bắc Giang 60 0 0

Hưng Yên 66 20 30,30

Hải Dương 40 18 45,00

Nam Hà 30 26 26,67

Ninh Bình 64 22 34,37

Hà Tây 292 22 7,53

Thái Bình 54 20 37,03

Tổng số 908 200 22,02

Kết quả bảng 1 cho thấy, từ 908 mẫu đất phân lập từ các tỉnh miền Bắc Việt Nam,

chúng tôi đã phân lập được 200 chủng Corynebacterrium có khả năng sinh tổng hợp L-

lysin.

Kết quả cho thấy, tỷ lệ chủng vi khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh tổng hợp

L-lysin so với số chủng phân lập được là 200/908, chiếm 22,02%.

Các kết quả này cho thấy sự phân bố các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng

hợp L-lysin trong các mẫu đất ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam là khá cao, các chủng này

thường tập trung ở các vùng đất nông nghiệp tơi xốp, có độ thoáng khí cao, thích hợp cho

khả năng sinh tổng hợp L-lysin của chúng.

1.1.2. Tuyển chọn các chủng Corynebacterrium có khả năng sinh tổng hợp L-lysin

91

Chúng tôi đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp L-lysin của 200 chủng

Corynebacterrium phân lập được trên môi trường thích hợp D2. Kết quả được chỉ ra ở

bảng 2.

Bảng 2. Khả năng sinh L-lysin của các chủng Corynebacterrium phân lập

Tổng số chủng phân lập

Số chủng sinh L-lysin phân theo các mức (g/l)

1-2 3-9 10-12 13-15 200

160 16 16 8

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, từ 200 chủng Corynebacterrium có khả năng sinh tổng

hợp L-lysin, chúng tôi thu được 160 chủng có khả năng sinh tổng hợp L-lysin ở mức 1-

2g/l, 16 chủng có khả năng sinh tổng hợp L-lysin ở các mức 3-9g/l , 16 chủng có khả

năng sinh tổng hợp L-lysin ở mức 10-12g/l, 8 chủng có khả năng sinh tổng hợp L-lysin ở

các mức cao nhất , là từ 13 -15 g/l, trong đó có 2 chủng đạt mức 15 g/l.

1.1.3. Định loại C.glutamicum dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất sinh lý,

sinh hóa

Để định loại các chủng vi khuẩn, chúng tôi quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc,

kích thước tế bào, sự hình thành bào tử của 10 chủng vi khuẩn sinh L-lysin cao phân lập

từ các mẫu đất lấy ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.

Bảng 3. Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc, kích thước tế bào và bào tử của 10 chủng vi khuẩn C.glutamicum đã phân lập có khả năng sinh tổng hợp L-lysin cao

Ký hiệu chủng

Hình thái khuẩn lạc

Màu sắc

khuẩn

Hình dạng tế bào

Nhuộm Gram

Kích thước tế bào (µm)

Hình thành bào

tử

92

lạc

C.g 3600 Tròn, Trơn bóng

Vàng chanh

Trực khuẩn, phân nhánh

(+) 0,5 – 0,8 Không bào tử


Vàng chanh


(+) 0,6-0,9 Không bào tử

C.g 30 (26)

Tròn, Trơn bóng

Vàng chanh




Vàng chanh




Vàng chanh


(-) 0,8-1,2 Không bào tử

C.g 32 (1)

Tròn, Trơn bóng

Vàng chanh




Vàng chanh




Vàng chanh




Vàng chanh




Vàng chanh



Chúng tôi tiến hành phân loại các chủng Corynebacterrium glutamicum sinh L-

lysin dựa vào khóa phân loại của Bergey. Chúng tôi đã quan sát hình thái khuẩn lạc, kích

thước tế bào và bào tử của 10 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp L-lysin và nhận

thấy rằng, có 8 chủng có đặc điểm hình thái đặc trưng của loài C.glutamicum đó là các

chủng C.glutamicum 3600, C.glutamicum 30 (26), C.glutamicum 30, C.glutamicum 32

(1), C.glutamicum 137, C.glutamicum 36,C.glutamicum 335 , C.glutamicum 89.

1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh

tổng hợp L-lysin

93

Chúng tôi tiếp tục tiến hành các phản ứng sinh lý, sinh hóa với 8 chủng vi khuẩn

trên. Kết quả được trình bày ở bảng 4:

Bảng 4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng C.glutamicum phân lập có khả năng sinh tổng hợp L-lysin

Ký hiệu chủng

Hoạt tính

catalaza

Khả năng khử NO-

3 NO2

-

Lên men đường glucoza

Lên men đường lactoza

Khả năng

khử H2S

Khả năng

làm lỏng gelatin

C.g 89 + + + - - +

C.g 3600 + + + - - +

C.g 335 + + + - - +

C.g 30 (26) + + + - - +

C.g 32 (1) + + + - - +

C.g 30 + + + - - +

C.g 137 + + + - - +

C.g 36 + + + - - +

Chú thích: (+) Phản ứng dương tính

(-) Phản ứng âm tính.

Từ bảng 4 chúng tôi nhận thấy cả 8 chủng vi khuẩn trên đều có một số đặc điểm

hình thái và sinh lý, sinh hóa giống với các đặc điểm của C.glutamicum như đã miêu tả

trong khóa phân loại của Bergey.

1.2. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG CORYNEBACTERIUM

ACETOGLUTAMICUM SINH AXIT AMIN L-METHIONIN

1.2.1. Sự phân bố các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp L-methionin từ đất

ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam

Kết quả bảng 5 cho thấy, từ 908 mẫu đất phân lập từ các tỉnh miền Bắc Việt Nam,

chúng tôi phân lập được 26 chủng có khả năng sinh tổng hợp L-methionin. Các kết quả

này cho thấy sự phân bố các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp L- methionin

94

trong các mẫu đất ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam là rất thấp, tỷ lệ số chủng phân lập/số

mẫu phân lập là 2,86%.

Bảng 5. Sự phân bố của các chủng Corynebacterium có khả năng sinh tổng hợp L-methionin trong mẫu đất phân lập ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam

Địa điểm lấy mẫu

Số mẫu đất phân lập

Sô chủng có khả năng sinh L-

methionin

Tỷ lệ số chủng phân lập/số mẫu phân lập

(%) Hà Nội 190 5 2,63

Hải Phòng 48 2 4,16 Nam Định 64 3 4,68 Bắc Giang 60 0 0 Hưng Yên 66 2 3,03 Hải Dương 40 2 5,00

Nam Hà 30 4 13,33 Ninh Bình 64 3 4,68

Hà Tây 292 3 1,02 Thái Bình 54 2 3,70 Tổng số 908 26 2,86

1.2.2. Tuyển chọn các chủng Corynebacterium có khả năng sinh tổng hợp L-methionin cao

Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp L-methionin của các chủng

phân lập, nhằm tìm ra các chủng có khả năng sinh tổng hợp L-methionin cao. Kết quả

được thể hiện ở bảng 6.

Bảng 6. Khả năng sinh L-methionin của các chủng Corynebacterium Số chủng sinh L-methionin phân theo các mức (g/l) Tổng số chủng

phân lập 1-2 3-5 6-9 10-15

26 13 5 3 5

95

Kết quả ở bảng 6 cho thấy, từ 26 chủng Corynebacterium phân lập được, có 13

chủng có khả năng sinh tổng hợp L-methionin ở mức 1-2 g/l, 5 chủng có khả năng sinh

tổng hợp L-methionin ở các mức 3-5 g/l, 3 chủng cho sản lượng L-methionin đạt ở mức

6--9 g/l, 5 chủng đạt ở mức10--15g/l, trong đó có 1 chủng đạt mức 15g/l.

1.2.3. Định loại C.acetoglutamicum dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất sinh

lý, sinh hóa

Để định loại các chủng vi khuẩn C.acetoglutamicum sinh methionin theo khóa

phân loại của Bergey, chúng tôi quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, kích thước tế bào,

sự hình thành bào tử của 7 chủng vi khuẩn sinh L-methionin cao từ các mẫu đất lấy ở

một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.

96

Bảng 7. Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc, kích thước tế bào và bào tử của 7 chủng vi khuẩn C.acetoglutamicum phân lập có khả năng sinh tổng hợp

L-methionin cao

Ký hiệu chủng

Hình thái khuẩn lạc

Màu sắc

khuẩn lạc

Hình dạng tế bào

Nhuộm Gram

Kích thước tế bào (µm)

Hình thành bào tử

C.agB12 Tròn, Trơn bóng

Vàng xẫm


(+) 0,5 – 0,8 Không bào tử

C.agH1 Tròn, Trơn bóng

Vàng xẫm



C.ga309 Tròn, Trơn bóng

Vàng xẫm



C.ag12 Tròn, Trơn bóng

Vàng xẫm




Vàng xẫm




Vàng xẫm



C.agH4 Tròn, Trơn bóng

Vàng xẫm



Chúng tôi tiến hành phân loại các chủng Corynebacterrium acetoglutamicum sinh

L-methionin cao dựa vào khóa phân loại của Bergey. Chúng tôi đã quan sát hình thái

khuẩn lạc, kích thước tế bào và bào tử của 7 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp L-

methionin và nhận thấy rằng, có 7 chủng có đặc điểm hình thái đặc trưng của loài

C.acetoglutamicum đó là các chủng: C.agB12, C.agH1, C.ag309, C.ag12, C.ag21, C.ag34,

C.agH4.

97

Bảng 8 . Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng C.acetoglutamicum phân lập có khả năng sinh tổng hợp L-methionin cao

Ký hiệu chủng

Hoạt tính

catalaza

Khả năng khử NO-

3 NO2

-

Lên men đường glucoza

Lên men đường lactoza

Khả năng

khử H2S

Khẳ năng

làm lỏng gelatin

C.ag B12 + + + - - -

C.ag H1 + + + - - -

C.ag 309 + + + - - -

C.ag 12 + + + - - -

C.ag 21 + + + - - -

C.ag 34 + + + - - -

C.ag H4 + + + - - -

1.3. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG ASPERGILLUS NIGER CÓ KHẢ

NĂNG SINH TỔNG HỢP PHYTAZA

1.3.1. Phân lập các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp phytaza

Chúng tôi đã thu thập 111 mẫu đất và phân gà, trong đó có các 18 mẫu đất gần

chuồng trâu, bò, 13 mẫu đất gần chuông gà, 80 mẫu đất lấy từ phân gà từ các vùng lân cận

thuộc địa phận Hà Nội.

Chúng tôi đã tiến hành phân lập các chủng nấm mốc có khả năng sinh phytaza trên

môi trường phân lập chọn lọc Phy1. Dựa vào quá trình sàng lọc và lựa chọn khuẩn lạc có

vòng phân giải trên môi trường có chứa natri-phytat, chúng tôi đã chọn được một số

chủng có khả năng sinh phytaza.

98

1.3.2. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng h ợp phytaza cao

Bảng 9. Khả năng sinh tổng hợp phytaza của một số chủng A. niger phân lập từ đất và phân động vật

Tên mẫu Số lượng mẫu

Số chủng nấm mốc có khả năng phân giải natri-phytat

Đất gần chuồng trâu, bò 18 1 0 0

Đất gần chuồng gà 13 2 1 1

Phân gà 80 2 0 0

Tổng số 111 5 1 1

Kết quả phân lập được 7 chủng A. niger như trình bày ở bảng 9 bằng việc xác định

đường kính vòng phân giải natri-phytat của các chủng A. niger sau 3 ngày nuôi cấy đã cho

thấy những chủng A. niger có khả năng sinh phytaza tồn tại chủ yếu gần khu vực chuồng

gà cũng có nhiều trong phân gà. Trong 13 mẫu đất lấy gần chuồng gà đã phân lập được 4

chủng A. niger có khả năng sinh phytaza. Trong 80 mẫu phân gà cũng phân lập được 2

chủng A. niger có khả năng sinh phytaza. Trong 18 mẫu đất lấy ở gần chuồng trâu, bò

cũng cho 1 chủng A. niger có khả năng sinh phytaza. Hơn nữa sau khi thuần chủng A.

niger này ra đĩa petri lần thứ 2 thì hoạt tính của chủng cũng bị giảm đi, không còn thấy

vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc nữa. Từ đó chúng tôi kết luận rằng nguồn mẫu lấy

từ đất gần chuồng gà và phân gà cho kết quả phân lập khá tốt, nguồn mẫu lấy từ đất gần

chuồng trâu, bò cho kết quả phân lập không cao.

Điều này cũng phù hợp với kết luận của các nhà nghiên cứu cho rằng các động vật

ruột kết (lợn, gia cầm) không có khả năng sinh tổng hợp phytaza. Do vậy trong phân của

các động vật loại này chứa nhiều các loại hợp chất như axit phytic (hoặc muôi phytat) vì

vậy khả năng tồn tại các vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất này là rất nhiều.

Còn trong dạ dày động vật nhai lại như trâu, bò có hệ vi sinh vật có khả năng sinh

phytaza. Axit phytic hay muối của nó trong ruột những động vật này sẽ bị phân giải thành

những hợp chất đơn giản hơn và dễ tiêu hóa hơn như các myo-inositol, các gốc phosphat

và các muối khoáng. Chính vì vậy trong phân của trâu bò sẽ chứa rất ít các hợp chất axit

99

phytích (muối phytat) nên các vi sinh vật phân giải các hợp chất trên tồn tại ít hơn trong

nguồn mẫu này. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytaza của các

chủng phân lập bằng việc xác định đường kính vòng phân giải natri-phytat. Kết quả được

thể hiện ở bảng 10.

Bảng 10. Khả năng sinh tổng hợp của các chủng A. niger phân lập được

Số chủng nấm mốc có khả năng phân giải natri-phytat phân

theo các mức (cm đường kính vòng phân giải natri-phytat )

Tổng số

chủng nấm

mốc phân lập

được >4 >3 >2 >1

7 1 2 1 3

Trong số 7 chủng giống nấm mốc phân lập có khả năng sinh tổng hợp phytaza

được phân theo các mức khác nhau được chỉ ra ở bảng 10. Có 1 chủng có khả năng phân

giải natri phytat với đường kính phân giải lớn hơn 4 cm, có 2 chủng có khả năng phân giải

natri phytat với đường kính phân giải lớn hơn 3 cm, có 1chủng chủng có khả năng phân

giải natri phytat với đường kính phân giải lớn hơn 1 cm và có 3 chủng có khả năng phân

giải natri phytat thấp nhất, đường kính phân giải nhỏ hơn 1 cm.

1.4. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG A. NIGER CÓ KHẢ NĂNG SINH

TỔNG HỢP PECTINAZA CAO

1.4.1. Phân lập các chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp pectinaza

Chúng tôi đã thu thập 20 mẫu vỏ cam, 50 mẫu vỏ bưởi, 8 mẫu vỏ chanh, 20 mẫu

vỏ quýt từ các tỉnh khác nhau để phân lập các chủng nấm mốc A. niger sinh pectinaza trên

môi trường chọn lọc thạch pectin. Khả năng sinh pectinaza được đánh giá gián tiếp qua đường

kính vòng phân giải pectin. Kết quả thể hiện ở bảng 11.

100

Bảng 11. Khả năng sinh tổng hợp pectinaza của các chủng A. niger phân lập

Số chủng nấm mốc có đường kính vòng phân giải petin (cm) Nguồn

phân lập Số mẫu

phân lập

Số chủng nấm mốc phân lập được 0-2 2-4 4-6

Vỏ cam 20 11 8 2 1 Vỏ Bưởi 50 26 19 6 0 Vỏ chanh 8 6 5 0 2 Vỏ quýt 20 2 2 0 0 Tổng số 98 45 34 8 3

Kết quả ở bảng 11 cho thấy từ 98 mẫu thu thập được, chúng tôi đã phân lập được

45 chủng giống nấm mốc A. niger có hoạt tính sinh tổng hợp pectinaza ở các mức độ khác

nhau. Trong đó có 34 chủng cho đường kính vòng phân giải pectin từ 0-2 cm , 8 chủng

giống cho đường kính vòng phân giải từ 2-4 cm và 3 chủng cho đường kính vòng phân

giải cao nhất là 4-6cm.

Ảnh 1: Vòng phân giải pectinaza của chủng ĐL 1

101

1.5. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP MANNANAZA CAO

1.5.1. Phân lập các chủng vi sinh có khả năng sinh tổng hợp mannanaza cao

Chúng tôi đã thu thập 30 mẫu quả hỏng và 30 mẫu gỗ mục từ các tỉnh khác nhau

để phân lập chủng nấm mốc sinh mannanaza trên môi trường chọn lọc. Khả năng sinh

mannanaza được phân ra các mức khác nhau.Kết quả được thể hiện ở bảng 12.

Bảng 12. Khả năng sinh tổng hợp mannanaza của các chủng nấm mốc phân lập

Số chủng nấm mốc có khả năng sinh mannanaza (U/ml) Nguồn

phân lập Số mẫu

phân lập

Số chủng nấm mốc phân lập được 15-30 30-45

Qủa hỏng 30 13 3 1

Gỗ mục 30 8 6 1

Tổng số 60 21 9 2

45-60 0 1 1

Kết quả bảng 12 cho thấy từ 60 mẫu thu thập được chúng tôi đã phân lập được 21

chủng nấm mốc, trong đó có 13 chủng có hoạt tính sinh tổng hợp mannanaza ở các mức

độ khác nhau bao gồm: 9 chủng cho hoạt độ từ 15-30U/ml, 2 chủng cho hoạt độ từ 30-45

U/ml, 2 chủng cho hoạt độ từ 45-60U/ml, trong đó có 1 chủng đạt hoạt lực 58, 57 U/ml.

Bảng 13. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh mannanaza của các chủng nấm mốc phân lập

Hoạt lực mannanaza (U/ml) Thời gian (giờ) T1 Q1 0 - -

24 - - 48 1251 21,49 72 24,75 26,79 96 25,78 42,79 120 29,06 58,57 144 17,34 52,99 168 14,56 46,00

102

Kết quả ở bảng 13 cho thấy 2 chủng T1 và Q1 cho hoạt độ enzym cao nhất là

29,06 U/ml và 58,57 U/ml tại thời điểm nuôi cây là 120 giờ. Như vậy chúng tôi đã tuyển

chọn được chủng Q1 phân lập từ vỏ quýt hỏng cho hoạt độ enzym cao nhất đạt 58,57

U/ml. Chủng Q1 được đem định tên và xác định thuộc loài Aspergillus awamori và được

sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo với tên là A. awamori BK

1.6. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KHỬ TANNIN, CAFEIN TRÊN THỊT QUẢ CÀ PHÊ 1.6.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có khả năng khử caffein trên thịt quả cà phê Bảng 14. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có khả

năng khử caffein trên thịt quả cà phê

Khả năng khử caffein của mẫu thử

phân theo các mức (%) 0-30 30-50 50-60

Số chủng Lactobacillus platarum

trong mẫu thử có khả năng khử

caffein tương ứng

50 8 2

Tổng số chủng Lactobacillus

platarum phân lập được 60

Kết quả ở bảng 14 cho thấy, trong số 60 chủng Lactobacillus platarum phân lập từ

các mẫu dưa bắp cải và cải bẹ , có 2 chủng có khả năng khử cafein từ cao nhất, là 60%.

1.6.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng nâm mốc có khả năng khử caffein trên thịt quả cà phê

Kết quả phân lập cho thấy từ các mẫu đất trồng cà phê, thịt quả cà phê, thân cây cà

phê đã phân lập được 100 chủng nấm mốc chủ yếu thuộc các chi như: Aspergillus,

Trichoderma và Rhizopus.

103

Bảng 15. Khả năng khử caffein trong thịt quả cà phê của các chủng Aspergillus niger phân lập được

Khả năng khử caffein của mẫu thử phân theo các mức (%) 0-30 31-80 81-100

Số chủng Aspergillus niger trong mẫu thử có khả năng khử caffein

tương ứng 40 8 2

Tổng số chủng Aspergillus niger phân lập được 50

Kết quả bảng 15 cho thấy phần lớn tất cả các chủng nấm mốc phân lập đều có khả

năng khử caffein trong thịt quả cà phê, tuy nhiên khả năng khử caffein của các chủng là

khác nhau, trong số 50 chủng A. niger phân lập được có 40 chủng có khả năng khử

caffein từ 0% đến 305, 8 chủng có khả năng khử caffein từ 31% đến 80% và có 2 chủng

có khả năng khử caffein cao từ 81% đến 100% ký hiệu là A. niger VN12 và A. niger

ĐL1.

Bảng 16. Khả năng khử caffein trong thịt quả cà phê của chủng A. niger VN12 và

chủng A. niger DL 1 và chủng Neurospora sytophyla

Hiệu quả khử caffein (%) theo thời gian (ngày) Chủng nấm

2 3 4 5 6 7

A. niger VN 12 12 30 55 70 81 82

A. niger ĐL 1 14 35 59 72 85 85

N. sytophyla 15 34 60 73 87 87

Kết quả ở bảng 16 cho thấy hiệu quả khử caffein của các chủng A. niger VN12, A.

niger ĐL1 và N.sytophyla tăng dần theo thời gian xử lý và cao nhất sau 7 ngày đạt là

82%, 85%, 87% theo thứ tự. Theo kết quả nghiên cứu của Peraud-Gaime và S.rousos: cho

thấy từ 350 chủng nấm phân lập được từ cây cà phê, đất trồng cà phê, phế phụ phẩm cà

104

phê... có 2 chủng Penicillium và 6 chủng Aspergillus có khả năng khử caffein cao từ 90-

100%. S.roussos, Aquiahuatl, M.A và cộng sự cho biết: 272 chủng nấm hệ sợi đã phân lập

được từ đất trồng cà phê, lá cà phê...trong đó chủ yếu thuộc về các chi như Aspergillus,

Penicillium,Trichoderma và Fusarium nhưng chỉ có 5 chủng thuộc chi Aspergillusvà 2

chủng thuộc chi Penicillium có khả năng khử 100% caffein. Tuy nhiên, không có tác giả

nào công bố khả năng khử caffein từ . Trong nghiên cứu của chúng tôi, chủng N.

sytophyla có khả năng khử caffein trong thịt quả cà phê là 87% sau 7 ngày xử lý, cao hơn

so với 2 chủng A. niger VN12 và A. niger ĐL1.

1.6.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có khả năng khử tannin

Bảng 17. Khả năng khử tannin trong thịt quả cà phê của các chủng Bacillus subtilis phân lập được

Khả năng khử tannin của mẫu thử phân theo các mức (%) 0-30 31-80 81-100

Số chủng Bacillus subtilis trong mẫu thử có khả năng khử caffein tương ứng 9 18 4

Tổng số chủng Bacillus subtilis phân lập được 31

Khả năng khử tannin của các chủng B. subtilis được phân theo các mức: 0-30%,

31-80%, 81-100%. Kết quả ở bảng 17 cho thấy: từ 31 chủng B. subtilis phân lập được từ

đất và lá cây cà phê có 9 chủng B. subtilis có khả năng khử tannin dưới 30%, 18 chủng B.

subtilis có khả năng khử tannin từ 31-80% và 4 chủng B. subtilis có khả năng khử tannin

trên 80%. Chúng tôi lựa chọn chủng B. subtilis 61s có khả năng khử tannin cao nhất là

90,3% cho các nghiên cứu tiếp theo.

105

Bảng 18. Khả năng khử caffein và tannin trong thịt quả cà phê bằng Na(OH) và Ca(OH)2

Thời gian xử lý(giờ) Công thức xử lý Hiệu quả khử

caffein (%) Hiệu quả khử

tannin (%)

NaOH (17,5 g kg-1) 5 25,8

NaOH (35 g kg-1) 43,5 37,6

NaOH (70 g kg-1) 53 51,9

Ca(OH)2 (17,5 g kg-1) 0 15,3

Ca(OH)2 (35 g kg-1) 3 21,6

24

Ca(OH)2 (70 g kg-1) 22,4 34,2

NaOH (17,5 g kg-1) 5 27,4

NaOH (35 g kg-1) 46 39,5

NaOH (70 g kg-1) 55 53,6

Ca(OH)2 (17,5 g kg-1) 0 16,1

Ca(OH)2 (35 g kg-1) 5 21,9

48

Ca(OH)2 (70 g kg-1) 24 36,1

Kết quả ở bảng 18 cho thấy: Sau 24 giờ xử lý bằng NaOH với liều 17,5 g kg-1,35 g

kg-1 và 70 g kg-1, khả năng khử caffein theo thứ tự là 25,85%, 43,5% và 53%, khả năng

khử tannin theo thứ tự là 25,8%, 37,6% và 51,9%

Hiệu quả khử tannin trong thịt quả cà phê sau 24 giờ xử lý bằng Ca(OH)2 với liều

17,5 g kg-1,35 g kg-1 và 70 g kg-1, khả năng khử caffein theo thứ tự là 0%, 3% và 22,4%,

khả năng khử tannin theo thứ tự là 15,3%, 21,6% và 34,2%

Sau 48 giờ xử lý, khả năng khử caffein và tannin thay đổi không đáng kể so với 24

giờ xử lý

Kết quả này cho thấy hiệu quả khử tannin và caffein bằng các chủng vi sinh vật là

cao hơn so với khử bằng hóa chất, giá xử lý để khử tannin và caffein bằng con đường vi

sinh là rẻ hơn so với xử lý bằng hóa chất

106

Theo kết quả nghiên cứu của Juan B.Ulloa thì khả năng khử tannin trong thịt quả

cà phê sau 60 ngày xử lý bằng rỉ đường là 20%, rỉ đường không khử được caffein trong

thịt quả cà phê

Như vậy, trong các phương pháp xử lý các chất kháng dinh dưỡng (tannin, caffein)

trong thịt quả cà phê như xử lý bằng hóa chất (Na(OH), Ca(OH)2 , bằng rỉ đường, bằng

B.subtilis, A. niger, N.sytophla thì biện pháp xử lý tannin bằng B.subtilis và khử caffein

bằng A. niger, N.sytophla có hiệu quả cao nhất.

1.7. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS

PLANTARUM SINH AXIT LACTIC VÀ BACTERIOCIN ĐỂ LÊN MEN PHẾ PHỤ

PHẨM NÔNG SẢN VÀ THỦY HẢI SẢN LÀM THỨC ĂN GIA SÚC

1.7. 1. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic Từ 20 mẫu thực phẩm đã phân lập được 82 chủng vi khuẩn lactic phát triển trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3. Kết quả được ghi ở bảng 19.

Bảng 19. Kết quả phân lập vi khuẩn sinh axit lactic

Đường kính vòng trong (D-d, mm) Số chủng phân lập

Yếu (1-10) Trung bình (11-20) Mạnh (>21)

Tổng số 82 28 46 8

Tỷ lệ (%) 100 34,15 56,10 9,75

Kết quả sơ tuyển cho thấy trong số 82 chủng vi khuẩn sinh lactic có 34,15 % số

chủng sinh axit lactic ở mức độ yếu, 56,1% số chủng sinh axit lactic ở mức độ trung bình

và 9,75% số chủng sinh axit lactic mạnh. Chúng tôi đã xác định mức độ sinh axit lactic

của 8 chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic mạnh nhất, các chủng này được muôi

tĩnh trên môi trường MRS dịch thể ở 350C trong 56 giờ, sau đó tiến hành ly tâm dịch và

xác định hàm lượng axit lactic sinh ra.

107

Bảng 20. Khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic

Số TT Chủng vi khuẩn Hàm lượng axit (g/l)

1 L5 1,35

2 L12 2,52

3 L18 1,79

4 L23 1,65

5 L37 1,94

6 L45 2,23

7 L47 1,57

8 L49 2,41

Kết quả ở bảng 20 cho thấy trong số 8 chủng vi khuẩn lactic phân lập được có 3

chủng L12, L49, và L45 có khả năng sinh axit lactic mạnh nhất đạt 2,52 g/l, 2,41 g/l và

2,23g/l theo thứ tự. 4 chủng L18, L23, L37, và L47 cho sản lượng axit trung bình đạt 1,79

g/l, 1,65 g/l, 1,94 g/l và 1,57 g/l theo thứ tự. Chủng L5 có khả năng sinh axit lactic thấp

nhất chỉ đạt 1,35 g/l

Bảng 21. Khả năng sinh bacterioncin của các chủng vi khuẩn lactic

Lượng bacterioncin phân theo các mức (mg/l) Số chủng phân

lập 0 10-20 20-30 40-50

82 50 20 10 2

Kết quả ở bảng 21 cho thấy trong số 82 chủng phân lập được chỉ có 20 chủng có

khả năng sinh bacteriocin từ 10 đến 20 mg/l, 10 chủng có khả năng sinh bacteriocin từ 20-

30 mg/l và có 2 chủng có khả năng sinh bacteriocin từ 40-50 mg/l.

108

1.7.2 Định loại các chủng vi sinh vật phân lập được Để định loại các chủng vi khuẩn lactic dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh

hóa, chúng tôi tiến hành quan sát hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, nhuộm bào tử, xác định khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và xác định đặc điểm 2 chủng vi khuẩn L12 và L49. Dựa vào khóa phân loại của Bergey thì cả 2 chủng này thuộc chi Lactobacillus.

Hai chủng vi khuẩn này có khả năng hình thành axit mạnh trong quá trình lên men, là những chủng vi khuẩn ưa nhiệt phát triển ở nhiệt độ 320C-350C chịu được nồng độ NaCl từ 250/00 - 450/00, sử dụng nguồn C là rỉ đường, nguồn N là các phế phụ phẩm thủy hải sản. Đây là các đặc điểm quan trọng mà chủng vi khuẩn lactic L12 và vi khuẩn lactic L49 được lựa chọn.

Bảng 22. Đặc điểm hình thái và tính chất sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu

Đặc điểm Chủng vi khuẩn lactic L12 Chủng vi khuẩn lactic L49 Nguồn gốc phân lập Từ cá biển muối Từ rau cải muối dưa

Hình dạng tế bào Hình cầu sắp xếp dạng đôi hoặc chuỗi

Hình que, sắp xếp dạng chuỗi dài

Khuẩn lạc trên môi trường MRS

Hình tròn lồi 1,5-2,0 mm màu trắng đục, mép nhẵn

Hinh tròn mép nhăn = 1,0 – 1,2 mm , màu sữa.

Hoạt tính catalaza - - Nhuộm Gram + +

Khả năng hình thành axit trong môi trường lên men

Sau 24 giờ lên men pH =4.0

Sau 24 giờ lên men pH = 4,2-4,5

Sử dụng nguồn C Glucoza + + Sacaroza + + Lactoza + +

Rỉ đường + + Sử dụng nguồn N

Pepton + + Bột cá + +

Bột đậu tương + + Phế phụ phẩm hải sản + +

Nhiệt độ thích hợp lên men 320C - 350C 320C - 350C Khả năng chịu nồng độ NaCl 400/00 - 450/00 250/00 - 300/00

109

1.7. 3 Hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn lactic L12 và vi khuẩn lactic L49

Sử dụng những vi khuẩn kiểm định gây bệnh được lưu giữ tại phòng Công nghệ Vi

sinh- Viện Di truyền Nông nghiệp để kiểm tra hoạt tính đối kháng của dịch vi khuẩn

lactic L12 và vi khuẩn L49 sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 320C bằng phương pháp đục lỗ.

Kết quả được trình bày ở bảng 23.

Bảng 23: Hoạt tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn lactic L12

và vi khuẩn lactic L49

Hoạt tính ức chế kiểm định của chủng vi khuẩn lactic L12 và vi

khuẩn lactic L49 tr ên môi trường thạch thường sau 24h (D-d) cm

Chủng vi khuẩn lactic L12 Chủng vi khuẩn lactic L49

Chủng kiểm

định

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB

Salmonella 2,.7 2,8 2,7 2,73 2,2 2,1 2,3 2,16

Shigella 3,2 3,1 3,2 3,16 2,4 2,6 2,6 2,53

Escherichia

coli 2,8 2,6 2,9 2,73 2,0 2,2 2,1 2,10

Qua bảng 23 cho thấy các chủng vi khuẩn lactic L12 và L49 có khả năng ức chế

mạnh các vi khuẩn Salmonella, Shigella và E.coli là những vi khuẩn đường ruột nguy

hiểm đối với người và động vật.

2. SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT HIỆN ĐẠI TRONG CHỌN TẠO CÁC CHỦNG

GIỐNG VI SINH VẬT

2.1. Sử dụng kỹ thuật đột biến chọn tạo các chủng C. glutamicum sinh tổng hợp L-Lysin

110

Kết quả gây đột biến các chủng đột biến C. Glutamicum xử lý bằng

nitrosoguanidin và chọn lọc bằng S-aminoethyl-L-cystein(AEC).

Sau khi xử lý bằng nitrosoguanidin với nồng độ 0,01% và 0,05% để gây đột biến,

chúng tôi tiến hành phân lập các đột biến thể đề kháng với S-aminoethyl-L-cystein(AEC)

bằng cách tăng dần nồng độ AEC từ 0,1mg/ml đến 55mg/ml.

Bảng 24. Ảnh hưởng của nồng độ AEC đến số lượng khuẩn lạc của các đột biến thể đề kháng với AEC

Số lượng khuẩn lạc của các đột biến thể kháng với AEC/đĩa petri

Nồng độ AEC trong môi trường

nuôi cấy (mg/ml)

Thời gian nuôi

cấy(giờ) Xử lý với bằng

nitrosoguanidin nồng độ 0,01%

Xử lý với bằng nitrosoguanidin nồng độ

0,05%

0,1 24 48 72

Mọc nhiều, không thấy tạo khuẩn lạc vệ tinh


1 24 48 72

11 11 11

10 10 10

10 24 48 72

- 5 5

- 8 8

20 24 48 72

- 3 3

- 7 7

30 24 48 72

- - 3

- - 3

40 24 48 72

- - 3

- - 7

50

24 48 72 96

- - - 2

- - - 6

55

24 48 72 96

- - - -

- - - -

Ký hiệu:(-):chưa xuất hiện khuẩn lạc

111

Chúng tôi thấy rằng khi nồng độ AEC tăng lên thì thời gian xuất hiện khuẩn lạc

càng chậm và số lượng khuẩn lạc đề kháng với AEC giảm dần. Cùng với sự tăng nồng độ

AEC, số lượng khuẩn lạc thu được sau khi xử lý bằng nitrrosoguanidin nồng độ 0,05%

lớn hơn số lượng khuẩn lạc thu được sau khi xử lý bằng nitrrosoguanidin nồng độ 0,01%.

Tại nồng độ AEC bổ xung vào môi trường là 55mg/ml thì không thấy sự xuất hiện các

khuẩn lạc. Do vậy, các khuẩn lạc phân lập được ở nồng độ 50mg/ml sẽ được sử dụng cho

các nghiên cứu tiếp theo

2.1.1. Xác định các kiểu hình đột biến thu được của các đột biến thể

Bảng 25. Nhu cầu dinh dưỡng của các đột biến thể dị dưỡng và đề kháng với AEC ở nồng độ 50mg/ml

Sự phát triển trên các môi trường

Các đột biến thể

Thời gian nuôi cấy

(giờ)

Không bổ sung

amin

Bổ sung homoserin (threonin+ methionin)

Bổ sung threonin

Bổ sung methionin

CM11 24 72

- -

+ +

+ +

- -

CM12 24 72

- -

+ +

+ +

- -

CM21 24 72

- -

+ +

- -

- -

CM22 24 72

- -

+ +

+ +

- -

CM 23 24 72

- -

+ +

+ +

- -

CM24 24 72

- -

+ +

- -

- -

CM25 24 72

- -

+ +

- -

- -

CM26 24 72

- -

+ +

- -

- -

112

Để phân loại được các đột biến thể, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhu cầu dinh

dưỡng của các đột biến thể dị dưỡng. Chúng tôi đã sử dụng các đột biến thể phân lập

được trên môi trường NA có bổ sung AEC ở nồng độ 50mg/ml. Hai đột biến thể thu được

sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,01% được ký hiệu là CM11 và CM12. Sáu

đột biến thể phân lập được sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,05% được ký

hiệu là CM21, CM22, CM23, CM24, CM25, CM26.

Kết quả bảng 30 cho thấy sau khi xử lý chủng C.g 3600 tự nhiên bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,01% và 0,05% rồi chọn lọc bằng AEC với nồng độ 50mg/ml chúng tôi thu được kết quả như sau: - Chủng C.glutamicum 3600 tự nhiên xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0.01% chỉ

thu được các loại đột biến dị dưỡng với threonin bao gồm chủng CM11 và CM12. - Chủng C.glutamicum 3600 tự nhiên sau xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,05%

thu được 2 loại đột biến dị dưỡng là dị dưỡng với threonin gồm các đột biến thể CM22, CM23 và dị dưỡng với homoserin gồm các đột biến thể CM21, CM24, CM25, CM26.

2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ homoserin, threonin đến sự sinh tổng hợp L-lysin ở các chủng đột biến dị dưỡng 2.1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ threonin đến sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng với threonin

Để tìm được nồng độ threonin tối ưu cho sự sinh tổng hợp L-lysin ở đột biến thể dị dưỡng threonin chúng tôi tiến hành lên men 2 đột biến thể CM11 và CM12 trên môi trường L3 có bổ sung threonin với các nồng độ từ 0.1 mg/ml đến 1/0 mg/ml.

Bảng 26. Ảnh hưởng của nồng độ threonin lên sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng với threonin

Lượng L-lysin sinh tổng hợp (mg/ml) Nồng độ threonin bổ sung trong môi trường lên men

(mg/ml) Đột biến thể CM11 Đột biến thể CM12

0.1 1,5 1,4 0.2 9,0 9,2 0,3 9,6 9,4 0,4 9,9 10,0 0,5 10,5 10,7 0,6 10,6 10,8 0,7 11,0 11,2 0,8 12,0 11,8 0,9 7,0 7,3 1,0 2,0 2,6

113

Kết quả bảng 26 cho thấy nồng độ threonin thích hợp để L-lysin sinh tổng hợp tối

đa trong khoảng từ 0,2mg/ml đến 0,8mg/ml. Khi nồng độ này vượt quá 0,8mg/ml lượng

L-lysin sinh ra giảm rất nhanh. Hiện tượng này đặc trưng cho loài C.glutamicum.

2.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ threonin đến sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến

thể dị dưỡng với homoserin

Để tìm được nồng độ threonin tối ưu cho sinh tổng hợp L-lysin ở đột biến thể dị

dưỡng homoserin chúng tôi tiến hành lên men 2 đột biến thể CM24 và CM25 trên môi

trường L3 có bổ sung threonin với các nồng độ từ 0,1 mg/ml đến 1,0 mg/ml.

Bảng 27. Ảnh hưởng của nồng độ threonin lên sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng homoserin

Lượng L-lysin sinh tổng hợp (g/l) Nồng độ threonin bổ sung trong môi trường lên men (mg/ml) Đột biến thể CM24 Đột biến thể CM25

0,1 12,0 2,2

0,2 13,0 4,2

0,3 15,5 6,5

0,4 18,8 12,2

0,5 27,5 22,0

0,6 28,6 24,0

0,7 30,0 26,0

0,8 30,7 28,0

0,9 30,2 27,0

1,0 29,3 27,0

1,1 14,5 6,5

1,2 5,5 3,7

Kết quả bảng 27 cho thấy nồng độ threonin thích hợp để sinh tổng hợp L-lysin tối

đa là trong khoảng từ 0,5mg/ml đến 1,0mg/ml. Khi nồng độ threonin vượt quá 1,0

114

mg/ml, lượng L-lysin tạo ra giảm rất nhanh. Hiện tượng này là do threonin còn dư trong

môi trường lên men sẽ kết hợp với L-lysin để ức chế ngược trở lại enzym aspastokinase.

2.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ L-methionin đến sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng homoserin

Bảng 28. Ảnh hưởng của L-methionin đến sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng homoserin

Lượng L-lysin sinh tổng hợp (g/l) Nồng độ L-methionin bổ sung trong môi trường lên men (mg/ml) Đột biến thể CM24 Đột biến thể CM25

0,10 3,0 2,5

0,15 8,0 6,8

0,20 19,5 18,6

0,25 19,8 19,0

0,30 19,4 18,9

0,35 18,0 17,5

0,40 17,5 17,5

Kết quả bảng 28 cho thấy nồng độ L-methionin thích hợp để lượng L-lysin tích lũy

tối đa là trong khoảng từ 0,2 ml/ml đến 0,3 mg/ml. Ở nồng độ L-methionin thấp, sự phát

triển của các đột biến thể yếu kéo theo lượng L-lysin tạo ra sẽ giảm. Khi nồng độ L-

methionin vượt quá 0,3 mg/ml chúng tôi không thấy có sự ức chế trong quá trình tổng

hợp L-lysin.

2.1.2.4. Sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng với axit amin threonin,

homoserin

Các đột biến thể của mỗi nhóm đột biến dị dưỡng với homoserin và threonin trên

được xác định khả năng sinh tổng hợp L-lysin. Đột biến thể dị dưỡng với homoserin được

lên men trên môi trường L3 có bổ sung threonin với nồng độ là 0,8mg/ml và L-methionin

được bổ sung với nồng độ 0,25 mg/ml. Đột biến thể dị dưỡng với threonin được lên men

trên môi trường L3 có bổ sung threonin với nồng độ 0,8 mg/ml. Chủng tự nhiên

115

C.glutamicum 3600 được lên men trên môi trường L3 và không bổ sung các axit amin

nêu trên. Kết quả được trình bày ở bảng 29.

Bảng 29. Sự sinh tổng hợp L-lysin ở các thể dị dưỡng với axit amin threonin, homoserin

Chủng Nghiên cứu Kiểu hình Sản lượng L-lysin

(g/l)

C.g 3600 Chủng C. glutamicum tự nhiên 15

CM11 Dị dưỡng với threonin 28

CM24 Dị dưỡng với homoserin 30

Kết quả bảng 29 cho thấy, đột biến thể dị dưỡng với homoserin CM24 có khả năng

sinh tổng hợp L-lysin cao, sản lượng đạt 30 g/l. Đột biến thể dị dưỡng với threonin với

CM11 sinh tổng hợp được lượng L-lysin khá cao là 28 g/l. Trong khi đó chủng tự nhiên

C. glutamicum 3600 (không được xử lý bằng nitrosoguanidine) sản lượng được 15 g/l L-

lysin. Như vậy sau khi xử lý chủng C. glutamicum 3600 tự nhiên bằng nitrosoguanidine,

các đột biến thể dị dưỡng với homoserin đã sản sinh được lượng L-lysin cao gấp 2 lần so

với chủng C.glutamicum 3600 bố mẹ, các chủng dị dưỡng với threonin đã tích lũy được

lượng Lysin cao gấp 1, 86 lần so với chủng C. glutamicum 3600 tự nhiên.

2.2. Nâng cao sản lượng L-methionin bằng kỹ thuật đột biến nitroguanidine có chọn

lọc bằng L-methionin sulfoxide

2.2.1. Kết quả phân lập các đột biến thể C. acetoglutamicum xử lý bằng

nitrosoguonidine bằng chất đồng đẳng L-methionin sulfoxide

Sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1 % và 0,5 % để gây đột biến,

chúng tôi tiến hành phân lập các đột biến thể đề kháng với L-methionin sulfoxide bằng

cách tăng dần nồng độ L-methionin sulfoxide từ 0,1 mg/ml đến 100 mg/ml.

116

Bảng 30: Ảnh hưởng của nồng độ L-methionin sulfoxide đến số lượng

khuẩn lạc của các đột biến thể đề kháng với L-methionin sulfoxide

Số lượng khuẩn lạc đề kháng với L-methionin sulfoxide/đĩa petri Nồng độ L-methionin

sulfoxide trong môi trường nuôi cấy

(mg/ml)

Thời gian nuôi cấy

(giờ) Xử lý với

nitrosoguanidine nồng độ 0,1%

Xử lý với nitrosoguanidine nồng

độ 0,5%

0,1 24 48 72

Mọc nhiều, không thấy tạo khuẩn lạc vệ tinh.


1,0 24 48 72

14 14 14

12 12 12

10,0 24 48 72

- 6 6

- 9 9

20,0 24 48 72

- 4 4

- 8 8

40,0 24 48 72

- - 4

- - 4

60,0 24 48 72

- - 4

- - 3

80,0

24 48 72 96

- - - 2

- - - 6

100,0

24 48 72 96

- - - -

- - - -

Ký hiệu : - chưa xuất hiện khuẩn lạc.

117

Từ kết quả ở bảng 30 chúng tôi thấy rằng nồng độ L-methionin sulfoxide tăng lên

thì thời gian xuất hiện khuẩn lạc càng chậm và số lượng khuẩn lạc đề kháng với

methionin sulfoxide giảm dần. Cùng với sự tăng nồng độ methionin sulfoxide, số lượng

khuẩn lạc thu được sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1% lớn hơn số lượng

khuẩn lạc thu được sau khi xử lý bằng bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,5%. Tại nồng độ

methionin sulfoxide bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 100mg/ml không thấy sự xuất

hiện các khuẩn lạc. Do vậy, các khuẩn lạc phân lập được ở nồng độ methionin sulfoxide

50mg/ml sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 31. Nhu cầu dinh dưỡng của các đột biến thể dị dưỡng và đề kháng với methionin sulfoxide ở nồng độ 80mg/ml

Các đột biến thể

Thời gian nuôi cấy (giờ)

Không bổ sung axit

amin

bổ sung cystein

Bổ sung threonin

M1 24 72

- -

+ +

+ +

M2 24 72

- -

+ +

+ +

M3 24 72

- -

+ +

- -

M4 24 72

- -

+ +

+ +

M5 24 72

- -

+ +

+ +

M6 24 72

- -

+ +

- -

M7 24 72

- -

+ +

- -

M8 24 72

- -

+ +

- -

Để phân loại được các đột biến thể, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng của các đột biến thể dị dưỡng. Chúng tôi đã sử dụng các đột biến thể phân lập được trên môi trường MT3 có bổ sung methionin sulfoxide ở nồng độ 50mg/ml. Hai đột biến thể thu được sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1 % ký hiệu là M1 và

118

M2. Bốn đột biến thể phân lập được sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,5% được ký hiệu là M3, M4, M5, M6.

Kết quả bảng 31 cho thấy sau khi xử lý chủng C.acetoglutamicum 309 tự nhiên bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1% rồi chọn lọc bằng methionin sulfoxide nồng độ 50 mg/ml chúng tôi thu được kết quả như sau:

Chủng C.acetoglutamicum 309 tự nhiên xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1 % chỉ thu được các loại đột biến dị dưỡng với cystein bao gồm chủng M1 và M2. Chủng C.acetoglutamicum 309 tự nhiên xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,5 % thu được các loại đột biến dị dưỡng với threonin gồm các đột biến thể M3, M4, M5, M6. 2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cystein đến sự sinh tổng hợp L-methionin ở các đột biến thể dị dưỡng với cystein

Để tìm được nồng độ cystein tối ưu cho sự sinh tổng hợp L-methionin ở đột biến thể dị dưỡng cystein chúng tôi tiến hành lên men 2 đột biến thể M1 và M2 trên môi trường MT3 có bổ sung cystein với các nồng độ từ 0,1 đến 1,2mg/ml.

Kết quả ở bảng 32 cho thấy nồng độ cystein thích hợp cho sinh tổng hợp L-methionin tối đa là trong khoảng từ 0,9mg/ml đến 1,0mg/ml. Khi nồng độ cystein vượt quá 1,0 mg/ml thì lượng L-methionin sinh ra giảm rất nhanh. Bảng 32. Ảnh hưởng của nồng độ cystein lên sự sinh tổng hợp L-methionin ở các đột

biến thể dị dưỡng với cystein

Lượng L-methionin sinh tổng hợp (g/l) Nồng độ cystein bổ sung trong môi trường lên men

(mg/ml) Đột biến thể M1 Đột biến thể M2

0,1 1,5 1,4 0,2 9,0 9,2 0,3 12,0 12,4 0,4 16,0 15,8 0,5 18,5 17,9 0,6 21,0 20,6 0,7 22,8 22,2 0,8 25,2 24,8 0,9 26,6 26,1 1,0 28,4 28,0 1,1 26,4 26,3 1,2 24,2 24,0

119

2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ threonin đến sự sinh tổng hợp L-methionin ở các đột

biến thể dị dưỡng threonin

Để tìm được nồng độ threonin tối ưu cho sự sinh tổng hợp L-methionin ở đột biến

thể dị dưỡng threonin chúng tôi tiến hành lên men 2 đột biến thể M1 và M2 trên môi

trường MT3 có bổ sung threonin với các nồng độ từ 0,1 mg/ml đến 1,2 mg/ml.

Bảng 33. Ảnh hưởng của nồng độ threonin lên sự sinh tổng hợp L-methionin ở đột

biến thể dị dưỡng threonin

Lượng L-methionin sinh tổng hợp (g/l) Nồng độ threonin bổ sung trong môi trường lên men

(mg/ml) Đột biến thể M1 Đột biến thể M2

0,1 2,5 2,1

0,2 3,6 3,2

0,3 6,5 5,5

0,4 9,8 9,2

0,5 19,5 18,0

0,6 21,6 19,5

0,7 23,0 22,4

0,8 24,8 24,2

0,9 26,0 25,4

1,0 22,3 22,0

1,1 7,0 3,5

1,2 3,5 2,5

Kết quả ở bảng 33 cho thấy nồng độ threonin thích hợp để sinh tổng hợp L-

methionin tối đa là trong khoảng 0,6 mg/ml đến 1,0 mg/ml. Khi nồng độ threonin vượt

quá 1,0 mg/ml, lượng L-methionin tạo ra giảm rất nhanh. Hiện tượng này là do threonin

120

còn dư trong môi trường lên men sẽ kết hợp với L-methionin để ức chế ngược trở lại

enzym aspastokinaza.

2.2.4. Sự sinh tổng hợp L-methionin ở các đột biến thể dị dưỡng với axit amin

cystein và threonin

Các đột biến thể của mỗi nhóm đột biến thể dị dưỡng với cystein và threonin được

xác định khả năng sinh tổng hợp L-methionin. Đột biến thể dị dưỡng với cystein được lên

men trong môi trường MT3 có bổ sung cystein với nồng độ 1,0mg/ml. Đột biến thể dị

dưỡng với threonin được lên men trên môi trường MT3 có bổ sung threonin với nồng độ

0,9 mg/ml. Chủng tự nhiên C.acetoglutamicum 309 được lên men trên môi trường MT3

và không bổ sung các axit amin nêu trên. Kết quả được thể hiện ở bảng 34.

Bảng 34. Sự tổng hợp L-methionin ở đột biến thể dị dưỡng với cystein và threonin

Chủng nghiên cứu Kiểu hình L-methionin (g/l)

C.acetoglutamicum 309 Chủng C.acetoglutamicum 15

Đột biến thể M1 Dị dưỡng với cystein 30

Đột biến thể M2 Dị dưỡng với threonin 29

Kết quả ở bảng 34 cho thấy đột biến thể dị dưỡng với cystein M1 sinh tổng hợp

được một lượng L-methionin cao nhất là 28 g/l. Đột biến thể dị dưỡng với threonin M2

sinh tổng hợp được lượng L-methionin khá cao đạt 26 g/l. Trong khi đó chủng

C.acetoglutamicum 309 (không được xử lý bằng nitrosoguanidine) sản sinh được 15 g/l

L-methionin. Như vậy sau khi xử lý chủng C.acetoglutamicum 309 tự nhiên bằng

nitrosoguanidine, các đột biến thể dị dưỡng với cystein đã sản sinh được lượng L-

methionin cao gấp 2 lần so với chủng C.acetoglutamicum309 bố mẹ, các chủng dị dưỡng

với threonin đã tích lũy được lượng L-methionin gấp 1,93 lần so với chủng

c.acetoglutamicum 309 tự nhiên.

121

2.3. T¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù gen dihydrodipicolinate synthase (dap A)

tõ chñng C. glutamicum HN30 vµ CCM 3600(2)

Gen Dap A là gen mã hóa cho enzym dihydrodipicolinate synthase, biến đổi aspartat

semialdehyde thành dihydrodipicolinate ở điểm nhánh của quá trình trao đổi aspartat.

Việc tách dòng gen Dap A là cơ sở quan trọng trong việc tiến tới tạo chủng tái tổ hợp

nhằm nâng cao sản lượng L-lysin lysin. Chúng tôi đã tiến hành tách dòng gen Dap A từ

chủng C. glutamicum HN30 phân lập vµ CCM 3600(2) của Trung tâm giữ giống quốc gia

Cộng Hòa Séc.

2.3.1. KÕt qu¶ t¸ch ADN tæng sè:

Chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch ADN tæng sè theo ph−¬ng ph¸p ®· ®−îc tr×nh bµy ë phÇn

vËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p. S¶n phÈm t¸ch ADN tæng sè ®−îckiÓm tra trªn gel agaroza 1%.

Qua ¶nh 2 chóng t«i nhËn thÊy b¨ng ADN cña c¶ 7 chñng ®Òu râ vµ t−¬ng ®èi s¹ch.

Çc mÉu ®Òu cã tû sè A260/A280 ≥ 1,8. V× vËy cã thÓ sö dông cho çc giai ®o¹n tiÕp theo.

¶nh 2: KÕt qu¶ ®iÖn di ADN tæng sè trªn gel agaroza 1%

Chó thÝch:

1 2 3 4

122

Kªnh 1-5: ADN tæng sè cña chñng C. glutamicum HN89, C.glutamicumHN30

C. glutamicum N§24, C. glutamicum NH15, C. glutamicum NB32

2.3.2: . Nh©n b¶n gen Dap A cña chñng C. glutamicum HN30 vµ CCM 3600(2)

b»ng kü thuËt PCR

Dùa vµo tr×nh tù gen Dap A cña Bonnassie,S., Oreglia,J. and Sicard, A. M [10] ®·

®¨ng ký trong Ng©n hµng D÷ liÖu gen Quèc tÕ, chóng t«i sö dông phÇn mÒm PC/GENE ®Ó

thiÕt kÕ cÆp måi Dap AP8 vµ Dap AM4.

Chóng t«i tiÕn hµnh sö dông cÆp måi gåm hai ®o¹n måi Dap AP8 vµ Dap AM4 lµ:

Dap AP8 (5'-TGTGGCTTGGGCGATTGTTATGC-3') vµ

DapAM4(5'-ATTGTCGTTTCCGGCGGTCTCAGC-3')

KÕt qu¶ ë ¶nh 3 cho thÊy: s¶n phÈm PCR thu ®−îcrÊt ®Æc hiÖu. S¶n phÈm PCR cña

chñng C. glutamicum ph©n lËp ®Æc hiÖu vµo kho¶ng 1341 bp theo lý thuyÕt gièng víi s¶n

phÈm PCR cña chñng C. glutamicum CCM 3600(2) chuÈn cña Céng hßa SÐc. Nh vËy

chñng C. glutamicum ph©n lËp ký hiÖu HN30 ®· mang gen Dap A.

¶nh 3: §iÖn di trªn gel agaroza 1% kiÓm tra s¶n phÈm PCR cña chñng HN30 C. glutamicum ph©n lËp vµ chñng C. glutamicum CCM 3600(2) cña Céng hßa SÐc

Chó thÝch: Kªnh 1: ChØ thÞ ph©n tö (ADN λ c¾t b»ng Hind III vµ EcoR I) tõ

trªn xuèng (21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp).

1 2 3

1341b

123

Kªnh 2: chñng HN30 C. glutamicum ph©n lËp. Kªnh 3: chñng chuÈn C. glutamicum CCM

cña Céng hßa SÐc.

2.3.3.T¸ch dßng gen Dap A

§o¹n gen Dap A ®−îcghÐp nèi víi vect¬ t¸ch dßng pCRTM 2.1. S¶n phÈm cña qu¸

tr×nh ghÐp nèi ®−îcbiÕn n¹p vµo tÕ bµo E.Coli DH5α , sau ®ã tÕ bµo biÕn n¹p ®−îctr¶i trªn

m«i trêng LB chän läc cã bæ sung Ampicillin + IPTG+ X-gal vµ ñ ë 370C qua ®ªm.

Plasmid ®−îct¸ch chiÕt tõ vi khuÈn theo ph¬ng ph¸p Minipreps.

§Ó chän läc çc dßng tÕ bµo chøa plasmit cã ®Ýnh ®o¹n ADN ngo¹i lai ®Æc hiÖu

cña gen Dap A, chóng t«i lÊy ngÉu nhiªn ë mÉu biÕn n¹p 11 khuÈn l¹c riªng rÏ mµu tr¾ng vµ 1

khuÈn l¹c mµu xanh lµ ®èi chøng ®Ó t¸ch chiÕt plasmit . KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë ¶nh 4.

¶nh 4: §iÖn di trªn gel agaroza 1% ®Ó chän çc plasmid t¸i tæ hîp mang gen Dap A. 1-11:

Plasmid t¸ch tõ çc khuÈn l¹c tr¾ng. X: Plasmid t¸ch tõ çc khuÈn l¹c xanh.

Tõ 4 plasmid cã kh¶ n¨ng mang gen DapA (t¸ch tõ çc dßng sè 1, 6, 7, 9, 11)

chóng t«i ®· tiÕn hµnh c¾t b»ng enzym giíi h¹n EcoR I, khi c¾t b»ng enzym nµy ®o¹n

AND ngo¹i lai sÏ ®−îct¸ch ra khái vect¬.

KÕt qu¶ ë ¶nh 5 cho thÊy ®o¹n AND t¸ch ra khái vect¬ t¸ch tõ çc dßng1, 6 vµ 9 cã

®é dµi t−¬ng øng víi gen m· hãa cho Dap A theo lý thuyÕt lµ 1341 bp. Nh− vËy trong sè

124

çc khuÈn l¹c ®−îckiÓm tra, chóng t«i chän ®−îc4 dßng cã ®Ýnh s¶n phÈm PCR ®Æc hiÖu

cã kh¶ n¨ng mang gen Dap A ®Ó ®äc tr×nh tù.

Chó thÝch: 1, 6, 7, 9: Plasmid c¾t b»ng EcoR I. PCR: S¶n phÈm PCR ®o¹n ADN

®Æc hiÖu gen cña Dap A. M: ChØ thÞ ph©n tö (ADN λ c¾t b»ng Hind III vµ EcoR I , tõ trªn

xuèng 21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp).

2.3.4. X¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap a tõ chñng C. glutamicum

HN 30 ph©n lËp ë ViÖt Nam.

§Ó cã thÓ kh¼ng ®Þnh ®o¹n ADN ®· t¸ch dßng ®óng lµ ®o¹n ®Æc hiÖu cña gen Dap

A, chóng t«i tiÕn hµnh nu«i lîng lín, t¸ch plassmid, tinh s¹ch, sö dông hai måi xu«i vµ

ngîc cã vÞ trÝ b¸m ®Æc hiÖu trong vect¬ pCR®2.1 vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù theo ph¬ng ph¸p

tæng hîp cña Sanger vµ céng sù víi bé kit x¸c ®Þnh tr×nh tù BigDye Terminator 3.1 t¹i

ViÖn C«ng nghÖ sinh häc - Trung t©m Khoa häc tù nhiªn vµ C«ng nghÖ Quèc gia.

X¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A .

Gtcgacggat cgcaaatggc aacaagcccg tatgtcatgg acttttaacg caaagctcac 60

acccacgagc taaaaattca tatagttaag acaacatttt tggctgtaaa agacagccgt 120

aaaaacctct tgctcgtgtc aattgttctt atcggaatgt ggcttgggcg attgttatgc 180

aaaagttgtt aggttttttg cggggttgtt taacccccaa atgagggaag aaggtaacct 240

tgaactctat gagcacaggt ttaacagcta agaccggagt agagcacttc ggcaccgttg 300

gagtagcaat ggttactcca ttcacggaat ccggagacat cgatatcgct gctggccgcg 360

¶nh 5: §iÖn di trªn gel agaroza 1% ®Ó kiÓm tra çc plasmid t¸i tæ hîp mang s¶n phÈm PCR ®Æc hiÖu cña gen Dap A c¾t b»ng EcoR I.

125

aagtcgcggc ttatttggtt gataagggct tggattcttt ggttctcgcg ggcaccactg 420

gtgaatcccc aacgacaacc gccgctgaaa aactagaact gctcaaggcc gttcgtgagg 480

aagttgggga tcgggcgaag ctcatcgccg gtgtcggaac caacaacacg cggacatctg 540

tggaacttgc ggaagctgct gcttctgctg gcgcagacgg ccttttagtt gtaactcctt 600

attactccaa gccgagccaa gagggattgc tggcgcactt cggtgcaatt gctgcagcaa 660

cagaggttcc aatttgtctc tatgacattc ctggtcggtc aggtattcca attgagtctg 720

ataccatgag acgcctgagt gaattaccta cgattttggc ggtcaaggac gccaagggtg 780

acctcgttgc agccacgtca ttgatcaaag aaacgggact tgcctggtat tcaggcgatg 840

acccactaaa ccttgtttgg cttgctttgg gcggatcagg tttcatttcc gtaattggac 900

atgcagcccc cacagcatta cgtgagttgt acacaagctt cgaggaaggc gacctcgtcc 960

gtgcgcggga aatcaacgcc aaactatcac cgctggtagc tgcccaaggt cgcttgggtg 1020

gagtcagctt ggcaaaagct gcttcgcgtc tgcagggcat caacgtagga gatcctcgac 1080

ttccaattat ggctccaaat gagcaggaac ttgaggctct ccgagaagac atgaaaaaag 1140

ctggagttct ataaatatga atgattcccg aaatcgcggc cggaaggtta cccgcaaggc 1200

ggcccaccag aagctggtca ggaaaaccat ctggataccc ctgtctttca ggcaccagat 1260

gcttcctcta accagagcgc tgtaaaagct gagaccgccg gaaacgacaa tcgggatgct 1320

gcgcaaggtg ctcaaggatc c 1341

Tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A t¸ch dßng tõ chñng C.

glutamicum ph©n lËp, ®o¹n ADN nµy dµi 1341 cÆp baz¬.

KÕt qu¶ Tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A t¸ch dßng tõ chñng C.

glutamicum ph©n lËp, ®o¹n ADN nµy dµi 1341 cÆp baz¬ cho thÊy: tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc

hiÖu cña gen Dap A t¸ch dßng tõ chñng C. glutamicum HN 30 ®−îcx¸c ®Þnh cã chiÒu dµi

1341 cÆp baz¬ bao gåm sè lîng çc nucleotit nh sau: 340 A, 329 C, 358 G, 314 T ®·

®−îc®¨ng ký trong Ng©n hµng D÷ liÖu Gen Quèc tÕ víi sè ®¨ng ký AJ584662.

So s¸nh tr×nh tù nucleotit ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen dap A tõ chñng ph©n lËp ë ViÖt

Nam víi tr×nh tù cña thÕ giíi ®∙ c«ng bè

Chóng t«i ®· tiÕn hµnh so s¸nh víi tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A ®·

®−îcBonnassie vµ çc céng sù [10] c«ng bè n¨m 1990 trong Ng©n hµng d÷ liÖu gen Quèc

tÕ m· sè X53993. KÕt qu¶ ®−îcthÓ hiÖn nh− sau .

DAPAVN - GTCGACGGATCGCAAATGGCAACAAGCCCGTATGTCATGGACTTTTAACG -50 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

DAPAFR - GTCGACGGATCGCAAATGGCAACAAGCCCGTATGTCATGGACTTTTAACG -50 DAPAVN - CAAAGCTCACACCCACGAGCTAAAAATTCATATAGTTAAGACAACATTTT -100

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CAAAGCTCACACCCACGAGCTAAAAATTCATATAGTTAAGACAACATTTT -100

126

DAPAVN - TGGCTGTAAAAGACAGCCGTAAAAACCTCTTGCTCGTGTCAATTGTTCTT -150 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

DAPAFR - TGGCTGTAAAAGACAGCCGTAAAAACCTCTTGCTCGTGTCAATTGTTCTT -150 DAPAVN - ATCGGAATGTGGCTTGGGCGATTGTTATGCAAAAGTTGTTAGGTTTTTTG -200

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - ATCGGAATGTGGCTTGGGCGATTGTTATGCAAAAGTTGTTAGGTTTTTTG -200 DAPAVN - CGGGGTTGTTTAACCCCCAAATGAGGGAAGAAGGTAACCTTGAACTCTAT -250

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CGGGGTTGTTTAACCCCCAAATGAGGGAAGAAGGTAACCTTGAACTCTAT -250 DAPAVN - GAGCACAGGTTTAACAGCTAAGACCGGAGTAGAGCACTTCGGCACCGTTG -300

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GAGCACAGGTTTAACAGCTAAGACCGGAGTAGAGCACTTCGGCACCGTTG -300 DAPAVN - GAGTAGCAATGGTTACTCCATTCACGGAATCCGGAGACATCGATATCGCT -350

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GAGTAGCAATGGTTACTCCATTCACGGAATCCGGAGACATCGATATCGCT -350 DAPAVN - GCTGGCCGCGAAGTCGCGGCTTATTTGGTTGATAAGGGCTTGGATTCTTT -400

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GCTGGCCGCGAAGTCGCGGCTTATTTGGTTGATAAGGGCTTGGATTCTTT -400 DAPAVN - GGTTCTCGCGGGCACCACTGGTGAATCCCCAACGACAACCGCCGCTGAAA -450

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GGTTCTCGCGGGCACCACTGGTGAATCCCCAACGACAACCGCCGCTGAAA -450 DAPAVN - AACTAGAACTGCTCAAGGCCGTTCGTGAGGAAGTTGGGGATCGGGCGAAG -500

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - AACTAGAACTGCTCAAGGCCGTTCGTGAGGAAGTTGGGGATCGGGCGAAG -500 DAPAVN - CTCATCGCCGGTGTCGGAACCAACAACACGCGGACATCTGTGGAACTTGC -550

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CTCATCGCCGGTGTCGGAACCAACAACACGCGGACATCTGTGGAACTTGC -550 DAPAVN - GGAAGCTGCTGCTTCTGCTGGCGCAGACGGCCTTTTAGTTGTAACTCCTT -600

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GGAAGCTGCTGCTTCTGCTGGCGCAGACGGCCTTTTAGTTGTAACTCCTT -600 DAPAVN - ATTACTCCAAGCCGAGCCAAGAGGGATTGCTGGCGCACTTCGGTGCAATT -650

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - ATTACTCCAAGCCGAGCCAAGAGGGATTGCTGGCGCACTTCGGTGCAATT -650 DAPAVN - GCTGCAGCAACAGAGGTTCCAATTTGTCTCTATGACATTCCTGGTCGGTC -700

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GCTGCAGCAACAGAGGTTCCAATTTGTCTCTATGACATTCCTGGTCGGTC -700 DAPAVN - AGGTATTCCAATTGAGTCTGATACCATGAGACGCCTGAGTGAATTACCTA -750

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - AGGTATTCCAATTGAGTCTGATACCATGAGACGCCTGAGTGAATTACCTA -750 DAPAVN - CGATTTTGGCGGTCAAGGACGCCAAGGGTGACCTCGTTGCAGCCACGTCA -800

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CGATTTTGGCGGTCAAGGACGCCAAGGGTGACCTCGTTGCAGCCACGTCA -800 DAPAVN - TTGATCAAAGAAACGGGACTTGCCTGGTATTCAGGCGATGACCCACTAAA -850

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - TTGATCAAAGAAACGGGACTTGCCTGGTATTCAGGCGATGACCCACTAAA -850 DAPAVN - CCTTGTTTGGCTTGCTTTGGGCGGATCAGGTTTCATTTCCGTAATTGGAC -900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CCTTGTTTGGCTTGCTTTGGGCGGATCAGGTTTCATTTCCGTAATTGGAC -900 DAPAVN - ATGCAGCCCCCACAGCATTACGTGAGTTGTACACAAGCTTCGAGGAAGGC -950

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - ATGCAGCCCCCACAGCATTACGTGAGTTGTACACAAGCTTCGAGGAAGGC -950 DAPAVN - GACCTCGTCCGTGCGCGGGAAATCAACGCCAAACTATCACCGCTGGTAGC -1000

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GACCTCGTCCGTGCGCGGGAAATCAACGCCAAACTATCACCGCTGGTAGC -1000 DAPAVN - TGCCCAAGGTCGCTTGGGTGGAGTCAGCTTGGCAAAAGCTGCTTCGCGTC -1050

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - TGCCCAAGGTCGCTTGGGTGGAGTCAGCTTGGCAAAAGCTGCTTCGCGTC -1050

127

DAPAVN - TGCAGGGCATCAACGTAGGAGATCCTCGACTTCCAATTATGGCTCCAAAT -1100 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

DAPAFR - TGCAGGGCATCAACGTAGGAGATCCTCGACTTCCAATTATGGCTCCAAAT -1100 DAPAVN - GAGCAGGAACTTGAGGCTCTCCGAGAAGACATGAAAAAAGCTGGAGTTCT -1150

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GAGCAGGAACTTGAGGCTCTCCGAGAAGACATGAAAAAAGCTGGAGTTCT -1150 DAPAVN - ATAAATATGAATGATTCCCGAAATCGCGGCCGGAAGGTTACCCGCAAGGC -1200

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - ATAAATATGAATGATTCCCGAAATCGCGGCCGGAAGGTTACCCGCAAGGC -1200 DAPAVN - GGCCCACCAGAAGCTGGTCAGGAAAACCATCTGGATACCCCTGTCTTTCA -1250

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GGCCCACCAGAAGCTGGTCAGGAAAACCATCTGGATACCCCTGTCTTTCA -1250 DAPAVN - GGCACCAGATGCTTCCTCTAACCAGAGCGCTGTAAAAGCTGAGACCGCCG -1300

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GGCACCAGATGCTTCCTCTAACCAGAGCGCTGTAAAAGCTGAGACCGCCG -1300 DAPAVN - GAAACGACAATCGGGATGCTGCGCAAGGTGCTCAAGGATCC -1341

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GAAACGACAATCGGGATGCTGCGCAAGGTGCTCAAGGATCC -1341

So s¸nh tr×nh tù nucleotit gi÷a ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A tõ chñng C.

glutamicum HN30 ph©n lËp ë ViÖt Nam vµ ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A do

Bonnassie vµ céng sù c«ng bè trong Ng©n hµng d÷ liÖu gen Quèc tÕ .

Tõ kÕt qu¶ cho thÊy tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A t¸ch dßng tõ chñng C.

glutamicum HN30 ph©n lËp cña ViÖt Nam cã ®é t¬ng ®ång cao so víi ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña

gen Dap A do Bonnassie vµ çc céng sù c«ng bè. §é t−¬ng ®ång ®¹t 100%.

KÕt qu¶ dÞch m· ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap a.

Chóng t«i còng ®· tiÕn hµnh dÞch m· ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A sang

protein nhê ch−¬ng tr×nh phÇn mÒm PC/Gene.

250 260 270 280 290 300 | | | | | | ATGAGCACAGGTTTAACAGCTAAGACCGGAGTAGAGCACTTCGGCACCGTTGGAGTAGCA METSerThrGlyLeuThrAlaLysThrGlyValGluHisPheGlyThrValGlyValAla 310 320 330 340 350 360 | | | | | | ATGGTTACTCCATTCACGGAATCCGGAGACATCGATATCGCTGCTGGCCGCGAAGTCGCG METValThrProPheThrGluSerGlyAspIleAspIleAlaAlaGlyArgGluValAla

128

370 380 390 400 410 420 | | | | | | GCTTATTTGGTTGATAAGGGCTTGGATTCTTTGGTTCTCGCGGGCACCACTGGTGAATCC AlaTyrLeuValAspLysGlyLeuAspSerLeuValLeuAlaGlyThrThrGlyGluSer 430 440 450 460 470 480 | | | | | | CCAACGACAACCGCCGCTGAAAAACTAGAACTGCTCAAGGCCGTTCGTGAGGAAGTTGGG ProThrThrThrAlaAlaGluLysLeuGluLeuLeuLysAlaValArgGluGluValGly 490 500 510 520 530 540 | | | | | | GATCGGGCGAAGCTCATCGCCGGTGTCGGAACCAACAACACGCGGACATCTGTGGAACTT AspArgAlaLysLeuIleAlaGlyValGlyThrAsnAsnThrArgThrSerValGluLeu 550 560 570 580 590 600 | | | | | | GCGGAAGCTGCTGCTTCTGCTGGCGCAGACGGCCTTTTAGTTGTAACTCCTTATTACTCC AlaGluAlaAlaAlaSerAlaGlyAlaAspGlyLeuLeuValValThrProTyrTyrSer 610 620 630 640 650 660 | | | | | | AAGCCGAGCCAAGAGGGATTGCTGGCGCACTTCGGTGCAATTGCTGCAGCAACAGAGGTT LysProSerGlnGluGlyLeuLeuAlaHisPheGlyAlaIleAlaAlaAlaThrGluVal 670 680 690 700 710 720 | | | | | | CCAATTTGTCTCTATGACATTCCTGGTCGGTCAGGTATTCCAATTGAGTCTGATACCATG ProIleCysLeuTyrAspIleProGlyArgSerGlyIleProIleGluSerAspThrMET 730 740 750 760 770 780 | | | | | | AGACGCCTGAGTGAATTACCTACGATTTTGGCGGTCAAGGACGCCAAGGGTGACCTCGTT ArgArgLeuSerGluLeuProThrIleLeuAlaValLysAspAlaLysGlyAspLeuVal 790 800 810 820 830 840

129

| | | | | | GCAGCCACGTCATTGATCAAAGAAACGGGACTTGCCTGGTATTCAGGCGATGACCCACTA AlaAlaThrSerLeuIleLysGluThrGlyLeuAlaTrpTyrSerGlyAspAspProLeu 850 860 870 880 890 900 | | | | | | AACCTTGTTTGGCTTGCTTTGGGCGGATCAGGTTTCATTTCCGTAATTGGACATGCAGCC AsnLeuValTrpLeuAlaLeuGlyGlySerGlyPheIleSerValIleGlyHisAlaAla 910 920 930 940 950 960 | | | | | | CCCACAGCATTACGTGAGTTGTACACAAGCTTCGAGGAAGGCGACCTCGTCCGTGCGCGG ProThrAlaLeuArgGluLeuTyrThrSerPheGluGluGlyAspLeuValArgAlaArg 970 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | GAAATCAACGCCAAACTATCACCGCTGGTAGCTGCCCAAGGTCGCTTGGGTGGAGTCAGC GluIleAsnAlaLysLeuSerProLeuValAlaAlaGlnGlyArgLeuGlyGlyValSer 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | TTGGCAAAAGCTGCTTCGCGTCTGCAGGGCATCAACGTAGGAGATCCTCGACTTCCAATT LeuAlaLysAlaAlaSerArgLeuGlnGlyIleAsnValGlyAspProArgLeuProIle 1090 1100 1110 1120 1130 1140 | | | | | | ATGGCTCCAAATGAGCAGGAACTTGAGGCTCTCCGAGAAGACATGAAAAAAGCTGGAGTT METAlaProAsnGluGlnGluLeuGluAlaLeuArgGluAspMETLysLysAlaGlyVal 1150 | CTA Leu

130

Tr×nh tù çc axit amin ®−îcdÞch m· tõ ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A t¸ch

dßng tõ chñng C. glutamicum HN30 ph©n lËp ë ViÖt nam.

KÕt qu¶ cho ta thÊy ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A nµy cã thÓ dÞch th«ng sang

mét ®o¹n protein cã chiÒu dµi 301 axit amin.

5 10 15 20 25 30 | | | | | |

1 M S T G L T A K T G V E H F G T V G V A M V T P F T E S G D31 I D I A A G R E V A A Y L V D K G L D S L V L A G T T G E S61 P T T T A A E K L E L L K A V R E E V G D R A K L I A G V G91 T N N T R T S V E L A E A A A S A G A D G L L V V T P Y Y S

121 K P S Q E G L L A H F G A I A A A T E V P I C L Y D I P G R151 S G I P I E S D T M R R L S E L P T I L A V K D A K G D L V181 A A T S L I K E T G L A W Y S G D D P L N L V W L A L G G S 211 G F I S V I G H A A P T A L R E L Y T S F E E G D L V R A R 241 E I N A K LS P L V A A Q G R L G G V S L A K A A S R L Q G271 I N V G D P R LP I M A P N E Q E L E A L R E D M K K A G V301 L

Tr×nh tù axit amin cña gen m· ho¸ DapA cña HN 30

Thµnh phÇn axit amin:

42 A 1 C 3 H 5 M 22 T

14 R 4 Q 15 I 5 F 2 W

6 N 23 E 37 L 14 P 6 Y

15 D 32 G 13 K 19 S 23 V

Tr×nh tù protein cña gen m· ho¸ DapA HN 30 bao gåm 301 axit amin vµ cã träng

l−îng ph©n tö 31235 kDa.

2.4. Tách dòng gen Met A từ vi khuẩn C.acetoglutamicum H1

Gen Met A là gen mã hóa cho enzym homoserin acetyltransferase, là enzym đầu

tiên trong con đường sinh tổng hợp methionin. Việc tách dòng gen met A là cơ sở quan

131

trọng trong việc tiến tới tạo chủng tái tổ hợp nhằm nâng cao sản lượng methionin. Chúng

tôi đã tiến hành tách dòng gen Met A từ chủng C. acetoglutamicum H1.

Kết quả tách ADN tổng số:

Chúng tôi tiến hành tách ADN tổng số theo phương pháp đã trình bày ở phần vật

liệu và phương pháp. Sản phẩm tách ADN tổng số được kiểm tra trên gel agaroza 1% thu

được kết quả như trên ảnh 6.

Ảnh 6 . Điện di đồ các mẫu ADN tổng số tách từ chủng C.acetoglutamicum H1.

Chú thích: Kênh 1,2,3,4: ADN tổng số tách từ chủng C.acetoglutamicum H1

Qua ảnh điện di ở ảnh 6 chúng tôi nhận thấy 4 mẫu ADN tổng số tách được từ

chủng C.acetoglutamicum H1 đều có một dải băng sáng tập trung rõ nétở phía trên bản

gel, không có các vạch phụ, các mẫu ADN tách được là nguyên vẹn và ít bị đứt gãy, đảm

bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.

132

Nhân bản đoạn ADN đặc hiệu gen metA của chủng phân lập bằng phản

ứng PCR

Để nhân gen metA mã hóa cho homoserin acetyltransferase bằng phản ứng PCR

đòi hỏi có đầy đủ các yếu tố: Khuôn ADN, cặp mồi, ADN-polymeraza, các dATP và

dung dịch đệm.

Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi hser P15, hserM9 để nhân bản đoạn ADN chứa gen

metA bằng ký thuật PCR

Sản phẩm PCR của chủng C.acetoglutamicum H1 được kiểm tra bằng điện di trên

gel agaroza 1%. Kết quả được chỉ ra ở ảnh 7

Ảnh 7. Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gel metA.

Chú thích: Kênh 1: Sản phẩm PCR chủng C.glutamicum H1

Kênh 2: Chỉ thị phân tử (ADN λ cắt bằng Hind III và EcoRI) từ trên

xuống (21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564,

125bp).

133

Kết quả ở ảnh 7 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc hiệu, không có sản

phẩm phụ. Chủng C.acetoglutamicum H1 có duy nhất một sản phẩm PCR đặc hiệu vào

khoảng 1486 bp theo lý thuyết giống với chiều dài gen metA đã được công bố trong ngân

hàng gen thế giới.

2.4.1. Tạo dòng sản phẩm PCR của gen metA

2.4.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR®2.1 và biến nạp

Sản phẩm PCR dặc hiệu của gen metA đã thu được ở trên gắn vào vector pCR®2.1

để tạo vector tái tổ hợp. Sau đó biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli DH5α. Biến

nạp được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả được thể hiện ở ảnh 8.

Ảnh 8. Chủng E.coli DH5α sau khi biến nạp được nuôi cấy trên môi trường

LB+ampixillin+IPTG+Xgal.

134

Kết quả thí nghiệm thu được các khuẩn lạc xanh và trắng nằm rải rác trên đĩa,

trong đố số lượng các khuẩn lạc trắng đạt trung bình khoảng 65-70%. Như vậy hiệu quả

của quá trình gắn chúng tôi đạt được là khá cao. Các khuẩn lạc trắng được xem là chứa

vector mang sản phẩm PCR mong muốn. Tuy nhiên để thu được vector tái tổ hợp mang

gen metA thì việc tách chiết lại plasmid từ các khuẩn lạc trắng và kiểm tra cẩn thận bằng

cách cắt với các enzym giới hạn là cần thiết.

2.4.1.2. Tách chiết ADN plasmid từ E.coli DH5α và cắt bằng enzym giới

hạn EcoRI

Để chọn lọc các dòng tế bào chứa plasmid có đính gen metA, chúng tôi lấy ngẫu

nhiên ở mẫu biến nạp 12 khuẩn lạc riên rẽ màu trắng và 1 khuẩn lạc màu xanh là đối

chứng để tách chiết plasmid, sau đó tuyển chọn bằng điện di trên gel agaroza 1%. Kết quả

trên ảnh 9:

Ảnh 9. Điện di trên gel agaroza 1% đẻ chọn lọc các plasmid tái tổ hợp mang gen

metA. 1-13: Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng. &: Plasmid tách từ khuẩn lạc xanh.

Từ plasmid số 10 và số 11 với kích thước lớn hơn có khả năng mang gen metA

được kiểm tra bằng cách cắt với enzym giới hạn EcoRI. Vì vector pCR®2.1 có hai vị trí

cắt của EcoRI ở hai đầu của vùng cắt gắn đa vị, sau khi cắt với enzym này đoạn ADN

135

ngoại lai mang gen metA sẽ được tách ra khỏi vector. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng

điện di trên gel agaroza 1%, kết quả được thể hiện ở ảnh 10.

Ảnh 10.Diện di đồ các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đặc hiệu của

gen metA cắt bằng EcoRI.

Chú thích: Kênh 1: Sản phẩm PCR của gen metA.

Kênh 2: Plasmid cắt bằng EcoRI.

Kênh 3: Chỉ thị phân tử (ADN λ cắt bằng Hind III và EcoRI, từ trên xuống 21226,

5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564, 125bp).

Kết quả ở ảnh 10 cho thấy khi plasmid tái tổ hợp được cắt bởi enzym EcoRI, đoạn

ADN đựoc tách ra khỏi vector tái tổ hợp được có kích thước khoảng 1486 cặp bazơ đúng

bằng với sản phẩm PCR của chúng (kênh 1,2). Như vậy chúng tôi đã chọn được 1 dòng

có đính sản phẩm PCR đặc hiệu gen metA và được vi khuẩn E.coli DH5α nhân lên theo

mong muốn.

2.4.1.3.Xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen metA từ chủng

C.acetoglutamicum H1

Để có thể khẳng định đoạn ADN đã tách dòng đúng là đoạn đặc hiệu của gen metA

chúng tôi tiến hành nuôi lượng lớn, tách plasmid, tinh sạch để xác định trình tự.

2.4.1.4 Xác định trình tự nucleotit của gen metA từ chủng C.acetoglutamicum H1

1 2 3

136

Chúng tôi đã tiến hành đọc trình tự gen metA tạo dòng từ chủng

C.acetoglutamicum H1 phân lập ở Việt Nam. Kết quả được thể hiện GCGGCTTTGC TGAAATCTAG CTTTAAATAG ACTCACCCCA GTGCTTAAAG CGCTGGGTTT 60 TTCTTTTTCA AACTCGTGAG AATGCAAACT AGACTAGACA GAGCTGTCCA TATACACTGG 120 ACGAAGTTTT AGTCCCGTCC ACCCAGAACA GGCGGTTATT TTCATGCCCA CCCTCGCGCC 180 TTCAGGTCAA CTTGAAATCC AAGCGATCGG TGATGTCTCC ACCGAAGCCG GAGCAATCAT 240 TAAAAACGCT GAAATCGCCT ATCACCGCTG GGGTGAATAC CGCGTAGATA AAGAAGGACG 300 CAGCAATGTC GTCCTCATCG AACACGCCCT CACTGGAGAT TCCAACGCAG CCGATTGGTG 360 GGCTGACTTG CTCGGTCCCG GCAAAGCCAT CAACACTGAT ATTTACTGCG TGATCTGTAC 420 CAACGTCATC GGTGGTTGCA ACGGTTCCAC CGGACCTGGC TCCATGCATC CAGATGGAAA 480 TTTCTGGGGT AATCGCTTCC CCGCCACGTC CATTCGTGAT CAGGTAAACG CCGAAAAACA 540 ATTCCTCGAC GCACTCGGCA TCACCACGGT CGCCGCAGTA CTTGGTGGTT CCATGGGTGG 600 TGCCCGCACC CTAGAGTGGG CCGCAATGTA CCCAGAAATT GTTGGCGCAG CTGCTGTTCT 660 TGCAGTTTCT GCACGCGCCA GCGCCTGGCA AATCGGCATT CAATCCGCCC AAATTAAGGC 720 GATTGAAAAC GACCACCACT GGCACGAAGG CAACTACTAC GAATCCGGCT GCAACCCAGC 780 CACCGGACTC GGCGCCGCCC GACGCATCGC CCACCTCACC TACCGTGGCG AACTAGAAAT 840 CGACGAACGC TTCGGCACCA AAGCCCAAAA GAACGAAAAC CCACTCGGTC CCTACCGCAA 900 GCCCGACCAG CGCTTCGCCG TGGAATCCTA CTTGGACTAC CAAGCAGACA AGCTAGTACA 960 GCGTTTCGAC GCCGGCTCCT ACGTTTTGCT CACCGACGCC CTCAACCGCC ACGACATTGG 1020 TCGCGACCGC GGAGGCCTCA ACAAGGCACT CGAATCCATC AAAGTTCCAG TCCTTGTCGC 1080 AGGCGTAGAC ACCGATATTT TGTACCCCTA CCACCAGCAA GAACACCTCT CCCGAAACCT 1140 GGGAAATCTA CTGGCAATGG CAAAAATCGT ATCCCCTGTC GGCCACGATG CTTTCCTCAC 1200 CGAAAGCCGC CAAATGGATC GCATCGTGAG GAACTTCTTC AGCCTCATCT CCCCAGACGA 1260 AAACAACCCT TCGACGTACA TCGAGTTCTA CATCTAATAG GTATTTACGA CAAATAGACA 1320 GGGATCTCTA AACAACTCAC AGGCAACCCT CCGGATAAAC CAAAAAACAA TCTGTAACAT 1380 AAGTAGTTGT GACTTTGTTG AACTCTCGTC GGGCCGCTGG CGCTTTTGCT ACCACGCTAG 1440 TCGCCAGCAC TCTCGGATTA AGCGGATGTA CCTCCGTAAC TTCCAG 1486

Tr×nh tù gen metA t¹o dßng tõ chñng C. acetoglutamicum H1 ph©n lËp

Kết quả cho thấy: trình tự gen metA tạo dòng từ chủng C.acetoglutamicum H1

được xác định có chiều dài 1486 bp bao gồm số lượng các nucleotit như sau: 382A, 463

C, 331 G, 310 T.

Gen metA ®· ®−îcPark vµ céng sù c«ng bè, gen nµy cã chiÒu dµi 1493 axit amin.

KÕt qu¶ so s¸nh cho thÊy: tr×nh tù nucleotit cña gen metA t¹o dßng tõ chñng C.

glutamicum H1 ph©n lËp ë Viªt Nam cã ®é t−¬ng ®ång cao ®¹t tíi 99,06% khi so s¸nh

víi tr×nh tù gen metA ®· ®−îcPark vµ céng sù c«ng bè trong ng©n hµng gen quèc tÕ.

So s¸nh tr×nh tù çc axit amin cña ®o¹n protein ®−îc dÞch m· tõ gen metA

Gen metA t¹o dßng tõ chñng C. acetoglutamicum H1 ®−îc dÞch m· sang protein

nhê ch¬ng tr×nh phÇn mÒm PC/Gene. KÕt qu¶ cho thÊy: gen nµy ®−îcdÞch m· b¾t ®Çu tõ

nucleotit thø 164 vµ m· ho¸ cho mét ®o¹n protein cã chiÒu dµi 377 axit amin. ATG vµ

ATC lµ bé ba khëi ®Çu vµ bé ba kÕt thóc cña qu¸ tr×nh dÞch m·.

137

Tr×nh tù axit amin cña ®o¹n protein dÞch m· tõ gen metA t¹o dßng tõ chñng C.

acetoglutamicum H1 ph©n lËp ë Viªt Nam ®−îc so s¸nh víi tr×nh tù çc axit amin cña

cïng gen nµy ®· ®−îcPark vµ céng sù c«ng bè trong ng©n hµng gen quèc tÕ. KÕt qu¶ ®−îc

chØ ra nh− sau.

PMETA_VN - MPTLAPSGQLEIQAIGDVSTEAGAIIKNAEIAYHRWGEYRVDKEGRSNVV -50 |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| PMETA_KR - MPTLAPSGQLEIQAIGDVSTEAGAIITNAEIAYHRWGEYRVDKEGRSNVV -50 PMETA_VN - LIEHALTGDSNAADWWADLLGPGKAINTDIYCVICTNVIGGCNGSTGPGS -100 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| PMETA_KR - LIEHALTGDSNAADWWADLLGPGKAINTDIYCVICTNVIGGCNGSTGPGS -100 PMETA_VN - MHPDGNFWGNRFPATSIRDQVNAEKQFLDALGITTVAAV--LGGSMGGAR -148 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| PMETA_KR - MHPDGNFWGNRFPATSIRDQVNAEKQFLDALGITTVAAVVLLGGSMGGAR -150 PMETA_VN - TLEWAAMYPEIVGAAAVLAVSARASAWQIGIQSAQIKAIENDHHWHEGNY -198 |||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| PMETA_KR - TLEWAAMYPETVGAAAVLAVSARASAWQIGIQSAQIKAIENDHHWHEGNY -200 PMETA_VN - YESGCNPATGLGAARRIAHLTYRGELEIDERFGTKAQKNENPLGPYRKPD -248 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| PMETA_KR - YESGCNPATGLGAARRIAHLTYRGELEIDERFGTKAQKNENPLGPYRKPD -250 PMETA_VN - QRFAVESYLDYQADKLVQRFDAGSYVLLTDALNRHDIGRDRGGLNKALES -298 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| PMETA_KR - QRFAVESYLDYQADKLVQRFDAGSYVLLTDALNRHDIGRDRGGLNKALES -300 PMETA_VN - IKVPVLVAGVDTDILYPYHQQEHLSRNLGNLLAMAKIVSPVGHDAFLTES -348 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| PMETA_KR - IKVPVLVAGVDTDILYPYHQQEHLSRNLGNLLAMAKIVSPVGHDAFLTES -350 PMETA_VN - RQMDRIVRNFFSLISPDENNPSTYIEFYI -377 |||||||||||||||||| |||||||||| PMETA_KR - RQMDRIVRNFFSLISPDEDNPSTYIEFYI -379

So s¸nh ®é t−¬ng ®ång tr×nh tù çc axit amin ®−îcdÞch m∙ tõ gen metA cña Viªt

Nam víi tr×nh tù çc axit amin cña gen metA ®∙ ®−îcPark vµ céng sù c«ng bè trong

ng©n hµng gen Quèc tÕ.

Chó thÝch: PMETA_VN: ®o¹n protein ®−îcdÞch m· tõ gen MetA cña ViÖt Nam,

PMETA_KR: ®o¹n protein ®−îc dÞch m· tõ gen MetA cña t¸c gi¶ Park vµ céng sù, Hµn

Quèc.

KÕt qu¶ cho thÊy tr×nh tù axit amin ®−îc dÞch m· tõ gen metA t¹o dßng tõ chñng C.

acetoglutamicum H1 ph©n lËp ë Viªt Nam cã ®é t¬ng ®ång cao ®¹t tíi 99,20% khi so s¸nh

víi tr×nh tù çc axit amin dÞch m· tõ gen metA ®· ®−îcPark vµ céng sù c«ng bè trong

ng©n hµng gen Quèc tÕ. Tr×nh tù nucleotit gen metA t¹o dßng tõ vi khuÈn C.

acetoglutamicum H1 ph©n lËp ë ViÖt Nam ®· ®−îc®a vµo ng©n hµng gen Quèc tÕ víi m·

sè ®¨ng ký: AJ584663.

138

2.5. Tách dòng và biểu hiện gen plantaricin SA mã hóa bacteriocin plantaricin SA

trong vi khuẩn E.coli BL21

Plantaricin là một bacteriocin (chất diệt khuẩn sinh học) do vi khuẩn Lactobacillus

plantarum sinh ra. Để tạo chủng tái tổ hợp có khả năng sinh bacteriocin plantaricin với

sản lượng cao, chúng tôi tiến hành tách dòng và biểu hiện gen plantaricin SA (PLSA) mã

hóa bacteriocin plantaricin SA trong vi khuẩn E.coli BL21.

2.5.1. Tách chiết ADN genom

Tế bào L.plantarum được nuôi cấy trên môi trường LB lỏng để thu lượng lớn. Tiến

hành tách chiết ADN genom từ tế bào thu được. Kiểm tra kết quả tách chiết trên gel

agaroza 1% cho thấy ADN genom là một băng sáng rõ nét, có kích thước lớn, đủ điều

kiện làm khuôn để nhân gen plantaricin SA.

¶nh 11: ADN tổng số điện di trên gel agaroza 1%

Kênh 1-3: ADN tổng số tách từ 3 chủng L.plantarium L12, L49, L45 2.5.2. Nhân gen plantaricin SA bằng phương pháp PCR

Cùng với các điều kiện phù hợp cho chu trình chạy, gen PLSA được nhân lên từ

ADN genom. Trình tự thiết kế cặp mồi cho gen PLSA được nêu ở phần phương pháp. Sản

phẩm của phản ứng được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza 1%. Kết quả trình bày ở

ảnh 2 cho thấy, sản phẩm PCR của 3 chủng L.plantarium L12, L49, L45 là một băng đặc

1 2 3

139

hiệu, có kích thước khoảng 168bp theo đúng như lý thuyết. Sản phẩm PCR được sử dụng

cho các thí nghiệm tách dòng tiếp theo.

¶nh 12: Điện di sản phẩm PCR trên gel agaroza 1%

Kênh 1: Thang ADN chuẩn 100bp

Kênh 2-4: Sản phẩm PCR của 3 chủng L.plantarum L12, L49, L45

2.5.3. Tách dòng gen plantaricin SA

Đoạn gen PLSA được ghép nối với vectơ tách dòng pCRTM 2.1. Đây là vectơ được

thiết kế phù hợp để tiến hành nối ghép với sản phẩm PCR dùng Tag-polimeraza. Nucleotit

T được tổng hợp dư ra trên vectơ sẽ bắt cặp với nucleotit A của sản phẩm PCR. Sản phẩm

của quá trình ghép nối được biến nạp vào tế bào E.Coli DH5α, sau đó tế bào biến nạp

được trải trên môi trường LB chọn lọc có bổ sung Ampicillin + IPTG+ X-gal và ủ ở 370C

qua đêm. Plasmid được tách chiết từ vi khuẩn theo phương pháp Minipreps. Chọn lọc các

plasmid tái tổ hợp có khả năng chứa đoạn ADN mang gen PLSA được tiến hành bằng

phương pháp điện di trên gel agaroza 1% với đối chứng plasmid gốc.

Kết quả điện di trên gel agaroza 1% cho thấy đã chọn được 3 dòng plasmid tái tổ

hợp 1, 3 và 5 là các plasmid có kích thước lớn hơn plasmid gốc.

1 2 3 X 4 5 6

1 2 3 4

100 bp 200 bp300 bp

168 bp

¶nh 13: ADN plasmid tách từ các thể biến nạp

X: Plasmid đối chứng tách từ khuẩn lạc xanh Kênh 1-3: Các plasmid từ các clone 1,2,3

Kênh 4-7: Các plasmid từ các clone 4,5,6,7

140

2.5.4. Kiểm tra các plasmid tái tổ hợp bằng enzym E.coR I Dựa vào vị trí của các enzym giới hạn trên vùng cắt đa vị trên vectơ PCRTM2.1,

chúng tôi sử dụng enzym E.coR I làm enzym để kiểm tra. Theo lý thuyết, khi cắt các

plasmid tái tổ hợp với enzym E.coR I sẽ nhận được vectơ và đoạn ADN ngoại lai đặc

hiệu của gen PLSA với chiều dài 168bp.

K ết quả trên điện di đồ trên gel agaroza 1% cho thấy: Khi plasmid được cắt bởi

enzym E.coR I, đoạn ADN đặc hiệu của gen PLSA được tách ra khỏi plasmid tái tổ hợp

đoạn này có kích thước 168 cặp bazơ đúng bằng với sản phẩm PCR (kênh 2 và 3). Như

vậy chúng tôi đã chọn được 2 dòng có đính sản phẩm PCR là đoạn ADN đặc hiệu của gen

PLSA. Vectơ tái tổ hợp mang gen PLSA được đặt tên là pCR-PLSA. Chúng tôi chọn một

dòng tế bào để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Để kiểm tra gen PLSA đã được tách

dòng chính xác là gen mong muốn, chúng tôi tiên hành đọc trình tự đoạn gen này trong

vectơ pCR2.1.

¶nh 14: ADN plasmid tách từ các thể biến nạp cắt bằng E.CoR I

Kênh 1: Thang ADN chuẩn 1kb (1kb ADN Plus Ladder)

Kênh 2,3,4: Các plasmid từ các clone 1,3 và 5

Kênh 5: Sản phẩm PCR gen PLSA

1 2 3 4

168bp

141

Các dòng plasmid tái tổ hợp được tinh chế bằng Kit QIA, sau đó được sử dụng làm

phản ứng xác định trình tự. Trình tự gen được xác định tự động bằng máy xác định trình

tự ABI 3100 Avant với bộ kit BigDyeTerminator 3.1. Gen PLSA sau khi phân tích có

trình tự như sau: ATGAATAACG CATTAAGTTT TGAACAACAA TTTACAGACT TCAGCACCTT ATCAGACTCT 60 GAATTAGAAT CCGTTGAGGG TGGCCGAAAT AAGCTTGCGT ATAATATGGG GCATTACGCT 120 GGTAAGGCAA CCATTTTTGG CCTTGCAGCA TGGGCACTCC TTGCATGA 168

Trình tự đoạn ADN mang gen PLSA mã hóa bacteriocin từ chủng vi khuẩn

L.plantarum L12 phân lập ở Việt Nam Trình tự này cũng được so sánh với trình tự của tác giả Stephens,S.K và cộng sự bằng chương trình Fasta trên mạng và đạt độ tương đồng cao nhất là 98%.

KÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù axit amin gi÷a bacteriocin cña chñng L.plantarum L12 ViÖt

nam (PLSA VN) vµ bacteriocin cña chñng L.plantarum Anh (PLSA Anh)

Gen PLSA cũng được dịch mã sang protein và so sánh với gen PLSA của Anh, kết

quả cho thấy độ tương đồng là 100% và có chiều dài là 55 axit amin.

2.5.5. Thiết kế vectơ biểu hiện gen plantaricin SA mã hóa bacteriocin trong tế bào

E.coli

Khuyếch đại đoạn gen PLSA bằng cặp mồi biểu hiện

Đoạn gen PLSA được khuyếch đại bằng phương pháp PCR với cặp mồi biểu hiện

PLSABam, PLSAXho treo hai vị trí cắt của BamHI và XhoI. Sản phẩm PCR theo dự tính

lý thuyết có chiều dài 168bp. Kết quả ở ảnh 5 cho thấy, sản phẩm PCR được nhân lên rất

đặc hiệu, trọng lượng phân tử phù hợp với dự tính lý thuyết là 168bp.

Query 1 ATGAATAACGCATTAAGTTTTGAACAACAATTTACAGACTTCAGCACCTTATCAGACTCT 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| Sbjct 789 ATGAATAACGCATTAAGTTTTGAACAACAATTTACAGACTTCAGCACCTTATCGGACTCT 848 Query 61 GAATTAGAATCCGTTGAGGGTGGCCGAAATAAGCTTGCGTATAATATGGGGCATTACGCT 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| Sbjct 849 GAATTAGAATCCGTTGAGGGTGGCCGAAATAAGCTTGCATATAATATGGGGCATTACGCT 908 Query 121 GGTAAGGCAACCATTTTTGGCCTTGCAGCATGGGCACTCCTTGCATGA 168 |||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 909 GGTAAGGCAACCATTTTTGGACTTGCAGCATGGGCACTCCTTGCATGA 956

Query 1 MNNALSFEQQFTDFSTLSDSELESVEGGRNKLAYNMGHYAGKATIFGLAAWALLA MNNALSFEQQFTDFSTLSDSELESVEGGRNKLAYNMGHYAGKATIFGLAAWALLA Sbjct 1 MNNALSFEQQFTDFSTLSDSELESVEGGRNKLAYNMGHYAGKATIFGLAAWALLA 55

142

200 bp

500 bp

2000 bp

5000 bp

168 bp

1 2 3 4

¶nh 15: Kết quả khuyếch đại gen PLSA

Kênh 1: Thang ADN chuẩn 1kb (1kb ADN Plus Ladder) Kênh 2: Sản phẩm PCR chạy với cặp mồi biểu hiện PLSABam và PLSAXho

2.5.6. Chọn dòng plasmid tái tổ hợp pET-TRX-FuS-PLSA

Đoạn PLSA được gắn vào vectơ pET-TRX-FuS nhờ enzym T4-ligase. Sau đó sản

phẩm lai được biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5αT’. Các dòng plasmid tái tổ hợp

được sàng lọc và cắt kiểm tra bằng enzym giới hạn BamHI và Xho I. Kết quả cho thấy,

chúng tôi đã chọn dòng thành công vectơ biểu hiện pET-TRX-FuS-PLSA (ảnh 6).

¶nh 16: Các dòng plasmid tái tổ hợp pET-TRX-FuS-PLSA được cắt kiểm tra bằng

enzym giới hạn BamHI và XhoI

100 bp 200 bp 400 bp

168 bp

1 2

143

Kênh 1: Thang ADN chuẩn 1kb (1kb ADN Plus Ladder) Kênh 2-3: Các plasmid tái tổ hợp pET-TRX-FuS-PLSA

Kênh 4: Sản phẩm PCR đoạn gen PLSA Xác định trình tự gen PLSA trong pET- TRX-FuS

Một đoạn gen chỉ được biểu hiện khi nó được lắp đúng khung đọc, có mã khởi đầu

và mã kết thúc. Vì vậy để kiểm tra và khẳng định một cách hoàn toàn chắc chắn các dòng

tế bào trên đã mang đoạn gen mong muốn và có đúng khung đọc, chúng tôi tiến hành tinh

sạch những plasmid tái tổ hợp để xác định trình tự. Để xác định trình tự, chúng tôi sử

dụng phương pháp Sanger và Coulson. Bộ kit xác định trình tự ADN của hãng Invitrogen

với máy đọc trình tự ADN ABI- 3100 Avant của Hãng Applied Biosystems. Để khẳng

định chắc chắn trước khi tiến hành biểu hiện chúng tôi tiến hành giải trình tự vectơ tái tổ

hợp pET-TRX-FuS-PLSA. Trình tự gen được phân tích bằng phần mềm PC/Gene và dịch

mã ra protein. Kết quả cho thấy plasmid được chọn có mang đoạn gen PLSA dịch mã ra

protein có chiều dài là 55 axit amin và các trình tự của protein dung hợp bao gồm

Thioredoxin (Trx-Q) với 125 axit amin và đuôi His-tag với 6 axit amin, tổng cộng là 186

axit amin. Như vậy protein được chúng tôi biểu hiện sẽ có protein tái tổ hợp và protein

dung hợp với trọng lượng phân tử là 20,4 kDa.

10 20 30 40 50 60 | | | | | | ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCG M S D K I I H L T D D S F D T D V L K A 70 80 90 100 110 120 | | | | | | GACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCC D G A I L V D F W A E W C G P C K M I A 130 140 150 160 170 180 | | | | | | CCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAAC P I L D E I A D E Y Q G K L T V A K L N 190 200 210 220 230 240

144

| | | | | | ATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTG I D Q N P G T A P K Y G I R G I P T L L 250 260 270 280 290 300 | | | | | | CTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTG L F K N G E V A A T K V G A L S K G Q L 310 320 330 340 350 360 | | | | | | AAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGTGATGACGATGACAAGGTA Enterokinase R site K E F L D A N L A G S G S G D D D D K V 370 380 390 400 410 420 | | | | | | CCCCTGGTTCCGCGTGGATCCAATAACGCATTAAGTTTTGAACAACAATTTACAGACTTC P L V P R G S N N A L S F E Q Q F T D F 430 440 450 460 470 480 | | | | | | AGCACCTTATCGGACTCTGAATTAGAATCCGTTGAGGGTGGCCGAAATAAGCTTGCATAT S T L S D S E L E S V E G G R N K L A Y 490 500 510 520 530 540 | | | | | | AATATGGGGCATTACGCTGGTAAGGCAACCATTTTTGGACTTGCAGCATGGGCACTCCTT N M G H Y A G K A T I F G L A A W A L L 550 560 570 | | | GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA A L E H H H H H H -

145

Trình tự gen sau khi tiến hành giải trình tự và dịch mã ra protein

2.5.7. Biểu hiện protein PLSA tái tổ hợp

Chủng E. coli BL21 DE3 Star mang vectơ tái tổ hợp pET-TRX-FuS-PLSA được

tiến hành biểu hiện để thu nhận protein tái tổ hợp. Protein tái tổ hợp Thioredoxin-Histag-

PLSA-HisTag được hình thành bởi sự kết nối các protein với nhau: Thioredoxin (Trx-Q)

với 125 axit amin, PLSA với 55 axit amin và đuôi His-tag với 6 axit amin, tổng cộng là

186 axit amin với trọng lượng phân tử tính theo lý thuyết là 20,4 kDa. Kết quả ở ảnh 7

cho thấy protein biểu hiện được là một băng khá đậm, rõ nét với kích thước đúng như dự

đoán của chúng tôi khoảng 21 kDa. Từ kết quả này bước đầu chúng tôi có thể nhận định

protein biểu hiện được là protein mong muốn.

¶nh 17: Kết quả biểu hiện được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide

M: Maker protein

Kênh 1 : Mẫu sau cảm ứng bằng IPTG 1Mm

Kênh 2 : Mẫu không cảm ứng bằng IPTG

Để kiểm tra hoạt tính của protein tái tổ hợp (plantaricin SA), cần phải cắt đoạn

protein tái tổ hợp này khỏi các protein không cần thiết. Trong trường hợp này enzym cắt

là enterokinase. Do enzym này quá đắt nên trong nhiệm vụ của đề tài này chúng tôi chỉ

146

1357pb 983 bp831 bp

1375bp

M 1 2 3 4

nghiên cứu ở mức biểu hiện, còn những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành trong

khuôn khổ của những đề tài tới.

2.6. T¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gene phy A m· ho¸ phytaza cña nÊm mèc A. niger trong

nÊm men Pichia pastoris

Nh©n b¶n gen phyA b»ng kü thuËt PCR

Chóng t«i ®· x¸c ®Þnh sù tån t¹i cña gen phyA tõ 4 chñng A. niger b»ng kü thuËt

PCR b»ng viÖc sö dông cÆp måi PHYAP1 vµ PHYAP2. Çc mÉu ADN ®· ®−îct¸ch chiÕt

tõ 4 chñng A. niger, nång ®é ADN ®−îcx¸c ®Þnh b»ng m¸y quang phæ ë bíc sãng 260 nm

vµ ®−îckiÓm tra trªn gel agaroza 1%. 100ng ADN ®· t¸ch chiÕt ®−îcdïng lµm sîi khu«n

®Ó nh©n b¶n gen m· ho¸ cho phytaza (gen phy A). KÕt qu¶ cho thÊy c¶ 4 chñng A. niger

®Òu cho s¶n phÈm PCR ®Æc hiÖu ®óng theo lý thuyÕt lµ 1357bp (¶nh 18).

¶nh 18. KiÓm tra s¶n phÈm PCR çc chñng A. niger

M: ChØ thÞ ph©n tö. 1: S¶n phÈm PCR cña chñng A. niger MP2 ; 2 S¶n phÈm PCR cña

chñng A. niger MP7; 3 S¶n phÈm PCR cña chñng A. nige, MP19 ; 4 S¶n phÈm PCR cña

chñng A. niger MP35

KÕt qu¶ ë h×nh 1 cho thÊy s¶n phÈm PCR cña çc chñng A. niger chØ cã mét v¹ch duy

nhÊt cã chiÒu dµi ®óng lµ 1357bp.

§Ó kh¼ng ®Þnh mét çch ch¾c ch¾n chñng A. niger MP2 cã mang gen phyA kh«ng,

chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch dßng vµ ®äc tr×nh tù gen phyA.

147

T¸ch dßng gen phy A

S¶n phÈm PCR ®−îcg¾n trùc tiÕp vµo vect¬ t¸ch dßng pCR 2.1 vµ biÕn n¹p vµo tÕ

bµo E. coli chñng DH5α. Çc khuÈn l¹c chøa plasmid ®Ýnh ®o¹n ADN ngo¹i lai ®−îct¸ch

tõ çc khuÈn l¹c riªng rÏ mÇu tr¾ng b»ng ph¬ng ph¸p Miniprep sau ®ã ®−îctuyÓn chän

b»ng çch ®iÖn di trªn gel agaroza 1% cã so s¸nh víi plasmid gèc (®−îct¸ch ra tõ khuÈn

l¹c xanh). Chän çc plasmid cã kÝch thíc lín h¬n plasmid gèc ®Ó nghiªn cøu tiÕp. KÕt qu¶

tuyÓn chän çc plasmid cã ®Ýnh ®o¹n ADN ngo¹i lai ®−îc chØ ra ë ¶nh 19.

¶nh 19. §iÖn di kiÓm tra plasmid trªn gel agaroza 1%.

X: Plasmid ®èi chøng t¸ch tõ khuÈn l¹c xanh. 1 - 7 vµ 9 - 15: Plasmid t¸ch tõ khuÈn l¹c tr¾ng.

Tõ 4 plasmit cã kh¶ n¨ng chøa gen phyA t¸ch tõ çc dßng 2, 3, 4 chóng t«i ®· tiÕn

hµnh c¾t kiÓm tra b»ng enzym Eco R I, khi c¾t b»ng enzym nµy ®o¹n ADN ngo¹i lai sÏ t¸ch

ra khái vect¬. KÕt qu¶ sau khi c¾t cho thÊy ®o¹n ADN t¸ch ra khái vect¬ tõ çc dßng trªn

®· v¨ng ra 1 b¨ng cã kÝch thíc b»ng s¶n phÈm PCR kho¶ng 1357bp (¶nh 20).

¶nh 20. §iÖn di trªn gel agaroza kiÓm tra çc plasmit t¸i tæ hîp mang s¶n phÈm PCR c¾t b»ng EcoRI

1 2 3 4 5 6

1357pb

M 1 2 3 4 5

983 bp 831 bp

1375bp

564 bp

148

M: ChØ thÞ ph©n tö. Kªnh 1: S¶n phÈm PCR tríc khi g¾n vµo vect¬ t¸ch dßng. 5: S¶n phÈm PCR c¾t b»ng enzym EcoR I. Çc kªnh 2,3,4: Plasmid cña çc dßng 2,3,4 c¾t b»ng EcoR I.

Như vËy chóng t«i ®· chän ®−îcçc dßng plasmid 3, 4 cã chøa s¶n phÈm PCR mµ

chóng t«i mong muèn. Çc dßng plasmid t¸i tæ hîp ®−îctinh chÕ b»ng Kit QIA, sau

®−îcsö dông ®Ó lµm ph¶n øng x¸c ®Þnh tr×nh tù. Tr×nh tù gen ®−îcx¸c ®Þnh tù ®éng b»ng

m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù ABI 3100 Avant víi bé kit BigDye Terminator 3.1. Gen phyA sau

khi ph©n tÝch cã tr×nh tù nh− sau:

AGTCACCTCCGGACTGGCAGTCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCACTTGCGATACGGTCGA 60

TCAGGGGTACCAATGCTTCTCCGAGACTTCGCATCTTTGGGGTCAATACGCACCGTTCTT 120

CTCTCTGGCAAACGAATCGGTCATCTCCCCTGAGGTGCCCGCCGGATGCAGAGTCACTTT 180

CGCTCAGGTCCTCTCCCGTCATGGAGCGCGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAATA 240

CTCCGCTCTCATTGAGGAGATTCAGCAGAACGCGACCACCTTTGATGGAAAATATGCCTT 300

CCTGAAGACATACAACTACAGCCTGGGTGCAGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAACAGGA 360

GCTAGTCAACTCCGGCATCAAGTTCTACCAGCGATACGAATCGCTCACAAGGAACATCAT 420

TCCATTCATCCGATCCTCTGGCTCCAGCCGCGTGATCGCCTCCGGCAAGAAATTCATCGA 480

GGGCTTCCAGAGCACCAAGTTGAAGGATCCTCGTGCCCAGCCTGGCCAATCGTCGCCCAA 540

GATCGACGTGGTCATTTCCGAGGCCAGCTCATCCAACAACACGCTCGACCCAGGCACCTG 600

CACTGTCTTTGAAGACAGCGAATTGGCCGATACCGTCGAAGCCAATTTCACCGCCACGTT 660

CGTCCCCTCTATTCGTCAACGTCTGGAGAACGACCTGTCTGGCGTGTCTCTCACAGACAC 720

AGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACTATCTCCACTAACACCGTCGA 780

CACCAAACTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCACGAAGAATGGATCAACTACGACTA 840

CCTCCAGTCCCTGAAAAAGTACTACGGTCATGGCGCCGGTAACCCGCTCGGCCCGACCCA 900

GGGCGTCGGCTACGCTAACGAGCTCATCGCCCGTCTCACCCACTCGCCTGTCCACGATGA 960

CACCAGCTCCAACCACACATTGGACTCTAACCCGACTACCTTTCCGCTCAACTCTACTCT 1020

CTACGCGGATTTTTCCCACGATAACGGTATCATCTCTATCCTCTTTGCTTTGGGTCTGTA 1080

TAACGGCACCAAGCCGCTGTCTACCACGACCGTGGAGAATATCACCCAGACAGATGGATT 1140

TTCGTCTGCTTGGACGGTTCCGTTTGCTTCGCGTCTGTACGTTGAGATGATGCAGTGTCA 1200

GGCCGAGCAGGAGCCGCTGGTCCGTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTCCCGCTGCATGG 1260

TTGTCCGGCTGATGCTTTGGGGAGATGTACCCGGGATAGCTTTGTGAAGGGGTTGAGCTT 1320

TGCTAGATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCT 1357

Tr×nh tù ®o¹n ADN m∙ hãa cho enzym phytaza tõ chñng nÊm mèc A. nigerMP2 ph©n lËp ë ViÖt Nam.

149

Tr×nh tù nµy còng ®· ®−îcso s¸nh víi tr×nh tù cña çc t¸c gi¶ kh¸c b»ng ch-

¬ng tr×nh Fasta trªn m¹ng vµ ®¹t ®é t¬ng ®ång cao nhÊt lµ 99,7%.

Alignment DB:ID Source Length Identity% Ungapped% Overlap E()

1 EM_FUN:AY426977 Aspergillus niger strain N1

1525 99.705 99.705 1357 0

2 EM_FUN:AY745739 Aspergillus niger phytase g

1506 96.758 96.758 1357 0

3 EM_FUN:AF218813 Aspergillus niger myo-inosi

1528 96.610 96.610 1357 0

4 EM_FUN:ANPHYTAS Aspergillus niger var awamori

2379 96.389 96.389 1357 0

5 EM_FUN:ANPHYAG Aspergillus niger phyA gene

2000 96.315 96.315 1357 0

6 EM_FUN:ANPHYTASE Aspergillus niger myo-inisto

2665 96.315 96.315 1357 0

7 EM_FUN:AY513749 Aspergillus niger phytase (

1506 96.094 96.094 1357 0

8 EM_FUN:AY013315 Aspergillus ficuum phytase

1590 92.404 92.404 1356 0

9 EM_FUN:AB022700 Aspergillus niger gene for

1515 92.262 92.262 1357 0

10 EM_FUN:AF537344 Aspergillus ficuum phytase

1347 92.262 92.262 1344 0

KÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù axit amin gi÷a phytaza cña chñng A. niger MP2 ViÖt nam (PHYAVN) vµ phytaza cña chñng nÊm mèc A. niger Trung quèc (PHYATQ) Query VTSGLAVPASRNQSTCDTVDQGYQCFSETSHLWGQYAPFFSLANESVISPEVPAGCRVTF 60 VTSGLAVPASRNQSTCDTVDQGYQCFSETSHLWGQYAPFFSLANES ISP+VPAGC+VTF Sbjct VTSGLAVPASRNQSTCDTVDQGYQCFSETSHLWGQYAPFFSLANESAISPDVPAGCKVTF 75

150

Query AQVLSRHGARYPTDSKGKKYSALIEEIQQNATTFDGKYAFLKTYNYSLGADDLTPFGEQE 120 AQVLSRHGARYPTDSKGKKYSALIEEIQQNATTFDGKYAFLKTYNYSLGADDLTPFGEQE Sbjct AQVLSRHGARYPTDSKGKKYSALIEEIQQNATTFDGKYAFLKTYNYSLGADDLTPFGEQE 135 Query LVNSGIKFYQRYESLTRNIIPFIRSSGSSRVIASGKKFIEGFQSTKLKDPRAQPGQSSPK 180 LVNSGIKFYQRYESLTRNIIPFIRSSGSSRVIASGKKFIEGFQSTKLKDPRAQP QSSPK Sbjct LVNSGIKFYQRYESLTRNIIPFIRSSGSSRVIASGKKFIEGFQSTKLKDPRAQPSQSSPK 195 Query IDVVISEASSSNNTLDPGTCTVFEDSELADTVEANFTATFVPSIRQRLENDLSGVSLTDT 240 IDVVISEASSSNNTLDPGTC VFEDSELADTVEANFTATFVPSIRQRL NDLSGVSLTDT Sbjct IDVVISEASSSNNTLDPGTCAVFEDSELADTVEANFTATFVPSIRQRLGNDLSGVSLTDT 255 Query EVTYLMDMCSFDTISTNTVDTKLSPFCDLFTHEEWINYDYLQSLKKYYGHGAGNPLGPTQ 300 EVTYLMDMCSFDTIST+TVDTKLSPFCDLFTH+EWINYDYLQSLKKYYGHGAGNPLGPTQ Sbjct EVTYLMDMCSFDTISTSTVDTKLSPFCDLFTHDEWINYDYLQSLKKYYGHGAGNPLGPTQ 315 Query GVGYANELIARLTHSPVHDDTSSNHTLDSNPTTFPLNSTLYADFSHDNGIISILFALGLY 360 GVGYANELIARLTHSPVHDDTSSNHTLDS+P TFPLNSTLYADFSHDNGIISILFALGLY Sbjct GVGYANELIARLTHSPVHDDTSSNHTLDSSPATFPLNSTLYADFSHDNGIISILFALGLY 375 Query NGTKPLSTTTVENITQTDGFSSAWTVPFASRLYVEMMQCQAEQEPLVRVLVNDRVVPLHG 420 NGTKPLSTTTV+NITQTDGFSSAWTVPFASRLYVEMMQCQAEQEPLVRVLVNDRVVPLHG Sbjct NGTKPLSTTTVQNITQTDGFSSAWTVPFASRLYVEMMQCQAEQEPLVRVLVNDRVVPLHG 435 Query CPADALGRCTRDSFVKGLSFARSGGDWAECFA 452 CPADALGRCTRDSFV+GLSFARSGGDWAECFA Sbjct CPADALGRCTRDSFVRGLSFARSGGDWAECFA 467

Gen phyA còng ®−îcdÞch m· sang protein vµ so s¸nh víi gen phyA cña Trung quèc, kÕt

qu¶ cho thÊy ®é tư¬ng ®ång lµ 98% vµ cã chiÒu dµi lµ 452 axit amin

ThiÕt kÕ vector pPICZαPA mang vïng gene phy A m· hãa phytaza

Toµn bé vïng gene phy A m· hãa phytaza cña nÊm mèc A. niger ®−îcghÐp nèi vµ ®a vµo vector biÓu hiÖn pPICZα trong nÊm men P. pastoris (S¬ ®å 1).

S¬ ®å 1 S¬ ®å thiÕt kÕ vector biÓu hiÖn gene phy A m· hãa Phytaza cña nÊm mèc A. niger

DNA Ligase

pCRPA

(4275bp)

Plac

LacZf1 ori

Amp

pUC oriBstEIII

phyA (1375bp)

EcoRI NotI

XhoI

EcoRI XhoI SacII NOt I XbaI pPICZα

3600bp

'AOX1t

zeocin ColE1

5’ AOX1

pPICzαPA(4957bp)

AOX1t

zeocin

ColE

5'AOX1

EcoRI NotI

151

ThiÕt kÕ vector biÓu hiÖn pPICZαPA mang gene m· hãa phytaza

§Ó ®−a toµn bé vïng gen phy A m· hãa phytaza vµo vector biÓu hiÖn pPICZα, hai

cÆp måi 5’ EcoRI – GGAATTCGTCACCTCCGGACTGGCAGTCC- 3’ vµ 5’ Not –

AGCGGCCGCAGCAAAACACTCCGCCC – 3’ ®−îcthiÕt kÕ ®Ó nh©n vïng gen m· hãa

phytaza cã chøa ®iÓm c¾t cña çc enzym h¹n chÕ EcoRI vµ NotI. Plasmid pCRPA ®−îcsö

dông lµm khu«n ®Ó nh©n vïng gen phy A m· hãa phytaza cña nÊm mèc A. niger. Vector

pPICZα chøa toµn bé gen phy A ®−îcký hiÖu lµ pPICZαPA. Çc plasmid mang gen

phy A ®−îcc¾t kiÓm tra b»ng çc enzym h¹n chÕ EcoRI, NotI vµ c¾t phèi hîp EcoRI /

NotI. KÕt qu¶ c¾t kiÓm tra pPICZαPA ®−îctr×nh bµy trªn ¶nh 21.

M 1 2 3

¶nh 21. S¶n phÈm c¾t kiÓm tra plasmid pPICZαPA trªn gel agarose 0,8% §ưêng ch¹y 1: Thang DNA chuÈn §ưêng ch¹y 2: S¶n phÈm c¾t pPICZαPA b»ng EcoRI §ưêng ch¹y 3: S¶n phÈm c¾t pPICZαPA b»ng NotI §ưêng ch¹y 4: S¶n phÈm c¾t pPICPA b»ng EcoRI/NotI

Theo tÝnh to¸n lý thuyÕt sau khi c¾t b»ng EcoRI vµ NotI, dßng ®èi chøng pPICZαPA cho mét b¨ng duy nhÊt cã kÝch thưíc kho¶ng 4957 bp, vµ khi c¾t pPICZαPA b»ng hai enzym phèi hîp EcoRI / NotI, dßng pPICZαPA t¹o ra hai b¨ng cã kÝch thưíc kho¶ng 1357bp vµ 3600bp. KÕt qu¶ ®iÖn di h×nh 7 cho thÊy çc s¶n phÈm c¾t kiÓm tra cho çc b¨ng DNA cã kÝch thưíc lµ 1357bp vµ 3600bp, ®óng như lý thuyÕt. Như vËy, chóng t«i ®· thiÕt kÕ thµnh c«ng vector pPICZαPA chøa toµn bé gen phy A m· hãa phytaza cña nÊm mèc A. niger ®Ó ®a vµo nÊm men P. pastoris.

BiÕn n¹p vector pPICZαPA vµo tÕ bµo nÊm men P. Pastoris

§Ó kiÓm tra sù cã mÆt cña gene phy A, DNA genome cña chñng t¸i tæ hîp ®−îc t¸ch vµ sö dông lµm khu«n cho qu¸ tr×nh PCR. KÕt qu¶ kiÓm tra ®−îc thÓ hiÖn trªn ¶nh 22.

983 bp831 bp

1357bp

564 bp

-1357bp

152

¶nh 22. §iÖn di s¶n phÈm PCR trªn gel agarose 0,8%

§ưêng ch¹y M: Thang DNA chuÈn

§ưêng ch¹y 1: S¶n phÈm PCR cña chñng t¸i tæ hîp chøa gen phyA

Tõ kÕt qu¶ h×nh 8 cho thÊy s¶n phÈm PCR cã kÝch thưíc kho¶ng 1357bp ®óng

b»ng kÝch thưíc vïng gen phy A theo lý thuyÕt. Chóng t«i kÕt luËn toµn bé vïng gen

phy A ®· ®−îc tÝch hîp vµo hÖ gen cña nÊm men P. pastoris.

BiÓu hiÖn protein t¸i tæ hîp phytaza

Mét sè thÓ biÕn n¹p ®−îc chän läc vµ c¶m øng b»ng 0,5% methanol ®Ó biÓu hiÖn

protein ngo¹i lai trªn çc lo¹i m«i trêng kh¸c nhau. M«i trưêng tèt nhÊt cho qu¸ tr×nh biÓu

hiÖn protein ngo¹i lai phytaza cña nÊm mèc A. niger ®−îc chän lµ m«i trưêng BMMY

(m«i trêng c¶m øng víi nguån çc bon lµ 0,5% methanol). M«i trưêng nµy cho phÐp thu

®−îc lưîng protein ngo¹i lai nhiÒu nhÊt. KÕt qu¶ biÓu hiÖn protein ngo¹i lai ®−îc thÓ hiÖn

trªn ¶nh 23.

116

4335

25

18

kD

66

1 2

¶nh 23. §iÖn di dÞch nu«i cÊy nÊm men

trªn gel polyacrylamide 12,5%

§ưêng ch¹y 1: Thang protein chuÈn

§ưêng ch¹y 2: DÞch nu«i cÊy tÕ bµo nÊm men cã chøa pPICPA

153

Trong tÕ bµo nÊm men th−êng x¶y ra qu¸ tr×nh glycosyl hãa çc protein sau khi

dÞch m·, do ®ã protein ngo¹i lai ®−îcbiÓu hiÖn th−êng ®−îcg¾n thªm çc gèc ®−êng. KÕt

qu¶ ®iÖn di h×nh 7 cho thÊy, phytaza cã kÝch th−íc kho¶ng 67 kDa (cao h¬n tÝnh to¸n

3kDa) ®· ®−îc biÓu hiÖn m¹nh trong tÕ bµo nÊm men P. pastoris sau khi c¶m øng b»ng

methanol 0,5%. Ngoµi ra trªn gel polyacrylamide cßn xuÊt hiÖn 2 b¨ng protein cã khèi

l−îng ph©n tö kho¶ng 43kDa vµ 110 kDa. Tõ kÕt qu¶ trªn chóng t«i kÕt luËn protein t¸i tæ

hîp PhyA cña nÊm mèc A. niger ®· ®−îcbiÓu hiÖn thµnh c«ng trong nÊm men P. pastoris.

Thö ho¹t tÝnh phytaza cña chñng nÊm men t¸i tæ hîp

DÞch næi cña chñng nÊm men P.pastoris vµ chñng nÊm men P.pastoris t¸i tæ hîp

nu«i cÊy trªn m«i tr−êng BMMY cã bæ sung 0,5% phytat natri ®· ®−îckiÓm tra ho¹t tÝnh

b»ng ph¬ng ph¸p ®ôc lç th¹ch. KÕt qu¶ cho thÊy vßng trong ®· xuÊt hiÖn quanh lç th¹ch

cã chøa dÞch næi cña chñng nÊm men P.pastoris t¸i tæ hîp. §iÒu ®ã chøng tá r»ng chñng

nÊm men P.pastoris t¸i tæ hîp ®· mang gen phy A.

Ảnh 24. Vòng phân giải phytat natri của dịch nổi của chủng nấm men P.pastoris tái tổ hợp

154

3.NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ LÊN MEN AXIT AMIN VÀ

ENZYM Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ QUI MÔ 150L/MẺ VÀ 1500L/MẺ

3. 1. Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men L-Lyzin

3. 1.1. Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men L-Lyzin ở qui mô phòng thí nghiệm

3.1.2 Lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp L-Lysin sản lượng cao

Có thể nói việc lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp L-Lysin

đạt sản lượng cao là vô cùng quan trọng. Nó có một ý nghĩa thực tiễn cho việc sử dụng để

sản xuất L-Lysin trên qui mô lớn. Chúng tôi đã lên men chủng C.glutamicum 36000 đã

đột biến, được đặt tên là đột biến thể CM24 dị dưỡng homoserin cho sinh thích hợp L-

Lysin trên 4 loại môi trường khác nhau gồm: Môi trường L1, môi trường L2, môi trường

L3. Tiến hành lên men trên hệ thống lên men chìm sục khí 50l/mẻ (qui mô phòng thí

nghiệm). Kết quả được trình bày ở bảng 35.

Bảng 35: Khả năng sinh tổng hợp L-lysine của đột biến thể CM24 trên 4 loại

môi trường khác nhau

Sản lượng L-lysin (g/l) Chủng

L1 L2 L3 L4

Đột biến thể CM24 22 25 30 18

Kết quả ở bảng 35 cho thấy: Đột biến thể CM24 của chủng C.glutamicum 3600 sau

khi lên men đã cho sản lượng cao hơn rất nhiều so với chủng C.glutamicum 3600 tự

nhiên. Chủng C.glutamicum 3600 đã đột biến cho sản lượng cao nhất trên môi trường L3

là 30 g/l cao hơn 20 lần so với chủng C.glutamicum 3600 tự nhiên khi lên men trên môi

trường L2 chỉ cho sản lượng 1,5g/l.

Như vậy môi trường L3 đã cho sản lượng L-lysin cao nhất là 30g/l, vì vậy môi

trường L3 là môi trường thích hơp có thể dùng để sản xuất L-lysin ở qui mô công

nghiệp.

155

3.1.1.2.1Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh thích hợp L-lysin

3.1.1.2.1.1 Động thái sinh tổng hợp L-lysin

§éng th¸i sinh tæng hîp L-lysin ë hÖ thèng lªn me qui m« 50l/mÎ

0

5

10

15

20

25

30

35

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78

Thêi gian

Hµm

l−în

g L

-lys

in g

/l

L−îng sinh khè g/l

Hµm l−îng L-lysin g/l

Đồ thị 1: Động thái sinh tổng hợp L-lysin ở qui mô phòng thí nghiệm

Từ kết quả ở đồ thị 1 cho thấy động thái của quá trình sinh tổng hợp L-lysin ở qui

mô phòng thí nghiệm trong điều kiện được xác định: sinh khối phát triển cực đại ở 24 giờ,

pha cân bằng bắt đầu từ 24 giờ đến 78 giờ. Hàm lượng L-lysin tăng mạnh từ 18 giờ đến

72 giờ. Hàm lượng L-lysin đạt cao nhất là 30g/lit.

3.1.1.2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp L-lysin của

đột biến thể CM24 khi lên men ở tăng 50l/mẻ

Sau khi xác định được môi trường thích hợp cho sản lượng L-lysin cao, chúng tôi

tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp L-lysin. Đột biến thể

CM24 được lên men trên môi trường L3 ở các nhiệt độ 20oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC với thời

gian lên men là 3 ngày. Kết quả được trình bày ở đồ thị sau:

156

Đồ thị 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men tới khả năng sinh tổng hợp L-lysin của đột biến thể CM24 ở hệ thống lên men 50lít/mẻ

Kết quả ở đồ thị 2 cho thấy đột biến thể CM24 khi lên men ở nhiệt độ 30oC đã cho

sản lượng L-lysin đạt cao nhất là 31g/l. Vì vậy có thể nói rằng nhiệt độ 30oC là thích hợp

cho quá trình lên men sinh tổng hợp L-lysin.

3.1.1.2.1.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp L-lysin trong

quá trình lên men ở hệ thống lên men 50 lít/mẻ

Chúng tôi đã tiến khành khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến sản

lượng L-lysin. Kết quả được chỉ ra ở bảng 36.

Bảng 36: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp L-lysin của đột

biến thể CM24

PH môi trường 6,0 6,5 7,0 7,5

Sản lượng L-lysin (g/l) 18 23 31 25,5

Kết quả ở bảng 36 cho thấy đột biến thể CM24 khi lên men ở môi trường có pH =

7,0 đã cho sản lượng L-lysin cao nhất, đạt 31g/l. Vì vậy đây là pH tối ưu cho quá trình

sinh tổng hợp L-lysin.

¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é lªn men ®Õn s¶n l−îng L-lysin

0

10

20

30

40

20 25 30 35

NhiÖt ®é (0C)S¶

n l−

îng

L-l

ysin

(g

/l)

157

3.1.1.2.1.4. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến khả năng sinh tổng hợp L-lysin trong

quá trình lên men ở tăng lên men 50l/mẻ

Bảng 37: Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến khả năng sinh tổng hợp L-lysin

của đột biến thể CM24 trên hệ thống lên men 50l/mẻ

Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Thời gian lên

men (giờ) Độ oxy hòa tan (%)

Sản lượng L-lysin (g/l)

Độ oxy hòa tan (%)


0 100 - 100 -

12 100 - 100 -

24 100 3,8 90 3,1

36 100 8,1 90 6,8

48 100 16,0 90 14,0

60 100 24,2 90 21,5

72 100 32,2 90 28,2

84 100 30,0 90 25,2

Kết quả ở bảng 37 cho thấy khi điều khiển độ oxy hòa tan trong suốt quá trình lên

men là 100% sản lượng L-lysin là 32,2 g/l tạI thời điểm 72 giờ. Khi độ oxy hòa tan thay

đổI trong quá trình lên men, giảm từ 100% từ giờ thứ 12 đến giờ 24 xuống còn 90% ở

thời gian còn lại của quá trình lên men, sản lượng L-lysin giảm xuống còn 28,2g/l. Như

vậy có thể nói rằng đột biến thể CM 24 là chủng hiếu khí cao rất, cần oxy trong quá trình

sinh tổng hợp L-lysin.

3.1.1.3. Công nghệ thu hồi L-lysin

Dịch sau khi lên men được li tâm trên hệ thống li tâm liên tục với vận tốc

16000v/phút để loại xác tế bào vi khuẩn, thu dịch nổi. Tiến hành sắc ký trao đổi cation

bằng nhựa Dowex 50. Dịch chiết rút của quá trình sắc ký trao đổi ion được cô đặc bằng

thiết bị cô chân không RP2 của Anh quốc rồi phối trộn phụ gia để thành chế phẩm axit

amin L-lysin. Kết quả được chỉ ra ở bảng 38.

158

Bảng 38: Hiệu quả thu hồi L-lysin

Dịch L-lysin sau lên men Lượng L-lysin (g/1000l) Trước thu hồi 30 200

Thu hồi bằng sắc ký và cô chân không 27180

Hiệu quả thu hồi 90 %

Kết quả bảng 38 cho thấy lượng L-lysin trong dịch lên men ban đầu theo tính toán thu

được là 30 200g/1000l , sau thu hồi bằng li tâm và chạy sắc ký trao đổi ion, lượng L-lysin thu

được là 27 180g/1000l, đạt tỷ lệ thu hồi 90 %.

3.1.2. NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ LÊN MEN AXIT AMIN L-LYSIN TRÊN MÔI TRƯỜNG RỈ ĐƯỜNG Ở HỆ THỐNG LÊN MEN CHÌM SỤC KHÍ 150L/MẺ 3.1.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng L-lysin của chủng C.glutamicum đột biến CM24 trên hệ thống lên men chìm sục khí 150l/mẻ Đồ thị 3: Động thái sinh tổng hợp L-lysin của chủng C.glutamicum đột biến CM24

trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 150l/mẻ

§éng th¸i sinh tæng hîp L-lysin trªn hÖ thèng lªn men ch×m sôc khÝ qui m« 150 l/mÎ

0

5

10

15

20

25

30

35

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78

Thêi gian (giê)

S¶n

L−î

ng

sin

h k

hè

i

S¶n l−îng sinh khèi (g/l)

S¶n l−îng L-lysin (g/l)

Kết quả ở đồ thị 3 cho thấy động thái của quá trình sinh tổng hợp L-lysin ở qui

mô phòng thí nghiệm trong điều kiện được xác định: sinh khối phát triển cực đại ở 24 giờ,

159

pha cân bằng bắt đầu từ 24 giờ đến 78 giờ. Hàm lượng L-lysin tăng mạnh từ 18 giờ đến

72 giờ. Hàm lượng L-lysin đạt cao nhất là 30g/lit.

3.1.2.2. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sản lượng L-lysin của chủng C.glutamicum đột biến CM24 trến hệ thống lên men chìm sục khí 150l/mẻ

Bảng 39: Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sản lượng L-lysin của chủng C.glutamicum đột biến CM24 trến hệ thống lên men chìm sục khí 150l/mẻ






0 100 - 100 - 12 100 - 100 - 24 100 3,8 90 3,1 36 100 8,1 90 6,8 48 100 16,0 90 14,0 60 100 24,2 90 21,5 72 100 30,2 90 28,2 84 100 30,2 90 28,2

Kết quả bảng 39 cho thấy khi điều khiển độ oxy hòa tan trong suốt quá trình lên

men là 100% sản lượng L-lysin là 30,2g/l tại thời điểm 72 giờ. Khi điều chỉnh độ oxy hòa

tan từ 100% ở giờ thứ nhất đến giờ thứ 24 xuống còn 90% ở thời gian còn lại của quá

trình lên men, sản lượng L-lysin giảm xuống còn 28,2g/l. Như vậy, có thể nòi rằng chủng

C.glutamicum là chủng hiếu khí cao và rất cần oxy trong quá trình sinh tổng hợp L-lysin.

160

3.1.3. NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ LÊN MEN AXIT AMIN L-

LYSIN TRÊN MÔI TRƯỜNG RỈ ĐƯỜNG Ở HỆ THỐNG LÊN MEN CHÌM SỤC

KHÍ 1500L/MẺ

3.1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng L-lysin của chủng

C.glutamicum đột biến CM24 trên hệ thống lên men chìm sục khí 1500l/mẻ

Đồ thị 4: Động thái sinh tổng hợp L-lysin của chủng C.glutamicum đột biến CM24


Kết quả ở đồ thị 4 cho thấy động thái của quá trình sinh tổng hợp L-lysin ở qui

mô 1500 l/mẻ trong điều kiện được xác định: sinh khối phát triển cực đại ở 24 giờ, pha

cân bằng bắt đầu từ 24 giờ đến 78 giờ. Hàm lượng L-lysin tăng mạnh từ 18 giờ đến 72

giờ. Hàm lượng L-lysin đạt cao nhất là 30g/lit.

Như vậy ở hệ thống lên men 1500l/mẻ, sản lượng L-lysin ở 72 giờ là 28,5g/l. Sản

lượng này giảm hơn so với sản lượng ở tăng 150l/mẻ Chúng tôi cho rằng hiệu quả khuấy

của tăng 1500l/mẻ có kém hơn so với tăng 150l/mẻ đã dẫn đến kết quả trên.

§éng th¸i sinh tæng hîp L-lysin ë hÖ thèng lªn men 1500l/mÎ

0

5

10

15

20

25

30

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78

Thêi gian (giê)

S¶n

l−în

g (g

/l)

S¶n l−îng sinh khè (g/l)i

S¶n l−îng L-lysin (g/l)

161

3.1.3.2. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sản lượng L-lysin của chủng

C.glutamicum đột biến CM24 trên hệ thống lên men chìm sục khí 1500l/mẻ

Bảng 40: Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sản lượng L-lysin của chủng

C.glutamicum đột biến CM24 trên hệ thống lên men chìm sục khí 1.500l/mẻ


men (giờ) Độ oxy hòa

tan (%)

Sản lượng L-

lysin (g/l)

Độ oxy hòa

tan (%)

Sản lượng L-

lysin (g/l)

0 100 - 100 -

12 100 - 100 -

24 100 3,8 90 3,1

36 100 8,1 90 6,8

48 100 16,0 90 14,0

60 100 24,2 90 21,5

72 100 28,5 90 25,5

84 100 28,5 90 25,5

Kết quả ở bảng 40 cho thầy khi điều chỉnh độ oxy hòa tan trong suốt quá trình lên

men là 100% sản lượng L-lysin là 28,5 g/l tại thời điểm 72 giờ trên môi trường L3. Khi độ

oxy hòa tan được thay đổi trong quá trình lên men, giảm từ 100% từ giờ thứ nhất đến giờ

thứ 24 xuống còn 90% ở thời gian còn lại của quá trình lên men, sản lượng L-lysin giảm

xuống còn 25,5 g/l. Như vậy có thể nói rằng chủng C.glutamicum là chủng hiếu khí cao

và rất cần oxy trong quá trình sinh tổng hợp L-lysin.

162

Ảnh 25.Hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1500 l/ mẻ của Viện Cơ điện

Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

3.1.4. Tạo chế phẩm L-lysin

L-lysin sau khi thu hồi bằng sắc ký trao đổi ion và cô đặc bằng cô chân không

được phối trộn với bột sắn tinh theo tỷ lệ L-lysin/bột sắn là 7:3. Tiến hành sấy khô hỗn

hợp ở nhiệt độ 50-55oC thu được thành phẩm chứa 70% L-lysin.

163

QUI TRÌNH 1 :

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN L-LYSIN QUI MÔ 1500L/MẺ

Đột biến thể CM24 từ chủng C.glutamicum 3600 giữ giống trên

ống thạch nghiêng

Nhân giống trên bình tam giác nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 24giờ trên

môi trường L3, t = 300C, pH=7.0

Nhân giống trên hệ thống lên men 150l/mẻ trong 24giờ trên môi trường L3, t = 300C, pH=7.0, DO =100%, Vận tốc cánh khuấy 200V/phút, tỉ lệ tiếp

giống10%

Lên men trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong 72giờ trên môi trường L3, t = 300C, pH=7.0, DO

=100%, Vận tốc cánh khuấy 200V/phút

164

QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ THU HỒI VÀ TẠO CHẾ PHẨM L-LYSIN

Miêu tả qui trình công nghệ sản xuất L-lysin qui mô 1000l/mẻ.

Dịch lên men L-lysin

Ly tâm liên tục ở vận tốc 16000v/phút, loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi

Sắc ký trao đổi cation bằng nhựa Dowex 50

Dịch chiết rút được cô đặc bằng cô chân không đến thể tích1/10

Dịch L-lysin được phối trộn phụ gia(L-Lysin/bột sắn là 7/3)

Chế phẩm L-lysin

Sấy khô hỗn hợp ở nhiệt độ 50-550C đến hàm ẩm chế phẩm đạt 12%

165

Chủng Corynebacterium glutamicum đột biến dị dưỡng homoserin giữ ở ống thạch

nghiêng ở 40C trên môi trường L3 (Giống gốc giữ bằng phương pháp đông khô và bảo

quản trong tủ lạnh -200C). Nhân giống trong bình tam giác 500ml có chứa 150ml môi

trường L3 (thành phần gồm (g/l) rỉ đường 130, NH4Cl 20, Urê 5, KH2PO4 1,

MgSO4.7H2O 0,4; FeSO4.7H2O 10mg; MnSO4.4H2O 8mg; đậu tương thủy phân 10;

thiamin 0,1mg; biotin 0,3mg; pH = 7) tỷ lệ tiếp giống là 10%. Nuôi cấy lắc ở vận tốc

200v/phút trong 24h. Nhân giống trên hệ thống lên men 150l/mẻ trong 24h trên môi

trường L3 tỷ lệ tiếp giống là 10%. Lên men L-lysin trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong

72h trên môi trường L3, tỷ lệ tiếp giống là 10%. Ly tâm ở vận tốc 16.000v/phút, loại bỏ

xác tế bào, thu dịch nổi. Tiến hành sắc ký trao đổi cation bằng nhựa Dowex 50 có nhóm

axit và rửa giải bằng dung dịch amonium hydroxid. Dịch chiết rút chứa L-lysin được cô

đặc bằng cô chân không đến thể tích1/10 sau đó được axit hóa bằng HCl và kết tinh bằng

hạ nhiệt độ, dịch L-lysin cô đặc được phối trộn với bột sắn theo tỷ lệ 7:3. Tiến hành sấy

khô hỗn hợp ở nhiệt độ 500C – 550C, thu được thành phẩm dạng bột chứa 70% L-lysin,

với hàm ẩm 12%.

Tính toán hiệu quả kinh tế

Chúng tôi sơ bộ tính giá thành sản xuất thử cho 30 kg L-lysin cho 1 mẻ sản xuất ở hệ

thống lên men chìm sục khí 1500 l/ mẻ như sau:

Tiền môi trường cho lên men: 50 000 đ/ kg Tiền hóa chất cho thu hồi axit amin: 15 000 đ/ kg Tiền năng luợng và khấu hao thiết bị : 27 000đ/kg Tiền nhân công : 15 000 đ/ kg Tổng : 107 000 đ/kg 3.2. NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ LÊN MEN L-METHIONIN

3.2.1. Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men L-mehionin trên hệ thống lên

men 50l/mẻ

3.2.1.1. Lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp methionin đạt sản lượng cao

166

Chúng tôi đã lên men chủng C.acetogluatamium 309 đã đột biến (được đặt tên là

đột biến thể M1) sinh tổng hợp methionin trên 4 loại môi trường khác nhau gồm: Môi

trường MT1, MT2, MT3, MT4.

Bảng 41: Khả năng sinh tổng hợp methionin của đột biến thể M1 trên các

môi trường lên men khác nhau

Sản lượng Methionin (g/l) Chủng

MT1 MT2 MT3 MT4

Đột biến thể

M1 20 25,5 29,5 23,

Kết quả bảng 41 cho thấy trên cùng môi trường lên men MT2 sản lượng lên men

methionin thu được từ đột biến thể M1 đã cho sản lượng methionin là 25,5 g/l, trong khi

đó chủng C.acetogluatamium 309 tự nhiên chỉ đạt là 1,4 g/l. Sản lượng methionin khi lên

men trên tăng 50 l/mẻ ở trên các môi trường sau 3 ngày cho sản lượng methionin cao nhất

29,5g/l trên môi trường MT3. Vì vậy môi trường MT3 là môi trường thích hợp nhất và có

thể ứng dụng cho công nghệ lên men methionin ở quy mô lớn.

3.2.1.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp methionin

3.2.1.2.1. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp methionin của

đột biến thể M1 khi lên men ở tăng 50 l/mẻ

Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sản lượng

methionin trong quá trình lên men, kết quả được chỉ ra ở bảng 42.

Bảng 42: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

methionin của đột biến thể M1 khi lên men ở tăng 50 l/mẻ

pH môi trường 6,0 6,5 7,0 7,5

Sản lượng

Methionin (g/l) 20 22,5 31 24,5

167

Kết quả ở bảng 42 cho thấy đột biến thể M1 khi lên men trên môi trường rỉ đường

MT3 có pH = 7,0 đã cho sản lượng L-methionin cao nhất, đạt 31 g/l. Như vậy pH 7,0 là

pH tối ưu cho sinh tổng hợp L-methionine.

3.2.1.2.2. Động thái sinh tổng hợp L-methionin

§éng th¸i sinh tæng hîp L-methionin ë hÖ thèng lªn men qui m« 50l/mÎ

0

5

10

15

20

25

30

35

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Thêi gian (giê)

S¶n

l−în

g L

-met

hion

in (

g/l)

L−îng sinh khèi g/l

S¶n l−îng L-methionin g/l

Đồ thị 5: Động thái sinh tổng hợp L-methionin ở hệ thống lên men qui mô 50l/mẻ

Từ kết quả ở đồ thị 5: động thái của quá trình sinh tổng hợp L-methionine ở qui mô

phòng thí nghiệm trong điều kiện được xác định: sinh khối phát triển cực đại ở 24 giờ,

pha cân bằng bắt đầu từ 24 giờ đến 78 giờ. Hàm lượng L-methionine tăng mạnh từ 18 giờ

đến 72 giờ. Hàm lượng L-methionine đạt cao nhất là 30,5g/lit.

3.2.1.2.3. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến khả năng sinh tổng hợp L-

methionin của đột biến thể M1 khi lên men ở tăng 50 l/mẻ

Chúng tôi tiến hành điều chỉnh lượng oxy hòa tan trong hệ tăng lên men bằng cách giữ

nguyên độ oxy hòa tan 100% hoặc giảm độ oxy hòa tan xuống còn 90% từ 18 giờ. Kết

quả thu được thể hiện ở bảng 43:

168

Bảng 43. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến khả năng sinh tổng hợp L-methionin của đột biến thể M1 khi lên men ở tăng 50 l/mẻ


men (giờ) Độ oxy hòa tan

(%)

Sản lượng L-methionin (g/l)

Độ oxy hòa tan

(%)


0 100 - 100 - 6 100 - 100 - 12 100 - 100 - 18 100 1,3 90 1,3 24 100 3,3 90 3,3 30 100 5,1 90 4,9 36 100 7,4 90 6,8 42 100 11,7 90 10 48 100 15,6 90 14,5 54 100 19,3 90 16,0 60 100 23,5 90 19,5 66 100 27,2 90 21,0 72 100 30,5 90 23,5 78 100 30,5 90 23,5

Kết quả bảng 43 cho thấy khi điều khiển độ oxy hòa tan trong suốt quá trình lên

men là 100% thì sản lượng L-methionin đạt 30,5 g/l tại thời điểm 72 giờ. Khi độ oxy hòa

tan được thay đổi trong quá trình lên men, giảm từ 100% xuống còn 90% từ giờ thứ 18

cho đến hết quá trình lên men sản lượng L-methionin giảm xuống còn 23,5 g/l tạI thời

điểm 72 giờ. Như vậy có thể nói rằng đột biến thể M1 là chủng hiếu khí cao và rất cần

trong quá trình sinh tổng hợp L-methionin.

3.2.1.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp L-methionin của đột

biến thể M1 khi lên men ở tăng 50 l/mẻ

Sau khi xác định được môi trường thích hợp cho sản lượng L-methionin cao,

chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp L-

methionin. Đột biến thể M1 được lên men trên môi trường rỉ đường MT3 ở các nhiệt độ 200C,

250C, 300C, 350C và thời gian lên men là 3 ngày. Kết quả thu được trình bày ở bảng 44.

169

Bảng 44: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp L-methionin

của đột biến thể M1 khi lên men ở tăng 50 l/mẻ

Nhiệt độ lên

men 200C 250C 300C 350C

Sản lượng L-

methionin 18 23 30,5 25

Kết quả ở bảng 44 cho thấy đột biến thể M1 khi lên men ở nhiệt độ 300C sản lượng

L-methionin đạt cao nhất là 30,5 g/l. Như vậy nhiệt độ 300C là thích hợp cho quá trình lên

men sinh tổng hợp L-methionin.

3.2.2 NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AMIN L-

METHIONIN TRÊN MÔI TRƯỜNG RỈ ĐƯỜNG Ở HỆ THỐNG LÊN MEN

CHÌM SỤC KHÍ QUI MÔ 150L/MẺ

3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng L-methionin trên môi

trường L3 trên hệ thống lên men chìm sục khí 150l/mẻ

Sau khi nghiên cứu động thái sinh tổng hợp L-methionin ở qui mô phòng thí

nghiệm 50l/mẻ, chúng tôi tiến hành lên men trên hệ thống lên men qui mô 150l/mẻ Động

thái sinh tổng hợp L-methionin của chủng C.acetoglutamicum đột biến M1 trên hệ thống

lên men chìm sục khí 150l/mẻ được thể hiện ở đồ thị 6:

170

§éng th i sinh tæng hîp L-methionin ë hÖ th«ng lªn men qui m« 150l/mÎ

0

5

10

15

20

25

30

35

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Thêi gian (giê)

S¶n

l−în

g L

-met

hion

in (

g/l)



Đồ thị 6: Động thái sinh tổng hợp L-methionin

Từ kết quả ở đồ thị 6: cho thấy động thái của quá trình sinh tổng hợp L-methionine

ở qui mô phòng thí nghiệm trong điều kiện được xác định: sinh khối phát triển cực đại ở

24 giờ, pha cân bằng bắt đầu từ 24 giờ đến 78 giờ. Hàm lượng L-methionine tăng mạnh từ

18 giờ đến 72 giờ. Hàm lượng L-methionine đạt cao nhất là 30,5g/lit.

3.2.2.2. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sản lượng L-methionin của chủng

C.acetoglutamicum đột biến M1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 150l/mẻ

Kết quả ở bảng 45 cho thấy khi điều khiển độ oxy hòa tan trong suốt quá trình lên

men là 100% sản lượng L-methionin là 30,5 g/l tại thời điểm 72 giờ. Khi độ oxy hòa tan

được thay đổi trong quá trình lên men,giảm từ giờ thứ 18 xuống còn 90% ở thời gian còn

lại của quá trình lên men, sản lượng L-methionin giảm xuống còn 26,1g/l. Như vậy có thể

nói rằng chủng C.acetoglutamicum M1 là chủng hiếu khí cao và rất cần oxy trong quá

trình sinh tổng hợp L-methionin.

171

Bảng 45: Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sản lượng L-methionin của

chủng C.acetoglutamicum đột biến M1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô

150l/mẻ






0 100 - 100 -

6 100 - 100 -

12 100 - 100 -

18 100 1,3 90 1,3

24 100 3,3 90 3,3

30 100 5,1 90 4,9

36 100 7,4 90 6,8

42 100 11,7 90 10

48 100 15,6 90 14,5

54 100 19,3 90 16,0

60 100 23,5 90 19,5

66 100 27,2 90 21,0

72 100 30,5 90 26,1

78 100 30,5 90 26,1

3.2.3. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AMIN L-

METHIONIN TRÊN MÔI TRƯỜNG RỈ ĐƯỜNG Ở HỆ THỐNG LÊN MEN

CHÌM SỤC KHÍ QUI MÔ 1500L/MẺ

3.2.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng L-methionin trên môi

trường L3 trên hệ thống lên men chìm sục khí 1500l/mẻ

Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành lên men tiếp theo ở hệ thống lên men qui mô

1500l/mẻ Kết quả được thể hiện ở đồ thị 7:

172

§éng th¸i sinh tæng hîp L-methionin ë hÖ thèng lªn men qui m« 1500l/mÎ

0

5

10

15

20

25

30

35

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Thêi gian (giê)

S¶n

l−în

g L

-met

hion

in (

g/l)



Đồ thị 7 Động thái sinh tổng hợp L-methionin ở quy m ô 1500l ít/m ẻ

Từ kết quả ở đồ thị 7 : cho thấy động thái của quá trình sinh tổng hợp L-

methionine ở qui mô phòng thí nghiệm trong điều kiện được xác định: sinh khối phát triển

cực đại ở 24 giờ, pha cân bằng bắt đầu từ 24 giờ đến 78 giờ. Hàm lượng L-methionine

tăng mạnh từ 18 giờ đến 72 giờ. Hàm lượng L-methionine đạt cao nhất là 29g/lit.

3.2.3.2. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sản lượng L-methionin của chủng C.

acetoglutamicum đột biến M1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1500l/mẻ

Kết quả bảng 46 cho thấy khi cho thấy điều chỉnh độ oxy hòa tan trong suốt quá

trình lên men là 100% sản lượng L-methionin là 29g/l tại thời điểm 72 giờ. Khi độ oxy

hòa tan được thay đổi trong quá trình lên men, sản lượng L-methionin giảm xuống còn

90% ở thời gian 24 giờ cho đến hết thời gian lên men, sản lượng L-methionin còn lại là

24,1g/l. Như vậy có thể nói rằng chủng C.acetoglutamicum là chủng hiều khí cao và rất

cần oxy trong quá trình sinh tổng hợp L-methionin.

173

Bảng46: Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sản lượng L-methionin cảu chủng C.acetoglutamicum đột biến M1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1500l/mẻ


men (giờ) Độ oxy hòa

tan (%)

Sản lượng L-

methionin (g/l)

Độ oxy hòa

tan (%)

Sản lượng L-

methionin (g/l)

0 100 - 100 -

6 100 - 100 -

12 100 - 100 -

18 100 1,3 90 1,3

24 100 3,3 90 3,3

30 100 5,1 90 4,9

36 100 7,4 90 6,8

42 100 11,7 90 1,0

48 100 15,6 90 14,5

54 100 19,3 90 16,0

60 100 23,5 90 19,5

66 100 27,2 90 21,0

72 100 29 90 24,1

78 100 29 90 24,1

3.2.4. Công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm L-methionin

Dịch L-methionin sau lên men được ly tâm ở hệ thống li tâm liên tục với vận tốc

16.000v/phút để loại xác tế bào. Thu dịch nổi và tiến hành làm sắc ký trao đổi cation bằng

174

nhựa Dowex 50. Dịch chiết rút của quá trình sắc ký trao đổi catiion được cô bằng thiết bị

cô chân không rồi phối trộn phụ gia thành chế phẩm L-methionin . Kết quả được chỉ ra ở

bảng 47.

Bảng 47. Hiệu quả thu hồi L- methionin

Dịch l-methionin sau lên men Lượng L-methionin (g/1000l)

Trước khi thu hồi 29 000

Sau khi thu hồi 26100

Hiệu quả thu hồi 90 %

Kết quả bảng 47 cho thấy lượng L-methionin trong 1000 l dịch lên men ban đầu

theo tính toán thu được là 29 000 g. Thực tế sau thu hồi, lượng L-methionin thu được là

26 100 g/ 1000 l, đạt tỷ lệ thu hôì 90%.

3.2.5.Tạo chế phẩm L-methionin

L-methionin sau khi thu hồi được phối trộn với bột sắn tinh theo tỷ lệ L-methionin/bột

sắn là 7/3. Tiến hành sấy khô hỗn hợp ở nhiệt độ 40 – 50 0C, thu được chế phẩm chứa 70

% L-methionin.

175

QUI TRÌNH 2:

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN L-METHIONIN QUI MÔ 1500L/MẺ

Đột biến thể M1từ chủng C.acetoglutamicum 309 giữ giống

trên ống thạch nghiêng

Nhân giống cấp1 trên bình tam giác nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 24giờ

trên môi trường MT3, nhiệt độ 300C, pH=7.0

Nhân giống cấp 2 trên hệ thống lên men 150l/mẻ trong 24giờ trên môi trường MT3, vận tốc cánh khuấy 200V/phút, DO=100%, nhiệt độ

300C, pH=7.0, tỉ lệ tiếp giống 10%

Lên men trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong 72giờ trên môi trường MT3, vận tốc

cánh khuấy 200V/phút, DO=100%, nhiệt độ 300C, pH=7.0.

176

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ THU HỒI VÀ TẠO CHẾ PHẨM

L-METHIONIN.

Miêu tả qui trình công nghệ sản xuất L-methionin qui mô 1000l/mẻ.

Chủng Corynebacterium acetoglutamicum đột biến dị dưỡng với cystein giữ ở ống thạch nghiêng ở 40C trên môi trường MT3 (hàng tháng phải cấy truyền giống. Giống gốc giữ bằng phương pháp đông khô và bảo quản trong tủ lạnh -200C). Nhân giống trong bình

Dịch lên men L-methionin

Ly tâm ở vận tốc 16000v/phút, loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi

Sắc ký trao đổi cation bằng nhựa Dowwex 50

Dịch chiết rút được cô đặc bằng cô chân không

L-methionin được phối trộn phụ gia(L-Methionin/bột sắn là 7/3 và chất

bảo quản)

Chế phẩm L-methionin thô

Sấy khô hỗn hợp ở nhiệt độ 50-550C đến hàm ẩm chế phẩm đạt 12%

177

tam giác 500ml có chứa 150ml môi trường MT3 có thành phần gồm (g/l): rỉ đường (80); cystein (0,75); (NH4)2SO4 (5); K2HPO4 (0.5); KH2PO4 (20); MgSO4.7H2O (0,01); MnSO4.4H2O (0,01); biotin (50µg) thiaminhydrochoride (2mg) CaCO3 (2), pH = 7,2. Nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 24h. Nhân giống trên hê thống lên men150l/mẻ trong 24 giờ trên môi trường MT3, tỉ lệ tiếp giống là 10%. Lên men L-Methionin trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong 72 giờ trên môi trường MT3, tỉ lệ tiếp giống là 10%. Ly tâm ở vận tốc 16.000 v/ph, loại bỏ xác tê bào, thu dịch nổi. Tiến hành sắc ký trao đổi cation bằng nhựa Dowex 50 có nhóm axit và rửa giải bằng dung dịch amonium hydroxit. Dịch chiết rút chứa L-Methionin được cô đặc bằng cô chân không đến thể tích 1/10. Sau đó được axit hoá bằng HCl và kết tinh bằng hạ nhiệt độ. Dịch L-Methionin cô đặc được phối trộn với bột sắn với tỉ lệ 7/3 và bổ sung chất bảo quản. Tiến hành sấy khô hỗn hợp ở nhiệt độ 50-550C, thu được thành phần dạng bột chứa 70% L- Methionin với hàm ẩm 12%. Tính toán hiệu quả kinh tế : Chúng tôi sơ bộ tính giá thành sản xuất thử cho 30 kg L-methionin cho 1 mẻ sản xuất ở

hệ thống lên men chìm sục khí 1500 l/ mẻ như sau:

Tiền môi trường cho lên men: 54 000 đ/ kg Tiền hóa chất cho thu hồi axit amin: 15 000 đ/ kg Tiền năng luợng và khấu hao thiết bị : 27 000đ/kg Tiền nhân công : 15 000 đ/ kg Tổng : 111. 000 đ/kg 3.3. NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ LÊN MEN CHỦNG A. NIGER CHO SINH TỔNG HỢP PHYTAZA. 3.3.1. Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men chủng A. niger MP2 sinh tổng

hợp phytaza trên hệ thống lên men 50l/mẻ.

3.3.1.1. Lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao

Có thể nói việc lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp phytaza

hoạt tính cao rất quan trọng. Nó có một ý nghĩa thực tiễn cho việc sử dụng để sản xuất

phytaza trên qui mô lớn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thay thế natri-phytat trong thành

phần môi trường nghiên cứu bằng các nguồn nguyên liệu có chứa hợp chất này như cám

ngô, cám đại mạch, cám gạo, bột đậu tương. Đây là các môi trường rất sẵn có và rẻ tiền.

178

Chúng tôi đã lên men 4 chủng A. niger cho sinh tổng hợp phytaza trên 4 loại môi trường

khác nhau gồm môi trường P2, P3, P4, P5. Kết quả thu được trình bày ở bảng 48.

Bảng 48. Khả năng sinh tổng hợp phytaza của một số chủng A. niger trên các môi trường khác nhau

Hoạt độ phytaza (U/ml) Ký hiệu chủng

P2 P3 P4 P5

A. niger MP2 11 13,5 12 6

A. niger MP7 3 11 11 6

A. niger MP19 6 10 6,5 0,00

A. niger MP35 6 7,5 4 2

Kết quả trình bày ở bảng 48 cho thấy việc sử dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên như

bột ngô, cám đại mạch,…thay thế cho natri-phytat ở dạng hóa chất trong môi trường lên

men không làm giảm khả năng sinh tổng hợp phytaza của các chủng. Các chủng nấm đều

tổng hợp phytaza trên cả 4 loại môi trường nuôi cây. Đối với từng chủng, khả năng sinh

tổng hợp phytaza trên 4 loại môi trường là khác nhau. Đáng chú ý là môi trường P3. Trên

môi trường này, cả 4 chủng A. niger MP2, A. niger MP7 A. niger MP19A. niger MP35

đều có khả năng sinh tổng hợp phytaza với hoạt độ cao nhất. Chủng A. niger MP2 nuôi

trên môi trường này cho enzym với hoạt độ cao nhất là 13,5 U/ml. Chủng A. niger MP19

nuôi trên môi trường P5 không sản sinh ra enzym phytaza.

Trên cơ sở số liệu thu được, để nghiên cứu đặc tính chủng giống và tính chất

enzym được sinh tổng hợp từ các chủng A. niger chúng tôi đã lựa chọn chủng A. niger

MP2 và môi trường P3 vì trên môi trường P3, chủng A. niger MP2 có khả năng sinh tổng

hợp phytaza cao nhất.

3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính phytaza của chủng A. niger MP2

Thời gian lên men là yếu tố công nghệ quan trọng trong công nghệ lên men các

hoạt chất sinh học. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát thời gian lên men của chủng A. niger

179

MP2 trên môi trường P3 có chứa bột ngô và các muối khoáng. Trong quá trình lên men,

chúng tôi tiến hành lấy mẫu lên men từng ngày, bắt đầu từ ngày thứ 2 để xác định hoạt độ

phytaza trong dịch lên men. Kết quả thu được trình bày ở đồ thị sau:.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

2 3 4 5 6 7 8

Ngµy lªn men

Ho¹

t ®é

enzy

m p

hyta

za (

U/m

l)

Ho¹t ®é enzym phytaza (U/ml)L−îng sinh khèi (g/l)

Đồ thị 8: Động thái sinh tổng hợp enzym phytaza ở hệ thống lên men qui mô 50l/mẻ

Kết quả đồ thị 8 cho thấy hoạt độ enzym phytaza tăng dần từ ngày thứ 2 và đạt cao

nhất ở ngày lên men thứ 7 (13,5 U/ml). Ngay sau khi lên men đến ngày thứ 2, chủng A.

niger MP2 đã bắt đầu phát triển và sinh tổng hợp phytaza. Hoạt độ enzym ở ngày thứ 2 là

3,0 U/ml. Sang đến ngày lên men thứ 3, 4 và hoạt độ enzym tăng nhanh và đạt cao nhất

vào ngày thứ 7. Tuy nhiên, hoạt độ enzym phytaza do chủng A. niger MP2 sinh tổng hợp

lại giảm khi thời gian lên men vượt quá ngày thứ 7. Sang ngày thứ 8, hoạt tính của enzym

là 7,0 U/ml rồi tiếp tục giảm trong ngày lên men tiếp theo. Chúng tôi cho rằng, sau 5 ngày

lên men, khi môi trường lên men đã cạn kiệt phytat, có thể chủng A. niger MP2 đã sản

sinh ra enzym proteaza hay một sản phẩm trao đổi chất khác, những chất này có thể là

nguyên nhân gây ức chế và làm giảm hoạt độ của phytaza.

Như vậy động thái sinh tổng hợp phytaza ở quy mô phòng thí nghiệm được xác

định: sinh khối phát triển cực đại ở ngày thứ 4, pha cân bằng bắt đầu từ ngày thứ 4 đến

Động thái sinh tổng hợp enzym phytaza của chủng A. niger quy mô 50l/mẻ

x10

180

ngày thứ 8. Hoạt lực phytaza tăng mạnh từ ngày thứ 2 và đạt cực đại vào ngày thứ 6. Hoạt

lực phytaza đạt cao nhất là 13,5 U/ml.

3.3.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính phytaza của chủng A. niger MP2

Sau khi xác định được thời gian thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp enzym phytaza có

hoạt độ cao, chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men của chủng A. niger MP2

tới hoạt độ của enzym phytaza. Chúng tôi tiến hành lên men chủng A. niger MP2 ở các nhiệt độ

khác là 200C, 250C, 300C, 350C,và 400C với thành phần môi trường P3 và thời gian lên men là 5

ngày. Dịch lên men sau 5 ngày lên men được ly tâm và sau đó đem phân tích để xác định hoạt độ

enzym phytaza. Kết quả được thể hiện ở đồ thị 9.

Đồ thị 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzym phytaza của chủng A.

niger MP2

Kết quả thu được ở đồ thị 9 cho thấy ở nhiệt độ 300C hoạt lực enzym phytaza của

chủng A. niger MP2 đạt cao nhất là 13,5 U/ml. Còn ở các nhiệt độ thấp hơn hay cao hơn

đều không thuận lợi cho sự sinh tổng hợp enzym phytaza có hoạt lực cao. Tại nhiệt độ lên

men là 200C hoạt độ enzym phytaza chỉ đạt 9 U/ml còn ở nhiệt độ lên men là 250C thì

hoạt độ enzym là 12 U/ml. Điều này chứng tỏ rằng chủng A. niger MP2 không phát triển

mạnh ở nhiệt độ 200C – 250C. Ở nhiệt độ lên men là 400C, hoạt độ enzym phytaza cũng

chỉ đạt 8 U/ml. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Wyss và cộng sự [ ] khi

02468

10121416

20 25 30 35 40NhiÖt ®é lªn men

Ho¹

t ®é

enz

ym p

hyta

za (

U/m

l)

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzym phytaza của chủng A. niger MP2

181

nghiên cứu tính bền nhiệt của enzym phytaza bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang.

Ông cho rằng enzym phytaza từ A. niger không có tính bền nhiệt. Nhiệt độ làm biến tính

enzym là 50 –550C. Vì vậy, khi nhiệt độ lên men tăng hơn 350C hoạt tính enzym giảm.

3.3.1.4. Ảnh hưởng của oxy hòa tan đến hoạt độ enzym phytaza của chủng A. niger

MP2 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 50 l/mẻ

Bảng 49. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ enzym phytaza của chủng A. niger MP2 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 50 l/mẻ

Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2

Thời gian lên men (giờ) Độ oxy hòa

tan (%)

Hoạt độ của enzym

phytaza (U/ml)


Hoạt độ của enzym

phytaza (U/ml)

0 100 - 100 - 24 100 - 100 - 36 100 5, 0 100 5,0 48 100 7,6 100 7,6 60 100 8,2 90 8,4 72 100 9,0 90 9,2 84 100 9,6 90 9,7 96 100 9,8 90 10,2

108 100 10,4 90 10,7 120 100 10,6 90 11,1 132 100 11,2 90 11,6 144 100 11,6 90 12,0 156 100 12,1 90 12,8 168 100 12,5 90 13,2 180 100 12,0 90 12,8

Kết quả ở bảng 49 cho thấy từ giờ thứ 36 trở đi ở thí nghiệm 2 độ oxy hòa tan giảm

từ 100% xuống còn 90% đã cho thấy có ảnh hưởng tốt đến sản lượng enzym phytaza, ở

thí nghiệm 2 sản lượng enzym phytaza đạt 13,2 U/ml, trong khi đó ở thí nghiệm 1 đôi oxy

hòa tan luôn luôn giữ ở 100% thì sản lượng enzym phytaza chỉ đạt 12,5 U/ml. Như vậy có

thể nói rằng quá trình sinh tổng hợp enzym phytaza từ chủng A. niger MP2 không cần

oxy ở mức độ cao.

182

3.3.2. Khảo sát nồng độ (NH4)2SO4 kết tủa enzym phytaza của chủng A. niger MP2

Để chọn được nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho kết tủa enzym phytaza, chúng tôi

đã tiến hành khảo sát hiệu quả kết tủa enzim phytaza bằng (NH4)2SO4 ở các ở các nồng

độ khác nhau. Dịch sau kết tủa li tâm 12000v/phút, thu cặn hòa tan trong đệm xitrat pH

4,0 và tiến hành thẩm tích, xác định hoạt tính.

HiÖu suÊt thu håi enzym phytaza b»ng sunfat amon

0

20

40

60

80

100

60 65 70 75

Nång ®é sunfat amon b·o hßa(%)

HiÖ

u su

Êt t

hu h

åi e

nzym

ph

ytaz

a (%

)

Đồ thị 10: Khảo sát nồng độ (NH4)2SO4 kết tủa enzim phytaza của chủng A. niger DL1

Kết quả thu được ở đồ thị 10 cho thấy nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa 65% cho hiệu

suất thu hồi phytaza cao nhất, là 90 %, còn những nồng độ sunfat amon bão hòa thấp hơn

hoặc cao hơn đều cho hiệu suất thu hồi thấp hơn.

3.3.3 Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger MP 2

Chúng tôi đã xác định tính chất của enzym phytaza sinh tổng hợp bởi chủng A.

niger MP2 bao gồm xác định pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzym này.

3.3.3.1. Xác định pH tối ưu của phytaza sinh tổng hợp từ chủng A. niger MP2

Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong phản ứng đến hoạt độ enzym

phytaza của chủng A. niger MP2 thông qua đó nhằm khả sát pH tối ưu cho enzym này.

Việc xác định tính chịu axit của enzym là rất quan trọng, nó giúp cho khả năng hoạt động

183

của nó trong ruột động vật tốt hơn bởi việc sử dụng enzym phytaza trong chăn nuôi luôn

được sử dụng cùng với thức ăn gia súc.

Quá trình khảo sát khi cho dịch enzym thô (dịch lên men A. niger MP2 trên môi

trường P3 lên men trong 5 ngày) cho phản ứng với cơ chất natri-phytat với pH biến đổi

khác nhau từ 4,0 đến 7,5 trong môi trường đệm natri axetat –axit axetic và glycin – HCl.

Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 50.

Bảng 50. Ảnh hưởng của pH phản ứng đến hoạt độ của enzym phytaza

pH phản ứng 4 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5

Hoạt độ enzym

phytaza (U/ml) 6 10 12 13,5 12 10 8 6

Kết quả ở bảng 50 cho thấy enzym phytaza từ chủng A. niger MP2 cho hoạt độ tối ưu là

13,5 U/ml ở pH = 5,5. Ở giá trị pH là 5,0 và 6,0 thì hoạt độ enzym bằng nhau, đạt 12 U/ml. Khi

pH là 4,0 hoặc 7,5 thì hoạt độ enzym chỉ đạt 6U/ml. Kết quả này cho thấy hoạt độ tối ưu của

enzym phytaza trong môi trường axit yếu hoặc môi trường phản ứng quá kiềm thì hoạt độ enzym

giảm nhanh. Như vậy phổ pH hoạt động của enzym phytaza được sinh tổng hợp từ chủng A.

niger MP2 nằm trong khoảng pH từ 4,5 đến 6,5.

3.3.3.2. Khả năng chịu nhiệt của enzym phytaza từ chủng A. niger MP2

Cùng với ảnh hưởng của pH môi trường phản ứng đến hoạt tính của enzym thì nhiệt độ

cũng là một trong các yếu tố ảnh hưởng nhiều đến hoạt độ của enzym. Việc xác định được nhiệt

độ tối ưu cho enzym hoạt động tốt có ảnh hưởng khá nhiều đến công nghệ lên men thức ăn chăn

nuôi sau này. Dải nhiệt độ được khảo sát là từ 300C đến 800C. Sau khi dịch chiết enzym từ môi

trường lên men cho phản ứng với cơ chất tại các giá trị nhiệt độ khác nhau. Kết quả thu được

được trình bày ở bảng 51.

184

Bảng 51. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ của enzym phytaza từ

chủng A. niger MP2.

Nhiệt độ

phản ứng

(0C)

30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

Hoạt độ

enzym

phytaza

(U/ml)

10 10,5 11 11,5 12,5 13 13,5 12 11 8 6

Từ kết quả ở bảng 51 biểu diễn sự biến thiên của hoạt độ enzym phytaza theo nhiệt

độ phản ứng ta thấy rằng hoạt tính của enzym phytaza tăng dần theo sự tăng của nhiệt độ.

Hoạt độ enzym tăng dần từ 300C đến 600C thì đạt giá trị lớn nhất. Tại nhiệt độ là 600C

hoạt độ enzym đạt là 13,5 U/ml. Trong khoảng nhiệt độ từ 650C đến 800C thì hoạt độ của

enzym giảm dần, đặc biệt giảm nhanh ở khoảng nhiệt độ từ 700C đến 800C. Như vậy có

thể nói nhiệt độ thích hợp nhất cho sự hoạt động của enzym phytaza được sinh tổng hợp

từ chủng A. niger MP2 là 600C với hoạt độ xác định được là 13,5 U/ml. Tuy hoạt tính của

enzym tăng dần khi nhiệt độ tăng dần nhưng chúng chỉ tăng trong một giới hạn nhất định,

không vượt quá giới hạn đó. Ở nhiệt độ quá cao, hoạt tính của enzym phytaza bị giảm

mạnh, và gần như mất hoạt tính ở nhiệt độ lớn hơn 900C.

3.3.4. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PHYTAZA Ở HỆ THỐNG LÊN

MEN CHÌM SỤC KHÍ QUI MÔ 150L/MẺ

3.3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp phytaza của

chủng A. niger MP2 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 150l/mẻ

185

0

2

4

6

8

10

12

14

16

2 3 4 5 6 7 8

Ngµy lªn men

Ho¹

t ®é

enzy

m p

hyta

za (

U/m

l)


Đồ thị 11: Động thái sinh tổng hợp enzym phytaza của chủng A. niger MP2


Từ đồ thị 11 cho thấy động thái sinh tổng hợp phytaza ở quy mô 150l/mẻ được xác

định: sinh khối phát triển cực đại ở ngày thứ 4, pha cân bằng bắt đầu từ ngày thứ 4 đến

ngày thứ 8. Hoạt lực phytaza tăng mạnh từ ngày thứ 2 và đạt cực đại vào ngày thứ 6.

Hoạt lực phytaza đạt cao nhất là 13,5U/ml.

3.3.4.2. Ảnh hưởng cuả độ oxy hòa tan đến hoạt độ của chủng A. niger MP2 trên hệ

thống lên men chìm sục khí qui mô 150l/mẻ

Kết quả ở bảng 52 cho thấy, từ ngày thứ 2 trở đi, ở thí nghiệm 2 độ oxy hòa tan

giảm từ 100% xuống còn 90% đã cho thấy ảnh hưởng tốt đên sản lượng phytaza. Ở thời

gian lên men 7 ngày sản lượng phytaza ở thí nghiệm 2 này là 13,1U/ml, trong khi đó ở thí

nghiệm 1 độ oxy hòa tan luôn giữ ở 100%, sản lượng phytaza là 12,8U/ml.

Động thái sinh tổng hợp enzym phytaza của chủng A. niger MP2 quy

x10

186

Bảng 52: Ảnh hưởng cuả độ oxy hòa tan đến hoạt độ của chủng A. niger MP2 trên

hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 150l/mẻ


Thời gian lên

men (ngày) Độ oxy hòa

tan (%)

Hoạt độ

phytaza

(U/ml)

Độ oxy hòa

tan (%)

Hoạt độ

phytaza

(U/ml)

2 100 6,1 90 4,8

3 100 8,2 90 8,2

4 100 10 90 11,2

5 100 11,2 90 11,6

6 100 13 90 122

7 100 12,8 90 13,1

8 100 12,4 90 12,8

9 100 12,0 90 12,0

3.3.5 Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ lên men chủng A. niger MP2 sinh tổng hợp

phytaza trên hệ thống lên men qui mô 1500l/mẻ.

3.3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp phytaza của

chủng A. niger MP2 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1500l/mẻ

Kết quả đồ thị 12 cho thấy động thái sinh tổng hợp phytaza ở quy mô 1500l/mẻ được xác định:

sinh khối phát triển cực đại ở ngày thứ 4, pha cân bằng bắt đầu từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 8.

Hoạt lực phytaza tăng mạnh từ ngày thứ 2 và đạt cực đại vào ngày thứ 6. Hoạt lực phytaza đạt

cao nhất là 12,5U/ml.

187

0

2

4

6

8

10

12

14

2 3 4 5 6 7 8

Ngµy lªn men

Ho¹

t ®é

enzy

m p

hyta

za (

U/l

)


Đồ thị 12: Động thái sinh tổng hợp enzym phytaza của chủng A. niger MP2 trên hệ

thống lên men chìm sục khí qui mô 1500l/mẻ

3.3.5.2. Ảnh hưởng cuả độ oxy hòa tan đến hoạt độ phytaza của chủng A. niger MP2


Bảng 53: Ảnh hưởng cuả độ oxy hòa tan đến hoạt độ của chủng A. niger MP2 trên

hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1500l/mẻ

Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Thời gian lên men (ngày) Độ oxy hòa

tan (%)

HoạT Độ phytaza (U/ml)


HoạT Độ phytaza (U/ml)

2 100 4,1 100 4,8 3 100 4,2 90 8,2 4 100 7,9 90 11,2 5 100 10,8 90 11,6 6 100 11,6 90 12,2 7 100 12 90 12,8 8 100 11,8 90 12,0

Động thái sinh tổng hợp enzym phytaza của chủng A. niger MP2 quy

x10

188

Kết quả ở bảng 53 cho thấy, từ ngày thú 2 trở đi, ở thí nghiệm 2 độ oxy hòa tan

giảm từ 100% xuống còn 90% đã cho thấy ảnh hưởng tốt đên sản lượng phytaza. Ở thời

gian lên men 7 ngày sản lượng phytaza ở thí nghiệm 2 này là 12,8U/ml, trong khi đó ở thí

nghiệm 1 độ oxy hòa tan luôn giữ ở 100%, sản lượng phytaza là 12U/ml. Ở các thời gian

tiếp theo hoạt độ của enzym bắt đầu giảm.

3.3.6. Công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm enzym phytaza

Dịch enzym phytaza sau lên men được ly tâm ở tốc độ 16.000v/phút để loại xác tế

bào, kết tủa protein enzym, ly tâm 12.000v/phút trong 15 phút, thu cặn protein enzym loại

bỏ dịch nổi. Kết quả được trình bày ở bảng 54.

Bảng 54. Tách và tinh chế một phần enzym phytaza ở qui mô 1000 lít/mẻ

Các bước tinh sạch Tổng thể tích (lít)

Hoạt độ tổng (U)

Độ tinh sạch (lần)

Hiệu suất thu hồi (%)

Dịch enzym thô 950 1178000 1 100

Sau kết tủa bằng sunphat amôn 65% bão hòa 71 10602000 13,4 90

Kết quả ở bảng 54 cho thấy tổng hoạt độ enzym trong dịch ban đầu thu được là

11780000 U, khi kết tủa phytaza bằng sunphat amôn 65% bão hòa, hoạt độ của enzym

phytaza còn lại là 10 602 000 U đạt tỷ lệ thu hồi là 90%.

Tạo chế phẩm enzym phytaza dạng bột

Enzym phytaza sau khi tinh sạch một phần được phối trộn với bột sắn và các chất

phụ gia theo tỷ lệ như sau : 71 lít dịch kết tủa + 11 kg bột sắn và chất bảo quản, sau đó

đem đông khô, kết quả là thu được 30 kg chế phẩm enzym phytaza. Như vậy từ 1000 lít

dịch lên men đã sản xuất được 30kg enzym phytaza có hoạt độ là 353 U/g chế phẩm.

189

QUI TRÌNH 3:

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN ENZYM PHYTAZA TỪ CHỦNG A. NIGER

MP2 QUI MÔ 1500L/MẺ

Chủng A. niger MP2 giữ giống trên ống thạch nghiêng

Nhân giống trên bình tam giác nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 48giờ trên môi trường phy3, nhiệt độ 300C, pH=5.5

Nhân giống trên hệ thống lên men 150l/mẻ trong 48giờ trên môi trường phy3, pH=5.5, nhiệt độ

300C, DO=90%, vận tốc cánh khuấy 200 vòng/phút, tỉ lệ tiếp giống 10%

Lên men trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong 144giờ trên môi trường phy3, pH=5.5,

nhiệt độ 300C, vận tốc cánh khuấy 200v/phút, DO=90%.

190

SƠ ĐỒ QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ TINH CHẾ MỘT PHẦN VÀ TẠO CHẾ PHẨM

PHYTAZA

Miêu tả qui trình công nghệ sản xuất phytaza qui mô 1000l/mẻ.

Chủng A. niger giữ ở ống thạch nghiêng ở 40C trên môi trường phy3(P3) (hàng tháng phải cấy truyền giống. Giống gốc giữ bằng phương pháp đông khô và bảo quản

Dịch lên men

Ly tâm liên tục ở vận tốc 16000v/phút trong 15phút loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi chứa

enzym phytaza

Kết tủa bằng sunphat amôn 65% bão hòa

Ly tâm ở hệ thống ly tâm liên tục 16000v/phút thu cặn loại bỏ dịch nổi

Phối trộn chất phụ gia (từ1000l dịch lên men thu được 71 lit dịch kết tủa + 11 kg bột sắn va chất

Bao gói

Thẩm tích qua màng celophan qua đêm, loại bỏ sunphat amon và thu enzym

Chế phẩm enzym phytaza

Đông khô

191

trong tủ lạnh -200C). Nhân giống trong bình tam giác 500ml có chứa 150ml môi trường P3 (thành phần gồm §Ëu t−¬ng: 40g, glucoza: 15g, NaNO3 : 5g, MgSO4.7H2O: 0,5g, KCl: 0,5g, K2HPO4: 0,4g, FeSO4.7H2O: 0,1g, N−íc cÊt: 1lÝt, PH = 6,5 – 7 ) tỷ lệ tiếp giống là 10%. Nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 48h. Nhân giống trên hệ thống lên men 150l/mẻ trong 48h trên môi trường P3 tỷ lệ tiếp giống là 10%. Lên men phytaza trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong 144h trên môi trường P3, tỷ lệ tiếp giống là 10%. Ly tâm ở vận tốc 16.000v/phút, loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi. Kết tủa bằng sunphat amom bão hòa 65%. Ly tâm ở vận tốc 16.000v/phút thu cặn bỏ dịch nổi. sau đó Thẩm tích qua màng celophan qua đêm, loại bỏ sunphat amon và thu enzym, sau đó phối trộn với bột sắn theo tỷ lệ 71 lít dịch kết tủa + 11 kg bột sắn và chất bảo quản, sau đó đem đông khô, kết quả thu được 30 kg chế phẩm Enzim Phytaza. Như vậy từ 1000lít dịch lên men đã sản xuất được 30 kg Enzim Phytaza có hoạt độ là 353 U/g chế phẩm.

Tính toán hiệu quả kinh t ế

Chúng tôi sơ bộ tính giá thành sản xuất thử cho 30 kg enzym phytaza cho 1 mẻ

sản xuất ở hệ thống lên men chìm sục khí 1500 l/ mẻ như sau:

Tiền môi trường cho lên men: 123 000 đ/ kg Tiền hóa chất cho thu hồi enzym: 300 000 đ/ kg Tiền năng luợng và khấu hao thiết bị : 27 000đ/kg Tiền nhân công : 15 000 đ/ kg Tổng : 465 000 đ/kg 3.4. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN CHỦNG A. NIGER ĐL1 SINH

TỔNG HỢP ENZYM PECTINAZA HOẠT LỰC CAO

3.4.1. Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men chủng A. niger DL1 sinh tổng

hợp enzym pectinaza ở qui mô phòng thí nghiệm (qui mô 50l/mẻ)

3.4.1.1. Tuyển chọn môi trường lên men cho sinh tổng hợp enzym pectinaza

Chúng tôi đã khảo sát 4 loại môi trường lên men khác nhau là PC1, PC2, PC3, PC4

cho sinh tổng hợp pectinaza của chủng A. niger ĐL1 theo phương pháp lên men chìm sục

khí. Kết quả được thể hiện ở bảng 55.

192

Bảng 55. Tuyển chọn môi trường lên men cho sinh tổng hợp enzym pectinaza

của chủng A. niger ĐL1 trên các môi trường khác nhau

Môi trường lên men PC1 PC2 PC3 PC4

Hoạt tính của enzym

pectinaza (U/ml) 8,4 9,6 12,2 7,7

Từ kết quả ở bảng 55 cho thấy sản lượng enzym pectinaza của chủng A. niger ĐL1

đạt cao nhất trên môi trường PC3, hoạt độ enzym pectinaza đạt 12,2U/ml, trong khi đó

sản lượng enzym pectinaza của chủng ĐL1 trên các môi trường PC1 chỉ đạt 8,4 U/ml,

trên môi trường PC2 là 9,6 U/ml và trên môi trường PC4 là 7,7 U/ml. Qua kết quả trên

chúng tôi nhận thấy môi trường PC3 là môi trường thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng

hợp enzym pectinaza của chủng A. niger ĐL1.

3.4.1.2. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym

pectinaza

3.4.1.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men

Thời gian lên men là yếu tố công nghệ quan trọng trong công nghệ lên men các

hoạt chất sinh học. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên men

đến sự sinh tổng hợp enzym pectinaza của chủng A. niger ĐL1 trên môi trường PC3. Kết

quả được thể hiện ở đồ thị 13:

§éng th¸i sinh tæng hîp enzym pectinaza ë hÖ thèng lªn men qui m« 50l/mÎ

0

20

40

60

80

100

120

140

24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

Thêi gian (giê)

Ho¹

t ®é

enzy

m p

ecti

naza

(U

/ml)

x1/

10

Ho¹t lùoc enzym pectinaza (U/ml)

L−îng sinh khèi (g/l)

193

Đồ thị. 13: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt độ enzym pectinaza của

chủng A. niger ĐL1

Kết quả ở đồ thị 13 cho thấy: Động thái của quá trình sinh tổng hợp pectinaza ở

qui mô phòng thí nghiệm trong điều kiện được xác định: sinh khối phát triển cực đại 84

giờ. Pha cân bằng bắt đầu từ giờ thứ 84. Hoạt lực pectinaza tăng mạnh từ 48 giờ đến 108

giờ và đạt hoạt lực cao nhất là 12,4U/ml ở tại thời điểm trên.

3.4.1.2.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzym pectinaza

Bảng 56. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzym pectinaza

Nhiệt độ (0C) 20 25 30 35 40

Hoạt độ enzym pectinaza (U/ml) 7,0 10,1 12,4 10,4 7,5

Từ kết quả ở bảng 56 cho thấy ở nhiệt độ lên men là 300C thì hoạt độ của enzym

pectinaza đạt cao nhất đạt 12,4 U/ml. Ở các nhiệt độ thấp hơn và cao hơn đều không thích

hợp cho sinh tổng hợp enzym pectinaza của chủng A. niger ĐL1.

3.4.1.2.3.Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzym pectinaza của chủng A. niger ĐL1

Bảng 57. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzym pectinaza của chủng A. niger ĐL1

trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 50 l/mẻ

pH 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5

Hoạt độ enzym pectinaza (U/ml) 5,2 6,1 7,1 8,4 8,8 12,5 12,5 8,7 8,2

Kết quả ở bảng 57 cho thấy khi pH môi trường đạt từ 5,0 – 5,5 thì hoạt độ của

enzym pectinaza đạt cao nhất là 12,5 U/ml còn khi pH của môi trường là 4,5 và 6,0 thì

hoạt độ enzym pectinaza giảm xuống chỉ còn 8,8 U/ml và 8,7 U/ml. Vậy có thể nói pH tối

ưu của môi trường cho sinh tổng hợp enzym pectinaza của chủng A. niger ĐL1 là từ 5,0 đến 5,5.

194

3.4.1.2.4. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ enzym pectinaza của chủng A.

niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 50 l/mẻ

Bảng 58. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ enzym pectinaza của chủng A.

niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 50 l/mẻ



tan (%)

Hoạt độ enzym

pectinaza (U/ml)


Hoạt độ enzym

pectinaza (U/ml)

0 100 - 100 - 12 100 - 100 - 24 100 5,5 100 5,5 36 100 6,9 100 6,9 48 100 7,7 90 8,3 60 100 8,6 90 9,1 72 100 9,8 90 10,2 84 100 10,6 90 10,9 96 100 11,3 90 11,6

108 100 11,6 90 11,9 120 100 11,9 90 12,1 136 100 11,9 90 12,1

Kết quả bảng 58 cho thấy từ giờ thứ 36 trở đi ở thí nghiệm 2 khi điều chỉnh lượng

oxy hòa tan từ 100% xuống 90% đã cho thấy có ảnh hưởng tốt đến hoạt độ enzym

pectinaza. Hoạt độ enzym pectinaza ở thí nghiệm 2 đạt 12,1 U/ml ở thời gian là 120,

trong khi đó ở thí nghiệm 1 độ oxy hòa tan luôn giữ ở mức 100% thì hoạt độ của enzym

pectinaza chỉ đạt 11,9 U/ml.

3.4.2. Khảo sát nồng độ (NH4)2SO4 kết tủa enzim pectinaza của chủng DL1

Để chọn được nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho kết tủa enzym pectinaza, chúng

tôi đã tiến hành khảo sát hiệu quả kết tủa enzym pectinaza bằng (NH4)2SO4 ở các ở các

nồng độ khác nhau. Dịch sau kết tủa li tâm 12000v/phút, thu cặn hòa tan trong đệm xitrat

pH 4,0 và tiến hành thẩm tích, xác định hoạt tính.

195

HiÖu suÊt thu håi enzym pectinaza b»ng sunfat amon

0

20

40

60

80

100

60 65 70 75

Någ ®é sunfat amon b·o hßa(%)

HiÖ

u su

Êt th

u hå

i enz

ym

pect

inaz

a (%

)

Đồ thị 14. Hiệu suất thu hồi enzym pectinaza bằng sunfat amon

Kết quả thu được ở đồ thị 14 cho thấy nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa 65% cho hiệu

suất thu hồi pectinaza cao nhất, là 90 %, còn những nồng độ sunfat amon bão hòa thấp

hơn hoặc cao hơn đều cho hiệu suất thu hồi thấp hơn.

3.4.3. TÁCH VÀ TINH CHẾ PECTINAZA BẰNG SẮC KHÍ TRAO ĐỔI ION

Bằng việc dùng sắc ký trao đổi cation CM-Sephadex C-50 để tinh chế pectinaza

thô chúng tôi đã thu được pectinaza tinh khiết. Các tiểu phần thu được bằng sắc ký trao

đổi ion đã được đo trên máy quang phổ UV-VIS. Kết quả được chỉ ra ở hình 6.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 5 10 15 20 25

fraction number

A 2

80nm

Hình 6: Phổ hấp phụ của các tiểu phần pectinaza của chủng A. niger ĐL1

196

Từ hình 6 ta có thể thấy rằng 2 đỉnh ở bước sóng 250nm có độ hấp phụ là 0,32 và

0,2 theo thứ tự. Đỉnh đầu với độ hấp phụ là 0,32 đã được chọn để làm điện di trên SDS-

PAGE. Kết quả được chỉ ra ở hình 2. Đường chạy 1 là trọng lượng phân tử của protein

chuẩn, đường chạy 2 là pectinaza tinh chế, đường chạy 3 là pectinaza thô và đường chạy 4

là pectinaza chuẩn của Sigma. Theo kết quả của hình 2, chúng tôi quan sát thấy rằng dải

thứ 2 của đường 2 bằng với dải thứ 3 của đường 4 với trọng lượng phân tử khoảng 63kDa.

Theo báo cáo của Semenove và cộng sự , đó là polygallacturonaza II. Dải thứ 3 của

đường 2 bằng với dải thứ 4 của đường 4. Dải này có trọng lượng phân tử gần bằng 41

kDa, đó là pectinasteraza.

So sánh pectinaza chuẩn của Sigma và pectinaza của chúng tôi do chủng A. niger

ĐL1 sản sinh trên môi trường thịt quả cà phê, chúng tôi kết luận rằng chung A. niger ĐL1

chứa pectinesteraza và polygallacturonaza.

Ảnh 26. Điện di SDS – PAGE của pectinaza tinh chế

197

Biểu thị sự có mặt cellulaza trong dịch lên men thịt quả cà phê của chủng A. niger

ĐL1

Bằng việc cho dịch lên men chủng A. niger vào môi trường chứa CMC chứa

cellulo, chúng tôi đã quan sát thấy vòng phân giải cellulo, kết quả được chỉ ra ở hình 3.

Như vậy có thể nói rằng chủng A. niger ĐL1 không chỉ sinh ra pectinaza (gồm

polygalacturonaza và pectinesteraza) mà còn sản sinh ra cellulaza trên môi trường có

thành phần chính là thịt quả cà phê.

Ảnh 27. Vòng phân giải cellulo của dịch lêm men của chủng A. niger ĐL1 trên

môi trường CMC

3.4.4. Xác định tính chất của pectinaza từ chủng Aspergillus niger ĐL1

Chúng tôi đã xác định tính chất của enzym pectinaza sinh tổng hợp bởi chủng A.

niger ĐL1 bao gồm xác định pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzym này. 3.4.4.1. Xác định pH tối ưu của pectinaza từ chủng A. niger ĐL1

Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong phản ứng đến hoạt độ enzym

pectinaza của chủng A. niger ĐL1 thông qua đó nhằm xác định pH tối ưu cho enzym này.

Việc xác định tính chịu axit của enzym là rất quan trọng, nó giúp cho khả năng hoạt động

198

của nó trong ruột động vật tốt hơn bởi việc sử dụng enzym pectinaza trong chăn nuôi luôn

được sử dụng cùng với thức ăn gia súc.

Quá trình khảo sát khi cho dịch enzym thô (dịch lên men A. niger ĐL1 trên môi

trường PC3 lên men trong 3 ngày) cho phản ứng với cơ chất pectin với pH biến đổi khác nhau

từ 4,0 đến 7,5 trong môi trường đệm citrat. Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 59.

Bảng 59. Ảnh hưởng của pH phản ứng đến hoạt độ của enzym pectinaza

pH phản ứng 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0

Hoạt độ enzym pectinaza (U/ml) 5,0 10,0 12,0 12,4 11,5 9,0 8,5 6,0

Kết quả ở bảng 59 cho thấy enzym pectinaza từ chủng A. niger ĐL1 cho hoạt độ

tối ưu là 12,4 U/ml ở pH = 5,0. Ở giá trị pH là 4,5 và 5,5 thì hoạt độ enzym đạt 12,0 U/ml

và 11,5 U/ml theo thứ tự. Khi pH là 3,5 và 7,0 thì hoạt độ enzym chỉ đạt 5,0 U/ml và 6,0

U/ml theo thứ tự. Kết quả này cho thấy hoạt độ tối ưu của enzym pectinaza trong môi

trường axit yếu, trong môi trường kiềm thì hoạt độ enzym giảm nhanh. Như vậy phổ hoạt

động của enzym pectinaza sinh tổng hợp từ chủng A. niger ĐL1 nằm trong khoảng pH từ

4,5 đến 5,5.

3.4.4.2. Khả năng chịu nhiệt của enzym pectinaza từ chủng A. niger ĐL1

Cùng với ảnh hưởng của pH môi trường phản ứng đến hoạt tính của enzym thì

nhiệt độ cũng là một trong các yếu tố ảnh hưởng nhiều đến hoạt độ của enzym. Việc xác

định được nhiệt độ tối ưu cho enzym hoạt động tốt có ảnh hưởng khá nhiều đến công

nghệ lên men thức ăn chăn nuôi sau này. Dải nhiệt độ được khảo sát là từ 300C đến 800C.

Sau khi dịch chiết enzym từ môi trường lên men cho phản ứng với cơ chất tại các giá trị

nhiệt độ khác nhau. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 60.

199

Bảng 60. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ của enzym pectinaza từ

chủng A. niger ĐL1

Nhiệt độ phản ứng (0C) 30 35 40 45 50 55 60

Hoạt độ enzym phytaza

(U/ml) 10,2 11,5 12,4 12,4 11,3 5,6 4,0

Từ kết quả ở bảng 60 biểu diễn sự biến thiên của hoạt độ enzym phytaza theo nhiệt

độ phản ứng ta thấy rằng hoạt tính của enzym pectinaza tăng dần theo sự tăng của nhiệt

độ. Hoạt độ enzym tăng dần từ 350C đến 500C thì đạt giá trị lớn nhất. Tại nhiệt độ là

400C đến 450C hoạt độ enzym đạt là 12,4 U/ml. Trong khoảng nhiệt độ từ 550C đến 600C

thì hoạt độ của enzym giảm dần, đặc biệt giảm nhanh ở khoảng nhiệt độ từ 600C. Như vậy

có thể nói nhiệt độ thích hợp nhất cho sự hoạt động của enzym pectinaza được sinh tổng

hợp từ chủng A. niger ĐL1 là 400C – 450C với hoạt độ xác định được là 12,4 U/ml. Tuy

hoạt tính của enzym tăng dần khi nhiệt độ tăng dần nhưng chúng chỉ tăng trong một giới

hạn nhất định, không vượt quá giới hạn đó. Ở nhiệt độ quá cao, hoạt tính của enzym

pectinaza bị giảm mạnh, và gần như mất hoạt tính ở nhiệt độ lớn hơn 600C.

3.4.5. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PECTINAZA Ở HỆ THỐNG LÊN


3.4.5.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp pectinaza của

chủng A. niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 150l/mẻ


0

20

40

60

80

100

120

140

24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

Thêi gian (giê)

Ho¹

t ®é

enzy

m p

ectin

aza

(U/m

l) x

1/10



200

Đồ thị.15:Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt độ pectinaza của chủng A.

niger ĐL1

Kết quả ở đồ thị 15 cho thấy: Động thái của quá trình sinh tổng hợp

pectinaza ở qui mô phòng thí nghiệm trong điều kiện được xác định: sinh khối phát

triển cực đại 84 giờ. Pha cân bằng bắt đầu từ giờ thứ 84. Hoạt lực pectinaza tăng

mạnh từ 48 giờ đến 108 giờ và đạt hoạt lực cao nhất là 12,4U/ml ở tại thời điểm

trên.

3.4.5.2. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ enzyme pectinaza của chủng A.

niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 150l/mẻ

Bảng 61: Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ enzyme pectinaza của chủng A. niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 150l/mẻ



tan (%)

Hoạt độ enzym

pectinaza (U/ml)


Hoạt độ enzym pectinaza

(U/ml)

0 100 - 100 -

12 100 - 100 -

24 100 5,5 100 5,5

36 100 6,9 100 6,9

48 100 7,7 90 8,3

60 100 8,6 90 9,1

72 100 9,8 90 10,2

84 100 10,6 90 10,9

96 100 11,3 90 11,6

108 100 11,4 90 12,4

120 100 11,4 90 12,4

136 100 10,8 90 11,5

201

Kết quả ở bảng 61 cho thấy, từ giờ thứ 36 trở đi khi điều chỉnh độ oxy hòa tan từ

100% xuống còn 90% đã cho thấy có ảnh hưởng tốt đến hoạt độ pectinaza của chủng A.

niger ĐL1. Hoạt độ pectinaza ở thí nghiệm 2 này là 12,4U/ml, trong khi đó ở thí nghiệm

1 độ oxy hòa tan luôn giữ ở 100%, hoạt độ pectinaza là 11,4U/ml.

3.4.6. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PECTINAZA Ở HỆ THỐNG LÊN


3.4.6.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp pectinaza của

chủng A. niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1500l/mẻ

Đồ thị 16 : Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp pectinaza của chủng A. niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1500l/mẻ

Kết quả ở đồ thị 16 cho thấy: Động thái của quá trình sinh tổng hợp pectinaza ở

qui mô phòng thí nghiệm trong điều kiện được xác định: sinh khối phát triển cực đại 84

giờ. Pha cân bằng bắt đầu từ giờ thứ 84. Hoạt lực pectinaza tăng mạnh từ 48 giờ đến 108

giờ và đạt hoạt lực cao nhất là 11,8U/ml ở tại thời điểm trên.


0

20

40

60

80

100

120

140

24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

Thêi gian (giê)

Ho¹

t ®é

enzy

m p

ecti

naza

(U

/ml)

x1/

10



202

Như vậy, hoạt độ enzym pectinaza có thấp hơn so với khi lên men A. niger ở qui

mô 150/mẻ. Điều này phù hợp với những kết quả nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm.

Vậy hoàn toàn có thể sử dụng hệ thống lên men cho sản xuất ở qui mô công nghiệp.

3.4.6.2. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ enzyme pectinaza của chủng A. niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1500l/mẻ Bảng 62: Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ enzyme pectinaza của chủng A.

niger ĐL1 trên hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1.500l/mẻ



tan (%)

Hoạt độ enzym

pectinaza (U/ml)


Hoạt độ enzym

pectinaza (U/ml)

0 100 - 100 -

12 100 - 100 -

24 100 5,5 100 5,5

36 100 6,9 100 6,9

48 100 7,5 90 8,3

60 100 8,2 90 9,1

72 100 9,0 90 10,0

84 100 9,3 90 10,5

96 100 9,7 90 11

108 100 10,9 90 11,8

120 100 10,9 90 11,8

136 100 10,2 90 11.2

Kết quả ở bảng 62 cho thấy , từ giờ thứ 36 trở đi, ở thí nghiệm 2, khi điều chỉnh độ

oxy hòa tan từ 100% xuống còn 90% đã cho thấy có ảnh hưởng tốt đến hoạt độ pectinaza.

Hoạt độ pectinaza ở thí nghiệm 2 này là 11.8U/ml, trong khi đó ở thí nghiệm 1 độ oxy

hòa tan luôn giữ ở 100%, hoạt độ pectinaza là 10,2U/ml.

203

Điều này chứng tỏ rằng chủng A. niger ĐL 1 không phải là chủng hiếu khí cao và

không cần nhiều oxy trong quá trình lên men pectinaza.

Tách và tinh chế enzym pectinaza

Bảng 63. Tách và tinh chế một phần enzym pectinaza ở qui mô 1.000 lít/mẻ



độ tinh sạch (lần)


Dịch enzym thô 960 10560000 1 100

Sau kết tủa bằng sunphat amôn 65% bão hòa 72 8640000 13,3 90

Kết quả ở bảng 63 cho thấy tổng hoạt độ enzym pectinaza trong dịch ban đầu thu

được là 10560000 U, khi kết tủa pectinaza bằng sunphat amôn 65% bão hòa, hoạt độ của

enzym pectinaza còn lại là 8640000 U đạt tỷ lệ thu hồi là 90%.

Tạo chế phẩm enzym pectinaza dạng bột

Enzym pectinaza sau khi tinh sạch một phần được phối trộn với bột sắn và các chất

phụ gia theo tỷ lệ như sau : 72 lít dịch kết tủa + 11 kg bột sắn và chất bảo quản, sau đó

đem đông khô, kết quả là thu được 30 kg chế phẩm enzym pectinaza. Như vậy từ 1000 lít

dịch lên men đã sản xuất được 30kg enzym pectinaza có hoạt độ là 288 U/g chế phẩm.

204

QUI TRÌNH 4:

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN ENZYM PECTINAZA TỪ CHỦNG A.

NIGER ĐL1 QUI MÔ 1500L/MẺ

Chủng A. niger ĐL1 giữ giống trên ống thạch nghiêng

Nhân giống trên bình tam giác nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 48giờ trên

môi trường PC3, nhiệt độ 300C

Nhân giống trên hệ thống lên men 150l/mẻ trong 48giờ trên môi trường PC3, pH=5.5, nhiệt độ 300C,

vận tốc cánh khuấy 200V/phút, DO=90%

Lên men trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong 108giờ trên môi trường PC3 pH=5.5, nhiệt độ 300C, vận tốc

cánh khuấy 200V/phút, DO=90%

205

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ TINH CHẾ MỘT PHẦN VÀ TẠO CHẾ PHẨM

PECTINAZA Ở QUI MÔ BÁN CÔNG NGHIỆP

Dịch lên men

Ly tâm liên tục ở vận tốc 12.000v/phút trong 15 phút loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi chứa enzym pectinaza


Ly tâm ở hệ thống ly tâm liên tục 12.000v/phút thu cặn loại bỏ dịch nổi

Phối trộn chất phụ gia (từ1000l dịch lên men thu được 72 l ít dịch kết tủa + 11 kg bột sắn v à chất

b ảo qu ản

Chế phẩm enzym pectinaza

Thẩm tích qua màng celophan qua đêm loại sunphat amon, thu enzym thô

Tinh sạch enzim Pectinaza thô qua sắc ký trao đổi cation CM-Sephadex C50, thu Pectinaza

tinh khiết

Đông khô

206

Miêu tả qui trình công nghệ sản xuất pectinaza qui mô 1000l/mẻ.

Chủng A. niger giữ ở ống thạch nghiêng ở 40C trên môi trường PC3 (hàng tháng

phải cấy truyền giống. Giống gốc giữ bằng phương pháp đông khô và bảo quản trong tủ

lạnh -200C). Nhân giống trong bình tam giác 500ml có chứa 150ml môi trường PC3

(thành phần gồm ThÞt qu¶ cµ phª 50%, Glucoza 2%, Kho¸ng vi l−îng ( CaCl2 2,5g,

CaCO3 5g, (NH4)2SO4 2,5g trong 100 ml n−íc): 1%, (NH4)3PO4 0.7%, N−íc chiÕt khoai

t©y 45%) tỷ lệ tiếp giống là 10%. Nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 48h. Nhân

giống trên hệ thống lên men 150l/mẻ trong 48h trên môi trường PC3 tỷ lệ tiếp giống là

10%. Lên men pectinaza trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong 108h trên môi trường

PC3, tỷ lệ tiếp giống là 10%, vận tốc cánh khuấy 200 v/ph. Ly tâm ở vận tốc

12.000v/phút ở 40 C trong 15-20 phút, loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi. Kết tủa bằng

sunphat amon bão hòa 65%. Dịch sau khi kết tủa ly tâm ở vận tốc 12.000v/phút ở 40 C

trong 15-20 phút, thu cặn hoà tan trong đệm Xitrat, pH 4 bỏ dịch nổi. Sau đó thẩm tích

qua màng celophan qua đêm, loại bỏ sunphat amon và thu enzym thô. Để thu được enzim

pectinaza tinh khiết cần tiếp tục làm sạch bằng sắc ký trao đổi cation CM- Sephdex C50,

thu Enzim Pectinaza tinh khiết. Phối trộn với bột sắn và các chất bảo quản theo tỷ lệ 72 lít

dịch kết tủa cộng 11 kg bột sắn. Sau đó đem đông khô, kết quả thu được 30 kg chế phẩm

enzim Pectinaza. Như vậy từ 1000lít dịch lên men đã thu được 30 kg chế phẩm enzim

Pectinaza có hoạt độ là 288U/g chế phẩm.

T ính toán hiệu quả kinh tế

Chúng tôi sơ bộ tính giá thành sản xuất thử cho 30 kg enzym pectinaza cho 1 mẻ

sản xuất ở hệ thống lên men chìm sục khí 1500 l/ mẻ như sau:

Tiền môi trường cho lên men: 83 333 đ/ kg Tiền hóa chất cho thu hồi enzym: 300 000 đ/ kg Tiền năng luợng và khấu hao thiết bị : 27 000đ/kg Tiền nhân công : 15 000 đ/ kg Tổng : 425 333 đ/kg

207

3.5. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN SINH TỔNG HỢP MANNANAZA

TỪ ASPERGILLUS NIGER AWAMORI BK

3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cây đến khả năng sinh mananaza của các chủng

nấm mốc phân lập

Bảng 64. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh mannanaza của các chủng nấm mốc phân lập

Hoạt lực mannanaza (U/ml) Thời gian (giờ)

T1 Q1

0 - -

24 - -

48 12,51 21,49

72 24,75 26,79

96 25,78 42,79

120 29,06 58,57

144 17,34 52,99

168 14,56 46,00

Kết quả ở bảng 64 cho thấy 2 chủng T1 và Q1 cho hoạt độ enzym cao nhất là

29,06 U/ml và 58,57 U/ml tại thời điểm nuôi cấy là 120 giờ. Như vậy chúng tôi đã tuyển

chọn được chủng Q1 phân lập từ vỏ quýt hỏng cho hoạt độ enzym cao nhất đạt 58,57

U/ml. Chủng Q1 được đem định tên và xác định thuộc loài Aspergillus awamori và được

sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo với tên là A. awamori BK.

208

3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Chủng nghiên cứu được nuôi trên một số nguồn cacbon khác nhau và sau các

khoảng thời gian nhất định canh trường nuôi cấy được lấy ra và xác định hoạt độ.

Bảng 65. Khả năng sinh tổng hợp mannanaza trên các nguồn cacbon khác nhau

Nguồn cacbon Nồng độ (g/l) Hoạt độ (U/ml) Ngày cho hoạt độ cao nhất

Glucose 42,6 8,10 6

LBG 20,0 67,72 6

Guar gum 20,0 68,57 3

CMC 42,6 48,75 6

α-cellulose 42,6 38,75 5

Bã mía 20,0 39,25 6

Bã cà phê 42,6 61,68 8

Cà phê 42,6 43,56 7

Bã cơm dừa 42.6 34,14 5

Guar gum + Bã cà phê

10 và 21,3

64,48 4

Kết quả bảng 65 cho thấy, khi glucose được dùng làm nguồn cacbon duy nhất,

hoạt độ mannanaza sinh tổng hợp được rất thấp bởi lẽ glucose là nguồn cacbon dễ sử

dụng và không phải là cơ chất cảm ứng cho enzym này. Giá trị hoạt độ mannanaza thu

được cao nhất (68,75 U/ml) đạt được khi sử dụng nguồn cacbon là guar gum. Tuy nhiên,

lượng guar gum còn lại trong canh trường chưa xác định được, sẽ là một yếu tố có thể ảnh

hưởng lớn đến hiệu quả sử dụng mannanaza trong chế biến thức ăn gia súc. Bã cà phê là

nguồn cacbon khá thích hợp cho sinh tổng hợp mannanaza (61,68 U/ml). Tuy nhiên nếu

sử dụng bã cà phê là nguồn cacbon, thời gian nuôi phải kéo dài 8 ngày ảnh hưởng không

nhỏ đến hiệu quả kinh tế của quá trình. Sử dụng kết hợp guar gum và bã cà phê cho phép

giảm lượng guar gum đồng thời tận dụng được nguồn bã thải cà phê mà hoạt độ vẫn đạt 64,48

U/ml sau 4 ngày nuôi cấy.

209

3.5.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Chủng nghiên cứu được nuôi trong môi trường chứa guar gum và bã cà phê tỷ lệ

giống cấy là 5% với các nguồn nitơ khác nhau với nồng độ tính toán tương đương lượng

nitơ chứa trong môi trường gốc (20g pepton). Kết quả được trình bày như trong bảng 66.

Bảng 66. Khả năng sinh tổng hợp mannanaza trên các nguồn nitơ khác nhau

Nguồn nitơ Nồng độ (g/l) Hoạt lực (U/ml) Ngày cho hoạt độ

cao nhất

Pepton 20,0 64,80 4

Cao nấm men 20,0 69,05 4

(NH4)2SO4 15,0 13,49 5

NH4NO3 8,8 11,91 4

NaNO3 19,0 67,21 5

Pepton và NH4NO3 10 và 44 33,44 5

Pepton và (NH4)2SO4 10 và 7,5 42,57 5

`Kết quả bảng 66 cho thấy khả năng sinh tổng hợp mannanaza của chủng

A.awamori BK cao khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men đạt cao nhất (69,05 U/ml sau

4 ngày nuôi), tuy nhiên đây là nguồn cơ chất khá đắt tiền. Với các nguồn nitơ vô cơ như

(NH4)2SO4, NH4NO3, khả năng sinh tổng hợp mannanaza của chủng này thấp. Trong môi

trường chứa NaNO3, hoạt lực mannanaza đạt khá cao (67,21 U/ml).

3.5.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống

Bảng 67. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến sinh tổng hợp mannanaza

Hoạt lực mannanaza (U/ml) Mẫu Tỷ lệ

giống 0 Giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ 168

giờ 1 2,5 0 5,42 18,09 40,08 43,91 51,53 40,08 39,76 2 5,0 0 5,42 24,12 36,25 47,64 47,64 40,82 30,81 3 7,5 0 5,04 22,99 46,31 49,28 73,58 56,35 35,13 4 10,0 0 5,31 33,58 47,80 48,28 64,49 45,20 37,84

210

A.awamori BK được hoạt hóa trong môi trường Czapeck hai ngày, sau đó được

cấy vào môi trường với 4 tỷ lệ giống khác nhau (2,5 %, 5%, 7,5%, 10%). Kết quả cho

thấy tỷ lệ giống thích hợp cho sinh tổng hợp mananaza của chủng nghiên cứu là 7,5%.

Đồ thị 17: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến sinh tổng hợp mannanaza

3.5.5. Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp mannanaza

Mục đích của quá trình này nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho chủng A.awamori BK

sinh tổng hợp mannanaza. Từ kết quả khảo sát sơ bộ ở trên và bằng các thuật toán cơ bản

của phép qui hoạch thực nghiệm the Box Wilson đi lên, chúng tôi tiến hành tối ưu với 3

biến là hàm lượng guargum, cao nấm men và lượng giống cấy truyền.

Kết quả thực nghiệm đã xác định được môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp

mannanaza từ A.awamori BK là (g/l) Guar gum (10), cao nấm men (22), lượng giống

(11), chủng được nuôi ở pH đầu là 5,0, nhiệt độ là 300C với tốc độ lắc là 200v/phút, hoạt

độ enzym đạt cực đại sau 4 ngày nuôi đạt 120 U/ml. Động thái của quá trình này được

biểu diễn ở đồ thị 18.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Thêi gian, giê

Ho¹

t lùc

Man

nana

se, U

/ml

MÉu 1 2.50%MÉu 2 5%

MÉu 3 7,5 %

MÉu 4 10%

211

Đồ thị 18: Động thái của quá trình sinh tổng hợp mannanaza.

3.5.6. Đặc tính của mananaza từ A.awamori BK

3.5.6.1. Khả năng thủy phân một số cơ chất

Mananaza thô từ canh trường nuôi cấy A.awamori BK được cho thủy phân với một

số cơ chất khác nhau trong đệm citrat có pH=4. Kết quả phân tích hoạt độ enzym cho thấy

LBG là cơ chất tốt nhất của mananaza. Tiếp đến là guargum, galactomanan với số lượng

các bên galactosyl cao hơn cũng bị nthủy phân bởi enzym nhưng với vận tốc nhỏ hơn.

Enzym không thủy phân CMC, nhưng thể hiện hoạt tính phân cắt khi có mặt α-cellulose

và xylan, điều này cõ lẽ do trong canh trường có mặt xylananse và α-cellulose.

Bảng 68: Tính đặc hiệu cơ chất của mananaza

Hoạt lực mananaza (U/ml) STT Cơ chất

U/ml % 1 LBG 93,11 100 2 Guargum 31,91 34,27 3 Xylan 6,59 7,08 4 CMC 0 0 5 α-cellulose 8,32 8,94

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

Thêi gian (giê)

Ho¹

t lùc

man

nana

se (U

/ml)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Sinh

khè

i (x1

0g/l)

H o¹t lùc

Sinh khèi

212

0

20

40

60

80

100

120

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78Thêi gian (giê)

Ho¹

t lù

c (%

) 3040506070

3.5.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt lực mananaza

Kết quả xác định hoạt độ mananaza ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy enzym từ

A.awamori BK có nhiệt độ xúc tác tối ưu là 75oC.

Bảng 69: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt lực mananaza

Nhiệt độ (oC) 40 50 60 70 75 80 85

Hoạt độ (U/ml) 50,26 80,83 110,94 139,29 142,81 132,37 120,61

Để xác định độ bền của mananaza nghiên cứu, chế phẩm mananaza đựoc giữ tại

các nhiệt độ khác nhau: 30, 40, 50, 60 và 70oC. Hoạt độ còn lại của chế phẩm ở các mốc

nhiệt độ khác nhau được biểu diễn bằng phần trăm so với hoạt độ enzym khi giữ ở 4oC.

Kết quả trình bày ở bảng 69 cho thấy mananaza từ chủng A.awamori BK khá bền ở 30oC,

sau 72 giờ vẫn còn trên 80%. Khi nhiệt độ tăng đến 50, 60oC, hoạt độ enzym giảm nhanh

nhưng vẫn đạt trên 60% sau 72 giờ. Ở nhiệt độ trên 70oC, hoạt độ enzym giảm mạnh

nhưng sau 36 giờ vẫn còn trên 50%. Như vậy cố thẻ nói mananaza từ A.awamori BK khá

bền nhiệt .

Đồ thị 19: Độ bền nhiệt của mananaza từ A.awamori BK

213

3.5.6.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt lực mananaza.

Tiến hành xác định hoạt lực mananaza tại các pH khác nhau. Kết quả cho thấy

mananaza từ A.awamori BK thể hiện hoạt độ cao nhất tại giá trị pH = 3,4.

Bảng 70: Ảnh hưởng của pH đến hoạt lực mananaza.

PH 2,8 3,0 3,4 4,0 4,4 5,0 5,4 6,0

Hoạt độ

mananaza

(U/ml)

60,0 91,9 105,9 95,5 79,4 61,0 51,8 44,6

Để khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền enzym, chế phẩm được giữ ở các giá trị

pH khác nhau: 3, 4, 5, 6 và 7 ở 30oC. Sau những khoảng thời gian nhất định chế phẩm

được lấy ra xác định hoạt độ. Hoạt độ còn lại được biểu diễn bằng phần trăm so với hoạt

độ enzym lúc bắt đầu, kết quả trình bày đồ thị 20. Kết quả phân tích cho thấy khi chế

phẩm enzym được giữ ở pH 4, sau hai ngày, hoạt độ enzym vẫn còn trên 80%, đạt cao

hơn khi enzym được giữ ở pH 3, 5, 6 hay 7.

Hoạt độ mananaza giảm mạnh nhất ở pH 7 (còn 49,05% sau 3 ngày). Như vậy ở

300C mananaza từ A.awamori BK bền trong môi trường axit yếu

Đồ thị 20: Ảnh hưởng của pH đến hoạt lực mananaza

0

20

40

60

80

100

120

0 12 24 36 48 60 72 84T h êi g ian (g iê )

Ho¹

t lùc

man

nana

se (%

)

pH = 3pH = 4pH = 5pH = 6pH = 7

214

3.5.6.4. Xác định pH đẳng điện của mananaza

Điểm đẳng điện của enzym được xác định bằng giá trị pH môi trường khi kết tủa với etylic 96% cho độ đục cao nhất. Kết quả khảo sát ở 13 giá trị pH khác nhau được thể hiện trên đồ thị 21 cho thấy mananaza của chủng nghiên cứu có giá trị pH 4,4.

Đồ thị 21: Xác định điểm đẳng điện pH

3.5.7. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ mananaza trong quá trình lên men trên tăng 50 l/mẻ

Bảng 71: Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến hoạt độ mananaza của chủng A.awamori BK trên hệ thống lên men chìm sục khí quy mô 50 l/mẻ


Thời gian lên men Độ oxy hòa

tan (%)

Hoạt độ mananaza

(U/ml)


Hoạt độ mananaza

(U/ml)

0 100 - 100 -

24 100 11 100 12

48 100 58 100 60

72 100 102 100 104

96 100 117 90 120

120 100 103 90 106

144 100 98 90 98

168 100 81 90 84

192 100 71 90 74

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

3 3.2 3.6 4 4.4 4.8 5.2 5.6 6 6.4 6.8 7.0 7.2

Mật

độ

quan

g O

D62

0 nm

215

Kết quả ở bảng 71 cho thấy, khi điều khiển độ oxy hòa tan trong suốt qúa trình lên

men là 100% sản lượng mananaza đạt là 117 U/ml tại thời điểm 96 giờ. Khi độ oxy hòa

tan giảm từ 100 % từ giờ thứ 12 đến giờ thứ 24 xuống còn 90% ở thời gian còn lại của

quá trình lên men, sản lượng mananaza tăng lên là 120 U/ml. Như vậy có thể nói rằng quá

trình sinh tổng hợp mananaza của chủng A.awamori BK cần oxy ở mức độ vừa phải.

3.5.8. Tách, tinh chế mananaza từ A.awamori BK

3.5.8.1. Khảo sát nồng độ (NH4)2SO4 kết tủa mananaza từ A.awamori BK

Để chọn được nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho kết tủa mananaza, chúng tôi đã

tiến hành khảo sát ở các nồng độ khác nhau. Dịch sau kết tủa li tâm 12000v/phút, thu cặn

hòa tan trong đệm xitrat pH 4,0 và tiến hành thẩm tích, xác định hoạt tính. Kết quả thu

được (đồ thị 22) cho thấy nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho việc kết tủa mananaza từ

A.awamori BK là 75% độ bão hòa với hiệu suất thu hồi 91,51%.

Đồ thị 22: Khảo sát nồng độ (NH4)2SO4 kết tủa mananaza từ A. awamori BK

3.5.8.2. Tách, tinh chế mananaza bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose

Dịch mananaza sau kết tủa amonsufat 75% độ bão hòa, thẩm tích qua đêm ở 40oC,

được tiếp tục làm sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose trên hệ thống sắc ký

60 65 70 75 80 85 90 Nồng độ (NH4)2SO4 (%độ bão hòa)

0

20

40

60

80

100

HiÖ

u su

Êt th

u hå

i (%

)

216

FPLC (Pharmacia Biotech, Thủy Điển). Cột được rửa và ổn định bằng đệm natri axetat

20mM pH 5,5 với tốc độ 1ml/phút. Mỗi phân đoạn thu 2ml. Kết quả thu được pick hoạt tính

mananaza trùng với pick protein thứ 2 (113U/ml) và pick độ tinh sạch và hiệu suất của

mananaza sau khi qua cột được thể hiện ở bảng 72.

Bảng 72: Tóm tắt quá trình làm sạch mananaza từ A.awamori BK

Hoạt độ Các bước tinh sạch

Tổng thể tích (ml)

Protein tổng (mg) Tổng (U)

Riêng (U/mg

Pr)

Mức độ tinh sạch

(lần)


Dịch enzym thô 200 1600 17500 10,1 1 100

Sau tủa (NH4)2SO4

15 466,5 16095 31,1 2,9 92

Sau sắc ký DEAE-

cellulose 15 30,45 4421 145,2 14,4 25,3

Các kết quả trình bày ở bảng 72 cho thấy chế phẩm mananaza từ A.awamori BK

sau sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose có hoạt độ riêng đạt 145,2 U/ml pr, với độ tinh

sạch gấp 14,4 lần so với dịch enzym thô , hiệu suất thu hồi đạt 25,3%.

Kiểm tra dộ tinh sạch của endo-β-1,4-mananaza trên SDS-PAGE 12,5% cho thấy

endo-β-1,4-mananaza thu được ở pick 2 và pick 3 đều có khối lượng phân tử khoảng

44kDa. Từ kết quả tách tinh chế chứng tỏ endo-β-1,4-mananaza từ A.awamori BK có 2

izozym, khối lượng phân tử xấp xỉ nhau.

3.5.8.3. Nghiên cứu công nghệ lên men enzym mananaza

Trên cơ sở các nghiên cứu đã đạt được trong phòng thí nghỉệm, chúng tôi đã tiến

hành nuôi cấy chìm chủng Aspergillus để sinh tổng hợp mananaza trên hệ thống lên men

50l với các điều kiện sau:

- Nguồn cacbon: guargum (20g/l)

217

- Nguồn nitơ: Cao nấm men (15g/l), NaNO3 (5g/l)

- MgSO4.7H2O (1,5); KCl (0,61); K2HPO4 (1,2)

- Dịch khoáng (g/l): ZnSO4.7H2O (1); MnCl2.2H2O (0,3); H3BO3(3): CoCl2.5H2O

(0,1); NiCl2.6H2O (0,2); H2SO4 đặc (4ml).

- pH đầu :5,0

- Tỷ lệ gống cấy : 10%

- Nhiệt độ nuôi : 30oC, tốc độ lắc 100vòng/phút.

Kết quả hoạt lực mananaza đạt 25,2U/ml sau 5 ngày nuôi cấy .Động thái của quá

trình sinh tổng hợp mananaza trên hệ thống lên men 50lít được thể hiện trong Đồ thị.23

Sinh khối phát triển cực đại ở 72 giờ , pha cân bằng bắt đầu từ 72 giờ đến 96 giờ .Trong

toàn bộ pha cân bằng pH môi trường giảm so với pH đầu, chủng bắt đầu sinh mananaza

cho đến khi bước vào suy vong, pH đã trở lại giá trị đầu hoạt lực mananaza tăng mạnh và

đạt cực đại (25,2U/ml) vào giờ thứ 108.

0

5

10

15

20

25

30

Ho

¹t ®

é m

anna

nase

(u/m

l)

3

6

9

12

15p

HS

inh

khèi

(x1

0g)

Series2

Series1

Series3

Đồ thị 23: Động thái sinh tổng hợp mananaza của A.awamori BK trên hệ thống lên

men 50L

Tiến hành nuôi cấy chìm chủng A.awamori BK để sinh tổng hợp mananaza trên hệ

thống lên men 150l với các điều kiện tương tự như tăng lên men 50lít nhưng với tốc độ

hoạt độ

pH

Sinh khối

218

lắc 250vòng/phút. Động thái của quá trình sinh tổng hợp mananaza trên hệ thống lên men

150lít được thể hiện trong đồ thị 24 sinh khối phát triển cực đại ở 72 giờ , pha cân bằng

bắt đầu từ 60 đến 120 giờ. Từ 60 giờ hoạt lực mananaza tăng và đạt cực đại (87.5U/ml)

vào giờ thứ 144.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ho

¹t ®

é m

anan

ase

(u/m

l)

3

6

9

12

15

pH

Sin

h kh

èi (

x10g

)

Series2

Series1

Series3

Đồ thị 24: Động thái sinh tổng hợp mananaza của A.awamori BK trên hệ thống lên

men 150l/mẻ

Bảng 73. Tách và tinh chế một phần enzym mananaza ở qui mô 100 lít/mẻ




Dịch enzym thô 100 8750000 100

Sau kết tủa bằng sunphat amôn 65% bão hòa 7.5 8050000 92

Sau sắc ký DEAE-cellulose 7.5 2036650 25.3 `

Kết quả ở bảng 73 cho thấy tổng hoạt độ enzym trong dịch ban đầu thu được là

8750000 U, khi kết tủa mananaza bằng sunphat amôn 65% bão hòa, hoạt độ của enzym

Hoạt độpH

Sinh khối 6 42 78 114 150 186

Thêi gian (h)

219

mananza còn lại là 8050000 U đạt tỷ lệ thu hồi là 92%. Sau sắc ký DEAE-cellulose còn

2036650 U

3.5.9. Tạo chế phẩm enzym mananaza dạng bột

Enzym mananaza sau khi tinh sạch một phần được phối trộn với bột sắn và các

chất phụ gia theo tỷ lệ như sau : 7,5 lít dịch kết tủa + 4 kg bột sắn và chất bảo quản, sau

đó đem đông khô, kết quả là thu được 5 kg chế phẩm enzym mananaza. Như vậy từ 100

lít dịch lên men đã sản xuất được 5 kg enzym mananaza có hoạt độ là 407 U/g chế phẩm

220

QUI TRÌNH 5:

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN ENZYM MANANAZA TỪ CHỦNG

A.awamori BK QUI MÔ 1500L/MẺ

Chủng A.awamori BK giữ giống trên ống thạch nghiêng

Nhân giống trên bình tam giác nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 48 giờ trên

môi trường Guar gum, nhiệt độ 300C

Nhân giống trên hệ thống lên men 150l/m ẻ với tỉ lệ giống 11% trong 48 giờ trên môi trường Guar gum, nhiệt độ 300C, vận tốc cánh khuấy 200 v/ph, pH=5

L ên men trên hệ thống lên men 1500l/mẻ trong 108giờ trên môi trường Guar gum pH=5, nhiệt độ

300C, vận tốc cánh khuấy 200V/phút

221

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ TINH CHẾ MỘT PHẦN VÀ TẠO CHẾ PHẨM

ENZYM MANANAZA Ở QUI MÔ BÁN CÔNG NGHIỆP

Dịch lên men

Ly tâm liên tục ở vận tốc 12.000v/phút ở 40 trong 20 phút loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi chứa enzym

Mananaza


Ly tâm ở hệ thống ly tâm liên tục 12.000v/phút, thu cặn loại bỏ dịch nổi

Phối trộn chất phụ gia và đông khô

Chế phẩm enzym Mananaza

Thẩm tích qua màng celophan qua đêm loại sunphat amon, thu enzym Mananaza thô

Tinh sạch enzim mananaza thô qua sắc ký trao đổi ion DEAE cellulose

222

Mô tả qui trình công nghệ sản xuất mananaza qui mô 1500l/mẻ

Chủng A. awamori BK giữ ở ống thạch nghiêng ở 40C trên môi trường Guar gum

(hàng tháng phải cấy truyền giống). Giống gốc giữ bằng phương pháp đông khô và bảo

quản ở nhiệt độ - 200C. Nhân giống trong bình tam giác 500 ml có chứa 150 ml môi

trường guar gum( thành phần gồm: guar gum 20 g/l, pepton 20g/l, MgSO 4 .7H 2 O 1,5g/l,

KCl: 0,6 g/l, K 2 HPO 4 : 1,2g/l, dịch khoáng: 0,3 ml trong đó bao gồm: ZnSO4.7H2O 1g/l,

MnCl2.2H2O 0,3g/l, H3BO3 3g/l, CoCl2.5H2O 0,1g/l, NiCl2.6H2O 0,2g/l, H2SO4 đặc 4ml).

Tỉ lệ tiếp giống là 11%, nuôi cấy lắc ở vận tốc 200 v/ph trong 48 gi. Nhân giống trên hệ

thống lên men 150 l/mẻ trong 48 giờ trwn môi trường Guar gum với tỉ lệ tiếp giống là

11%, vận tốc cánh khuấy 200v/ph. Lên men mananaza trên hệ thống 1500l/mẻ trong 108

giờ, vận tốc khuấy 200v/ph trên môi trường Guar gum, tỉ lệ tiếp giống là 11%. Li tâm ở

vận tốc 12.000 v/ph ở 40 C trong 20 phút, loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi. Kết tủa bằng

Sunphat amon bão hoà 65%. Dịch sau khi kết tủa li tâm ở vận tốc 12.000 v/ph ở 40 trong

20 ph, thu cặn, hào tan trong đệm xitrat pH=4 và tiến hành thẩn tích qua màng celophan

qua đêm, loại bỏ sunphat amon và thu enzim thô. Để thu được enzim mananaza tinh sạch

hơn cần tiếp tục làm sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose trên hệ thống sắc ký

HPLC. Sau đó phối trộn với bột sắn theo tỉ lệ 7:3, tiến hành sấy khô ở nhiệt độ 50-550 C

thu được thành phần dạng bột với hàm ẩm 12%

3.6. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỊT QUẢ CÀ PHÊ LÊN MEN

LÀM THỨC ĂN GIA SÚC QUI MÔ 1 TẤN /MẺ

Các chủng sử dụng cho sản xuất thịt quả cà phê làm thức ăn gia súc bao gồm :

Lactobacillus plantarum có khả năng khử cafein với hiệu quả 60%, chủng A. niger có khả

năng khử cafein là 85% và chủng Neorospora sitophilla có khả năng khử cafein là là

87%. Vì vậy để sản xuất thức ăn gia súc từ thịt quả cà phê chế biến theo phương pháp ướt

ở qui mô lớn ( 1 tấn /mẻ trở lên ), chúng tôi đã sử dụng chủng A. niger cho sản xuất thức

ăn gia súc từ thịt quả cà phê chế biến theo phương pháp ướt và dùng chủng Neorospora

sitophilla cho sản xuất thức ăn gia súc từ thịt quả cà phê chế biến theo phương pháp khô.

223

Quy tr×nh 6: QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN THỊT QUẢ CÀ PHÊ

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN THỊT QUẢ CÀ PHÊ CHẾ BIẾN THEO PHƯƠNG PHÁP ƯỚT

Qu¸ tr×nh khö tannin ®−îc tiÕn hµnh tr−íc tiªn. ViÖc khö tannin trªn thÞt qu¶

cµ phª ë qui m« c«ng nghiÖp ch¼ng h¹n 10 tÊn mÎ ®−îc tiÕn hµnh b»ng viÖc sö

dông çc vi khuÈn B. subtilis tù nhiªn cã trong thÞt qu¶ cµ phª th«ng qua viÖc ®¶o

trén ®èng thÞt qu¶ cµ phª b»ng m¸y ch¼ng h¹n nh− m¸y kÐo cã l¾p bé phËn ®¶o

trén. ViÖc ®¶o trén ®−îc tiÕn hµnh mçi ngµy mét lÇn vµ kÐo dµi tõ 7 ®Õn 8 ngµy.

Khö trïng hÖ thèng lªn men

Tr−íc khi khö trïng, toµn bé t¨ng lªn men vµ hÖ thèng èng dÉn khÝ, dÉn h¬i

®−îc lµm s¹ch, sau ®ã ®ãng chÆt n¾p t¨ng vµ cho h¬i dÉn trùc tiÕp vµo t¨ng. H¬i dÉn

Thịt quả cà phê được khử tannin bằng cách bổ xung 10% vi khuẩn Bacillus subtilis, nhiệt

độ 300C, thời gian

Bổ xung 20% cám gạo, 10% nước chiết khoai tây, điều chỉnh pH=5.5.Hấp khử trùng 120oC trong 1 giờ

Cấy 10% hỗn dịch chủng A. niger đã được nuôi cấy

Ủ yếm khí 10 ngày

Chế phẩm thịt quả cà phê lên men làm thức ăn gia súc

224

vµo khö trïng t¨ng ph¶i ®¶m b¶o s¹ch vµ ¸p suÊt nåi h¬i lu«n gi÷ ë 2 atm. ¸p suÊt

trong t¨ng khi khö trïng lµ 1,5 atm, khi b¾t ®Çu dÉn h¬i vµo t¨ng th× ph¶i hÐ më tÊt

c¶ çc van ®Ó h¬i ®−îc l−u th«ng, ®ång thêi kÕt hîp khö trïng hÖ thèng phin läc khÝ

vµ hÖ thèng trôc chÌn kÝn víi chÕ ®é khö trïng gièng khö trïng t¨ng lµ 1,5 atm. Khi

kim ®ång hå trong t¨ng chØ 1.5 atm th× b¾t ®Çu tÝnh giê vµ ¸p suÊt nµy ®−îc gi÷

trong suèt thêi gian khö trïng lµ 1 giê.

M«i tr−êng thÞt qu¶ cµ phª: ThÞt qu¶ cµ phª 80%, çm g¹o 20%, n−íc chiÕt

khoai t©y 10%, çc muèi kho¸ng 1% (CaCl2 2,5g, CaCO3 5g, (NH4)2SO4 2,5g hßa

tan trong 100ml n−íc), glucoza 1%, (NH4)3PO4 0,5%. pH = 5,5. §iÒu chØnh m«i

tr−êng b»ng n−íc chiÕt khoai t©y ®Õn ®é Èm 70-80%. Cho thÞt qu¶ cµ phª vµo tói

nilon, mçi tói 10 kg, buéc chÆt. HÊp khö trïng 1200C trong 1 giê.

Qu¸ tr×nh ®iÒu chÕ m«i tr−êng ë quy m« 150 lÝt/mÎ

Sau khi kÕt thóc qu¸ tr×nh khö trïng toµn bé hÖ thèng lªn men ta tiÕn hµnh

b¬m lµm nguéi vµ b¬m n−íc vµo t¨ng ®Õn møc 100 lÝt. C©n ®Çy ®ñ çc hãa chÊt

trong thµnh phÇn m«i tr−êng lªn men PDA (g/l): n−íc chiÕt khoai t©y 1 lÝt, glucoza

20, chØnh pH 5,5, bæ sung dÇu ph¸ bät. §ãng n¾p t¨ng vµ më van dÉn h¬i vµo vá

t¨ng ®ång thêi bËt çnh khuÊy víi tèc ®é lµ 250 vßng/phót ®Ó ®¶o trén ®Òu m«i

tr−êng lªn men. Khö trïng m«i tr−êng ë 0,8 atm trong 30 phót. Sau khi khö trïng

xong th× ng¾t h¬i vµ b¬m n−íc tõ bÓ l¹nh ®Ó lµm nguéi m«i tr−êng, khi nhiÖt ®é

m«i tr−êng trong t¨ng gi¶m xuèng cßn 300C th× míi tiÕn hµnh tiÕp gièng.

Qu¸ tr×nh tiÕp gièng

NÊm A. niger ®−îc gi÷ gièng trªn èng th¹ch nghiªng trªn m«i tr−êng PDA.

ViÖc nh©n gièng ®−îc thùc hiÖn b»ng viÖc l¾c trªn b×nh tam gi¸c 150 vßng/phót

trong 18 giê råi nh©n tiÕp trªn t¨ng nu«i cÊy ch×m sôc khÝ dung tÝch 150l/ mÎ víi tû

lÖ tiÕp gièng lµ 1/ 10.

L−îng oxy hßa tan trong m«i tr−êng lªn men ch×m ®−îc gi÷ ë nång ®é 90 -

100% tïy vµo thêi çc ®iÓm nu«i cÊy. Nång ®é oxy hßa tan trong t¨ng lªn men

®−îc ®iÒu khiÓn b»ng hÖ thèng ®iÒu khiÓn oxy hßa tan tù ®éng.

225

NhiÖt ®é lªn men ®−îc ®iÒu khiÓn b»ng hÖ thèng ®iÒu khiÓn nhiÖt ®é ®Õn

280C.

pH cña m«i tr−êng lªn men ®−îc ®iÒu khiÓn b»ng hÖ thèng ®iÒu khiÓn nhiÖt

®é ®Õn 5,5.

Sau khi nh©n nu«i hçn dÞch nÊm A. niger trªn t¨ng nu«i cÊy ch×m sôc khÝ,

tiÕn hµnh lªn men thÞt qu¶ cµ phª b»ng viÖc bæ sung 10 % hçn dÞch nÊm A. niger

vµo m«i tr−êng lªn men thÞt qu¶ cµ phª ().

Lªn men thÞt qu¶ cµ phª b»ng nÊm A. niger ®· ®−îc tuyÓn chän theo ph−¬ng

ph¸p yÕm khÝ trong çc tói nilon, thêi gian 7-10 ngµy. ChÕ phÈm thÞt qu¶ cµ phª cã

mïi th¬m hÊp dÉn, kh«ng cßn vÞ ®¾ng ch¸t vµ cã mµu vµng s¸ng. KiÓm tra vi sinh

vËt vµ ®éc tè vi nÊm trong chÕ phÈm thÞt qu¶ cµ phª. §ãng gãi.

226

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN THỊT QUẢ CÀ PHÊ (CHẾ BIẾN THEO

PHƯƠNG PHÁP KHÔ) LÀM THỨC ĂN GIA SÚC

ViÖc khö tannin trªn thÞt qu¶ cµ phª ë qui m« c«ng nghiÖp ch¼ng h¹n 10 tÊn

mÎ ®−îc tiÕn hµnh b»ng viÖc sö dông çc vi khuÈn B. subtilis tù nhiªn cã trong thÞt

qu¶ cµ phª th«ng qua viÖc ®¶o trén ®èng thÞt qu¶ cµ phª. Qu¸ tr×nh khö trïng hÖ

thèng lªn men, ®iÒu chÕ m«i tr−êng, tiÕp gièng vµ lªn men N. sitophyla ®−îc tiÕn

hµnh gièng nh− ph−¬ng ph¸p ®· miªu t¶ ë trªn. Sau khi nh©n nu«i hçn dÞch nÊm N.

sitophyla trªn t¨ng nu«i cÊy ch×m sôc khÝ, tiÕn hµnh lªn men thÞt qu¶ cµ phª b»ng

Thịt quả cà phê được khử tannin bằng10% vi khuẩn Bacillus subtilis, nhiệt độ 300C, thời gian

Bổ xung 20% cám gạo, 10% nước chiết khoai tây, điều chỉnh pH=5.5. Hấp khử trùng trong

1200C trong 1 giờ

Cấy 10% hỗn dịch chủng Neurospora sitophila

Nuôi cấy hiếm khí ở túi nilon trong 7 ngày nhiệt

độ

Chế phẩm thịt quả cà phê lên men làm thức ăn gia súc

227

viÖc bæ sung 10% hçn dÞch nÊm N. sitophyla vµo m«i tr−êng lªn men thÞt qu¶ cµ

phª.

Lªn men thÞt qu¶ cµ phª b»ng nÊm N. sitophyla ®· ®−îc tuyÓn chän theo

ph−¬ng ph¸p hiÕu khÝ trong çc tói nilon, thêi gian 7 ngµy ®Õn khi sîi nÊm ph¸t

triÓn vµ kÕt thµnh khèi chÆt trªn thÞt qu¶ cµ phª th× dõng. ThÞt qu¶ cµ phª cã mïi

th¬m hÊp dÉn vµ cã mµu n©u s¸ng. KiÓm tra vi sinh vËt vµ ®éc tè vi nÊm trong chÕ

phÈm thÞt qu¶ cµ phª. §ãng gãi.

Bảng 74. Thành phần hóa học của thịt quả cà phê bằng việc sử dụng chủng Bacillus

subtilis 61s và Neurospora sytophla

Thành phần hóa học của thịt quả cà phê( tính theo % chất khô )

Thịt quả cà phê trước xử lý

Thịt quả cà phê xử lý Bacillus subtilis 61s và Neurospora sytophla

Protein tổng số 18,62 21,21

Đường tổng số 4,18 3,85

Chất xơ 74,5 74,02

Caffein 0,35 0,07

Tannin 2,3 0,85

Kết quả ở bảng 74 cho thấy khi xử lý thịt quả cà phê bằng việc sử dụng chủng

Bacillus subtilis 61s và Neurospora sytophla, hàm lượng protein tổng số tăng 13,9%,

đường tổng số giảm là 7,89%, chất xơ giảm 0,71%, hàm lượng caffein giảm 80%, hàm

lượng tannin giảm 63%.

Bảng 75. Thành phần hóa học của thịt quả cà phê bằng việc sử dụng chủng Bacillus

subtilis 61S và Aspergillus niger

Thành phần hóa học của thịt quả cà phê( tính theo % chất khô )

Thịt quả cà phê trước xử lý

Thịt quả cà phê xử lý Bacillus subtilis 61S và

Aspergillus niger

228

Protein t�ng s� 18,62 19,5

Đường tổng số 4,18 3,85

Chất xơ 74,5 63,02

Caffein 0,35 0,07

Tannin 2,3 0,85

Kết quả ở bảng 75 cho thấy khi xử lý thịt quả cà phê bằng việc sử dụng chủng

Bacillus subtilis 61s và Aspergillus niger, hàm lượng protein tổng số tăng 4.7%, đường

tổng số giảm là 7,89 %, chất xơ giảm 15,481%, hàm lượng caffein giảm 80%, hàm lượng

tannin giảm 63%.

Ảnh28: Lên men thịt quả cà phê qui mô 1 tấn/ mẻ tại xưởng thực nghiệm Viện Cơ điện

Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.

Chúng tôi sơ bộ tính giá thành sản xuất thử thịt quả cà phê lên men làm thức ăn gia súc

qui mô 1tấn/ mẻ sản như sau:

229

Tiền nguyên nhiên vật liệu cho lên men: 1100 000 đ/ kg Tiền bao bì, khấu hao thiết bị nhà xưởng: 100 000 đ/ kg Tiền nhân công : 100 000 đ/ kg Tổng : 1300 000 đ/ tấn Sản phẩm có thể bán ra với giá 2000 000 đ/ tấn ( 2000 đ/ kg). Chúng tôi thấy rằng công nghệ sản xuất thịt quả cà phê lên men của đề tài có tính khả thi

cao. Công nghệ này có thể chuyển giao cho những cơ sở chế biến cà phê ở những tỉnh

trọng điểm trồng cà phê như Đắc lắc, Đắc Nông, Gia rai trong thời gian tới. Cụ thể công

ty Tân Phát của tỉnh Đắc lắc đã ký hợp đồng với Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ

sau thu hoạch để nhận chuyển giao công nghệ này.

3.7. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN BÃ DỨA LÀM THỨC ĂN GIA SÚC

3.7.1. Kết quả thử nghiệm lên men bã dứa bằng hỗn hợp A. niger, Saccaharomyces

và Lactobacillus ở qui mô 2,5 tấn/mẻ

Ch úng t ôi đ ã s ử d ụng h ốn h ợp chủng A.. niger và Lactobacillus ký hiệu là

VSDD1 v à Saccharomyces v à Lactobacillus ký hiệu l à VSDD2 đ ể l ên men b ã d ứa qui

m ô 2,5 t ấn/ m ẻ. Ti ến h ành lên men nấm sợi hoặc nấm men trong 24 giờ, sau đ ó bổ

sung thêm vi khuẩn lactic sau 12 giờ đem sấy khô ở nhiệt độ 50 đến 550C tạo ra sản phẩm

giống thứ cấp phục vụ nghiên cứu thí nghiệm.

3.7.2. Ảnh hưởng của thành phần nguyên liệu đến sự biến đổi độ pH trong quá trình

lên men

Thí nghiệm khảo nghiệm được tiến hành v ới qui mô 2,5 tấn mẻ và bố trí làm 3 công thức

khác nhau về lượng bã dứa và tinh bột bổ sung.

Bảng 76. Thành phần nguyên liệu để lên men bã dứa

Tỷ lệ nguyên liệu (%) CT1 CT2 CT3 Bã quả dứa ép tươi 50 60 70

Bột sắn khô 40 30 20 Cám mì 8 8 8

Giống vi sinh vật 2 2 2

230

Nguyên liệu được trộn đều sau đó cho vào túi nilon nén chặt sau 3 đến 7 ngày mở

ra lấy mẫu phân tích.

Bảng 77. Sự biến đổi pH trong quá trình lên men bã dứa

Thời gian (ngày) Công thức chế biến BĐTN 3 7 14 21 28

CT1 + VSDD1 6,78 5,21 4,66 4,53 4,28 4,14

CT2 + VSDD1 6,78 5,15 4,57 4,42 4,20 3,96

CT3 + VSDD1 6,80 5,09 4,44 4,31 4,09 3,75

CT1 + VSDD2 6,78 5,16 4,46 4,40 4,21 4,02

CT2 + VSDD2 6,78 5,04 4,38 4,30 4,10 3,91

CT3 + VSDD2 6,80 4,97 4,25 4,14 3,87 3,55

3.7.3. Thành phần hóa học của bã dứa lên men

Chỉ tiêu để đánh giá chất lượng ủ men nói chung là thành phần hóa học của chúng

ít thay đổi trong suốt quá trình lên men và bảo quản. Đối với bã dứa hàm lượng đường dễ

tan (saccarose, glucose, fructose, pentose...) còn rât nhiều (24 – 27% trong VCK), vì thế

vi sinh vật lợi dụng ngay để sinh trưởng và phát triển. Điều này giải thích vì sao tốc độ

lên men của bã dứa khá nhanh, nhưng thời gian bảo quản còn hạn chế. Sau 4 tuần hàm

lượng axit acetic đã tăng hơn 100%, vì thế sản phẩm xuất hiện mùi chua.

Bảng 78. Một số thành phần hóa học của bã dứa trước và sau khi ủ

Sau ủ (tuần) Chỉ tiêu Trước ủ 1 2 3 4 VCK (%) 35,89 33,38 33,06 32,97 31,92

Protein thô (%VCK) 7,78 7,64 7,61 7,28 6,94Lipit thô (%VCK) 3,26 3,24 3,20 3,16 3,03Xơ thô (%VCK) 18,63 19,67 18,70 18,72 18,76Axit lactic (%) 1,77 2,89 3,05 2,92Axit acetic (%) 1,09 1,31 2,02 2,62

231

Hàm lượng VCK của bã dứa lên men giảm rất rõ rệt, nhất là trong tuần đầu quá

trình hô hấp của tế bào thực vật còn diễn ra, đó là nguyên nhân gây mất mát VCK. Một số

thành phần dinh dưỡng khác của bã dứa như protein thô, lipit thô, xơ thô trước và sau

công thức ủ chênh lệch nhau không lớn. Nhìn chung hàm lượng protein thô giảm dần theo

thời gian. Hàm lượng lipit thô có giảm chút ít nhưng không đáng kể. Hàm lượng axit

lactic tăng cao đến tuần thứ 3 và giảm dần vào tuần thứ 4, axit acetic tăng dần đều sau

tuần thứ 4 thức ăn có mùi chua mạnh. Điều này chứng tỏ chỉ nên dùng bã dứa lên men

trước 3 tuần.

3.7..4. NHẬN XÉT CHUNG VỀ CHẤT LƯỢNG THỨC ĂN

+ Mặc dù hàm lượng nước trong phụ phẩm dứa khá cao, nhưng phụ phẩm dứa lại có hàm

lượng đường dễ tan cao nên dễ ủ chua.

+ Hàm lượng protein thô, lipit thô trong phụ phẩm dứa tương đối thấp do vậy cần lưu ý

khi xây dựng khẩu phần ăn cho gia súc.

+ Phụ phẩm dứa có chất lượng tốt, có màu vàng, mùi thơm dễ chịu.

232

3.7.5. Qui trình lên men chế biến bã dứa

QUI TRÌNH 7: QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN, CHẾ BIẾN BÃ DỨA LÀM THỨC ĂN GIA

SÚC TỪ CHỦNG VI KHUẨN VÀ NẤM MỐC Mô tả qui trình công nghệ lên men chế biến bã dứa làm thức ăn gia súc + Chuẩn bị giống vi sinh vật 2 chủng phối hợp : Nấm mốc A. niger có khả năng phân

giải tốt tinh bột, xenluloza lên men bề mặt và vi khuẩn Lactobacillus có khả năng phân

giải tinh bột, protein t ốt cho lên men thể dịch

Nấm mốc Aspergillus niger lên men bề mặt 50%

Vi khuẩn Lactobacillus lên men thể dịch 50%

Hỗn hợp giống vi sinh vật lên men

Trộn đều nguyên liệu: bã dứa, cám gạo(bột sắn) theo tỉ lệ 70:30, bổ sung giống men 2%

Nén chặt nguyên liệu và ủ theo 2 cách: 1. Trong túi nilon, bao, tải với qui mô 20-100 kg/mẻ

hoặc bịch nilon khổ lớn 300-1000kg.mẻ 2. Trong hố ủ kích thước 3x2x1(m) che kín bằng túi

nilon, phủ đát qui mô 2000-3000 kg/mẻ

Ủ hỗn hợp lên men trên trong 3-5 ngày tạo thành sản phẩm cho gia súc ăn dần

233

+ Trộn đều nguyên liệu: bã dứa, cám gạo (bột sắn) theo tỉ lệ 70:30 giống men bổ sung

2%

+ Nén chặt, ủ theo 2 cách:

• Trong túi nilon, bao tải, với quy mô 20-100kg/m ẻ v à trong bịch nilon khổ lớn

đường kính 1m với quy mô 300-1000kg/mẻ

• Trong hố ủ kích thước 3mX2mX1m. Che nilon kín đảm bảo yếm khí v à phủ

đất lên trên với quy mô 2000-3000kg/mẻ

Thời gian ủ 3-5 ngày, lấy ra cho gia súc ăn dần. Chú ý sau khi lấy thức ăn ủ phải che đậy

thật kín tránh sản phẩm ủ tiếp xúc với không khí sẽ có màu đen, nếu ủ trong các bao tải

nhỏ nên tính toán số lượng vừa đủ cho 1 bữa ăn hoặc ngày ăn của đàn bò.

3.7.6. Chuyển giao công nghệ chế biến bã dứa tới hộ chăn nuôi bò sữa

Trong năm 2004, đề tài đã tiến hành khảo sát vùng nguyên liệu, phổ biến qui trình

chế biến bã dứa lên lem cho các hộ chăn nuôi bò sữa thuộc các tỉnh Phú Thọ, Vính Phúc,

Nghệ An tổng số là 32 hộ.

Ảnh 29 PGS. TS. Nguyễn Thùy Châu ( Chủ nhiệm đề tài KC-04-20) và

ThS.Nguyễn Giang Phúc ( chủ nhiệm đề tài nhánh) hướng dẫn nông dân sản xuất bã

dứa lên men làm thức ăn cho bò qui mô 1 tấn mẻ tại Trung tâm bò và đồng cỏ Ba vì

234

3.8. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN PHẾ PHỤ PHẨM TÔM LÀM

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

3.8.1. Nghi ªn cøu çc yÕu tè c«ng nghÖ lªn men lactic phÕ phô phÈm t«m quy m« 1 tÊn/mÎ

B¶ng 79. Sù biÕn ®âi pH trong qu¸ tr×nh lªn men phÕ th¶i t«m víi çc møc bæ sung men khëi ®éng kh¸c nhau

Men khëi Thêi gian lªn men (ngµy) ®éng (%) 0 3 5 7 10

0,5 7,05 5,75 5,15 4,50 4,40 1,0 7,06 4,51 4,39 4,31 4,21 1,5 7,03 4,42 4,96 4,25 4,20

Víi nguèn n¨ng l−îng tõ rØ mËt ë møc æn ®Þnh 20% bæ sung 0,5; 1,0 vµ1,5 % bét

men khëi ®éng vµo nguyªn liÖu lªn men. Qu¸ tr×nh lªn men ®−îc thÓ hiÖn ë trÞ sè pH vµ

hµm l−îng axit h÷u c¬.

Sù gi¶m thiÓu cña trÞ sè pH theo thêi gian lªn men ë tÊt c¶ çc l« thÝ nghiÖm thÓ

hiÖn qu¸ tr×nh lªn men ®· ®−îc diÔn ra trong thêi gian thÝ nghiÖm. Cô thÓ trÞ sè pH cña

hçn hîp çc nguyªn liÖu lªn men ë møc trung tÝnh vµ gi¶m dÇn ®Õn 4,4-4,2 ë ngµy lªn

men thø 10.

Møc bæ sung men khëi ®éng kh¸c nhau ®· xóc tiÕn qu¸ tr×nh lªn men. Bæ sung

cµng nhiÒu th× qu¸ tr×nh lªn men cµng nhanh lµm cho trÞ sè pH gi¶m nhiÒu. Bæ sung

0,5% qu¸ tr×nh lªn men mÊt 7 ngµy ®Ó ®−a pH xuèng 4,5. Trong khi ®ã bæ sung 1,0%

vµ 1,5% chØ mÊt 3 ngµy. KÕt qu¶ nµy thùc sù lý thó so víi kÕt qu¶ tr−íc ®©y kh«ng sö

dông men khëi ®éng th× thêi gian lªn men mÊt 10 ngµy hoÆc kÐo dµi h¬n (Lª V¨n LiÔn

vµ CTV, 1994). Trong thêi gian pH > 4,5 çc vi khuÈn g©y thèi cßn ho¹t ®éng ph©n

hñy protein cña phÕ th¶i t«m. V× lÏ ®ã cµng rót ng¾n thêi gian lªn men hßan chØnh (pH

≤ 4,5) cµng cã lîi trong b¶o qu¶n thøc ¨n vÒ gi¸ trÞ dinh d−ìng. Møc bæ sung 1,0%

sang ngµy lªn men thø 3 ®· gi¶m pH xuèng 4,51. §èi chiÕu víi tiªu chuÈn lªn men th×

trÞ sè pH nµy ®· ®¹t tiªu chuÈn lªn men lactic phô phÈm h¶i s¶n ( R.E. Levin, 1994) Do

®ã møc bæ sung men khëi ®éng 1,0% d¹ng kh« lµ møc cÇn x¸c ®Þnh trong qu¸ tr×nh

c«ng nghÖ lªn men lactic phÕ phô phÈm t«m ®Ó b¶o qu¶n lµm thøc ¨n ch¨n nu«i.

235

S¶n phÈm lªn men ngµy thø 3 cña çc l« cã møc bæ sung men khëi ®éng kh¸c

nhau ®−îc ph©n tÝch hµm l−îng axÝt lactic, axetic vµ butyric. KÕt qu¶ ghi ë b¶ng 80.

B¶ng 80. Hµm l−îng axÝt lactic, axetic vµ butyric trong s¶n phÈm lªn men phÕ th¶i t«m cã bæ sung men khëi ®éng (%)

Axit h÷u c¬ Men khëi ®éng (%) 0,5 1,0 1,5 Lactic 2,91 3,53 3,96 Axetic 1,00 0,97 0,66 Butyric 0,06 0,10 0,08

Axit lactic cã hµm l−îng cao ë tÊt c¶ çc l« tõ 2,9-3,9%. Hµm l−îng nµy còng cao

h¬n çc kÕt qu¶ nghiªn cøu tr−íc ®©y. Ph−¬ng ph¸p ®−îc sö dông trong nghiªn cøu nµy lµ

ch−ng cÊt ph©n ®o¹n, nã kh¸c vµ kh«ng thÓ chÝnh x¸c b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký khÝ cña

çc t¸c gi¶ trªn thÕ giíi. Khi so s¸nh víi çc axit axetic vµ butyric nh÷ng axit th−êng cã

trong qu¸ tr×nh lªn men yÕm khÝ dÞ thÓ (hetero fermentation) thÊy r»ng: hµm l−îng axit

lactic chiÕm chñ yÕu. §iÒu ®ã chØ râ −u ®iÓm cña qu¸ tr×nh lªn men lactic khi bæ sung

men khëi ®éng. Sù cã mÆt rÊt Ýt (0,1%) axit butyric trong s¶n phÈm nµy chøng tá chÊt

l−îng cao cña s¶n phÈm lªn men v× axit nµy g©y mïi khã chÞu gi¶m tÝnh thÌm ¨n cña gia

sóc.

3.8.2. BiÕn ®æi chÊt l−îng s¶n phÈm trong qu¸ tr×nh lªn men tù nhiªn phô phÈm

t«m víi bét ng«.

§Ó ®¸nh gi¸ chÊt l−îng cña phô phÈm h¶i s¶n lªn men lactic víi bét ng«, chóng t«i

tiÕn hµnh ph©n tÝch thµnh phÇn dinh d−ìng cña s¶n phÈm phô h¶i s¶n lªn men víi 60% bét

ng« ë thêi ®iÓm ban ®Çu ch−a lªn men vµ thêi ®iÓm lªn men hoµn toµn t¹i phong thÝ

nghiªm Bé m«n ph©n tÝch thøc ¨n vµ s¶n phÈm ch¨n nu«i gia sóc- ViÖn ch¨n nu«i Quèc

gia. KÕt qu¶ ®−îc ghi ë b¶ng 81

236

B¶ng 81: Thµnh phÇn dinh d−ìng cña phô phÈm h¶i s¶n lªn men víi 60% bét ng« (% theo khèi l−îng −ít)

ChØ tiªu VËt chÊt kh«

Protein th«

Lipit th«

Kho¸ng tæng sè

Canxi Ph«tpho §−êng

Hçn hîp nguyªn liÖu

lªn men 61,16 14,86 3,71 7,09 1,67 0,55 2,49

S¶n phÈm lªn men

57,73 14,85 2,67 7,85 1,75 0,53 1,45

Tû lÖ vËt chÊt kh« lµ mét trong nh÷ng chØ tiªu gãp phÇn ®¸nh gi¸ gi¸ trÞ dinh

d−ìng vµ ®Þnh h−íng sö dông cña mét lo¹i s¶n phÈm lµm thøc ¨n ch¨n nu«i. Qua b¶ng

81 cho thÊy hµm l−îng vËt chÊt kh« cña phô phÈm h¶i s¶n víi bét ng« ë çc thêi ®iÓm

lªn men lµ kh¸c nhau, cô thÓ lµ 61,16% vµ 57,73% t−¬ng øng ë thêi ®iÓm ban ®Çu (0

ngµy) vµ thêi ®iÓm lªn men hoµn toµn (15 ngµy), so víi çc nguyªn liÖu lªn men th× chØ

tiªu nµy lµ thÝch hîp (phô phÈm t«m:80,02%; phô phÈm ç: 77,07%; ng«

vµng:87,15%). Trong giai ®o¹n lªn men 15 ngµy, hµm l−îng vËt chÊt kh« gi¶m ®i chót

Ýt tõ 61,16% xuèng 57,73%. §iÒu nµy phï hîp v× trong thêi gian nµy vi khuÈn lactic

ph¶i sö dông ®−êng ®Ó lµm pH cña m«i tr−êng gi¶m xuèng, mÆt kh¸c ho¹t ®éng cña

men protease lµm cho s¶n phÈm lo·ng h¬n.

Hµm l−îng protein trong s¶n phÈm kh¸ cao vµ æn ®Þnh sau thêi gian lªn men,

chóng chøa tíi 14,86% vµ 14,85% theo khèi l−îng −ít. Nh− vËy chøng tá sù lªn men

trong qu¸ tr×nh ñ chua vi sinh rÊt tèt, l−îng axit h÷u c¬ sinh ra ®· øc chÕ nhãm vi khÈn

g©y h¹i kh¸c. KÕt qu¶ lµ protein th« trong hçn hîp ñ kh«ng bÞ ph©n huû vµ ®−îc gi÷

gÇn nh− nguyªn vÑn. KÕt qu¶ nµy còng phï hîp víi kÕt qu¶ cña NguyÔn ThÞ Phông

(1997), Kompiang, I.P (1980) khi nghiªn cøu ç ñ víi rØ mËt hµm l−îng protein còng

kh«ng thay ®æi trong qu¸ tr×nh lªn men.

Hµm l−îng chÊt kho¸ng lµ chØ tiªu chÊt l−îng quan träng trong thøc ¨n gia sóc,

chóng gi÷ nhiÒu chøc n¨ng ®èi víi sù ph¸t triÓn vµ tån t¹i cña vËt nu«i. Ca,P tham gia

237

vµo thµnh phÇn cÊu t¹o cña x−¬ng vµ r¨ng, chóng tham gia lµm chÊt m«i giíi trong

®iÒu hoµ hormon. Ngoµi ra P cßn tham gia vµo çc qu¸ tr×nh ho¹t ®éng sèng, cÊu thµnh

cña çc enzymes xóc t¸c sinh häc, cÊu thµnh çc axit nucleic vµ çc hîp chÊt giµu

n¨ng l−îng. KÕt qu¶ cho thÊy kho¸ng tæng sè Ca, P trong s¶n phÈm lªn men cã hµm

l−îng kh¸ cao. Hµm l−îng chÊt nµy vÉn gi÷ nguyªn trong qu¸ tr×nh lªn men ë møc

7,09- 7,85% ®èi víi kho¸ng tæng sè 1,67- 1,75% Ca vµ 0,55- 0,52% P.

§−êng lµ c¬ chÊt chñ yÕu cña qu¸ tr×nh lªn men nªn hµm l−îng ®−êng gi¶m

xuèng nhiÒu sau 15 ngµy lªn men tõ 2,49% ë thêi ®iÓm ban ®Çu xuèng cßn 1,45% ë

thêi ®iÓm lªn men hoµn toµn. Sù biÕn ®æi cña hµm l−îng ®−êng trong m«i tr−êng ñ liªn

quan tíi sù biÕn ®æi cña pH. Khi pH gi¶m th× hµm l−îng ®−êng còng gi¶m. Nghiªn cøu

ñ chua vi sinh ç nghiÒn nhá víi rØ mËt ®−êng, Kompiang, I.P (1980) rót ra kÕt luËn:

“Hµm l−îng ®−êng cña tÊt c¶ çc l« ñ gi¶m râ rÖt trong qu¸ tr×nh lªn men vµ sù gi¶m

nµy ®ång thêi víi sù gi¶m ®é pH”.

KÕt qu¶ cña çc t¸c gi¶ trong n−íc vÒ thµnh phÇn dinh d−ìng trong s¶n phÈm

lªn men ®Çu t«m víi rØ mËt ®Òu cho thÊy sù biÕn ®æi cña nh÷ng thµnh phÇn nµy trong

qu¸ tr×nh lªn men t−¬ng tù nh− kÕt qu¶ nghiªn cøu cña chóng t«i (NguyÔn ThÞ B¹ch

YÕn,1994, §µo ThÞ Ph−îng, 1997).

Tãm l¹i phô phÈm h¶i s¶n cã thÓ b¶o qu¶n b»ng çch ñ víi bét ng«. Ph−¬ng

ph¸p nµy ®¬n gi¶n, dÔ lµm, kh«ng ®ßi hái thiÕt bÞ ®¾t tiÒn. ChÊt l−îng cña s¶n phÈm

lªn men gÇn nh− gi÷ nguyªn vµ ë l« ñ 60% bét ng« vµ çm g¹o ®· ®¸p øng nhu cÇu

dinh d−ìng cho lîn lai nu«i thÞt( ngo¹i x néi).

238

QUI TRÌNH 8: QUI TRÌNH CHẾ BIẾN PHẾ PHỤ PHẨM TÔM

LÀM THỨC ĂN CHO CHĂN NUÔI

Miêu tả các bước tiến hành trong quy trình

Bước 1: Chuẩn bị phụ phẩm thuỷ hải sản nguyên liệu:

Phụ phẩm thuỷ hải sản bao gổm:

+ Phụ phẩm từ chế biến tôm nõn đông lạnh và sấy khô (đầu tôm, chân, vỏ, đuôi và

đôi khi có cả trứng tôm, tôm nhỏ, tôm nát). Do đầu tôm chiếm phần lớn nên

thường gọi phụ phẩm tôm là đầu tôm cho đơn giản.

+ Phụ phẩm từ chế biến phi lê cá hoặc cá chặt đầu, cắt vây moi ruột, cá tạp cả con

dùng cho chăn nuôi.

+ Các phụ phẩm thuỷ hải sản khác từ chế biến cua, mực, ghẹ đều được sử dụng để

lên men làm thức ăn chăn nuôi.

Nghiền nhỏ PPTHS (độ lớn của nguyên liệu đã nghiền đạt từ 1-2mm thành dạng sệt)

Chuẩn bị PPTHS (phụ phẩm từ tôm, cá, cua, mực, ghẹ…)

Phối trộn (PPTHS + nguồn Cacbon + men khởi động +NaCl)

Lên men

Thu chế phẩm và sử dụng sản phẩm lên men nuôi gia súc, gia cầm

239

+ Nguyên liệu phụ phẩm thuỷ hải sản nếu lẫn đất, cát cần phải rửa bằng vòi phun

nước sạch. Tuy nhiên cần loại bỏ nước đá ướp nguyên liệu.

Bước 2: Nghiền nhỏ nguyên liệu, xác định khối lượng phế phụ phẩm hải sản dựa vào chế

biến để định lượng cá chất phụ gia khác

Nguyên liệu được nghiền nhỏ bằng máy nghiền dao cắt chạy điện sản xuất trong

nước trong thời gian 1 phút. Độ lớn của nguyên liệu đã nghiền từ 1-2 mm thành dạng sệt.

Những nơi không có máy nghiền có thể dùng dao băm chặt càng nhỏ càng tốt. Cũng có

thể để nguyên dạng trong lên men nhưng khó lên men hơn và thời gian lâu hơn ( trên 10

ngày).

Bước 3: Phối trộn

Tỷ lệ thành phần các nguyên liệu lên men như sau:

+ Rỉ mật ít nhất là 20% khối lượng tổng thành phần lên men hoặc ít nhất 60% bột

ngô hay bột ngũ cốc khác nhau hoặc cám gạo

+ NaCl 2%

+ Men khởi động 1% (dạng bột), 5% dạng lỏng. Nếu không có men khởi động thì

dùng 10% theo khối lượng sản phẩm đã lên men hoàn chỉnh.

+ Tất cả các nguyên liệu lên men theo các liều lượng quy định được trộn đều trong

máy trộn bê tông hình cầu chạy điện. Có thể sử dụng máy trộn quay tay được thiết

kế theo kiểu máy trộn bê tông chạy điện. Khi quy mô lên men nhỏ có thể trộn bằng

tay. Nếu nguồn Cacbon là rỉ mật thì có thể cho rỉ mật và các nguyên liệu khác

đồng thời với phụ phẩm thuỷ hải sản vào máy xay. Làm như vậy máy vừa nghiền

vừa trộn nên hỗn hợp trộn đều và nhanh, lại không tốn sức.

Bước 4: Lên men lactic phụ phẩm thuỷ hải sản

Hỗn hợp các thành phần lên men đã trộn đều được đưa vào dụng cụ lên men. dụng

cụ lên men có thể là túi polyeste, can, thùng phi bằng nhựa, nếu dùng thùng phi bằng kim

loại cần lót trong ít nhất 2 lần nilon và buộc túm đầu. Dụng cụ lên men cũng có thể là

chum, vại, sành hoặc bể xi măng. Để bảo quản tốt và dễ vận chuyển thường dùng phi

nhựa hoặc túi nilon trong tải dứa.

240

Hỗn hợp nguyên liệu lên men cần được nén chặt và làm đầy, tránh khoảng nhỏ chứa

không khí. Dụng cụ lên men phải có nắp kín và buộc chặt đảm bảo yếm khí tuyệt đối.

Trong thời gian lên men không nên mở nắp kiểm tra, cố gắng để nguyên liệu lên men

tránh tiếp xúc với không khí.

Thời gian lên men hoàn ch ỉnh là 3 ngày (trong rỉ mật), 7 ngày (trong bột ngô). Lúc này

sản phẩm có màu đỏ t ươi (trong rỉ mật), màu vàng t ươi (trong cám gạo hoăc bột ngũ

cốc) mùi thơm của axit lactic. Hàm lượng axit này chiếm trên 2%, axit acetic nhỏ hơn

0,5%, axit butylic nhỏ hơn 0,1%, đ ộ pH ≤ 4,5.

Thời gian lên men còn phụ thuộc vào nhiệt độ xung quanh: mùa hè nhanh hơn mùa đông.

Thời gian bảo quản sản phẩm lên men là 6 tháng.

Bước 5: Sử dụng sản phẩm lên men nuôi gia súc gia cầm

Khi sử dụng sản phẩm lên men làm thức ăn chăn nuôi vẫn cần đảm bảo yếm khí

phần còn lại chỉ lấy đủ mức cho gia súc gia cầm ăn và đậy kín, nén chặt ngay sau mỗi lần

lấy sản phẩm.

Để vật nuôi ăn được nhiều, cần trộn sản phẩm lên men với khẩu phần ăn cơ sỏ. L ượng

sản phẩm lên men phụ thuộc vào số l ượng và nguồn Cacbon lên men. Nếu ph ụ phẩm

tôm, cá lên men trong 20% rỉ mật thì l ượng sản phẩm lên men là 30% theo dạng ướt của

khẩu phần ăn truyền thống cho lợn (cám nấu với rau). Nếu phụ phẩm tôm, cá lên men

trong 50-60% cám gạo hoặc bột ngô thì sản phẩm lên men được sử dụng như thức ăn

hoàn chỉnh nuôi lợn lai (nội và ngoại), vịt, gà thả vườn.

3.9. Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men lactic phÕ phô phÈm ç lµm thøc ¨n ch¨n nu«i. 3.9.1. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña çc ®iÒu kiÖn: Nguån C, nhiÖt ®é, thêi gian trong qu¸ tr×nh lªn men.

KÕt qu¶ ë b¶ng 82 cho thÊy nguån c ¶nh h−ëng tíi sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo vi

khuÈn lactic, sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo vi khuÈn lµm thay ®æi pH trong m«i tr−êng lªn

men chÕ biÕn phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n. Qua thÝ nghiÖm lÆp l¹i nhiÒu lÇn thÊy r»ng sù

thÝch hîp cña nguån C trong kho¶ng 30% ®èi víi çm, bét ng«. §èi víi nguån C sö

dông lµ rØ ®−êng víi l−îng 15%. §Æc biÖt thÝch hîp cho qu¸ tr×nh lªn men cña vi khuÈn

241

lactic nÕu dïng hçn hîp 3 nguån Cacbon víi tØ lÖ ®−êng 10%; bét ng«, bét çm, mçi

lo¹i 15%. Khi ph©n tÝch thµnh phÇn sè l−îng vi khuÈn trong çc mÉu thö nghiÖm cho

thÊy víi çc mÉu cã ®é pH trong kho¶ng 4,0-4,8 hÇu nh− kh«ng t¹p nhiÔm.

B¶ng 82. ¶nh h−ëng cña nguån C vµ thêi gian trong qu¸ tr×nh lªn men.

Sè tÕ bµo lactic x 106 CFU/g Nguån C LiÒu l−îng (%)

pH sau 24h 48h 96h 192h

5 4,5 162 155 128

10 4,3 176 162 120

15 4,3 178 169 136

RØ ®−êng

20 4,2 156 142 118

10 4,8 190 176 138

20 4,5 212 178 154

30 4,5 185 165 124

Bét çm

40 4,4 182 152 132

10 5,0 176 166 156

20 5,0 195 178 152

30 4,8 152 166 128

Bét ng«

40 4,5 168 160 120

R®: 10

Çm: 15

Hçn hîp

Ng«: 15

4,2

235

224

182

§èi chøng 0 7,2 98 62 44

Sù ph¸t triÓn cña çc chñng vi khuÈn lactic cã ¶nh h−ëng víi nhiÖt ®é, ®iÒu nµy ®· ®−îc thÓ hiÖn qua b¶ng 83 cho thÊy nhiÖt ®é tõ 32-350C rÊt thÝch hîp cho sù ph¸t triÓn cña chñng vi khuÈn nghiªn cøu.

242

B¶ng 83: ¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é vµ thêi gian trong qu¸ tr×nh lªn men.

Sè l−îng tÕ bµo vi khuÈn lactic x 106 CFU/ml

NhiÖt ®é pH sau 24h

48h 96h 192h 28 5,2 128 148 112 30 5,0 156 180 168 32 4,5 182 242 180 34 4,2 188 224 146 36 4,2 146 198 124 38 5,6 68 42 28

3.9.2. Qui trình công nghệ chế biến phế phụ phẩm của cá làm thức ăn chăn nuôi

Phế phụ thủy hải sản sau khi lên men bằng các chủng vi khuẩn lactic được sử dụng làm

thức ăn chăn nuôi đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở đây chúng tôi sử

dụng phế phụ phẩm cá dã được lên men bằng các chủng vi khẩn lactic L1-L2 để chế biến

thành thức ăn cho chăn nuôi theo qui trình dưới đây.

QUI TRÌNH 9: QUI TRÌNH CHẾ BIẾN PHẾ PHỤ PHẨM CÁ LÀM THỨC ĂN CHO CHĂN NUÔI

Giống vi khuẩn lactic phân lập trong ống nghiệm

Nhân giống trên máy lắc MT MRS Nhiệt độ 300C/24h

Nhân giống trên bình lên men, nhiệt độ 300C/48h

Lên men ở trong túi nilon với các nguồn (N) là phế phụ cá, nguồn (C) là bột cám, bột ngô, rỉ đường, bột khoáng, 300C/96h

Đóng gói sản phẩm

Phân tích chỉ tiêu VSV, hàm lượng (N) tổng số

243

Mô tả qui trình công nghệ chế biến phế phụ phẩm cá

Chủng lactic L1(Streptococus lactic ) và chủng Lactic L2( Lactobacillus lactic) giữ

ở ống thạch nghiêng ở 40C trên môi trường MRS (hàng tháng phải cấy truyền giống).

Giống gốc giữ bằng phương pháp đông khô và bảo quản ở nhiệt độ - 200C. Nhân giống

trong bình tam giác 500 ml có chứa 150 ml môi trường MRS nhiệt độ lên men 300 trong

24 giờ. Dùng môi trường MRS dịch thể để nhân giống vi khuẩn Lactic L1, L2 và tiến

hành trên hê thống bình lên men thể tích 5 lit, tỉ lệ tiếp giống là 10%, lượng khí vô trùng

cung cấp là: 0,5lit KK/ lit MT/ph, nhiệt độ lên men 300 trong 48 giờ. Dịch lên men đạt số

lượng tế bào khoảng 5x109CFU/ml, được bảo quản làm giống để lên men phế phụ phẩm

thuỷ hải sản. Lên men ở trong túi nilon với các nguồn nitơ là phế phụ cá(cá chất lượng

kém như đầu, vây, ruột cá với lượng l à 100 kg đ ư ợc xay nh ỏ đem trộn đều v ới rỉ

đường 10kg, bột ngô, bột cám, mỗi loại 10kg. Sau đó bổ sung 10%lượng giống vi khuẩn

lactic L1- L2 được lên men sau 24 giờ có số lượng tế bào đạt khoảng 5.109CFU/ml, bổ

sung thêm bột khoáng Premic và muối ăn. Tất cả hỗn hợp trên được đóng gói vào túi

nilon và lên men ở 32oC. Sau 96 giờ kiểm tra số lượng vi sinh vật không tạp nhiễm, thức

ăn chế biến phế phụ phẩm cá có mùi vị thơm, số lượng tế bào vi khuẩn lactic đạt

1,25.107CFU/g, độ đạm tổng số đạt 32,5%, độ ẩm là 40%, đóng gói (thời gian bảo quản từ

4-5 tuần).

4. THỬ NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC CHẾ PHẨM SẢN XUẤT ĐƯỢC TRÊN ĐÀN GIA SÚC, GIA CẦM 4.1. Kết quả thử nghiệm L-lysin và L-methionin của Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch sản xuất thay thế cho L-lysin và L-methionin nhập ngoại trên đàn lơn, đàn gà của Trạm thử nghiệm thức ăn chăn nuôi, Viện Chăn Nuôi Quốc Gia

Vật liệu nghiên cứu gồm: các nguyên liệu chế biến thức ăn phổ biến ở nước ta như

ngô, tấm thóc, cám gạo, khô đỗ, bột cá, L-lysin và L-methionin do Viện Cơ Điện nông

nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch sản xuất và L-lysin và L-methionin nhập khẩu.

Thí nghiệm được triển khai trên đàn gà Kabir bố mẹ giai đoạn đẻ trứng và trên đàn

lợn lai F2 giống ngoại 30 con có khối lượng khoảng 20kg được phân ngẫu nhiên thành 2

244

lô trong điều kiện nuôi nền, chuồng trại thông thoáng tự nhiên tại Trạm nghiên cứu và thử

nghiệm thức ăn gia súc - Viện Chăn Nuôi từ ngày 01/07 đến ngày 31/08 năm 2004.

Bảng 84: Bố trí thí nghiệm

Lô thí nghiệm

Chỉ tiêu Lô 1 (dùng L-lysin + L-

methionin ngoại)

Lô 2 (dùng L-lysin + L-

methionin của Viện

CĐNN&CNSTH)

Lô 3 (dùng L-lysin + L-

methionin của Viện

CĐNN&CNSTH)

n 10 10 10

L-lysin ngoại 0,1 - -

L-methionin ngoại 0,2 - -

L-lysin nội - 0,3 0,1

L-methionin nội - 0,6 0,2

Thời gian nuôi (60 ngày) 60 60 60

4.1.1. Kết quả thử nghiệm chế phẩm L-lysin, L-methionine trên đàn gà

Tỷ lệ đẻ, sản lượng trứng và tiêu tốn thức ăn/10 quả trứng.

Qua theo dõi 7 tuần đẻ trứng của gà thí nghiệm chúng tôi thu được kết quả thể hiện

ở bảng 85.

Bảng 85. Tỷ lệ đẻ, sản lượng trứng và tiêu tốn thức ăn/10 quả trứng

Lô thí nghiệm

Chỉ tiêu ĐVT Lô 1 (dùng L-lysin + L-

methionin ngoại)

Lô 2 (dùng L-lysin + L-methionin của

Viện CĐNN&CNSTH)

Lô 3 (dùng L-lysin + L-methionin của

Viện CĐNN&CNSTH)

Bình quân mái Con 68,00 67,00 65,44

Tỷ lệ đẻ % 57,61 55,01 51,30

Sản lượng trứng Quả 36,30 34,70 32,30

Tổng thức ăn tiêu thụ Kg 692,80 676,70 662,50

TĂ/10 quả trứng Kg 2,81 2,91 3,13

245

Tỷ lệ trứng giống % 92,22 94,87 93,34

TĂ/10 quả trứng Kg 3,05 3,07 3,35

Tiền ăn/10 quả trứng giống Đồng 1.032,80 1.045,81 1.101,40

Qua kết quả bảng 80 cho thấy tầm quan trọng của việc cân đối các axit amin quan

trọng trong khẩu phần ăn của gia cầm đặc biệt là 2 axit amin thiết yếu nhất là L-lysin và

L-methionin đã không ảnh hưởng đến năng suất sinh sản của gà thí nghiệm. Tiêu tốn thức

ăn/10 quả trứng và cho 10 trứng giống ở lô 1 và 2 là tương đương nhau.

Một số chỉ tiêu ấp và hiệu quả kinh tế

Qua bảng 86 cho thấy các chỉ tiêu ấp nở, số gà con loại 1/tổng số trứng ấp sau khi

sử dụng L-lysin và L-methionin trong nước sản xuất thay thế nhập ngoại với hamg lượng

tương đương nhau thì không có sự sai khác. Qua đó khẳng định hoàn toàn có thể thay thế

L-lysin và L-methionin do Viên Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch sản

xuất thay thế L-lysin và L-methionin nhập khẩu với mức 0,3% L-lysin và 0,6% L-

methionin trong khẩu phần nuôi gà sinh sản không làm ảnh hưởng đén năng xuất sinh sản

của gà, chất lượng gà con 1 ngày tuổi là tương đương.

Bảng 86: Hiệu quả kinh tế

Lô thí nghiệm

Chỉ tiêu ĐVT Lô 1 (dùng L-

lysin + L-

methionin

ngoại)

Lô 2 (dùng L-lysin +

L-methionin của

Viện

CĐNN&CNSTH)

Lô 3 (dùng L-lysin +

L-methionin của Viện

CĐNN&CNSTH)

Tổng trứng ấp quả 1.138 1.003 1.016

Số trứng có phôi quả 1.117 984 977

Tỷ lệ phôi % 98,15 98,11 96,16

Gà loại 1 Con 894 777 754

Tỷ lệ nở loại trứng ấ

% 78,56 77,47 74,21

246

1/trứng ấp

Số gà con loại 1/bình quân

Con 26,29 25,47 23,04

Tiền TĂ/1gà con loại 1

Đồng 1.314,67 1.349,96 1.484,17

So sánh % 100 102,68 101,89

4.2. Kết quả thử nghiệm enzym pectinaza trên đàn lợn, đàn gà của Trạm thử nghiệm thức ăn chăn nuôi - Viện chăn nuôi Quốc gia Đối tượng:

Gà Lương Phượng thương phẩm loại 1 số lượng 200 gà từ 01 ngày tuổi đến 70 ngày tuổi. Enzym pectinaza 10 kg bổ sung 50g/20kg thức ăn chăn nuôi. Thời gian từ 31/12/2004 đến 20/03/2005 tại Trạm nghiên cứu và thử nghiệm thức ăn gia súc - Viện chăn nuôi Quốc gia. 4.2.1. Kết quả thử nghiệm enzym pectinaza trên đàn gà Lương Phượng nuôi thịt

Bảng 87. Tổng hợp một số chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật (gà Lương Phượng nuôi thịt 01 đến 70 ngày tuổi)

Chỉ tiêu ĐVT Lô 1 (đối chứng) Lô 2 (Thí nghiệm)

n con 100 100 Tỷ lệ nuôi sống % 97,00 98,00

Khối lượng gà sơ sinh g 37,20 ± 0,48Khối lượng gà 3 tuần tuổi g Khối lượng gà 6 tuần tuổi g

Khối lượng gà 10 tuần tuổi g Tổng số TĂ/tiêu thụ/con/gđ kg 4,67 4,41T/tốn TĂ/kg khối lượng cơ

thể tăng kg 2,89 2,66

Tiền TĂ/kg tăng khối lượng cơ thể đ 11.560 10.640

Tổng chi đ 2.437.750 2.344.900giống đ 300.000 300.000TĂ đ 1.840.000 1.746.400

Thuốc thú y đ 147.750 148.500Chi phí khác đ 150.000 150.000

Tổng thu đ 3.129.200 3.241.400

247

Tổng số thịt gà hơi kg 156,46 162,07Giá bán đ/kg đ 20.000 20.000

Cân đối thu chi đ 691.200 896.500Hiệu quả chuyển hóa TĂ % 92,04 100

Kết quả bảng 87 cho thấy bổ sung enzym pectinaza vào thức ăn chăn nuôi gà thịt

Lương Phượng (giai đoạn 01-70 ngày tuổi) cho kết quả tốt, tỷ lệ nuôi sống bình quân đạt

98%. Khối lượng cơ thể bình quân 70 ngày tuổi đạt 1.653,08 g/con, tiêu tốn thức ăn cho

1kg tăng khối lượng cơ thể 2,66 giảm 0,23kg/1kg tăng khối lượng cơ thể 920đ/kg tương

ứng tăng hiệu quả chuyển hóa thức ăn, 7,96% tăng thu nhập trên đầu gà ở thời điểm thử

nghiệm 2.053đ/con.

4.2.2 Kết quả thử nghiệm enzympectinaza trên đàn lợn nuôi thịt

Lợn lai F2 giống ngoại khối lượng khoản 20kg (60ngày tuổi). 40 con nuôi đến 120 ngày

tuổi.

Bảng 88. Tổng hợp một số chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật ở lợn thịt (giai đoạn 60 – 120 ngày tuổi)

Chỉ tiêu Lô 1 (đối chứng) Lô 2 (thí nghiêm)

n 20 20 Khối lượng cơ thể (kg)

Khối lượng cơ thể lúc kết thúc thí nghiệm (kg)

Tăng trọng cả giai đoạn (kg/con) 36,26 38,22

Tổng số thức ăn tiêu thụ (kg) 2.076 1.968

Tiêu tốn TĂ/kg tăng khối lượng cơ thể (kg) 2,86 2,57

Tăng trọng g/con/ngày 604,33 637,00

Hiệu quả sử dụng thức ăn (%) 111,28 100

Giá thành 1kg lơn hơi (đ) 12.729,72 12.053,70

Hiệu quả kinh tế (đ) Chênh lệch giữa lô 1 và lô 2

676.02 đ/kg thịt hơi

248

Kết quả bảng 88 cho thấy sử dụng enzym pectinaza bổ sung vào thức ăn hỗn hợp

50g/20kg cám hỗn hợp nuôi lợn thịt lai F2 giống ngoại giai đoạn 1 (60- 120 ngày tuổi) so

với lô đối chứng ( lô 1) không bổ sung enzym pectinaza cho kết quả tăng khối lượng toàn

đàn bình quân cao hơn lô đối chứng 1,96kg/ con ( tăng thêm được 39,2 kg lợn hơn so với

cùng thời gian nuôi), giảm tiêu tốn thức ăn/1 kg thịt hơi tăng là 0,29 kg thức ăn tương ứng

giảm được số lượng thức ăn là 108kg, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn 11,28% làm

giảm giá thành 1kg lợn hơi 676 đ/kg, tăng thu nhập trên một đầu lợn hơi là 41.995,36 đồng.

4.3. Kết quả thử nghiệm chế phẩm enzym phytaza bổ sung vào thức ăn nuôi lợn và

gia cầm tại Trạm Nghiên cứu và Thử nghiệm thức ăn gia súc- Viện Chăn Nuôi

Đối tượng thử nghiệm:

Gà Lương Phượng sinh sản và lợn thịt hướng nạc F2 giống ngoại từ 50kg đến xuất

chuồng.

Bổ sung 50g chế phẩm enzym phytaza cho 10kg của gà đẻ, 50g cho 10kg thức ăn

cho lợn. Thời gian từ 09/03/2005 – 11/04/2005 tại Trạm nghiên cứu và Thử nghiệm thức

ăn gia súc- Viện Chăn Nuôi.

Trên gà sinh sản

Thử nghiệm được tiến hành trên 881 gà mái và 98 gà trống ở giai đoạn 52-56 tuần

tuổi dược phân thành 2 lô, theo phương pháp phân lô so sánh. Lô 1: lô đối chứng 435 gà

mái + 49 gà trống. Lô 2: thí nghiệm: 445 gà mái + 49 gà trống trong điều kiện nuôi nền

chuồng trại thông thoáng tự nhiên.

Lô 1: đối chứng không bổ sung enzym phytaza

Lô 2: Thí nghiệm bổ sung enzym phytaza mức 50g/10kg thức ăn hỗn hợp gà đẻ giai đoạn

khai thác trứng.

Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ đẻ và sản lượng trứng, tiêu tốn thức ăn cho mười quả

trứng, tỷ lệ nuôi sống, hiệu quả chuyển hóa thức ăn. Đánh giá mùi và trạng thái chất độn

của chuồng gà.

249

Trên đàn lợn thịt

Thử nghiệm được bố trí trên đàn lợn lai giống ngoại ở giai đoạn từ 50 kg đến lúc

xuất bán với tổng 31 con lợn được phân thành 2 lô theo phương pháp lô so sánh.

Lô 1 (lô đối chứng): Với 16 lợn ăn thức ăn không bổ sung enzym phytaza

Lô 2 (lô thí nghiệm): Với 15 lợn ăn thức ăn có bổ sung enzym phytaza ở mức 50 g

chế phẩm/ 10 kg thức ăn hỗn hợp.

Hàm lượng các chất dinh dưỡng trong khẩu phần được xây dựng theo kết quả

nghiên cứu tiêu chuẩn lợn thịt lai F2 và tiêu chuẩn Việt Nam. TCVN-94. Lợn ở các lô

được cho ăn tự do hoàn toàn.

Các chỉ tiêu cần theo dõi: Thức ăn thu nhận hàng ngày, khối lượng cơ thể qua các

giai đoạn và kết thúc thử nghiệm, tiêu tốn và chi phí thức ăn/ 1 kg khối lượng cơ thể tăng,

lượng phân thải ra màu sắc và mùi của phân lợn theo đánh giá cảm quan.

4.3.1.Kết quả thử nghiệm trên đàn gà Lương Phượng bố mẹ sinh sản

Bảng 89: Tổng hợp một số chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật trên đàn gà đẻ trứng


n con 436 gà mái + 39 gà trống

445 gà mái + 49 gà trống

Tỷ lệ nuôi sống % 100.00 100.00

Tổng sổ trứng thu được quả 5.944 6.375

Bình quân gà mái Con 429.25 439.50

Tỷ lệ đẻ bình quân % 49,46 51,80

Sản lượng trứng/ mái quả 13,80 14,51

Tổng thức ăn tiêu thụ Kg 1.757,90 1.751,20

Thức ăn/10 quả trứng Kg 2.96 2.74

Hiệu quả chuyển hóa thức ăn % 108,02 100,00

Sau 4 tuần theo dõi trên gà đẻ trứng giống Lương Phượng tại thời điểm 52-56 tuần

tuổi cho kết quả thể hiện ở bảng trên, chúng tôi có nhận xét sau: Việc bổ sung enzym

250

phytaza mức 50g/10kg thức ăn hỗn hợp gà đẻ không gây ảnh hưởng đến khả năng sinh

trưởng và sức đề kháng của gà tuy việc bổ sung này đã làm tăng 2,34% tỷ lệ đẻ tương ứng

sản lượng trứng tăng 0,67 quả/mái, tiêu tốn thức ăn/10 quả trứng giảm 0,22kg song đã

làm tăng được hiệu quả chuyển hoá thức ăn 8,02%.

Vì thời gian thử nghiệm ngắn (4 tuần) nên ảnh hưởng của việc bổ sung enzym

phytaza là chưa rõ rệt được thể hiện ở các chỉ tiêu theo dõi trên bảng 88.

Về mùi và trạng thái chất độn chuồng: qua theo dõi quan sát thấy rằng trong điều

kiện triển khai thử nghiệm vào mùa xuân thời tiết hay nồm và mưa phùn có độ ẩm cao.

Nên việc bổ sung enzym phytaza có tác dụng phần nào, chuồng đỡ mùi hơn và phân khô

hơn nhưng không rõ rệt như dùng EM. Điều này cho thấy cần phải tiến hành thử nghiệm

thời gian dài hơn với dung lượng mẫu lớn hơn và cần theo dõi kỹ tiểu khí hậu chuồng

nuôi, phân tích phân của chúng thải ra để có đánh giá khách quan và khoa học nhằm

khuyến cáo cho người chăn nuôi

4.3.2. Kết quả thử nghiệm trên đàn lợn thịt

Qua 34 ngày nuôi thử nghiệm, kết quả thu được thể hiện ở bảng sau:

Từ kết quả ghi ở bảng 85 có nhận xét sau:

Sử dụng enzym phytaza bổ sung vào thức ăn hỗn hợp nuôi lợn thịt ở mức 50g chế

phẩm/10kg thức ăn so với lô 1 (đối chứng) không bổ sung chế phẩm này đã tăng được

0,62 kg lợn hơi/ đầu lợn (9,3kg hơi cả lô) trong cùng một thời gian nuôi giảm tiêu tốn

thức ăn/ 1kg lợn hơi tăng 0,33 kg tương ứng giảm 148,8 kg thức ăn tinh làm tăng hiệu quả

sử dụng thức ăn 10,57% giảm chi phí tiền thức ăn/1kg thịt hơi tăng là 990đ. Tăng thu

nhập trên một đầu lợn 29.779,2đ

251

Bảng 90: Tổng hợp một số chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật trên đàn lợn thịt (từ 50 kg đến xuất bán)


n con 16 15 Số ngày nuôi Ngày 34 34 KL cơ thể lúc đầu bình quân Kg/con 56,21 56,46 KL cơ thể lúc kết thúc thí nghiệm Kg/con 85,67 86,54

Tăng trọng cả giai đoạn Kg/con 29,46 30,08 Tổng số thức ăn tiêu thụ Kg/con 101,66 93,84 Tiêu tốn thức ăn/Kg khối lượng cơ thể tăng Kg 3,45 3,12

Tăng trọng (gam/con/ngày) Gam 866,47 884,70 Hiệu quả sử dụng thức ăn % 110,57 100 Tiền thức ăn/kg lợn hơi tăng đ 10.350,00 9.360 Hiệu quả kinh tế, chênh lệch giữa lô 1 và lô 2 đ/kg 990đ/kg thịt hơi

Tăng thu/ một đầu lợn đ/con 29.779,20 đ/con

Quan sát mức độ thải phân ra môi trường giảm được mùi thối và phân có dạng

khuôn, phân không bị lỏng như ở lô đối chứng, còn mức độ giảm thiểu như thế nào cần

phải được thử nghiệm ở qui mô lớn và có sự kiểm tra phân tích đánh giá khả năng giảm

thiểu ô nhiễm môi trường.

4.3.3 Kết quả thử nghiệm enzym mannanaza bổ sung vào thức ăn nuôi gà thịt giống

Lương Phượng

A. Khối lượng cơ thể, thức ăn g/con/giai đoạn và tiêu tốn thức ăn/tăng khối lượng cơ

thể của gà ở các giai đoạn

Sau 70 ngày thử nghiệm chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 91.

252

Bảng 91: Khối lượng, thức ăn bình quân (g/con/ngày) và tiêu tốn thức ăn cho kg

tăng khối lượng cơ thể

Lô 1 (đối chứng) Lô 2 (thí nghiệm) Chỉ tiêu

X ± mx X ± mx

4 tuần tuổi (g) n n

Thức ăn/con/ngày (g) 306,51 ± 9,13 319,26 ± 11,43

TĂ/con/kg khối lượng tăng (kg) 24,87 18g TĂ + 7g (men)

8 tuần tuổi (g) 2,27 2,19

TĂ/con/ngày (g) 913,81a ± 21,56 1,059,63b ± 18,50

TĂ/kg khối lượng tăng (kg) 76,42 61,2 TĂ +22g (men)

10 tuần tuổi (g) 1.536,74a 51,34 1.688,67 b + 61,30

TĂ/con/ngày (g) 117,7 87 TĂ + 34g (men)

TĂ/kg khối lượng tăng (kg) 2,64 2,6 g

Kết quả ở bảng 91 cho thấy ở 4 tuần tuổi khối lượng gà thí nghiệm và lượng TĂ

tiêu thụ ở cả 2 lô không có sự sai khác. Kết quả này có được là do tốc độ sinh trưởng giai

đoạn này thấp và ảnh hưởng của enzym mannanaza là chưa rõ ràng.

Ở giai đoạn 8 và 10 tuần tuổi ở lô 1 (đối chứng) có khối lượng cơ thể gà thấp hơn

lô 2 (thí nghiệm) được bổ sung enzym mannanaza ở mức 22g/con/ngày cà 34g/con/ngày

sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

Điều này cho lý giải trong tiêu thụ TĂ/con/ngày ở lô 2 (thí nghiệm) có cao

hơn lô đối chứng vì gà phải ăn để đủ mức năng lượng trao đổi (ME) cần thiết nên

mức tiêu thụ TĂ có cao hơn song tăng khối lượng cơ thể lại cao hơn lô 1.

Tỷ lệ nuôi sống, TĂ tiêu thụ (g/gà/giai đoạn)

253

Bảng 92. Tỷ lệ nuôi sống và tiêu tốn TĂ/kg tăng khối lượng (từ 01 – 70 ngày tuổi)

Chỉ tiêu Lô 1 (đối chứng) Lô 2 (thí nghiệm)

TĂ/con/cả kỳ (kg) 4,48 4,72

Tiêu tốn TĂ/kg khối lượng

cơ thể tăng 2,92 2,79

So sanh (%) 100 95,54

Nuôi sống (%) 100 100

Kết quả 92 cho thấy khi bổ sung enzym mannanaza vào thức ăn nuôi gà thịt tổng

TĂ/con/giai đoạn cao hơn lô đối chứng song tiêu tốn TĂ/kg khối lượng cơ thể tăng lại

thấp hơn lô đối chứng 3,13kg thức ăn. Điều này cho thấy việc bổ sung enzym này đã có

tắc dụng phân giải chất xơ và nâng cao hiệu quả chuyển hóa TĂ 4,46% tăng trọng hàng

ngày của gà và khối lượng cơ thể gà được nâng cao hơn lô đối chứng là 151,93 g/con bình

quân. Kết quả này phù hợp với kết quả của M.C.Haughton, Jame và cộng sự 1998 và

Daskiran.M.R.G teefer, D.Fodge và HY Hsiao tháng 1-2000. Khi đánh giá việc bổ sung

men β mannanaza đến năng suất gà Broiler và sử dụng năng lượng ở các khẩu phần có

hàm lượng men β mannanaza khác nhau.

4.4. Kết quả thử nghiệm thịt quả cà phê lên men

4.4.1. Kết quả thử nghiệm thịt quả cà phê lên men làm thức ăn chăn nuôi lợn và gia cấm

Các nguyên liệu phổ biến dùng để chế biến thức ăn gia súc ở nước ta như: ngô,

thóc, tấm, cám...và bã thịt quả cà phê lên men

Gà Lương Phượng bố mẹ giai đoạn sinh sản tuần 33 (443 mái và 48 trống ), 30 lợn

hướng nạc trọng lượng bình quân từ 29,85-32,10kg/con.

Thời gian tiến hành thử nghiệm từ 31/05/2004 đến 30/06/2004 tại Trạm Nghiên

cứu và Thử nghiệm thức ăn gia súc- Viện Chăn Nuôi.

254

4.4.2. Kết quả thử nghiệm đối với gà bố mẹ Lương Phượng

Sau 3 tuần thử nghiệm chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng sau:

Bảng 93: Kết quả thử nghiệm trên đàn gà bố mẹ Lương Phượng

Lô thí nghiệm Chỉ tiêu ĐVT

1 2 3 4

Số gà mái bình quân Con 111,34 113,50 107,00 108,00

Tổng số trứng thu được quả 1.426 1.477 1.498 1.476

Tỷ lệ đẻ % 60,98 61,97 66,67 65,08

Năng suất trứng/ mái quả 12,80 13,01 14,00 13,66

Tổng thức ăn tiêu thụ kg 333,42 339,89 324,87 327,60

TĂ/10 trứng kg 2,34 2,30 2,17 2,22

Số lượng trứng giống quả 1.405 1.444 1.463 1.441

Tỷ lệ trứng giống % 98,52 97,76 97,66 97,62

Tiêu tốn TĂ/10 trứng giống kg 2,37 2,35 2,22 2,27

Tỷ lệ nuôi sống % 98,23 97,39 100 100

Tiền TĂ/10 trứng giống đ 9.145,83 9.020,47 8.238,42 8.134,54

Qua bảng 93 cho thấy: việc thay thế vào khẩu phần thức ăn hỗn hợp nuôi gà Lương

Phượng sinh sản bã thịt quả cà phê lên men với mức 5%, 10% và 15% của khẩu phần

không ảnh hưởng đến sinh trưởng phát dục của gà. Tỷ lệ nuôi sống đạt cao tương đương

nhau giữa các lô.

Qua dó cho thấy với bã thịt quả cà phê lên men có thể bổ sung thay thế các nguyên

liệu khác để phối hợp khẩu phần nuôi gà đẻ từ 5%-15%.

255

4.4.3. Kết quả thử nghiệm trên đàn lợn thịt hướng nạc

Qua một tháng nuôi thử nghiệm bã thịt quả cà phê lên men trên đàn lợn thịt, chúng

tôi thu được kết quả thể hiện tại bảng sau:

Bảng 94: Kết quả thử nghiệm trên lợn

Lô thí nghiệm Chỉ tiêu ĐVT 1 2 3 n con 10 10 10khối lượng trước thí nghiệm

kg 321 312,5 298,5

khối lượng sau thí nghiệm kg 480 445 430

Tăng trọng kg 159 152,5 151,5Tổng TĂ tiêu thụ kg 497,5 441 421,2

TĂ/kg tăng trong kg 3,13 2,89 2,78

Tổng tiền TĂ đ 1.791.000 1.587.600 1.516.320Tiền TĂ/kg thịt hơi tăng đ 11.264,41 10.410,49 10.008,71

So sánh % 100 92,41 88,85

Qua bảng 94, chúng tôi có nhận xét:

Khi thay thế bã thịt quả cà phê lên men mức 16%-20% vào khẩu phần nuôi lợn thịt

không có sự chênh lệch về khả năng tăng trọng của lợn giữa mức có thể thay thế và không

thay thế, cụ thể:

Tăng trọng bình quân con/tháng lô đối chứng (lô 1 ) đạt 15,9kg ở lô 2 và lô 3 đạt

15,15- 15,25 kg/con/tháng. Song tiêu tốn thức ăn/ kg tăng trọng thấp nhất ở lô 3 (2,78 kg

thức ăn tinh) với mức thay thế 20% bã thịt quả cà phê lên men.

Điều này khẳng định dùng bã thịt quả cà phê lên men thay thế vào khẩu phần nuôi

lợn thịt không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của lợn, giảm chi phí tiền thức

ăn tinh cho 1 kg tăng trọng từ 7,58- 11,15%.

256

Ảnh 30: Lợn ăn thức ăn có bổ sung thịt quả cà phê lên men- Thử nghiệm tại Trạm

thử nghiệm thức ăn chăn nuôi, Viện chăn nuôi Quốc gia

4.4.4. Kết quả thử nghiệm thịt quả cà phê lên men vào thức ăn gia súc trên bò sữa tại

Ba Vì - Hà Tây

Bảng 95: Kết quả thử nghiệm thịt quả cà phê lên men vào thức ăn gia súc trên bò sữa

Bố trí thí

nghiệm N Lứa

Thời

gian cho

sữa

Thời gian

thí nghiệm

(ngày)

Kết quả

sản lượng

sữa (kg)

Kết quả

tính

theo %

Đối chứng 10 3,2 5,8 30 12,57 100

Lô bổ sung thịt

quả cà phê lên

men

10 3,5 6,8 30 13,21 105

257

Bảng 96: Kết quả về chất lượng sữa

Bố trí thí nghiệm N

Thời gian

thí nghiệm

(ngày)

Mỡ Protein VCK Đường

Đối chứng 10 30 3,73 3,48 9,27 5,04

Lô bổ sung thịt quả cà

phê lên men 10 30 3,94 3,35 9,31 5,14

- Khả năng sử dụng để thay thế 30% thức ăn tinh trong khẩu phần cho vào sữa thì bò

sữa đã ăn hết khẩu phần.

- Khả năng cho sữa ổn định về năng suất và chất lượng sữa. Sản lượng sữa hàng ngày

tính bình quân tăng 5,09%, chứng tỏ khi sử dụng chế phẩm thịt quả cà phê đã qua xử

lý (lên men) có khả năng thay thế 30% thức ăn tinh trong khẩu phần.

- Bước đầu đánh giá sản phẩm trên có khả năng thay thế được 30% thức ăn tinh trên đàn

bò đang vắt sữa tại Ba Vì- Hà Tây.

258

Ảnh 31: Trứng gà không ăn thức ăn gia súc có bổ sung thịt quả cà phê lên men

Ảnh 32: Trứng gà ăn thức ăn gia súc có bổ sung 10 % thịt quả cà phê lên men

259

Ảnh 33: Trứng gà ăn thức ăn gia súc có bổ sung 15 % thịt quả cà phê lên men

4.5. Kết quả thử nghiệm bã dứa lên men cho bò sữa

Bã dứa sau khi lên men có màu vàng tươi, mùi thơm pha lẫn mùi rượu rất hấp dẫn

bò.Thành phần dinh dưỡng dã được cải thiện đáng kể, bò ăn liên tục không bị rát lưỡi như

dạng bã ép quả tươi.Thí nghiệm I và II được bố trí trên 24 bò cái đang vắt sữa, tháng sữa

từ 3-5, lứa sữa 3-4

Khẩu phần ăn của lô thí nghiệmthay thế 50% thức ăn xanh bằng bã dứa lên men và

40% bã bia để bảo đảm lượng cung cấp vật chất khô cho bò từ 10-11 kg/con/ngày và

protein tương đương nhau

Thức ăn HH (thí nghiệm 1): Cám mì 65%, bột sắn 20%, khô đỗ tương 8%, bột

xương 2%, bột cá mặn 5%, protein 13,56%

Thức ăn thí nghiệm 2: Cám gạo 65%, bột sắn 25%, thức ăn đậm đặc Guo 10%,

Protein 45%, protein hỗn hợp 11,95%.

260

Bảng 97. Khẩu phần ăn thực tế của bò thí nghiệm

Nguyên liệu Lô đối chứng 1

Lô thí nghiệm

1

Tỉ lệ thay thế

1(%)

Lô đối chứng

2

Lô thí nghiệm

2

Tỉ lệ thay thế

2(%)

Bã dứa(kg/con/ngày) 0 11,43 0 13,10

Bã bia(kg/con/ngày) 6,43 4,06 36,8 0 0

TĂ tinh HH(kg/con/ngày) 4,76 3,07 35,5 3,28 1,82 44,5

Cỏ voi(kg/con/ngày) 28,66 18,17 36,6 35,20 16,80 52,27

Khoáng(g/con/ngày) 25,00 25,00 10,02

VCK(kg/con/ngày) 10,67 10,43 9,9 1464,7

Protein thô(g/con/ngày) 1372,6 1475,8 1011,5

Thực tế bò thí nghiệm ăn được 11,43 kg/con/ngày đã thay thế 35% bã bia và

36,6% cỏ voi hàng ngày.Trong thành phần bã dứa lên men đã có 30% thức ăn tinh nên

khẩu phần vẫn đảm bảo lượng vật chất khô cần thiết cho bò tương đương với lô đối

chứng(10,67 và 10,43% VCK/con/ngày)

Trong thí nghiệm 2(đàn bò F1): tỉ lệ thay thế cỏ voivà thức ăn tinh cao hơn thí

nghiệm1, đạt được 44,5-52,2%, bò ăn được 13,1 kg bã dứa ủ/con/ngày

Bảng 98. Năng suất sữa và tiêu tốn thức ăn/kg sữa của bò thí nghiệm

Chỉ tiêu Lô đối chứng 1

Lô thí nghiệm 1

Lô đối chứng 2

Lô thí nghiệm 2

Năng suất sữa(kg/con/ngày) 9,63a 10,82b 7,46a 8,55b

Tiêu tốn thức ăn - Vật chất

khô(kg/con/ngày) - Protein(g/con/ngày)

1,11 142,50

0,97 136,32

1,32 135,5

1,17 171,3

Các giá trị trung bình có các chữ cái khác nhau theo hàng ngang khác nhau đáng kể

(p<0.01).

261

Với đặc điểm của động vật tiêu hóa dạ cỏ, thức ăn lên men sẽ được vi sinh vật dạ

cỏ sử dụng ngay để tạo thành các axit béo bay hơi (ABBH) theo Piatkowski (1990) thì

khẩu phần ăn nhiều cỏ khô lượng ABBH tổng số thấp, sự bổ sung củ cải đường hay thức

ăn giàu gluxit sẽ làm tăng lượng ABBH tổng số trong dạ cỏ. Thức ăn lên men từ bã dứa

đáp ứng được điều đó. Bã dứa chỉ sau 3 ngày ủ men đã có thể sử dụng được, sản phẩm có

mùi thơm.

4.5.1. Đánh giá hiệu quả của việc lên men bã dứa

Giá thành chế biến và hiệu quả sử dụng thức ăn bã dứa lên men được xem là chỉ tiêu

quan trọng để đánh giá kỹ thuật công nghệ.

Bảng 99. Giá thành lên men bã dứa (tại Ba Vì 2003)

Chỉ tiêu Đơn vị Số lượng Đơn giá Thành

tiền

Mua & vận chuyển bã dứa kg 2.500 300 750.000

Bột sắn kg 715 1.800 1.287.000

Cám mỳ kg 285 2.400 684.000

Men giống kg 20 10.000 200.000

Túi nilon ủ M 20 10.000 200.000

Công lao động Công 5 40.000 200.000

Tổng cộng kg 3520

Giá thành/1kg sản phẩm đ 1.100* 3.321.000

262

Bảng 100. Giá thành chế biến lên men bã dứa (tại Nghĩa Đàn, Nghệ An 2004)

Chỉ tiêu Đơn vị Số lượng Đơn giá Thành tiền

Mua & vận chuyển bã dứa kg 2.000 200 750.000

Bột sắn kg 750 1.287.000

Men giống kg 20 200.000

Túi nilon ủ M 20 200.000

Công lao động Công 5 200.000

Tổng cộng kg 2.770

Giá thành/1kg sản phẩm đ 1.100* 3.321.000 Tỷ lệ hao hụt chất khô là 12%.

Trong chăn nuôi chỉ tiêu cuối cùng người ta quan tâm là hiệu quả kinh tế bao gồm

các khoản thu chi và nhiều hơn cả là chi phí về thức ăn. Tại thí nghiệm này chúng tôi đã

sử dụng bã dứa lên men trong khẩu phẩn để thay thế 1 phần thức ăn thô xanh và giảm tiền

thức ăn tinh. Kết quả trình bày trong bảng 100, ở đây chỉ tính chi phí tiền thức ăn cho việc

sản xuất sữa của bò.

Bảng 101. Hiệu quả kinh tế của việc sử dụng bã dứa lên men cho bò sữa

Chỉ tiêu Lô đối chứng 1

Lô thí nghiệm 1

Lô đối chứng 2

Lô thí nghiệm 2

Chi TĂ cho sản xuất sữa (đ/con/ngày) 27.075 29.785 20.230 21.312

Năng suất sữa (kg/con/ngày) 9,63 10,82 7,46 8,55

Tỷ lệ tăng sữa (%) 12,25 14,61

Chi phí TĂ/kg sữa (đ) 2.811 2.755 2.711 2.492

Từ các kết quả trên cho thấy sử dụng bã dứa lên men trong khẩu phần ăn của bò

sữa đã thay thế được 36,6% cỏ voi, 35,6% thức ăn tinh và 36,8% bã bia mà năng suất sữa

263

tăng hơn 12,25% so với lô đối chứng ở thí nghiệm 1. Trong điều kiện vùng chăn nuôi bò

sữa Nghĩa Đàn - Nghệ An thì việc chế biến bã dứa ủ men càng có ý nghĩa vì rằng ở đây

gần nguồn nguyên liệu bột sắn và nhà máy chế biến dứa. Trong mùa khô khắc nghiệt cỏ

voi và cây ngô không trồng được thì bã dứa ủ thức ăn là tốt nhất để duy trì đàn bò.

4.6. Kết quả đánh giá chế phẩm phế phụ của tôm trên lợn nuôi lấy thịt tại Trạm

Nghiên cứu và Thử nghiệm TACN thuộc Viện Chăn Nuôi

Chúng tôi chọn con 32 lơn thịt lai F1 (Landrace x Móng Cái) được nuôi bằng chế

phẩm lên men phụ phẩm tôm (PPT) tại Trạm Nghiên cứu và Thư nghiệm TACN thuộc

Viện Chăn Nuôi. Mục đích của thí nghiệm là so sánh chất lượng của chế phẩm lên men

với bột cá một loại thức ăn chất lượng cao nhập từ Nam Mỹ.

Bảng 102. Tỷ lệ tiêu hóa vật chất khô, prôtêin và xơ trong khẩu phần ăn của

lợn thí nghiệm (%)

Thức ăn có mức thay thế protêin bột cá bằng phế phụ phẩm tôm lên men (%) Thành phần dinh

dưỡng 0 10 20 30

VCK 78,3 ± 2,9 78,0 ± 2,4 76,6 ± 3,3 77,0 ± 3,1

Prôtein 87,3 ± 2,5 87,0 ± 1,4 88,0 ± 2,0 87,8 ± 1,0

Chất xơ 40,3 ± 3,4 39,7 ± 8,6 38,3 ± 8,4 37,6 ± 5,0

Bảng 103. Khả năng tăng trọng và mức tiêu tốn thức ăn của lợn thí nghiệm

nuôi bằng thức ăn có phế phụ phẩm tôm lên men

Mức thay thế Protein bột cá bằng phế phụ phẩm tôm lên men (%) Chỉ tiêu

0 10 20 30

Đầu lợn thí nghiệm 8 8 8 8

Khối lượng ban đầu (kg) 39,3 41,4 40,8 43,6

Khối lượng kết thúc (kg) 69,8 70,1 74,3 76,7

Tăng trọng (g/con/ngày) 763a 748a 813a 828a

TĂ ăn vào (kg VCK/con/ngày) 2,01 1,84 2,19 2,00

264

Tiêu tốn TĂ/kg tăng trọng (kg) 2,63 2,57 2,69 2,41

Tiền thức ăn/kg tăng trọng (đ) 7316,27 6685,73 6622,51 5652,29

Tỷ lệ (%) 100 91,4 90,5 77,3

Ghi chú: Theo hàng ngang các số trung bình mang các chữ cái khác nhau thì khác

nhau có ý nghĩa thống kê và ngược lại.

Bảng 102 cho thấy chế phẩm lên men có chất lượng tốt ngang với bột cá nhập

ngoại về khả năng tiêu hóa, dặc biệt là protêin trên lợn: 87,0- 87,8% (chế phẩm lên men)

so với 87,3% (bột cá Nam Mỹ)

Bảng 103 thể hiện chất lượng của chế phẩm lên men thông qua khả năng sinh

trưởng và phát triển của lợn được ăn loại thức ăn này: lợn tăng được 24,8 kg/con/tháng

(ăn thức ăn có chế phẩm lên men) so với 22,9 kg/con/tháng (lơn ăn có bột cá Nam Mỹ)

Do giá thành chế phẩm lên men thấp so với bột cá nhập ngoại lên đã làm hạ 22,7% giá

thành cho 1 kg thịt lơn hơi khi nuôi lợn bằng thức ăn cho sản phẩm lên men

Ảnh 34: Vịt ăn thức ăn có bổ sung đầu tôm lên men- Thử nghiệm tại làng nghề Hải bình,

Tĩnh gia, Thanh hóa

265

4.7. Kết quả thử nghiệm thức ăn lên men phế phụ phẩm cá bằng vi khuẩn lactic trên

gà ở các hộ gia đình xã Nam Hồng- Đông Anh- Hà Nội

Thức ăn chế biến từ phế phụ phẩm cá được lên men từ các chủng vi khuẩn lactic L12 và

L49 được tiến hành thử nghiệm trên qui mô hộ gia đình theo phương pháp chia lô thí nghiệm.

Kết quả được theo dõi sự tăng trưởng gà thí nghiệm được trình bày ở bảng 104.

Bảng 104. Kết quả theo dõi sự tăng trưởng trên gà thí nghiệm ở Đông Anh – Hà Nội Lô TN 1 Lô TN2 Lô TN3 ĐC

Chỉ tiêu theo dõi Gà

TH

Gà

AC

Gà

TH

Gà

AC

Gà

TH

Gà

AC

Gà

TH

Gà

AC

Số lượng gà TN (con) 30 30 30 30 30 30 30 30

Thời gian TN (ngày) 60 60 60 60 60 60 60 60

Khối lượng TB gà

trước TN (g) 200 250 200 255 200 250 200 255

Khối lượng trung bình

gà sau TN (g) 1950 1550 1855 1500 1800 1455 1690 1325

Tăng trọng trong thời

gian TN (g) 1750 1300 1655 1255 1600 1205 1490 1070

Tăng trọng so với ĐC

(g) 260 225 165 125 170 130

Ghi chú: Gà TH: Giống gà Tam Hoàng Gà AC: Gà đen Ai Cập Các Lô TN 1,2,3: Sử dụng loại thức ăn lên men vi khuẩn lactic Lô ĐC: Sử dụng thay thế phế phụ cá lên men bằng bột cá

Qua kết quả bảng 104 cho thấy: gà Tam Hoàng và gà đen Ai cập được cho ăn loại

thức ăn lên men bằng VK lactic cho thấy trọng lượng trung bình của gà thí nghiệm ở các

lô 1,2,3 tăng trọng lượng tương đối đồng đều tăng hơn từ 14-15% so với lô ĐC. Bởi thực

tế trong thời gian thí nghiệm theo dõi chúng tôi thấy loại thức ăn lên men có mùi vị thơm,

gà thường xuyên ăn hết khẩu phần, không mắc bệnh ỉa chảy, phân khô. Kết quả thử

nghiệm trên lô gà đẻ còn cho thấy ngoài trọng lượng trứng lớn hơn, lòng đỏ to hơn và có

266

mùi vị thơm hơn so với đối chứng. Tất cả các hộ gia đình tham gia thử nghiệm thức ăn

của đề tài dều mong muốn được sử dụng loại thức ăn này trong tương lai.

Kết quả thử nghiệm thức ăn lên men phế phụ phẩm cá bằng VK lactic trên gà ở các

hộ gia đình xã Đông Tân- Đông Kinh huyện Đông Hưng- Thái Bình.

Trong thời gian qua chúng tôi đã tiến hành chuyển giao qui trình công nghệ chế

biến phế phụ cá lên men bằng vi khuẩn lactic ở qui mô hộ gia đình với khối lượng 500 kg

thức ăn để tận dụng nguồn phế phụ phẩm cá ở địa phương. Kết quả cho thấy ở các hộ gia

đình ở xã Đông Tân - Đông Kinh huyện Đông Hưng - Thái Bình sử dụng loại thức ăn lên

men phế phụ cá để chăn nuôi thí nghiệm thức ăn trên 2 giống gà trống và gà mái của loài

gà Lương Phượng. Trọng lượng TB của gà nuôi bằng thức ăn lên men tăng trọng hơn 25-

35% sau thời gian 3 tháng so với lô gà ĐC nuôi theo tập quán ở địa phương trước đây.

Kết quả được trình bày ở bảng 105.

Bảng 105: Kết quả theo dõi sự tăng trưởng trên giống gà Lương Phượng TN ở

Đông Hưng- Thái Bình

Lô TN 1 Lô TN2 Lô TN3 ĐC Chỉ tiêu theo dõi

Trống Mái Trống Mái Trống Mái Trống Mái

Số lượng gà TN (con) 30 30 30 30 30 30 30 30

Thời gian TN (ngày) 90 90 90 90 90 90 90 90

Khối lượng TB gà

trước TN (g) 200 150 200 150 200 150 200 150

Khối lượng trung bình

gà sau TN (g) 2150 1800 2200 1900 2100 1850 1850 1550

Tăng trọng trong thời

gian TN (g) 1950 1650 2000 1750 1900 1700 1650 1400

Tăng trọng so với ĐC

(g) 300 250 350 450 250 300

267

Ghi chú: Lô TN1,2,3 gà được nuôi thả vườn cho ăn bằng thức ăn chế biến Lô ĐC gà được nuôi thả vườn cho ăn theo tập quán tại địa phương

Ảnh 35: Gà ăn thức ăn có bổ sung cá lên men- Thử nghiệm tại xã Đông Kinh

huyện Đông Hưng- Thái Bình

268

KẾT LUẬN

1. Đề tài đã phân lập và tuyển chọn được bộ chủng giống vi sinh vật có hoạt tính

sinh học từ các nguồn thiên nhiên bao gồm:

- Đã phân lập và tuyển chọn được 2 chủng C.glutamicum và C.acetoglutamicum

sinh tổng hợp L-lysin và L-lysin methionin cao sản lượng đạt 15 g/l.

- Đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp pectinaza

cao , trong đó chủng A. niger ĐL1 cho hoạt lực cao nhất đạt 12,2 U/ml.

- Đã phân lập và tuyển chọn được 4 chủng A. niger sinh tổng hợp mananaza cao

trong đó chủng A.awamori BK cho hoạt lực cao nhất đạt 58,57 U/ml.

- Đã phân lập và tuyển chọn được 4 chủng A. niger sinh phytaza trong đó chủng A.

niger MP2 cho sản lượng phytaza cao nhất đạt 13U/ml.

- Đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic và

bacteriocin, trong đó chủng L12 sinh axit lactic mạnh nhất đạt 2,52g/l.

- Đã phân lập và tuyển chọn được 2 chủng Lactobacillus plantarum có hiệu quả

khử cafein là 60 %, 3 chủng nấm mốc có khả năng khử caffein cao từ 81%-100% và 1

chủng vi khuẩn B.subtilis có khả năng khử tannin cao, đạt 90,3%.

2. Đề tài đã chọn tạo và nâng cao được hoạt lực của bộ chủng giống vi sinh vật

phục vụ cho sản xuất bằng việc sử dụng kỹ thuật đột biến và các kỹ thuật sinh học phân tử

bao gồm:

- Đã chọn tạo được 2 chủng C.glutamicum đột biến sinh L-lysin CM 11 và CM24,

trong đó chủng CM 24 đột biến cho sản lượng L-lysin cao nhất, đạt 30g/l.

- Đã chọn tạo được 2 chủng C.acetoglutamicum đột biến sinh L-methionin M1 và

M2, trong đó chủng M1 đột biến cho sản lượng L- methionin cao nhất đạt 30g/l.

- Đã tách dòng và đọc trình tự gen Dap A mã hóa cho enzym diaminopimelovate

synthase xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp L-lysin của chủng Corynebacterrium

glutamicum

- Đã tách dòng và đọc trình tự gen Met A mã hóa cho enzym

homoserinacetyltransferasse xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp L- methionin của chủng

Corynebacterrium acetoglutamicum

269

-Đã tách dòng và biểu hiện gen phyA mã hóa phytaza của chủng nấm mốc A. niger

trong nấm men Pichia pastoris. Dịch chiết của chủng nấm men tái tổ hợp đã có hoạt tính

phytaza.

- Đã tách dòng và biểu hiện gen plantaricin SA mã hóa bacteriocin trong vi khuẩn

E.coli BL21.

3. Đề tài đã nghiên cứu và hoàn thiện qui trình công nghệ lên men các axit amin và

enzym ở qui mô bán công nghiệp bao gồm:

- Đã nghiên cứu công nghệ lên men axit amin L-lysin trên môi trường rỉ đường

trên hệ thống lên men chìm sục khí 150l/mẻ-1500l/mẻ Xác định được các yếu tố công

nghệ thích hợp cho sinh tổng hợp L-lysin cao: nhiệt độ 300C, pH=7,0, độ oxy hòa tan là

100%, sản lượng L-lysin đạt 28 g/l tại thời điểm 72h. Đã nghiên cứu được công nghệ thu

hồi và tạo chế phẩm L-lysin. Chế phẩm L-lysin chứa 70 % L-lysin.

-Đã nghiên cứu công nghệ lên men axit amin L-methionin trên môi trường rỉ

đường MT3 trên hệ thống lên men chìm sục khí 150/mẻ-1500l/mẻ. Đã xác định được các

yếu tố công nghệ thích hợp cho sinh tổng hợp L- methionin cao: nhiệt độ 300C, pH=7,0,

độ oxy hòa tan là 100% sản lượng L-methionin đạt 28,1 g/l tại thời điểm 72h. Đã nghiên

cứu được công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm L- methionin. Chế phẩm L- methionin chứa

70 % L-lysin methionin.

- Đã nghiên cứu công nghệ lên men enzym phytaza trên hệ thống lên men chìm

sục khí 150l/mẻ-1500l/mẻ. Đã xác định được các yếu tố công nghệ thích hợp cho sinh

tổng hợp phytaza cao: môi trường thích hợp cho sinh phytaza là môi trường P3, nhiệt độ

300C, pH=5,5, độ oxy hòa tan là 90% sản lượng phytaza đạt 12,8U/ml. Chế phẩm phytaza

dạng bột đạt 354 u/g.

- Đã nghiên cứu công nghệ lên men enzym pectinaza trên môi trường thịt quả cà

phê trên hệ thống lên men chìm sục khí 150l/mẻ-1500l/mẻ Đã xác định được các yếu tố

công nghệ thích hợp cho sinh tổng hợp pectinaza cao: nhiệt độ 300C, pH=5,0-5,5, độ oxy

hòa tan là 90% sản lượng pectinaza đạt 12,3U/ml. Đã nghiên cứu được qui trình công

nghệ tinh sạch và tạo chế phẩm pectinaza. Chế phẩm pectinaza dạng bột có 288 u/g.

270

- Đã nghiên cứu công nghệ lên men enzym mananaza trên hệ thống lên men chìm

sục khí 150/mẻ. Xác định được các yếu tố công nghệ thích hợp cho sinh tổng hợp

mananaza: nguồn cacbon thích hợp là guargum và bã cà phê, nguồn nitơ là NaN03 , tỷ lệ

giống cấy là 7,5%, độ oxy hòa tan là 90% sản lượng mananaza đạt 120U/ml tại 96h. Chế

phẩm mananaza dạng bột đạt 407 U/g.

- Đã nghiên cứu công nghệ lên men thịt quả cà phê làm thức ăn gia súc qui mô 1

tấn/mẻ chế biến theo phương pháp ướt và phương pháp khô bằng việc dùng vi khuẩn

Bacillus subtilis và nấm Neurospora sitophila và nấm Aspegillus niger. Hiệu quả khử

tannin và cafein trong thịt quả cà phê đạt 90 %.

- Đã nghiên cứu công nghệ lên men bã dứa làm thức ăn cho bò sữa qui mô 1

tấn/mẻ bằng việc sử dụng vi khuẩn Lactobacillus phantarum và nấm Aspergillus niger.

Bã dứa lên men có thể bảo quản trong thời gian 3 tuần.

- Đã nghiên cứu công nghệ lên men phế phụ phẩm thủy tôm, cá qui mô 1 tấn

mẻ làm thức ăn chăn nuôi bằng việc dùng vi khuẩn Lactobacillus phantarum. Phế

phụ phẩm tôm, cá lên men có thể bảo quản trong 3- 4 tháng.

4. Đề tài đã thử nghiệm và đánh giá các chế phẩm sản xuất được trên đàn gia súc,

gia cầm bao gồm:

- Đã thử nghiệm chế phẩm L-lysin và L methionin trên đàn lợn, gà. Kết quả cho

thấy chế phẩm L-lysin và L methionin của Viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công Nghệ

Sau Thu Hoạch sản xuất hoàn toàn có thể thay thế L-lysin và L methionin nhập ngoại với

mức 0,3% L-lysin và 0,6% L-methionin trong khẩu phần nuôi gà sinh sản, không ảnh

hưởng đến năng suất sinh sản của gà.

- Chế phẩm pectinaza thử nghiệm được bổ sung vào thức ăn nuôi gà thịt Lương

Phượng (giai đoạn 01-70 ngày tuổi) đã cho kết quả tốt, tỷ lệ nuôi sống bình quân đạt 98%,

hiệu quả kinh tế tăng. Thử nghiệm chế phẩm trên đàn lợn đã đã làm tăng hiệu quả sử dụng

thức ăn của lợn 11,28%, tăng trọng lượng cơ thể của lợn và tăng thu nhập bình quân trên

mỗi đầu lợn.

- Đã thử nghiệm chế phẩm phytaza trên đàn lợn, gà. Kết quả cho thấy bổ sung 50g

chế phẩm/20kg thức ăn hỗn hợp của gà đẻ đã không gây ảnh hưởng đến khả năng sinh

271

trưởng và sức đề kháng của gà, tăng tỷ lệ đẻ 2,34% tương ứng với sản lượng trứng tăng

0,67quả/mái. Thử nghiệm trên lợn đã tăng hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn là 10,57%,

giảm chi phí tiền thức ăn/kg thịt hơi là 990đ và tăng thu nhập trên mỗi đầu lợn.

- Chế phẩm thịt quả cà phê lên men được thử nghiệm trên đàn lợn thịt cho thấy có

thể thay thế 16-20% thịt quả cà phê lên men vào khẩu phần nuôi lợn thịt, không ảnh

hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của lợn, giảm chi phí tiền thức ăn tinh cho 1kg,

tăng trọng từ 7,58- 11,15%. Đối với bò sữa, chế phẩm có thể thay thế 30% thức ăn tinh

trong khẩu phần ăn của bò, bò cho sản lượng sữa ổn định và năng suất sữa tăng 5 %.

- Chế phẩm bã dứa lên men đã được thử nghiệm bổ sung vào khẩu phần ăn của bò

sữa. Kết quả cho thấy hiệu quả sử dụng thức ăn của bò tăng và năng suất sữa tăng

12,25%.

- Đã thử nghiệm chế phẩm phế phụ của tôm trên đàn lợn thịt. Chế phẩm có chất

lượng tốt ngang với bột cá nhập ngoại về khả năng tiêu hóa, khả năng sinh trưởng và phát

triển của lợn, giá thành chế phẩm thấp.

- Đã thử nghiệm chế phẩm thức ăn lên men phế phụ phẩm cá bằng vi khuẩn lactic

trên đàn gà. Kết quả cho thấy gà ăn thức ăn lên men bằng vi khuẩn lactic trọng lượng gà

tăng 14%, gà ăn hết khẩu phần và không mắc các bệnh ỉa chảy và phân khô. Trọng lượng

trứng của gà đẻ tăng.

- Chế phẩm mananaza được thử nghiệm bổ sung vào thức ăn nuôi gà thịt Lương

phượng đã có tác dụng phân giải chất xơ và nâng cao hiệu quả chuyển hóa thức ăn 4,46%,

trọng lượng cơ thể gà tăng 151,93g/con.

272

KIẾN NGHỊ

Với những kết quả thu được của đề tài chúng tôi kiến nghị với Hội đồng nghiệm thu đề tài, với Bộ khoa học và Công nghệ và Ban chủ nhiệm chương trình Công nghệ sinh học cho phép các đề tài nhánh sau đây được chuyển thành dự án sản xuất thử để những công nghệ này sớm được chuyển giao vào sản xuất:

Đề tài nhánhnghiên cứu công nghệ sản xuất L-lysin, Đề tài nhánh nghiên cứu công nghệ sản xuất L-methionin, Đề tài nhánh nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza, Đề tài nhánh nghiên cứu công nghệ sản xuất pectinaza Đề tài nhánh nghiên cứu công nghệ sản xuất bã dứa lên men Đề tài nhánh nghiên cứu công nghệ sản xuất phế phụ phẩm tôm Đề tài nhánh nghiên cứu công nghệ sản xuất phế phụ phẩm cá

Chúng tôi đề nghị để đề tài nhánh nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym mananaza được tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện công nghệ và nghiên cứu công nghệ sản xuất oligosacharit làm chế phẩm probiotic

273

kÕt qu¶ kh¸c cña ®Ò tµi

§Çu t− trang thiÕt bÞ n©ng cÊp phßng thÝ nghiÖm

Trong kinh phÝ 2700 triÖu ®ång tõ ng©n s¸ch Nhµ n−íc, ®Ò tµi ®· sö dông 700 triÖu

®ång ®Ó mua s¾m mét sè trang thiÕt bÞ ®Ó n©ng cÊp phßng thÝ nghiÖm vµ c¬ së h¹ tÇng cña

c¬ quan chñ tr× ®Ò tµi vµ çc ®¬n vÞ phèi hîp. Danh s¸ch çc trang thiÕt bÞ ®· ®−îc mua

®−îcliÖt kª trong b¶ng. Sè trang thiÕt bÞ nµy ®· ®−îcViÖn c¬ ®iÖn n«ng nghiÖp vµ c«ng

nghÖ sau thu ho¹ch nghiÖm thu vµ ®¸nh gi¸ cao hiÖu qu¶ sö dông çc trang thiÕt bÞ nµy

Bảng 106. Danh môc çc trang thiÕt bÞ ®Çu t− n©ng cÊp phßng thÝ nghiÖm cho ®Ò tµi

Nguån vèn TT Néi dung §¬n vÞ ®o

Sè l−îng §¬n gi¸(triÖu ®ång)

Thµnh tiÒn (triÖu ®ång) NSNN

(triÖu ®ång)

Tù cã

Kh¸c

1 M¸y ®o pH c 1 15 15 15

2 BÓ æn nhiÖt 00C – 90 0C c 1 34 34 34

3

M¸y quang phæ quÐt tù ®éng UV – VIS bíc sãng 200nm – 1100nm

c 1 30 30 30

4 Bé ®iÖn di protªin c 1 10 10 10 5 M¸y l¾c æn nhiÖt c 1 140 140 140 6 Pipet man çc lo¹i c 1 10 10 10

7 Cét trao ®æi ion c 1 20 20 20

8 M¸y li t©m èng eppendof nhá c 1 25 25 25

9 Tñ l¹nh c 2 3 6 6

10 Trôc chÌn kÝn cho t¨ng lªn men 150l/ mÎ vµ 1500 l/ mÎ

c 1 190 190 190

11 MÊy li t©m liªn tôc c 1 220 220 220 Céng 700 700

274

KÕt qu¶ ®µo t¹o

Trong khu«n khæ cña ®Ò tµi, chóng t«i ®· ®µo t¹o ®−îc20 sinh viªn lµm luËn

v¨n tèt nghiÖp, 3 häc viªn cao häc lµm luËn v¨n th¹c sÜ vµ 2 nghiªn cøu sinh sÏ b¶o

vÖ luËn v¨n tiÕn sÜ.

275

Tµi liÖu tham kh¶o

Tµi liÖu trong n−íc: 1. §Æng ThÞ Thu, T« Kim Anh, NguyÔn ThÞ Xu©n S©m, “ThÝ nghiÖm ho¸ sinh c«ng

nghiÖp” Tr−êng §¹i häc B¸ch Khoa Hµ Néi.

2. KiÒu H÷u ¶nh, “gi¸o tr×nh vi sinh vËt häc c«ng nghiÖp” nhµ xuÊt b¶n khoa häc kÜ

thuËt

3. L−¬ng §øc PhÈm, “c«ng nghÖ vi sinh vËt” nhµ xuÊt b¶n n«ng nghiÖp 1998.

4. L−¬ng §øc PhÈm, Hå Sëng, “ vi sinh tæng hîp”, NXB khoa häc kÜ thuËt 1978.

5. Lª §×nh L−¬ng, “Di truyÒn häc vi sinh vËt” §¹i Häc Tæng Hîp 1970.

6. Lª Ngäc Tó, La V¨n Chø, §Æng ThÞ Thu, Ph¹m ThÞ ThÞnh, Bïi §øc Hîi, Lu DuÈn,

Lª Do·n Diªn, “Ho¸ sinh häc c«ng nghiÖp” NXB khoa häc kÜ thuËt

7. Lª §×nh L−¬ng, NguyÔn Thanh HiÒn, NguyÔn ThÞ Nam Hoa ( dÞch), “Ph¬ng ph¸p

nghiªn cøu di truyÒn häc vi sinh vËt ( virus, vi khuÈn, nÊm mèc)” NXB khoa häc kÜ

thuËt 1983.

8. NguyÔn L©n Dòng, §µo Xu©n Mîn, NguyÔn Phïng TiÕn, §Æng §øc Tr¹ch, Ph¹m

V¨n Ty, “ mét sè ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu vi sinh vËt, tËp 1” NXB khoa häc vµ kÜ

thuËt.

9. PGS.TS. NguyÔn L©n Dòng ( dÞch), “ Vi sinh vËt häc” NXB ®¹i häc vµ trung häc

chuyªn nghiÖp Hµ Néi.

Tµi liÖu n−íc ngoµi: 10. 38.A.Ulloa, J.&H. Van Wee. 1997. The growth and feed untilization of

Oreochromis 11. Alonso, J.C. and Espinosa, M. “Plasmids from Gram positive bacteria. In:

Plasmids”, A Practical Approach (Hardy, K.G., Ed.), pp. 39^63. IRL Press,

Oxford. 1993

12. Ankri, S., Bouvier, I., Reyes, O., Predali, F. and Leblon, G. “A Brevibacterium

linens pRBL1 replicon functional in Corynebacterium glutamicum”. Plasmid 36,

36 - 41. 1996

13. Ankri, S., Bouvier, I., Reyes, O., Predali, F. and Leblon, G. “A Brevibacterium linens pRBL1 replicon functional in Corynebacterium glutamicum”. Plasmid 36, 36 - 41. 1996

276

14. Archer, J.A.C. and Sinskey, A.J. “The DNA sequence and minimal replicon of the

Corynebacterium glutamicum plasmid pSR1: evidence of a common ancestry with

plasmids from Corynebacterium diphtheriae”. J. Gen. Microbiol. 139, 1753 -

1759. 1993

15. Bachmann, F., Sonnen, H, and Kutzner, H.J. “Plasmid curing in Corynebacteria

with penicillin G. DECHAMA Biotech”. Conf. 853 - 856. 1992

16. Billman-Jacobe, H., Hodgson, A.L.M., Lightowlers, M., Wood, P.R. and Radford,

A.J. “Expression of ovine gamma interferon in Escherichia coli and

Corynebacterium glutamicum”. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1641 - 1645. 1994

17. Billman-Jacobe, H., Wang, L., Kortt, A., Stewert, D. and Radford, A. “Expression

and secretion of heterologous proteases by Corynebacterium glutamicum”. Appl.

Environ. Microbiol. 61, 1610 - 1613. 1995

18. Cadenas, R.F., Martin, J.F. and Gil, J.A. “Construction and characterization of

promoter-probe vectors for Corynebacteria using the kanamycin resistance

reporter gene”. Gene 98, 117 - 121. 1991

19. Cardini, G. and Jurtshuk, P. “The enzymatic hydroxylation of n-octane by

Corynebacterium sp. strain 7ECIC”. J. Biol. Chem. 245, 2789 - 2796. 1970

20. Chan Kwo Chion, C.K.N., Duran, R., Arnaud, R. and Galzy, P. “Cloning vectors

and antibiotic resistance markers for Brevibacterium sp. R312”. Gene 105, 119 -

124. 1991

21. Constatinides, A. “Steroid transformation at high substrateconcentrations using

immobilized Corynebacterium simplex cells”. Biotechnol. Bioeng. 22, 119 - 136.

1980

22. Duvnjak, Z. and Kosaric, N. “Release of surfactantfrom Corynebacterium lepus

with alkenes”. Biotech. Lett. 3, 583 - 588. 1981

23. Fernandez-Gonzales, C.Cadenas, R.F.Noirot-Gros, M.Martin, J.F. and Gil, J.A.

“Characterization of a region of plasmid pBL1 of Brevibacterium lactofermentum

involved in replication via the rolling circle model”. J. Bacteriol. 176, 3154 - 3161.

1994

277

24. Filpula, D.Ally, A.H. and Nagle, J. “Complete nucleotide sequence of a native

plasmid of Brevibacterium lactofermentum”. Nucleic Acids Res. 14, 5114. 1986

25. Golding. G. B, and A. M. Dean. “The structural basis of molecular adaptation”.

Mol. Biol. Evol.15:355 - 369. 1998

26. Gross, D.C., Vidaver, A.K. and Keralis, M.B. “Indigenous plasmids from

phytopathogenic Corynebacterium sp”. J. Gen. Microbiol. 115, 479 - 489. 1979

27. Haino, K (1971), “studies on the egg-membrane lysine of Tegulapfeifferi. Purification and properties of the egg-membrane lysine’, Biochim. Biophys. Acta, vol 229, pp.459 - 470.

28. Lãpez, e. & M. Pabãn. 1986. Mejorramieto nutricional de la pulpa de cafe. Noticias QuÝmicas

29. Lee, Y. H., and V. D. Vacquier. “The divergence ofspecies-specific abalone sperm

lysins is promoted by posi-tive Darwinian selection”. Biol. Bull.182: 97 - 104.

1993.

30. Lee, Y. H., T. Ota, and V. D. Vacquier. “Positive selection is a general

phenomenon in the evolution of abalonesperm lysin”. Mol. Biol. Evol.12: 231 -

238. 1995.

31. Lee, Y.-H. “Abalone sperm lysin: molecular evolution of fertilization protein,

implications concerning the species-specificity of fertilization and speciation in

marine inverte-brates”. Ph.D. dissertation, University of California, San Di-ego.

1994.

32. Lewis, C. A., C. F. Talbot, and V. D. Vacquier. “A protein from abalone sperm

dissolves the egg vitelline layerby a non-enzymatic mechanism”. Dev. Biol. 92:

227 - 239. 1982.

33. Liebl, W., Sinskey, A.J. and Schleifer, K. “Expression, secretion and processing of staphylococcal nuclease by Corynebacterium glutamicum”. J. Bacteriol. 171, 1854 - 1861. 1992

34. Martin, J.F., Santamaria, R., Sandoval, H., del Real, G., Mateos, L.M., Gil, J.A.

and Aguilar, A. “Cloning systems in amino acid producing Corynebacteria”.

Bio/Technology 5, 137 - 146. 1987

278

35. Mehansho, H.,Butler, L&D. Carlson.1987. Dietary tanins and salivary proline-rich proteins: Interactions, induction, and defense mechanisms. Annual Review of nutrition

36. Metz, E. C., and S. R. Palumbi. “Positive selection and sequence rearrangements

generate extensive polymorphismin the gamete recognition protein bindin”. Mol.

Biol. Evol.13: 397 - 406. 1996.

37. Metz, E. C., R. Robles-Sikisaka, and V. D. Vacquier. “Nonsynonymous

substitution in abalone sperm fertilizationgenes exceeds substitution in introns and

mitochondrial DNA”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10676 - 10681. 1998

38. Minor, J. E., D. R. Fromson, R. J. Britten, and E. H. Da-Vidson. “Comparison of

the binding proteins of Stron-gylocentrotus franciscanus, S. purpuratus, and

Lytechinusvariegatus: sequences involved in the species-specificity

offertilization”. Mol. Biol. Evol.8: 781 - 795. 1991.

39. Miyata, T., S. Miyzawa, and T. Yasunga. “Two types of amino acid substitutions

in protein evolution. J. Mol. Evol.12: 219 - 236. 1979.

40. Haino. K. “Studies on the egg-membrane lysin of Tegulapfeifferi. Purification and

properties of the egg-membrane lysin”. Biochim. Biophys. Acta 229 : 459 - 470.

1971

41. Haino-Fukushima, K., H. Kasai, T. Isobe, M. Kimura, and T. Okuyama. “The

complete amino acid sequence of vitelline coat lysin”. Eur. J. Biochem.154 : 503 -

510. 1986

42. Haino-Fukushima, K.H. Kasai, T. Isobe, M. Kimura, and T. Okuyama. “The complete amino acid sequence of vitelline coat lysin”. Eur. J. Biochem.154 : 503 - 510. 1986

43. Haino-Fukushima. K. “Studies on the egg-membrane ly-sin of Tegula pfeifferi: the

reaction mechanism of the egg-membrane lysin”. Biochim. Biophys. Acta 352 :

179 - 191. 1974.

44. Harasewych, M. G., S. L. Adamkewicz, J. A. Blake, D.Saudek, T. Spriggs, and C.

J. Bult. “Phylogeny andrelationships of pleurotomariid gastropods (Mollusca: Gas-

279

tropoda): an assessment based on partial 18S rDNA andcytochrome c oxidase I

sequences”. Mol. Mar. Biol. Bio-technol.6: 1 - 20. 1997

45. Hellberg, M. E. “Sympatric sea shells along the sea'sshore: the geography of

speciation in the marine gastropo Tegula”. Evolution 52: 1311 - 1324. 1998

46. Hendrick, C.A., Haskins, W.P. and Vidaver, A.K. “Conjugative plasmid in

Corynebacterium Esaccumfaciens subsp. oorti that confers resistance to arsenite,

arsenate and antimony(III). Appl. Environ. Microbiol. 48, 56 - 60. 1984

47. Sonnen, H., Thierbach, G., Kautz, S., Kalinowski, J., Schneider, J., Puhler, A. and

Kutzner, H. “Characterization of pGA1, a new plasmid from Corynebacterium

glutamicum LP-6”. Gene 107, 69 - 74. 1991

48. Takagi, H., Morinaga, Y., Miwa, K., Hakamori, S. and Sano, K. Versatile

“Cloning vectors constructed with genes indigenous to glutamic acid producer

Brevibacterium lactofermentum”. Agric. Biol. Chem. 50, 2597 - 2603. 1986

49. Takeda, Y., Fuji, M., Nakajyoh, Nishimura, T. and Issiki, S. “Isolation of a

tetracycline resistance plasmid from a glutamate producing Corynebacterium,

Corynebacterium melassecola”. J. Ferment. Bioeng. 70, 177 - 179. 1990

50. Trautwetter, A. and Blanco, C. “Structural organization of the Corynebacterium

glutamicum plasmid pCG100”. J. Gen. Microbiol. 137, 2093 - 2101. 1991

51. Tsuchiya, M. and Morinaga, Y. “Genetic control systems of Escherichia coli can

confer inducible expression of cloned genes in Coryneform bacteria”.

Bio/Technology 6, 428 - 430. 1988

52. Tsuchiya, M. and Morinaga, Y. “Genetic control systems of Escherichia coli can confer inducible expression of cloned genes in Coryneform bacteria”. Bio/Technology 6, 428 - 430. 1988

Documents

nghiªn cøu ¸p dông c«ng nghÖ vi sinh hiÖn ®¹i ®Ó s¶n xuÊt ... · giµu axit amin vµ enzym tõ nguån thø phÈm n«ng nghiÖp vµ thuû h¶i s¶n ë qui m« b¸n c«ng