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Nouveaux mécanismes de résistance aux antibiotiques…et
les bactéries en action
Y. GlupczynskiService de Microbiologie
Cliniques U.C.L Mont-Godinne
28 juin 2007
Community
- Strep. pneumoniae -MDR- CA-MRSA- Salmonella, E. coli (ESBL,
FQ)- Campylobacter (FQ,
macrolides)- Helicobacter pylori
(macrolides, imidazoles)- Myc. tuberculosis - MDR
Healthcare
- Staphyloccocus aureus(MRSA, VISA, VRSA)
- Enterococcus spp. (VRE)
- Enterobacteriaceae (BLSE, FQ, carbapénémases)
- Ps. aeruginosa - MDR- Ac. baumannii - MDR
The challenging
resistant pathogens
Antibiotiques actifs sur la synthèse protéique
16S rRNA
Mécanismes de résistance aux aminoglycosides
•
Inactivation enzymatique -
N-acetylation
(AAC)
-
O-Nucleotidylation
(ANT)-
O-Phosphorylation (APH)
•
Diminution de l’accumulation intracellulaire-
Diminution de la perméabilité
membranaire
-
Diminution du transport membranaire-
Efflux actif
•
Modification de la cible–
Mutations dans des protéines ribosomales / 16 S rRNA
Fréquent
Rare
Phénotypes
de résistance aux aminoglycosides
Phénotype Enzyme GEN TOB NET AKN ISE Espèces
Sauvage - S S S S S Toutes(Providencia)
G AAC(3)-I I/R S S S S E.coli, P. mirabilis,K. pneumoniae
A APH(3’)-VI S S S I/R I/R (rares)
KTG ANT(2”) I/R I/R S S S toutes
KTA ANT(4’)-II S R S R R (rares)
GTN AAC(2’)-IAAC(3)-II, -IV
I/RR
I/RR
I/RS/I/R
SS
SS
P. stuartiiE. coli, Proteus,KES, Citrobacter
KTNA(I) AAC(6’)-I S R R S/I/R S KES, Citrobacter
KTGNAI Imperméabilitéplus, enzymes
RR
RR
RR
RR
RR
Toutes (rares)Toutes (rares)
Methylation de l’ARNr 16S
G1405(Gram -)
A1408(Actinomycetes)
Doi
& Arakawa, Clin Infect Dis 2007; 45:88-94
Arbre phylogénique des 16S rRNA méthylasesd’Actinomycetes et de bactéries à Gram-négatif
Yamane
et al., Emerg. Infect. Dis 2005
Actinomycetes(Micromonospora,Streptomyces)
Gram-négatifs-
Enterobactéries-
Non-fermentants
??
Dendrogramme d’homologie de séquence des 16S rRNA méthylases
30-35% homologie séquence AA
Profil de résistance aux aminosides associé aux 16S rRNA méthylases
Molécule Sensibilité
4,6-
DOS* GentamicineTobramycineAmikacineArbekacine (-> Dibekacine)
Résistance HNRésistance, Résistance HNRésistance HN Résistance HN
4,5-
DOS,NéomycineApramycine
SensibleSensible
Non-
DOSStreptomycine Sensible
* DOS, deoxystreptamine
Distribution géographique des gènes codant pour les 16S rRNA méthylases
Doi
& Arakawa, Clin Infect Dis 2007; 45:88-94
Prevalence / distribution des 16S rRNA methylases « Worldwide »
•
Prévalence exacte ? (0.01 –
1%) •
ArmA
>> RmtB
> RmtA
> RmtC/RmtD
•
Asie > Europe, Am. Sud (Brésil)•
Enterobactéries
(ArmA, RmtB, RmtC)
•
P. aeruginosa, Acinetobacter
spp. (RmtA, RmtD, ArmA)•
Association avec ESBL (CTX-M-3, M-9, SHV-5/-12) ou carbapenemase
(SPM-1)
•
Localisation sur transposons composites (Tn1548)•
Plasmides transférables (Inc
L/M, Inc
FI, Inc
N)
•
Isolés à
partir de souches humaines, animales (pigs)
16S rRNA
methylases
en Belgique•
Screening 15,000 souches d’Entérobactéries dans 2 hôpitaux belges (2000-2005)
•
PCR (ArmA, RmtA/B) + Résistance HN Genta, Tobra, Amika
•
20 souches (19 armA, 1RmtB)–
K. pneumoniae
(10), E. coli
(5), E. aerogenes
(2), E. cloacae
(1),
C. diversus
(1)
•
Cas index (importation: Algérie, Serbie)•
Association constante avec BLSE (CTX-M-3, M-14, M-9)
•
Diffusion clonale (K. pneumoniae), polyclonale
(E. coli,…)•
Plasmides conjugatifs
(≠
groupe Inc
L/M, IncFI)
•
Résistance transférable in vitro (aminogl, BL, quinolones)
Bogaerts et al., JAC 2007
Profil de résistance aux aminosides caractéristique d’une souche de E. coli
productrice de 16S rRNA
méthylase
(armA)
Haut niveau de résistance: Genta, Tobra, Amika
(CMI > 256 µg/ml)
Arbekacine
(CMI > 256 µg/ml)
E. coli transconconjugant
Bogaerts
et al., JAC 2007
Fluoroquinolone Structures
Gemifloxacin
Bacterial Type II Topoisomerases Quinolone
Target Enzymes
Enzyme Subunits Activities
DNA DNA GyraseGyrase((TopoisomeraseTopoisomerase II)II)
2 2 GyrAGyrA2 2 GyrBGyrB
DNA DNA SupercoilingSupercoiling(DNA Relaxation)(DNA Relaxation)(DNA (DNA DecatenationDecatenation))
TopoisomeraseTopoisomeraseIVIV
2 2 ParCParC ((GrlAGrlA))2 2 ParEParE ((GrlBGrlB) )
DNA DNA DecatenationDecatenation(DNA Relaxation)(DNA Relaxation)
Mécanismes de résistance aux quinolones
Chromosomiques :- Diminution d’affinité
par modification de la cible (QRDR)
- Diminution de la conc. intracellulaire de l’ATB :imperméabilité
(ex. OmpF)
efflux actif (ex. AcrAB-TolC)
Plasmidiques :- Protection de la cible (protéines Qnr) 1998- Inactivation par modification de l’ATB (acétylase) 2006
Protéines Qnr (1)
Structure :QnrA
(QnrA1) dans une souche de
K. pneumoniae
(USA, 1998) : 218 AA(gène = 657 bp) Famille des protéines à
motifs penta-
peptidiques répétésMême famille que les protéines McbG
(antidote Microcine
B17) et MfpA
(19.6% et 18.9%)
MfpA
de M. tuberculosis(Vetting
et al. Biochemistry
2006)
Variants :QnrB
et QnrS
id. à
40% et 59% avec QnrA
5 variants QnrA
(1 à
5)6 variants QnrB
(1 à
6)
2 variants QnrS
(1 et 2)
QnrA
Reduces Gyrase
Binding to DNA
Tran J et al. Antimicrob
Agents Chemother
2005; 49:118-125
Protection de la cible: diminue interaction ADN -
gyrase
et donc formationcomplexe ternaire DNA-DNA gyrase-quinolones
Implication dans la R aux quinolones :R à
Ac.Nalidixique
mais pas aux FQ (mais ↑
CMI x20)
Augmente le risque de sélection de mutants résistants (QRDR)
Association avec les BLSE et AmpC plasmidiques :QnrA
associé
à
BLSE (SHV-5, SHV-7, CTX-M-15, VEB-1) et AmpC
(FOX-5) au sein d’une structure intégron
de classe 1 de type sul1QnrB
associé
à
SHV-12
(7.7% of CIP-R E. coli isolates (Shangai, China), most of them associated with CTX-M-9 ß-lactamase Wang et al. AAC 2003; 47: 2242; 11.1% of CAZR K. pneumoniae isolates in USA with FOX-5 or SHV-7 Wang et al. AAC 2004; 48: 1295-1299; 0.3% in E. coli in Paris but associated with an ESBL (VEB-1), Mammeri
et al. AAC 2005; 49:71-76)
Réservoir :Réservoir des déterminants Qnr
dans bactéries de l’environnement,
notamment le milieu marinEx. Progéniteur
de QnrA
: S. algae
(Vibrio
vulnificus,
V. parahaemolyticus,….)
Protéines Qnr (2)
Réservoirs des gènes qnr•
Bactéries
d’environnement
aquatiques
identifiés
par
homologie
de séquences
génomiques
–
Photobacterium
profundum•
66% homologie
avec QnrA
•
Clonage
de qnrA
dans
E. coli: CMI à
la cipro
augmentée
x 80
–
Vibrio
vulnificus•
60% homologie
avec QnrA
•
Clonage
de qnrA
confère
une
augmentation de CMI cipro
x 64
–
Vibrio
parahaemolyticus•
58% homologie
avec QnrA
•
Clonage
de qnrA
confère
une
augmentation de CMI cipro
x 16
–
Shewanella
algae•
Homologue de QnrA
•
Clonage
de qnrA
augmente
la CMI cipro
x 16Poirel
L et al. J Antimicrob
Chemother. 2005; 56:1118Saga T et al. Antimicrob
Agents Chemother. 2005; 49:2144
Effect of qnrA on Quinolones
Wang M et al. Antimicrob
Agents Chemother. 2004; 48:1400-1
Increase
of MIC by 16x to 125x fold
values for most
agents in qnrA
+ transconjugants
QnrA facilite la sélection de haut niveau de résistance aux quinolones
Martínez-Martínez
L et al. Lancet 1998; 351:797-9
Les systèmes de capture de gènes: les intégrons
intI1
attI
sul1qacE∆
resistance
gene
cassette (R gene)
integrase
Int
3'-
conserved
segment
attC
antP
antP
attIintI1 sul1qacE∆R gene attC
Profils de résistances d’enterobactéries porteuses d’Integrons
Antimicrobial
Percent Resistant Integron
(-)
Integron
(+)
(n = 120) (n = 54)
Piperacillin
24
94*Ceftazidime
26
33
Cefotaxime
29
44*Meropenem
0
0
Gentamicin
2
94*Ciprofloxacin
3
33*
Nijssen
S et al. Clin
Infect Dis. 2005; 41:1-9.
Espèces
1993
1996
1999
E. coli 2.6 6.2 10.1
K. pneumoniae 4.8 9.1 17.4
E. cloacae 9.5 19.0 36.4
Pourcentage de souches positivesPourcentage de souches positives
In37 in transconjugant 12-4
intI1 dfr16 aadA2 qacEΔ1
sul1 orf513 qnr ampR qacEΔ1 sul1 orf6 IS6100 EcoRII
catB3 aar-3qacEΔ1
sul1 orf513 qnr ampR qacEΔ1 sul1 orf5 orf6 IS6100 EcoRII
EcoRII cytosine methylase
aac(6’)-Ib
Gene cassettes5’-CS 3’-CS1 Common region 3’-CS2
In36 in transconjugant 4-59
intI1 aadA2 qacEΔ1
sul1 orf513 blaCTX-M-9 orf3-like qacEΔ1
sul1
In60
EcoRII cytosine methylase
IS3000
intI1 aadA2 qacEΔ1 sul1 orf513 ampC ampR qacE
Δ1 sul1 orf5
pSAL-1
intI1 aadB sul1 orf513 orf5
In7
qacEΔ1
intI1 aacA4 aadA2 sul1 orf513 catA2 qacEΔ1 sul1 orf5
In6
qacEΔ1
Unique region
In35 (InS21)
intI1 blaOXA-2 orfDqacEΔ1 sul1
orf513blaCTX-M-2 orf3
qacEΔ1
orf5
qacEΔ1 sul1dfrA10
sul1
dfr16
aac(6’)-Ib
intI1 blaOXA-30
Wang M et al. Antimicrob
Agents Chemother. 2003; 47:2242-8
Associations of qnr genes with complexSul1-type integrons
Plasmid-Encoded Quinolone Resistance: Qnr Genes
Robicsek
A et al. Lancet Infect Dis
2006; 6:629-40
Resistance patterns of E. coli J53 and E. coli J53/pQR1 transconjugant
E. coli J53 Transconjugant E. coli J53/pQR1
Worldwide distribution of Qnr Quinolone Resistance Genes
Robicsek A et al. Lancet Infect Dis 2006; 6:629-40
•
Europe–
E. coli: 1 of 297 NalR
with qnrA
(France)
–
Enterobacteriaceae: 1 qnrA
associated with VEB-1 β-lactamase
(France)
–
Enterobacter
–
1 of 703 with qnrA
(Germany)–
Citrobacter
freundii:
qnrA
outbreak in 4 patients
(German ICUs)–
E. cloacae, K. pneumoniae, E. coli, C. freundii: 15 qnrA
(32%) of 47 (ciproR
cefotaxR) (UK)
Prevalence of Plasmid-Mediated Quinolone Resistance
Mammeri
H et al. Antimicrob
Agents Chemother
2005; 49:71Jonas D et al. Antimicrob
Agents Chemother
2005; 49:773Poirel
L et al. Antimicrob
Agents Chemother
2005; 49:3091Corkill
JE et al. J Antimicrob
Chemother
2005; 56:1115
•
Europe–
Enterobacteriaceae
(France 2002-2005):
28 /1468 (1.9%) isolates3.3% of all ESBL + isolates; 0% in non-ESBL isolates22 qnrA
E. cloacae
(78%) associated with SHV-12
clonal
spread in two hospitalsexistence of different integrons
structures
Prevalence of Plasmid-Mediated Quinolone Resistance
Cambau
et aL. Clin
Microbiol
Infect. 2006; 12: 1013-20Honoré
et al. Pathol
Biol. 2006; 54: 270-9
Acétylase AAC(6’)-Ib-crRésistance enzymatique aux quinolones
Aminoglycoside
acétyltransférase
qui confère la R à
(Kana), Tob
et AmikVariant de l’AAC(6’)-Ib
avec 2 mutations :
. Trp102Arg
. Asp179Tyr
Mutations resp. de la R à
certaines FQ par acétylation au niveau cycle pipérazinyle
non substitué
(comme CIP et NOR ++)
Effet de l’AAC(6’)-Ib
sur les CMI des FQ :
Résistance de bas niveau (x 4), mais favorise la sélection de haut niveau de résistance si exposition aux quinolones
aac(6’)-Ib-cr sur
plasmide
avec ou
sans gènes
qnr
(effets
additifs)
Souche CMI (µg/mL)CIP NAc-CIP ENR NOR PEF LEV GEM
DH10B 0.02 0.08 0.02 0.156 0.08 0.08 0.005DH10B + aac(6’)Ib-cr 0.04-
0.08
0.08 0.02 0.625 0.08 0.08 0.005
Infections nosocomiales avec des souches ‘pan-résistantes’
•
Nombreuses
descriptions “worldwide”
d’
Entérobactéries, P. aeruginosa
et Acinetobacter
spp. resistants
à
tous
les
antibiotiques, excepté
la colistine/polymyxin
B.
•
Nombreuses
épidémies
avec des organismes
génotypiquement reliés, soulignant
la nécessité
de mesures
de lutte
contre
les
infections nosocomiales
renforcées
A. baumannii et la médiatisation
Activity of broad-spectrum antibiotics against Acinetobacter
spp.
Acinetobacter - MYSTIC Belgium - 1998/2005
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
MEM IMP CAZ CPE TAZO CIP AN
% s
usce
ptib
le s
trai
ns
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
With
courtesy
from
G. Ieven
(03/2006)
Imipenem-resistant Acinetobacter Jan ’96- Dec ‘03, USA
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003
Per c
ent
R ITSN®-Database, USA
Carbapenemases de type-OXA (oxacillinases)
• Enzymes Classe D, >120 enzymes
• 4 clusters génomiques chez Acinetobacter(OXA-23/27, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58)
• Support génétique mobile (transposons, plasmides)
• Prévalence élevée dans certains pays (Grèce, Espagne, Portugal, Turquie, France, UK,…)
• Multi-résistance (penicillines, +/- inhibiteurs BL, C3, C4,aminoglycosides, SXT,…)
• Niveau de résistance variable à imip & merop (4->256 µg/ml)
Class DOxacillinase-Mediated Resistance to carbapenem
Three main clusters (amino acid identity)
OXA-40OXA-24OXA-25OXA-26
OXA-23OXA-27
OXA-58 (less than 48% with the two other clusters)
99%
99%60%
Acinetobacter sp.
Enterobacteriaceae
OXA-48
Class D (OXA) carbapenemases
in Acinetobacter
baumannii
Oxa-23 Oxa-58
•
Prévalence en Belgique (1-5% ??)
•
Alerte nationale 2003-2004 (Epidémie d’
A. baumannii VEB-1 en France)
•
Epidemies
d’infections à
A. baumannii
dans qq
hôpitaux-
BLSE type VEB-1 & PER-1
(Naas et al., JAC 2006)
-
Carbapénémases
OXA-23, OXA-58 (Bogaerts
et al., JCM 2006)
(Bogaerts
et al., ICAAC 2006)
•
Cas sporadiques d’infections à
A. baumannii
MR (Importation: Espagne, Portugal, Grèce, Turquie, Af. Sud)
Acinetobacter
spp.
producteurs
de carbapenemase
OXA et de BLSE en Belgique
Pseudomonas aeruginosa - MYSTIC Belgium - 1998/2004
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
MER IMI CAZ CPM PTZ CIP AMU
% s
usce
ptib
le s
trai
ns
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
Activity vs
Pseudomonas aeruginosa
n=263 n=211 n=233 n=264 n=214 n=204 n=242
P. aeruginosa
isolate
producing
VIM-2 carbapenemase
ß-lactamases
plasmidiques
de classe B Enzyme Espèce
Pays (isolement)IMP-1 S. marcescens, K. pneumoniae, K. oxytoca
E. coli, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii, M. morganii, P. rettgerii JaponA. xylosoxydans, A faecalisP. aeruginosa Japon, SingaporeP. stutzeri, P. putida, P. fluorescens Japon, Singapore B. cepacia JaponA. baumannii Japon, Corée, ItalieA. junii Angleterre
IMP-2 P. aeruginosa JaponA. baumannii Italie, JaponA. lwoffi
JaponIMP-3
S. flexneri JaponIMP-4
A. baumannii Hong-KongC. youngae ChineK. pneumoniae, E. coli
AustralieIMP-5
A. baumannii PortugalIMP-6
S. marcescens JaponIMP-7
P. aeruginosa Canada, MalaisieIMP-8
K. pneumoniae, E. cloacae TaiwanIMP-9
P. aeruginosa ChineIMP-10
P. aeruginosa, A. xylosoxydans JaponIMP-11
P. aeruginosa, A. baumannii JaponIMP-12
P. putida ItalieIMP-13
P. aeruginosa, Italie, Belgique…IMP-21
Enzyme Espèce
Pays (isolement)VIM-1
P.aeruginosa Italie, GrèceA. baumannii ItalieA. xylosoxydans ItalieP. putida ItalieE. coli Grèce
VIM-2
P. aeruginosa France,
Belgique, Grèce , Italie,
Japon, Corée, Portugal, Espagne,Croatie
A. baumannii Italie, CoréeE. cloacae CoréeS. marcescens CoréeP. putida Corée, Taiwan, JaponP. stutzeri TaiwanA. xylosoxydans Corée C. freundii Taiwan
VIM-3
P. aeruginosa TaiwanC. freundii Taiwan
VIM-4 P. aeruginosa Grèce , Suède, Hongrie, Pologne, Belgique
VIM-5
P. aeruginosa TurkieK. pneumoniae Turkie
VIM-6
P. putida SingaporeVIM-7
P. aeruginosa USA…VIM-12
SPMSPM--11
P. P. aeruginosaaeruginosa BrBréésil (1997)sil (1997)
GIMGIM--11
P. P. aeruginosaaeruginosa Allemagne (2003)Allemagne (2003)SIMSIM--11
A. baumannii CorCoréée (2005)e (2005)
Carbapenèmases
•
Metallo beta-lactamases (Classe B)
–
P. aeruginosa, S. marcescens, Acinetobacter….
–
Plasmides/intégrons
–
Spectre large (hydrolysent tous les beta-lactames sauf aztreonam)
–
Japon/Corée, US, Italie, Grèce, France
–
Fréquence ↑ depuis 1995–
Pas de relation claire avec exposition préalable aux carbapenèmes
–
réservoir des gènes de résistance (bactéries de l’environnement ?)
Pseudomonas aeruginosaSPM-1 (MBL)
Class B beta-lactamasesMetalloenzymes (MBL) - Carbapenemases
+ EDTA+ EDTA
EDTA (240 µg)
EDTA (120 µg)
Imipenem (10 µg) + EDTA (240 µg)
Imipenem (10 µg) + EDTA (120 µg)
Genetically mobile (acquired) metallo-β-lactamase genes
• IMP-1 (now to IMP-23) • VIM-1 (now to VIM-12) • VIM-7 (North America)• SPM-1 (South America)• GIM-1 (Germany)• SIM-1 (Korea)Broad spectrum β-lactam resistance
Highly mobile (integron-associated)
Increasing prevalence worldwide
Few treatment possibilities (colistin !), no clinically available inhibitor
SE AsiaS. AmericaEurope (Italy, Greece, France,…)
IntI1 aacA7 blaVIM-2 aacC1 aacA4 qacEΔ1/sulIn58
Mobile metallo-β-lactamases
Found as gene cassettes on integrons(co-resistance to other drugs)
5’CS 3’CS
Resistance gene collection device
attI1 site 59 base element
Structure
variable region
Mobile—gene cassettes—transposons—plasmids etc
Nordmann
P, Poirel
L. Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes. Clin Microbiol
Infect. 2002 .Walsh TR, Toleman
MA, Poirel
L, Nordmann
P. Metallo ß-lactamases; the quiet before the storm. Clin Microbol
Rev
2005
Associated
resistance….
Metallo-β-Lactamases: epidemiology
Senda et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1996; 40:349Kurokawa et al., Lancet 1999; 354:955Yamasaki et al., J. Antimicrob. Chemother. 2003; 51:631
Country IsolatesYear(s) PrevalenceSpecies
Japan 92-94 P. aeruginosa 3700 (17 hosp.) 0.4% (IMP)
Japan 96-97 P. aeruginosaS. marcescens
25333222
1.3% (IMP)4.4% (IMP)
Japan 98 & 00 P. aeruginosaEnterobacteriaceae
200800 0.7% (IMP)
Greec
e98-00 Pseudomonas spp. 233 (1 hosp.) 0.9% (VIM)
Italy 01 P. aeruginosa 506 (1 hosp.) 0.8% (VIM)
Nationwide
Regional
Tsakris et al., Clin. Microbiol. Infect. 2003; 9:846Luzzaro et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2004; 48:13Jones et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2004; 49: 289Kimura et al., J. Clin, Microbiol. 2005; 43: 458
Japan 98-02 Gram-negatives 801 (3 hosp.) 1.1% (IMP)
Japan 02 P. aeruginosa 594 1.9% (IMP/VIM)Nationwide
•
No exact data on frequency/prevalence
for Belgium, but present
at
least in P. aeruginosa
(P. putida)
–
>80 VIM+ P. aeruginosa
isolates
in 8 hospitals
since associated
with
limited
or major outbreaks
–
Spread
of two
major clones across
different
hospitals
–
Multi-drug
resistant
(variable resistance
profiles)
–
VIM-2, gene
cassettes on class 1 integrons
Where are we now with metallo-β-lactamases in Belgium ?
Deplano
et al. Eurosurveillance
2007
Conclusion
•
Souches pan-résistantes–
détection
du/des mécanisme(s) difficlie
–
responsables d’épidémies
–
Rôle des systèmes de capture de gène (intégrons) dans la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques
•
Surveillance des taux de résistance aux antibiotiques ne suffit plus–
Les taux de résistance (incidence, prévalence) peuvent cacher un mécanisme émergent de résistance
–
Importance de la mise en évidence précoce des mécanismes émergents de résistance aux antibiotiques
–
==> OUTILS MOLECULAIRES–
==> OBSERVATOIRES DE SURVEILLANCE NATIONALE
(centres de réf.)
Treatment regimens for multi-resistant Gram-negative organisms
- No new drugs expected for the coming years- Resistance will get worse not better