NÜKLEIK ASIT HIBRIDIZASYONUNA

DAYALı YÖNTEMLER

HIBRIDIZASYON

Nükleik asit hibridizayon (melezleme) yöntemleri;

tek iplikli nükleik asit moleküllerinin tamamlayıcı

dizileri ile uygun koşullar altında kendiliğinden

eşleşerek çift iplikli hibrid moleküller (melezler)

oluşturma özelliğine dayanır.

Hibridizasyon reaksiyonları tamamlayıcı nükleotid dizileri içeren

tüm tek zincirli nükleik asit molekülleri arasında gerçekleşebilir.

DNA/DNA

RNA/RNA

RNA/DNA

Bu özgün reaksiyonlar, hem RNA hem de DNA molekülleri

üzerindeki belirli nükleotid dizilerini belirlemek amacıyla kullanılır.

Yöntemin uygulanması için, araştırılan nükleik asit dizilerine eşlenik

olan tek iplikli nükleik asit (DNA veya RNA) dizilerine ihtiyaç vardır.

Ayrıca bu dizilerin radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir belirleyici

ile işaretlenmesi gerekir.

Ancak bu sayede hibridizasyon reaksiyonu sonucu oluşan çift iplikli

molekül görülebilir hale gelir.

Tanımlanmak istenen nükleik asit bölgesine eşlenik olan ve

belirleyici olarak kullanılan tek iplikli özgün nükleik asit parçalarına

prob adı verilir.

YÖNTEM

Belirli doku veya hücrelerden izole edildikten sonra

jel elektroforezi ile ayrılan ve nitroselüloz veya

naylon membranlara transfer edilen DNA

moleküllerinin (Southern blotting) veya özgün RNA

dizilerinin (Northern blotting) saptanması ve analizi

için uygulandığı gibi, gerek RNA gerekse DNA

dizilerinin belirli hücre veya dokulardaki varlığı ve

dağılımını belirlemede (in situ hibridizasyon) de

kullanılmaktadır.

NÜKLEIK ASIT HIBRIDIZASYONU

REAKSIYONUNUN TEMELLERI

Çift iplikli bir nükleik asitin dayanıklılığı onun erime

(melting temperature = Tm) sıcaklığını hesaplayarak

belirlenir. Bu değer her bir organizma için farklıdır.

Hibrid molekül ne kadar dayanıklı ise, Tm derecesi o kadar

yüksektir, yani ipliklerin ayrılması için gereken enerji o

oranda fazladır.

HIBRID NÜKLEIK ASITLERIN DAYANıKLıLıĞı BIR TAKıM

FAKTÖRLERE BAĞLıDıR

1.Guanin-sitozin oranı (%GC): GC çiftleri, 3 H bağı içerdiğinden, AT çiftlerine

göre daha sağlamdır. Bu nedenle yüksek GC içeriğine sahip olan DNA, AT

bakımından zengin olan DNA’ya nazaran daha dayanıklıdır ve iki ipliği ayırmak

için daha çok enerji gereklidir.

2.Hibrid molekülün boyu: Genellikle uzun bir nükleik asit molekülü, kısa

olana göre daha sağlamdır. Çünkü içerdiği hidrojen bağı sayısı daha fazladır.

Böylece iki ipliği ayırmak için daha çok enerji gerekir.

3.Nükleik asitlerin içinde bulunduğu ortam: Hibridizasyon karışımı ve

hibridizasyon sonrası yıkama solüsyonlarında, tek değerlikli katyonları içeren

iyonik bir tuz tamponu içinde formamid bulunur. Formamid hidrojen bağlarını

bozarak çift iplikli nükleik asitlerin çözülmesini kolaylaştırır. Bunun tersine Na+

gibi tek değerlikli katyonların konsantrasyonunu artırmak hibridleri

sağlamlaştırır. Organik çözücülerin çift iplikli polinükleotitlerin ısıya

dayanıklılığını azaltarak daha düşük sıcaklıklarda hibridizasyona olanak vermesi

bu problemi çözümlemiştir. Formamid bu amaçla kullanılan organik bir

çözücüdür; DNA/DNA ve DNA/RNA çift ipliklerinin ayrılma sıcaklığını azaltır.

Böylece hibridizasyon, %50 formamid varlığında 30-45°C’da gerçekleştirilebilir.

Belirli formamid ve Na+ konsantrasyonlarındaki bu solüsyonların sıcaklığı

hibridizasyonun kesinliğini belirler.

4.Nükleik asit hibridinin çeĢidi: RNA/RNA hibridleri DNA/DNA

hibridlerine göre ısıya daha dayanıklıdır. DNA/RNA hibridleri ise orta

dayanıklılıktadır.

5. YanlıĢ eĢleĢen hibridlerin varlığı: Yanlış eşleşen nükleotitler

(A-T yerine T-T vb.) hibridin dayanıklılığını azaltır. Çünkü bunlar

arasında hidrojen bağları oluşamaz. Yanlış eşleşmenin dayanıklılığı

azaltan etkisi, kısmen prob uzunluğuna bağlıdır. Çift iplikli hibrid ne

kadar uzun ise yanlış eşleşmiş bir çiftin, hibrid dayanıklılığına etkisi

o kadar azdır.

IN SITU HIBRIDIZASYON

In situ hibridizasyon (ISH), nükleik asit dizilerinin (DNA ve RNA)morfolojik olarak korunmuş kromozomlar, hücreler veya doku kesitlerindesaptanarak gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli nükleikasit oluşumu kinetiğini kullanan güçlü bir tekniktir.

In situ hibridizasyonun diğer hibridizasyon yöntemlerinden (Southernveya Northern Blotting) farkı nükleik asitlerin kendi hücreselortamlarında tanınarak gösterilmesidir. Böylece hedef nükleik asitdizisinin hücredeki yeri belirlenmiş olur.

Nükleik asitlerin bulundukları yerde saptanması:

Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında,

Kromozom yapı ve hatalarının analizinde,

Kromozomların ve genomun yapı, işlev ve evrimininaraştırılmasında,

Gen anlatımının belirlenmesinde,

Eşey tayininde,

Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında,

Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerininbelirlenmesinde önemlidir.

In situ hibridizasyonun anlaşılması moleküler biyoloji, genetik,

immünokimya ve histokimya bilgilerini gerektirmektedir. Yöntemin

başlıca aşamaları yandaki gibidir.

Biyolojik materyalin

hazırlanmasıProbun işaretlenmesi

Prob ve materyalin

denatürasyonu

Hibridizasyon

Yıkama

Saptama

Görünür hale getirme

ISH yöntemi ilk kez 1969’da birbirinden bağımsız olarak çalışan iki gruparaştırıcı tarafından (John ve ark., Pardue ve Gall) uygulandı.

İlk uygulamalarda nükleik asitleri işaretlemede radyoizotoplarkullanılmaktaydı; buna göre hibritleşmiş dizileri göstermek içinbaşvurulan tek yöntem otoradyografiydi.

Ayrıca, o sıralarda moleküler klonlama mümkün olmadığından ISH sadecebiyolokimyasal metotlar ile saflaştırılabilen ve izole edilebilen dizilere(fare satellit DNA’sı, viral DNA, ribozomal RNA vb.) uygulanabiliyordu.

Nükleik asitlerin moleküler klonlaması ve radyoaktif işaretlemetekniklerindeki gelişmeler bu tabloyu önemli derecede değiştirdi.

Öte yandan, radyoaktif olmayan işaretleyici ile hazırlanmış nükleik asitproblarının ISH’da kullanılması radyoaktif yöntemin getirdiği zorluklarıortadan kaldırdı.

Radyoaktif olmayan ISH ilk kez 1970’lerin sonunda uygulandı (Rudkin veStollar, 1977; Bauman ve ark., 1980). O günden beri radyoaktif olmayan insitu hibridizasyonun (NISH) biyomedikal araştırmalarda ve kliniktanıdaki uygulamaları büyük bir hız kazanmıştır.

Son yıllarda nükleik asitleri işaretlemek için birçok yöntemgeliştirilmiştir. Günümüzde, biotin, digoksigenin, dinitrofenil veyafluorokromlarla enzimatik olarak işaretleme genellikle tercihedilmektedir. Piyasada çeşitli prob işaretleme kitlerininbulunması, bu işlemleri oldukça kolaylaştırmıştır.

Rekombinant DNA preparasyonları ile birlikte saf prob eldeedilmesi sorunu çözülmüştür. Prob seçimine bağlı olarak, belirligenom ve kromozomlar, tekrarlanan DNA dizileri, tek kopyalıdiziler, mRNA ve viral diziler gibi farklı hedeflersaptanabilmektedir.

Çeşitli sitokimyasal saptama yöntemlerinin geliştirilmesi de ISHtekniğinin başarısını arttırmıştır. Birden fazla prob işaretleme vesaptama yönteminin birlikte kullanılması aynı hücre preparatındaiki veya daha çok nükleik asit dizisinin farklı renklerdegösterilmesini sağlamıştır.

Ayrıca radyoaktif olmayan ISH ile immünositokimyasal yönteminbirlikte kullanılması gen topografisi ile gen aktivitesi arasındakiilişkinin DNA, mRNA ve protein düzeyinde ortaya konulmasınaolanak vermiştir.

In situ Hibridizasyon Problarının Seçimi

ISH’da kullanılacak probların seçilmesinde iki temel nokta vardır:

Prob olarak kullanılacak nükleik asitin tipi ve uygun

işaretleme cinsi

Prob tipleri

Prob olarak hazırlanan nükleik asitler; çift iplikli DNA (dsDNA),

tek iplikli DNA (ssDNA), tek iplikli RNA ve oligonükleotitler olarak

sınıflandırılabilirler (Tablo).

Prob tipi Avantajları Dezavantajları

RNA RNA:RNA melezleri oldukça

dengelidir.

Prob denatürasyonu gerekmez.

Hibridizasyon işlemi sırasında

yeniden eşleşme olmaz.

Prob vektör içermez.

Hibridizasyon sonrası RNaz

uygulaması hibritleşmeyen probları

ortadan kaldırır.

Probun RNaz aktivitesinden

korunması gereklidir. Çok çabuk

parçalanır.

Probun vektör içine altklonlanması

gerekir.

dsDNA Altklonlama gerektirmez.

Fazla sayıda ve uygun işaretleme

yöntemleri uygulanabilir.

Prob denatürasyonu gerekir.

Hibridizasyon sırasında

tamamlayıcı iplikler yeniden

eşleşir.

Hibridler RNA problarından daha

az dengelidir.

Oligonükleotitler Klonlama gerektirmez.

Kendi içinde eşleşmeye uğramaz.

Dokuya penetrasyonu çok iyidir.

Protein dizilerinden yararlanarak

hazırlanabilir.

Sınırlı işaretleme yöntemi

uygulanır.

Dizileme sırasında hatalar

oluşabilir.

Hibridizasyon için oldukça kısa

dizilerdir.

Her prob çalışılacak materyale ve araştırıcının

moleküler biyoloji deneyimine bağlı olarak seçilir.

Kromozomlar üzerinde gerçekleştirilen ISH’da ve

viral DNA tayinlerinde genellikle DNA probları,

mRNA tayinlerinde ise tek iplikli RNA probları

veya oligonükleotitler tercih edilmektedir.

Problar parça-izolasyon, klonlama, in vitro

transkripsiyon veya kimyasal sentez yolu ile elde

edilebilirler.

PROB UZUNLUĞU

Maksimum hibridizasyon oranı uzun problar ile elde edilir.

Ancak ISH’da kısa problar gereklidir. Çünkü, probun hücre veyakromozomlar çevresindeki yoğun matriksten geçerek hedefe ulaşmasıgerekmektedir.

Probların 50-150 bazlık olanları birçok doku için en iyi sinyali verir.

Çok kısa problar ise çok zayıf sinyaller verirler, bazen de istenmeyenişaretlere neden olabilirler. Bununla beraber probun optimum boyuçalışmaya göre değişir.

Örneğin, paraformaldehit ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüşembriyo için, ISH çalışmalarında optimum sinyal 1 kb boyutundakiRNA probları ile elde edilir.

Dokunun özelliği, fiksasyon tipi, hibridizasyon öncesi işlemlerininuygulanıp uygulanmamasına göre de prob uzunluğunun seçimi değişir.

Oligonükleotitler tek iplikli oluşları ve çok iyi penetrasyon özelliklerinesahio olmalarından dolayı ISH için oldukça avantajlı problardır. Ancakküçük boyutlu olduklarından, hedef nükleik asidin ancak küçük birbölümü ile eşleşirler.

PROBUN ĠġARETLENMESI

ĠZOTOPIK ĠġARETLEME

ĠZOTOPIK OLMAYAN ĠġARETLEME

Ġzotopik ĠĢaretleme

İşaretleme radyoaktif madde ile yapılır ve işaretin belirlenmesi içinotoradyografi kullanılır.

Reaksiyonun sonucunun hızına, prob stabilitesine ve çalışılankonuya göre farklı tipte izotoplar kullanılır.

H3 işaretli problar; subsellüler uygulamalar için kullanılır, yüksekçözünürlüğe (0,5-1 µm) sahiptir. İşaretli problar birkaç yılsaklanabilir.

S35 ISH’da en yaygın olarak kullanılan radyoaktif işaretlemedir. S35

işaretli problar, özellikle hücresel uygulamalar için uygundur.Otoradyografi işlemi 1 hafta sürebilir. İşaretli prob birkaç ay içindetüketilmelidir. Çözünürlüğü 10-15 µm kadardır.

P32, geniş çaplı alanlar için uygulanır. Çözünürlük 20-30 µm’dir.İşaretli problar bir hafta içinde kullanılmalıdır.

Ġzotopik Olmayan ĠĢaretleme

İşaretleme radyoaktif olmayan maddelerle yapılır ve işaretin

tayini için immünohistokimyasal yöntemler kullanılır.

Son yıllarda izotopik olmayan işaretlemeler daha sıklıkla

kullanılmaktadır.

İzotopik olanlara göre avantajları, işaretli probların 6 ay veya

daha uzun süreli olarak -20°C’da saklanabilmesi,

çözünürlüğün yüksek olması, hızlı sonuç alınması, daha fazla

sayıda işaretleme yöntemi bulunması ve daha güvenilir

olmasıdır.

Dezavantajları ise; duyarlılığın izotopik işaretlemelerden daha

az olması ve istenmeyen bağlantılara daha fazla yol

açabilmesidir.

Prob işaretlemeleri kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar ile yapılır.

En yaygın kullanılan işaret maddeleri biotin, digoksigenin gibi

haptenler ve FITC (fluoresein) gibi fluoresan maddelerdir. Ayrıca,

ender olarak peroksidaz, alkalin fosfataz gibi enzim işaretlemelerine

de rastlanır.

Hapten işaretli problar mRNA ISH için güvenilirlik, yüksek stabilite,

hızlı sonuç verme ve tek hücre çözünürlüğü gibi önemli avantajlara

sahiptirler.

En duyarlı yöntem, özgün bir antikora uygun olan bir haptenin, bir

nükleotit türevine bağlanması ile gerçekleştirilir (örneğin,

digoksigenin ddUTP veya dUTP’ye bağlanır). Hibridizasyon ve

yıkamaları takiben doku bir enzime bağlı olan ve hapteni bağlayan bir

protein ile inkübe edilir. Daha sonra sinyal bu enzim için uygun

substratın kullanılması sonucunda, ürünün renklendirilmesi şeklinde

elde edilir. Bu işlem fluoresein işaret maddesinin kullanımı için de

benzer şekildedir. İşaret fluoresan mikroskobunda gözlenir.

IN SITU HIBRIDIZASYONDA KONTROL

ISH deney sonuçlarının doğru olarak yorumlanabilmesi ve güvenilirliğiaçısından çok dikkatli davranılmalı ve işlem sonuçlarından emin olmak içinçeşitli kontroller yapılmalıdır.

Hibridizasyon reaksiyonlarında, problar ile hedef olmayan nükleik asitdizileri arasında, olası homolojilerden dolayı istenmeyen sonuçlar ortayaçıkabilir.

Ayrıca probun G-C bakımından zengin bölgeleri ile hedef olmayan nükleikasitler arasındaki hibridizasyon da yanlış pozitif sonuç verebilir.

Böyle hatalı hibridizasyon reaksiyonlarının önlenmesi için prob dizisininçok dikkatli seçilmesi ve kontrol probların kullanılması gereklidir.

Hibridizasyon öncesi uygulamalarda yer alan RNaz veya DNaz ile sindirmeDNA veya RNA gibi hedef nükleik asitlerin varlığının saptanmasındaönemli bir kontroldür.

Enzim uygulamaları çok dikkatli yapılmalıdır. Nükleaz uygulamasındansonra, hedef nükleik asitin ortadan kaldırılmasını takiben, eğer enzimdokudan tam olarak giderilmemiş ise daha sonraki aşamada probu dasindireceğinden hibridizasyon sinyali çok zayıf olur veya gözlenemez.

İstenmeyen hibridizasyon sinyallerinin bir kısmı da probların spesifikolmayan hücresel bölgelere bağlanması ile ortaya çıkabilir. Bu duruma,proteinler ile prob arasındaki elektriksel çekimlere yol açabilir. Birdiğer prob-protein ilişkisine DNA’ya bağlanan proteinler neden olabilir.Bu gibi özgün olmayan ilişkiler, hücresel nükleik asitlerlehibritlenmeyen negatif kontrol problar kullanılarak ortadankaldırılabilir.

Bunlara ek olarak, histokimyasal veya immünohistokimyasaltekniklerdeki bir hata sürpriz pozitif sonuçlar doğurabilir. Bu da probiçermeyen hibridizasyon tamponu ile inkübe edilen kesitlere işarettayin sistemlerinin uygulanması ile kontrol edilebilir. Ayrıcaimmünolojik tayin sistemlerinde kullanılan enzimlerini dokudaendojen olarak varlıkları dikkate alınmalı; gerekirse bir başka enzimseçilmeli ya da prehibridizasyon aşamasında endojen enzimmaskelenmelidir.

Kontrol probları olarak hedef gene karşı anlamlı (sense) veya anlatımyapmayan bir gene ait karşı anlamlı (antisense) oligonükleotitler,ayrıca rastgele dizili oligonükleotitler ve oligo d(T) veya d(A)kullanılabilir. Oligo d(T) probları, dokudaki mRNA’nın korunmuşluğuve hücresel aktivitesi hakkında önemli bilgi veren poliadenil-RNA’larıtayin etmek için kullanılır. Bu aynı zamanda ISH protokolününoptimizasyonunda kullanılan bir adımdır.

SOUTHERN BLOTTING

İstenilen bir genin veya DNA dizisinin, binlerce baz çiftlik bir DNAmolekülündeki varlığının belirlenmesi, moleküler biyoloji verekombinant DNA teknolojisi çalışmaları için önemli ve vazgeçilmezişlemlerden biridir.

Özellikle gen yapısı, gen ifadesi, genom organizasyonu, haritalamave gen aktarımı çalışmalarında (transformantların istenilen genitaşıyıp taşımadığının, kopya sayısının analizi vb) aranılan DNAdizisinin saptanması Southern blotting tekniği ile mümkünolabilmektedir.

Bu teknik ilk kez adını aldığı Southern tarafından 1975 yılındatanımlanmıştır.

Tekniğin temeli, istenilen DNA parçasının ona tamamlayıcı olanradyoaktif veya radyoaktif olmayan bir takım belirleyicilerleişaretlenmiş olan problar kullanılarak hibridizasyonuna vehibridizasyonun ardından belirleyicinin özelliğine göre radyoaktif,immünolojik, kimyasal ya da fluoresan yöntemlerle görünür halegetirilmesine dayanır.

Probların (tanımlamak istenilen nükleik asidin tamamlayıcısı olan özgün

DNA ya da RNA parçaları) işaretlenmesinde son yıllara kadar belirleyici

olarak P32, S35 ve H3 radyoizotopları yaygın bir şekilde kullanılmış ve

radyoaktivitenin belirlenmesi için otoradyografiden yararlanılmıştır.

Otoradyografinin hızlı sonuç vermesi, güvenilirliği gibi üstün

özelliklerinin yanısıra radyoaktif maddelerle çalışmanın getirdiği

zorluklar ve tehlikeler sistemin en önemli dezavantajını oluşturmaktadır.

Bu durum araştırıcıları daha tehlikesiz yöntemler geliştirmeye

yöneltmiştir. Bu yöntemlerin tümünün ortak özelliği işaretlemenin

radyoaktif olmayan belirleyicilerle yapılmasıdır. Radyoaktif olmayan

işaretleme ve belirleme sistemleri;

Digoksigenin-anti-digoksigenin sistemi,

Yabanturpu (Armoracia lapathifolia, horseradish) peroksidaz

sistemi,

Biotin-streptavidin sistemidir.

Bu üç sistemle de hibritlenen probun belirlenmesi kromogenik

(kolorimetrik) yani renkli bir ürün oluşturan veya ışık oluşumuna neden

olan (kemoluminogenik) substratlar kullanılarak gerçekleştirilir.

PROBUN HAZıRLANMASı VE IġARETLENMESI

Prob hazırlamak, istenilen DNA fragmentinin kalıp olarak

kullanılması ve ona tamamlayıcı DNA zincirinin in vitro sentez

edilmesi demektir.

Probların işaretlenmesi, probun cinsine göre farklı şekillerde yapılır.

DNA probları; ‘random primed’ işaretleme1, ‘nick translation’2 veya

Taq DNA polimeraz3 ile işaretlenir.

1 ‘Random primed’ iĢaretleme: In vitro DNA sentezi sırasında yeni sentez edilen probun

yapısına rastgele biçimde DIG-11-dUTP’ler girer.

2 ‘Nick translation’: DNaz I enzimi ile çift iplikli DNA’nın tek ipliğinde kesikler oluşturma

esasına dayanır. E.coli DNA polimeraz I enziminin 5’-3’ eksonükleaz aktivitesi ile tek iplik

üzerinde kesik noktalar genişletilir ve boşluklar aynı anda enzimin 5’-3’ polimeraz aktivitesi

ile ve DIG işaretli dNTP’lerle doldurulur.

3 Taq DNA polimeraz ile iĢaretleme: PCR ile prob DNA’sı çoğaltılırken Taq DNA

polimeraz enziminin diğer dNTP’lerin yanısıra DIG işaretli dNTP’leri de kullanmasıyla

işaretleme gerçekleştirilir.

RNA probları; T3, T7 ve SP6 RNA polimerazları ile in

vitro transkripsiyon reaksiyonu ile sentezlenirken

ortama katılan DIG-11-dUTP ile işaretlenir.

Oligonükleotit problar; terminal transferaz enzimi ile

ya 3’ uca bir DIG-11-dUTP veya DIG-11-dUTP’den

oluşan bir kuyruk eklenmesi ile ya da digoksigenin-

NHS-esterin 5’ uca eklenmesi ile işaretlenir.

Problar hazırlandıktan sonra hibridizasyon için istenilen

DNA parçası açısından taranacak DNA, eğer plazmid

DNA’sı ya da genomik DNA gibi kompleks özellikte ise

önce bir restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilerek

daha küçük parçalara bölünmelidir.

DNA parçaları, agaroz jel elektroforezi ile birbirinden

ayrıldıktan sonra nitoselüloz membrana aktarılır.

Daha sonra da hazırlanan DIG işaretli probla

hibridizasyona bırakılır.

Probla nitroselüloz membran üzerindeki DNA

parçalarından tamamlayıcısı olan arasında H bağları

oluşumu ile çift zincirli DNA parçası meydana gelir.

Bundan sonraki aşamada prob ile hibritlenmiş DNAparçasının belirlenmesi gerekir.

Bir hapten olduğu daha önce belirtilen digoksigenine karşıözgül digoksigenşn antikoru, alkalin fosfataz enzimi ile bağlıolarak bulunur.

Hibridizasyon işleminin ardından ortama eklenen anti-digoksigenin (digoksigenin antikoru), probların yapısındabulunan dUTP’lere bağlı digoksigenin ile bir antijen-antikorkompleksi oluşturur.

Bu kompleksin oluşumunu takiben ortama katılan ve alkalinfosfataz enziminin substratları olan ‘nitroblue tetrazolium’tuzu (NBT) ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (X-fosfat)varlığında enzim aktivite gösterir.

Sonuçta mavi renkli bir ürün oluşumu sayesinde istenilenDNA parçası belirlenmiş olur.

ELECTROBLOTTING ILE SOUTHERN AKTARıMı

DNA parçalarının, özellikle de restriksiyon enzim kesimi

uygulaması ile oluşan, boyutları birbirine çok yakın ve çok

sayıda olanların, agaroz jeldeki bantları kısa sürede

difüzyonla kaybolabileceğinden ve/veya agaroz jel kolayca

kırılıp parçalanabileceğinden hibridizasyon amacıyla jeli

kullanmak uygun değildir.

Bu nedenle agaroz jeldeki DNA parçaları electroblotting ile

bir membrana (örneğin nitroselüloz membrana) aktarılır.

Böylece DNA parçaları membran üzerinde tutuklanmış

(immobilize edilmiş) olur.

NORTHERN BLOTTING

İlgilenilen genin transkripsiyon ürünü olan RNA’nın analizininyapılmasında kullanılan başlıca yöntemlerden biri DNA-RNAhibridizasyonudur.

Northern hibridizasyonu olarak adlandırılan bu yöntemde önce totalRNA agaroz jelde yürütülerek RNA moleküllerinin ayrılmasısağlanır.

Daha sonra jelde ayrılmış RNA molekülleri membrana aktarılır veRNA’nın membran üzerine sabit şekilde bağlanması sağlandıktansonra uygun problarla hibridizasyon işlemi gerçekleştirilir.

Membranlar genellikle naylon veya nitroselüloz yapıdadır.

Nötr, negatif veya pozitif yüklü olabilirler.

Northern hibridizasyon için genellikle tercih edilen naylonmembrandır fakat organik çözücüler etkisinde bırakıldığındaküçülebilir veya katlanabilir.

Nitroselüloz membranlar ise fiksasyon işlemindeki fırınlamasırasında yanabilir ve/veya yıkama sırasında kolayca yırtılabilir.