Numeričke metode temeljene na interpolacijskim … HOMO-LUMO interakcija diena i dienofila u a) Diels-Alderovoj reakciji i b) u Diels-Alderovoj reakciji s obrnutim elektronskim zahtjevom

PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET

Kemijski odsjek

Nora Tir

BIOORTOGONALNE KLIK-REAKCIJE

Kemijski seminar I

Rad je izrađen u Zavodu za organsku kemiju

Mentor rada: prof. dr. sc. Srđanka Tomić-Pisarović

Zagreb, 2017.

Sadržaj

§ SAŽETAK .............................................................................................................................. 1

§ 1. UVOD ............................................................................................................................... 2

1.1. Klik-kemija ................................................................................................................................... 2

1.2. Ciljevi klik-kemije ........................................................................................................................ 2

§ 2. KLIK-REAKCIJE .......................................................................................................... 4

2.1. Cikloadicije ................................................................................................................................... 4

2.2. Klik-reakcije tiola ........................................................................................................................ 8

2.3. Promijenjena Staudingerova ligacija ....................................................................................... 10

§ 3. PRIMJENE U BIOORTOGONALNOJ KEMIJI ..................................................... 11

3.1. Najčešće primjene ...................................................................................................................... 11

3.2. CuAAC in vitro i in vivo ............................................................................................................ 14

3.3. IED-DA i SPAAC in vivo ........................................................................................................... 18

3.4. Sinteza biokompatibilnih hidrogelova ...................................................................................... 20

§ 4. ZAKLJUČAK ............................................................................................................... 22

§ 5. LITERATURNI IZVORI ............................................................................................. 23

§ Sažetak 1

§ Sažetak

Klik-kemija je koncept uveden 2001. godine1 i obuhvaća skup reakcija koje moraju

zadovoljavati određena svojstva. Neka reakcija smatra se klik-reakcijom ako je modularna,

stereospecifična, visokog iskorištenja, odvija se u jednostavnim uvjetima i koristi lako dostupne

reagense te neškodljiva ili lako uklonjiva otapala, a nastali produkti lako se izoliraju bez potrebe

za kromatografskim pročišćavanjem. Mnogo reakcija zadovoljava te uvjete, ali samo neke od

njih našle su široku primjenjivost zbog svoje kemospecifičnosti koja omogućuje njihovo

provođenje u prisutnosti uobičajenih funkcionalnih skupina. Takve reakcije su bioortogonalne

i od iznimnog interesa jer se mogu provoditi u živim sustavima bez narušavanja njihovog

integriteta. U posljednjih nekoliko godina pronađeni su načini provođenja klik-reakcija u

stanicama i u živim organizmima, čak i uz uporabu bakrovog katalizatora. Produkti koji nastaju

tim reakcijama često se mogu pratiti UV/VIS spektroskopijom ili fluorescencijskom

mikroskopijom što otvara velike mogućnosti za proučavanje biološki važnih procesa, ali i

razvoj terapeutika te njihovu ciljanu dostavu.

§ 1. Uvod 2

§ 1. UVOD

1.1. Klik-kemija

Klik-kemija pojam je kojeg su 2001. godine definirali H. C. Kolb, M. G. Finn i K. Barry

Sharpless, a odnosi se na modularne reakcije koje su stereospecifične, visokih iskorištenja,

odvijaju se u jednostavnim uvjetima, široke su primjenjivosti i daju samo neškodljive sporedne

produkte koji se mogu ukloniti nekromatografskim metodama. Polazni materijali moraju biti

lako dostupni, a otapala, ako su potrebna, moraju bili ili neškodljiva ili lako uklonjiva. Produkti

moraju biti stabilni u fiziološkim uvjetima te se moraju moći lako izolirati i pročistiti

nekromatografskim metodama.1

Koncept klik-kemije nije ograničen samo na reakcije organskih spojeva, već se može

primijeniti na bilo koju reakciju kod koje nastaje jedan produkt iz dva polazna spoja u

jednostavnim uvjetima i visokom iskorištenju bez potrebe za kromatografskim pročišćavanjem.

Primjeri reakcija u organskoj kemiji koje zadovoljavaju uvjete klik-reakcija su cikloadicije,

otvaranja prstena napetih heterocikličkih elektrofila (epoksida, aziridina, aziridinijevih iona i

episulfonijevih iona), adicije na nezasićene veze ugljik-ugljik (epoksidacije, dihidroksilacije,

aziridinacije, adicije sulfenil-halogenida te Michaelova adicija) i reakcije na karbonilnim

spojevima nealdolskog tipa (nastanak urea, tiourea, aromatskih heterocikla, oksim-etera,

hidrazona i amida).1

1.2. Ciljevi klik-kemije

Najčešći cilj sinteza u organskoj kemiji je dobivanje produkata s korisnim svojstvima zbog čega

se što više nastoje skratiti i pojednostaviti sintetski koraci. Budući da su klik-reakcije

modularne, stereospecifične i visokih prinosa, odgovaraju zahtjevima sinteza kompleksnih

spojeva, pogotovo onih koji imaju farmakološku i biološku primjenu.

Energija koja se oslobađa tijekom klik-reakcija obično iznosi više od 20 kcal mol-1

sugerirajući visoku reaktivnost komponenata koje ulaze u reakciju. Ipak, kemoselektivnost

reaktanata usko je definirana stoga se većina klik-reakcija može odvijati u prisutnosti

uobičajenih funkcionalnih skupina, poput hidroksilne, karboksilne, amidne i amino skupine

omogućujući izbjegavanje korištenja zaštitnih skupina.1 Uz to, mnoge klik-reakcije mogu se

§ 1. Uvod 3

provoditi in vitro i in vivo jer reaktanti ne reagiraju s biološkim molekulama pa su te reakcije

bioortogonalne.

Uzimajući za inspiraciju reakcije iz prirode, klik reakcije sve se više koriste za sintezu

analoga prirodnih supstrata u što manje koraka i u što većem iskorištenju u jednoj reakciji dobiti

novu vezu između atoma ugljika i heteroatoma. Poželjna osnovna osobina dobivenih spojeva

jest stabilnost u fiziološkim uvjetima kako bi se ubrzao proces razvoja novih terapeutika te lako

mijenjala svojstva polimera koji mogu biti biokompatibilni. S obzirom na važnu ulogu

farmaceutske industrije, kao i stalan porast istraživanja fizioloških i staničnih procesa,

bioortogonalne klik-reakcije dobivaju sve veću pažnju u organskoj kemiji.

Na kraju, već iz samih uvjeta koje moraju zadovoljiti klik-reakcije, prema Sharplessu i

suradnicima,1 proizlazi dodatni cilj njihove sve veće primjene u organskoj sintezi – smanjivanje

uporabe štetnih kemikalija i usmjeravanje ka „zelenoj kemiji“.

Za biološke sustave najpogodnije klik-reakcije su bakrom(I) katalizirana azid-alkin

cikloadicija, Staudingerova ligacija, Diels-Alderova reakcija s inverznim elektronskim

zahtjevom te, rjeđe, adicija hidrazida na karbonilne skupine, Michaelova adicija tiola, tiol-en i

tiol-in reakcije.

§ 2. Klik-reakcije 4

§ 2. KLIK-REAKCIJE

2.1. Cikloadicije

2.1.1. Huisgenova azid-alkin 1,3-dipolarna cikloadicija

Od povijesnog značaja u klik-kemiji jest Huisgenova 1,3-dipolarna cikloadicija (HDC) između

terminalnog alkina i azida kojom nastaje 1,2,3-triazolni produkt.2 Bez katalizatora odvija se pri

povišenoj temperaturi i veoma sporo dajući regioizomere.3 Ako se u susjedstvu terminalne

trostruke veze alkina nalazi elektron odvlačeća skupina, prevladava 1,4-disupstituirani 1,2,3-

triazolni produkt. Reakcija se općenito može prikazati shemom 1.

Shema 1. Huisgenova 1,3-dipolarna azid-alkin cikloadicija.

HDC više nema praktičnu primjenu zbog dugotrajnosti, nespecifičnosti i slabih iskorištenja.

Ipak, tijekom godina razvijena su dva katalizatora ove reakcije koji daju samo jedan

regioizomer i znatno ubrzavaju reakciju.

2.1.2. Bakrom(I) katalizirana azid-alkin cikloadicija (CuAAC)

Sharpless3 i Meldal4 neovisno jedan o drugome razvili su znatno bržu HDC kataliziranu

monovalentnim atomom bakra. Interakcijom terminalnih alkina s Cu(I) nastaje acetilid koji

stupa u reakciju s azidom dajući 1,4-disupstituirani 1,2,3-triazolni produkt. Reakcija se može

odviti i pri sobnoj temperaturi u znatno kraćem vremenu u odnosu na HDC, a triazolna skupina

zbog ove reakcije može se koristiti kao poveznica jer je otporna na hidrolizu, redukciju i

oksidaciju pri uobičajenim reakcijskim uvjetima. Općenito, CuAAC se može prikazati shemom

2.

Shema 2. Bakrom(I) katalizirana azid-alkin cikloadicija (CuAAC).

V. V. Fokin i suradnici predložili su 2013. godine mehanizam CuAAC reakcija prema

kojem dva atoma Cu(I) sudjeluju u katalizi.5 Takav mehanizam prikazan je na slici 1.


Slika 1. Mehanizam CuAAC s dva atoma Cu(I). Slika preuzeta iz reference 5.

Prema predloženom mehanizmu, tijekom CuAAC dolazi do stvaranja kompleksa između

jednog atoma Cu(I) i -veze alkina, ali i njegovog premještanja prilikom deprotonacije alkina i

dolaska drugog atoma Cu(I). Takav dvocentrični kompleks polarizira -vezu i usmjeruje N-3

dušikov atom azida za nukleofilni napad na -C atom alkina. Atomi Cu(I) ne odlaze

istovremeno iz kompleksa – nakon stvaranja 1,2,3-triazola preostaje jedan atom Cu(I) vezan za

C-5 triazola i odlazi tek ponovnom protonacijom.

Jedini problem koji može nastati prilikom CuAAC jest oksidacija atoma Cu(I) u Cu(II)

ili disproporcioniranje u smjesu Cu(II) i elementarnog bakra zbog prisutnosti kisika u

reakcijskoj smjesi. Nastanak Cu(II) zaustavlja reakciju. Razvijeni su načini za uvođenje atoma

Cu(I) bez njegove razgradnje. U suhim uvjetima i nedostatku kisika, Cu(I) soli stabilni su i

učinkoviti katalizatori, primjerice, CuI, CuBr i CuOTf ∙ C6H6. Kao otapalo koristi se aprotično

organsko otapalo uz dodatak aminske baze poput diizopropilamina (DIPEA) i 2,6-lutidina.6

Ako se reakcije provode u vodi ili u smjesi vode i alkohola uz prisutnost kisika, koriste se Cu(II)

soli, najčešće CuSO4 ∙ 5H2O uz dodatak reducensa u suvišku, najčešće natrijevog askorbata,

kako bi se atomi Cu(I) dobili in situ.7 Ovakav pristup ima prednost kada supstrati imaju

nezaštićene amino i hidroksilne skupine.

Za potrebe laboratorijske i industrijske sinteze 1,4-disupstituiranih 1,2,3-triazola

promjenom reakcijskih uvjeta i liganda za Cu(I) lako se mijenjaju brzine i iskorištenja CuAAC.

Ipak, za reakcije in vitro i in vivo mnogi takvi postupci nisu povoljni. Poznato je da je bakar

toksičan za žive organizme jer uzrokuje lomove lanaca DNA,8 nastanak reaktivnih kisikovih

spojeva9 i koordinira se na različite funkcionalne skupine bioloških molekula utječući na

biološki važne procese. Nedavno je i taj problem riješen sintezom biokompatibilnih nanočestica


modificiranog polimera s koordiniranim atomima Cu(I) koje su katalizirale reakcije in vitro i

in vivo.10

2.1.3. Rutenijem katalizirana azid-alkin cikloadicija (RuAAC)

Za razliku od CuAAC, azid-alkin cikloadicije katalizirane kompleksima divalentnog atoma

rutenija, poput pentametilciklopentadienilrutenijevog klorida, daju 1,5-disupstituirane 1,2,3-

triazole, općenito prikazano na shemi 3.

Shema 3. Rutenijem(II) katalizirana azid-alkin cikloadicija (RuAAC).

Otapala korištena za RuAAC su smjesa tetrahidrofurana i dioksana, no mogu se koristiti

bilo koja aprotična otapala pogodna za provođenje reakcije pri temperaturama od sobne do 80

°C. U ovoj se cikloadiciji kao supstrati mogu koristiti i neterminalni alkini i tada nastaju 1,4,5-

trisupstituirani 1,2,3-triazoli, a primijećena je i veća ovisnost reakcije o geometriji azida nego

alkina u odnosu na CuAAC.11 Fokin i suradnici 2008. godine predložili su mehanizam ove

cikloadicije koji je prikazan na slici 2.12

Slika 2. Mehanizam RuAAC. L označava ligand koji se izmjenjuje tijekom reakcije. Slika

preuzeta i prilagođena iz reference 12.

Predloženi mehanizam uključuje korak oksidativnog sparivanja azida i alkina u kojem alkin

djeluje kao nukleofil pri čemu nastaju rutenacikli. Tim korakom određena je regioselektivnost


reakcije. Zatim slijedi reduktivna eliminacija u kojoj se oslobađa 1,5-disupstituirani 1,2,3-

triazol.

2.1.4. Azid-alkin cikloadicija potaknuta napetošću prstena (eng. strain-promoted azide-

alkyne cycloaddition, SPAAC)

Kako bi se izbjegla štetnost prijelaznih metala u biološkim sustavima, razvijene su klik-reakcije

kod kojih se oslobađa znatna energija napetosti prstena i omogućuje odvijanje reakcije bez

katalizatora. Osnova tih reakcija je brza cikloadicija između ciklooktina i fenilazida.13

Dodavanjem supstituenata u susjedstvo trostruke veze povećava napetost ciklooktina i ubrzava

reakcija.14 Primjer unaprjeđene SPAAC15 prikazan je na shemi 4.

Shema 4. Azid-alkin cikloadicija potaknuta napetošću prstena.

Premda je SPAAC atraktivan i netoksičan pristup provođenju reakcija in vitro i in vivo,

rijetko se koristi zbog manje brzine reakcije i iskorištenja u odnosu na CuAAC. Ipak, Bertozzi

i suradnici proveli su ovu reakciju u svrhu obilježavanja glikana na površini stanice i praćenja

njihove dinamike.15 Nakon njih, pokazalo se da uvođenje aromatskih supstituenata na

ciklooktinski prsten dodatno ubrzava reakciju.16

2.1.5. Diels-Alderova reakcija s inverznim elektronskim zahtjevom (eng. inverse electron-

demand Diels-Alder, IED-DA)

Diels-Alderove reakcije s inverznim elektronskim zahtjevom (IED-DA) odvijaju se između

dienofila supstituiranih elektron-donorskim skupinama i diena supstituiranih elektron-

akceptorskim skupinama prilikom čega dolazi do interakcije HOMO dienofila i LUMO diena,

za razliku od klasične Diels-Alderove reakcije kod koje dolazi do interakcije HOMO diena i

LUMO dienofila. Molekulsko orbitalni dijagram shematski je prikazan na slici 3.


Slika 3. Usporedba HOMO-LUMO interakcija diena i dienofila u a) Diels-Alderovoj reakciji

i b) u Diels-Alderovoj reakciji s obrnutim elektronskim zahtjevom.

Fox i suradnici 2008. godine pokazali su bioortogonalnost reakcija tetrazina i napetih

alkena ili alkina17 koje pripadaju IED-DA cikloadicijama za koje se pokazalo da su najbrže do

danas poznate bioortogonalne reakcije. Jedini nedostatak na kojemu se intenzivno radi jest

razvoj napetih alkena stabilnih u biološkim uvjetima jer se pokazalo da prvotno korišten trans-

ciklookten izomerizira u nereaktivni cis-ciklookten.18 S druge strane, ciklooktenski sustav

relativno je velik za primjene koje uključuju reakcije na teško dostupnim mjestima poput

aktivnih mjesta enzima pa je primjenjivost IED-DA reakcija ograničena.

2.2. Klik-reakcije tiola

2.2.1. Tiol-en radikalske reakcije

Premda poznate od 1905. godine,19 reakcije tiola s alkenima odvijaju se u blagim uvjetima i

mogu se potaknuti radikalskim inicijatorom ili pobuđivanjem UV zračenjem valne duljine od

254 nm. Homolizom S-H veze nastaje tiilni radikal čija je reakcija s alkenima regioselektivna i

kemoselektivna.20 Kako bi se reakcije nastanka radikala ubrzale, koristi se fotoinicijator,

primjerice dimetoksifenilacetofenon ili fosfin-oksid, uz ozračivanje tiola što je sažeto prikazano

na shemi 5.

a) b)


Shema 5. Fotokatalizirana reakcija tiola i alkena.

Mehanizam ovih reakcija prati uobičajeni radikalski mehanizam koji se sastoji od tri koraka –

inicijacije, propagacije i terminacije. Reakcija se zaustavljaju rekombinacijom tiilnih radikala i

ugljikovih radikala međusobno ili jednih s drugima. Regioselektivnost tiol-en reakcija je anti-

Markovnikovljeva čime nastaju najstabilniji ugljikovi radikali. U skladu s tim, reaktivnost

alkena smanjuje se sa smanjenjem elektronske gustoće dvostruke veze.21

Tioeterske veze koje nastaju u ovim reakcijama stabilne su kiselim, bazičnim i

reducirajućim uvjetima te se često koriste kao poveznice u biokompatibilnim materijalima.

2.2.2. Tiol-in radikalske reakcije

Za razliku od tiol-en reakcija, kod tiol-in radikalskih reakcija dvije molekule tiola reagiraju s

jednom molekulom alkina dajući 1,2-ditioeter kako je prikazano na shemi 6.

Shema 6. Fotokatalizirana reakcija tiola i alkina.

Adicija prve molekule tiola je korak koji određuje brzinu reakcije i u njemu nastaju vinilni

radikali s -tioeterskom skupinom.22 Ove reakcije upotrebljavaju se za pripremu razgranatih

polimera23 i dendrimera24.

Budući da radikalske reakcije tiola ne zahtijevaju uporabu metalnih katalizatora, svoju

primjenu mogu pronaći u reakcijama in vitro i in vivo.

2.2.3. Michaelova adicija tiola

Budući da su tioli i tiolatni anioni veoma dobri nukleofili, lako stupaju u reakciju s elektrofilima

poput epoksida, izocijanata, halogenida i Michaelovih akceptora. Aktivacijom dvostruke veze

ugljik-ugljik koja je u konjugaciji s elektron-akceptorskom skupinom Michaelova adicija tiola

odvija se u visokom prinosu. Kao katalizator se koriste aminske baze25 ili jaki nukleofili26, a

nastali tiolatni anion nukleofilno napada ugljikov atom dvostruke veze u -položaju u odnosu


na elektron-akceptorski supstituent što u konačnici daje tioeter kako je prikazano na shemi 7.

Reakcije se mogu provoditi pri sobnoj temperaturi u vodi ili drugim protičnim otapalima.

Shema 7. Michaelova adicija tiola. EWG označava elektron-akceptorsku skupinu.

2.3. Promijenjena Staudingerova ligacija

U Staudingerovoj ligaciji27 između fosfina i azida nastaju aza-ilidi koji spontano hidroliziraju

dajući primarni amin i odgovarajući fosfin-oksid u visokom iskorištenju. Reakcija se odvija u

vodi i pri sobnoj temperaturi. Budući da aza-ilid nije stabilan u vodi, reakcija se ne može

primijeniti u biološkim sustavima stoga su je 2000. godine E. Saxon i C. R. Bertozzi izmijenili

tako da nastaje adukt s amidnom vezom stabilan u vodi kao jedini produkt.28 Takva

promijenjena Staudingerova ligacija prikazana je na shemi 8.

Shema 8. Promijenjena Staudingerova ligacija.

Na taj način omogućene su bioortogonalne reakcije između azidnom skupinom modificiranih

šećera ili aminokiselina i fosfina supstituiranih s tzv. elektronskom stupicom, a nastali produkti

lako se mogu pratiti spektrofotometrijski. Poznati primjer uporabe ove reakcije je sinteza

biotiniliranog fosfina za praćenje reakcije s azidošećerima na površini stanica.28

§ 3. Primjene u bioortogonalnoj kemiji 11

§ 3. PRIMJENE U BIOORTOGONALNOJ KEMIJI

3.1. Najčešće primjene

Sinteza inhibitora enzima jedan je od veoma aktualnih ciljeva organske kemije. Pristup u kojem

se CuAAC pokazala veoma korisnom je sinteza vođena metom (eng. target-guided synthesis,

TGS) koja se temelji na korištenju ciljnog enzima za sastavljanje vlastitog inhibitora iz njegovih

prekursora. Samo one molekule koje stupaju u interakciju s veznim mjestom enzima reagiraju

međusobno dajući snažne inhibitore. Na taj se način izbjegava pretraživanje velikog broja

spojeva jer je dovoljno analizirati dobiveni inhibitor u veznom mjestu. H.C. Kolb i suradnici29

iskoristili su TGS pristup za sintezu inhibitora acetilkolin-esteraze iz smjese takrinskih i

fenantridinijevih azidnih i alkinskih reaktanata. Nakon 6 sati inkubacije smjese s enzimom

proveli su analizu sirove reakcijske smjese LC/MS-SIM metodom i na relativno jednostavan

način proveli pretraživanje najoptimalnijih inhibitora enzima iz knjižnice reaktanata koji

međusobno reagiraju klik-reakcijom (slika 4 a)). Pristup koji se nadovezuje na TGS je

profiliranje proteina na temelju aktivnosti (eng. activity based protein profiling)30 u kojem se

ligand za neku klasu enzima dizajnira tako da sadrži dio kojeg prepoznaju ciljani enzimi i dio

koji omogućuje selektivno obilježavanje enzim-ligand kompleksa. Modifikacijom liganda tako

da sadrži dio koji stupa u klik-reakciju lako se uvodi fluorescentni biljeg za analizu proteoma.31

C. R. Bertozzi i E. Saxon28 promijenjenu Staudingerovu ligaciju iskoristile su za

obilježavanje stanica. Ugradivši glikoproteine s azido derivatom sijalične kiseline dobivene

staničnim procesima iz sintetskog N-azidoacetilmanozamina, selektivno su modificirale

dobivene glikane reakcijom s biotiniliranim triarilfosfinom. Praćenjem promjene fluorescencije

protočnom citometrijom i vezanjem avidina konjugiranog s fluorescein-izotiocijanatom

kvantificirana je količina slobodnih sulfhidrilnih skupina na površini stanica (slika 4 b)). Time

su otvorene brojne mogućnosti za manipulaciju membranskih proteina bez uporabe metalnih

katalizatora. Osim membranskih proteina, uspješno su modificirani lipidi i provedena je

cikloadicija u fiksiranim i živim stanicama kojom je omogućeno praćenje lokalizacije lipida

fluorescencijskom mikroskopijom. Na taj način je također moguće pratiti dinamiku lipida i

dobiti uvid u njihovu raspodjelu u stanicama, partnere koji s njima stupaju u interakciju i

njihovo ponašanje kao odgovor na različite podražaje.32


Nakon modifikacije membranskih proteina, uspješno je provedena i ciljana modifikacija

staničnih proteina ugradnjom neprirodnih aminokiselina s azidnom ili alkinskom skupinom

metodom koja koristi par mutirane aminoacil-tRNA-sintetaze i supresorske tRNA.34 Tako

izmijenjeni proteini mogu se naknadno koristiti u razne svrhe jer se neprirodne aminokiseline

nalaze na točno određenim mjestima i specifično reagiraju u klik-reakcijama. Primjeri nekih od

ispitanih neprirodnih aminokiselina i shema ugradnje u proteine prikazani su na slici 5.

a)

b)

Slika 4. a) Shema sinteze inhibitora u enzimskom kalupu. b)

Ugradnja derivata šećera u glikoproteine i selektivno obilježavanje

klik-reakcijom. Slike su preuzete i prilagođene iz reference 33.


Slika 5. a) Neke od ugrađenih neprirodnih aminokiselina. b) Shema ugradnje

neprirodne aminokiseline u protein i njegovo obilježavanje klik-reakcijom. Slika je preuzeta i

prilagođena iz reference 33.

Uspješno obilježavanje DNA i RNA in vitro i in vivo klik-reakcijom proveli su A. Salic

i suradnici ugradivši alkinske derivate deoksiuridin35 i uridin nukleotida36 na mjesto uracila. Na

stanicama i tkivima nekoliko organa miševa proveli su CuAAC s fluorescentnim azidima kako

bi pratili sintezu DNA i RNA (slika 6).

Slika 6. a) Alkinski derivati i) deoksiuridina i ii) uridina. b) Shema obilježavanja DNA s

alkinskim derivatima nukleotida klik-reakcijom. Slika je preuzeta i prilagođena iz reference

33.

a)

b)

a)

b)


3.2. CuAAC in vitro i in vivo

Donedavno se izbjegavalo korištenje kompleksa Cu(I) u biološkim sustavima zbog njegove

toksičnosti. Osim toga, atomi Cu(I) lako se oksidiraju i disproporcioniraju gubeći tako svoju

katalitičku sposobnost. Zimmerman i suradnici 2016. godine pokazali su da metaloorganske

nanočestice koje sadrže kompleksirane atome Cu(I) mogu veoma učinkovito katalizirati azid-

alkin cikloadiciju u vodi i stanicama.37 Iste godine Bradley i suradnici razvili su netoksični

heterogeni katalizator koji sadrži Cu(I) i kompatibilan je s biološkim sustavima u koje se može

lako uvesti.38

Katalizator kojeg su razvili Bradley i suradnici heterogen je, robusan i biokompatibilan,

a dobiven je inkubacijom polistirena presvučenog polietilenglikolom modificiranim s amino

skupinom, pod komercijalnim nazivom TentaGelTM, s otopinom Cu(OAc)2, redukcijom Cu(II)

hidrazinom te zarobljavanjem nastalog Cu(I) pomoću sukcinil-klorida. Priprava takvog

katalizatora shematski je prikazana na slici 7.

Slika 7. Priprava nanočestica s ugrađenim kompleksom Cu(I). Slika je preuzeta i prilagođena

iz reference 38.

Promjer tako dobivenih nanočestica (eng. entrapped copper nanoparticles, E-Cu-NP) iznosio

je 51,2 ± 4,2 nm raspoređenih unutar čestica TentaGel-a čiji je promjer u vodi iznosio 160,4 ±

10,3 nm, a sadržaj Cu(I) iznosio je 0,37 ± 0,02 mol/mg TentaGel-a.

Kako bi se provjerila citotoksičnost priređenog katalizatora, SKOV-3 i HeLa stanice

inkubirane su s E-Cu-NP (0,3 mg, 0,1 mol Cu) te, za usporedbu, s otopinom CuSO4

koncentracije od 0 M do 20M, 4 ekvivalenta tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amina

(THPTA) i natrijevim askorbatom (200 M). Testom s 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazoliijevim bromidom (MTT) i usporedbom s netretiranim stanicama uočena je


vijabilnost stanica inkubiranih s E-Cu-NP dok je povećanje koncentracije CuSO4 pogodovalo

smanjenju broja živih stanica tijekom 24 i 48 sati. Rezultati tog testa prikazani su na slici 8.

Slika 8. Provjera citotoksičnosti E-Cu-NP-ova u usporedbi s CuSO4/THPTA

katalizatorom za a) SKOV-3 i b) HeLa stanica mjereno nakon i) 24 h i ii) 48 h. Slika je

preuzeta i prilagođena iz reference 38.

Potvrdom vijabilnosti stanica u prisutnosti E-Cu-NP omogućeno je daljnje testiranje

katalitičke sposobnosti in vitro. Provedena je cikloadicija 3-azido-7-hidrooksikumarina (1) i [5-

(propargilamino)-5-oksopentil]trifenil fosfonija (2) katalizirana E-Cu-NP-om što je shematski

prikazano na slici 9 a). Dobiveni produkt 3 poslužio je kao boja za mitohondrije jer je otprije

poznato da trifenilfosfonijeva skupina usmjerava u mitohondrije. Na slici 9 b) prikazani su

rezultati dobiveni konfokalnom fluorescencijskom mikroskopijom živih stanica nakon 18 h.

Fluorescencija je praćena pobudom pri 355 nm, a emisija praćena pri 450 nm. Lokalizacija

produkta 3 u mitohondrije SKOV-3 i HeLa stanica (plava fluorescentna boja) uspoređena je s

lokalizacijom standardne crvene boje za mitohondrije. Bez katalizatora nije došlo do pojave

plave fluorescentne boje, odnosno nastanka produkta 3.

a) i) ii)

b) i) ii)


Slika 9. a) Sinteza i lokalizacija 3 u mitohondrijima b) SKOV-3 i c) HeLa stanica. Plava boja

pripada produktu 3, a crvena standardnoj boji za mitohondrije. Ljubičasta boja nastala je

superpozicijom prethodnih slika. Slike su preuzete iz reference 38.

Nakon uspješne lokalizacije produkta cikloadicije katalizirane E-Cu-NP-om provedeno

je ispitivanje katalitičke sposobnosti in vivo u žumanjčanoj vrećici embrija zebraste ribice,

modelnog organizma. Jedna čestica katalizatora uvedena je u žumanjčanu vrećicu embrija 24

sata nakon oplodnje. Katalizator se nije pokazao toksičnim, nije mijenjao fenotip i embriji su

se normalno razvili do stadija larve što je prikazano na slici 10 a). Zatim je provedena

cikloadicija spojeva 1 i 2 i uočena je fluorescencija u embrijima s katalizatorom čiji je intenzitet

bio 5,7 puta veći u mjestu označenom strjelicom na slici 10 b) i 3,2 puta veći unutar cijele

vrećice u odnosu na pozadinsku fluorescenciju embrija s ugrađenom česticom nemodificiranog

polimera.

a)

b) c)


Slika 10. Provjera katalitičke sposobnosti E-Cu-NP-ova u stanicama embrija zebraste ribice.

Slike dobivene svjetlosnom (lijevo) i fluorescencijskom (desno) mikroskopijom uvođenjem

jedne čestice katalizatora u embrij i) 24 sata nakon oplodnje, ii) 3 dana nnakon oplodnje (dpf)

i iii) 4 dpf. a) Praćenje razvoja embrija. b) Usporedba fluorescencije s česticama gela bez

Cu(I) i s ugrađenim Cu(I) 2 dpf. Slika je preuzeta i prilagođena iz reference 38.

Osim za sintezu netkosičnih spojeva, ispitana je i katalitička sposobnost E-Cu-NP-ova

prilikom cikloadicije azida 4 i alkina 5 pri čemu nastaje triazolni analog kombretastanina A4

(CA4, 6), inhibitora polimerizacije tubulina koji pokazuje visoku razinu toksičnosti za različite

tumorske stanične linije. Ispitivanje citotoskičnosti provedeno je na SKOV-3 i HeLa stanicama.

Prekursori 4 i 5 nisu pokazali citotoksičnost dok je dodatkom E-Cu-NP-ova smanjena

vijabilnost stanica za 70 % u odnosu na kontrole. Analiza indukcije apoptoze prilikom nastanka

spoja 6 provedena je bojanjem stanica aneksinom V konjugiranim s fluorescein-izotiocijanatom

(FITC) i propidijevim jodidom. Shema reakcije i citogrami SKOV-3 stanica prikazani su na

slici 11.

a) i)

ii)

iii)

b)


Iz provedenih ispitivanja Bradley i suradnici zaključili su da je moguće razviti biokompatibilni

katalizator koji sadrži kompleksirane atome Cu(I) te da je samo potrebno usmjeriti se na sintezu

netoksičnih stabilnih prekursora željenoga triazolnog produkta. Time je olakšan put razvoju

terapeutika za ciljanu dostavu u stanice i nije nužno izbjegavanje bioortogonalnih klik-reakcija

koje nisu katalizirane prijelaznim metalima za reakcije in vitro i in vivo.

3.3. IED-DA i SPAAC in vivo

David J. Mooney i suradnici39 proveli su ciljanu dostavu malih molekula do oboljelog tkiva u

miševima koristeći dvije bioortogonalne i međusobno ortogonalne klik-reakcije, IED-DA i

SPAAC. Pristup koji su koristili u svom radu zasniva se na ugradnji biookompatibilnog

hidrogela, dobivenog gelacijom alginata koji je prethodno modificiran tetrazniskom ili azidnom

skupinom, u mišićno tkivo miša oboljelog od ishemije stražnjeg uda.

Na osnovi pretpostavke da male molekule krvotokom mogu doći do modificiranih

hidrogelova i prepoznati funkcionalnu skupinu koja se nalazi na njihovoj površini te reagirati,

Mooney i suradnici testirali su sintezu biokompatibilnih supstrata s fluoroforima koji

apsorbiraju u području bliskog infracrvenog zračenja. Gel od alginata modificiran azidnom ili

tetrazinskom skupinom ugrađen je u mišićno tkivo stražnjeg uda miša podvrgnutog operaciji

podvezivanja bedrene arterije. Dan poslije operacije miševima su intravenozno administrirane

a)

b)

Slika 11. a) Sinteza citotoksičnog spoja 6 in situ. b) Citogram netretiranih i

tretiranih SKOV-3 stanica. „Cu“ označava prisutnost katalizatora E-Cu-

NP-a. Slika je preuzeta i prilagođena iz reference 38.


molekule s fluoroforima, dibenzociklooktin (DBCO) ili trans-ciklookten (TCO). Praćenjem

fluorescentnim oslikavanjem živih miševa (eng. live animal fluorescence imaging) tijekom 24

sata uočena je fluorescencija u udovima s ugrađenim modificiranim gelovima dok isto nije

uočeno u kontrolnim životinjama, s ugrađenim nemodificiranim gelom.

Dodatno je ispitana istovremena ciljana dostava DBCO i TCO na različita mjesta u

istom mišu. Gel modificiran azidnom skupinom ugrađen je u mišićno tkivo stražnjeg uda

(intramuskularno), a gel modificiran tetrazinskom skupinom u masno tkivo mliječne žlijezde

(intramamarno). Miševima oboljelima od ishemije intravenozno je primijenjena smjesa DBCO

obilježenog cijaninom 7 (Cy7) i TCO obilježenog cijaninom 5 (Cy5) 24 sata nakon ugradnje

gelova. Uspješnost ovakvog pristupa prikazana je na Slici 12.

Istovremenom IED-DA i SPAAC in vivo otvara se put razvoju kombiniranja međusobno

ortogonalnih terapeutika jer dolazi do prostornog razdvajanja različitih molekula koje ciljaju

prema različitim mjestima u istom organizmu.

Također, uz provedena ispitivanja utvrđena je mogućnost ponovljene ciljane dostave

malih molekula za klik-reakciju tijekom mjesec dana što upućuje na to da se medicinski

implantati poput hidrogelova i medicinskih uređaja mogu selektivno ciljati malim molekulama

koje kolaju krvotokom.

a) b)

Slika 12. Intravenozna primjena molekula s fluoroforima u miševe

kojima je ugrađen alginat modificiran azidnom i tetrazinskom skupinom.

a) Shema stupanja reaktanata u reakciju in vivo. b) Usporedba intenziteta

signala fluorofora Cy5 (plavo) i Cy7 (crveno) u mliječnoj žlijezdi i

stražnjem udu 48 sati nakon primjene. Slike su preuzete i prilagođene iz

reference 39.


3.4. Sinteza biokompatibilnih hidrogelova

Hidrogelovi su poznati već od 1960. godine40 i čine ih trodimenzionalne mreže hidrofilnih

polimera koji su kemijski ili fizikalno povezani tako da mogu zadržavati veliku količinu vode

ne mijenjajući pritom svoju strukturu. Da bi neki materijal bio hidrogel, udio vode mora biti

barem 10 % od ukupne mase ili volumena tog materijala. Zbog toga, fleksibilnost hidrogelova

može biti slična fleksibilnosti prirodnog tkiva zbog čega se oni sve više koriste za tkivni

inženjering, dostavu terapeutika i proučavanja kretanja stanica u izvanstaničnom matriksu.

Ipak, tek je 2006. godine prvi put sintetiziran hidrogel dobro definirane mreže korištenjem klik-

kemije. Prije toga koristile su se tradicionalne metode polimerizacije radikalskim reakcijama

koje su davale produkte čija su se svojstva teško kontrolirala.41

Andrew P. Dove i suradnici razvili su pripravu hidrogelova in situ koji stvaraju omotač

oko stanica pritom ne narušavajući njihovu vijabilnost.42 Jednostavnim istovremenim klik-

reakcijama u fiziološkim uvjetima priređeni su hidrogelovi s dvostrukom mrežom koji su

zadržali visoku mehaničku čvrstoću i složenu strukturu kao i drugi čvrsti hidrogelovi. Uz to,

hidrogelovi su pokazali visoku podnošljivost kompresije i istezanja bez loma ili histereze čak i

nakon ponovljenih opterećivanja. Također, pokazali su mogućnost kemijske modifikacije na

slobodnim funkcionalnim skupinama i nakon same reakcije umrežavanja polimera. Na slici 13

prikazana je shema dobivanja hidrogela pojedinim klik-reakcijama, IED-DA reakcijom (slika

13 a)) i Michaelovom adicijom tiola (slika 13 b)), te miješanjem obiju reakcija čime se dobio

gel s dvostrukom mrežom (slika 13 d)).


Hidrogel s labavom mrežom dobiven je povezivanjem kitozana modificiranog norbornenskom

skupinom (1) i linearnog polietilen-glikola (PEG) modificiranog ditetrazinskom skupinom (2)

na svojim krajevima. Hidrogel s gustom mrežom dobiven je povezivanjem PEG-a s četiri ručice

modificirane alkinskom skupinom (3) i linearnog PEG-a s tiolnim skupinama na svojim

krajevima (4). Hidrogel s dvostrukom mrežom priređen je miješanjem otopina svih navedenih

polimera u uvjetima koji oponašaju fiziološke. Ispitivanja mehaničkih svojstava pojedinih

hidrogelova pokazala su da se u jednom koraku korištenjem dviju međusobno ortogonalnih

klik-reakcija može dobiti složeni hidrogel čija svojstva konkuriraju onima tradicionalno

priređenima. Na taj se način u daljnjoj proizvodnji biokompatibilnih materijala mogu izbjeći

dugotrajne pripreme koje zahtijevaju nekoliko koraka polimerizacije i pročišćavanja.

Slika 13. a) Labavi gel dobiven IED-DA polimerizacijom.

b) Gusti gel dobiven Michaelovom adicijom tiola. c) Gel

dobiven miješanjem svih komponenata. d) Reakcije

povezivanja polimera. Slika je preuzeta iz reference 42.

a)

b) c) d)

§ 4. Zaključak 22

§ 4. ZAKLJUČAK

Klik-kemija je koncept koji se svakodnevno brzo razvija. Premda su reakcije koje

zadovoljavaju zahtjeve klik-kemije jednostavne za izvedbu, mehanizmi neki od njih još uvijek

su predmet rasprave. Cikloadicije su se pokazale kao najbrže i najisplativije reakcije, a

reakcijski uvjeti i reagensi uvijek se mogu mijenjati i unaprjeđivati. Nakon uspješnog razvoja

biookompatibilnog katalizatora za CuAAC i primjene IED-DA in vitro i in vivo, znatno je

smanjena početna ograničenost uporabe ovih kinetički najpovoljnijih bioortogonalnih klik-

reakcija. Daljnji razvoj CuAAC za reakcije in vivo sve se više temelji na unaprjeđenju

katalizatora temeljenog na ugradnji Cu(I) vrsta u nanočestice modificiranih polimera.

Također, osim za reakcije u živim sustavima, svakodnevno se ispituju utjecaji različitih

otapala i aditiva na pojedine klik-reakcije kako bi se povećao njihov prinos i skratilo vrijeme

reakcije. Uz to, izmjene reakcijskih uvjeta usmjerene su načelima „zelene kemije“ stoga i

izazovi koji se postavljaju kemičarima nemaju vidljivih granica.

Budući da su se klik-reakcije iskazale na području ciljane dostave terapeutika, pažnja

se može usmjeriti ka razvoju stabilnih i biokompatibilnih reaktanata s različitim stupnjem

zadržavanja u organizmu ili stanici kao i njihovih produkata. Osim toga, razvoj hidrogelova

različitih svojstava, kao, primjerice, mogućnost oponašanja prirodnih tkiva ili prijenos različitih

molekula, proširuje područje klik-kemije i izvan bimolekulskih reakcija.

§ 5. Literaturni izvori 23

§ 5. LITERATURNI IZVORI

1. H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed. 40 (2001) 2004-2021.

2. R. Huisgen, Angew. Chem. 75 (1963) 604–637.

3. V. V. Rostovtsev, L. G. Green, V. V. Fokin, K. B. Sharpless, Angew. Chem. 114 (2002)

2708–2711.

4. C. W. Tornøe, C. Christensen, M. Meldal, J. Org. Chem. 67 (2002) 3057–3064.

5. B. T. Worrell, J. A. Malik, V. V. Fokin, Science 340 (2013) 457-460.

6. W. S. Horne, C. D. Stout, M. R. Ghadiri, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 9372–9376.

7. D. D. Díaz, S. Punna, P. Holzer, A. K. McPherson, K. B. Sharpless, V. V. Fokin, M. G.

Finn, J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 42 (2004) 4392–4403.

8. K. Yamamoto, S. Kawanishi, J. Biol. Chem. 264 (1989) 15435-15440. 9. L. M. Gaetke, C. K. Chow, Toxicology 189 (2003) 147–163. 10. J. Clavadetscher, S. Hoffmann, A. Lilienkampf, L. Mackay, R. M. Yusop, S. A. Rider, J.

J. Mullins, M. Bradley, Angew. Chem. Int. Ed. 55 (2016) 1-6. 11. S. D. González, Catal. Sci. Technol. 1 (2011) 166–178. 12. B. C. Boren, S. Narayan, L. K. Rasmussen, L. Zhang, H. Zhao, Z. Lin, G. Jia, V. V. Fokin,

J. Am. Chem. Soc. 130 (2008) 8923–893. 13. G. Wittig, A. Krebs, Chem. Ber. 94 (1961) 3260-3275. 14. D. H. Ess, G. O. Jones, K. N. Houk, Org. Lett. 10 (2008) 1633–1636. 15. J. M. Baskin, J. A. Prescher, S. T. Laughlin, N. J. Agard, P. V. Chang, I. A. Miller, A. Lo,

J. A. Codelli, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104 (2007) 16793-16797. 16. X. Ning, J. Guo, M. A. Wolfert, G.-J. Boons, Angew. Chem. Int. Ed. 47 (2008) 2253–2255. 17. M. L. Blackman, M. Royzen, J. M. Fox, J. Am. Chem. Soc. 130 (2008) 13518–13519. 18. R. Rossin, S. M. van den Bosch, W. Ten Hoeve, M. Carvelli, R. M. Versteegen, J. Lub, M.

S. Robillard, Bioconjugate Chem. 24 (2013) 1210−1217. 19. T. Posner, Ber. Dtsch. Chem. Ges. 38 (1905) 646–657. 20. N. B. Cramer, J. P. Scott, C. N. Bowman, Macromolecules 35 (2002) 5361-5365. 21. A. Dondoni, Angew. Chem. Int. Ed. 47 (2008) 8995–8997. 22. B. D. Fairbanks, T. F. Scott, C. J. Kloxin, K. S. Anseth, C. N. Bowman, Macromolecules

42 (2008) 211–217.

§ 5. Literaturni izvori 24

23. D. Konkolewicz, A. G. Weale, S. Perrier, J. Am. Chem. Soc. 131 (2009) 18075–18077. 24. G. Chen, J. Kumar, A. Gregory, M. H. Stenzel, Chem. Commun. 41 (2009) 6291–6293. 25. C. D. Hued, L. L. Gershbein, J. Am. Chem. Soc. 69 (1947) 2328–2335. 26. J. W. Chan, J. Shin, C. E. Hoyle, C. N. Bowman, A. B. Lowe, Macromolecules 43 (2010)

4937–4942. 27. H. Staudinger, J. Meyer, Helv. Chim. Acta 2 (1919) 635. 28. E. Saxon, C. B. Bertozzi, Science 287 (2000) 2007-2010. 29. R. Manetsch, A. Krasinski, Z. Radić, J. Raushel, P. Taylor, K. B. Sharpless, H. C. Kolb, J.

Am. Chem. Soc. 126 (2004) 12809–12818. 30. Y. S. Liu, M. P. Patricelli, B. F. Cravatt, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (1999) 14694–

14699. 31. A. E. Speers, G. C. Adam, B. F. Cravatt, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 4686–4687. 32. A. B. Neef, C. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. 48 (2009) 1498 –1500.

33. M. D. Best, Biochemistry 48 (2009) 6571–6584.

34. W. S. Liu, A. Brock, S. Chen, S. B. Chen, P. G. Schultz, Nat. Methods 4 (2007) 239–244.

35. A. Salic, T. J. Mitchison, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (2008) 2415–2420.

36. C. Y. Jao, A. Salic, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (2008) 15779–15784.

37. Y. Bai, X. Feng, H. Xing, Y. Xu, B.K. Kim, N. Baig, T. Zhou, A. A. Gewirth, Y. Lu, E.

Oldfield, S. C. Zimmerman, J. Am. Chem. Soc. 138 (2016) 11077-11080.

38. J. Clavadetscher, S. Hoffmann, A. Lilienkampf, L. Mackay, R. M. Yusop, S. A. Rider, J.

J. Mullins, M. Bradley, Angew. Chem. Int. Ed. 55 (2016) 1-6.

39. Y. Brudno, R. M. Desai, B. J. Kwee, N. S. Joshi, M. Aizenberg, D. J. Mooney,

ChemMedChem. 4 (2015) 617-620. 40. O. Wichterle, D. Lím, Nature 185 (1960) 117-118. 41. M. Malkoch, R. Vestberg, N. Gupta, L. Mespouille, P. Dubois, A. F. Mason, J. L. Hedrick,

Q. Liao, C. W. Frank, K. Kingsbury, C. J. Hawker, Chem. Commun. (Camb). 26 (2006)

2774-2276. 42. V. X. Truong, M. P. Ablett, S. M. Richardson, J. A. Hoyland, A. P. Dove, J. Am. Chem.

Soc. 137 (2015) 1618−1622.

Documents

Numeričke metode temeljene na interpolacijskim … HOMO-LUMO interakcija diena i dienofila u a) Diels-Alderovoj reakciji i b) u Diels-Alderovoj reakciji s obrnutim elektronskim zahtjevom