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FACULTAD DE INGENIERÍA
Carrera de Ingeniería Agroindustrial y Agronegocios
OBTENCIÓN DE ANTOCIANINAS DE PAPA NATIVA “YAWAR WAYKU” (Solanum stenotomum) PARA LA
ELABORACIÓN DE UN COLORANTE NATURAL APLICABLE A ALIMENTOS
Tesis para optar por el Título Profesional de Ingeniero
Agroindustrial y Agronegocios
SALAS AQUICE, DIANA PATRICIA
TOVALINO PÁRRAGA, STEPHANIE JATSUMI
Asesor:
Elías Peñafiel, Carlos César Augusto
Lima - Perú
2018
JURADO DE LA SUSTENTACION ORAL
……………….………………………………………
Presidente
……………….………………………………………
Jurado 1
……………….………………………………………
Jurado 2
Entregado el 06 de setiembre de 2018
Aprobado por:
……………….……………………………………………………….…………………
Graduando 1
……………….……………………………………………………….…………………
Graduando 2
……………….……………………………………………………….…………………
Asesor de Tesis:
UNIVERSIDAD SAN IGNACIO DE LOYOLA
FACULTAD DE INGENIERIA
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Stephanie Jatsumi Tovalino Párraga, identificado con DNI Nº 73093595 Bachiller del
Programa Académico de la Carrera de Ingeniería Agroindustrial y Agronegocios de la
Facultad de Ingeniería de la Universidad San Ignacio de Loyola, presentamos nuestra tesis
titulada: “Obtención de antocianinas de papa nativa Yawar Wayku (Solanum stenotomum)
para la elaboración de un colorante natural aplicable a alimentos”.
Declaro en honor a la verdad, que el trabajo de tesis es de nuestra autoría; que los datos, los
resultados y su análisis e interpretación, constituyen nuestro aporte. Todas las referencias han
sido debidamente consultadas y reconocidas en la investigación.
En tal sentido, asumimos la responsabilidad que corresponda ante cualquier falsedad u
ocultamiento de la información aportada. Por todas las afirmaciones, ratificamos lo
expresado, a través de nuestras firmas correspondientes.
Lima, setiembre de 2018
…………………………..……………
Stephanie Jatsumi Tovalino Párraga
DNI: 73093595
UNIVERSIDAD SAN IGNACIO DE LOYOLA
FACULTAD DE INGENIERIA
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Diana Patricia Salas Aquice, identificado con DNI Nº 47167222 Bachiller del Programa
Académico de la Carrera de Ingeniería Agroindustrial y Agronegocios de la Facultad de
Ingeniería de la Universidad San Ignacio de Loyola, presentamos nuestra tesis titulada:
“Obtención de antocianina de papa nativa Yawar Wayku (Solanum stenotomum) para la
elaboración de un colorante natural aplicable a alimentos”.
Declaro en honor a la verdad, que el trabajo de tesis es de nuestra autoría; que los datos, los
resultados y su análisis e interpretación, constituyen nuestro aporte. Todas las referencias han
sido debidamente consultadas y reconocidas en la investigación.
En tal sentido, asumimos la responsabilidad que corresponda ante cualquier falsedad u
ocultamiento de la información aportada. Por todas las afirmaciones, ratificamos lo
expresado, a través de nuestras firmas correspondientes.
Lima, setiembre de 2018
…………………………..……………
Diana Patricia Salas Aquice
DNI: 47167222
EPÍGRAFE
La fuerza no viene de la capacidad física,
viene de una indomable fuerza de voluntad.
(Mahatma Gandhi)
INDICE
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
INDICE DE TABLAS
INDICE DE FIGURAS
INDICE DE ANEXOS
LISTA DE ABREVIATURAS
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTO
RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCION 1
PROBLEMA DE LA INVESTIGACION 2
IDENTIFICACIÓN DE PROBLEMA 2
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 4
PROBLEMA GENERAL 4
PROBLEMAS ESPECÍFICOS 4
MARCO REFERENCIAL 5
ANTECEDENTES 5
NACIONALES 5
INTERNACIONALES 8
ESTADO DEL ARTE 13
MARCO TEORICO 14
GENERALIDADES DE LA PAPA 14
ORIGEN 15
ZONAS DE PRODUCCIÓN 15
USOS 16
VARIEDADES 17
PAPA NATIVA “YAWAR WAYKU” Y SU POTENCIAL USO COMO
FUENTE DE ANTOCIANINAS 17
DESCRIPCIÓN 17
UBICACIÓN TAXONOMICA 18
CARACTERIZACION MORFOLÓGICA 18
CARACTERIZACION NUTRICIONAL 19
CONDICIONES DE CULTIVO 20
USOS 20
COLORANTES USADOS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 20
PIGMENTOS SINTETICOS 21
PIGMENTOS NATURALES 21
ANTOCIANINAS 22
ESTRUCTURA 22
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA DEGRADACIÓN DE LAS
ANTOCIANINAS 24
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ESTABILIDAD DE LAS
ANTOCIANINAS 27
EXTRACCIÓN SÓLIDO – LÍQUIDO 28
FACTORES QUE INFLUYEN EN EL PROCESO DE EXTRACCIÓN 29
EXTRACCIÓN DE ANTOCIANINAS 31
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ANTOCIANINAS 33
OBJETIVOS 35
OBJETIVO GENERAL 35
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 35
JUSTIFICACIÓN 36
TEÓRICA 36
PRÁCTICA 36
SOCIAL 37
HIPOTESIS 37
HIPOTESIS GENERAL 37
HIPÓTESIS ESPECÍFICAS 38
MATRIZ DE CONSISTENCIA 38
MARCO METODOLOGICO 39
METODOLOGIA 39
PARADIGMA 39
ENFOQUE 40
MÉTODO 40
VARIABLES 40
VARIABLE INDEPENDIENTE 41
VARIABLE DEPENDIENTE 41
MATERIALES Y MÉTODOS 41
LUGAR DE EJECUCIÓN 41
MATERIA PRIMA E INSUMOS 42
MATERIALES Y EQUIPOS 42
EQUIPOS 42
INSTRUMENTOS DE LABORATORIO 42
REACTIVOS 43
FLUJO Y DESCRIPCIÓN DEL PROCESO 44
OBTENCION DEL EXTRACTO CONCENTRADO DE ANTOCIANINAS 44
FLUJO DE PROCESO 47
DISEÑO EXPERIMENTAL 47
METODOS DE ANALISIS 51
ANALISIS FISICOQUIMICOS 51
ANALISIS ESTADISTICO 55
RESULTADOS 57
DISCUSIÓN 67
CONCLUSIONES 72
RECOMENDACIONES 73
BIBLIOGRAFIA 73
ANEXOS 82
Lista de Abreviaturas
AOAC: Association of Official Analytical Chemistry
AT: Antocianinas Totales
CIP: Centro Internacional de la Papa
DPPH: Método del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
E120: El ácido carmínico, es una sustancia química compleja utilizada como
colorante rojo extraído de la cochinilla (Dactylopius coccus).
ECA: Extracto Concentrado de Antocianinas
FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations
FSA: Food Standards Agency
g: Gramos
h: Horas
HPLC –DAD: Cromatografía de líquidos de alto rendimiento - Detector de arreglo de
diodos
JCV: Valor de Color de los Extracto de Japón
LC-ESI-MS2: Cromatografía liquida – Ionización electrospray – Espectrofotometría
de masa tándem
m.s.n.m.: Metros sobre el nivel del mar
mBar: Milibar
mL: Mililitros
MPS: Proporción Materia Prima/Solvente (variable)
MSR: Método de Superficie de Respuesta
PE: pH de Extracción (variable)
pH: Potencial de hidrógeno
PLE: Extracción de Liquido Presurizado
T: Temperatura (variable)
Índice de Tablas
Tabla 1. Meses principales de siembra, cosecha y superficie cultivada en las
zonas de producción de papa 15
Tabla 2. Contenido nutricional de la papa “Yawar Wayku” 19
Tabla 3. Variables independientes y dependientes 41
Tabla 4. Diseño de Primera Serie de Experiencias 49
Tabla 5. Diseño de Segunda serie de experiencias 50
Tabla 6. Valores de absorbancias de las diluciones del producto de
extracción a 520 y 700 nm, a pH 1 y 4.5, para la primera serie de
experiencias.
57
Tabla 7. Valores de absorbancias de las diluciones del producto de
extracción a 520 y 700 nm, a pH 1 y 4.5, para la segunda serie de
experiencias.
58
Tabla 8. Concentración de antocianinas totales (AT) obtenidas para la
primera serie de experiencias, para las variables proporción materia prima:
solvente (Proporción) y porcentaje de etanol (Etanol).
60
Tabla 9. Concentración de antocianinas totales (AT) obtenidas para la
segunda serie de experiencias, para las variables de pH y temperatura. 61
Tabla 10. Valores mínimo, máximo y óptimo para los factores proporción
materia prima: solvente (Proporción) y porcentaje de etanol (Etanol). 65
Tabla 11. Valores mínimo, máximo y óptimo para los factores pH y
temperatura (°C). 66
Tabla 12. Características de color LCH, a y b de los yogures comerciales y
yogur coloreado con antocianinas de papa. 67
Índice de Figuras
Figura 1. Papa Yawar Wayku (Solanum stenotomum) 19
Figura 2. Flor de la papa Yawar Wayku (Solanum stenotomum) 19
Figura 3. Estructura básica de la antocianina. 23
Figura 4. Figura 4. (a) Estructura básica de las antocianidinas (Wrolstad y
Durst, 2004) (b) Estructura de los monosacáridos más comunes encontrados
en las estructuras de las antocianinas.
23
Figura 5. Flujo de Proceso General para obtención de Extracto Concentrado
de Antocianinas 47
Figura 6. Escala de color Munsell. 54
Figura 7. Comparación de yogures de fresa comerciales y yogures
coloreados con antocianinas de papa. A: Antocianinas de papa en base de
yogurt natural Laive. B: Yogurt de fresa bebible Laive. C: Antocianina de
papa en base de yogurt natural Gloria. D: Yogurt frutado de fresa Gloria. E:
Yogurt de fresa bebible Gloria.
67
Índice de Gráficos
Gráfico 1. Superficie de respuesta estimada para las antocianinas totales (AT)
en función de proporción de materia prima: solvente (Proporción) y
porcentaje de etanol (Etanol).
62
Gráfico 2. Contorno de la superficie de respuesta estimada para las
antocianinas totales (AT) en función de proporción de materia prima: solvente
(Proporción) y porcentaje de etanol (Etanol).
63
Gráfico 3. Superficie de respuesta estimada para las antocianinas totales (AT)
en función de pH y temperatura (°C). 64
Gráfico 4. Contorno de la superficie de respuesta estimada para las
antocianinas totales (AT) en función de pH y temperatura (°C). 65
Índice de Anexos
Anexo 1: Matriz de Consistencia 78
Dedicatoria
La presente tesis es dedicada a nuestros padres,
quienes nos dieron fuerza y nos apoyaron de manera
incondicional en esta etapa tan importante para
nosotras.
Agradecimiento
A Dios por habernos guiado y acompañado a lo
largo de toda nuestra carrera y a todas aquellas
personas que formaron parte del desarrollo de esta
tesis, agradecemos su amistad, consejos, orientación
y ánimos.
Resumen
En los últimos años los colorantes naturales están siendo ampliamente utilizados como
reemplazo de los colorantes artificiales. Las antocianinas son un ejemplo de dichos colorantes
naturales, estas se caracterizan por tener un amplio espectro de colores, además de ser
compuestos antioxidantes beneficiosos para la salud. La papa nativa Yawar Wayku (Solanum
stenotomum) es una fuente rica en este compuesto, sin embargo, su proceso de extracción de
antocianinas no ha sido estudiado anteriormente.
En la presente investigación se realizó la optimización del proceso de extracción de
antocianinas de la papa Yawar Wayku mediante la metodología de superficie de respuesta, en
donde se evaluaron cuatro condiciones de extracción divididas en dos series de experiencias,
proporción materia prima:solvente y porcentaje de etanol, en una primera serie; y temperatura
y pH, en una segunda. Además, se analizó la diferencia entre las características de color de
yogures comerciales frente a yogurt natural comercial coloreado con antocianinas de papa.
Al finalizar el estudio se determinó que los valores óptimos para la primera serie de
experiencias fueron 1:3.3 y 14.6 %, y para la segunda 73.3 °C y 1.96. Así mismo, se observó
que el yogur coloreado con antocianinas de papa presentó características de color (Chroma, a
y b) similares a las comerciales, pudiendo dichas antocianinas ser consideradas como una
opción para la búsqueda de sustitutos naturales de los colorantes comerciales actualmente
empleados.
Palabras claves: PAPA NATIVA, YAWAR WAYKU, ANTOCIANINAS, OPTIMIZACIÓN,
SUPERFICIE DE RESPUESTA.
Abstract
In recent years natural dyes have been widely used as a replacement for artificial dyes.
Anthocyanins are an example of such natural colorants, these are characterized by a wide
spectrum of colors, as well as being antioxidant compounds beneficial to health. The native
potato Yawar Wayku (Solanum stenotomum) is a rich source of this compound, however, its
process of anthocyanin extraction has not been studied before.
In the present research, the process of extraction of anthocyanins from Yawar Wayku potato
was optimized using the response surface methodology, in which four extraction conditions
were evaluated, divided into two series of experiences: raw material:solvent ratio and ethanol
percentage, in a first series; and temperature and pH, in a second series. In addition, the
difference between the colour characteristics of commercial yogurts and natural commercial
yogurts coloured with potato anthocyanins was analysed.
At the end of the study it was determined that the optimal values for the first series of
experiences were 1:3.3 and 14.6 %, and for the second series 73.3 °C and 1.96 %. Likewise, it
was observed that yogurt coloured with potato anthocyanins had similar colour characteristics
(Chroma, a and b) to commercial ones, and these anthocyanins could be considered as an
option in the search for natural substitutes for the commercial dyes currently used.
Key words: NATIVE POTATOES, YAWAR WAYKU, ANTHOCYANINS,
OPTIMIZATION, RESPONSE SURFACE.
1
Introducción
Desde épocas remotas hasta la actualidad, el color continúa siendo un elemento determinante
al momento de elegir y consumir los alimentos. Es por ello que la industria alimentaria, en su
afán de atender la demanda de los consumidores, ha recurrido a la tecnología para la
obtención de colorantes artificiales que con el transcurrir del tiempo demostraron ser nocivos
para la salud del ser humano.
Es así que, en un estudio efectuado por la Universidad de Southampton (McCann et al.,
2007), a solicitud de la FSA del Reino Unido (Food Standards Agency), se analizaron los
efectos de la mezcla de seis colorantes sintéticos con benzoato sódico (preservante) usados
generalmente en la elaboración de bebidas refrescantes y en otros productos consumidos por
niños, concluyendo que la hiperactividad infantil podría ser generada por el uso de este tipo
de componentes; razón por la cual hoy en día la industria a nivel mundial está incrementando
de manera progresiva el reemplazo de colorantes sintéticos por naturales en los alimentos.
A esto se le añade la creciente tendencia de consumo de productos naturales, siendo estos
los factores que incentivaron la búsqueda nuevas fuentes de colorantes (Carmona, 2013). Tal
es así que se ha identificado que muchas plantas comestibles, frutas y hortalizas contienen
pigmentos naturales llamados carotenoides y antocianinas, compuestos conocidos por su gran
actividad antioxidante, efectos anticancerígenos y preventivos de algunas enfermedades
(Castañeda Sanchez & J.A., 2015).
“En el Perú existe un gran número de variedades nativas de papa, que presentan una
enorme diversidad de características y se les conoce como recurso genético valioso”
(Egúsquiza, 2000). La papa nativa “Yawar Wayku” es una de las 4000 variedades de papas
producidas en nuestro país; este cultivar de pulpa de color rojo tiene un alto contenido de
2
compuestos fenólicos, presentando buena capacidad antioxidante (Fondazione Slow Food per
la Biodiversità Onlus, n.d.).
La presente investigación tiene como finalidad determinar las condiciones óptimas para el
proceso de extracción de antocianinas presentes en la variedad de papa nativa Yawar Wayku
(Solanum stenotomum), empleando el sistema de extracción sólido – liquido, para luego
evaluar su aplicación como colorante natural en alimentos, específicamente en yogur.
Problema de Investigación
Identificación de problema
En los últimos años se ha venido efectuando estudios sobre los efectos de los aditivos
alimentarios artificiales en la salud de los consumidores, y en particular los de los colorantes
sintéticos (Amchova, Kotolova, & Ruda-Kucerova, 2015). Uno de los principales efectos del
consumo de dichos colorantes puede ser observado en la modificación de la respuesta
conductual que causan en los niños; es así que en diversos estudios se ha encontrado que su
consumo se encuentra fuertemente relacionado con problemas de hiperactividad y déficit de
atención (Arnold, Lofthouse, & Hurt, 2012; McCann et al., 2007; Rojas & Chan, 2005). Por
este y entre otros motivos, en la actualidad, la industria a nivel mundial está incrementando de
manera progresiva el reemplazo de colorantes sintéticos por naturales en los alimentos
(Aberoumand, 2011).
Un ejemplo de colorantes naturales es el carmín que se extrae de la cochinilla (Dactylopius
coccus), presente en la industria bajo el rotulo de E120, pero también es uno de los colorantes
naturales de mayor costo en el mercado internacional (Parra Ortega, 2004). Una alternativa
3
para su uso en la industria alimentaria pueden ser las antocianinas, las cuales son pigmentos
que se encuentran naturalmente en frutas y vegetales, que pueden ser utilizados para la
elaboración de colorantes naturales con un amplio espectro de colores que abarcan
tonalidades rojas y moradas (Garzón, 2008), y poseen propiedades beneficiosas para la salud
(He & Giusti, 2010).
El Perú presenta una gran diversidad de especies tanto animales como vegetales, siendo los
recursos genéticos nativos, fuente de alrededor del 65% de la agricultura nacional (Brack-
Egg, 2003). Un cultivo nativo ejemplar es la papa, que a nivel nacional cuenta con más de
4000 variedades comestibles y que además mantiene una colección de más de 7000
accesiones de variedades nativas, silvestres y mejoradas en el Banco de germoplasma del
Centro Internacional de la Papa (CIP) (International Potato Center, 2018).
La papa en sus diferentes variedades ha sido desde los tiempos incaicos hasta la actualidad
uno de los principales cultivos, al ser una fuente de alimento y de sustento para la mayoría de
familias peruanas.
En el caso de las papas nativas, en los últimos años vienen mostrando un potencial notable
para su transformación primaria, siendo comercializadas en fresco o procesadas (frituras o
purés). Sin embargo, existe una ausencia considerable de oportunidades que no permiten
ofertar de manera sostenible muchas de las propiedades intrínsecas de este cultivo oriundo del
Perú (Repo-Carrasco, R., Cortez, G., Montes, R. O., & Villalpando, 1988). Las papas pueden
ser fuentes alternativas de antocianinas (Juli Mamani & Arias Jordan, 2011), la cual es una
característica importante que puede generar el aprovechamiento de esta materia prima que
actualmente no es explotada a nivel industrial, y conferirle valor agregado. Es la papa nativa
de pulpa roja, como la variedad Yawar Wayku, una buena alternativa como fuente de
4
antocianas al presentar una tonalidad roja y propiedades antioxidantes (Fonseca, Burgos,
Rodriguez, Muñoa, & Ordinola, 2014).
Formulación del problema
Problema General.
¿Cuáles son las condiciones óptimas de extracción de antocianinas a partir de papa nativa
y cuál es su potencial como colorante natural en yogur?
Problemas Específicos.
Problema específico 1:
¿Cuál es la proporción de materia prima / solvente óptima para la extracción de
antocianinas?
Problema específico 2:
¿Cuál es la temperatura óptima de extracción de antocianinas?
Problema específico 3:
¿Cuál es el pH óptimo de extracción de antocianinas?
Problema específico 4:
¿Cuál es el porcentaje óptimo de etanol empleado como solvente para la extracción de
antocianinas?
Problema específico 5:
¿Cuál es la diferencia entre el color del colorante obtenido y el color de los colorantes
comerciales aplicados al yogur?
5
Marco Referencial
Antecedentes
Durante los últimos años, se han realizado estudios tanto a nivel nacional como internacional
que proporcionan información útil para la presente investigación, algunos de los cuales serán
descritos a continuación:
Nacionales.
Elias Sansoni & Gamero Collado (1988) de la Universidad Nacional de Ingeniería en su
tesis titulada “Obtención de colorantes a partir de maíz morado”, tuvieron como objetivo
principal extraer e identificar las antocianinas presentes en la coronta del maíz morado,
tanto a nivel laboratorio como a nivel planta piloto. El procedimiento experimental tuvo
como etapa inicial la extracción de antocianinas, donde se emplearon dos métodos:
Extracción directa y Extracción Soxhlet, para el primero se usaron diferentes solventes;
agua, etanol y metanol para luego ser calentados a temperaturas de 100 °C, 80 °C y 0 °C, y
para el segundo el solvente fue un alcohol (metanol o etanol). Luego de extraído el
pigmento se procedió con la identificación de las antocianinas, a través de las técnicas de
cromatografía de papel y espectrofotometría. Al finalizar el estudio, concluyeron que para
la extracción del colorante es recomendable emplear soluciones ácidas en un rango de pH
entre 4 y 5 así como temperaturas inferiores a 100 °C para evitar degradaciones del
pigmento, también determinaron que el pico máximo de identificación de antocianinas
presentes en el maíz morado fue de 528 nm y que la antocianina presente en la materia
prima analizada fue la cianina.
López Guerra (2014) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima – Perú
en su tesis titulada “Extracción y actividad antioxidante del colorante natural de la pulpa
6
del fruto de Opuntia ficus-indica (tuna morada) y su aplicación en la crema chantilly",
tuvo como etapa inicial la recolección de materia prima originaria del Distrito de San Juan
Bautista, Huamanga – Ayacucho, para luego proceder con la preparación de la muestra:
pelado, cortado e inactivación enzimática. Como segunda etapa se realizó la extracción del
colorante natural empleando el método de extracción hidro-alcohólica, que consistió en
sumergir la muestra a una solución de ácido cítrico (0.2 %) y alcohol al 96% para un
posterior filtrado y concentrado del extracto. La actividad antioxidante se determinó por
dos métodos: método de actividad secuestradora del radical 1,1-Difenil-2-Picrilhidrazilo y
el método de per oxidación lipídica microsomal; adicionalmente se establecieron
parámetros de color, olor y sabor mediante escala ordinal para la evaluación sensorial. Al
finalizar la investigación, se obtuvo un colorante natural con un rendimiento de 16% de la
pulpa total, actividad antioxidante de 62,56% (DPPH) y con alto índice de aceptación
sensorial, concluyendo que los pigmentos del fruto de “tuna morada” tienen actividad
antioxidante y son aplicables en crema chantilly.
Diez Morales, López Medina, Zavaleta Salvatierra, Barrantes Rodríguez, & Huaynay
Viera (2013) en su investigación titulada “Cuantificación de los principios
anticancerígenos de la variedad de papa nativa de pulpa de color de la región la Libertad
con el fin de procesamiento industrial”, tuvieron como objetivo extraer y cuantificar los
elementos activos de diversas variedades de papa nativa. El proceso inició con la
recolección de materia prima proveniente de cuatro comunidades de La Libertad:
Huamachuco, Santiago de Chuco, Carabamba y Tallabamba, luego se prepararon las
muestras mediante procesos de liofilización y homogenización. Seguidamente se
extrajeron las antocianinas por el método de Youdim, McDonald, Kalt, & Joseph (2002)
que consistió en licuar la muestra junto con una combinación de metanol, agua y ácido
7
fórmico por 10 minutos, la mezcla obtenida se filtró para realizar la determinación de
antocianinas por el método de pH diferencial y finalmente se llevó a cabo la identificación
de antocianinas mediante espectrofotometría. Del estudio se determinó que la variedad de
papa “púrpura” (originaria de Huamachuco) presenta altas concentraciones de
pelargonidina, pigmento propio de las variedades de pulpa de color rojo, diferenciándose
de otras como la variedad “Mano de Oso” (nativa de Carabamba), cuya pulpa presenta un
color azulado y en donde se encontró significativa concentración de malvidina;
concluyendo así que las variedades estudiadas contienen antocianinas.
Rosillo Zevallos (2016) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, en su tesis
titulada “Estudio de los principios bioactivos y obtención de colorantes naturales de la
cáscara de “tuna” Opuntia ficus-indica (L.)” tuvo como finalidad estudiar la composición
química, cuantificar los elementos bioactivos y extraer los pigmentos presentes en la
cáscara de la tuna. La etapa inicial de la investigación fue la recolección de materia de
campo, originaria del distrito de San Bartolomé, Huarochiri – Lima, luego se realizó la
evaluación química bromatológica empleando métodos de la AOAC para analizar
parámetros como humedad, acidez total, proteínas cenizas, carbohidratos, azúcares
reductores, pH, minerales y grasas, posteriormente se evaluaron los compuestos
bioquímicos y como etapa final se cuantificaron betalaínas (pigmentos rojos) por el
método espectrofotométrico UV-visible, de las cuales 378 mg/L fueron betaxantinas y 637
mg/L fueron betacianinas, mientras que las antocianinas (pigmentos morados y rojos)
fueron obtenidas por el método de extracción de pH diferencial a través del cual no fueron
detectadas. Finalizado el estudio, se determinó que la cáscara de tuna contiene un colorante
natural que presenta una tonalidad roja intensa con pigmentos amarillos y anaranjados, y
que además cuenta con una buena estabilidad a un pH de 5 o 6.
8
Pérez Sauñi (2014) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos en su tesis
titulada “Utilización de la antocianina del maíz morado (Zea Mays L.) y stevia (Stevia
Rebaudiana Bertoni) en la elaboración de un producto tipo mermelada y su aceptabilidad”,
tuvo como objetivo extraer el pigmento natural presente en la coronta de maíz morado y
aplicarlo a un producto similar a la mermelada, de forma conjunta con la stevia. Su
investigación tuvo como primera fase la obtención de antocianina a través del método de
extracción por solvente, que consistió en sumergir la coronta el maíz en un medio ácido
para luego calentarlo a temperaturas entre los 100 y los 110 °C por 15 minutos. Posterior
al filtrado del colorante, se elaboró el producto tipo mermelada usando como aditivos
alimentarios, la antocianina (colorante) y stevia (edulcorante). Se concluye del estudio que
el producto a dos concentraciones de stevia (1.5 % y 2%) tuvo una aceptación en cuanto a
características organolépticas de 54% y 88 % respectivamente en una muestra de 64
personas, por otro lado se determinó que la concentración de las antocianinas obtenidas a
partir de 200 g. de coronta de maíz, se encuentra entre los valores de 14.8– 21.9 g/mL.
Internacionales.
Avendaño Prieto & Acevedo Buitrago (2014) en su investigación titulada “Proceso de
micro-encapsulación de colorantes naturales presentes en la fresa”, tuvieron como
finalidad evaluar la preservación de los pigmentos naturales de la fresa a través del proceso
de micro encapsulación. Inicialmente se realizó la extracción de los colorantes de la fresa
por dos métodos: osmodeshidratación y extracción Soxhlet. El primero consistió en
someter a la fruta a una inmersión en dos soluciones: una de etanol y otra de sacarosa por
24 horas; mientras que en el segundo se aplicó un tratamiento térmico a la materia prima
junto con el solvente (etanol), por dos horas. Luego de obtenidos los pigmentos, fueron
caracterizados fisicoquímicamente, analizando: el pH, densidad y sólidos solubles; para
9
luego evaluar su actividad antioxidante y determinar el contenido de fenoles totales. Como
etapa final se procedió con el secado por aspersión y micro encapsulación de los
pigmentos. Es así, que al finalizar el estudio se obtuvo un pigmento micro-encapsulado en
una solución de maltodextrina soluble en agua, que conserva su capacidad antioxidante y
sus propiedades de color.
Cacace & Mazza (2003), en su trabajo titulado “Optimización de la extracción de
antocianinas y compuestos fenólicos de grosellas negras usando etanol acuoso”, buscaron
evaluar la concentración de dos compuestos: polifenoles totales y antocianinas;
consideraron como variables independientes el porcentaje de etanol (solvente),
temperatura y proporción materia prima:solvente (MPS). Al finalizar la parte
experimental, obtuvieron resultados favorables cuando se empleó un 60% de etanol, un
MPS 1 Kg: 19 L de frutos y una temperatura de 30 °C. Por otro lado, se observó que con
un aumento de temperatura la extracción de fenoles no se vio afectada, pero que a su vez
se produjo una disminución del rendimiento de la extracción por la degradación de los
mismos. Adicionalmente, se pudo identificar la existencia de una temperatura crítica que
aumenta con el porcentaje de etanol, los parámetros fueron de 25 ºC a 20% de etanol, hasta
35 °C a 95% de etanol; observando además, que temperaturas mayores a 45 °C reducen de
manera significativa la concentración de antocianinas.
Cevallos-Casals & Cisneros-Zevallos (2004) del Departamento de Ciencias Hortícolas,
Texas A & M University, en su investigación titulada “Estabilidad de la antocianina en
extractos acuosos a base maíz morado andino y camote de pulpa roja comparados con
colorantes sintéticos y naturales”, tuvieron como finalidad extraer los pigmentos de dos
cultivos y evaluarlos a diferentes niveles de pH, temperatura y condiciones de luz para
10
luego compararlos con colorantes comerciales obtenidos de zanahoria morada, uva roja y
otros como rojo 40 y rojo 3. El estudio empleó como materia prima camote rojo liofilizado
(origen: Virú, Perú) y maíz morado (origen: California, Estados Unidos). La fase inicial
fue la preparación de los extractos que consistió en blanquearlos, homogeneizarlos,
filtrarlos y centrifugarlos, seguidamente se extrajeron los pigmentos antociánicos a través
del método de pH diferencial, para luego llevar a cabo los análisis cromatográficos y
espectrofotométricos. Finalmente, se evaluaron dichos pigmentos junto con los colorantes
sintéticos bajo diversas condiciones de luz, temperatura y pH. Al finalizar la investigación,
concluyeron que tanto el camote de pulpa roja como el colorante de zanahoria morada son
ricos en antocianinas aciladas (cianidina acilada y derivados de glucósido de peonidina)
mientras que el maíz morado y el colorante de uva roja contienen antocianinas no acilados
(cianidina 3-glucósido y pelargonidina-3-glucósido, peonidina-3-glucósido y sus derivados
respectivos). También determinaron que después de un almacenamiento a 20 °C por 138
días, la estabilidad de los extractos de antocianinas fue la siguiente: camote de pulpa roja>
zanahoria morada > maíz morado > uva roja.
Eichhorn & Winterhalter (2005) en su estudio titulada “Antocianinas de las variedades
pigmentadas de Papa (Solanum Tuberosum L.)”, tuvieron como objetivo aislar y
caracterizar cuatro variedades de papas conocidas como "Hermanns Blaue", "Highland
Borgoña rojo", "Shetland negro" y "Vitelotte”. Como primera etapa, se blanqueó la
materia prima con la finalidad de reducir las reacciones enzimáticas y evitar la degradación
de antocianinas. Posteriormente, se llevó a cabo la preparación de la muestra empleando el
método de extracción en fase sólida, se continuó con la extracción de los compuestos
antociánicos a través de dos tipos de cromatografía: contracorriente y cromatografía
líquida de alta presión (HPLC) preparativa. Como última etapa, se llevó a cabo la
11
identificación los compuestos a través de la cromatografía HPLC-DAD con LC-ESI-MS2.
Al concluir la investigación, determinaron que todas las variedades estudiadas presentan
pequeñas cantidades de petunidina (pigmento antociánico), excepto la papa “Highland
Borgoña Roja” en la que se encontró pelargonidina; mientras que en el cultivar “Vitelotte”
fue la malvidina el pigmento predominante. Por último, de los cuatro tipos de papas
analizadas la papa “Shetland Black” fue la única que contenía derivados de peonidina en
bajos niveles.
Fan, Han, Gu, & Chen (2008) en su estudio titulado “Optimización de las condiciones
para la extracción de antocianinas de camote morado utilizando la metodología de
superficie de respuesta (MSR)”, emplearon etanol como solvente de extracción acidificado
con ácido clorhídrico, teniendo como variables independientes: la temperatura, tiempo, y
la proporción materia prima:solvente, para poder evaluar el rendimiento de extracción de
antocianinas. Al aplicar la metodología de superficie de respuesta, obtuvieron como
resultados que la temperatura de extracción y la MPS aumentaron el rendimiento del
proceso extractivo; sin embargo, la variable tiempo no tuvo un efecto relevante.
Finalmente, las condiciones óptimas para la extracción de antocianinas fueron las
siguientes: 80 °C, 1:32 y 60 minutos.
Giusti & Wrolstad (2003) en su estudio titulado “Antocianinas aciladas de fuentes
comestibles y sus aplicaciones en sistemas alimentarios”, analizaron tanto las
características físico-químicas así como las posibles aplicaciones en alimentos de un
número de extractos de antocianinas aciladas obtenidos a partir frutos y vegetales. Esta
investigación surgió debido a la creciente demanda de colorantes alimentarios naturales,
donde las antocianinas representan una buena alternativa al ser compuestos con gran
12
capacidad antioxidante. El estudio se enfocó en las antocianinas presentes en rábanos,
papas rojas, col morada, zanahorias negras y batatas púrpuras. Como resultado de diversos
análisis se concluyó que la transformación que sufren las estructuras de las antocianinas se
debe a la variación del pH, por lo que recomiendan la aplicación de este pigmento en
alimentos ácidos, es decir con pH inferior a 3, asegurando así el predominio del catión
flavilio. Por otro lado, determinaron que la antocianina pelargonidina, presente en los
rábanos y las papas rojas, puede ser considerada como una potencial alternativa para la
elaboración de un colorante natural similar al rojo 40 (Rojo Allura). Así mismo,
mencionan que es posible aplicar este pigmento en productos lácteos, cuyo sistema es
considerado complicado debido al pH que fluctúa entre 4.2 – 4.5.
Truong, Hu, Thompson, Yencho, & Pecota (2012) realizaron un estudio titulado
“Extracción de líquido a presión y cuantificación de antocianinas en genotipos de camote
morado”, que tuvo como objetivo optimizar los parámetros de extracción de las
antocianinas contenidas en camote morado durante la aplicación del método de extracción
de líquido presurizado (PLE). La investigación inició con el cultivo de diversas variedades
de camote de pulpa de color amarilla, naranja, crema y morada. Luego se acondicionaron
las muestras: cortado y liofilizado, para pasar a la extracción de los pigmentos antociánicos
por dos métodos: Extracción de pigmentos convencionales y valor de color de los extractos
de Japón (JCV), y Extracción con líquidos presurizados (PLE). Al culminar el estudio
determinaron que los rendimientos más altos de antocianina se obtuvieron con mezcla de
ácido acético/metanol/agua para el método PLE, usando menos de 0.5 g de muestra inicial
a temperaturas entre 80 - 100 °C, encontrando pigmentos como la cianidina y peonidina;
concluyendo así que el contenido tipos de antocianinas es variable en los cultivares de
camote de pulpa de color analizados.
13
Estado del Arte
Menéndez (2008) de la Escuela Superior Politécnica del Litoral, Guayaquil – Ecuador, realizó
una tesis de grado titulada “Obtención de colorante para su uso en yogur a partir de la flor de
Jamaica (Hibiscus sabdariffa) y del mortiño (Vaccinium myttillus L.)”, la cual tuvo como
objetivo extraer los pigmentos presentes en dos frutos (flor de Jamaica y mortiño) y evaluar
su aplicación como colorante alimentario en el yogur. El estudio inició con la preparación de
la muestra a través de los procesos de selección de corte, molienda y liofilizado.
Posteriormente, se llevó a cabo la extracción de los colorantes por el método de extracción
por solventes, donde se empleó ácido cítrico y etanol en diferentes porcentajes. Una vez
obtenido el colorante, se filtró y concentró para que pueda ser aplicable al producto
alimenticio. Luego se procedió con la concentración del colorante por el método de pH
diferencial, para finalmente aplicar el colorante obtenido al yogur, el cual pasó luego por un
análisis sensorial entre 20 panelistas semientrenados. Como conclusión del estudio, se
determinó que el extracto de mortiño (blueberry andino) presenta un mayor contenido de
pigmentos antociánicos que el extracto de la flor de Jamaica, así mismo concluyeron que se
debe considerar la pureza del alcohol como factor influyente en la concentración del
colorante. Por último, concluyeron que el uso del colorante natural no genera una diferencia
de color frente al colorante sintético, siendo entonces una opción más saludable para la
industria de alimentos.
Zapata (2014) de la Universidad Politécnica de Valencia – España, desarrolló una tesis
titulada “Obtención de extracto de antocianinas a partir de arándanos para ser utilizado como
antioxidante y colorante en la industria alimentaria”, la cual tuvo como objetivo caracterizar
el proceso de extracción de antocianinas de arándanos y analizar su potencial uso como
14
antioxidante y colorante natural en alimentos. La etapa inicial del estudio consistió en la
determinación de la influencia de variables en el proceso de extracción de antocianinas.
Eligieron como variables la temperatura, el pH, el tiempo de extracción, el tipo de solvente y
la proporción de materia prima/solvente, evaluadas a través de dos métodos de extracción:
Sólido - Líquido y fermentación. Se llevaron a cabo diferentes tipos de diseños
experimentales con la finalidad de reducir el número de experimentos, donde se obtuvieron
los resultados finales modelizados por el método de superficie de respuesta. Del estudio se
concluye que los valores óptimos para las variables de proceso fueron: solvente extractor,
etanol acidificado (empleando ácido cítrico al 1%); MPS 1:3 kg/kg; temperatura de 36±1 ºC y
tiempo de extracción de 2 h. Con respecto al método de extracción, la extracción sólido
líquido fue con la que se logró un rendimiento con mayor estabilidad de las antocianinas. Es
necesario resaltar que el extracto obtenido pasó por una doble concentración para ser
impregnado al vacío en cubos de melón, comprobándose que el desarrollo tecnológico en
alimentos es posible.
Marco Teórico
Generalidades de la papa.
La papa (Solanum tuberosum) es una planta alimenticia que ha estado vinculada con las
culturas más remotas de la historia peruana. Los primeros habitantes del Perú
(cazadores, recolectores, nómades) colectaron tubérculos de especies silvestres que,
producto de una domesticación y selección lograron mejorar su calidad y actualmente
se encuentran ampliamente distribuidas en el territorio nacional (Egúsquiza, 2000).
Según Alvarez & Repo (1999) la papa, fue la base para la alimentación de la cultura
pre- inca e inca, y actualmente continua siendo uno de los principales cultivos del Perú,
15
tanto por las hectáreas sembradas como por la población dedicada a su cultivo (después
del maíz, la papa ocupa el segundo lugar en importancia).
Origen.
Desde tiempos remotos la papa tuvo un rol muy importante en Sudamérica y
particularmente en el Perú, siendo así que las teorías indican que este cultivo pudo
provenir de diferentes lugares. Según Hawkes (1990), la papa cultivada se originó en
zonas cercanas al Lago Titicaca, dado que esta región presenta una gran variedad de
papas y el número de especies es mayor que en cualquier otro lugar. Por otro lado
Ochoa & Frey (1999), sostienen que la papa se desarrolló en la región sur de Perú y
Bolivia.
Zonas de producción.
Egúsquiza (2000), indica que la altitud sobre el nivel del mar en la que son cultivadas
las papas determina las zonas de producción, clasificándose en tres (Tabla 1):
Tabla 1. Meses principales de siembra, cosecha y superficie cultivada en las zonas
de producción de papa (Egúsquiza, 2000).
16
Costa (500 a 0 m.s.n.m.): zona en la que el riesgo climático es muy bajo; los
productores usan semillas de sierra media o alta, emplean tecnología moderna y el
cultivo de papa es de poco riego, obteniendo una producción controlada.
Sierra Media (3000 a 500 m.s.n.m.): en esta zona existe un cierto riesgo
climático; los productores utilizan semillas de zonas más altas, la tecnología es
intermedia y el cultivo es supeditado a la presencia de lluvias y complementado
con sistema de riego bajo.
Sierra Alta (4000 a 3000 m.s.n.m.): zona en la que el cultivo de papa es de alto
riesgo de acuerdo a la altitud de siembra; los productores usan semilla local o de
zonas aún más altas, la tecnología es tradicional o intermedia y la producción
depende de la cantidad y la temporalidad de las lluvias.
Usos.
De acuerdo con la FAO (2008), la papa después de ser cosechada presenta dos fines:
- Alimentarios: Consumo en fresco (horneadas, cocidas, fritas o hervidas) que
representa menos del 50 % de la producción mundial, con el resto se elaboran
alimentos e ingredientes alimentarios industriales, piensos para el ganado
bovino, porcino y las aves de corral, almidón y tubérculos semilla para las
posteriores cosechas.
- No alimentarios: una vez obtenido el almidón de la papa también es utilizado en
la industria farmacéutica, textil, de la madera y del papel. La cáscara y otros
deshechos “sin valor” de la papa son licuados para obtener etanol apto para la
producción de combustibles.
17
Variedades.
De acuerdo a los últimos estudios, las papas de mayor calidad son aquellas que se
producen sobre los 3,000 m.s.n.m. (Rojas Calderón, 2014).
Según Egúsquiza (2000), este cultivo se clasifica por su origen en variedades nativas
y modernas, estimando que en el Perú existen más de tres mil variedades de papas
nativas o criollas. Preferentemente las papas nativas no pueden ser cultivadas fuera de
los Andes peruanos, porque requieren particulares condiciones climáticas y
agroecológicas.
Entre las características más importantes presentes en las papas nativas se encuentran
la resistencia a plagas y enfermedades, valor nutritivo, gusto y adaptación a condiciones
climáticas extremas.(La papa nuestra de cada día, 2011).
Papa Nativa “Yawar Wayku” y su potencial uso como fuente de antocianinas
Descripción.
De acuerdo a la Fondazione Slow Food per la Biodiversità Onlus (n.d.), la papa
Yawar Wayku es una variedad de papa nativa que proviene del Departamento de
Andahuaylas, Apurímac. Junto con otras variedades autóctonas de dichas zonas,
Yawar Wayku es uno de los cultivos más importantes para los pequeños agricultores.
El color de pulpa de esta variedad de papa se refiere a la palabra quechua
"yawar", que significa sangre.
18
Ubicación taxonómica.
Reino : Plantae
División : Magoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Asteridae
Orden : Solanales
Familia : Solanáceas
Género : Solanum
Especie : stenotomum
Caracterización morfológica.
Según el Catalogo de Variedades de Papa Nativa (Fonseca et al., 2014), la papa
Yawar Wayku presenta las siguientes características morfológicas:
- Hábito de crecimiento : Tallo decumbente
- Color de flor : Blanco y amarillo pálido con pistilo amarillo.
- Forma de flor : Estrella.
- Forma de tubérculo : Oblongo
- Profundidad de ojo : Medio
- Color de piel : Rojo – morado
- Color de pulpa : Violeta (como la remolacha)
19
Figura 1. Papa Yawar Wayku (Solanum Stenotomum)
Figura 2. Flor de la papa Yawar Wayku (Solanum Stenotomum)
Caracterización nutricional.
Tabla 2. Contenido nutricional de la papa “Yawar Wayku”
Fuente: Fonseca et al. (2014)
Además de vitaminas y minerales, este tubérculo presenta un buen contenido de
compuestos fenólicos y alta capacidad antioxidante (Fonseca et al., 2014).
20
Condiciones de cultivo.
Este tubérculo se cultiva en áreas menores a una hectárea, es decir en pequeñas
parcelas ubicadas en altitudes entre los 3400 y 4200 metros sobre el nivel del mar
(Fondazione Slow Food per la Biodiversità Onlus, n.d.)
La papa Yawar Wayku, por no ser un cultivo de alto consumo, en su sembrado es
combinada con otros tubérculos como la oca, olluco y mashua. (Fondazione Slow
Food per la Biodiversità Onlus, n.d.).
Usos.
Según la Fondazione Slow Food per la Biodiversità Onlus (n.d.) un gran porcentaje
de la producción está destinada para el autoconsumo y el resto es intercambiado
entre las comunidades campesinas aledañas. Así mismo, señalan que la papa Yawar
Wayku tiene una consistencia harinosa ideal para la cocción, también es utilizada en
la gastronomía peruana para la preparación de guisos.
Colorantes usados en la industria alimentaria.
La cantidad de colorantes sintéticos permitidos por las instancias gubernamentales en el
mundo ha ido decreciendo en los últimos años, esto debido a la preferencia de los
consumidores por productos de origen natural y el continuo aumento de la disposición de
pigmentos naturales para alimentos (Parra Ortega, 2004). Adicionalmente, se observa un
mayor interés en los efectos que los atributos de los aditivos alimentarios en general y de
los colorantes en particular, tienen para su salud (Carmona, 2013).
21
Pigmentos sintéticos.
Los colorantes sintéticos que se utilizan en los alimentos deben poseer ciertas
características básicas a fin de prevenir riesgos para la salud de los consumidores y
garantizar su utilidad (Sánchez Juan, 2013). Entre las más importantes están su
inocuidad, pureza química, alto poder tintóreo, facilidad de incorporación al alimento,
estabilidad a la luz, al calor y a los cambios de acidez y alcalinidad, compatibilidad con
los productos que van a pigmentar, no conferir olores ni sabores desagradables para no
alterar las características del alimento que colorean y tener bajo costo.
Debido a los riesgos derivados del consumo de aditivos sintéticos, se ha legislado su
uso respecto a la posible toxicidad de los pigmentos. La Unión Europea elaboró una
lista que comprende 42 materiales pigmentantes diferentes para su uso en alimentos, de
los cuales 15 son sintéticos de tipo orgánico; los demás son naturales o idénticos a ellos
(Lock Sing de Ugaz, 1997).
Pigmentos naturales.
Los colorantes naturales que más se emplean en los alimentos a nivel mundial son el
color caramelo, el anato (bixina y norvixina), las antocianinas de diversas fuentes, el
betabel (betalaínas y vulgaxantinas), la curcumina (resina turmérica) y la cochinilla
(carmín y ácido carmínico), etc. (Francis & Markakis, 1989). A nivel mundial, los
pigmentos naturales gozan de mayor aceptación que los sintéticos, aunque el principal
reto en su desarrollo es obtener la estabilidad de color y variedad de tonalidad que se
obtienen con los pigmentos sintéticos (Lock Sing de Ugaz, 1997). Un ejemplo de
pigmentos naturales es la antocianina, la cual posee un gran potencial para el reemplazo
de colorantes sintéticos por ser capaz de proporcionar una amplia gama de colores que
22
abarcan desde el rojo hasta el azul, entre otras características convenientes para la
industria (Garzón, 2008).
Antocianinas.
La antocianina es un compuesto fenólico perteneciente a la subcategoría de los
flavonoides. Este pigmento se encuentra altamente distribuido en la naturaleza,
confiriéndole a los vegetales una amplia gama de colores que van desde el azul,
púrpura, violeta, magenta y rojo, hasta el amarillo (Fennema, 2000). Poseen una
estructura adecuada que les permite actuar como antioxidantes, contando con la
capacidad de donar hidrógenos o electrones a los radicales libres, debido a que la carga
negativa resultante de dicha pérdida puede deslocalizarse en la estructura aromática
(Ramirez-Tortosa et al., 2001).
Estructura.
Las antocianinas son glucósidos de antocianidinas pertenecientes al grupo de los
compuestos fenólicos conocidos como flavonoides por su característico esqueleto
carbonado C6C3C6, el color de cada compuesto depende de la presencia y número de
restos unidos a dicha estructura (Fennema, 2000). Constan de una estructura básica
de sal flavilio conocida en la química orgánica como 2-fenilbenzopirilo (Wong,
1995).
23
Figura 3. Estructura básica de la antocianina (Fennema, 1996).
Se diferencian entre sí por el número de grupos hidroxilo y/o metoxilo presentes,
por el tipo, número y puntos de unión de azucares en la molécula, y por el tipo y
número de ácidos alifáticos o aromáticos que están unidos a estos azúcares. Entre los
azúcares que frecuentemente están presentes en su estructura se encuentran la
glucosa, ramnosa, galactosa, arabinosa, xilosa, y los disacáridos y trisacáridos
homogéneos o heterogéneos formados como glicósidos de estos azúcares.
Figura 4. (a) Estructura básica de las antocianidinas (Wrolstad y Durst,
2004) (b) Estructura de los monosacáridos más comunes encontrados en las
estructuras de las antocianinas (Boulton, 2001).
24
Factores que influyen en la degradación de las antocianinas.
Estructura y pH: Los grupos hidroxilo, metoxilo, glucósidos y acilos de las
antocianinas son susceptibles a modificaciones estructurales por cambios de pH,
lo que afecta su estabilidad (Francis & Markakis, 1989; Rodriguez-Saona &
Wrolstad, 2001).
La velocidad de degradación presenta amplias variaciones entre las
antocianinas según su estructura, y estas pueden encontrarse en diferentes formas
químicas dependiendo del pH. A pH 1 hay predominancia del catión flavilio que
presenta color rojo y es la más estable de las antocianinas; a valores de pH entre 2
y 4 ocurre la pérdida de un protón y adición de agua, encontrándose las
antocianinas preferentemente bajo las formas quinoidales de color azul; A pH
entre 5 y 6 se aprecian las especies pseudobase carbinol y chalconas, que son
incoloras y de tonalidad amarilla respectivamente, siendo ambas muy inestables.
Por otro lado, cuando el pH se encuentra por encima de 7 la antocianina se
degrada rápidamente por oxidación con el aire (Moldovan, David, Chisbora, &
Cimpoiu, 2012; Castañeda-Ovando, Pacheco-Hernández, Páez-Hernández,
Rodríguez, & Galán-Vidal, 2009; Garzón, 2008a).
Luiz Bordignon Jr, Francescatto, Augusto Nienow, Calvete, & Henrique
Regginatto (2009) estudiaron la extracción de antocianinas en frutas en el rango
de pH de 1.0 a 13.0 y obtuvo una mejor extracción al valor más bajo de pH.
Adicionalmente, en el estudio de cinética de degradación de antocianinas
realizado por Moldovan, David, Chisbora, & Cimpoiu (2012) se obtuvo menor
degradación con el valor más bajo de pH también. De modo que, la acidez tiene
un efecto protector sobre la estructura de las antocianinas, cuanto más elevado es
25
el pH aparecen estructuras inestables que se degradan con rapidez. Es por eso que
la aplicación de antocianinas en el rubro alimentario se da mayormente en
productos de baja acidez (Aguilera-Ortíz, Reza-Vargas, Chew-Madinaveita, &
Meza-Velázquez, 2011)
Temperatura: es otro de los factores críticos que influyen en la degradación de
antocianinas (Su & Chien, 2007). Los cambios estructurales en las antocianinas se
dan por reacciones endotérmicas. Tienen resistencia a procesos térmicos a altas
temperaturas durante cortos periodos de tiempo; sin embargo, se degradan a
temperaturas por encima de los 60°C. Las antocianinas altamente hidroxiladas son
térmicamente menos estables que las metiladas, glicosidadas o acetiladas
(Fennema, 2000). Por otro lado, incrementos de temperatura provocan pérdidas
del azúcar glicosilante y la apertura del anillo en su estructura, resultando en la
formación de chalconas incoloras (Garzón, 2008).
Por lo tanto, temperaturas más elevadas provocan un efecto adverso sobre la
estructura de las antocianinas, especialmente durante un tratamiento térmico o
durante el almacenamiento. Sin embargo, durante la etapa de extracción de
determinados productos, se obtienen mejores rendimientos a temperaturas altas
(L. M. Zapata, 2014).
Agua: El agua actúa como nucleófilo y ataca al catión flavilio formando la base
carbinol incolora; sin embargo, la degradación varía dependiendo de la
concentración de azucares o con la copigmentación. A altas concentraciones de
azúcares la actividad de agua es baja y las moléculas tienen menores posibilidades
de formar la base carbinol. Por otro lado, a bajas concentraciones de azúcares la
actividad de agua no se ve reducida, por lo tanto los productos de degradación
26
(hidroximetilfurfural y furfural) aceleran la degradación de las antocianinas
(Kopjar & Piližota, 2009; Lewis, Walker, & Lancaster, 1995). Por ello es
conveniente eliminarla después de realizada la extracción mediante un proceso de
concentración del extracto.
Oxigeno: Las antocianinas se oxidan por reacción directa con oxígeno o de
manera indirecta al reaccionar con compuestos que han sido oxidados
previamente, resultando en la formación de productos amarronados o incoloros.
Adicionalmente, pueden reaccionar con radicales de oxigeno cumpliendo la
función de antioxidantes, reacción que se ve favorecida con los aumentos de
temperatura (Rein, 2005).
También se observó que el ácido ascórbico reacciona con las antocianinas en
presencia de oxígeno, formando peróxido de hidrogeno y produciendo ésteres
incoloros y derivados de la cumarina, reacción que se cataliza con la presencia de
cobre y se inhibe con la de flavonoles (Fennema, 2000). Este efecto del ácido
ascórbico sobre la estabilidad de la antocianina es explicado como una reacción
de condensación entre el ácido y los pigmentos (Garzón, 2008). Por ello los
diversos métodos donde hay eliminación del oxígeno, como el envasado al vacío,
muestran prevalencia de color (Fennema, 2000).
Enzimas: Se ha atribuido la pérdida de antocianinas en fruta a la actividad
enzimática de la antocianasa y fenolasa (Van Buren, Scheiner, & Wagenknecht,
1960). Por un lado, la antocianasa hidroliza el azúcar adherido en la posición 3
del grupo fenólico de las antocianinas, liberando los azúcares y produciendo
agliconas inestables. Por otro lado, la polifenoloxidasa, contribuye a la
degradación de la antocianina a través de la oxidación acoplada. Ya que se tratan
27
de compuestos polifenólicos, es de esperar que resulten afectados por la
polifenoloxidasa; sin embargo, no se ha definido la existencia de enzimas
específicas oxidantes de las antocianinas, pero se ha demostrado que las
peroxidasas actúan sobre las antocianinas decolorándolas rápidamente en
presencia de catecol, por la acción de este último como intermediario (Yufera,
1979).
Luz: es un factor que acelera la degradación de las antocianinas. Se ha observado
que la sustitución del grupo hidroxilo en el C-5 hace que la antocianina sea más
susceptible a la fotodegradación cuando ésta se presenta con flavonas
polihidroxiladas, isoflavonas y auronas sulfonadas (Delgado-Vargas, Jiménez,
Paredes-López, & Francis, 2000). Por lo tanto, es importante proteger de la luz a
los productos ricos en antocianinas.
Factores que influyen en la estabilidad de las antocianinas.
Copigmentación: Las formas coloreadas de las antocianinas pueden ser estabilizadas
por interacción con otros compuestos llamados copigmentos, los mismos que están
presentes en las células de las flores y frutas (Rein, 2005). Los copigmentos pueden
ser flavonoides, polifenoles, alcaloides, aminoácidos, ácidos orgánicos, grupos acilo
aromáticos, entre otros (Sari, Wijaya, Sajuthi, & Supratman, 2012; Lewis et al.,
1995). Este mecanismo se da en un rango de pH ácido (Mazza, 1995), pudiendo
ocurrir cuatro fenómenos: copigmentación intermolecular, copigmentación
intramolecular, autoasociación y formación de complejos de metales.
28
La copigmentación se puede observar como un cambio batocrómico, que consiste
en un desplazamiento de la longitud de onda de máxima absorción en el rango
visible hacia una mayor longitud de onda, conocido también como “efecto de
azulado”, tornando la antocianina de rojo a tonalidades azules. Contrariamente,
también se puede observar la copigmentación como un efecto hipercrómico, donde la
intensidad de color de la antocianina es reforzada por este fenómeno. Por lo tanto, es
recomendable buscar alternativas de copigmentación y evitar así el ataque
nucleofílico del agua al catión flavilio, impidiendo la decoloración de los pigmentos
antociánicos (Rein, 2005). Entonces, como alternativas, se puede mantener altas
concentraciones de antocianinas, incitando la autoasociación; o de lo contrario,
incorporar un compuesto que cumpla la función de copigmento.
Extracción sólido – líquido.
La extracción sólido – líquido es un proceso que tiene como fin separar determinados
componentes presentes en una fase sólida, empleando una fase líquida o disolvente.
Estos componentes reciben el nombre de solutos y aquellos insolubles son denominados
inertes.
Este procedimiento es nombrado de diversas formas dependiendo la finalidad del
proceso, pudiendo ser una etapa de lavado, percolación, maceración, etc. En la industria
alimentaria muchos compuestos son separados de su fuente natural original por medio
de estos procesos (Geankoplis, 1983).
El soluto se encuentra en el sólido inerte de diferentes formas, ya sea disperso en
material insoluble, recubriendo una superficie, adherido o retenido en el sólido o
contenido en su estructura molecular (Ibarz Ribas & Barbosa Cánovas, 2005). En el
29
caso de las antocianinas, están contenidas en las vacuolas de las células de frutas y
vegetales (Leguizamón et al., 2005; Wagner, 1982).
La extracción se puede llevar a cabo en una o múltiples etapas. Se define a la etapa
como una unidad de equipo en donde se ponen en contacto las fases durante un tiempo
determinado, mientras que ocurre la transferencia de materia entre los componentes de
las fases hasta alcanzar un equilibrio, momento en el cual la disolución adherida al
residuo está presente en la misma concentración que en el flujo líquido (Brennan,
1996). Una vez alcanzado el equilibrio se procede a la separación mecánica de las fases.
En lo que respecta al mecanismo de extracción de un soluto contenido en una
partícula sólida, se pueden considerar tres etapas consecutivas hasta alcanzar el
equilibrio (Ibarz Ribas & Barbosa Cánovas, 2005): La transferencia del solvente desde
el seno de la solución extractiva hacia dentro del sólido, la difusión del soluto hacia el
disolvente contenido en los poros del sólido y la transferencia del soluto desde las
partículas del sólido hasta el seno de la disolución.
Factores que influyen en el proceso de extracción.
Tamaño de partícula.
La reducción del tamaño facilita la extracción de un constituyente deseado contenido
en una estructura compuesta (Brennan, 1996). Por ello, para obtener una buena
difusión del soluto en el solvente es necesario determinar el grado de molienda o
fineza del producto. Es así que, cuanto más pequeñas son las partículas, mayor es el
área interfacial entre el sólido y el líquido. Sin embargo, tamaños de partícula
demasiado finos dificultan la extracción debido a que en algunos casos se impide la
libre circulación del líquido, la separación de las partículas del líquido, y el drenaje
30
del solido residual resulta más difícil, considerando también que en algunas
ocasiones la ruptura de las células deja en libertad materiales indeseables.
Temperatura de extracción.
Una mayor temperatura de extracción facilita el pasaje de agua a través de las
membranas semipermeables de las células vegetales. La temperatura debe ser lo
suficientemente alta de manera que permita la buena solubilidad del pigmento, sin
llegar al extremo de hidrolizarlo o solubilizarlo, ya que, como diversos estudios
sobre la estabilidad de antocianinas evidencian, son fácilmente degradadas a
temperaturas altas.
Agitación del fluido.
Incrementa la difusión y transferencia del soluto desde la superficie de las partículas
hasta a la solución. (R. Zapata, 1978) indica que la agitación debe tener una
velocidad adecuada considerando que: una velocidad alta permite un proceso de
mezcla más rápido y una velocidad baja requiere de baja potencia.
Tiempo de extracción.
El tiempo de extracción está en función inversa a los factores de temperatura y
agitación. Generalmente se emplea un tiempo suficiente que permita lograr un buen
contacto del sólido con el solvente.
Proporción de solido-liquido.
Es necesario encontrar un equilibrio entre el solvente y la materia prima a extraer, el
cual ocurre cuando el soluto se disuelve totalmente y la concentración de la solución
que se forma es uniforme (Revilla, Ryan, & Martin-Ortega, 1998). Una proporción
de solvente alta dará lugar a extractos demasiados diluidos; por el contrario, si es
muy baja no habrá buena difusión.
31
Número de lavados.
Es necesario determinar el número de lavados al que será sometida la materia prima
para obtener un extracto con un grado de concentración lo suficientemente alto y a la
vez tratar de agotar completamente el soluto (R. Zapata, 1978).
Solvente utilizado.
Diversos solventes son utilizados para la extracción de antocianinas, entre ellos:
acetona, agua, etilenglicol, propilenglicol, metil etil cetona, isopropanol, metanol y
etanol, siendo los dos últimos más efectivos que el resto (Revilla et al., 1998). La
acetona es un solvente efectivo pero aparentemente deteriora los pigmentos durante
un contacto prolongado; en cuanto al agua, es económicamente conveniente pero
menos efectiva como solvente de extracción (Chiriboga & Francis, 1973). Es
necesario incluir en el solvente ácidos orgánicos e inorgánicos debido a la
estabilidad que presentan las antocianinas a pH ácido, demostrándose en estudios
previos que el HCl estabiliza los pigmentos (Fuleki & Francis, 1968).
Extracción de antocianinas.
Las antocianinas pueden ser obtenidas a partir de diversas fuentes vegetales (Francis &
Markakis, 1989; Skrede, Wrolstad, & Durst, 2000). El tipo de extracción mayormente
utilizado es la extracción solido-liquido, existiendo otras metodologías como la
fermentación de las matrices que las contienen (Fan et al., 2008). Rodriguez-Saona &
Wrolstad (2001) indican que las antocianinas son solubles en diversos solventes, como
agua, alcohol y acetona, debido a la estructura polar que presentan.
La extracción de antocianinas es comúnmente llevada a cabo con metanol o etanol
conteniendo una pequeña cantidad de ácido (15%, HCl 1M) con el objetivo de obtener
32
la forma del catión flavilio, el cual es estable en un medio altamente ácido. No se ha
encontrado diferencia significativa en lecturas de absorbancia o eficiencia de extracción
entre ambos alcoholes (Abdel-Aal & Hucl, 1999). El método de extracción a emplear
debe considerar los factores involucrados en la estabilidad y aquellos que influyen en la
degradación de la antocianina, procurando maximizar la extracción de pigmentos y
minimizar la adhesión de compuestos que alteren el estado natural del extracto (Kalt,
Forney, Martin, & Prior, 1999).
El ácido puede causar hidrólisis parcial de los grupos acilo en las antocianinas
aciladas, especialmente en aquellas con ácidos dicarboxílicos tales como ácido
malónico, por lo que es preferible el uso de ácidos débiles tales como ácido tartárico o
cítrico, para mantener los sustituyentes dicarboxílicos intactos (Castañeda-Ovando et
al., 2009;(Escribano-Bailón, Alcalde-Eon, Muñoz, Rivas-Gonzalo, & Santos-Buelga,
2004).
Determinación de las condiciones de extracción de las antocianinas.
Diversos autores proponen la metodología de superficie de respuesta (MSR)
como técnica ideal para modelar y optimizar procesos de extracción. La MSR es una
estrategia experimental que busca resolver las condiciones de operación óptimas de
un proceso, es decir aquellas que dan por resultado “valores óptimos” (Gutiérrez-
Pulido & De la Vara-Salazar, 2008). Para ello, primero es importante seleccionar las
variables independientes a estudiar, la variable respuesta a medir y definir el diseño y
la región experimental para cada variable independiente, obteniendo así una serie de
condiciones experimentales a las que se deberá realizar la determinación de AT.
Luego de realizadas las mediciones, los resultados pasarán a través de un ajuste
33
matemático para determinar la superficie que mejor se ajuste a ellos, a partir de la
cual se obtendrá el punto óptimo (en términos de las variables independientes) que
maximice la variable respuesta (Bezerra, Santelli, Oliveira, Villar, & Escaleira,
2008).
Métodos de extracción de antocianinas.
Extracción por maceración
Es una extracción sencilla donde se somete únicamente a la disolución del soluto en
un solvente, dejando reposar hasta que el solvente penetre en la estructura celular, lo
ablande y disuelva la porciones solubles, controlando convenientemente la
temperatura y tiempo de extracción. Kalt, Forney, Martin, & Prior, (1999)
recomienda una temperatura de 15-20°C para la maceración; por otro lado, si el
tiempo de extracción es prolongado es recomendable usar conservadores para evitar
alteraciones microbianas (Yufera, 1979). La ventaja de esta extracción es que
produce un extracto de concentración uniforme, pero resulta laborioso y requiere de
prolongados tiempos de extracción para conseguir mejores rendimientos.
En este tipo de extracción se consideran de influencia los siguientes aspectos:
tiempo de maceración, relación materia prima/ solvente de extracción, ácido,
concentración del ácido y temperatura de maceración.
Extracción por el método de agitación mecánica o difusión.
La extracción consiste en colocar la muestra con el solvente elegido en un vaso de
precipitado y mediante un agitador mecánico se pone en contacto el solvente con la
materia prima para obtener el colorante deseado (Cabezudo, 1973; R. Zapata, 1978).
34
Extracción por cocciones.
En este tipo de extracción, los cocimientos vienen a ser preparados líquidos que se
obtuvieron hirviendo las sustancias vegetales con agua Kalt, Forney, Martin, &
Prior, (1999). La muestra se coloca en un recipiente de vidrio, se agrega el solvente y
se somete a ebullición por diferentes tiempos. La temperatura de extracción debe ser
tal que no afecte a la estructura del colorante (Yufera, 1979). En este método de
extracción se consideran de influencia los siguientes aspectos: el número de etapas
de extracción, el tiempo y temperatura de calentamiento en la extracción.
Lixiviación.
En este método de extracción, la mezcla o una fase solida se descompone en sus
componentes, o en la que un componente valioso se quita y se recupera de una masa
sólida mediante el tratamiento por un líquido. El sólido suele ser una mezcla
heterogénea de varios constituyentes, pudiendo ser líquidos o sólidos en disolución,
o también puede ser una mezcla homogénea tal como una solución sólida. Se
requiere desintegrar el sólido para formar una gran superficie de contacto con el
disolvente. Una de las más importantes operaciones de lixiviación es la eliminación
del componente soluble del interior del solido inerte efectuado por un proceso lento
de difusión a través de una membrana vegetal o animal.
35
Objetivos
Objetivo General
Determinar las condiciones óptimas de extracción de antocianinas a partir de papa nativa y
evaluar su uso potencial como colorante natural en yogur.
Objetivos Específicos
Objetivo específico 1:
Establecer la proporción materia prima / solvente óptima para la extracción de antocianinas.
Objetivo específico 2:
Definir la temperatura óptima de extracción de antocianinas.
Objetivo específico 3:
Determinar el pH óptimo de extracción de antocianinas.
Objetivo específico 4:
Establecer el porcentaje óptimo de etanol empleado como solvente para la extracción de
antocianinas.
Objetivo específico 5:
Evaluar la diferencia entre el color del colorante obtenido y el color de los colorantes
comerciales aplicados en yogur.
36
Justificación
Teórica
La presente investigación servirá como fuente de información para la industria de colorantes
naturales que en la actualidad se encuentra en crecimiento, aportando a la misma una nueva
alternativa de materia prima oriunda de nuestro país que sirva como fuente potencial de
antocianinas, situando a su vez a estas como pigmentos empleables para la elaboración de
colorantes naturales. Teniendo en consideración las propiedades anticancerígenas que le
confiere su alto contenido de antioxidantes, la industria contará con un colorante que satisfaga
la necesidad de color, pero adicionalmente que añada un valor nutritivo a los productos
alimenticios aplicados.
Por otro lado, se aportará información importante a nivel laboratorio sobre el proceso de
obtención de antocianinas por el método de extracción sólido - líquido, así como una
posterior determinación de antocianinas por pH diferencial; de manera que se pueda replicar
el proceso a nivel industrial.
Práctica
Mediante la caracterización fisicoquímica del colorante final extraído y, a través de una
comparación con los colorantes sintéticos mayormente aplicados en el yogur, podremos
definir en cuanto a unidades de color y tonalidades a los pigmentos naturales presentes en la
variedad de papa de pulpa de color roja, como una opción más saludable para ser utilizada en
este producto altamente consumido.
37
Social
Actualmente existe una tendencia de consumo productos saludables, surgiendo una
preferencia por el uso de colorantes y pigmentos naturales, debido a la asociación de los
sintéticos con problemas de salud. El yogur es un producto muy consumido, por lo que al
emplear insumos naturales en este caso un colorante, se mejorará la calidad nutritiva del
mismo brindando beneficios a la salud de los consumidores.
Así mismo, la industrialización de este producto impactaría positivamente en la economía
de las familias rurales que se dedican al cultivo de papas nativas, ya que la demanda se
incrementaría de acuerdo a la necesidad en cuanto a volumen de materia prima que una
producción de este tipo requiere, generando a su vez que las empresas del rubro ofrezcan
mayor pago por este tubérculo.
Hipótesis
Hipótesis General
Hi: Mediante la aplicación del método de superficie de respuesta, es posible determinar las
condiciones óptimas para la obtención de antocianinas a partir de papa nativa, para la
elaboración de un colorante aplicable al yogur.
Ho: Mediante la aplicación del método de superficie de respuesta, no es posible determinar
las condiciones óptimas para la obtención de antocianinas a partir de papa nativa, para la
elaboración de un colorante aplicable al yogur.
38
Hipótesis Específicas
Hipótesis Específica 1:
Hi: Es posible establecer la proporción materia prima / solvente óptima para lograr la
extracción de antocianinas.
Ho: No es posible establecer la proporción materia prima / solvente óptima para lograr la
extracción de antocianinas.
Hipótesis Específica 2:
Hi: Es posible definir la temperatura óptima para lograr la extracción de antocianinas.
Ho: No es posible definir la temperatura óptima para lograr la extracción de antocianinas.
Hipótesis Específica 3:
Hi: Es posible determinar el pH óptimo para lograr la extracción de antocianinas.
Ho: No posible determinar el pH óptimo para lograr la extracción de antocianinas.
Hipótesis Específica 4:
Hi: Existe una diferencia en la aplicación del colorante obtenido y los colorantes aplicados en
yogur.
Ho: No existe una diferencia en la aplicación del colorante obtenido y los colorantes
aplicados en yogur.
Matriz de Consistencia
Ver Anexo 1
39
Marco Metodológico
Metodología
El presente estudio empleó una metodología de investigación cuantitativa. Según Hueso
Gonzáles & Cascant i Sempere (2012), esta metodología se basa en el uso de técnicas
estadísticas para conocer los aspectos más importantes de la población que está siendo
estudiada.
“La investigación cuantitativa en su forma ideal parte de los cuerpos teóricos aceptados
por la comunidad científica, que permiten formular hipótesis sobre relaciones esperadas entre
las variables que hacen parte del problema que se estudia. Continúa con el proceso de
recolección de información con base en conceptos empíricos medibles, derivados de los
conceptos teóricos con los que se construyen las hipótesis conceptuales; una vez concluida
esta etapa se proceden a analizar los datos, presentar los resultados y determina si el grado de
significación de las relaciones estipuladas” (Bonilla, Castro, & Rodríguez, 2005).
Paradigma
El estudio utilizó una metodología de investigación cuantitativa con un paradigma positivista.
De acuerdo con (Bonilla et al., 2005), la investigación cuantitativa se inspira en el
positivismo, ya que este tipo de enfoque plantea la unidad de la ciencia, es decir, la utilización
de una metodología única que es la misma de las ciencias exactas y naturales.
“Lo que importa para el positivismo es la cuantificación. Cuando se cuantifican y se miden
una serie de repeticiones, se logran formular tendencias, plantear nuevas hipótesis y construir
teorías. La estadística es una manera de poder cuantificar todo, sin tener que contar cada uno
40
de los elementos que componen el todo: es la metodología más idónea y coherente de este
paradigma positivista” (Orozco Gómez, 1997).
Enfoque
Para el desarrollo de la investigación se aplicó un enfoque cuantitativo. Según Hernández
Sampieri, Férnandez Collado, & Baptista Lucio (2014), el enfoque cuantitativo es secuencial
y probatorio, usa la recolección de datos para probar una hipótesis con base en la medición
numérica y el análisis estadístico, con la finalidad de establecer pautas de comportamiento y
probar teorías.
Método
Se utilizó el método experimental. “En este método el investigador controla las variables para
delimitar relaciones entre ellas; se recopilan datos para comparar las mediciones de
comportamiento de un grupo control, con las mediciones de un grupo experimental” (Zazzo,
1992).
Variables
“Una variable es una propiedad que puede variar y cuya variación es susceptible de medirse u
observarse” (Hernández Sampieri et al., 2014).
41
Variable Independiente
En el presente estudio trabajaremos con cuatro variables independientes (temperatura,
proporción materia prima/solvente, pH y porcentaje de etanol) que influyen directamente en
el proceso de extracción de antocianinas y consecuentemente en el color y contenido final de
las mismas.
Variable Dependiente
El contenido total de antocianinas es la variable que depende de los parámetros establecidos
por las variables independientes que intervienen en el proceso de extracción de antocianinas.
Tabla 3. Variables independientes y dependientes.
Materiales y Métodos
Lugar de ejecución
La parte experimental de la investigación (extracción de antocianinas, análisis fisicoquímicos
y aplicación) se llevó a cabo en los laboratorios de química ubicados en el campus Fernando
Belaunde Terry de la Universidad San Ignacio de Loyola.
Independientes Dependientes
Porcentaje de etanol
Contenido de antocianinas Temperatura de extracción
pH de extracción
Proporción materia prima/solvente
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Materia prima e insumos
Materia prima: Papa Yawar Wayku (Solanum Stenotomun)
Agua destilada: Será empleada en la elaboración del solvente, dilución de ácido cítrico.
Etanol de 96°C
Materiales y equipos
Equipos.
Licuadora (Capacidad: 2L)
Balanza analítica
Cocinilla
Termómetro digital
Potenciómetro
Refractómetro
Espectrofotómetro UV-1800 Shimadzu
Espectrocolorímetro -Datacolor 650
Rotavapor R-3000 (Buchi)
Centrifuga digital
Bomba de vacío
Campana extractora
Instrumentos de laboratorio.
Baguetas
Botellas de vidrio de 2L
Matraces 250 mL.
Matraz kitasato
43
Alcoholímetro
Fiola de 1000 ml
Fiola de 25 ml
Pipeta de vidrio de 2 ml
Pipetas Pasteur
Bombillas
Gradillas
Papel Whatman N° 1
Celdas para espectrofotómetro (10 mm)
Tubos para centrífuga
Magnetos
Tapones de jebe
Papel aluminio
Cuchillo
Reactivos.
Ácido cítrico
0.025 M Cloruro de potasio, buffer pH 1.0
0.4 M Acetato de sodio, buffer pH 4.5
Ácido clorhidrico
44
Flujo y descripción del proceso
Obtención del extracto concentrado de antocianinas (ECA) de la papa.
Materia Prima
La papa Yawar Wayku fue comprada en el distrito de Kishuara, departamento de Apurímac
– Perú, fue cosechada en julio de 2017 y a las dos semanas de haber sido retiradas del
campo fueron recepcionadas en mallas de plástico en las instalaciones de la universidad.
Se seleccionaron 5 papas de manera aleatoria para cada proceso de extracción.
Lavado
Como primera operación se llevó a cabo el lavado de la papa para remover la suciedad
(tierra y otros) que esta traía consigo.
Desinfección
A continuación se realizó la desinfección de la materia prima empleando Dioxill Plus, el
cual es un desinfectante de baja toxicidad, que elimina la posible carga microbiana de la
papa. Se utilizó 0.5 mL de dióxido de cloro al 5 % diluido en 1000 mL de agua y se
sumergió la papa por un tiempo de 10 minutos.
Cortado
La papa ya desinfectada fue cortada manualmente en trozos de similar tamaño para
facilitar su posterior licuado. Se tomó en consideración, que luego del cortado, el tiempo
de exposición al ambiente fuera el mínimo posible para evitar la pérdida de color por
oxidación.
45
Pesado
Seguidamente se pesó de 50 gramos de papa, de acuerdo al diseño experimental.
Licuado
La primera operación principal fue el licuado, ya que es aquí donde se dio inicio a la
extracción de antocianinas. La materia prima fue licuada con agua ácida por un tiempo de
40 segundos, periodo en el cual se obtuvo una contextura homogénea del puré.
Preparación del agua ácida
Para la extracción de antocianinas se empleó como solvente agua acidificada con ácido
cítrico y etanol. La primera solución se preparó diluyendo ácido cítrico en agua
destilada, la cantidad de ácido que se agregó fue determinada por el pH deseado,
tomando en consideración que las antocianinas presentan una tonalidad roja en el rango
de pH de 2 a 5.
Mezclado
Al finalizar el licuado, se vertió el puré en un matraz de 250 mL el cual contenía alcohol a
concentraciones indicadas en la Tabla 4, se colocó un agitador y se tapó el matraz con un
corcho de jebe, protegiéndolo de la luz con papel aluminio.
Extracción
La segunda operación principal fue la extracción, en esta etapa el matraz que contenía la
mezcla fue colocado en una plancha eléctrica con agitador, en la cual se reguló la
temperatura de acuerdo los parámetros requeridos (Tabla 4) y se mantuvo en agitación
constante (400 rpm) por un tiempo de 30 minutos.
46
Enfriamiento y sedimentación
Culminada la etapa de extracción, se procedió a realizar el enfriamiento del puré
colocando el matraz en una congeladora a -16 °C hasta que llegó a una temperatura de
15°C aproximadamente, con el propósito de acelerar la separación de la fase sólido-líquido
(sedimentación) y la reducción de la velocidad de difusión de partículas, deteniendo así la
extracción.
Decantación
Terminado el proceso de enfriamiento y sedimentación se observó la formación de dos
fases, donde se procedió a recuperar el sobrenadante mediante decantación. Una vez
recuperado se tomaron muestras de dicho sobrenadante para realizar las lecturas de
antocianinas totales y pH.
Filtrado
El sobrenadante obtenido en la etapa previa, fue filtrado al vacío para eliminar la mayor
cantidad de sólidos. Se empleó papel Whatman N° 1 y tela para filtrar, el proceso duró 10
minutos aproximadamente.
Centrifugado
Para asegurar la máxima eliminación de sólidos en el sobrenadante, se llevó a cabo un
centrifugado a 5000 rpm durante 20 minutos.
Concentración
El sobrenadante centrifugado fue concentrado en un rotavapor (80 mBar y 60°C) con la
finalidad de alcanzar los 65°Brix. Obteniendo así un jugo concentrado denominado
“extracto concentrado de antocianinas” (ECA).
47
Flujo de proceso.
Figura 5. Flujo de Proceso General para obtención de Extracto Concentrado de
Antocianinas
Diseño Experimental
Se llevó a cabo un estudio experimental sobre la extracción antocianinas a partir de papa
nativa a diferentes condiciones de pH, proporción de materia prima:solvente, temperatura y
porcentaje de etanol. Se realizaron dos series de experiencias a nivel laboratorio utilizando las
48
condiciones de extracción obtenidas mediante la aplicación del método de Superficie de
Respuesta, con un diseño experimental central compuesto 22 + estrella, rotable y ortogonal
aleatorio. Este diseño permite la estimación de la curvatura de la superficie de respuesta,
debida a los efectos cuadráticos de los factores en estudio, sobre la variable respuesta.
Mientras que las características de rotabilidad y ortogonalidad generan una mayor calidad en
la estimación del diseño.
Un diseño central compuesto, es un tipo de diseño factorial de dos niveles, de segundo orden;
que se compone de tres tipos de puntos (o pares de valores de los factores): un primer tipo
dado por ambos niveles del diseño factorial, conocido como “porción factorial”; al menos un
punto central, ubicado al punto medio de ambos niveles; y puntos estrella, ubicados por
encima y debajo de ambos niveles.
Dos características deseables para un diseño eficiente son la rotabilidad y la ortogonalidad. La
primera garantiza que la varianza de la variable respuesta sea igual para los puntos que están a
una misma distancia del punto centro. La segunda permite estimar el efecto de un factor (o
interacción de factores) sobre la variable respuesta, de forma independiente del efecto de
cualquier otro.
Para que el diseño tenga características rotables y ortogonales, la distancia de los puntos
estrella y el número de puntos centrales (n) deben cumplir las siguientes relaciones:
𝛼 = √𝐹 4
& 𝑛 ≅ 4√𝐹 + 4 − 𝐹
Dónde: F= #puntos de la porción factorial = 2Núme ro de factores
Los valores del diseño experimental arrojados por el programa se basan en parámetros
máximo y mínimo elegidos por el analista.
49
La primera serie de extracciones se realizó a temperatura ambiente (25°C), para mantener
una temperatura constante; y a pH 2.3, como punto medio de un rango de pH de 1.8 a 2.8,
valores cercanos al rango propuesto por Gorriti et al. (2009). Se tomaron como constantes
ambos parámetros con el objetivo de hallar el valor óptimo de las variables proporción
materia prima:solvente (MPS) y porcentaje de etanol (PE), en el solvente de extracción (agua
acidificada con ácido cítrico).
Tabla 4. Diseño experimental para la primera serie de experiencias
N° de
extracción
Proporción
materia
prima
solvente
Etanol
(%)
1 1:3 50.0
2 1:4 75.0
3 1:3 14.6
4 1:3 50.0
5 1:3 50.0
6 1:4 25.0
7 1:3 50.0
8 1:4.4 50.0
9 1:2 25.0
10 1:3 50.0
11 1:3 85.4
12 1:1.6 50.0
13 1:3 50.0
14 1:3 50.0
15 1:3 50.0
16 1:2 75.0
50
En la segunda serie de extracciones se evaluaron como variables la temperatura (T) y el
pH, para lo cual las experiencias fueron realizadas a una MPS de 1:3.3 y a un PE de 14. 6%,
ambos resultantes luego de la optimización de la primera serie.
Tabla 5. Diseño experimental para la segunda serie de experiencias
N° de
extracción pH
Temperatura
(°C)
1 2.3 45
2 1.8 65
3 3.0 45
4 2.3 16.7
5 2.3 45
6 2.3 73.3
7 2.3 45
8 2.3 45
9 1.6 45
10 2.8 25
11 2.8 65
12 1.8 25
13 2.3 45
14 2.3 45
15 2.3 45
16 2.3 45
51
Métodos de Análisis
Análisis Fisicoquímicos.
Determinación de °Brix.
Los sólidos solubles se expresaron como °Brix y se determinaron utilizando un
refractómetro digital a 25 °C (±1).
1. Calibrar el refractómetro con agua desionizada
2. Colocar una gota de la muestra en el refractómetro para proceder con la lectura.
*Realizar la lectura por triplicado.
Determinación de pH.
Se midió el pH en una alícuota de 30 ml de muestra homogenizada utilizando un
potenciómetro.
Determinación de concentración de antocianinas monoméricas por pH diferencial
(AOAC Oficial Methods 37.1.68).
De acuerdo a la Association of Official Analytical Chemistry (AOAC) (2006), esta
metodología se aplica para determinar el contenido de antocianinas en frutas, jugos,
bebidas, colorantes naturales y vinos. Se caracteriza por mostrar una medición exacta
dentro del rango 20-3000 mg/L de la antocianina cianidina-3-glucósido.
El principio de esta metodología consiste en el cambio reversible de color que sufren
las antocianinas monoméricas debido a los cambios en su estructura como respuesta a
las variaciones de pH, el mismo que se manifiesta en un diferente espectro de
52
absorbancia. Considera la predominación del pigmento en su forma de catión flavilio a
pH 1 y su forma incolora hemiacetal a pH 4.5, siendo la diferencia de absorbancia de
los pigmentos a longitudes de onda de 520 nm y 700 nm, proporcional a la
concentración del pigmento. Realizando esta diferencia se logra anular el error en la
determinación de antocianinas provocado por los pigmentos degradados, cuya
absorbancia cae en el rango de 700 nm.
Procedimiento.
Preparación de buffers.
1. Pesar 1.86 g de cloruro de potasio y añadir agua destilada hasta alcanzar un
volumen de 980 mL. Luego realizar un ajuste de pH a 1 (±0.05) con HCl (6.3 ml
aprox.). Transferir a una fiola de 1L y enrazar.
2. Pesar 54.43 g de acetato de sodio y añadir agua destilada hasta alcanzar un
volumen de 960 mL. Luego realizar un ajuste de pH a 4.5 (±0.05) con HCl (20
mL). Transferir a una fiola de 1L y enrazar.
Preparación de la solución de prueba.
1. Efectuar todas las diluciones en fiolas de 25 mL empleando pipetas
volumétricas. Adicionar la porción de prueba, que no debe ser mayor a 10 mL
(proporción muestra-tampón 1:4 para no exceder la capacidad tampón de los
reactivos).
2. Determinar el factor de dilución apropiado, diluyendo la porción de prueba con
el buffer de pH 1, hasta que la absorbancia a 520 nm este dentro el intervalo
lineal del espectrofotómetro. (Para la mayoría de espectrofotómetros la
absorbancia debe estar entre 0.2 y 1.4 ua).
53
3. Utilizar el factor de dilución para preparar dos diluciones de muestra para la
prueba, con el tampón pH 1 y 4.5 respectivamente.
Determinación de absorbancia.
1. Para las muestras de la primera etapa del proceso, y tomando en consideración la
consistencia de la muestra, realizar un centrifugado por 20 minutos a 5000 rpm
empleando de 10-14 mL en tubos de ensayo.
* Las muestras de producto final no lo requieren
2. Colocar las muestras diluidas a pH 1 y 4.5 en las celdas espectrofotométricas y
realizar la medición de absorbancia, ambas a longitudes de onda (520 nm y 700
nm).
*Las diluciones son leídas con una celda en blanco que contiene agua
destilada.
*Realizar las mediciones luego de 10-15 min de preparación.
*La razón por la que se realiza la medición a 700 nm es para corregir la
turbidez de la muestra. Sin embargo, si la dilución de la muestra de prueba
está excesivamente turbia se deberá emplear un filtro que no retenga las
antocianinas.
Cálculos.
1. Para determinar la concentración de antocianinas expresadas como cianidina-3-
glucósido equivalente, se debe realizar el siguiente cálculo:
𝐴 × 𝑃𝑀 × 𝐷𝐹 × 103
𝜀 × 𝑙
Dónde:
A = (A520nm-A700nm) pH1.0 - (A520nm-A700nm) pH4.5
54
PM peso molecular = 449.2g/mol para cianidina-3-glucosido
DF = Factor de dilución
𝑙 = longitud de la celda, cuyo valor generalmente es 1
ε (absortividad molar) = 26 900 (para cianidina-3-glucósido)
Determinación del espacio de color CIE L, C, H.
El espacio de color CIE es un método para expresar el color de un objeto a través de
números, utilizando los siguientes valores, CIE XYZ, CIE L*a*b, y CIE L*C*H. Este
sistema permite evaluar atributos de color, identificar inconsistencias, y expresar los
resultados. En este espacio de color L* indica luminosidad, C* representa croma o
saturación, y es la distancia desde el eje de luminosidad (L*), y h* es el ángulo de
matiz, que comienza en el eje +a* y es expresado en grados (0° es rojo, y 90° es
amarillo).
Figura 6. Escala de color Munsell (Instructivo DataColor 650, Chr. Hansen, 2014).
a= componente color rojo-verde
b= componente color amarillo-azul
55
Medición de LCH.
*Las mediciones se realizan en transmisión, bajo el iluminante D65 10Deg.
1. Se calibró el Espectrocolorímetro Datacolor 650 usando una placa negra para
medir el 100% de oscurecimiento, una placa blanca para medir el 100% de
transmisión y una placa verde.
2. Se añadió el ECA a una base de yogur natural marca “Gloria” hasta llegar a una
luminosidad inicial entre el rango de luminosidad presentado por las marcas
comerciales de yogur de fresa.
3. Se aumentó la luminosidad añadiendo más yogur natural, y se redujo añadiendo
ECA.
4. Se midieron los datos de LCH.
Análisis Estadístico.
Método de Superficie de Respuesta.
Los resultados de las experiencias fueron analizados mediante el Método de Superficie de
Respuesta (MSR), el cual es “un conjunto de técnicas estadísticas y matemáticas
empleadas para modelar y analizar problemas, en los que una respuesta es influenciada por
diversas variables y el objetivo es optimizar esta respuesta” (Cornell, 1990).
Por lo general, el MSR permite que en cualquier diseño experimental aplicado a la
optimización de un proceso, se pueda estudiar la influencia de las diferentes variables de
operación (factores experimentales), refiriéndose tanto a la variabilidad de las respuestas
como a la tendencia central, realizando siempre el mínimo de experiencias posibles. Es
decir, se trata de establecer el modelo matemático teórico que los relacione realizando el
56
menor número de experimentos posibles teniendo en cuenta, una estrategia secuencial
obteniendo en diferentes fases la máxima información con el mínimo de recursos (Myers,
Montgomery, & Anderson-Cook, 1995).
El método de superficie de respuesta se realizó mediante el software STATGRAPHICS
Centurion XVI.
57
Resultados
Análisis Espectrofotométrico
Para la primera serie de experiencias se realizaron 16 extracciones de antocianinas a
temperatura y pH constantes (25°C y 2.3 respectivamente). Las absorbancias mostradas en la
tabla 6 se obtuvieron realizando las diluciones de las alícuotas correspondientes en 50 mL de
buffer.
Tabla 6. Valores de absorbancias de las diluciones del producto de extracción a 520 y
700 nm, a pH 1 y 4.5, para la primera serie de experiencias (Ver Tabla 4).
N° de
extracción
Volumen
alícuota
(ml)
pH 1 pH 4.5
Abs (520) Abs (700) Abs (520) Abs (700)
1 1 0.620 0.006 0.149 0.005
2 1.2 0.485 0.000 0.099 0.001
3 1.6 0.648 0.077 0.118 0.003
4 1 0.569 -0.004 0.123 -0.004
5 1.4 0.358 0.010 0.153 0.016
6 1.6 0.656 0.070 0.148 0.022
7 1.2 0.71 0.003 0.167 0.005
8 1.6 0.768 0.103 0.176 0.038
9 1.4 0.559 -0.002 0.111 -0.002
10 1.4 0.524 -0.003 0.100 -0.004
11 1.4 0.760 0.000 0.180 0.001
12 1.6 0.625 -0.008 0.131 -0.005
13 1.0 0.550 0.006 0.145 0.009
14 1.6 0.599 0.076 0.155 0.039
15 1.4 0.767 0.000 0.180 0.001
16 1.4 0.528 -0.003 0.100 -0.004
58
Para la segunda serie de experiencias se realizó 16 extracciones de antocianinas a
proporción materia prima: solvente y porcentaje de etanol constantes (1:3.3 y 14.6
respectivamente). Las absorbancias mostradas en la tabla 8 se obtuvieron realizando las
diluciones de las alícuotas correspondientes en 50 mL de buffer.
Tabla 7. Valores de absorbancias de las diluciones del producto de extracción a 520 y
700 nm, a pH 1 y 4.5, para la segunda serie de experiencias (Ver Tabla 5).
N° de
extracción
Volumen
alícuota
(ml)
pH 1 pH 4.5
Abs (520) Abs (700) Abs (520) Abs (700)
1 1 0.559 0 0.114 0.002
2 1.2 0.791 0.009 0.191 0.012
3 1.4 0.269 0.016 0.167 0.026
4 1.4 0.332 0.01 0.152 0.016
5 1.4 0.72 0.008 0.169 0.005
6 1.2 0.798 0.009 0.191 0.012
7 1.4 0.705 0.002 0.165 0.004
8 1.4 0.138 0.009 0.135 0.006
9 1.4 0.781 0.002 0.195 0.007
10 1.2 0.655 0.002 0.154 0.004
11 1.4 0.785 0.003 0.193 0.006
12 1.2 0.663 0.004 0.164 0.008
13 1.2 0.64 0 0.133 0.001
14 1.4 0.78 0.003 0.195 0.007
15 1.2 0.614 0.002 0.107 0.002
16 1.2 0.664 0.004 0.16 0.008
59
Determinación de contenido de antocianina
La optimización de la extracción de antocianinas se realizó en dos series de experiencias en
donde se evaluaron cuatro variables de extracción (dos en cada una), cada una con tres niveles
de trabajo.
Para la primera serie de experiencias, con las variables proporción de solvente y porcentaje
de etanol, y según el diseño base utilizado, se obtuvieron 16 condiciones de extracción
mostradas en la tabla 8. Luego de efectuar las extracciones con cada una de dichas
condiciones se obtuvieron los valores de antocianinas totales mostrados en la misma tabla.
Se observa que a determinadas proporciones de materia prima: solvente, la concentración
de antocianinas totales tiende a disminuir al aumentar el porcentaje de etanol. Por otro lado,
para todos los porcentajes de etanol se observa que se obtiene mayor cantidad de antocianinas
totales a una proporción intermedia de entre las evaluadas (1:3 respecto a 1:1.6 y 1:4.4).
Para la segunda serie de experiencias, con las variables pH y temperatura, y según el
diseño base utilizado, se obtuvieron 16 condiciones de extracción mostradas en la tabla 9.
Luego de efectuar las extracciones con cada una de dichas condiciones se obtuvieron los
valores de antocianinas totales mostrados en la misma tabla.
Se observa que, para la mayoría de los casos, a un determinado pH la concentración de
antocianinas aumenta al aumentar la temperatura, mientras que tiende a disminuir al aumentar
el pH.
60
Tabla 8. Concentración de antocianinas totales (AT) obtenidas para la primera serie de
experiencias, para las variables proporción materia prima: solvente (Proporción) y
porcentaje de etanol (Etanol).
N° de
extracción
Proporción
(papa:solvente)
Etanol
(%)
AT
(mg/L)
1 1:3 50.0 509.81
2 1:4 75.0 558.37
3 1:3 14.6 758.16
4 1:3 50.0 526.04
5 1:3 50.0 530.62
6 1:4 25.0 673.17
7 1:3 50.0 510.71
8 1:4.4 50.0 480.22
9 1:2 25.0 588.64
10 1:3 50.0 518.9
11 1:3 85.4 550.29
12 1:1.6 50.0 252.14
13 1:3 50.0 520.15
14 1:3 50.0 504.54
15 1:3 50.0 534.36
16 1:2 75.0 356.94
61
Tabla 9. Concentración de antocianinas totales (AT) obtenidas para la segunda serie de
experiencias, para las variables de pH y temperatura.
N° de
extracción
pH
Temperatura
(°C)
AT
(mg/L)
1 2.3 45 705.80
2 1.8 65 839.12
3 3.0 45 0.07
4 2.3 16.7 653.64
5 2.3 45 710.30
6 2.3 73.3 848.10
7 2.3 45 699.98
8 2.3 45 707.42
9 1.6 45 646.66
10 2.8 25 133.59
11 2.8 65 221.86
12 1.8 25 746.44
13 2.3 45 702.02
14 2.3 45 700.51
15 2.3 45 704.91
16 2.3 45 707.01
62
Superficie de respuesta para antocianinas totales
La ecuación de la superficie de respuesta obtenida para la primera serie de experiencias fue:
AT=317.6 + 426.1 PS – 18.9 E – 68.1 PS2 + 1.2 PS*E + 0.1 E2
Dónde:
PS: Proporción materia prima solvente (g/g)
E: Porcentaje de etanol (%)
El estadístico R2 ajustado explico en un 97.1% la variabilidad en las Antocianinas totales.
Dicha ecuación tiene como superficie de respuesta la mostrada en el gráfico 1 y cuyo
contorno se aprecia en el gráfico 2.
Se observa una mayor concentración de antocianinas en la región comprendida entre 0-20
% de etanol y 1:2.5 - 1:4 de proporción materia prima : solvente.
Gráfico 1. Superficie de respuesta estimada para las antocianinas totales (AT) en
función de proporción de materia prima: solvente (Proporción) y porcentaje de etanol
(Etanol).
63
Gráfico 2. Contorno de la superficie de respuesta estimada para las antocianinas totales
(AT) en función de proporción de materia prima: solvente (Proporción) y porcentaje de
etanol (Etanol).
La ecuación de la superficie de respuesta obtenida para la segunda serie de experiencias fue:
AT=-2460 + 3216.1 pH + 0.8 T – 814.6 pH2 – 0.1 pH*T + 0.03 T2
Donde:
T: Temperatura (°C)
pH: potencial de hidrógeno
Según los valores p obtenidos para los coeficientes pH*T y T2 (0.96 y 0.53,
respectivamente) se decidió eliminarlos de la ecuación por no resultar estadísticamente
significativos a un nivel de significancia del 0.05%, obteniendo finalmente la siguiente
ecuación:
AT=-2494.7 + 3211.1 pH + 2.8 T – 814.6 pH2
64
El estadístico R2 ajustado para esta ecuación explico en un 97.4% la variabilidad en las
Antocianinas totales.
Dicha ecuación tiene como superficie de respuesta la mostrada en el gráfico 3 y cuyo
contorno se aprecia en el gráfico 4.
Se observa una mayor concentración de antocianinas en la región comprendida entre las
temperaturas de 60-80 °C y pH 1.7 – 2.2.
Gráfico 3. Superficie de respuesta estimada para las antocianinas totales (AT) en
función de pH y temperatura (°C).
65
Gráfico 4. Contorno de la superficie de respuesta estimada para las antocianinas totales
(AT) en función de pH y temperatura (°C).
Optimización de respuesta
Según la superficie de respuesta para la primera serie de experiencias, el máximo valor de
antocianinas totales obtenido es 788.9 mg/L, y dicho valor se alcanza a las condiciones
óptimas de 1:3.3 proporción materia prima: solvente y 14.6% de etanol (tabla 10).
Se observa que el valor óptimo de porcentaje de etanol coincide con su valor mínimo.
Tabla 10. Valores mínimo, máximo y óptimo para los factores proporción materia
prima: solvente (Proporción) y porcentaje de etanol (Etanol).
Factor Bajo Alto Óptimo
Proporción 1:1.6 1:4.4 1:3.3
Etanol (%) 14.6 85.4 14.6
66
Según la superficie de respuesta para la segunda serie de experiencias, el máximo valor de
antocianinas totales obtenido es 878.6 mg/L, y dicho valor se alcanza a las condiciones
óptimas de pH 1.96 y temperatura de 73.3 °C (tabla 11).
Se observa que el valor óptimo de temperatura coincide con su valor máximo.
Tabla 11. Valores mínimo, máximo y óptimo para los factores pH y temperatura (°C).
Factor Bajo Alto Óptimo
pH 1.6 3.0 1.96
Temperatura 16.7 73.3 73.3
A partir de 100 gr de papa se obtendría aproximadamente 20 mg de cianidina-3-glucósido
siguiendo las condiciones óptimas de extracción obtenidas mediante la superficie de respuesta
trabajada.
Comparación de atributo de color entre el yogurt comercial de fresa y el yogurt
coloreado con antocianina de papa.
Como se puede ver en la Tabla 12, a un mismo rango de luminosidad (L) se observó valores
comparables de Chroma (C), a y b; siendo el C y el a del extracto concentrado de
antocianinas en yogur natural menor al de los yogures comerciales, y el b, mayor. En cuanto
al Hue (H), se observó valores comparables entre las marcas comerciales, los cuales
resultaron menores al de la papa en más de 10 unidades.
67
Tabla 12. Características de color LCH, a y b de los yogures comerciales y yogur
coloreado con antocianinas de papa.
L C H a b
GLORIA 78.27 18.87 2.91 18.84 0.96
LAIVE 77.49 19.42 1.93 19.41 0.66
TOTTUS 76.26 17.09 4.85 17.03 1.44
YOLEIT 80.17 15.93 6.28 15.83 1.74
PAPA 77.30 11.69 17.95 11.12 3.61
Figura 7. Comparación de yogures de fresa comerciales y yogures coloreados con
antocianinas de papa. A: Antocianinas de papa en base de yogurt natural Laive. B:
Yogurt de fresa bebible Laive. C: Antocianina de papa en base de yogurt natural
Gloria. D: Yogurt frutado de fresa Gloria. E: Yogurt de fresa bebible Gloria.
Discusión
Optimización de las condiciones de extracción de antocianinas.
Una vez realizada la optimización de los cuatro parámetros en la primera (PMS, PE) y
segunda (T, pH) serie de experimentos por el método de superficie de respuesta, se encontró
68
que la influencia lineal de todas las variables estudiadas sobre las AT resultó ser significativa
(p<0.001 para T y p<0.0001 para las otras), mientras que la influencia cuadrática fue
significativa (p<0.0001) para todas las variables menos para la temperatura. En cuanto a la
influencia de la interacción entre variables, solo la de interacción entre PMS y PE fue
significativa (p<0.012). Zapata (2014), en su estudio de extracción de antocianinas de
arándanos, no muestra valores de significancia para sus variables estudiadas, pero considera
todas las influencias de sus variables en sus ecuaciones de superficie de respuesta
(particularmente las de PMS, T y pH); lo que indica que dicho autor considera la influencia
de todas ellas como significativa. Fan, Han, Gu, & Chen (2008) consideraron evaluar las
variables PMS, T y tiempo de extracción para su optimización de la obtención de
antocianinas de camote, encontrando que solo la influencia de las dos primeras fue
significativa. El análisis ANOVA de la influencia de las variables PE, T y pH realizado por
Gorriti G, Quispe J, & Taype (2009) también mostró que todas fueron significativas en su
estudio de extracción a partir de maíz morado. Por otro lado, el análisis de superficie de
respuesta con las variables MPS, PE y T realizada en grosella negra por Cacace & Mazza
(2003) mostró que solo la influencia de T fue significativa a un nivel de significancia de 0.05.
De esta manera se observa que todas las variables estudiadas tienen influencia significativa en
la extracción de las antocianinas.
Durante la primera serie de experimentos se observó que la MPS tuvo un efecto positivo
sobre la AT hasta alcanzar un punto máximo alrededor 1:3 g/g, pero luego ésta disminuyó al
llevar la MPS hasta 1:4.4 g/g; sin embargo, a MPS más bajas se obtuvo las menores AT. Un
efecto similar se reportó en el trabajo de Zapata (2014), en donde el rendimiento de AT
aumentó hasta valores de MPS de 1:2.2 kg/kg y disminuyó a partir de valores de 1:3.4 kg/kg.
Dicho autor atribuye el mencionado efecto ocurrido a mayores MPS, a una dilución de la
concentración de antocianinas y copigmentos; argumentando que al disminuir la posibilidad
69
de copigmentación, la probabilidad de ataque nucleofílico por parte del etanol y el agua
aumenta. Efectos similares de aumento y disminución de AT (o “efecto campana”) con la
MPS se observan en el trabajo de Fan et al. (2008) debido a la significancia de sus efectos
lineales y cuadráticos, lo que en cierta medida refuerza el argumento presentado por Zapata.
Sin embargo, Cacace & Mazza (2003) obtuvieron un aumento de AT en todo su rango de
MPS evaluado (0.6-80 mL/g); posiblemente porque su rango de evaluación no abarcó el valor
“crítico” donde la AT empieza a disminuir. El aumento de AT en su rango de estudio fue
atribuido por dichos autores a un aumento en la gradiente de concentración y por lo tanto a
una mayor taza de difusión de las antocianinas al solvente.
En cuanto al PE, el aumento de éste (de 14.6-85.4%) tuvo un efecto negativo sobre la AT.
Gorriti et al. (2009) evaluó dos niveles de PE (20 y 40%) obteniendo una mayor cantidad de
AT al menor PE, lo cual concuerda con los resultados aquí obtenidos. Se ha visto
anteriormente que el etanol es capaz de reducir el fenómeno de copigmentación de las
antocianinas (Canals, Llaudy, Valls, Canals, & Zamora, 2005) dejándolas más susceptibles a
degradación, por lo que un aumento en la porcentaje de etanol en la solución causaría una
disminución de la intensidad del color. El efecto observado en el presente trabajo estaría
ocurriendo a pesar de que un aumento en etanol debería favorecer (por solubilidad) la
extracción de antocianinas, debido a que dicho incremento no ayudaría a compensar la
disminución de copigmentación (Canals et al., 2005). En el estudio de Cacace & Mazza
(2003), en donde realizan la extracción de antocianinas a partir de grosellas negras, se puede
observar que el efecto de la influencia del etanol sobre el AT podría estar presentando ambos
comportamientos, pues a relativamente bajos porcentajes de etanol el aumento del solvente
mejoró muy ligeramente el AT hasta un máximo de 50% de etanol, luego de lo cual un
aumento de dicho solvente causó una reducción del AT, similar nuevamente a los resultados
70
aquí presentados. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, no encontraron influencia
significativa de PE sobre AT.
En la segunda serie de experiencias se obtuvo una influencia positiva de la temperatura (T)
sobre el contenido de AT dentro del rango estudiado (17-73 °C), pues un aumento de dicha
variable resultó en una mejor extracción de antocianinas; tal y como Fan et al. (2008) y
Gorriti et al. (2009) reportaron en sus respectivos estudios realizados en camote y maíz
morado, respectivamente. Por otro lado, Cacace & Mazza (2003) y Zapata (2014) encontraron
un efecto distinto, determinando igualmente que el AT aumenta con el incremento de la
temperatura pero hasta un punto máximo o punto crítico (35 y 45 °C, respectivamente), que
según Cacace & Mazza varía de forma dependiente con el PE, luego del cual comienza a
disminuir; y atribuyen esta disminución a la mayor susceptibilidad de las antocianinas a las
altas temperaturas, lo que implicaría a su vez una mayor degradación de las mismas, debida a
la formación de chalconas incoloras provocada por una pérdida del azúcar en el carbono 3
(Garzón, 2008). En cuanto al efecto positivo, estaría siendo atribuido a un aumento de
solubilidad y del coeficiente de difusión de las antocianinas en el solvente (Cacace & Mazza,
2003b; Zapata, 2014).
Quizá el mencionado “efecto campana” de la T presentado por Cacace & Mazza (2003) y
Zapata (2014), se llegaría a observar si se aumentara el límite superior de T evaluado tanto en
el presente estudio como en el de Fan et al. (2008) y Gorriti G et al. (2009). Sin embargo, su
búsqueda no sería útil por tratarse de T muy elevadas que podrían finalmente resultar en una
degradación de antocianinas.
La diferencia de los efectos observados entre los estudios de Cacace & Mazza (2003) y
Zapata ( 2014) frente a los de Fan et al. (2008), Gorriti et al. (2009) y el presente, podría estar
ocurriendo por la diferencia de la materia prima utilizada: grosella negra y arándanos en los
71
dos primeros frente a camote, maíz morado y papa en los últimos, respectivamente.
Considerando que los dos primeros son frutos tipo bayas cuyo contenido de agua es mayor
frente a las otras materias primas (cereal y tubérculos). Esta idea puede ser reforzada por el
hecho de que las T óptimas obtenidas por todos estos autores resultaron ser similares en cada
grupo de materia prima (30 y 36 °C para grosella y arándano, 73 y 80 °C para papa y camote,
y T mayores a 60 °C para maíz morado).
En cuanto a la influencia del pH sobre AT, este tuvo un efecto inverso pues al ir
aumentando el pH de 1.6 a 3.0 se observa una disminución del AT, obteniendo un valor
mínimo extremo de 0.07 mg/mL a pH 3.0. Estos resultados tienen sentido pues la forma más
estable de la antocianina (catión flavilio) es favorecida a pH menores a 2; al ir aumentando el
pH, las moléculas de antocianina sufren cada vez más fácilmente un ataque nucleofílico por
parte del agua dando lugar a una especie hemiacetal en equilibrio con su forma chalcona, las
cuales son más inestables e incoloras (Garzón, 2008). Estos resultados también son
observados por Gorriti et al.(2009) y Zapata (2014), obteniendo un pH óptimo de 2 y 2.12,
respectivamente, los cuales son muy similares al obtenido en el presente trabajo (1.96).
Comparación de las características de color de yogures comerciales frente a yogur
natural comercial coloreado con antocianinas de papa.
Después de llevar la solución de antocianinas en yogur natural comercial a una luminosidad
(L) comparable a la de los yogures comerciales de fresa (Gloria, Laive, Tottus y Yoleit), se
observó cierta similitud en los valores de Chroma (C), a y b, entre todos. Contrariamente,
solo se observa similitud para los valores de H entre las marcas comerciales, teniendo un
valor más alto en la solución de antocianinas de papa, lo cual indica una tonalidad menos
rojiza para este último comparado con los anteriores. Sin embargo, esa diferencia no es
72
notoria a la vista, como se observa en la Figura 7. Rodriguez-Saona, Giusti, & Wrolstad
(1998) indican que el extracto de papa roja tiene características de color similares a las del
colorante artificial Rojo 40. Por lo tanto, teniendo en cuenta todas estas observaciones, se
podría considerar el uso del colorante obtenido de la papa Yawar Wayku como posible
sustituto de los colorantes comerciales utilizados para yogur. No obstante, adicionalmente
habría que considerar estudiar previamente la estabilidad en el tiempo de dicho colorante
(Rodríguez-Saona, Glusti, & Wrolstad, 1999), lo que se recomienda para futuros estudios.
Conclusiones
Todos los parámetros estudiados (proporción materia prima: solvente, porcentaje de
etanol, temperatura, pH) influyen significativamente en el proceso de extracción de
antocianinas.
La proporción materia prima / solvente óptima para la extracción de antocianinas
determinada por la aplicación del método de superficie de respuesta fue de 1:3.3 g/g.
La temperatura óptima para la extracción de antocianinas resultante de la aplicación del
método de superficie de respuesta fue de 73.3 °C.
El pH óptimo para la extracción de antocianinas obtenido por la aplicación del método
de superficie de respuesta fue de 1.96.
El porcentaje óptimo de etanol utilizado como solvente para la extracción de
antocianinas determinada por la aplicación del método de superficie de respuesta fue de
14.6%.
Debido a las características de color del colorante obtenido, podría ser posible utilizarlo
como sustituto de los colorantes artificiales para yogur, como por ejemplo el Rojo 40.
73
Recomendaciones
A modo de recomendación cabe mencionar que se puede mejorar la optimización de las
variables, porcentaje de etanol y temperatura, moviendo la superficie de respuesta a niveles
factoriales por debajo de 14.6% para el caso de etanol y por encima de 73°C para el caso de la
temperatura, con el fin de hallar los puntos críticos para dichas variables.
Por otro lado, en lo que respecta a la aplicación del extracto en yogurt, el valor de Croma, que
mostró cierta opacidad, puede ser corregido al añadir una etapa de purificación al proceso, o
buscar la forma de hacer más eficientes las etapas de filtración o centrifugado. Lo ideal podría
ser emplear una de estas dos últimas etapas para la separación de sólidos y otra etapa
adicional para eliminar impurezas.
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1
Anexos
Anexo 1: MATRIZ DE CONSISTENCIA DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
CUANTITATIVA
TÍTULO DEL PROYECTO: OBTENCIÓN DE ANTOCIANINAS DE PAPA NATIVA “YAWAR WAYKU”
(Solanum stenotomum) PARA LA ELABORACIÓN DE UN COLORANTE NATURAL APLICABLE A
ALIMENTOS
PROBLEMA OBJETIVOS HIPÓTESIS VARIABLES INDICADORES MÉTODOS
Problema General Objetivo General Hipótesis General Variables
Dependientes Indicador
Método de pH
Diferencial
(Determinación
de antocianinas)
Método de
Superficie de
Respuesta
(Diseño
Experimental)
¿Cuáles son las
condiciones óptimas
de extracción de
antocianinas a partir de
papa nativa y cuál es
su potencial como
colorante natural en
yogur?
Determinar las
condiciones óptimas
de extracción de
antocianinas a partir de
papa nativa y evaluar
su uso potencial como
colorante natural en
yogur.
Hi: Mediante la aplicación
del método de superficie
de respuesta, es posible
determinar las condiciones
óptimas para la obtención
de antocianinas a partir de
papa nativa, para la
elaboración de un
colorante aplicable al
yogur.
Contenido de
antocianinas
Porcentaje de
antocianinas: %
Problemas
Específicos
Objetivos
Específicos Hipótesis Específica
Variables
Independientes Indicadores
¿Cuál es la proporción
de materia prima /
solvente óptima de
extracción para la
antocianinas?
Establecer la
proporción materia
prima / solvente
óptima de extracción
de antocianinas.
Hi: Es posible establecer
la proporción materia
prima / solvente óptima
para lograr la extracción
de antocianinas. Porcentaje de
etanol
Temperatura de
extracción
pH de
extracción
Proporción
materia
prima/solvente
Porcentaje de etanol: %
Grados Celsius: °C
Escala de pH
Proporción materia
prima/solvente: Kg/Kg
¿Cuál es la
temperatura óptima de
extracción de
antocianinas?
Definir la temperatura
óptima de extracción
de antocianinas.
Hi: Es posible definir la
temperatura óptima para
lograr la extracción de
antocianinas.
¿Cuál es el pH óptimo
de extracción de
antocianinas?
Determinar el pH
óptimo de extracción
de antocianinas.
Hi: Es posible determinar
el pH óptimo para lograr la
extracción de antocianinas.
¿Cuál es el porcentaje
óptimo de etanol
empleado como
solvente para la
extracción de
antocianinas?
Establecer el
porcentaje óptimo de
etanol empleado como
solvente para la
extracción de
antocianinas.
Hi: Es posible determinar
el porcentaje de etanol
óptimo para lograr la
extracción de antocianinas.
¿Cuál es la diferencia
entre el color del
colorante obtenido y
el color de los
colorantes comerciales
aplicados al yogur?
Analizar la diferencia
entre el color del
colorante obtenido y el
color de los colorantes
comerciales aplicados
al yogur
Hi: Existe una diferencia
en la aplicación del
colorante obtenido y los
colorantes comerciales
aplicados al yogur.
