Michal JurajdaMichal Jurajda

ÚPFÚPF

Odběr a uchování biologického Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNAmateriálu pro stanovení mRNA

Odběr materiálu pro izolaci RNAOdběr materiálu pro izolaci RNA

• Problém „biologicko-vědecký“Problém „biologicko-vědecký“

• Problém technologickýProblém technologický

• Problém organizačníProblém organizační

Problém „biologicko-vědecký“Problém „biologicko-vědecký“

• Co? Co?

• Proč?Proč?

• Jak?Jak?

• Kdy?Kdy?

Získávání materiáluZískávání materiálu

• Přímo v laboratořiPřímo v laboratoři

• Ve zdravotnickém zařízeníVe zdravotnickém zařízení

• Tkáňové banky a archivy preparátůTkáňové banky a archivy preparátů

Zpracovávaný materiálZpracovávaný materiál

• Buněčné kulturyBuněčné kultury

• Čerstvá tkáňČerstvá tkáň

• Tkáň z tkáňových bank z Tkáň z tkáňových bank z parafinových bločkůparafinových bločků

Obecné poznámkyObecné poznámky

• RNázy jsou stabilní, velice aktivní a RNázy jsou stabilní, velice aktivní a nevyžadují kofaktorynevyžadují kofaktory

• Obecně potřeba pracovat v čistším Obecně potřeba pracovat v čistším prostředí než při izolaci DNAprostředí než při izolaci DNA

Požadavky na odběrPožadavky na odběr

• Uchování co největšího množství Uchování co největšího množství RNA – snaha uchovat intaktní bb. RNA – snaha uchovat intaktní bb. až do lýzy ve speciálním pufru.až do lýzy ve speciálním pufru.

• Uchování expresního profilu – Uchování expresního profilu – okamžité usmrcení bb. a okamžité usmrcení bb. a stabilizace RNA.stabilizace RNA.

Postup prácePostup práce

• Odběr, transport, stabilizaceOdběr, transport, stabilizace• Odběr,stabilizace, transportOdběr,stabilizace, transport• LýzaLýza• HomogenizaceHomogenizace• Izolace RNAIzolace RNA• Stabilizace (-80 nebo Stabilizace (-80 nebo liqliqNN22))• Reverzní transkripce + real-time Reverzní transkripce + real-time

PCRPCR

Postup prácePostup práce

• Postupné zpracováváníPostupné zpracovávání

• Dávkové zpracováníDávkové zpracování

Technologie odběruTechnologie odběru

• Transport Transport in vivoin vivo

• Okamžitá izolace RNAOkamžitá izolace RNA

Technologie odběruTechnologie odběru

• Odběr ve zdravotnickém zařízeníOdběr ve zdravotnickém zařízení

• Stabilizace vzorkuStabilizace vzorku– Kultivační medium + okamžitý Kultivační medium + okamžitý

transporttransport

– Snap-frozen, NSnap-frozen, N22, ultralow freezer, ultralow freezer

– RNARNAlaterlater– PAXPAXgenegene

Technologie izolaceTechnologie izolace

• Příprava vzorkuPříprava vzorku– Zamražené nerozpouštětZamražené nerozpouštět

• Lýza buněkLýza buněk– Lytické pufry obsahují inhibitory RNázLytické pufry obsahují inhibitory RNáz

• HomogenizaceHomogenizace– Mechanické rozbití makromolekulMechanické rozbití makromolekul

• Izolace RNA „no proteins = no Izolace RNA „no proteins = no RNA-ses“RNA-ses“

Praktická realizacePraktická realizace

Fázová separaceFázová separace

Selektivní vazbaSelektivní vazbaCentrifugaceCentrifugace

VývěvyVývěvyManuální systémyManuální systémy

Automatické systémyAutomatické systémy

Kritické krokyKritické kroky

• Stabilizace kvantity i kvality RNA v Stabilizace kvantity i kvality RNA v tkáňovém vzorkutkáňovém vzorku

• Uchování izolované RNAUchování izolované RNA

• Uchování cDNA ????Uchování cDNA ????

Organizační problémyOrganizační problémy

• Specializovaní pracovníci Specializovaní pracovníci popřípadě zaškolení stávajících popřípadě zaškolení stávajících pracovníkůpracovníků

• Přístrojové vybavení (low freezer, Přístrojové vybavení (low freezer, NN22))

• Evidence vzorků a rychlá Evidence vzorků a rychlá komunikacekomunikace

ŘešeníŘešení

??

ŘešeníŘešení

AMBIONAMBIONRNARNAlater, RNAwiz, ToTALLY RNAlater, RNAwiz, ToTALLY RNA

QIAGENQIAGENPAXgene System, RNAeasyPAXgene System, RNAeasy

MRCMRCTRI reagentTRI reagent

AppliedbiosystemsAppliedbiosystemsTotal RNA Isolation Chemistry, ABI 6100Total RNA Isolation Chemistry, ABI 6100

ŘešeníŘešení

AMBIONAMBIONRNARNAlater 500ml 310€later 500ml 310€

ToTALLY RNA 100ml ToTALLY RNA 100ml (pro 10g tkáně)(pro 10g tkáně) 276€ + 276€ + plastikplastik

RNAwiz 100ml 144€ + plastik + chloroform RNAwiz 100ml 144€ + plastik + chloroform + isopropanol+ isopropanol

ŘešeníŘešení

QIAGENQIAGENPAXgene System (Tubes+Kit) 100 izolací PAXgene System (Tubes+Kit) 100 izolací

25 000Kč + 2x 12 900 Kč25 000Kč + 2x 12 900 Kč

RNAeasy mini kit 250 izolací 29 000KčRNAeasy mini kit 250 izolací 29 000Kč

ŘešeníŘešení

MRCMRCTRI reagent 500ml TRI reagent 500ml 50g tkáně/166ml krve 50g tkáně/166ml krve 418418$$/455/455$$

+ plastik+ plastik

• Co? Co?

• Proč?Proč?

• Jak?Jak?

• Kdy?Kdy?