抗がん剤と天然物－古典的薬剤から分子標的薬まで－

青木 俊二兵庫医療大学薬学部

古典的抗がん剤としての天然物

細胞分裂と抗がん剤の作用点

DNA に直接作用する抗がん剤 （抗腫瘍性抗生物質）

放線菌(Streptomyces caespitosus)

放線菌(Streptomyces sp.)

CH3O O

O OH

OH O

OH

O CH3

O

OHNH2

H3C

マイトマイシンCO

O

NNH

H3C

H2N OCH3

O

ONH2

ドキソルビシン（アドリアマイシン）

慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病乳癌、胃癌、肺ガンなど

DNAに直接的に相互作用して、DNAの複製を妨げることでガン細胞の増殖を阻害する。

微小管 (tubulin) に作用する抗がん剤

NH

N

COOMeOH

N

NMeOOC

HOAcO

OHC

MeO

H

OOAc

H

OBz

OAcO OHO

OHOOH

ONHイチイ

ニチニチソウ(Vinca rosea)

イチイ (Taxus brevifolia)

乳ガン・卵巣ガン タキソール

ビンクリスチン

白血病や悪性リンパ腫

微小管 (tubulin) は、細胞分裂の際に２倍体になった染色体を両極に引っ張る紡錘糸を構成する重要なタンパクで、これらの抗がん剤は、微小管の形成を阻害する。

DNAトポイソメラーゼを阻害する抗がん剤

ポドフィルム根(Podophyllum peltatum)CH3O OCH3

OH

OO

O

O

OH

OH

OO

O

O

カンレンボク(Camptotheca acuminata)

カンプトテシン

NN

O

O

OOH

エトポシド (VP16)

ポドフィルム根に含まれるpodophyllotoxinの誘導体臨床では、誘導体のイリノテカンや

SN38が使われている。

トポイソメラーゼは、DNAの複製時にDNA２重らせんを解いたり巻き戻したりする酵素で、これを阻害することでDNAの複製が妨げられ、細胞分裂は停止する。

分子標的抗がん剤とは？

古典的抗がん剤

その作用点は、正常細胞にも普遍的に存在する細胞分裂のメカニズムであることがほとんど。

正常細胞も殺してしまうので副作用大

分子標的抗がん剤

ガン細胞特異的に働くので、正常細胞へのダメージが少ない（はず・・・）。

ガン細胞に存在する正常細胞との相違点に特異的に作用することを目標に開発。

分子標的抗がん剤の標的とは？

これについては、現在も精力的な研究が行われています。(発展途上）

・異常な増殖シグナル伝達系を抑制する薬剤

慢性骨髄性白血病の原因であるBCR-Ablタンパクの特異的な阻害剤

グリベック

ハーセプチン 乳がん細胞の増殖に関わる受容体タンパクHER-2の抗体

・細胞周期制御をターゲットとする薬剤（分化誘導剤）

ヒストンでアセチラーゼ(HDAC)の特異的な阻害剤

ボリノスタット

・腫瘍血管新生をターゲットとする薬剤

血管新生因子VGEFの抗体アバスチン

分子標的抗がん剤としての天然物

レチノイン酸 (all-trans retinoic acid, ATRA＝活性型ビタミンA）

急性前骨髄性白血病(APL)の治療薬

APL は、レチノイン酸受容体遺伝子の異常によって引き起こされる疾病であるが、ATRAを大量に投与することで異常な増殖を停止し脱がん化（分化誘導）することが明らかになっている。

COOH

retinoic acid

活性型ビタミンD

HO

H

乳癌、前立腺癌の治療に臨床で用いられている例あり。

vitamin D3

分子標的抗がん剤リード化合物の探索（私の研究例）

がん細胞に毒性を示す化合物 altohyrtins, arenastatin A, callystatin A

がん細胞に対する分化誘導物質

・各種白血病細胞 (K562, HEL, U937, HL60) に対する分化誘導物質

・神経芽細胞腫 (SH-SY-5Y, Neuro2A, PC12) に対する分化誘導物質

がんの血管新生阻害物質

・ヒト齊帯静脈内皮血管 (HUVEC) に対する選択的増殖抑制物質（血管内皮細胞増殖因子 (VEGF, b-FGF)の阻害物質）

・チミジンホスホリラーゼの阻害剤

smenospongine（赤芽球様分化）hymenialdisines （マクロファージ様分化）misakinolides

lembehynes

bastadinslembehsterols

多剤耐性がん細胞に対する耐性克服物質araguspongines, brianthein A （P-glycoprotein に対する阻害剤)

agosterols（P-glycoprotein と MRP1に対する阻害剤)

・がんの多剤耐性に関わるトランスポーターの特異的な阻害物質

ガン細胞に対する分化誘導物質の探索

１）慢性骨髄性白血病細胞に対する分化誘導物質の例

Design of differentiation inducer for tumor treatment

normal cell tumor cell

DNA damage

checkpoint of cell cycle（細胞周期の停止）

repairable unrepairable

DNA repair apoptosis（細胞死）

正常分裂

disrupted checkpoint of cell cycle

differentiation inducer (cell cycle inhibitor)

abnormal proliferation recover of checkpoint regulation（細胞周期の停止）

apoptosis(tumor treatment)

（細胞周期が停止しない）

副作用の少ないがん治療薬

Search for differentiation inducer of tumor cell

granulocyte

erythrocyte

monocyte

hematinic stem cell marrow cell

transformation

leukemia

abnormal proliferation antitumor drug

apoptotic cell

normal cell differentiation

< cell death >

<normalization >

differentiation inducer

＊activation of oncogene＊inactivation of antioncogene

＊mutation (chemicals, UV etc.)＊virus

NH2H2N

H2O2

H2O

HN NH

Assay method for cell differentiation of K562 cells

added sample, incubated for 4 days

extraction of hemoglobin

( 2 X104cells / 2ml / well in 24 well plate)

fluorene blue

hemoglobin( peroxidase )

( measuring absorbance of fluorene blue at 630 nm )

diaminofluorene

added diaminofluorene solution

and 3 % hydrogen peroxide

added H2Ocentrifuged, medium aspirated

K562 cells ( human chronic myelogenous leukemia (CML))

colorimetric assay

Bcr-Abl tyrosine kinase : the major cause of pathogenesis in CML

From the Indonesian marine sponge Dactylospongia elegans

Labuanbajo, west Flores, Nusa Tenggara Timur

OOH

R

H

O

5

smenospongine (1):R= NH2smenospongorine (3):R= NHCH2CH(CH3)2

ilimaquinone (5):R= OCH3

OHH

COOCH3

5

R

dictyoceratin-C (7):R= Hsmenospondiol (8):R= OH

OOH

R

H

O

5

5-epi-smenospongine (2):R= NH25-epi-smenospongorine (4):R= NHCH2CH(CH3)2

5-epi-ilimaquinone (6):R= OCH3

control

aphidicolin

smenospongine

(15 µM)

(15 µM)

Expression of glycophorin A in K562 cells treated by smenospongine

expression of GP-A

K562 cells

1) incubated with sampleat 37°C, 5% CO2 for 6 days

2) harvested,suspended in PBS

3) added FITC*-labeledglycophorin A antibody

4) incubated for 40 min at 4°C

5) washed with PBS and

Flow cytometry * FITC: fluorescein isothiocyanate

resuspended in PBS

glycophorin A (GP-A): differentiation marker for erythroblast

expression of GP-A

expression of GP-A

cell

num

ber

cell

num

ber

cell

num

ber

Regulation of cell cycle by cdk/cyclin complex and cdk inhibitor

G0

cyclinB

cdk1

cyclin Bcdk1

cyclin Acdk2

cylcin E

cdk2

cyclinDcdk4,6 G1 phase

p16, p18, p19

p21, p27, p57

p21, p27, p57

S phase

G2 phase

M phase

2. Cdk inhibitors (CKIs)

1) Cip/Kip1 family

2) INK4 family

all cyclin-cdks

inhibition

inhibition

cyclinD-cdk4, 6

(p21, p27, p57)

(p16, p18, p19)

1. cdk: cyclin-dependent kinase

cdkcylin

accelerator for cell cycle

brake for cell cycle

Effect of smenospongine on cell cycle of K562 cells

K562 cells1) incubated with sample at 37℃,

5% CO2 for 24 h2) cells harvested3) washed with PBS4) resuspended in PBS5) stained with propidium iodide

aphidicolin5 µg / ml

G1 G2, MS

DNA content

cell

num

ber

Flow cytometry

control

G1 G2, MS

DNA content

cell

num

ber smenospongine

2.5 µg / ml

G1 G2, MS

DNA content

cell

num

ber

Effect on expression of CDK inhibitors (p21, p27, p57) in K562 cells

K562 cells (1X106 cells)1) incubated with 15 µM of smenospongine

2) lysed in lysis buffer

0 12 24 48 hr

p21

p27

p57

3) SDS-PAGE

4) transfered to PVDF membrane

5) blocked with 5 % skim milk6) bound to primary antibody7) bound to secondary antibody8) added ECL reagent9) exposed to X-ray film

Cell lysates

Blotted PVDF membrane

Detection of expression of CDK inhibitors

at 37°C, 5% CO2 for indicated time

expression of p21

no effect on p21promoter assay

smenospongine

From the Indonesian marine sponge Monanchora ungiculata

erythroid differentiation inducer for K562 cells

Tolobulu, Southeast Sulawesi

N

HN

HN

OO

O

O(CH2)14

O

NNH2NH2

OH+

X-

crambescidin 800

Differentiation-inducing activity of crambescidin 800

Cb (0.15

µM)

APC(15

µM)

Cb (1.0 µ

M)Cb (0.

5 µM)

Drug

free

0.20.40.6

0.8

1.0

a b s o r b aCb: crambescidin 800 APC: aphidicolin

hemoglobin production

G1 S G2/M

35 (%)44 21

control

G1 S G2/M

32 (%)66 2

S arrestCb (0.5 µM, 24 hr)

cell cycle analysis

0 6 12 24 48 hr

p21

p27

CKI expression(0.5µM of Cb)

ガン細胞に対する分化誘導物質の探索

２）神経芽細胞腫に対する分化誘導物質の例

Conception of Neuronal Differentiation Inducer

neuroblastoma

apoptosisneuron

(Alzheimer's disease etc. )neurodegenerative disorder

NGF-like neuroprotective agent

abnormal proliferation

low molecular differentiation inducer

neuron-like cell

differentiation therapy for cancer

neuronal differentiation

Assay for Neuronal Differentiation

PC12 cellsrat pheochromocytomaラット副腎髄質褐色細胞腫

・ replac ed w it h fresh medium・ added sample as EtOH solution

observed neurite outgrowth under microscope

37℃, 5% CO224 - 48 h

37℃, 5% CO224 h

plated on 24 multiwell plate(2 × 104 cell / 1 ml / 1 well)

DMEM with 10% inactivated horse serum and 5% FBS

Neuro 2A cellsmouse neuroblastomaマウス神経芽細胞腫

DMEM with 10% FBS

Culture medium:

PC12 cells or Neuro 2A cells

NGF receptor positive( responsive to NGF)

NGF receptor negative(nonresponsive to NGF)

Culture medium:

Assay

Neuritogenic Polyacetylene from Marine Sponge of Haliclona sp.

structureS. Aoki, K. Matsui, K. Tanaka, R. Satari, M. Kobayashi, Tetrahedron 2000, 56, 9945.

S. Aoki, K. Matsui, T. Takata, and M. Kobayashi, FEBS Lett., 544, 223-227 (2003).

activityS. Aoki, K. Matsui, T. Takaka, M. Kobayashi, Biochem. Biophys. Res. Commun., 289,558-563 (2001).

photoaffinity labeling

(CH2)14CH3

H

OH

lembehyne A

neuritogenic activityNeuro 2A 0.1 µg/mlPC 12 2 µg/ml

Morphological Changes of PC12 and Neuro 2A Induced by Lembehyne A

PC12

intact

Neuro 2A

intact

unipolar type

retinoic acidganglioside

bipolar type

lactacystin(proteasome inhibitor)

multipolar type

Bt2cyclic AMPgriseolic acid

lembehyne A (4.0 µM) lembehyne A (2.0 µM)bipolar neurite outgrowth

Structure-activity Relationship of Lembehynes

0 . 1

0 . 3

1

3

compound 1 2 3 4 5 6 7 8

Cel

ls w

ith n

eurit

es (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

OCH3

H3

2

O

H3

3

OH

H3C3

4(CH2) 3

H

OH10

5(CH2) 11

H

OH18

8

(CH2)14-CH3(CH2)7

H

OH

3

36

lembehyne A (1)

(CH2) 11H

OH

H

OH 20

18 67

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

24 h 48 hTime (hr)

control

LB-A 2 μM

LB-A 6 μM

Effect of Lembehyne A (LB-A) on Acetylcholinesterase (AChE) Activity of Neuro 2A Cells

Functional Differentiation

AC

hE a

ctiv

ity

01020304050607080

Effects of Lembehyne A (LB-A) on the Cell Cycle and the Expression of the Cyclin Dependent Kinase Inhibitor Protein p21 in Neuro 2A Cells

G1 S G2/M

Western blotting analysis of p21 expression

(hr) LB-A ( 3 µM)

p210 6 12 18 24 48

flow cytometric analysis (24 h)ce

ll cy

cle

phas

e (%

)

G1 S G2 /M

G1 S G2 /M

control

G1 arrest

LB-A 3 µM

既存の活性物質O

S

HOOCHN CH3

O

NHO

H3COH CH3

CH3

OH

O

O N

N

N

N

NH2

OHHOOCHOOC

OH

NHOH

O

N

O

(CH2)13

H

OH

ONN

HN

NHCH3

MeO

H3C

O

CH3 CH3

COOHH3C CH3

CH3

O

HO

OH

O

OCH3

O

HO

H

OH

lactacystin

staurosporin

griseolic acid

trichostatin A

Various Neuronal Differentiation Inducers for Neuro 2A or PC12 cells

protein kinase C inhibitor

proteasome inhibitor

histone deacetylase inhibitor

cyclic nucleotide phospho-diesterase inhibitor

ganglioside GD1a

2αNeuAc

3Galβ1 3GalNAcβ1

34Galβ1 4Glcβ1 1'Cer

2αNeuAcCer: ceramide lembehyne A (1)

Target molecule?

retinoic acidbutyrolactone I

cdk inhibitor17 nM for Neuro 2A

5 µM for Neuro 2A

10 µM for Neuro 2A

0.1 µM for PC12, Neuro 2A

24 µM for Neuro 2A

1 mM for Neuro 2A

10 µM for Neuro 2A

activity

10 µM for PC1 2

11C18 analogue

1 µM for Neuro 2A4 µM for PC12

0.3 µM for Neuro 2A

血管新生阻害活性を有する

海綿由来成分bastadin類のin vivo抗腫瘍効果

腫瘍血管新生のメカニズムと血管新生阻害剤のターゲット

既存の血管

血管新生促進因子 マトリクスメタロ

プロテアーゼ(MMPs)

MMPs 血管内皮細胞

固形癌

VEGFbFGF etc.

腫瘍の増殖と遠隔転移

血管新生促進因子の産生

血管壁の消化

血管内皮細胞の増殖・遊走

血管内皮細胞の管腔形成

血管新生促進因子の阻害

（レセプターetc.）

消化酵素(MMP)の阻害剤

血管内皮細胞の選択的増殖阻害

血管内皮細胞の管腔形成並びに裏打ち組織の成熟

過程

ターゲット

HUVEC or KB3-1plated on 96 multiwell plate

(2 x 103 cells/well)

replaced with minimal mediumincluding VEGF or bFGF

HUVECWST-8 assay

KB3-1MTT assay

evaluation of selective growth inhibition

Assay for selective growth inhibitors against HUVEC

37 °C, 5 % CO224 h

37 °C, 5 % CO248-72 hculture medium

human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)

HuMedia-EG2 : normal mediumHuMedia-EB2 : minimal medium

human KB epidermoid carcinoma cells(KB3-1)

RPMI1640 with 10 % FBS

added samples as EtOH solution(VEGF or bFGF dependent growth)

HUVEC

KB3-1

HUVEC KB3-1

血管新生阻害物質 bastadin類の化学構造

HN

N

O

OHO

NNH

O

O

OH

OH

R3Br

Br

HO

Br

R2

56

R1bastadin-5 : R1 = H, R2 = Br, R3 = Brbastadin-6 : R1 = Br, R2 = Br, R3 = Brbastadin-7 : R1 = H, R2 = Br, R3 = H, ∆5, 6

bastadin-11 : R1 = H, R2 = H, R3 = Br, ∆5, 6

bastadin-4 : R1 = H, R2 = Br, R3 = Br, ∆5, 6

HN

N

O

OHBr O

NNH

O

O

Br

HO

OH

OH

BrBr

R1

bastadin-13 : R1 = Hbastadin-19 : R1 = Br

NH

NOH

O

HN

NOH

O

HO

HO

Br

Br OH

OH

Br

Br

bastadin-3

Bastadin 6 のヒト血管内皮細胞に対する選択的増殖抑制効果

doxorubicin（現在臨床で使われている抗がん剤）

bastadin 6

0

100

20

40

60

80

0.01 0.03 0.1 0.3 1 3 10薬物濃度 (µM)

増殖抑制率(%

)0

100

20

40

60

80

0.01 0.03 0.1 0.3 1 3 10

増殖抑制率(%

)

薬物濃度 (µM)

HUVEC (bFGF dependent condition) KB 3-1

3Y1 : rat embryonic fibroblastHUVEC (normal condition) 3Y1

HUVEC：ヒト臍帯静脈血管内皮細胞

Selective growth inhibition of cortistatins

Compounds 1 2 3 4Cell line IC50 S.I. IC50 S.I. IC50 S.I. IC50 S.I.

HUVECs 0.0018 1.1 0.019 0.12KB3-1 7 3900 120 110 150 7900 55 460Neuro2A 6 3300 160 150 180 9500 >300 -K562 7 3900 200 180 >300 - >300 -NHDF 6 3300 >300 - >300 - >300 -- : not determine IC50 = µM

cortistatin A (1) : R = Hcortistatin B (2) : R = OH

cortistatin C (3) : R = Hcortistatin D (4) : R = OH

HOR

N

OH

H

N

OHO

O

N

OH

H

N

O

R

Selective growth inhibition against HUVEC

Bastadin 6の in vivoでの血管新生阻害活性の評価

12 % hydron でペレットを作成し、中に血管新生促進因子を混ぜる。(VEGF, 200 ng or bFGF, 40 ng)

マウス角膜へのペレット移植操作

５～６日後

角膜レンズ

虹彩

眼底輪部血管

ペレット

ペレット

薬物処置

・ペレットに直接混ぜる・腹腔内投与

生じた新生血管を顕微鏡下で観察

Bastadin 6の in vivoでの血管新生阻害活性の評価VEGF

bFGF

薬物無処置(VEGF, 200 ng in pellet)

薬物無処置(bFGF, 40 ng in pellet)

bFGF + bastadin 6(0.1 µg) in pellet

VEGF + bastadin 6 (0.1 µg) in pellet

VEGF in pellet + bastadin 6 (i.p., 100 mg/kg/day X 3)

bFGF in pellet + bastadin 6 (i.p., 100 mg/kg/day X 3)

マウス角膜法を用いてin vivoでのbastadin 6の効果を検討した結果、bastadin 6をペレットに直接導入した場合も、ペレット投入後1日目から3日目までbastadin 6を100 mg/kg/day腹腔内投与したマウスにおいても血管新生が完全に抑制された。

control (day 22)

bastadin 6 (early) bastadin 6 (late)

(100 mg/kg, i.p., day 22)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 8 11 14 18 22 days

drug treatment (early)

drug treatment (late)

control early treatment (7 times in 0-2 week)late treatment (7 times in 1-3 week)

腫瘍体積

(mm3)

薬物投与

薬物投与

移植同時投与（０から２週間、７回）

腫瘍形成後投与（１から３週間、７回）

Bastadin 6 のヒト腫瘍移植モデルにおける抗腫瘍効果

腫瘍移植モデルにおけるbastadin 6の抗がん作用を検討した結果、bastadin 6を1日目から投与した群でも7日目から投与した群においても、100 mg/kg腹腔内投与したマウスに抗腫瘍効果が確認された。