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物理雙月刊（廿八卷四期）2006 年 8 月 661
同步輻射蛋白質結晶學的
近期發展與應用研究
文/陳俊榮
一、引言
自西元 2000 年美英宣布人類基因圖譜的鹼基
定序完成，這項突破使生命科學邁向一個全新的領
域。我們對於基因在生物體內的作用有更深的認
識，但是這些帶有功能訊息的基因所轉譯出來的蛋
白質才是真正在生理功能中扮演重要的角色，因此
後基因體時代的重要研究標地就是”蛋白質體學”。
而其中生物巨分子立體結構所提供的生物學資訊，
是我們瞭解生物分子之間作用機制的重要來源。透
過生物分子結構我們可以看到愛滋病病毒如何使用
其上的關鍵蛋白來感染人體細胞、蛋白質如何構成
堅韌如鋼的蜘蛛絲、蛇毒蛋白的毒理機制、蛋白質
酵素的運作機轉。數以不盡的生物界奧妙就藏在這
原子級的生物結構中。因此從一級基因序列歸納預
測蛋白質的功能，成為基因體研究中最重要的目標
之一，而在此極具挑戰性的研究範疇中，大量及快
速蛋白質結構的決定乃為此研究領域之成功指標
(圖一)。美國由其國家衛生研究院(National Institute
of Health, NIH)轄下的國家一般醫藥科學研究所主
導 ， 於 1998 年 開 始 規 劃 推 動 結 構 基 因 體 計 畫
(Structural Genomics Project;
http://www.nigms.nih.gov/psi/)，目前成立有九個蛋白
質結構中心，進行結構基因體實驗及計算的最先端
研究。日本理化學研究所(RIKEN)於 2002 年進行 ”
蛋 白 質 3000 計 畫 ” (Protein 3000 project;
http://www.mext-life.jp/protein/index.html#)，目標在
大量決定具生物醫學價值之蛋白質結構，有效應用
在未來基礎生物研究及工業應用上，如研發新藥
物。而台灣也自 2002 年開始投入大量人力與經費，
積極籌劃推動國內基因體醫學的各領域相關研究。
圖一 基因體與蛋白質結構功能之關係
目前解得生物巨分子立體結構主要的實驗方法有
X 光單晶繞射以及高磁場高解析核磁共振圖譜法。近
年來由於實驗儀器(同步加速器 X 光光源、核磁共振
的磁場強度)與實驗技術的進步，生物巨分子三度空間
立體結構被決定出來的數目正在急速地累積中，已經
足夠成為統計分析的數據來源。蛋白質資料銀行
(RCSB Protein Data Bank，PDB)自 1971 年起開始收集
全世界使用核磁共振 (Nuclear Magnetic Resonance,
NMR)、X 光生物巨分子結晶學(X-ray Macromolecular
Crystallography)、電子顯微鏡(Electron Microscopy)及
其它方法所解出來的三度空間立體結構。截至目前為
止(7/25/2006)總共收錄了 37,874 個生物巨分子結構，
其中以 X 光單晶結構的 32,096 個(約佔 84.7 %)為主
要，而核磁共振圖譜則有 5,571 個(約佔 14.7 %)。這個
資料庫所提供的資訊是全球最重要的蛋白質結構在原
子尺度層級(atomic level，~Å)的資料來源，為所有結
構生物學研究工作者瞭解蛋白質立體結構及其功能的
知識泉源(圖二)。生物大分子結構學家對於同步加速
器光源的使用率增加十分快速，從 1990 年到 2005 年
全世界使用同步加速器光源決定新結構的數量已從
18 % 增加到 76 %，而目前有超過 90 % 的大分子結
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晶學家需使用同步加速器光源。身為我國第一座大型
科學研究共用設施，國家同步輻射研究中心長期提供
各種光源給不同的研究領域使用，亦在最近幾年投入
不少人力與經費，積極發展蛋白質結晶學領域相關設
施與研究。
Year
圖二 近十五年(1990~2006 年)蛋白質資庫中結構發表之統
計數據 (資料來源：RCSB PDB)
在決定分子量愈來愈大且結構愈來愈複雜的生物
大分子三維結構時，結晶學方法一直在全世界結構生
物與結構基因體領域上佔有很重要的地位。同時，近
年來在發展各種疾病的新的診斷方法及藥物設計上，
同步加速器光源蛋白質結晶學已漸漸成為不可或缺的
工具。在台灣的同步輻射蛋白質結晶學實驗站的使用
與應用研究，在近幾年亦持續地成長中，分別從事各
種相關領域之重要研究。
生物大分子覆合體的晶體結構決定通常是高強
度、高通量的同步加速器光源在生物結構研究領域之
重要指標。一般最常見的應用是在病毒分子的結構決
定；病毒(virus)一般是由繁多的蛋白質所組成，具高
對稱性，其分子量包含 DNA 或 RNA 基因核酸可超過
數百萬道耳頓(dalton)。如此巨大分子的組成增加了研
究其晶體結構之困難度，例如較弱的繞射能力、晶胞
體積過大以及對輻射傷害的敏感度增加。因此對於傳
統實驗室 X 光繞射數據收集的種種限制，同步加速器
光源是必要且唯一的使用光源。除了病毒之外，核醣
體(ribosome)及 DNA/RNA 聚合脢(polymerase)覆合物
等之結構研究亦需有穩定、高強度之同步加速器 X 光
源長期有效之配合。以下將針對同步輻射蛋白質結晶
學的基本原理及其近期發展與應用研究做一簡短介
紹。
二、基本原理及其近期發展
蛋白質的準備
高濃度(約 10 mg/ml)和高純度(> 90%)的蛋白質，
是利用 X 光來解析蛋白質結構的基本條件，如此才能
進行長晶、X 光繞射實驗和結構解析的工作。一般我
們要得到如此大量且高純度的蛋白質有下列二種方
法：
(一) 從天然生物活體直接純化：收集大量含所欲研
究蛋白質之生物活體(如稻米芽鞘、蛇毒毒液、
細菌等)，利用個別蛋白質的不同物化特性來分
離特定蛋白質。例如可以利用蛋白質的分子
量、帶電量、親水性的高低或者是蛋白質專一
性高的抗體來純化所要解析結構的蛋白質。
(二) 利用分子生物學的方法來表現、純化蛋白質：
將欲表現蛋白質的 cDNA 送入細菌或是特定宿
主細胞中，利用這些宿主細胞的快速複製的特
性，來快速且大量地產生所要的特定蛋白質，
並經過後續的純化工作來得到大量且高純度的
蛋白質。
培養蛋白質晶體
在得到高純度的蛋白質之後，下一步驟即是使蛋
白質在穩定緩衝溶液中長成晶體。晶體是由最小單元
“晶胞“（unit cell）在三度空間中重複並且規則堆疊排
列所組成，具有折射面可折射光線，生活中最好的例
子就是水晶。典型的蛋白質晶體約由 1014 個晶胞（unit
cell）組成，長度大小約 0.2 mm，並平均約含 50 %體
積的水，如果這些水分子被移除晶體也會失去規則性
而被破壞。需要得到蛋白質晶體的理由為單一蛋白質
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分子在 X-光光源照射下的散射訊號太弱，偵測器無法
測出其強度，晶體具有重複堆疊的特性就像是個放大
器，把原本單一的分子散射訊號放大數兆倍以致可偵
測。
要培養出好的晶體必須找到適當的長晶條件，使
蛋白質規則排列並在三度空間方向的堆疊(單晶)。晶
體培養的方法有數種，而現今最常用的方法為懸吊式
蒸氣擴散長晶法（Hanging-drop Vapor Diffusion），此
種方法的優點在於方便快速並且所需蛋白量較少。在
初步的條件篩選方面，長晶條件是常無法有效預測且
沒有一定規則可循，不同的蛋白質所使用的條件可能
差異非常多，甚至單一氨基酸突變亦造成條件改變。
一些生技公司如“Hampton Research Co.”依據過去發
表結果將最常用的長晶條件整理並做成商業化產品，
其中包括了多組試劑提供最初步篩選長晶條件的好工
具，除了試劑外也提供與 X-光晶體學相關的商業產
品。配合大量試劑，目前已有自動化長晶設備可縮短
條件篩選時間與減少人力(圖三)。
圖三 Hydra eDrop (MATRIX)自動化長晶條件篩選系統
(左)；蛋白質晶體，其長約 0.2 mm(右)
數據收集與處理
在過去幾年中，台灣第一座位於日本 SPring-8 的
蛋白質結晶學實驗站於2002 年 9 月正式開放給國內用
戶使用，而同步輻射研究中心原有的 17B2 蛋白質結
晶學實驗站也隨即順利完成性能昇級(已於 2005 年第
一季退役)，此兩座實驗站均配備有先進的電荷耦合偵
檢器(CCD detector)以利 X 光繞射資料收集。此外，有
鑑於基因體醫學國家型科技計畫(National Science and
Technology Program for Genomic Medicine)的推動以
及蛋白質結晶學方法的進展，使得蛋白質結晶學光束
線時間需求量大增。國家同步輻射研究中心自 2002
年起負責建造兩座蛋白質結晶學專屬光束線，以作為
國家基因體計畫的 X 光核心設施。其中一座(BL13B)
為針對未知蛋白質結構解析用途，其能量是從 6.5 keV
到 19 keV 之 MAD/SAD 光束線；另一條(BL13C)為晶
體篩選、分子置換計算、藥物設計及高解析度結構分
析之用，其能量固定為 13 keV 之單色光束線。兩座實
驗站均配有最先進的高效率 CCD 偵測器、自動化的
樣品更換及晶體定位機制、微小晶體所需之微聚焦光
束以及快速電腦資料處理分析等，實驗站已於 2005
年九月對外開放(圖四)。可以預期的，國家同步輻射
中心對這些蛋白質結晶學光束線的建造發展，將有助
於提昇結構生物學資訊的研究。
圖四 國家同步輻射研究中心現有蛋白質結晶學專屬光束線
解決相位角問題
當然 X-光蛋白質晶體學所要使用的就是 X-光光
源，究其本質 X-光就是波，而波是由振幅和相位角這
兩個要素所構成。要由 X-光研究蛋白質結構需要的就
是重建波，其中振幅可直接由偵檢器上繞射點的強度
求得，但是相位角就必須使用其他的方法求得了。相
位角的求得是晶體結構分析的最大困難點，同時也是
最重要的步驟，只要相位角解出來即可得到電子密度
圖(圖五)，再經由電子密度圖建立蛋白質結構，以下
是目前常用解相位角的方法簡介。
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圖五 CCD 偵檢器上蛋白質晶體繞射點(左)；相位角問題：
結構因子包括振幅和相位角 (右)；電子密度與繞射點振幅
和相位角之關係式(下)
傳統 X-光蛋白質結晶學使用實驗室旋轉銅靶
(rotating anode)產生波長限制在 1.54 埃(Å)的 X-光源及
利 用 多 重 同 形 取 代 法 (Multiple Isomorphous
Replacement；MIR)方法將蛋白質晶體浸泡在不同的重
金屬溶液中(如汞、金、鉑等)，來測量蛋白質本身及
不同重金屬晶體在固定能量的 X-光照射下之繞射強
度數據的差異，其原理為使用重原子衍生物計算出重
原子位置，以解決結晶學中的相位問題，進而解出未
知蛋白質結構。其優點是使用實驗室旋轉銅靶即可收
集數據，然而受限於 X-光低強度、固定波長以及兩種
以上不同重金屬同形衍生蛋白質晶體之準備不易，使
得決定一全新未知蛋白質結構通常需較長時間。這個
方法裡也包含了單同形取代法（Single Isomorphous
Replacement；SIR），也就是只使用一個重原子衍生
物，不過相位角較不易準確解得，需要其他方法配合，
如電子密度改善，以減少相位角的計算誤差。
隨著同步輻射科技的快速進展，利用其光源之高
強度與能量波長可調性，發展出異常射散(Anomalous
Dispersion)方法來解決相位問題，於近年來成為一新
的主流趨勢而被廣泛應用。其主要原理為利用於蛋白
質晶體中的金屬原子(如鍶、鐵、鋅、鉑等)或其他特
殊元素(溴、碘等)，當入射 X-光在其原子特性能量附
近會產生異常散射現象。選擇不同單一波長對應蛋白
質單晶衍生物某重原子之異常振幅因子(∆f’和∆f”)極
大或極小，由此波長(∆f”極大)收集到的繞射數據相當
於一上述同形取代法之重金屬衍生物繞射數據，此為
單波長異常繞射方法 (Single-wavelength Anomalous
Diffraction ； SAD) ； 而 利 用 多 波 長 異 常 繞 射
(Multiple-wavelength Anomalous Diffraction；MAD)數
據則相當於 MIR 之多重金屬衍生物數據，藉此可以獲
得相位角(圖六)。另外，近年來利用蛋白質中硫原子
的單波長異常射散方法來決定結構，也逐漸被研究發
展。MAD 及 SAD 方法目前為全世界蛋白質結晶學家
廣泛使用，因為利用同步輻射可調性能量之 X-光遠比
準備多重金屬衍生蛋白質晶體要快速簡易，而利用異
常散射元素浸泡或分子生物學方法將鍶原子殖入蛋白
質中，也有效提供異常繞射晶體樣品。
圖六 X-光能量對應蛋白質單晶中重金屬鋅原子之異常振幅
因子(∆f’和 ∆f”)( 左 ) ；異常繞射差異的帕特森圖
(Anomalous Difference Patterson Map)可決定鋅原子位置進
而計算出蛋白質晶體的結構因子相位角(右)
其他目前常用解決相位角的方法有分子置換法
（Molecular replacement），使用分子置換法的條件受
限於必須要有已存在的相似結構，也就是已知和未知
結構的氨基酸序列至少需要 25 %以上的序列相同，此
法的原理為借用已存在相似結構經由旋轉及平移計算
來得到未知晶體中的相對位置，求得未知結構的相位
角。此法較為單純，在數據收集上並不需要特殊的要
求，也不需要有重金屬衍生物。
蛋白質結構建立與精調
解出結構因子之相位角是蛋白質結構晶體學裡最
重要的一步，只要有了正確的相位角即可得到“清晰”
且“連續”的電子密度圖，即具有α-螺旋與β-摺疊之二
級結構特徵，可進行蛋白質分子結構的建立(圖七)。
通常由上述方法解出之初始相位角具有很大的誤差(>
real
imaginary
Fhkl
Φhkl
Ahkl
Bhkl
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60o)，且根據此相位計算所得之電子密度圖而建立的
結構亦不全然正確與完整，為了使建立結構更接近實
驗數據就必須做精準化(refinement)。通常在晶體學裡
都以 R 值與 Rfree 值來判斷結構的精準度，R 值與 Rfree
值越小代表的就是所建立之分子模型越符合實驗數據
也越準確，一個典型的蛋白質結構的 R 值大約在 20 %
左右，基本上可被接受發表。
R =|| Fo |− | Fc ||∑
| Fo |∑
在建立蛋白質結構時通常須在電腦上來回進行，
依據電子密度圖建構越完整且正確之模型所獲得之計
算相位角越準確。如此反覆可得相位改善達到最佳
化，進而決定出最正確之蛋白質分子結構。同步輻射
X-光較傳統旋轉靶 X-光的強度要高上千、萬倍以上，
使得電子密度圖解析度大大提高(< 2 Å)，可更準確定
出蛋白質中的原子位置。目前有一些電腦程式可依據
初始相位角與高解析電子密度自動進行精準化建構模
型，加速結構解析。
圖七 清晰且連續的電子密度圖(~2.5 Å)，具有-平行摺板
之二級結構特徵(左)；電子密度圖清楚顯示錯誤的氨基酸位
置(右)
應用研究
１． 下圖是利用眼鏡蛇毒中的心臟毒蛋白與細胞膜
表面上肝素硫酸的類似物所做的複合結構(解析
度 2.4 Å) (圖八)。利用此結構來探討心臟毒蛋白
的毒理機制。因為蛇毒毒液中含有高達 50mM 的
檸檬酸，心臟毒蛋白利用檸檬酸來形成二元體，
並利用其上 Lys12-18-35 的陰離子口袋區來與細
胞膜表面的肝素硫酸結合，經由這樣的結合模
式，使蛇毒分子能夠大量的累積在細胞膜表面，
並增加其毒殺細胞的能力。
(圖八)
２．凝集素(lectin)，能對人類紅血球細胞有凝集的效
果。在植物中也有發現一級結構和其有相似性極
高的蛋白，稱為植物性凝集素。植物性的凝集素
的蛋白質結合的醣類多為 α-D-甘露糖（mannose）
或 α-D-半乳糖（galactose）。當植物遇到外界環境
壓力時(如鹽害、無氧環境、蟲害)，細胞中的凝
集素會大量表現，這些大量表現的凝集素可能會
與細胞核通道上的醣蛋白上的醣類結合，在細胞
核通道上形成障礙物，阻礙一些調控基因表現分
子的進出，而
促使植物在遇
到外界環境壓
力時，會有外
在形態表現的
不 同 ( 例 如 在
無氧環境下，
稻米的根部會
消失，但是卻會長出向上的芽鞘)。右上圖(圖九)
就是稻米凝集素的 3D 結構(解析度 1.8 Å)，它是
由 12 個 β-sheet 所組成。另外稻米凝集素在水溶
液中是二元體(dimer)的形態，此結構顯示出此蛋
白質的 8 個可能的氫鍵是幫助稻米凝集素形成二
元體的主要作用力，也因為這些作用力造成稻米
凝集素必須加熱到 100 °C 才會使這個二元體分
開。
３．Ferredoxin II，這是一個從懨氧菌 Desulfovibrio
gigas 中純化出來且含有一個 [3Fe-4S] 氧化還原
中心的蛋白質，主要功能為電子傳送。為了了解
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此蛋白在有氧與無氧環境下電子傳遞的情形，我
們同時在有氧與無氧環境下長晶體，並且得到了
高解析度的結構(圖十)（有氧狀態下為 0.9 埃；
無氧狀態下為 1.37 埃），使我們可看出有氧與無
氧下的氧化還原中心的差別，並且也在這個蛋白
的週圍發現六個金屬結合位置，均可使我們對此
蛋白有更進一步的認識。
(圖十)
４．生物蛋白質分子通常需要多元體來執行其功能，
分子間的作用力亦常在晶體的非對稱晶胞形成大
的 蛋 白 質 聚 合 體 ， 例 如 核 苷 二 磷 酸 激 酶
(Nucleoside Diphosphate Kinase，NDK)是一普遍
存在於真核及原核細胞的重要酵素，它能催化細
胞中 NTP 的γ-磷酸根轉換到 NDP。NDK 在所有
的生物體內細胞代謝上扮演著極重要的角色，它
維持著 DNA 及 RNA 合成所需 NTP 的一定量。
NDK 在細胞生長的影響及差異早已於動物體中
被證實，而在真核生物中亦有相當的證據顯示
NDK 與β-tubulin 形成分子覆合體，在分化過程中
有著重要的角色。許多的植物 NDK 基因已被發
現，如菠菜、蕃茄、燕麥等，此蛋白質均對植物
的成長與發育的功能有影響。NDK 亦被發現會自
成多聚合體而直接影響其活性與調控。在實驗室
中已證實此蛋白質在稻米種子發芽及初期生長期
間會出現量的改變，也發現 NDK 影響著稻米葉
鞘的伸展，而要更進一步了解 NDK 在稻米發育
過程的重要性，探討此酵素的晶體結構將可幫助
了解它的結構及功能上的關係。最近我們利用同
步加速器 X 光解出了 NDK 的晶體結構(圖十
一)，發現其結構是由 12 個蛋白質分子所組成，
總分子量超過二百萬道耳頓。如此巨大的分子覆
合體相對造成 X 光繞射數據收集的種種限制，例
如解析度不足(僅 2.5Å)與晶胞過大及輻射傷害
等，均增加了結構解析的困難。
(圖十一)
５．以蛋白質結構為基礎的藥物設計(structure-based
drug design)在尋找新藥物的過程中扮演一個很重
要的角色，其優點在降低成本，縮短時間以迅速
研發出新藥。另外，此方法可設計出更高的專一
性及更少副作用的藥物，其原理為利用先導藥物
(drug lead)與蛋白質三度空間結構去設計更有效
的抑制或活化蛋白作用之物質。大多數的製藥公
司及衛生研究組織自 1990 年已開始著手進行以
結構為基礎的藥物設計計畫並在此研究領域中長
久地投入強大的心血及努力，一些新藥研發成功
的例子已有報導並已發展到臨床試驗階段。所
以，以蛋白質結構為基礎的藥物設計在藥物研發
過程中將會扮演越來越重要的角色。在藥物研發
中，最為大眾感興趣的是合成出來的先導藥物如
何和蛋白質，也就是藥物標的(drug target)作用。
因為先導藥物通常都是小分子，其分子量比蛋白
質小很多，所以要清楚了解先導藥物與藥物標的
的作用需要高解析度的繞射數據才可以進行結構
分析。以蛋白質結構為基礎的藥物設計需要頻繁
且長久的光源使用時間。因為通常藥物研發時會
同時發展及合成多種的先導藥物，每一個先導藥
物的化學結構及生物活性都不同，所以需要一一
解出先導藥物與藥物標的的結構，以了解這些先
導藥物為什麼有如此不同的生物活性，因此需要
解很多蛋白質結構才能提供足夠的資訊來進一步
設計更有效、更安全的藥物。這也就是為什麼世
界有名的藥廠在同步輻射中心都設有專屬的光束
物理雙月刊（廿八卷四期）2006 年 8 月 667
線，供研發人員使用，進行這些藥物標的與有活
性的化合物的結構生物學實驗，以提供更多的資
訊幫助化學合成人員進行藥物最佳化過程(lead
optimization)以設計更有效的藥物。下圖為假單胞
菌(Pseudomonads putida)中酯酶(esterase)的晶體
結構(1.6 Å) (圖十二)。透過 3D 結構，我們可以瞭
解酯酶如何合成 DAT 分子作為抗高血壓抑制劑的
中間產物，進而提高合成效率。
(圖十二)
三、結語
生物巨分子立體結構提供的結構生物學資訊，是
我們瞭解分子之間作用機制的來源。而一蛋白質的獨
特功能常表現在其特殊的結構及氨基酸序列上。唯有
瞭解分子結構及其功能之間的關係，也就是功能性結
構生物的充分瞭解，是進一步進行醫藥研發、農產業
改良與生物科技發展的堅強基石。使用 X-光蛋白質結
晶學，是目前解得生物巨分子，例如蛋白質、核酸、
病毒等之立體結構的主要實驗方法。利用Ｘ光蛋白質
結晶學及新竹國家同步輻射研究中心(NSRRC)和日本
SPring-8 同步加速器Ｘ光線來進行蛋白質結構及基因
體之研究，所解得之生物巨分子立體結構，可提供建
立結構生物資訊中心資料庫、提高農產業效率與品種
改良；結合生物晶體結構及藥物資料庫篩選，可利中
西藥廠研發生物醫藥；同時，近年來在發展各種疾病
的新的診斷方法以及生物晶片產業，同步輻射 X-光蛋
白質結晶學已然成為一不可或缺的跨領域研究科學。
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187, 8470-8476 (2005).
(本文經作者授權同意與國家同步輻射研究中心簡訊
第 61 期同步於八月份刊登)
作者簡介
陳俊榮，美國匹茲堡大學結晶學博士，現任職國家同
步輻射研究中心研究組生命科學小組副研究員，清華
大學物理系合聘副教授。
Email: [email protected]
Trp31
Thr98Ser97
His256
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