Čo urobí lekár, ak nevie čo je pacientovi?

Čo urobí lekár, ak nevie čo je pacientovi?

1. Nič, vykašle sa na to.

2. Povie, že ma vaskulitídu.

3. Dá vyšetri ť autoprotilátky.

4. Pošle ho k imunológovi.

2. Povie, že ma vaskulitídu.

Antinukleárne protilátky.Vieme ich správne interpretova ť?

Gürtler Ľ, Cebecauer L Gürtler Ľ, Cebecauer L **

FNsP Bratislava, Oddelenie klinickej imunológie, Pe tržalka *Laboratóriá Pieš ťany, s.r.o.

Martin, 2010

DgDg ANAANA antianti--dsds

DNA*DNA*

antianti--SmSm antianti--U1 U1 RNPRNP

aa--SSA/SSA/SSBSSB

aa--SCL70SCL70

aa--Jo1Jo1 aa--ribribRNPRNP

ANCA ANCA MPOMPO--ANCAANCA

PR3PR3--ANCAANCA

ACLAACLA aa--B2GP IB2GP I IgM IgM RFRF

aa--CCPCCP

SLESLE �� �� �� �� �� �� �� �� �� ��

SjSSjS �� �� �� �� �� �� ��

SScSSc �� �� ��

MCTDMCTD �� �� �� �� ��

Autoprotilátky pri systémových chorobách

PM/DMPM/DM �� �� �� ��

APSAPS �� �� ��

vasculitisvasculitis �� �� �� ��

RARA �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� ��

* lepšie anti* lepšie anti--nukleozómynukleozómy� primárny skríningový test � doplnkový test � konfirmácia

Zlaté pravidlá:

Pozitívne ANA nemusia znamenať systémové ochorenie spojiva (SCHS)

Negatívne ANA takmer s istotou (99 %) SCHS vylučujú (s výnimkou RA)vylučujú (s výnimkou RA)

... Ale čo iné choroby ako SCHS?, napríklad: M. Crohn, Ulcerózna kolitída, AIH, PBC, AITP, AIHA, intersticiálne pľúcne, GN...

Cebecauer L, email 2010Cebecauer L, email 2010

ANAANA dsDNAdsDNA HistoneHistone SmSm U1RNPU1RNP SSSS--AA/Ro/Ro

SSSS--BB/La/La

SclScl--7070 JoJo--11 PCNAPCNA

SLESLE 9595 6060--8080 6060--7070 1515--3030 1010--4545 3030--5050 1515--2020 22--1010

Drug induced SLEDrug induced SLE 9090--9999 8080--9595

Frekvencia antinukleárnych protilátok (%)

MCTDMCTD 9595--9999 9595--9898

SjSjöögrengren´́s s syndromesyndrome

7575--8080 3030 4040--9595 4040--8585

Systemic sclerosisSystemic sclerosis 9090--9595 2020 1515--3030

PM/DMPM/DM 4040--6060 4040 2525

Indika čné kritéria (pod ľa autoprotilátky)AutoprotilátkaAutoprotilátka Ochorenia, symptómy, syndrómyOchorenia, symptómy, syndrómyAntinukleárneAntinukleárne Zápalové reumatické, pe čeňové autoimunitné, iné Zápalové reumatické, pe čeňové autoimunitné, iné

autoimunitnéautoimunitné

AntifosfolipidovéAntifosfolipidové Antifosfolipidový syndróm, vaskuli tídy, zápalové Antifosfolipidový syndróm, vaskulitídy, zápalové reumatickéreumatické

ANCA, MPO, PR3ANCA, MPO, PR3 Vaskulitídy, pulmorenálne syndrómy, glomerulonefrit ídy, IBD, Vaskulitídy, pulmorenálne syndrómy, glomerulonefrit ídy, IBD, cholestatické hepatitídy, iné (p ľúcne hemorágie, subglotická cholestatické hepatitídy, iné (p ľúcne hemorágie, subglotická stenóza trachey, ložiskový p ľúcny proces, protrahovaná sinusitída, stenóza trachey, ložiskový p ľúcny proces, protrahovaná sinusitída, otitída, retroorbitálna expanzia, mononeuritída)otitída, retroorbitálna expanzia, mononeuritída)

RF, Keratín, CCPRF, Keratín, CCP Reumatoidná artritídaReumatoidná artritída

GBMGBM Glomerulonefritídy (RP), pulmorenálne syndrómyGlomerulonefritídy (RP), pulmorenálne syndrómy

SMASMA Pečeňové autoimunitné (AIH)Pečeňové autoimunitné (AIH)

AMAAMA PBC, pe čeňové autoimunitné (AIH, Overlap syndrómy)PBC, pečeňové autoimunitné (AIH, Overlap syndrómy)

LKM, SLA/LPLKM, SLA/LP Hepatocelulárne poškodenie pe čene (vírusové, poliekové, Hepatocelulárne poškodenie pe čene (vírusové, poliekové, autoimunitné)autoimunitné)

APCA, intrinsic factorAPCA, intrinsic factor Atrofická gastritída, pernici ózna anémiaAtrofická gastritída, perniciózna anémia

ASCA, pancreas (acini, secretion)ASCA, pancreas (acini, secretion) IBD (Crohnova chor oba)IBD (Crohnova choroba)

TPO, TG, TRAK, rTSHTPO, TG, TRAK, rTSH Autoimunitné ochorenia štítnej ž ľazyAutoimunitné ochorenia štítnej ž ľazy

GAD, IA2, inzulínGAD, IA2, inzulín Diabetes mellitus (IDDM)Diabetes mellitus (IDDM)

Prvá veta: Vo väčšine populácií až 75% osôb s detegovanými ANA protilátkami nemá identifikované reumatické ochorenie, avšak ANA u zdravých ľudí sú v nízkej koncentrácií, polyreaktívne, s nízkou afinitou a často IgM.polyreaktívne, s nízkou afinitou a často IgM.

Posledná veta:Správnym riedením séra redukujeme „Iatrogénnu ANA neurózu“ u pacientov s ANA pozitivitou a nešpecifickými prejavmi.

Cebecauer L, email 2010Cebecauer L, email 2010Indian J Med Res 126, July 2007, 10-11 A. Wanchu

485 zdravých darcov krvi

62 (12,7%) ANA pozitívnych sér

Detection & identification of antinuclear antibodies in the serum of normal blood donors

23 (4,7%)

15 (3,0%)

1 (0,2%) Clin Exp Rheumatol 1993, 11: 393

485 zdravých darcov krvi

62 (12,7%) FITC polyvalentný, sérum 1:40

ANA pozitivity

23 (4,7%)

15 (3,0%)

1 (0,2%)

FITC IgG, 1:40

FITC IgG, 1:160

anti-Ro

485 zdravých darcov krvi

62 (12,7%) ANA pozitivít

CIE 1 anti-RoIF Crithidia 1 ds DNA, 1:40, nie IgGImunoblot 18 nedefinovaných

72% Speckled17% Homogénny11% Nucleolar

Muži 17/257 (6,6%)Ženy 45/228 (19,7%)>40r 26/83 (31,3%)<40r 19/145 (13,1%)

Imunoblot 18 nedefinovaných 11% Nucleolar<40r 19/145 (13,1%)

ZÁVERY:1. Prevalencia ANA je závislá od veku a pohlavia.

2. Prevalencia ANA odráža prevalenciu NOAs (natural occuring autoantibodies).

3. Pre ďalšiu identifikáciu sú potrebné citlivejšie metódy ako IF.

4. Väčšina, ale nie všetky NOAs, sú izotypu IgM, majú nízku väzbovú afinitu, ale značnú skríženú reaktivitu.

AutoprotilátkaAutoprotilátkaPrediktívna?Prediktívna?

Epifenomen(ón)? Epifenomen(ón)?

Falošná pozitivita? Falošná pozitivita?

Diagnostická hodnota?Diagnostická hodnota?

Titer, vek pacienta?Titer, vek pacienta?

Prognostická hodnota?Prognostická hodnota?

Diagnostic delaySLE 4rSjS 6r

asymptomatickýoligosymptomatický

SLE (dsDNA, Sm, Rib-P, PCNA, nucleosome?)

SSc(CENP-B, Topo/Scl)

ASCA a M.Crohn

TiterTiter ANAANA

dsDNA - 9r 87% SLEAMA - 5r 50% PBC

20r 95% PBC

+ -

Špecificita?Špecificita?

Klinická korelácia?Klinická korelácia?

Počet špecifických?Počet špecifických?

SSc(CENP-B, Topo/Scl)

Veľa protilátok nemá klinickú koreláciualebo ju zatiaľ nepoznáme

ds-DNA, anti-C1Q nefritídaanti-MPO/PR3 - aktivita

anti-GBM - aktivitaAnti-protrombín - SLE trombózy

APCA/anti-GPC - atrofia

TiterTiter ANAANApozitivitapozitivita

(%)(%)

1:401:40 3232

1:801:80 1313

1:1601:160 55

1:3201:320 33

+ - PrevalenciaPrevalencia %%Štítna žľazaŠtítna žľaza 3.03.0

CeliakiaCeliakia 1.51.5

Reumatoidná artritídaReumatoidná artritída 1.01.0

SjSjöögrenov syndrómgrenov syndróm 0.60.6

SLE SLE 0.120.12

MetódaMetóda (ne)výhoda(ne)výhoda Klinický významKlinický významPriama imunofluorescenciaPriama imunofluorescencia subjektívna, mikroskopiasubjektívna, mikroskopia bioptická diagnostikabioptická diagnostika

NepriamaNepriamaImunofluorescencia Imunofluorescencia

subjektívnasubjektívnamikroskopiamikroskopia

autoprotilátky (Ab)autoprotilátky (Ab)

ImunohistochémiaImunohistochémia subjektívna, mikroskopiasubjektívna, mikroskopia enzýmy, peptidy, Ab enzýmy, peptidy, Ab

ELISA ELISA objektívnaobjektívna„kvantifikovateľná“„kvantifikovateľná“

cirkulujúce autoprotilátkycirkulujúce autoprotilátkyšpecifické proteínyšpecifické proteíny

TurbidimetriaTurbidimetria často používané OKBčasto používané OKB špecifické proteíny, Abšpecifické proteíny, Ab

NefelometriaNefelometria presné, často používanépresné, často používané špecifické proteínyšpecifické proteíny

ChemiluminiscencieChemiluminiscencie presné, senzitívnepresné, senzitívne špecifické proteíny, Abšpecifické proteíny, Ab

Fluorescen čné imunoassay Fluorescen čné imunoassay presné, senzitívnepresné, senzitívne špecifické proteíny, Abšpecifické proteíny, Ab

ImunoblotyImunobloty náročné, skúsenosťnáročné, skúsenosť autoprotilátkyautoprotilátky

LIA (line immunoassay)LIA (line immunoassay) nenáročné, drahénenáročné, drahé autoprotilátkyautoprotilátky

Multiplexové metódyMultiplexové metódy finančne náročnéfinančne náročné proteíny, autoprotilátky, inéproteíny, autoprotilátky, iné

Imunodifúzie, imunoelfoImunodifúzie, imunoelfo časovo náročné, prácnečasovo náročné, prácne proteíny, autoprotilátkyproteíny, autoprotilátky

Prietoková cytometriaPrietoková cytometria „rutina“ na OKI„rutina“ na OKI subpopulácie lymfocytov (CD)subpopulácie lymfocytov (CD)

ImunofluorescenciaImunofluorescencia ELISAELISANatívne antigény in situNatívne antigény in situ Závislé od antigénov (natív ne, rekomb.)Závislé od antigénov (natívne, rekomb.)

Jadrové aj cytoplazmatické antigény Jadrové aj cytoplazmatické antigény Závislé od izolác ieZávislé od izolácie

Subjektívne hodnotenieSubjektívne hodnotenie Objektívne a reprodukovate ľnéObjektívne a reprodukovate ľné

Nieko ľko protilátok sú časne (?)Nieko ľko protilátok sú časne (?) Skríning vs izolované antigénySkríning vs izolované antigény

Semikvantitatívne hodnotenieSemikvantitatívne hodnotenie cutcut--off, kalibra čná krivka off, kalibra čná krivka

Závislos ť od hodnotiacehoZávislos ť od hodnotiaceho Nevyžaduje špeciálny tréningNevyžaduje špeciálny tréning

Kvalita substrátuKvalita substrátu Nezávislé od substrátovNezávislé od substrátovKvalita substrátuKvalita substrátu Nezávislé od substrátovNezávislé od substrátov

Závislos ť od kvality mikroskopu Závislos ť od kvality mikroskopu Premýva čka, reader, softvérPremýva čka, reader, softvér

Nešpecifické pozitivity ( často?)Nešpecifické pozitivity ( často?) Vyššia špecificita (špecifickos ť)Vyššia špecificita (špecifickos ť)

Malá automatizácia (laborant)Malá automatizácia (laborant) Automatizované (ve ľa vzoriek)Automatizované (ve ľa vzoriek)

Výsledky sú rýchloVýsledky sú rýchlo

IF versus ELISA: prístrojové vybavenie, počet pacientov, ordinujúci kliniciAk dominuje reumatológia: 1. IFA.....2. iné na konfirmáciu

ANA pozitivita

1.Kvantifikácia (titer riedenia, index, IU/ml)

2. IF vzor

3. Identifikácia antigénu

4. Dynamika (bez, vymiznutie, zmena spektra)

5. Komplement k ostatnému

Autoprotilátková pozitivita

1.Kvantifikácia (titer riedenia, index, IU/ml)

2. IF vzor

3. Identifikácia antigénu

4. Dynamika (bez, vymiznutie, zmena spektra)

5. Komplement k ostatnému

semikvantitatívnesemikvantitatívne IntenzitaIntenzitaIFIF

negatívnenegatívne --

hraničnéhraničné +/+/--

Hodnotiace kritéria IF testov

SubstrátSubstrát Titer Titer („end point“)(„end point“)

ANCAANCA 1:201:20

HEp bunkyHEp bunky 1:100/1601:100/160

slabo pozitívneslabo pozitívne +(1+)+(1+)

pozitívnepozitívne ++(2+)++(2+)

silno pozitívnesilno pozitívne +++(3+)+++(3+)

veľmi silno pozitívneveľmi silno pozitívne ++++(4+)++++(4+)

Presnos ť IF je limitovaná interlaboratórnou variabilitou !(substrát, procedúra, subjektívnosť interpretácie, skúsenosť hodnotiaceho, mikroskop...)

LKS (potkan, myš)LKS (potkan, myš) 1:80/401:80/40

SaccharomycesSaccharomyces 1:101:10

Monkey esophagusMonkey esophagus 1:5/201:5/20

Monkey pancreasMonkey pancreas 1:101:10

U/mlU/ml RatioRatio EvaluationEvaluation EvaluationEvaluation

> 8.0 > 8x Cutoff8x Cutoff very strong positivevery strong positive ++++++++

> 4.0-8.0 > 44--8x Cutoff8x Cutoff strong positivestrong positive ++++++

> 2.0-4.0 > 22--4x Cutoff4x Cutoff positivepositive ++++

Hodnotiace kritéria ELISA testov

> 2.0-4.0 > 22--4x Cutoff4x Cutoff positivepositive ++++

> 1.0-2.0 > 11--2x Cutoff2x Cutoff weak positiveweak positive ++

1.0 1x Cutoff1x Cutoff borderlineborderline (+)(+)

<1.0 <1x Cutoff1x Cutoff negativenegative --

Typ antigénu purifikovaný, rekombinantný, mixtúry, konformačné epitopy

Komplexnos ť antigénového substrátu nie je absolútnou garanciou „good test performance“

Veľká variabilita testov (príprava antigénu, procedúra, hodnoty cutoff...)

Autoprotilátková pozitivita

1.Kvantifikácia (index, IU/ml, titer riedenia)

2. IF vzor

3. Identifikácia antigénu

4. Dynamika (bez, vymiznutie, zmena spektra)

5. Komplement k ostatnému

Antinukleárne Antinukleárne protilátkyprotilátky

LokalizáciaLokalizáciaTyp fluorescencieTyp fluorescencie

Asociované Asociované ochoreniaochorenia

antianti--ds/ssds/ss--DNADNA Chromatín, Homogeneous (H)Chromatín, Homogeneous (H) SLESLE

antianti--histonehistone Chromatín, HChromatín, H SLE, AIH, PBCSLE, AIH, PBC

antianti--nucleosomenucleosome Chromatín, HChromatín, H SLESLE

antianti--SclScl--70 (Topoisomerase)70 (Topoisomerase) Chromatín, H, speckled/nucleolarChromatín, H, speckled/nucleolar SScSSc

antianti--centromerecentromere Chromatín, Multiple speckledChromatín, Multiple speckled CREST, PBCCREST, PBC

antianti--U1RNPU1RNP Nucleus, speckledNucleus, speckled MCTDMCTD

antianti--SmSm Nucleus, speckledNucleus, speckled SLESLEantianti--SmSm Nucleus, speckledNucleus, speckled SLESLE

antianti--SSSS--A/RoA/Ro Nucleus, speckledNucleus, speckled SjS, SLE, AIHSjS, SLE, AIH

antianti--SSSS--B/LaB/La Nucleus, speckledNucleus, speckled SjS, SLE, AIHSjS, SLE, AIH

antianti--p80 coilinp80 coilin Nucleus, FND (few nuclear dots)Nucleus, FND (few nuclear dots) SjS, PBCSjS, PBC

antianti--PCNAPCNA Nucleus, typický vzorNucleus, typický vzor SLESLE

antianti--RNA polymeraseRNA polymerase Nucleolus, nucleolarNucleolus, nucleolar SScSSc

antianti--PMPM--SclScl Nucleolus, nucleolarNucleolus, nucleolar PM/DM Overlap PM/DM Overlap

antianti--JoJo--11 CytoplazmaCytoplazma PM, DMPM, DM

antianti--ribosomalribosomal CytoplazmaCytoplazma SLESLE

antianti--mitochondrialmitochondrial CytoplazmaCytoplazma PBCPBC

Autoprotilátková pozitivita

1.Kvantifikácia (index, IU/ml, titer riedenia)

2. IF vzor

3. Identifikácia antigénu

4. Dynamika (bez, vymiznutie, zmena spektra)

5. Komplement k ostatnému

SpeckledHomogeneousNucleolar(Speckled)

IF HEp2 cells

Centomere,Mitotic struct.

ANA diagnostický postup - „cascade testing“(1/ skríning… 2/ špecifikácia antigénu)

ELISA Screen

(Speckled)+

Homogeneous

Mitotic struct.

SS-A/RoSS-B/LaU1RNP

SmPCNA

ds DNAHistone

DNPNucleosome

Scl-70(Topoisomerase 1)

Others

CytoplasmAMA, FND, Jo-1, Ro…

HEp2 IFHEp2 IF

++ --

Korelácia medzi nepriamou imunofluorescenciouna HEp2 bunkách a skríningovým ELISA testom

ELISAELISAScreenScreen

++ XXXX

-- XXXX

OO

OO

IF versus ELISAIF versus ELISA(1365 sér)(1365 sér)

HEp2 IFHEp2 IF

++ --

ELISAELISA++

6161(4,5%)(4,5%)

106106(7,8%)(7,8%)

Konkordantné (concordance), zhoda (agreement), Diskordantné, diskrepantné výsledky

ScreenScreen--

123123(9,0%)(9,0%)

10751075(78,7%)(78,7%)

ELISA testy (konkordancia):1. Natívne a purifikované, rekombinantné, kombinované (80%)2. Extrakty (HEp2, HeLa) buniek (70-90%)3. Kombinácie 1+2 (80-83%)

IF versus ELISAIF versus ELISAHEp2 IFHEp2 IF

++ --

ELISAELISAScreenScreen

++ ?*?* 5,9%5,9%

-- ?*?*14,2%14,2%-- ?*?*

372 (14,2%) diskrepantne negatívnych 213 nedokázaný antigén (ELISA, ANA onlys)159 (6%) falošne negatívnych - 69 (anti-dsDNA)- 63 (anti-Histone)- 14 (anti-SSA/Ro)

*2084 (79,9%) konkordantných výsledkovCobas Core HEp ANA EIA Roche

14,2%14,2%

HEp2 IFHEp2 IF

++ --

ELISAELISAScreenScreen

++ OO

-- OOXXXX

XXXX

„falošné pozitivity“ Neprítomné antigény v ELISA

ANA Onlys

„falošné negativity“

Diskrepantné pozitivity sčasti identifikujeme ďalším testom (špecifická ELISA, imunoblot)Diskrepantné negativity sú väčší problém, môžu ostať nedetegované!

titrácia séraZopakova ť(3 mesiace)

Indikujúci Indikujúci odborníkodborník

%%

ReumatológReumatológ 25 25

InternistaInternista 1515

GastroenterológGastroenterológ 77

DermatológDermatológ 55

HEp2 IF HEp2 IF vzorvzor

%%

SpeckledSpeckled 42.542.5

HomogeneousHomogeneous 41.541.5

NucleolarNucleolar 10.510.5

CentromereCentromere 4.04.0

AntigénAntigén %%

SSSS--A/Ro A/Ro + SS+ SS--B/LaB/La

12.012.0

SSSS--A/RoA/Ro 10.510.5

SSSS--B/LaB/La 6.56.5

Nucleosome,Nucleosome,NeurológNeurológ 55

NefrológNefrológ 33

Iné (imunológ?)Iné (imunológ?) 1515

ExternistiExternisti 2525

OtherOther 1.51.5 Nucleosome,Nucleosome,dsDNA, histonedsDNA, histone

5.25.2

CentromereCentromere 4.04.0

RNPRNP 3.23.2

SmSm 1.81.8

SclScl 1.21.2

JoJo 0.20.2

University Ghent Hospital, 3 roky, 10 550 sér, ANA vyšetrenie

INTERPRETÁCIA ANA POZITIVITY(snaha identifikova ť antigén)

1. Laboratórny epifenomén- Infekcie (superantigény)- Lieky (aromatické amíny, hydantoíny...)- Iné (vek, pohlavie, rodinná anamnéza,

malignity, transplantácie) malignity, transplantácie)

2. Subklinické zápalové reumatické och.3. Zápalové reumatické ochorenia4. Iné autoimunitné ochorenia5. Prirodzená autoprotilátka (SMA, ANA, AMA)

Interpretácia antinukleárnych protilátok

Ďalšia identifikácia antigénu: a/ len pozitivity v skríningub/ niektoré ENA (4.5-5.5%) môžu uniknúť detekcii

pri IF (Jo-1, SS-A/Ro, SS-B/La), iné? (dsDNA, históny) c/ ak je jasná klinická indikácia, aj pri IF negativite

(SjS, polymyozitída)

d/ ELISA a /alebo imunoblotomd/ ELISA a /alebo imunoblotom„Diagnostická versus analytická senzitivita“ (citlivos ť)

Diagnostická (vo vzťahu k diagnóze) musí byť prioritnejšia než analytická (napr. štruktúry HEp alebo bloty s neznámymi hodnotami)

ANA Onlysácibez klinických prejavov, ANA pozitivita, nedefinovaný antigénNevhodnos ť ELISA skríningových testov na:„low sensitivity antigens“ (Jo-1, rRNP, nukleolárne/ syntetázové)

Reumatologické guidelines:1:160 a viac je pozitívne, skríningová ELISA aspoň 90% konkordancia s IF

DIAGNOSTIKA AUTOIMUNITNÉHO OCHORENIA

Klinická

Laboratórna

Fyzikálnevyšetrenie

AnamnézaZobrazovacie

metódy

LaboratórnaLaboratórna Interpretáciaautoprotilátky

- orgánové poškodenie

- markery aktivity

1. Klinik by mal vedie ť čo chce vyšetri ť a prečo.

2. Laboratórium by to malo urobi ť čo najlepšie a najpresnejšie.

ZÁVER

a najpresnejšie.

3. Klinik a laboratórium by mali spolupracova ť.

4. Žiaden laboratórny výsledok nenahradí klinické myslenie.