ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

“ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ”

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ

ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

ΧΑΤΖΗ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ

ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2002

2

Αφιερώνεται σε όσους

μου συμπαραστάθηκαν

3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

ΠΡΟΛΟΓΟΣ ………………………………………………………………………...... 6 1. Επαγωγή της έκφρασης των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών και των ρετροϊκών στοιχείων VL30 σε κύτταρα επίμυος NIH3T3. …………………………

7

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ …………………………………………………………………….... 8 Α. 1. Κινητοποιήσιμες επαναλλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA. ……………… 8 Α. 2. Μηχανισμός Ρετρομετάθεσης. ……………………………………………... 10 A. 3. Αποτελέσματα της Ρετρομετάθεσης στο Γονιδίωμα……………………….. 11 Α. 4. Μεταθετά Στοιχεία VL 30 …………………………………………………. 12 Α. 4. 1. Δομικά Χαρακτηριστικά των VL30 στοιχείων. ……………………… 12 Α. 4. 2. Λειτουργικές ιδιότητες των στοιχείων VL30. ………………………... 13

Α. 4. 3. Ρετρομετάθεση των VL30 σε καρκινικά και μετασχηματισμένα κύτταρα. ………………………………………………………………………..

15

Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ. ……………………………………………………... 17 Γ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ………………………………………………………… 18 Γ. 1. Κυτταρική σειρά NIH3T3 cl.17 και συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας …... 18 Γ. 2. Απομόνωση RNA από τη κυτταρική σειρά NIH3T3 cl.17 …………………. 19 Γ. 3. Ηλεκτροφόρηση του RNA-Αποτύπωση κατά Νorthern (Νorthern Βlotting) . 20 Γ. 3. 1. Ηλεκτροφόρηση του RNA. …………………………………………… 21 Γ. 3. 2. Μεταφορά του RNA από τη πηκτή σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. ….. 21 Γ. 3. 3. Προϋβριδισμός ………………………………………………………… 22 Γ. 3. 4. Υβριδισμός υψηλής συγγένειας. ………………………………………. 22 Γ. 3. 5. Έκπλυση και αυτοραδιογραφία. ……………………………………….. 23 Γ. 3. 6. Αποϋβριδισμός. ……………………………………………………….. 23

Γ. 4. Ραδιενεργός ιχνηθέτηση DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). ………………………………………………………………

23

Γ. 5. Ραδιενεργός ιχνηθέτηση DNA με τη μέθοδο μετάφρασης εξ εγκοπής. …….. 25 Γ. 6. Χρωματογραφία στήλης μοριακής διήθησης με πληρωτικό υγρό Sephadex G-50 ……………………………………………………………………………….

25

Γ. 7. Παρασκευή DNA του ιχνηθέτη VL30. ……………………………………... 26 Γ. 8. Καθαρισμός DNA από πηκτή αγαρόζης με silica. ………………………….. 26 Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ……………………………………………………………… 28

Δ. 1. Επίδραση του αλκυλιωτικού παράγοντα MMS στην έκφραση των γονιδίων για το ενδογενές ένζυμο ανάστροφη μεταγραφάση (enRTs) και των VL30 ρετροστοιχείων. …………………………………………………………………...

28 Δ. 2. Επίδραση του αντικαρκινικού φαρμάκου Ετοποσίδιο στην έκφραση των ενδογενών γονιδίων της ανάστροφης μεταγραφάσης (enRTs) και των ρετροστοιχείων VL30. ……………………………………………………………

30 Δ. 3. Επίδραση του βαναδίου στην έκφραση των ρετροστοιχείων VL30 και των ενδογενών γονιδίων της ανάστροφης μεταγραφάσης. ……………………………

31

Δ. 4. Επίδραση του C2-κεραμιδίου στην έκφραση RNA των ρετροστοιχείων VL30 και των ενδογενών γονιδίων της ανάστροφης μεταγραφάσης. …………….

34

Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ……………………………………………………………………… 36 Ε. 1. Επαγωγή των ρετροστοιχείων VL30. ……………………………………….. 36 Ε. 2. Επαγωγή των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών. ……………………. 36 ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ……………………………………………………………….. 38

4

2. Ανίχνευση της παραθυμοσίνης στην απλή οζώδη βρογχοκήλη. Μελέτη της προθυμοσίνης α στην απόπτωση και στον κυτταρικό πολαπλασιασμό. …………...

41

A. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ………………………………………………………………………. 42 A. 1. Παραθυμοσίνη. Η πρωτοταγής δομή της πρωτεΐνης. ……………………… 42 Α. 1. 1. Το γονίδιο της παραθυμοσίνης ……………………………………….. 43

Α. 1. 2. Κατανομή της παραθυμοσίνης σε ιστούς και ενδοκυττάρια θέση της. 44 Α. 1. 3. Βιολογικός ρόλος της ParaTa. ………………………………………... 45 Α. 2. Πρωτοταγής δομή της πρoθυμοσίνης α. ……………………………………. 46 Α. 2. 1. Οργάνωση του γονιδίου της προθυμοσίνης α. ………………………... 46 Α. 2. 2. Ιστική κατανομή της προθυμοσίνης α και η ενδοκυττάρια θέση της. ... 47 Α. 2. 3. Βιολογικός ρόλος της προθυμοσίνης α. ………………………………. 47 Α. 2. 3. 1. Βιολογικός ρόλος της ProTa στην απόπτωση. ………………….. 48 Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ. ……………………………………………………... 52 Γ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ………………………………………………………... 53 Γ. 1. Απομόνωση ολικού γενωμικού DNA ………………………………………. 53 Γ. 2. Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, PCR ………………………………… 53 Γ. 3. Κυτταρικές σειρές και συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας ………………… 54 Γ. 4. Εκχύλιση πρωτεϊνών ………………………………………………………... 55 Γ. 5. Ηλεκτροφόρηση πρωτείνών σε πηκτή SDS–πολυακρυλαμιδίου. …………... 55

Γ. 6. Μεταφορά και ανίχνευση πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη με ανοσοαποτύπωση. …………………………………………………………………

57

Γ. 7. Αντισώματα του C-τελικού άκρου και του Ν-τελικού άκρου. ……………... 57 Γ. 8. Απομόνωση RNA σε κυτταρικές σειρές. …………………………………… 58 Γ. 9. Αποτύπωση κατά Νorthern (Νorthern Βlotting) ……………………………. 59 Γ. 9. 1. Ηλεκτροφόρηση του RNA …………………………………………….. 59

Γ. 9. 2. Επίπεδα mRNA της ProTa στη κυτταρική σειρά Hela σε συνθήκες απόπτωσης. ……………………………………………………………………..

60

Γ. 9. 3. Επίπεδα mRNA της ProTa σε κυτταρικούς πληθυσμούς υπό κανονικές συνθήκες. ……………………………………………………………………….

61

Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ……………………………………………………………… 63 Δ. 1. Ενίσχυση του γονιδίου της παραθυμοσίνης ………………………………… 63 Δ. 2. Μελέτη της πρωτεΐνης της προθυμοσίνης στη διαδικασία απόπτωσης. ……. 65

Δ. 3. Μελέτη του γονιδίου της Pro Ta σε επίπεδο πρωτεΐνης στις κυτταρικές σειρές CHO-MT-GSH και CHO-MT-UTR . ……………………………………..

67

Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ……………………………………………………………………… 68 ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ……………………………………………………………….. 71 3. Ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο p53 σε καρκίνο του μαστού με τη μέθοδο DGGE …………………………………………………………………

75 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ………………………………………………………………………. 76 Α. 1. Η πρωτεΐνη p53. …………………………………………………………….. 76 A. 2. Δομή του γονιδίου και της πρωτεΐνης του p53. ……………………………. 76 Α. 3. Βιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης p53. ……………………………………... 78 Α. 4. p53 και καρκίνος του μαστού. ……………………………………………… 79 Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ……………………………………………………… 82 Γ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ………………………………………………………… 83 Γ. 1. Απομόνωση DNA από νωπά ιστικά δείγματα μαστού. …………………….. 83 Γ. 2. Ενίσχυση των εξονίων 5 έως 8 του γονιδίου p53 με την αντίδραση PCR. … 83 Γ. 3. Ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο p53 με τη μέθοδο DGGE. …………… 85 Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. ……………………………………………………………... 89 Δ. 1. Ενίσχυση των εξονίων 5-8 του γονιδίου της p53. ………………………….. 89 Δ. 2. Ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο του p53 με τη μέθοδο DGGE. ………. 90 Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ……………………………………………………………………… 91

5

ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ………………………………………………………………. 93 4. Έκφραση της πρωτεΐνης κινητοποίησης που κωδικοποιείται από την περιοχή ORF1 του πλασμιδίου pZMO3 του στέλεχος ATCC 10988 του βακτηρίου Zymomonas Mobilis. ………………………………………………………………….

96

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ……………………………………………………………………… 97 Α. 1. Το βακτήριο Zymomonas mobilis ………………………………………………. 97 Α. 2. Το πλασμίδιο pZMO3 του στέλεχος ATCC 10988 του Z. mobilis. ………... 98 Α. 3. Ικανότητα κινητοποίησης του πλασμιδίου pZMO3 ………………………... 99 Α. 4. Γενετικός ανασυνδυασμός βακτηρίων. …………………………………….. 101 Α. 5. Βακτηριακή σύζευξη ……………………………………………………….. 101

Α. 6. Επιβοηθούμενη βακτηριακή σύζευξη ή συζευκτική παρακίνηση ή κινητοποίηση (mobilization) ………………………………………………………

103

A. 7. Φύση των περιοχών έναρξης της μεταφοράς, oriT. ………………………... 104 A. 8. Αντίδραση τρανσεστεροποίησης που καταλύεται από ριλαξάση ………….. 105 Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ. ……………………………………………………... 107 Γ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ………………………………………………………… 108 Γ. 1. Πλασμίδια. ………………………………………………………………….. 108 Γ. 2. Ανάπτυξη βακτηρίων σε υγρή καλλιέργεια και σε στερεό θρεπτικό υλικό. .. 110 Γ. 3. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA. …………………………………………... 110 Γ. 4. Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς. …………………………….. 111 Γ. 4. 1. Πέψη πλασμιδιακού DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες. ………... 112 Γ. 4. 2. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης. …………………………… 112 Γ. 4. 3. Καθαρισμός DNA από πηκτή αγαρόζης με silica. …………………….. 113 Γ. 4. 4. Σύνδεση περιοριστικών τμημάτων DNA. ……………………………... 114 Γ. 4. 5. Μετασχηματισμός του βακτηρίου E. coli DH5a με πλασμιδιακό DNA. 115 Γ. 4. 6. Επιλογή αποικιών που περιέχουν τα μετασχηματισμένα κύτταρα. …… 115 Γ. 4. 7. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από E. coli DH5a. ………………….. 115 Γ. 5. Κλωνοποίηση με το TA Cloning Kit της εταιρείας Invitrogen ……………... 116117

Γ. 5. 1. Ενίσχυση DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). ……………………………………………………………

118

Γ. 5. 2. Κλωνοποίηση εντός pCR2.1 του PCR προϊόντος. …………………….. 118 Γ. 5. 3. Μετασχηματισμός των κυττάρων INVaF΄ με το ανασυνδιασμένο πλασμιδιακό DNA. ……………………………………………………………...

119

Γ. 5. 4. Απομόνωση και ανάλυση του ανασυνδιασμένου πλασμιδιακού DNA με ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα και αλληλούχιση. ………………………..

120

Γ. 6. Μεταφορά DNA από πήγμα αγαρόζης σε νάυλον φιλτρο (υβριδισμός κατά Southern). ………………………………………………………………………….

120

Γ. 7. Μεταφορά του DNA από τη πηκτή σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. ……....... 121 Γ. 8. Μη ραδιενεργός υβριδισμός DNA-DNA. …………………………………... 121 Γ. 9. Κατασκευή του DNA ιχνηθέτη……………………………………………… 121 Γ. 10. Σήμανση DNA με digoxigenine-11-dUTP (dig-11-dUTP)………………… 121 Γ. 11. Υβριδισμός του ιχνηθέτη DNA με το ακινητοποιημένο DNA. ……. 122 Γ. 12. Εκπλύσεις και χρωμογόνος αντίδραση…………………………………. 123 Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ………………………………………………………………. 124

Δ. 1. Κλωνοποίηση της πρωτεΐνης κινητοποίησης στο φορέα υπρέκφρασης pET3d………………………………………………………………………………

124

Δ. 2. Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της ρηλαξάσης της περιοχής ORF1……... 124 Δ. 2. Μοριακή κλωνοποίηση του τμήματος DNA ORF1 που ενισχύθηκε με PCR. 127 Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ………………………………………………………………………. 129 ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ………………………………………………………………... 130

6

ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στην Ιατρική Σχολή και στο Τμήμα Χημείας

του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος

Ειδίκευσης "ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ". Αποτελείται από τέσσερις επιμέρους εργασίες οι

οποίες πραγματοποιήθηκαν στα ακόλουθα εργαστήρια:

§ Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας (Ιατρική Σχολή). Στο εργαστήριο αυτό

πραγματοποιήθηκε εξάμηνη εργασία με τίτλο: “Επαγωγή της έκφρασης των

ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών και των ρετροϊικών στοιχείων VL30 σε

κύτταρα επίμυος ΝΙΗ3Τ3” υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή Θεόδωρου

Τζαβάρα και της υποψήφιας Διδάκτορος Σοφίας Ευταξία.

§ Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας (Ιατρική Σχολή). Στο δεύτερο εξάμηνο

σπουδών πραγματοποιήθηκε εργασία με τίτλο: “Ανίχνευση της παραθυμοσίνης

στην απλή οζώδη βρογχοκήλη. Μελέτη της προθυμοσίνης α στην απόπτωση και

στον κυτταρικό πολαπλασιασμό” υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας

Καθηγήτριας Φράγκου-Λαζαρίδη Μαρία και της Διδάκτορος Βαρέλη Κατερίνα.

§ Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής (Ιατρική Στολή). Στο Εργαστήριο

Παθολογικής Ανατομικής πραγματοποιήθηκε εργασία με τίτλο: ‘‘Ανίχνευση

μεταλλάξεων στο γονίδιο p53 σε καρκίνο του μαστού με τη μέθοδο DGGE” και

έγινε υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας Μαλάμου-Μήτση

Βασιλικής και της υποψήφιας Διδάκτορος Ζυχαρίου Χριστιάνας.

§ Εργαστήριο Βιοχημείας (Τμήμα Χημείας). Στο τελευταίο εξάμηνο αυτού του

Προγράμματος ο τίτλος της εργασίας ήταν: “Έκφραση της πρωτεΐνης

κινητοποίησης που κωδικοποιείται από την περιοχή ORF1 του πλασμιδίου pZMO3

του στέλεχος ATCC 10988 του βακτηρίου Zymomonas mobilis” υπό την επίβλεψη

του Καθηγητή Δραΐνα Κωνσταντίνου και της υποψήφιας Διδάκτορος Βαρσάκη

Αθανασία.

Απευθύνω τις ευχαριστίες μου στους επιβλέποντες Καθηγητές και τους

υποψήφιους Διδάκτορες που συμμετείχαν στην εκπόνηση της παρούσας εργασίας για

τη βοήθεια και τις πολύτιμες συμβουλές τους οι οποίες ήταν καθοριστικές για την

ολοκλήρωση της Διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τους

Καλλιμάνη Αριστείδη, Βαρέλη Κατερίνα, Σαϊνη Ιωάννη καθώς επίσης και τους

συναδέλφους Γκορέζη Μαριάννα, Ζιώρη Κατερίνα και Κεφάλα Κατερίνα για την

πολύτιμη βοήθεια και συμπαράσταση. Τέλος ευχαριστώ θερμά τους στενούς φίλους

και την οικογένειά μου για την συνεχή υποστήριξη και κατανόηση.

7

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Επαγωγή της έκφρασης των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών

και των ρετροϊκών στοιχείων VL30 σε κύτταρα επίμυος NIH3T3.

Υπεύθυνοι: Τζαβάρας θεόδωρος (Επίκουρος Καθηγητής)

Ευταξία Σοφία (υποψήφια διδάκτορας)

8

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α. 1. Κινητοποιήσιμες επαναλλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA.

Τα τελευταία χρόνια η μελέτη των επαναλαμβανόμενων νουκλεοτιδικών

αλληλουχιών στα ευκαρυωτικά κύτταρα συσχετίστηκε με τη μελέτη των

βακτηριακών μεταθετών στοιχείων. Η τεχνική της αλληλούχισης έκανε δυνατή την

πιστοποίηση της ύπαρξης μετακινούμενων αλληλοδιαδοχών DNA στο γονιδίωμα

τόσο προκαρυωτικών, όσο και ευκαρυωτικών οργανισμών που καλούνται με το

γενικό όρο μεταθετά στοιχεία (mobile elements). Τα μεταθετά στοιχεία έχουν τη

κληρονομούμενη ιδιότητα της μετάθεσης, δηλαδή της μετακίνησης σε νέες θέσεις

στο χρωμοσωμικό DNA. Αν και η αναγνώριση των πρώτων μεταθετών στοιχείων

έγινε στο καλαμπόκι από την B. Mc Clintock πριν από 50 χρόνια η ρύθμιη του

φαινομένου της μετάθεσης παρέμεινε σχεδόν άγνωστη σε μοριακό επίπεδο μέχρι

πρόσφατα.

Η κατάταξη των μεταθετών στοιχείων γίνεται με βάση το μηχανισμό

μετάθεσης και το είδος των κυττάρων στα οποία εμφανίζονται. Έτσι τα διάφορα

κινητοποιήσιμα στοιχεία ανάλογα με το μηχανισμό μετάθεσης μπορούν να

διακριθούν σε τρανσποζόνια και ρετροτρανσποζόνια (σχήμα 1). Τα τρανσποζόνια,

κινητοποιούνται με ένα μηχανισμό που καλείται μετάθεση, μέσω ενός ενδιάμεσου

DNA. Τα ρετροτρανσποζόνια μεταθέτονται μέσω ενός ενδιάμεσου RNA, που

μεταγράφεται από το μεταθετό στοιχείο με RNA πολυμεράση II και στη συνέχεια

μετατρέπεται σε δίκλωνο DNA με ανάστροφη μεταγραφή. Ο μηχανισμός αυτός

καλείται ρετρομετάθεση, επειδή η κινητοποίηση των μεταθετών στοιχείων είναι

ανάλογη με τη μολυσματική διαδικασία των ρετροϊών.

Οι κυριότεροι τύποι κινητοποιήσιμων στοιχείων σε βακτήρια είναι οι ένθετες

αλληλουχίες ή IS στοιχεία που διακρίνονται σε εκείνα που ακολουθούν τη μη

αντιγραφική μετάθεση και σε εκείνα που ακολουθούν την αντιγραφική μετάθεση και

τα βακτηριακά τρανσποζόνια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες ανθεκτικότητας σε

αντιβιοτικά φέροντας στα άκρα τους άμεσες επαναλήψεις οι οποίες είναι πολλές

φορές IS στοιχεία.

Σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς πολύ γνωστά τρανσποζόνια αποτελούν τα

στοιχεία ελέγχου στο καλαμπόκι (control elements) όπως τα στοιχεία Ac και Ds και

στη Drosophila το στοιχείο P. Όλοι οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί που έχουν μελετηθεί

περιέχουν ρετροτρανσποζόνια, τα οποία χωρίζονται σε δύο κύριες τάξεις. Η πρώτη

κατηγορία περιλαμβάνει τα ιϊκά ρετροτρανσποζόνια που είναι άφθονα στους

9

ζυμομύκητες (π.χ. στοιχεία Ty), στη Δροσόφιλα (π.χ. στοιχεία copia) και αποτελούν

περίπου το 4% του ανθρώπινου γονιδιώματος. Η γενική δομή ιϊκών

ρετροτρανσποζονίων περιλαμβάνει άμεσες επαναλλήψεις στα 5΄ και 3΄ άκρα, που

είναι τυπικό χαρακτηριστικό όλων των ενσωματωμένων μεταθετών στοιχείων και η

κεντρική κωδικεύουσα περιοχή περιβάλλεται από μακρυές ακραίες επαναλήψεις

(LTRs), χαρακτηριστικά του ρετροϊκού DNA. Ακόμα, παρόμοια με τους ρετροϊούς,

κωδικοποιούν για ανάστροφη μεταγραφάση και ενσωματάση και μετακινούνται στο

γονιδίωμα με το μηχανισμό της ρετρομετάθεσης.

Σχήμα 1: Διάκριση μεταθετών στοιχείων με βάση τον γενικό μηχανισμό μετάθεσης σε τρανσποζόνια (α) και ρετροτρανσποζόνια (β).

Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τα μη ιϊκά ρετροτρανσποζόνια τα οποία

δεν έχουν LTRs στα άκρα τους, όπως η πρώτη τάξη των ρετροτρανσποζονίων, αλλά

παρουσιάζουν μια εκτεταμένη αλληλουχία πλούσια σε βάσεις Α/Τ στο 3΄ άκρο. Τα

περισσότερο συχνά απαντώμενα μεταθετά στοιχεία στα σπονδυλωτά είναι δύο τύποι

μη ιϊκών ρετροτρανσποζονίων, που καλούνται LINE (long interspersed elements) και

SINE (short interspersed elements). Οι δύο αυτοί τύποι σχετίζονται με μεταλλάξεις

που συνδέονται με ανθρώπινες γενετικές ασθένειες. Οι περισσότερες

επαναλλαμβανόμενες αλληλουχίες SINE, που αποτελούν το 5% του συνολικού

ανθρώπινου γονιδίωματος, περιέχουν μια θέση αναγνώρισης για το περιοριστικό

ένζυμο AluI για το λόγο αυτό καλούνται αλληλουχίες Alu. Χαρακτηριστικό των

LINE είναι ότι απαντούν σε περίπου 600.000 αντίγραφα και αποτελούν το 15-17%

του ανθρώπινου γονιδιώματος. Αυτά τα μεταθετά στοιχεία μετακινούνται στο

10

γονιδίωμα με ένα ασυνήθιστο μη ιϊκό μηχανισμό ρετρομετάθεσης. Η μετάθεση τους

φαίνεται να περιλαμβάνει ενδιάμεσο μόριο RNA και ανάστροφη μεταγραφή του,

αλλά το στοιχείο που μετατίθεται είναι ένα αντίγραφο cDNA του ενδιάμεσου μορίου

RNA. Η παραπάνω οικογένεια περιλαμβάνει ακόμα τα στοιχεία I, F και G στη

δροσόφιλα και την κατηγορία των ψευδογονιδίων στα θηλαστικά.

Α. 2. Μηχανισμός Ρετρομετάθεσης.

Η μετάθεση των ρετροτρανσποζονίων πραγματοποιείται σε τρία στάδια. Το

πρώτο στάδιο περιλαμβάνει την μεταγραφή των ενσωματωμένων προϊικών

ρετροτρανσποζονίων σε ένα μόριο RNA, με τη βοήθεια της RNA πολυμεράσης II.

Στη συνέχεια σε ένα δεύτερο στάδιο, το μεταγράφημα αυτό μετατρέπεται σε δίκλωνο

DNA μέσω της διαδικασίας της αντίστροφης μεταγραφής η οποία καταλύεται από το

ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση.

Το ένζυμο της αντίστροφης μεταγραφάσης ανακάλυψαν οι Temin και

Baltimore, ανεξάρτητα ο ένας από τον άλλον το 1970, εντός των ιοσωματίων μερικών

ογκογόνων ιών RNA. Η αντίστροφη μεταγραφάση επιτελεί τρία είδη αντιδράσεων:

σύνθεση DNA που κατευθύνεται από εκμαγείο RNA, υδρόλυση RNA και σύνθεση

DNA που κατευθύνεται από DNA. Η σύνθεση αρχίζει στο 5΄ άκρο του γονιδιώματος

με τη δέσμευση ενός tRNA που δρά ως πριμοδοτικό μόριο για τη σύνθεση της

αρνητικής μονής αλυσίδας DNA. Η αλυσίδα σταματά στην περιοχή R, μετά τη

σύνθεση περίπου 100-150 βάσεων. Παράλληλα με την επιμήκυνση του DNA κλώνου

από την ανάστροφη μεταγραφάση, με δράση πολυμεράσης, πραγματοποιείται

ταυτόχρονη διάσπαση του εκμαγείου RNA από το ίδιο ένζυμο με δράση RNάσης H.

Το μεταγράφημα περιέχει την ίδια αλληλουχία στα 5΄και 3΄ άκρα του που καλείται R.

Αυτή η επαναληπτικότητα των άκρων παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη σύνθεση του

δίκλωνου DNA όπως φαίνεται στο σχήμα 2. Οι νεοσύστατες αλυσίδες υφίστανται δύο

μετατοπίσεις στο ζευγάρωμα των βάσεων πριν συμπληρωθεί ένα πλήρως δίκλωνο

μόριο με τη βοήθεια της ανάστροφης μεταγραφάσης. Το ενδιάμεσο δίκλωνο μόριο

που προκύπτει περιέχει πανομοιότυπα άκρα που καλούνται μακρυές ακραίες

επαναλλήψεις (LTR). Τελικό στάδιο στη διαδικασία της ρετρομετάθεσης αποτελεί η

ενσωμάτωση του δίκλωνου ρετροτρανσποζονιακού DNA σε νέα θέση εντός του

γονιδιώματος.

11

Σχήμα 2: Διακριτά στάδια γεγονότος ρετρομετάθεσης.

A. 3. Αποτελέσματα της Ρετρομετάθεσης στο Γονιδίωμα.

Οι αλληλοδιαδοχές που ανήκουν στη μεγάλη κατηγορία του

επαναλλαμβανόμενου DNA (repetitions DNA) αποτελούν το 1/3 του ανθρώπινου

γονιδιώματος και έχουν την κληρονομούμενη ιδιότητα της πιθανής μετάθεσης

(transposition). Το φαινόμενο της μετάθεσης, αν και συμβαίνει με πολύ χαμηλή

συχνότητα, αποτελεί ένα από τους σημαντικότερους κινδύνους για τη δημιουργία

μεταλλάξεων. Έτσι η είδοδος ενός μεταθετού στοιχείου σε μία νέα θέση του

Απομάκρυνση του RNA μέσω RNAασηςH.

Απομάκρυνση του μεγαλύτερου μέρους του RNA μέσω RNAασηςH.

Επιμήκυνση του DNA από το 3΄ άκρο.

Πρώτο άλμα.

Γενωμικό RNA

Δημιουργία DNA με εκκινητή tRNA

Σύνθεση του 3΄ άκρου της δεύτερης αλυσίδας DNA.

Απομάκρυνση του tRNA και του RNA μέσω RNAάσηςΗ.

Δεύτερο άλμα.

Σύνθε-ση και των δύο αλυσί-δων.

12

γονιδιώματος του κυττάρου μπορεί να προκαλέσει μια μετάλλαξη με αποτέλεσμα να

διακόψει τη λειτουργία ενός γονιδίου ή να αλλάξει το επίπεδο της έκφρασής του.

Παρά το γεγονός ότι τα DNA μεταθετά στοιχεία δεν εμφανίζουν στην ουσία

καμμία άλλη λειτουργία από το να διατηρούν την παρουσία τους, υπάρχουν ενδείξεις

ότι έχουν διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των σύγχρονων οργανισμών.

Όπως έχει προαναφερθεί, αρκετές τυχαίες μεταλλάξεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα

προέκυψαν από ενθέσεις των κινητοποιήσιμων στοιχείων. Επιπλέον, ο ομόλογος

ανασυνδιασμός μεταξύ κινητοποιήσιμων στοιχείων DNA, που είναι διεσπαρμένα

κατά μήκος αρχέγονων γονιδιωμάτων πιθανόν να συνέβαλε στον διπλασιασμό

γονιδίων και σε άλλες επαναδιατάξεις κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Τέτοια

φαινόμενα είχαν σημαντική συμβολή στη δημιουργία νέων γονιδίων.

Α. 4. Μεταθετά Στοιχεία VL 30

Α. 4. 1. Δομικά Χαρακτηριστικά των VL30 στοιχείων.

Τα μεταθετά στοιχεία VL30 ταξινομούνται στη ιϊκή υπεροικογένεια των

ρετροτρανσποζονίων και έχουν εκτενώς μελετηθεί σε ποντίκια, όπου απαντούν 100-

200 αντίγραφα διασκορπισμένα μέσα στο γονιδίωμα. Η οικογένεια αυτή των

ρετροτρανσποζονίων έχει προσελκύσει την προσοχή των ερευνητών λόγω της

ικανότητας τους να ρετρομεταθέτονται εξωκυτταρικά δια μέσου ενός “ψευδοϊκού”

συμπλόκου.

Το όνομα VL30 προέρχεται από τα αρχικά “virus-like 30S”, επειδή τα

στοιχεία αυτά εκφράζονται ως ένα χαρακτηριστικό RNA 30S. Αυτά τα

μεταγραφήματα συχνά πακετάρονται σε ιούς τύπου C, γνωστοί ως ψευδοϊοί και

μπορούν να μεταθέτονται σε ετερόλογους κυτταρικούς τύπους και να ενθέτονται σε

νέες χρωμοσωμικές θέσεις.

Το 1988 απομονώθηκαν 12 κλώνοι VL30 (Carter et al. 1988) από κύτταρα

NIH3T3 μολυσμένα με MLV, οι οποίοι εκμεταλλευόμενοι την ενδογενή αντίστροφη

τρανσκριπτάση του ιού παρήγαγαν δίκλωνο VL30 DNA σε αφθονία. Από τους 12

αυτούς κλώνους VL30 αναγνωρίστηκαν τέσσερα διαφορετικά στελέχη: NVL-1 έως

NVL-4, με επικρατή τον κλώνο NVL-3 (8 από τους 12).

Δομική ανάλυση των NVL-3 κλώνων αποκάλυψε ότι αυτά και γενικά τα

VL30 στοιχεία διαθέτουν πολλά από τα δομικά χαρακτηριστικά ενός τυπικού

ρετροϊού (French N. and Norton J., 1997). Έτσι τα VL30 στοιχεία έχουν μήκος 5.0-

6.0 kb και στα άκρα τους περιέχουν μακρυές τελικές επαναλήψεις (LTRs) μήκους

13

0.4-0.6 kb με μια οργάνωση U3-R-U5 (σχήμα 3). Μια άλλη ιδιότητα της δομής VL30

που αντικατροπτίζει την ρετροϊκή οργάνωση, είναι η παρουσία μιας πολυπουρινικής

ακολουθίας (pp), που λειτουργεί ως ουσιαστικό στοιχείο της ανάστροφης

μεταγραφής. Επιπλέον, η ακολουθία καθοδικά του 5′ LTR είναι συμπληρωματική με

το 3′ άκρο ενός εξειδικευμένου κυτταρικού tRNA (tR) που απαιτείται για την έναρξη

της ανάστροφης μεταγραφής. Οι παραπάνω περιοχές φαίνονται στο σχήμα 3 και

σημειώνονται επιπλέον μια θέση δότη ματίσματος (SD) άγνωστης λειτουργίας και

ένα σήμα ρετροϊκού πακεταρίσματος (ψ).

Σχήμα 3: Δομικά χαρακτηριστικά NVL-3 στοιχείου.

Α. 4. 2. Λειτουργικές ιδιότητες των στοιχείων VL30.

Τα στοιχεία VL30 είναι ικανά να ρετρομεταθέτονται από κύτταρο σε κύτταρο,

με υψηλή συχνότητα μέσω ιϊκών σωματιδίων. Το 1977, ένα VL30 ρετρομεταθετό

στοιχείο αναγνωρίστηκε από τους Duesberg και Scolnick, ως ένα 30S συν-

πακεταρισμένο μόριο σε σωματίδια του ιού λευχαιμίας ποντικού (MLV) που

παράχθηκαν σε μια ποντικίσια κυτταρική σειρά πακεταρίσματος. Έτσι, ο ιός

λευχαιμίας ποντικού και άλλοι ρετροϊοί μπορούν να μεταθέτουν ένα πακεταρισμένο

μόριο mRNA του VL30 σε κύτταρα μολυσμένα από τους ρετροϊούς. Αυτό

πραγματοποιείται με σύνθεση ενός cDNA VL30, με τη βόηθεια του ενζύμου

ανάστροφη μεταγραφάση που κωδικοποιείται από τον ρετροϊό και κατόπιν ένθεση

του cDNA του VL30 εντός του κυτταρικού γονιδιώματος.

Ο ρόλος των VL30 στοιχείων είναι δύσκολο να διευκρινιστεί, επειδή τα

περισσότερα μέλη της οικογένειας αυτής δεν κωδικοποιούν για λειτουργικά

γονιδιακά προϊόντα. Σε αντίθεση με το τυπικό ρετροϊκό γονιδίωμα που κωδικοποιεί

για gag, pol και env πρωτεΐνες, απαραίτητες για τη δημιουργία ενός μολυσματικού

ιού, το VL30 γονιδίωμα έχει ένα σημαντικό αριθμό κωδικονίων τερματισμού σε όλα

τα πλαίσια ανάγνωσης. Η πλήρης νουκλεοτιδική ακολουθία του ρετροτρανσποζονίου

NVL-3 έδειξε ότι δεν κωδικοποιεί για καμία λειτουργική πρωτεϊνη λόγω της

παρουσίας στο πλαίσιο ανάγνωσης κωδικονίων τερματισμού (Adams, S. E., et. al.

1988). Επιπρόσθετα, η ανάλυση νουκλεοτιδίων του στοιχείου BVL-1 δεν έδειξε

tR

14

ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης για τα ρετροϊκά δομικά γονίδια gag και pol και καμία

ένδειξη για γονίδιο env (Hodgson, C. P. et. al., 1990).

Μια χαρακτηριστική ιδιότητα των στοιχείων VL30, όπως και των

περισσότερων οικογενειών ρετροτρανσποζονίων, είναι ότι σε αντίθεση με ένα υψηλό

αριθμό αντιγράφων στο γονιδίωμα μόνο ένας περιορισμένος αριθμός των στοιχείων

αυτών είναι μεταγραφικά ενεργός (Eaton, L. and Norton, J. D. 1990).

Αναμφισβήτητα, το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό της VL30 έκφρασης

είναι η μεταγραφική απόκριση σε μια πληθώρα εξωκυττάριων σημάτων που

πρόσφατα παρατηρήθηκαν σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Κύτταρα σε συνθήκες

στέρησης από αυξητικούς παράγοντες παρουσιάζουν κατιούσα ρύθμιση της

έκφρασης VL30 και ακόλουθη μιτογόνος διέγερση έχει ως αποτέλεσμα μια ταχεία

(εντός 3-5 ωρών) επαγωγή των μεταγραφημάτων VL30 (Singh, K., et. al., 1985).

Ακόμα, η έκφραση VL30 επάγεται από τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF)

(Nilson M. et al., 1995), ορρό (Eaton L. and Norton J., 1990), στερεοειδείς ορμόνες

(Harrigan M et al., 1989), UVB ακτινοβολία (Tobin D. et al., 1996) κ.α.

Νέες μέθοδοι γονιδιακής θεραπείας έχουν ραγδαία αναπτυχθεί με χρήση

ρετροϊκών φορέων για να επιτρέψουν την έκφραση ογκοκατασταλτικών γονιδίων,

κυτταροτοξινών, αντικαρκινικών παραγόντων σε καρκινικά κύτταρα καθώς και για

την έκφραση πρωτεϊνών που είναι ελλιπείς ή ελλατωματικές σε μια συγκεκριμένη

ασθένεια. Αυτά τα συστήματα ρετροϊκών φορέων παρουσιάζουν ορισμένα

μειονεκτήματα μεταξύ των οποίων είναι η μεταγραφική απενεργοποιήση των

ρετροϊκών προαγωγών μετά από μια περίοδο χρόνου που προκαλείται εν μέρει από

μεθυλίωση των CpG τόπων στις ακολουθίες LTR (περιοχές προαγωγών\ενισχυτών

των ρετροϊών) (Chakraborty A.K., et. al.,1993). Για το λόγο αυτό κατασκευάζονται

συνθετικοί ρετροϊκοί φορείς με χρήση ουσιωδών περιοχών του ρετροτρανσποζονίου

VL30, οι οποίες έχουν πολύ λιγότερες θέσεις μεθυλίωσης CpG και ταυτόχρονα ως

φυσικά συστατικά του γονιδιώματος των θηλαστικών αναγνωρίζονται λιγότερο ως

ξένα μόρια DNA από το μηχανισμό μεθυλίωσης κυτοσίνης (Chakraborty A.K., et.

al.,1993). Με αντικατάσταση της περιοχής του ιϊκού πακεταρίσματος Ψ του MVL

από την αντίστοιχη περιοχή του στοιχείου VL30 από επίμυ προκύπτει ένας δυναμικός

φορέας (Torrent C., et. al., 1994) επειδή αυτή η περιοχή είναι μικρότερη σε μέγεθος,

περισσότερο αποδοτική στην εγκαψιδίωση ανασυνδιασμένου RNA και δεν περιέχει

gag ή glyco-gag κωδικεύουσες αλληλουχίες. Έτσι, εξαιτίας των παραπάνω

15

παραγόντων, τα VL30 στοιχεία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δόμηση

ρετροϊκών φορέων στη γονιδιακή θεραπεία.

Α. 4. 3. Ρετρομετάθεση των VL30 σε καρκινικά και μετασχηματισμένα κύτταρα.

Ένας σημαντικός μηχανισμός δια μέσου του οποίου αρκετοί ρετροϊοί, παρότι

δεν περιέχουν ογκογονίδια στο γονιδίωμά τους, προκαλούν όγκους σε πειραματοζώα

είναι η ενθετική μεταλλαξιγένεση. Σύμφωνα με το μηχανισμό αυτό, όταν οι ρετροϊοί

ενσωματωθούν στο γονιδίωμα του ξενιστή οι LTR του ιού που περιέχουν υποκινητές

επηρεάζουν την έκφραση γειτονικών πρωτοογκογονιδίων (French N.S. and Norton

J.D., 1997). Έτσι καθώς τα στοιχεία VL30 κινητοποιούνται για αντιγραφική

ρετρομετάθεση από κύτταρο σε κύτταρο, δια μέσου ψευδοϊκών συμπλόκων, μπορούν

να προκαλέσουν την ενεργοποίηση ογκογονιδίων (Nusse, R. 1986,Trends in Genet. 2:

244-247).

Έχει παρατηρηθεί ότι πολλά ρετροτρανσποζόνια συμπεριλαμβανομένων και

των VL30 στοιχείων παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα μεταγραφικής έκφρασης σε

μετασχηματισμένα και καρκινικά κύτταρα (Han K. et al., 1990). Ο Singh και οι

συνεργάτες του (Singh K.,et. al., 1985) απέδειξαν ότι μέλη της οικογένειας VL30

παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση σε NIH3T3 κύτταρα μετασχηματισμένα από τον ιό

SV40. Ακόμα έδειξαν ότι η έκφραση των VL30 μεταγραφημάτων εμφανίζεται

εξειδικευμένη ως προς το στάδιο της κυτταρικής ανάπτυξης και ως προς το είδος των

κυττάρων. Έτσι, η έκφραση των VL30 ποικίλλει, σε κύτταρα που βρίσκονται σε

στάδιο ανάπτυξης (non confluent), σε σχέση με αυτά που βρίσκονται σε κατάσταση

κυτταρικής επαφής (confluent). Παράλληλα, παρουσιάζεται διαφοροποιημένη

έκφραση των VL30 στις διάφορες κυτταρικές σειρές του ποντικού με τις κυτταρικές

σειρές C3H να παρουσιάζουν πάρα πολύ χαμηλά επίπεδα VL30 μεταγραφημάτων σε

σχέση με τις κυτταρικές σειρές NIH3T3. Επίσης, παρατηρήθηκε σε κύτταρα NIH3T3

μετά τον μετασχηματισμό με τον ιό SV40 (Tzavaras T. et.al., 1998) αξιοσημείωτη

αύξηση των συμβάντων ρετρομετάθεσης ένος ανασυνδιασμένου ιού που περιέχει τον

προαγωγό του VL30 LTR. Η ανασυνδιασμένη ιϊκή κατασκευή συνίσταται από τις U3

και R ακολουθίες του 3΄LTR ενός μεταγραφικά ενεργού VL30, που εισάγεται εντός

ενός τμήματος του ιού της λευχαιμίας Moloney (MoMLV) που περιέχει την πολύ-Α

περιοχή και τη περιοχή ιϊκού πακεταρίσματος Ψ. Αυτή η συνθετική ανασυνδιασμένη

κατασκευή μετατίθεται με υψηλή συχνότητα, ανεξάρτητα από τα επίπεδα της RNA

16

έκφρασης της ιϊκής κατασκευής και με τη βοήθεια ενδογενούς ανάστροφης

μεταγραφάσης (Tzavaras T. et.al., 1998).

Σήμερα αρκετοί ρετροϊικοί φορείς χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο της

ανθρώπινης γονιδιακής θεραπείας για την μεταφορά γονιδίων μέσω κυτταρικών

σειρών πακεταρίσματος. Σε μια πρόσφατη τέτοια μελέτη (Song Xu, et. al., 2002)

μεταφοράς του γονιδίου του ιστικού παράγονται (TF) σε ανθρώπινα κύτταρα

μελανώματος μέσω ρετροϊών απεδείχθη ότι το μεταστατικό τους δυναμικό αυξάνεται

ισχυρά και συσχετίσθηκε με το συν-πακετάρισμα γενωμικού mRNA από στοιχεία

VL30. Το σημαντικό αυτό εύρημα προσδίδει για πρώτη φορά ένα σημαντικότατο

ρόλο που μπορεί να παίζουν μικρές πρωτεΐνες των VL30 στο φαινόμενο της

μετάστασης.

17

Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ.

Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της έκφρασης σε επίπεδο RNA, των

ενδογενών γονιδίων ανάστροφης μεταγραφάσης (enRTs) και των ρετρομεταθετών

στοιχείων VL30 υπο την επίδραση των ακόλουθων παραγόντων:

1. MMS (methyl methanesulfonate), μια μεταλλαξογόνος-καρκινογόνος ουσία

2. Ετοποσίδιο, ένα φάρμακο χημειοθεραπείας

3. Βανάδιο, μια ουσία που μιμείται την ινσουλίνη

4. C2-κεραμίδιο, ένας αποπτωτικός παράγοντας.

18

Γ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Γ. 1. Κυτταρική σειρά NIH3T3 cl.17 και συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας

Η κυτταρική σειρά NIH3T3 cl.17 από έμβρυο ποντικού, προέρχεται από

υποκλωνοποίηση της σειράς Swiss/3T3 και έχει χαρακτηριστικά ινοβλαστών.

Καλλιεργείται σε θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium),

εμπλουτισμένο με 10% εμβρυϊκό ορό μόσχου.

Το θρεπτικό υλικό DMEM πριν τη χρήση του εμπλουτίζεται με αντιβιοτικά

πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη σε τελικές συγκεντρώσεις 50.000U/L και 50.000μg/L

αντίστοιχα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε επωαστικό κλίβανο θερμοκρασίας 37°C

και η ατμόσφαιρα ήταν εμπλουτισμένη με 5% CO2 / 95% αέρα. Το pH του θρεπτικού

υλικού θα πρέπει να βρίσκεται στα όρια 6,8-7,8 γιατί διαφορετικά τα κύτταρα δε θα

αναπτυχθούν. Αυτό εξασφαλίζεται με ρύθμιση του pH με NaHCO3 σε pH 7,4 και από

την παροχή CO2 στον κλίβανο που καλλιεργούμε τα κύτταρα.

Τα κύτταρα καλλιεργούνται προσκολλημένα σε επίπεδες αποστειρωμένες

πλαστικές φιάλες μέχρι να αναπτυχθούν πλήρως όπου παρουσιάζουν αναστολή της

ανάπτυξης λόγω επαφής, οπότε και μοιράζονται σε περισσότερες φιάλες σύμφωνα με

τη παρακάτω διαδικασία:

• Απομακρύνεται το θρεπτικό υλικό με αποστειρωμένη πιπέτα Pasteur που είναι

συνδεδεμένη με αντλία κενού. Τα κύτταρα εκπλένονται δύο φορές με ρυθμιστικό

διάλυμα φωσφορικών PBS (11.5g/L Na2HPO4, 2.96g/L NaH2PO4.2H2O, 5.84g/L

NaCl). Με την έκπλυση των κυττάρων αφαιρείται πλήρως ο ορός που περιέχει το

DMEM και ο οποίος δρα ανασταλτικά στην ενεργότητα του επόμενου χειρισμού που

είναι η τρυψινοποίηση. Προστίθεται στα κύτταρα διάλυμα τρυψίνης (Trypsin-EDTA)

αρκετό για να καλύψει την επιφάνεια της φιάλης, ώστε τα κύτταρα να αποκολληθούν.

• Η τρυψίνη απομακρύνεται όταν παρατηρηθεί με τη βοήθεια του μικροσκοπίου

αποκόλληση των κυττάρων. Προστίθεται DMEM με 10% FCS για να σταματήσει η

δράση της τρυψίνης. Τα κυτταρικά συσσωματώματα διασπώνται με τη βοήθεια της

αυτόματης συσκευής αναρρόφησης-εκρόφησης και αποστειρωμένης πιπέτας των

10ml και ποσότητα κυτταρικού εναιωρήματος τοποθετείται σε φιάλη καλλιέργειας με

το ανάλογο θρεπτικό υλικό για να επανακαλλιεργηθεί.

19

Γ. 2. Απομόνωση RNA από τη κυτταρική σειρά NIH3T3 cl.17

Η δυσκολία στην απομόνωση του RNA είναι το περιεχόμενο των κυττάρων

σε ριβονουκλεάσες που καταλύουν την υδρόλυση των φωσφοδιεστερικών δεσμών

στις αλυσίδες RNA. Οι ριβονουκλεάσες είναι πολύ σταθερά και δραστικά ένζυμα και

γενικά δεν απαιτούν κανένα συμπαράγοντα για να λειτουργήσουν. Έτσι, στις

περισσότερες μεθόδους απομόνωσης RNA που ακολουθούνται, το πρώτο βήμα είναι

να απενεργοποιηθούν οι ενδοκυττάριες RNασες. Για το λόγο αυτό ακολουθούνται οι

παρακάτω προφυλάξεις:

1. Νερό ή διαλύματα αλάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην RNA απομόνωση

μεταχειρίστηκαν με διαιθυλοπυρανθρακικό (DEPC) που απενεργοποιεί

ριβονουκλεάσες. Διαλύματα που περιέχουν Tris δεν πρέπει να έρθουν σε επαφή με

(DEPC), επειδή το Tris αντιδρά με DEPC και απενεργοποιείται.

2. Τα χέρια είναι μια κύρια πηγή που περιέχει RNασες. Για το λόγο αυτό

χρησιμοποιούνται γάντια.

Η μέθοδος που ακολουθείται για την απομόνωση ολικού κυτταρικού RNA

υψηλής καθαρότητας περιλαμβάνει κατακρήμνιση του RNA με LiCl, εκχύλιση με

φαινόλη και κατακρήμνιση του με οξικό νάτριο.

Κύτταρα NIH3T3 cl.17 που αναπτύχθηκαν όπως περιγράφτηκε στο κεφ. Β. 1.,

συλλέχθηκαν από τις φιάλες ανάπτυξης με τρυψινοποίηση και μεταφέρθηκαν σε

φιαλίδια (ανθεκτικά σε φαινόλη). Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 1200 στροφές για

4 λεπτά και το κυτταρικό ίζημα εκπλύθηκε με 10 ml PBS.

Λύση κυττάρων και εξουδετέρωση RNασης: Τα δείγματα επαναιωρήθηκαν

με 5 ml κρύου διαλύματος 3Μ LiCl/6Μ Ουρία και ομογενοποιήθηκαν με τη βοήθεια

αποστειρωμένης σύριγγας και ισχυρή ανακίνηση (vortex) για 1 min. Το

ομογενοποιημένο εναιώρημα τοποθετήθηκε στους 4οC για 16 ώρες (σε αυτό το

στάδιο αν είναι επιθυμητό, τα δείγματα φυλάσσονται για αόριστο χρόνο). Στα βήματα

που ακολουθούν, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε πάγο.

Κατακρήμνιση RNA και απομάκρυνση πρωτεϊνών και DNA. Ακολούθησε

φυγοκέντριση σε ψυχρό θάλαμο στις 3.500 rpm για 30 λεπτά και επαναλήφθηκε το

προηγούμενο στάδιο, που περιλαμβάνει διαλυτοποίηση με 3ml κρύου διαλύματος 3Μ

LiCl/6Μ Ουρία, ισχυρή ανακίνηση και τοποθέτηση για 1h στους 4οC για την

κατακρήμνιση του RNA. Στη συνέχεια το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στο ψυχρό θάλαμο

στις 3500 rpm για 45 min. Στο ίζημα προστέθηκαν κατά σειρά 4ml TES (10mM Tris–

HCl pH 7.6, 1mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS), 2ml φαινόλη–TES για απομάκρυνση

20

των πρωτεϊνών και 2ml 49:1v/v χλωροφόρμιο/ισοαμυλική αλκοόλη. Ακολουθεί

ισχυρή ανακίνηση σε Vortex μέχρι να σχηματιστεί λευκό γαλάκτωμα.

Το στάδιο αυτό περιελάμβανε εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες. Οι πρωτεΐνες

και μεγαλύτερα θραύσματα DNA μετακινήθηκαν στη μεσαία φάση. Οι περισσότερες

πρωτεΐνες και μικρά θραύσματα DNA μετακινήθηκαν στην κατώτερη-οργανική

φάση. Ενώ το RNA μετακινείται στην υδατική φάση .

Λήψη RNA με κατακρήμνιση. Ακολούθησε φυγοκέντριση του δείγματος

στις 3500 rpm για 20 min. Συλλέχθηκε το μεγαλύτερο μέρος της υδατικής φάσης που

περιέχει RNA και ακολούθησε κατακρήμνιση του με 1/10 του όγκου 3Μ οξικού

νατρίου pH 5.2 και 2 όγκους 100% αιθανόλη. Ακολουθεί ισχυρή ανακίνηση και

αποθήκευση στους –20οC για 24 ώρες.

Απομόνωση ολικού RNA υψηλής καθαρότητας. Μετά από 24h το δείγμα

φυγοκεντρήθηκε στις 3500 rpm για 24 min, αποχύθηκε το υπερκείμενο και

εκπλύθηκε το RNA με 5ml 70% EtOH. Ακολούθησε ξήρανση του δείγματος και

επαναδιάλυση του σε 200μl ΤΕ (10mM Tris–HCl pH 7.6, 1mM EDTA pH 8.0).

Προκύπτει υψηλής καθαρότητας ολικό RNA που φυλάσσεται στους -70οC σε

φιαλίδια. Η περιεκτικότητα του δείγματος σε RNA μπορεί να υπολογιστεί με

μέτρηση της απορρόφησής του στα 260nm με βάση τη σχέση: μία οπτική πυκνότητα

(OD) αντιστοιχεί σε 40μg/ml διαλύματος.

Γ. 3. Ηλεκτροφόρηση του RNA-Αποτύπωση κατά Νorthern (Νorthern Βlotting)

Aπό τη στιγμή που απομονώθηκε ολικό κυτταρικό RNA υψηλής καθαρότητας

είναι δυνατή η ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών. Η ανίχνευση χωρίζεται σε τρία

τμήματα: α) Ηλεκτροφόρηση του RNA παρασκευάσματος υπό αποδιατακτικές

συνθήκες σε πηκτή αγαρόζης–φορμαλδεΰδης, β) Μεταφορά του από τη πηκτή σε

μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (ΝΚ) με φαινόμενα ανοδικής τριχοειδούς μεταφοράς, γ)

Ανάλυση υβριδισμού των ακολουθιών RNA που μας ενδιαφέρουν χρησιμοποιώντας

ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή DNA.

Υδατική φάση: RNA Μεσόφαση: Πρωτεϊνες και μικρά θραύσματα DNA Οργανική φάση: Πρωτεΐνες, μεγάλα θραύσματα DNA

21

Γ. 3. 1. Ηλεκτροφόρηση του RNA.

Επειδή τα περισσότερα μόρια RNA είναι μονόκλωνα και μπορούν να

σχηματίσουν δευτεροταγείς δομές με ενδομοριακό ζευγάρωμα βάσεων, για το λόγο

αυτό πρέπει να ηλεκτροφορηθούν υπό αποδιατακτικές συνθήκες. Η μετουσίωση

επιτυγχάνεται προσθέτοντας φορμαλδεΰδη στη πηκτή ενώ τα δείγματα

μεταχειρίστηκαν με φορμαλδεΰδη και φορμαμίδιο.

Πειραματική διαδικασία: Η ηλεκτροφόρηση του RNA γίνεται σε πηκτή 1%

αγαρόζης-2.2Μ φορμαλδεΰδης. Η αγαρόζη προστίθεται σε διάλυμα 1xΜOPS (20

mM MOPS, 1mM EDTA, 5mM οξικό νάτριο, pH 7.0 με 5N NaOH) και τήκεται υπό

ανάδευση στους 1000C. Το διάλυμα της αγαρόζης ψύχεται μέχρι τους 550C,

προστίθεται 2.2Μ φορμαλδεΰδη και 0.4μg/μl βρωμιούχο αιθίδιο. Aκολουθεί

ανάδευση και το μίγμα χρησιμοποιείται για τη δημιουργία οριζόντιας πηκτής.

Δείγματα 7μg RNA ξηραίνονται σε φυγοκεντρικό ξηραντήρα κενού και

επαναδιαλύονται σε 20μl διαλύματος μετουσίωσης (2.2Μ φορμαλδεΰδη, 50%

φορμαμίδιο, 1x MOPS) και επωάζονται στους 650C για 15min. Τα δείγματα

τοποθετούνται στις υποδοχές της πηκτής αφού αναμιχθούν σε αναλογία 6v/1v με

διάλυμα χρωστικής (40% γλυκερόλη, 0.2% μπλε της βρωμοφαινόλης, 0.2%

κυανολικό ξυλένιο).

Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου σε διάλυμα

ηλεκτροφόρησης 1x MOPS με σταθερή τάση 30Volt για 12 ώρες. Aκολουθεί

έκπλυση της πηκτής με απεσταγμένο H2O για 30 λεπτά, για να απομακρυνθεί η

φορμαλδεΰδη και παρατήρηση της πηκτής σε συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας για

έλεγχο του παρασκευάσματος.

Γ. 3. 2. Μεταφορά του RNA από τη πηκτή σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης.

Oι συσκευές όπου θα γίνει η μεταφορά παραμένουν σε διάλυμα 0.5Ν NaOH

για δύο ώρες τουλάχιστον πριν τη χρήση, ώστε να εξουδετερωθούν οι RNases. Στο

δοχείο που θα γίνει η μεταφορά, τοποθετήθηκε υάλινη πλάκα και φέρει τοποθετημένα

στην επιφάνειά της 3 φύλλα διηθητικού χαρτιού Whattman 3MΜ σε σχήμα γέφυρας,

έτσι ώστε οι δύο άκρες να εφάπτονται στη βάση του δοχείου.

Η μεταφορά πραγματοποιείται σε αρκετή ποσότητα διαλύματος μεταφοράς

(1xGene Screene) (0.5M Na2HPO4.2H2O, 0.5M NaH2PO4.2H2O, pH 6.5). Tα φύλλα

του διηθητικού χαρτιού εμποτίστηκαν με το διάλυμα αυτό και οι φυσαλίδες αέρα

απομακρύνθηκαν με γυάλινη ράβδο. Στη συνέχεια η πηκτή εξισορροπείται με

22

τοποθέτηση σε δοχείο που περιέχει 1xGene Screene (GS) για 2-3 min και στη

συνέχεια τοποθετήθηκε ανεστραμμένη πάνω στα φύλλα και οι φυσαλίδες

απομακρύνθηκαν όπως προηγουμένως. Στην επιφάνεια της πηκτής τοποθετήθηκε η

μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (ΝΚ) και δύο φύλλα διηθητικού χαρτιού τα οποία

εμβαπτίστηκαν στο ίδιο διάλυμα μεταφοράς GS και οι φυσαλίδες απομακρύνθηκαν

εκ νέου. Στην επιφάνεια των διηθητικών χαρτιών τοποθετήθηκαν πολλά στρώματα

απορροφητικού χαρτιού και στην κορυφή ένα αντικείμενο βάρους 0.5 kg. Η

μεταφορά ολοκληρώθηκε μετά από 20h. Η μεμβράνη ΝΚ στη συνέχεια τυλίχθηκε σε

διηθητικό χαρτί και τοποθετήθηκε σε κλίβανο στους 80οC για 2h για να

μονιμοποιηθεί το RNA που μεταφέρθηκε.

Γ. 3. 3. Προϋβριδισμός

Το στάδιο του προϋβριδισμού, περιλαμβάνει επώαση της μεμβράνης με

αντιδραστήριο Denhardt σε συνδυασμό με μετουσιωμένο, θραυσματοποιημένο DNA

από σπέρμα σολομού. Σκοπός της επώασης αυτής είναι η πρόσδεση του ετερόλογου

αυτού DNA στις μη ειδικές θέσεις του DNA για την ελαχιστοποίηση της μη ειδικής

πρόσδεσης του ομόλογου ιχνηθέτη κατά το στάδιο του υβριδισμού.

Κατά την πειραματική διαδικασία, η μεμβράνη διαβρέχεται με διάλυμα 1%

Triton X-100. Στη συνέχεια η μεμβράνη τοποθετείται σε ειδική υάλινη φιάλη του

κλιβάνου υβριδισμού και επωάζεται σε διάλυμα προϋβριδισμού που περιέχει 50%

φορμαμίδιο, 0.11% SDS, 6.9xSSC, 2.31mM NaH2PO4, 21.3mM Na2HPO4,

1.15xDenhardt (1xDenhardt: 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 0.02% πολυβίνιλ-

πιρολιδόνη). Στο διάλυμα αυτό προστίθεται 0.1mg/ml DNA από σπέρμα σολομού

που έχει μετουσιωθεί με βρασμό στους 100οC για 5 λεπτά. Παρασκευάζονται 12.4ml

αυτού του διαλύματος και χρησιμοποιούνται 10ml για το στάδιο του προϋβριδισμού,

ενώ τα υπόλοιπα 2.4ml φυλάσσονται για το στάδιο του υβριδισμού. Το στάδιο του

προϋβριδισμού ολοκληρώνεται με επώαση της μεμβράνης με το παραπάνω διάλυμα

υπό περιστροφή σε κλίβανο υβριδισμού στους 42οC για 6 ώρες.

Γ. 3. 4. Υβριδισμός υψηλής συγγένειας.

Το στάδιο του υβριδισμού επιτρέπει την ανίχνευση συγκεκριμένου mRNA, με

βάση τη συμπληρωματικότητα των βάσεων μεταξύ ομόλογων αλληλουχιών. Ο

υβριδισμός της μεμβράνης πραγματοποιείται με τα συμπληρωματικά ιχνηθετιμένα

μόρια DNA (κεφ.Β. 4.).

23

Μετά την ολοκλήρωση της επώασης ακολουθεί ο υβριδισμός. Ο σημασμένος

ανιχνευτής που έχουμε παρασκευάσει μετουσιώνεται μετά από βρασμό 5 λεπτών,

ψύχεται στους 4οC, αναμιγνύεται με το υπόλοιπο 2.4ml διάλυμα προϋβριδισμού και

προστίθεται στο διάλυμα προϋβριδισμού. Η επώαση συνεχίζεται στους 42οC για 18

ώρες.

Γ. 3. 5. Έκπλυση και αυτοραδιογραφία.

Οι εκπλύσεις της μεμβράνης έχουν ως σκοπό την απομάκρυνση των μη ειδικά

δεσμευμένων μορίων του ιχνηθέτη. Έτσι, η μεμβράνη υφίσταται πλύσεις αρχικά τρεις

φορές για 2 λεπτά η κάθε μία με διάλυμα 2xSSC, στη συνέχεια τρεις φορές για 20

λεπτά η κάθε μία στους 60-65οC με διάλυμα 0.1xSSC/0.5% SDS και τέλος τρεις

φορές για δύο λεπτά η κάθε μία με διάλυμα 0.1xSSC για την απομάκρυνση του SDS.

Στην περίπτωση του ανιχνευτή των ανάστροφων μεταγραφασών έγινε μία μόνο

πλύση στους 50οC για 15 λεπτά με διάλυμα 0.1xSSC/0.1% SDS. Στη συνέχεια η

μεμβράνη τοποθετείται σε κασέτα αυτοραδιογραφίας όπου εκτίθεται σε φωτογραφικό

φιλμ στους –70οC.

Γ. 3. 6. Αποϋβριδισμός.

Η διαδικασία του αποϋβριδισμού της μεμβράνης, αποσκοπεί στην

απομάκρυνση του ιχνηθέτη και την επώαση της μεμβράνης στη συνέχεια με νέο

ιχνηθέτη. Κατά τη διαδικασία του αποϋβριδισμού η μεμβράνη εκπλένεται τρεις φορές

με διάλυμα 0.5% SDS σε νερό που βρίσκεται σε θερμοκρασία βρασμού ώστε να

σπάσουν οι δεσμοί μεταξύ του ιχνηθέτη και του RNA. Η μεμβράνη αφήνεται να

στεγνώσει σε διηθητικό χαρτί και ακολουθεί υβριδισμός με νέο ιχνηθέτη.

Γ. 4. Ραδιενεργός ιχνηθέτηση DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης

πολυμεράσης (PCR).

Η μέθοδος αυτή συνίσταται σε μικρούς σε μέγεθος (μικρότερους από 300bp)

ανιχνευτές, για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε στην ιχνηθέτηση του ανιχνευτή των

ανάστροφων μεταγραφασών, περίπου 110-140bp. Η μέθοδος βασίζεται στην

ενσωμάτωση ραδιενεργών νουκλεοτιδίων [α-32P] dCTP, με τη μέθοδο της

αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).

Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε το προϊόν RT-PCR αντίδρασης που

αποτελείται από ένα πληθυσμό ανάστροφων μεταγραφασών των IAPS και MoLVs

24

(Tzavaras et. al., 1998). To υπόστρωμα DNA χρησιμοποιείται σε χαμηλή

συγκέντρωση, οπότε απαιτείται η προσθήκη DNA φορέα, ώστε να εξασφαλίζεται η

απαιτούμενη συγκέντρωση ολικού DNA εκμαγείου. Ο φορέας που χρησιμοποιήθηκε

στην περίπτωση αυτή είναι το πλασμίδιο Bluescript ΙΙ KS+.

H αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε με τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων

που φαίνονται στο πίνακα 1.

Πίνακας 1: Συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Οι τελικές συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων της αντίδρασης PCR που χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχυθεί το επιθυμητό τμήμα του γονιδίου.

Συστατικά Όγκος Cαντίδρασης

εκμαγείο DNA 3.5μl 7ng/μl

Φορέας DNA 1μl 5ng/μl

PCR buffer 10x 5μl 1x

Μίγμα dNTP εκτός dCTP 3.5μl 200μM

dCTP 7.5μl 1.5μM

MgCl2 3μl 1.5mM

Εκκινητής 3΄ άκρου 4.3μl 8.6ng

Εκκινητής 5΄ άκρου 4.5μl 9.0ng

Πολυμεράση Taq 0.5μl 5U/100μl

dd H2O 2.2μl _

Συνολικός όγκος 35μl

Πίνακας 3: Συνθήκες του θερμοκρασιακού προγράμματος της αντίδρασης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης.

Θερμοκρασίες Χρόνος

Αρχική μετουσίωση (Preliminary denaturation) 940C 4min

Κύρια μετουσίωση (Denaturation) 940C 1min

Πρόσδεση (Annealing) 550C 1min

Επιμήκυνση (Extension) 720C 1min

Τελική επιμήκυνση (Final extension) 720C 10min

Κύκλοι 30

25

Από το παραπάνω μίγμα των 35μl μεταφέρονται 17.5μl σε νέο φιαλίδιο και

προσθέτονται 7.5μl [α-32P] dCTP (~3000Ci/mmole, PAB 10205, Amersham) με

τελική συγκέντρωση στο μίγμα της αντίδρασης 1μΜ. Στη συνέχεια ακολουθεί η

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε θερμικό κυκλοποιητή με τις συνθήκες που

φαίνονται στο πίνακα 2, για την ενίσχυση ενός τμήματος DNA μεγέθους 110-140bp.

Γ. 5. Ραδιενεργός ιχνηθέτηση DNA με τη μέθοδο μετάφρασης εξ εγκοπής.

Στη περίπτωση που ο ιχνηθέτης είναι μεγαλύτερος από 300 βάσεις,

χρησιμοποιούμε τη μέθοδο μετάφρασης εξ εγκοπής (nick translation) για τη

ραδιενεργό ιχνηθέτηση. Η αντίδραση ιχνηθέτησης, με τη μέθοδο αυτή, περιλαμβάνει

τη προσθήκη των ενζύμων DNA νουκλεάση I και DNA πολυμεράση I. Ο ρόλος της

DNA νουκλεάσης I είναι να δημιουργεί εγκοπές σε τυχαίες θέσεις, κατά μήκος του

DNA, ενώ η πολυμεράση I συμπληρώνει τα κενά με την ενσωμάτωση και

ραδιενεργών νουκλεοτιδίων που έχουν συμπεριληφθεί στο μίγμα της αντίδρασης.

Η αντίδραση πραγματοποιείται με την ανάμιξη 2.5μl 10x ρυθμιστικού

διαλύματος, 2.5μl μίγματος dNTP (1.5mM το καθένα) εκτός του ραδιενεργού, 200ng

DNA που πρόκειται να ιχνηθετηθεί, 50μCi [α-32Ρ] dCTP, 3μl μίγματος των δύο

ενζύμων (DNase I/ DNA polymerase I). Η αντίδραση έχει τελικό όγκο 25μl και

επωάζεται στους 16οC για 75 λεπτά. Στη συνέχεια προστίθεται EDTA, το οποίο

αναστέλλει την αντίδραση.

Μετά την επώαση ακολουθεί διαχωρισμός των ραδιενεργά σημασμένων

μορίων DNA από τα μη ενσωματωμένα νουκλεοτίδια.

Γ. 6. Χρωματογραφία στήλης μοριακής διήθησης με πληρωτικό υγρό Sephadex

G-50

Το ιχνηθετημένο DNA διαχωρίστηκε από τα μη ενσωματωμένα ραδιενεργά

νουκλεοτίδια με χρωματογραφία μοριακής διήθησης με πληρωτικό υλικό Sephadex

G-50 και διάλυμα έκλουσης (5mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA (pH 8.0), 0.1%

SDS). Ο διαχωρισμός βασίζεται στο ότι η ταχύτητα διέλευσης μεγάλων μορίων είναι

μεγαλύτερη αυτής των μικρών. Έτσι το πρώτο κλάσμα που εκλούεται είναι αυτό που

περιέχει τα σημασμένα μόρια DNA.

Η στήλη πληρώνεται με το εναιώρημα του Sephadex G-50 και στη συνέχεια

εξισορροπείται με 10-20 ml διάλυμα έκλουσης. Το ιχνηθετημένο DNA που πρόκειται

να διαχωριστεί από τα μη ραδιενεργά ενσωματωμένα νουκλεοτίδια προστίθεται στη

26

στήλη καθαρισμού, αφήνεται να εισχωρήσει με ελεύθερη ροή και στη συνέχεια να

περάσει με τη βοήθεια του διαλύματος έκλουσης. Το πρώτο έκλουσμα, που

αντιστοιχεί στο σημασμένο DNA, παρακολουθείται με τη βοήθεια μετρητή

ακτινοβολίας Geiger-müller, συλλέγεται και μετριέται σε μετρητή υγρού

σπινθηρισμού β-ακτινοβολίας για να υπολογιστεί η ενσωμάτωση της ραδιενέργειας.

Γ. 7. Παρασκευή DNA του ιχνηθέτη VL30.

Το DNA του 9λ5, που βρίσκεται ενθετιμένο στο πλασμίδιο Ε/H 9λ5 σε pBL,

θα χρησιμοποιηθεί ως ιχνηθέτης για την ανίχνευση της έκφρασης RNA των VL30

στοιχείων. Για το λόγο αυτό, απομονώθηκε το 9λ5 EcoRI/HindIII θραύσμα, που στη

συνέχεια πρόκειται να ιχνηθετηθεί ραδιενεργά με τη μέθοδο μετάφρασης εξ εγκοπής.

Συνολικά σε μέγεθος το πλασμίδιο Ε/H 9λ5 σε pBL είναι 5kb και αποτελείται

από την αλληλουχία 9λ5 μεγέθους 2.1kb και το φορέα Bluescript (pBL) με μέγεθος

2.96kb. Κατά την διαδικασία απομόνωσης του 9λ5, 5μg του πλασμιδίου

μεταχειρίστηκαν με το περιοριστικό ένζυμο ΕcoRI και προέκυψαν δύο θραύσματα

2.1 kb και 2.96 kb που αντιστοιχούν στις αλληλουχίες 9λ5 και pBL. Σε ένα σωλήνα

προστέθηκαν 5μl 5μg/μl πλασμιδιακού DNA, 25μl 1xbuffer NE και 1.2μl 9.6U/100μl

περιοριστικό ένζυμο EcoRI και προστέθηκε H2O σε τελικό όγκο 250μl. Ακολούθησε

επώαση στους 37οC για 24 ώρες.

Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε 0.9% πηκτή αγαρόζης και απομόνωση της

ζώνης 2.1kb, που αντιστοιχεί στο DNA του 9λ5 με κόψιμο της πηκτής με τη βοήθεια

αποστειρωμένου νυστεριού.

Γ. 8. Καθαρισμός DNA από πηκτή αγαρόζης με silica.

Ο καθαρισμός του DNA από τη πηκτή αγαρόζης πραγματοποιήθηκε με τη

μέθοδο Geneclean II με πακέτο υλικών ΒΙΟ 101. Η ζώνη του 9λ5, μεγέθους 2.1kb,

τοποθετήθηκε σε προζυγισμένο σωλήνα και υπολογίστηκε το βάρος του. Στη

συνέχεια προστέθηκαν 4.5 όγκοι 4Μ NaI και 1/10 του όγκου TBE Modifier (διάλυμα

αλάτων) και το δείγμα επωάστηκε για 5min στους 55οC. Κάθε 2 min αναμιγνύεται το

δείγμα σε συσκευή ανάδευσης για να διαλυθεί η πηκτή. Κατόπιν προστέθηκαν 5μl

αιωρήματος Glassmilk (0.1g/ml silica matrix, 30mM NaI) (θεωρητικά η ικανότητα

σύνδεσης του silica matrix είναι: 1μl αιωρήματος Glassmilk για κάθε 1-2μg DNA),

ακολούθησε επώαση για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου και ανάμιξη κάθε 2

λεπτά, ώστε να προσδεθεί το DNA στο Glassmilk.

27

Ακολούθησε φυγοκέντριση για 5sec σε μικροφυγόκεντρο, αποχύθηκε το

υπερκείμενο και εκπλύθηκε το σύμπλεγμα Glassmilk-DNA τρεις φορές με 400μl

διαλύματος έκπλυσης (50mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH7.5, 2.5mM EDTA, 50% v/v

αιθανόλη). Μετά τη τελευταία έκπλυση και αφού αφαιρέθηκε τελείως το

υπερκείμενο, ακολούθησε ξήρανση του ιζήματος. Στη συνέχεια το ίζημα

επαναιωρήθηκε σε 5μl Η2Ο (ίσης ποσότητας με αυτή του Glassmilk), επωάστηκε για

5min στους 55οC, φυγοκεντρήθηκε για 30sec και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέο

σωλήνα. Στη συνέχεια 1μl DNA του 9λ5 ηλεκτροφορήθηκε, υπολογίστηκε η

συγκέντρωση του δείγματος και φυλάσσεται στους 4οC για περαιτέρω χρήση.

28

Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Δ. 1. Επίδραση του μεταλλαξογόνου παράγοντα MMS στην έκφραση των

γονιδίων για το ενδογενές ένζυμο ανάστροφη μεταγραφάση (enRTs) και των

VL30 ρετροστοιχείων.

Το MMS (methyl methanesulfonate) χρησιμοποιείται ως μεταλλαξογόνο,

καρκινογόνο και τερατογόνο (Komatsu K. et. al., 2000). Σε μια διαγονιδιακή

κυτταρική σειρά κινέζικου Hamster CHL/IU, που ονομάζεται KN63, μετά από

επίδραση με τον αλκυλιωτικό παράγοντα MMS επάγονται γονιδιακές μεταλλάξεις και

δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές (Yamada T., et. al., 2000). Τα δύο γεγονότα, της

γονιδιακής μετάλλαξης και οι δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές, συμμετέχουν στην

έναρξη και στα επακόλουθα βήματα της ανάπτυξης της καρκινογένεσης.

Στη συγκεκριμένη εργασία ο σκοπός είναι να ελεγχθεί σε επίπεδο RNA η

έκφραση των γονιδίων ενδογενούς ανάστροφης μεταγραφάσης enRTs και των

στοιχείων VL30 μετά από επίδραση σε κύτταρα NIH3T3 με MMS για 24 ώρες.

Παρασκευάστηκε διάλυμα MMS συγκέντρωσης 10μg/μl σε H2O. Σε κύτταρα

NIH3T3 cl.17, που αναπτύχθηκαν σε πλήρες θρεπτικό υλικό DMEM εμπλουτισμένο

με 10% FCS πραγματοποιήθηκε επίδραση για 24 ώρες με MMS σε δύο διαφορετικές

συγκεντρώσεις: 5μg/ml και 10μg/ml σε θρεπτικό υλικό. Ως αρνητικός μάρτυρας

χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα NIH3T3 που δεν έχουν υποστεί επίδραση με το

συγκεκριμένο παράγοντα. Σαν θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν ΝΙΗ3Τ3

κύτταρα μετασχηματισμένα από τον ιό SV40, που καλλούνται IΙα.

Ακολούθησε απομόνωση ολικού κυτταρικού RNA με τη μέθοδο που

περιγράφεται στο κεφάλαιο Β. 2. και 7μg/μl αυτού του RNA ηλεκτροφορήθηκαν σε

πηκτή αγαρόζης–φορμαλδεΰδης, το RNA μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης

και υβριδοποιήθηκε αρχικά με ένα μίγμα προϊόντων RT-PCR (Tzavaras et. al., 1998)

που αναγνωρίζει μεταγραφήματα ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών σε μοριακά

βάρη 5, 6 και 7 kb. Ο παραπάνω ανιχνευτής σημάνθηκε ραδιενεργά με τη μέθοδο της

αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR.

Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε αποϋβριδισμός της μεμβράνης, για την

απομάκρυνση του ιχνηθέτη και ακολουθεί επώαση της μεμβράνης με νέο ιχνηθέτη,

έναντι των VL30 ρετροστοιχείων. Η σήμανση του ανιχνευτή των VL30

ρετροστοιχείων έγινε με τη μέθοδο μετάφρασης εξ εγκοπής. Η ανάλυση της

έκφρασης των μεταγραφημάτων των ενδογενών γονιδίων της ανάστροφης

μεταγραφάσης και των ρετρομεταθετών στοιχείων VL30 παρουσιάζεται στην Εικόνα

29

1. Η ποσοτικοποίηση του RNA έγινε με αποϋβριδισμό της μεμβράνης και περαιτέρω

υβριδισμό με τον ιχνηθέτη της ποντικίσιας β-ακτίνης, είναι ένα PstI θραύσμα 1kb

που σημάνθηκε με τη μέθοδο μετάφρασης εξ εγκοπής.

Εικόνα 1: Επίδραση με MMS στην έκφραση RNA της ενδογενούς ανάστροφης μεταγραφάσης και των VL30 ρετροστοιχείων. 7μg ολικού RNA ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης–φορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και υβριδοποιήθηκε αρχικά με ανιχνευτή που αναγνωρίζει ένα μεγάλο πλήθος μεταγραφημάτων ανάστροφης μεταγραφάσης. Στη συνέχεια η μεμβράνη υβριδίστηκε με ραδιενεργό ιχνηθέτη έναντι των VL30 ρετροστοιχείων. Διαδρομές: Ca: κύτταρα II α ως θετικός μάρτυρας, N: κύτταρα NIH3T3 ως αρνητικός μάρτυρας, 5: επίδραση με 5μg/ml MMS για 24 ώρες και 10: επίδραση με 10μg/ml MMS για 24 ώρες. Το επάνω μέρος της εικόνας αντιπροσωπεύει την έκφραση των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών, το μεσαίο την έκφραση των VL30 και το τελευταίο την έκφραση της ακτίνης.

Στην εικόνα 1 φαίνεται η κατανομή των μεταγραφημάτων mRNA των

ανάστροφων μεταγραφασών και των ρετρομεταθετών στοιχείων VL30. Η δράση της

ουσίας MMS δεν επηρεάζει την έκφραση των ενδογενών ανάστροφων

μεταγραφασών σε καμία από τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκε.

Όσον αφορά την έκφραση των VL30 στοιχείων σε κύτταρα NIH3T3 μετά από

επίδραση με 10μg/ml MMS παρατηρείται μια μικρή αύξηση σε σύγκριση με τον

αρνητικό μάρτυρα. Ενώ, επίδραση με μικρότερη συγκέντρωση 5μg/ml MMS δεν

30

παρατηρείται αύξηση της έκφρασης των VL30 ρετροστοιχείων σε σχέση με τον

αρνητικό μάρτυρα.

Δ. 2. Επίδραση του αντικαρκινικού φαρμάκου Ετοποσίδιο στην έκφραση των

ενδογενών γονιδίων της ανάστροφης μεταγραφάσης (enRTs) και των

ρετροστοιχείων VL30.

Το ετοποσίδιο είναι φάρμακο χημειοθεραπείας και χρησιμοποιείται ευρέως

στην κλινική θεραπεία αρκετών όγκων όπως λευχαιμίας, λεμφώματος, καρκίνο του

πνεύμονα. Ο μηχανισμός της δράσης του ετοποσιδίου είναι η καθυστέρηση στη

μετάβαση των κυττάρων δια μέσου της S φάσης (O'Dwyer P. J., et. al., 1985). Το

ετοποσίδιο αναφέρεται ως παράγοντας που προκαλεί βλάβη στο DNA και επάγει

απόπτωση σε κύτταρα CHO (Chinese hamster ovary). Μεταχείριση κυττάρων CHO

με 250μΜ ετοποσίδιου για 12 ώρες έχει ως συνέπεια αξιοσημείωτη μείωση των

κυττάρων με ένα μεγάλο ποσοστό αυτών να παρουσιάζουν φαινοτυπικές ιδιότητες

χαρακτηριστικές της απόπτωσης (Budd D. C., et. al.,2003).

Στο πείραμα αυτό έγινε επίδραση με την αντικαρκινική ουσία ετοποσίδιο, στο

θρεπτικό μέσο καλλιέργειας κυττάρων NIH3T3, με σκοπό να ελεγχθεί η έκφραση

των γονιδίων ενδογενούς ανάστροφης μεταγραφάσης enRTs και των ρετρομεταθετών

στοιχείων VL30.

Σε κύτταρα NIH3T3 cl.17 που αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό DMEM

εμπλουτισμένο με 10% FCS προστέθηκε η ουσία ετοποσίδιο σε διάφορες

συγκεντρώσεις. Οι τελικές συγκεντρώσεις της ουσίας στο θρεπτικό υλικό είναι οι

ακόλουθες: 0.5μg/ml, 1μg/ml και 3μg/ml για 24 ώρες.

Τα κύτταρα επωάστηκαν στις διάφορες συγκεντρώσεις που σημειώθηκαν

παραπάνω, συλλέχθηκαν και απομονώθηκε ολικό κυτταρικό RNA. Κατόπιν 7μg

αυτού του RNA ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης-φορμαλδεΰδης και

ακολούθησε μεταφορά κατά Northern σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Ακολούθησε

υβριδισμός της μεμβράνης με ιχνηθετημένα μόρια DNA που αναγνωρίζουν τα

μεταγραφήματα των ανάστροφων μεταγραφασών και των ρετροστοιχείων VL30,

όπως αναφέρεται και στην παράγραφο Γ. 1.

Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αυτής παρουσιάζονται στην Εικόνα 2. Όπως

φαίνεται η δράση της ουσίας ετοποσίδιο δεν επηρεάζει την έκφραση των ενδογενών

ανάστροφων μεταγραφασών σε καμία από τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκε.

31

Παρόμοιο αποτέλεσμα σημειώνεται και για την έκφραση των ρετροστοιχείων VL30,

δηλαδή δεν παρατηρείται επαγωγή των μεταγραφημάτων VL30.

Εικόνα 2: Επίδραση με την ουσία ετοποσίδιο στην έκφραση RNA της ενδογενούς ανάστροφης μεταγραφάσης και των VL30 ρετροστοιχείων σε NIH3T3 κύτταρα για 24 ώρες. Για την αποτύπωση κατά Northern χρησιμοποιήθηκε 7μg ολικού RNA που ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης–φορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και υβριδοποιήθηκε αρχικά με ανιχνευτή που αναγνωρίζει ένα μεγάλο πλήθος μεταγραφημάτων ανάστροφης μεταγραφάσης. Στη συνέχεια η μεμβράνη υβριδίστηκε με ραδιενεργό ιχνηθέτη, έναντι των VL30 ρετροστοιχείων. Διαδρομές: Ca: κύτταρα II α ως θετικός μάρτυρας, N: κύτταρα NIH3T3 ως αρνητικός μάρτυρας, 0.5: κύτταρα NIH3T3 με επίδραση με 0.5μg/ml ετοποσίδιο 1: επίδραση με 1μg/ml ετοποσίδιο και 3: επίδραση με 3μg/ml ετοποσίδιο για 24 ώρες Το επάνω μέρος της εικόνας αντιπροσωπεύει την έκφραση των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών, το μεσαίο την έκφραση των VL30 και το τελευταίο την έκφραση της ακτίνης.

Δ. 3. Επίδραση του βαναδίου στην έκφραση των ρετροστοιχείων VL30 και των

ενδογενών γονιδίων της ανάστροφης μεταγραφάσης.

Ο δυναμικός ρόλος του βαναδίου στην ανθρώπινη υγεία έγκειται στο γεγονός

ότι είναι δομικό υλικό των οστών και των δοντιών καθώς και στην εφαρμογή του στη

θεραπεία του διαβήτη (Badmaev V., et. al., 1999). Ένας αριθμός σύμπλοκων

βαναδίου όπως βαναδικού οξέος και θειϊκού βαναδίου, παρουσιάζει ικανότητα

μίμησης της δράσης της ινσουλίνης (Fantus I. G., et. al., 1995). Ο μηχανισμός δράσης

του βαναδίου είναι υπό έρευνα. Αρκετές μελέτες δείχνουν ότι το βανάδιο είναι ένας

αναστολέας φωσφατασών και ότι ενεργοποιεί κινάσες σερίνης/θρεονίνης. Η

32

καθημερινή πρόσληψη βαναδίου στη διατροφή του ανθρώπου είναι 10-60

μικρογραμμάρια (Barceloux D. G., 2000). Σύμπλοκα βαναδίου όπως θειϊκό βανάδιο

έχουν πολλαπλές βιολογικές επιδράσεις σε κυτταροκαλλιέργειες και αλληλεπιδρούν

άμεσα με διάφορα ένζυμα (Fantus I. G., et. al., 1995).

Μελετήθηκε η επίδραση της ουσίας θειϊκό βανάδιο σε επίπεδο έκφρασης των

mRNA των γονιδίων του ενζύμου ανάστροφης μεταγραφάσης και των

ρετρομεταθετών στοιχείων VL30 σε κύτταρα NIH3T3.

Τα κύτταρα NIH3T3 αναπτύσσονται προσκολλημένα σε επίπεδες

αποστειρωμένες πλαστικές φιάλες μέχρι να αναπτυχθούν πλήρως. Μετά την

ανάπτυξή τους κατά 70-80% σε πλήρες θρεπτικό υλικό DMEM εμπλουτισμένο με

10% FCS πραγματοποιήθηκε επίδραση με την ουσία αυτή για 24 ώρες σε διάφορες

συγκεντρώσεις. Οι τελικές συγκεντρώσεις της ουσίας στο μέσο ανάπτυξης είναι οι

ακόλουθες: 25μΜ, 50μΜ, 100μΜ και 200μΜ.

Για την ανίχνευση των mRNA έγινε αποτύπωση κατά Northern. Oλικό

κυτταρικό RNA απομονώθηκε με τη μέθοδο που περιγράφεται στο κεφάλαιο Β. 2 και

7μg RNA από κάθε δείγμα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης-φορμαλδεΰδης.

Ακολούθησε μεταφορά του RNA σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, η οποία υβριδίστηκε

με τους ίδιους ραδιενεργά σημασμένους ανιχνευτές που προαναφέρθηκαν στις

προηγούμενες διαδικασίες.

Τα αποτελέσματα της επίδρασης αυτού του παράγοντα στην έκφραση των

ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών και των VL30 στοιχείων φαίνονται στην

Εικόνα 3. Σε κύτταρα NIH3T3 στα οποία πραγματοποιήθηκε επίδραση με τον

παράγοντα παρατηρήθηκε επαγωγή της έκφρασης των μεταγραφημάτων των

ανάστροφων μεταγραφασών. Κύτταρα μετά από επίδραση με 100μΜ, έδειξαν πολύ

ισχυρές ζώνες υβριδισμού στα μοριακά μεγέθη 7kb και 5kb. Επίδραση με μικρότερες

συγκεντρώσεις 25μΜ και 50μΜ τα κύτταρα παρουσίασαν μικρότερη επαγωγή της

έκφρασης των ανάστροφων μεταγραφασών σε μοριακό μέγεθος 5kb σε σύγκριση με

τη συγκέντρωση των 100μΜ. Σημαντική παρατήρηση αποτελεί η επίδραση με

200μΜ όπου φαίνεται αξιοσημείωτη μείωση της έκφρασης. Αυτό οφείλεται στο

γεγονός ότι το βανάδιο σε μεγαλύτερες συγκέντρωσεις από 100μΜ δρα τοξικά.

33

Εικόνα 3: Επίδραση με θειϊκό βανάδιο στην έκφραση RNA της ενδογενούς ανάστροφης μεταγραφάσης και των VL30 ρετροστοιχείων σε NIH3T3 κύτταρα για 24 ώρες. Για την αποτύπωση κατά Northern χρησιμοποιήθηκαν 7μg ολικού RNA ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης–φορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και υβριδοποιήθηκε αρχικά με ανιχνευτή που αναγνωρίζει ένα μεγάλο πλήθος μεταγραφημάτων ανάστροφης μεταγραφάσης. Στη συνέχεια η μεμβράνη υβριδίστηκε με ραδιενεργό ιχνηθέτη, έναντι των VL30 ρετροστοιχείων. Διαδρομές: Ca: κύτταρα II α ως θετικός μάρτυρας, N: κύτταρα NIH3T3 ως αρνητικός μάρτυρας, 25: κύτταρα NIH3T3 με επίδραση με 25μΜ 50: κύτταρα NIH3T3 με επίδραση με 50μΜ, 100: κύτταρα NIH3T3 με επίδραση με 100μΜ και 200: κύτταρα NIH3T3 με επίδραση με 200μΜ για 24 ώρες. Το επάνω μέρος της εικόνας αντιπροσωπεύει την έκφραση των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών, το μεσαίο την έκφραση των VL30 και το τελευταίο την έκφραση της ακτίνης.

Η έκφραση των ενδογενών στοιχείων VL30 φαίνεται να επηρεάζεται από την

παρουσία του θειϊκού βαναδίου σε όλες τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκε. Η

δράση του σε συγκέντρωση 25μΜ έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης

VL30 έως και 10 φορές σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα, σε συγκέντρωση 50μΜ

παρουσιάστηκε η μεγαλύτερη επαγωγή έως και 10 φορές σε σχέση με την επίδραση

με 25μΜ, ενώ σε συγκέντρωση 100μΜ του ίδιου παράγοντα παρατηρείται μείωση

της επαγωγής σε σύγκριση με την επίδραση με 50μΜ. Αντίθετα στη μεγαλύτερη

34

συγκέντρωση 200μΜ παρατηρείται μείωση της επαγωγής έως και 1/10-1/20 φορές σε

σχέση με την επαγωγή που σημειώθηκε σε συγκέντρωση 100μΜ.

Δ. 4. Επίδραση του C2-κεραμιδίου στην έκφραση RNA των ρετροστοιχείων

VL30 και των ενδογενών γονιδίων της ανάστροφης μεταγραφάσης.

Η ουσία C2-κεραμίδιο (N-acetyl sphingosine), είναι ανάλογο του κεραμιδίου

και διαπερνά τη κυτταρική μεμβράνη (Mei J., et. al., 2003). Το κεραμίδιο συμμετέχει

στο μονοπάτι σφιγγομυελίνης που αρχίζει με υδρόλυση του φωσφολιπιδίου

σφιγγομυελίνης για να δημιουργηθεί το κεραμίδιο. Θεωρείται ότι το μονοπάτι

σφιγγομυελίνης, δια μέσου μιας σειράς αλυσιδωτών αντιδράσεων, οδηγεί τα κύτταρα

σε απόπτωση (Verheij M. et. al., 1996). Με έκθεση της κυτταρικής σειράς U937

(human monoblastic leukaemia cells) σε συνθήκες στρες ή σε C2-κεραμίδιο

επάγονται μορφολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά της τυπικής απόπτωσης

(Verheij M. et. al., 1996).

Ύστερα από επώαση των κυττάρων με κεραμίδιο σε συγκεντρώσεις: 20μΜ,

40μΜ και 80μΜ για 24 ώρες ακολούθησε όπως και προηγουμένως (παράγραφο Γ.

1.), ανάλυση κατά Northern όπου ελέγχθηκε η έκφραση των ενδογενών ανάστροφων

μεταγραφασών και των στοιχείων VL30.

Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4 η δράση του κεραμιδίου στις διάφορες

συγκεντρώσεις οδηγεί σε επαγωγή της έκφρασης των ενδογενών ανάστροφων

μεταγραφασών. Η επαγωγή αφορά κυρίως τα μεταγραφήματα των 5kb. Συγκεκριμένα

παρατηρείται επαγωγή μετά από επίδραση των κυττάρων με 20μΜ κεραμιδίου κατά

3-4 φορές, η οποία παραμένει σταθερή και σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις

κεραμιδίου.

Η έκφραση των στοιχείων VL30 φαίνεται να επηρεάζεται επίσης από την

παρουσία του κεραμιδίου. Η έκφραση των VL30, μετά από επίδραση των κυττάρων

NIH3T3 με αυξανόμενη συγκέντρωση κεραμιδίου, παρατηρήθηκε οτι αυξάνεται

γραμμικά. Συγκεκριμένα η έκφραση των VL30 μετά από επίδραση με 40μΜ και

80μΜ κεραμιδίου επάγεται 10 και 50 φορές αντίστοιχα, σε σχέση με τον αρνητικό

μάρτυρα.

35

Εικόνα 4: Επίδραση του C2-κεραμιδίου στην έκφραση RNA της ενδογενούς ανάστροφης μεταγραφάσης και των VL30 ρετροστοιχείων σε κύτταρα NIH3T3 για 24 ώρες. Για την αποτύπωση κατά Northern χρησιμοποιήθηκε 7μg ολικού RNA ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης–φορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και υβριδοποιήθηκε αρχικά με ανιχνευτή που αναγνωρίζει ένα μεγάλο πλήθος μεταγραφημάτων ανάστροφης μεταγραφάσης. Στη συνέχεια η μεμβράνη υβριδίστηκε με ραδιενεργό ιχνηθέτη, έναντι των VL30 ρετροστοιχείων. Διαδρομές: Ca: κύτταρα II α ως θετικός μάρτυρας, N: κύτταρα NIH3T3 ως αρνητικός μάρτυρας, 20: κύτταρα NIH3T3 με επίδραση με 20μΜ 40: επίδραση με 40μΜ και 80: επίδραση με 80μΜ κεραμιδίου για 24 ώρες Το επάνω μέρος της εικόνας αντιπροσωπεύει την έκφραση των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών, το μεσαίο την έκφραση των VL30 και το τελευταίο την έκφραση της ακτίνης.

36

Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Ε. 1. Επαγωγή των ρετροστοιχείων VL30.

Το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό της έκφρασης VL30 είναι η μεταγραφική

απόκριση σε μια πληθώρα εξωκυττάριων σημάτων, που έχουν παρατηρηθεί σε

διάφορες κυτταρικές σειρές. Η έκφραση VL30 επάγεται από τον επιδερμικό αυξητικό

παράγοντα (EGF) (Nilson M. et al., 1995), τον ορρό (Eaton L. and Norton J., 1990),

τις στερεοειδείς ορμόνες (Harrigan M et al., 1989), την ακτινοβολία UVB (Tobin D.

et al., 1996) κ.α. Στην παρούσα εργασία η έκφραση του μηνύματος των στοιχείων

VL30 μελετήθηκε υπό την επίδραση του MMS, μια μεταλλαξογόνος-καρκινογόνος

ουσία, με το ετοποσίδιο ένα φάρμακο χημειοθεραπείας, με την ουσία βανάδιο που

μιμείται την δράση της ινσουλίνης και με τον αποπτωτικό παράγοντα C2-κεραμίδιο.

Επίδραση με τον αντικαρκινικό παράγοντα ετοποσίδιο σε κύτταρα NIH3T3

δεν επέφερε καμία επίδραση στην έκφραση των VL30 μεταγραφημάτων. Μικρή

επίδραση στην επαγωγή των VL30 ρετροστοιχείων παρατηρήθηκε με μεταχείριση

των κυττάρων με το μεταλλαξογόνο παράγοντα MMS.

Σε αντίθεση με τα παραπάνω αποτελέσματα δείχθηκε ότι τα VL30

ρετροστοιχεία επάγονται από τις ουσίες βανάδιο και τον αποπτωτικό παράγοντα

κεραμίδιο σε μεγάλη κλίμακα.

Ε. 2. Επαγωγή των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών.

Τα μεταθετά στοιχεία έχουν τη κληρονομούμενη ιδιότητα της μετάθεσης,

δηλαδή της μετακίνησης σε νέες θέσεις στο χρωμοσωμικό DNA, που

πραγματοποιείται με τη βοήθεια του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης. Η

ανάστροφη μεταγραφάση επιτελεί τρία είδη αντιδράσεων: σύνθεση DNA που

κατευθύνεται από RNA, υδρόλυση RNA και σύνθεση DNA που κατευθύνεται από

DNA. Η έκφραση του ενζύμου αυτού είναι πολύ σημαντική για να πραγματοποιηθεί

το φαινόμενο της ρετρομετάθεσης και η επαγωγή στην έκφρασή της αποτελεί μια

αρχική ένδειξη της επαγωγής της συχνότητας του φαινομένου.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των ίδιων ουσιών που

εξετάστηκαν παραπάνω, στην έκφραση RNA των ενδογενών ανάστροφων

μεταγραφασών σε ινοβλάστες ποντικών. Ο αντικαρκινικός παράγοντας ετοποσίδιο

δεν επηρεάζει την έκφραση των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών. Παρόμοιο

αποτέλεσμα σημειώνεται για τη δράση της καρκινογόνου-μεταλλαξογόνου ουσίας

MMS.

37

Στην επίδραση με την ουσία κεραμίδιο, που δρα ως αποπτωτικός παράγοντας,

παρατηρήθηκε σταθερή επαγωγή της έκφρασης των ενδογενών ανάστροφων

μεταγραφασών ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση της ουσίας. Αυτό μάλλον σημαίνει

ότι το κεραμίδιο δεν έχει ειδική δράση, ενώ η παρατηρούμενη αυτή μικρή επαγωγή

είναι παράγωγο αποπτωτικού στρες. Αξιοσημείωτη επαγωγή της έκφρασης των

ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών παρατηρήθηκε υπό την επίδραση της ουσίας

βανάδιο σε συγκέντρωση 100μΜ, ένω σε μεγαλύτερη συγκέντρωση παρουσιάζει

τοξική δράση.

Τέλος, από τους παράγοντες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη το

θειϊκό βανάδιο θα μπορούσε δυνητικά να αποτελέσει ένα παράγοντα για την επαγωγή

της συχνότητας της ρετρομετάθεσης των ρετροστοιχείων VL30 δεδομένου ότι επάγει:

τόσον την έκφραση των ενδογενών ανάστροφων μεταγραφασών που εμπλέκονται στο

μηχανισμό της ρετρομετάθεσης όσον και την έκφραση RNA των στοιχείων VL30

που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο για την μετατροπή του σε νέα

αντίγραφα VL30 στο κύτταρο.

38

ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Adams S.E., Rathjen P.D., Stanway C.A., Fulton S.M., Malim M.H., Wilson

W., Ogden J., King L., Kingsman S.M., Kingsman A.J. (1988). Complete

nucleotide sequence of a mouse VL30 retro-element. Mol. Cell Biol. 8(8),

2989-2998.

2. Badmaev V., Prakash S., Majeed M. (1999) Vanadium: a review of its

potential role in the fight against diabetes. J. Altern. Complement. Med. (3):

273-291.

3. Barceloux D. G. (2000) Vanadium. J. Toxicol. Clin. Toxicol 38(7): 813.

4. Budd D. C., McDonald J., Emsley N., Cain K., Tobin A. B. (2003) The C-

terminal tail of the M3-muscarinic receptor possesses anti-apoptotic

properties. J. Biol. Chem.

5. Carter A., Norton J. and Avery R. (1988). The genosomic DNA organisation

and evolution of a retrovirus-Transmissible family of mouse (vL30) genetic

elements. BBA, 951, 130-138.

6. Chakraborty A.K., Zink M.A., Boman B.M., Hodgson C.P., 1993, Synthetic

retrotransposon vectors for gene therapy. FASEB J. 7(10):971-977.

7. Eaton L. and Norton J., (1990). Independent regulation of mouse vl30

retrotransposon expression in response to serum and oncogenic cell

transformation nucleie aads. Res, 18 (8), 2069-2077.

8. Fantus I. G., Deragon G., Lai R., Tang S. (1995) Modulation of insulin action

by vanadate: evidence of a role for phosphotyrosine phosphatase activity to

alter cellular signaling. Mol. Cell. Biochem. 153(1-2): 103-112.

9. French N and Norton J., (1997). Structure and functional properties of mouse

vL30 retrotransposons. Biochim. Biophys. Acta. 1352 (1), 33-47.

10. Han K., Rothberg P., Kules Z. and Martin M., (1990). Altered levels of

endogenous retrovirus-like sequence (vL30) RNA during mouse epidermal

cell carcinogenesis. Mol. Carcinog., 3 (2), 75-82.

11. Harrigan M., Baughman G., Campdell N. and Baurgeosis S., (1989). Isolation

and characterization of glucorticoid and gudic Amp-induced genes in

lymphocytes. Mol. Cell. Biol., 9, 3438-3446.

12. Hodgson C.P., Fisk R.Z., Arora P., Chotani M. (1990). Nucleotide sequence of

mouse virus-like (VL30) retrotransposon BVL-1. Nucleic. Acids. Res. 18(3),

673.

39

13. Komatsu K., Hopkins K. M., Lieberman H. B., Wang H. (2000)

Schizosaccharomyces pombe Rad9 contains a BH3-like region and interacts

with the anti-apoptotic protein Bcl-2. FEBS Lett. 481 (2):122-126.

14. Mei J., Wang C.-N., O’Brien L. and Brindley D.N. (2003) Cell-permeable

ceramides increase basal glucose incorporation into triacylglycerols but

decrease the stimulation by insulin in 3T3-L1 adipocytes. International Journal

of Obesity 27, 31–39.

15. Nilsson M., Toftgard R. and Bohm S., (1995). Activated Ha-Ras but not TRA

induces transcription through binding sites for activating transcription factor

3/jun and a novel nuclear factor. J. Biol. Chem., 270, 12210-12218.

16. O'Dwyer P. J., Leyland-Jones B., Alonso M. T., Marsoni S., Wittes R. E.

(1985) Etoposide (VP-16-213). Current status of an active anticancer drug. N.

Engl. J. Med. 312 (11): 692-700.

17. Singh K., Savagosti S. and Botchan M. (1985). Insolation of cellular genes

differentially expressed in mouse NIH3T3 cells a simian virus 40-transformed

derivative: grauth specific expression of vL30 genes. Mol. Cell. Biol., 5 (10),

2590-2598.

18. Song X., Wang B., Bromberg M., Hu Z., Konigsberg W., Garen A. 2002.

Retroviral-mediated transmission of a mouse VL30 RNA to human melanoma

cells promotes metastasis in an immunodeficient mouse model. Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 99 (9):6269-6273.

19. Tobin D., Nilsson M. and Toftgard R., (1996). Ras-independent activation of

rel. family transcription factors by urb and TRA in cultured keratinocytes.

Oncogene, 12, 785-793.

20. Torrent C., Gabus C., Darlix J.L. (1994), A small and efficient

dimerization/packaging signal of rat VL30 RNA and its use in murine

leukemia virus-VL30-derived vectors for gene transfer. J. Virol. 68(2):661-

667.

21. Tzavaras T., Kalogera C., Eftaxia S., Saragosti S., Pagoulatos G., 1998, Clone-

specific high-frequency retrotransposition of a recombinant virus containing a

VL30 promoter inSV40-transformed NIH3T3 cells. Biochim. Biophys. Acta.

1442:186-198.

22. Verheij M., Bose R., Lin X. H., Yao B., Jarvis W. D., Grant S., Birrer M. J.,

Szabo E., Zon L. I., Kyriakis J. M., Haimovitz-Friedman A., Fuks Z.,

40

Kolesnick R. N. (1996) Requirement for ceramide-initiated SAPK/JNK

signalling in stress-induced apoptosis. Nature. 380 (6569): 75-79.

23. Yamada T., Odawara K., Kaneko H. (2000) Concurrent detection of gene

mutations and chromosome aberrations induced by five chemicals in a

CHL/IU cell line incorporating a gpt shuttle vector.Mutat. Res. 471 (1-2): 29-

36.

41

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

1. Ανίχνευση της παραθυμοσίνης στην απλή οζώδη βρογχοκήλη.

2. Μελέτη της προθυμοσίνης α στην απόπτωση και στον

κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Υπεύθυνος: Βαρέλη Κατερίνα (Ph.D)

Συμβουλευτικός ρόλoς: Φράγκου-Λαζαρίδη Μαρία (Αναπληρώτρια

Καθηγήτρια)

42

A. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Ο θύμος είναι ένα κεντρικό λεμφικό όργανο που προσφέρει το

μικροπεριβάλλον για την ανάπτυξη των ώριμων Τ λεμφοκυττάρων από πρόδρομες

μορφές κυττάρων που σχηματίζονται στο μυελό των οστών. Αυτό το

μικροπεριβάλλον περιέχει μια οικογένεια πεπτιδίων που εκκρίνονται από τα κύτταρα

του θύμου και μερικά από αυτά μπορούν επιτυχώς να εκχυλισθούν, να καθαριστούν

και να προσδιορισθεί η ακολουθία τους. Το 1975 παρασκευάσθηκε ένα εκχύλισμα

από θυμό μόσχου που ονομάστηκε θυμοσίνη κλάσμα 5 (TF5) με ανοσολογική

δραστικότητα (Hooper et. al., 1975).

Το 1977 απομονώθηκε από το παραπάνω θυμικό παρασκεύασμα ένα πεπτίδιο

28 αμινοξέων, η θυμοσίνη α1 (Goldstein et. al., 1977). Μια περισσότερο προσεκτική

εκχύλιση από θύμο επίμυ, οδήγησε στην απομόνωση ενός μεγαλύτερου πεπτιδίου 111

αμινοξέων που περιέχει τα προηγούμενα πεπτίδια στο αμινοτελικό άκρο. Αυτή η

πρωτεΐνη ονομάστηκε Προθυμοσίνη α (ProTa) (Haritos et. al., 1984a). Παράλληλα με

την απομόνωση της προθυμοσίνης α (ProTa), απομονώθηκε και ένα δεύτερο

πολυπεπτίδιο 101 αμινοξέων, που ονομάσθηκε παραθυμοσίνη (ParaTa) (Haritos et.

al., 1985c).

A. 1. Παραθυμοσίνη. Η πρωτοταγής δομή της πρωτεΐνης.

Η πρωτεΐνη έχει τον ίδιο αριθμό αμινοξέων 101 και στα τρία είδη από τα οποία

απομονώθηκε (επίμυς, βοός, άνθρωπος) και προσδιορίσθηκε η δομή της πρωτεΐνης. Η

πρωτοταγής δομή της παραθυμοσίνης (σχήμα 1) ταυτοποιήθηκε πλήρως μετά την

απομόνωση των κλώνων cDNA της παραθυμοσίνης, από σπλήνα επίμυος (Frangou-

Lazaridis et al., 1988). Η ανάλυση της πρωτοταγούς δομής της πρωτεΐνης δείχνει μια

ιδιάζουσα κατανομή των αμινοξέων λόγω της οποίας μπορούμε να διακρίνουμε τρεις

περιοχές: την αμινοτελική περιοχή (1-37), όπου υπάρχουν θετικά φορτισμένα

αμινοξέα (12 κατάλοιπα Lys και Arg) και αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα (10

κατάλοιπα Asp και Glu). Η κεντρική περιοχή (38-74) η οποία περιέχει το 65% των

όξινων καταλοίπων αμινοξέων. Το καρβόξυ άκρο, που εντοπίστηκε η αλληλουχία

οδηγός της πρωτεΐνης στον πυρήνα του κυττάρου στην θέση 90-95 (PKRQKT)

(Watts et al., 1990: Clinton et al.,1991). Πρόσφατα διαπιστώθηκε ότι για την

μεταφορά της παραθυμοσίνης ήπατος επίμυος στον πυρήνα είναι απαραίτητο το

τριπεπτίδιο RKR (θέσεις 78-80) και προτάθηκε ότι αποτελεί το τμήμα του πεπτιδίου

43

οδηγού στον πυρήνα (Trompeter et al., 1996). Τα αμινοξέα αυτά όμως δεν είναι

συντηρημένα στην πρωτεΐνη ανθρώπου και βοός.

Σχήμα 1: Διαγραμματκή απεικόνιση των περιοχών της πρωτεΐνης της παραθυμοσίνης. Με D1 σημειώνεται η αμινοτελική περιοχή. Η όξινη περιοχή D2, στην οποία συνδέονται τα ιόντα Zn2+, βρίσκεται στο κεντρικό τμήμα του μορίου. Στο καρβοξυτελικό άκρο υπάρχουν δύο αλληλουχίες D3 και D4 που σχηματίζουν το πεπτίδιο οδηγό της πρωτεΐνης στο πυρήνα (NLS) (Watts et al., 1990: Clinton et al.,1991: Trompeter et. al., 1996).

Α. 1. 1. Το γονίδιο της παραθυμοσίνης

Το 1992 απομονώθηκε ο γονιδιωματικός κλώνος από βιβλιοθήκη ήπατος

επίμυος που περιέχει το γονίδιο της παραθυμοσίνης (Trompeter and Soling, 1992)

Ανάλυση της αλληλουχίας του γονιδίου έδειξε ότι (σχήμα 2): Η κωδικοποιός περιοχή

αποτελείται από 5 εξόνια τα οποία διακόπτονται από 4 ιντρόνια. Στην 5΄ πλευρική

αλληλουχία του γονιδίου εντοπίστηκαν οι αλληλουχίες για την έναρξη της

μεταγραφής από την RNA πολυμεράση ΙΙ: κουτί ΤΑΤΑ (ΑΑΤΑΑΑΓ), κουτί CAAT

(GCAATA), περιοχές πλούσιες σε GC (GGGCCC, GGGCG) στις οποίες δεσμεύεται

ο μεταγραφικός παράγοντας SP1 (Trompeter and Soling, 1992).

Σχήμα 2: Απεικόνιση της δομής του γονιδίου της παραθυμοσίνης επίμυος. Το γονίδιο αποτελείται απο 5 εξόνια (Ε1-Ε5). Στην 5΄ πλευρική αλληλουχία του γονιδίου σημειώνονται με βέλη οι πιθανές περιοχές δέσμευσης για τους παράγοντες μεταγραφής 1: οι δύο περιοχές πλούσιες σε GC στις οποίες πιθανόν δεσμεύεται ο παράγοντας SP1, 2: κουτί CAAT και 3: κουτί ΤΑΤΑ. Η αρίθμηση των θέσεων των ρυθμιστικών αλληλουχιών γίνεται θεωρώντας σαν αρχή +1 τη θέση του πρώτου εξονίου. Το συνολικό μέγεθος είναι 6,3 kb.

Επίσης, στην περιοχή αυτή υπάρχει αλληλουχία που πιθανόν αντιστοιχεί στη

θέση δέσμευσης του ρυθμιστικού παράγοντα απόκρισης σε ορό, SRF (Serum

response factor) (Βαρέλη Κ., 1995).

1 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5

1 2 3

1 38 74 78 80 90 95

D1 D2 D3 D4

44

Α. 1. 2. Κατανομή της παραθυμοσίνης σε ιστούς και η ενδοκυττάρια θέση της.

Η παραθυμοσίνη ανιχνεύθηκε σε ιστούς ανθρώπου, επίμυος, ποντικού, βοός και

χοίρου. Η ανίχνευση της παραθυμοσίνης στον άνθρωπο, έδειξε ότι η μεγαλύτερη

πoσότητα μετρήθηκε στο ήπαρ και ακολουθούν οι πνεύμονες, ο θυμός και οι νεφροί

(Tsitsiloni et. al.,1988).

Τα δεδομένα που προέκυψαν για τη παραθυμοσίνη, σε σύγκριση με την

κατανομή της προθυμοσίνης α, δείχνουν μια αντίστροφη σχέση κατανομής των δύο

πρωτεϊνών. Στους ιστούς υψηλής περιεκτικότητας προθυμοσίνης α επικρατεί χαμηλή

περιεκτικότητα παραθυμοσίνης και αντίστροφα, παρατήρηση που επιβεβαιώθηκε σε

επίπεδο πρωτεΐνης και mRNA (Clinton et.al.,1989a), σε επίμυες και ποντικούς.

Τα δεδομένα για την ενδοκυττάρια θέση της παραθυμοσίνης είναι

αντικρουόμενα. Η πρωτεΐνη έχει ανιχνευθεί στο κυτταρόπλασμα των περισσοτέρων

κυττάρων που εξετάστηκαν (Roson et. al., 1990, Brand et. al., 1991), ενώ με

πειράματα έμμεσου ανοσοφθορισμού, έδειξαν ότι η ParaTa εντοπίσθηκε στο πυρήνα

των κυττάρων NRK που προέρχονται από νεφρά επίμυος και των κυττάρων H35

Reuber από ηπατοκύτταρα επίμυος (Trompeter et al., 1996). Αντίθετα, η πρωτεΐνη

εντοπίσθηκε στο κυτταρόπλασμα ηπατοκυττάρων επίμυος που μόλις είχαν

απομονωθεί. Όμως μετά από καλλιέργεια της ίδιας κυτταρικής σειράς για 24 ώρες, η

ZnBP συσσωρεύεται στο πυρήνα. Η παρατήρηση αυτή (Trompeter et al., 1996),

οδήγησε τους ερευνητές στη διαπίστωση ότι η θέση της πρωτεΐνης στο κύτταρο

πιθανόν να εξαρτάται από το βαθμό διαφοροποίησης του.

Πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι η πυρηνική τοποθέτηση της παραθυμοσίνης

οφείλεται σε μία ακολουθία πυρηνικής τοποθέτησης (NLS) στο καρβόξυτελικο άκρο

που αναγνωρίζεται ως PKRQKT (θέσεις 90-95) (Watts et al., 1990; Clinton

et.al.,1991). Αυτές οι ακολουθίες αποδείχθηκαν λειτουργικές, όταν η ιωδιωμένη

ParaTa ενέθηκε εντός ωοκυττάρων Xenopous οπότε παρατηρήθηκε συσσώρευση της

εισαγόμενης πρωτεΐνης στο πυρήνα (Watts et al., 1990). Με πειράματα σύντηξης της

ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης (Clinton M., et. al., 1991) με cDNA παραθυμοσίνης

έχει ως αποτέλεσμα σε κύτταρα Hela S3, μια πυρηνική τοποθέτηση της πρωτεΐνης,

δείχνοντας ότι η μετατόπιση της ParaTa στον πυρήνα γίνεται με ενεργητική

μεταφορά. Για να εξεταστεί η ακολουθία NLS της παραθυμοσίνης ως προς την

επίδρασή της στην ενδοκυττάρια τοποθέτηση έγινε υπερέκφραση σε COS κύτταρα. Η

υπερέκφραση σε COS κύτταρα έδειξε ότι η παραθυμοσίνη άγριου τύπου τοποθετείται

45

στο πυρήνα ενώ η μεταλλαγμένη πρωτεϊνη στη περιοχή NLS βρίσκεται στο

κυτοσόλιο (Trompeter H.-I., et. al., 1996).

Α. 1. 3. Βιολογικός ρόλος της ParaTa.

Ο βιολογικός ρόλος της ParaTa δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. Αρχικά,

ταυτοποιήθηκε ως η πρωτεΐνη η οποία παρουσία ιόντων Zn2+ απενεργοποιούσε

αντιστρεπτά την φωσφοφρουκτοκινάση 1, για το λόγο αυτό ονομάζεται και 19kDa

Zn2+-binding protein (Tromreter et. al., 1989). Ένας δεύτερος ρόλος που προτάθηκε

είναι ότι αναμιγνύεται στο κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Συγκεκριμένα, μέτρηση των

επιπέδων της ParaTa και ProTa σε καρκινικούς και φυσιολογικούς ιστούς εντέρου και

μαστού έδειξε αυξημένα επίπεδα στους πρώτους σε σχέση με τους δεύτερους

(Tsitsilonis et. al., 1993). Ακόμα, η έκφραση και των δύο α-θυμοσινών βρέθηκε να

είναι ηλικιακά και ιστικά εξειδικευμένη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα

υψηλά επίπεδα έκφρασης και των δύο θυμοσίνων ProTa και ParaTa, σε νεαρούς και

καρκινικούς ιστούς, οφείλονται στα υψηλά επίπεδα του κυτταρικού

πολλαπλασιασμού αυτών των κυττάρων (Tsitsilonis et. al., 1993).

Σε μια πρόσφατη μελέτη (Okamoto et. al., 2000), προστίθεται μια νέα

βιολογική λειτουργία για τη ParaTa, όπου η πρωτεΐνη φαίνεται να αναμιγνύεται στη

δράση των γλυκοκορτικοειδών, GR. Η πυρηνική πρόσδεση του υποδοχέα

γλυκορτικοειδών, GR αναστέλλεται από ενδογενείς μακρομόρια, που διακρίνονται σε

τρία είδη MTI-I, MTI-II, MTI-III. To N αμινοτελικό άκρο του πιο δυναμικού

αναστολέα, του MTI-II, είναι μια 11.5-kDa Zn2+-προσδεόμενη πρωτεΐνη

(παραθυμοσίνη). Δείχθηκε ότι για την αναστολή του υποδοχέα GR να προσδεθεί στο

πυρήνα, υπεύθυνη είναι η όξινη περιοχή της ParaTa. Οι ορμόνες των

γλυκορτικοειδών αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και προάγουν τη διαφοροποίηση

των κυττάρων. Έτσι στο πολλαπλασιασμένο κύτταρο, ο παράγοντας MTI-II μπορεί

να επιταχύνει τη διαδικασία πολλαπλασιασμού με αναστολή της δράσης των

γλυκοκορτικοειδών. Προστίθεται ένας νέος βιολογικός ρόλος για την ParaTa, όπου

μέσω της αναστολής της δράσης των γλυκοκορτικοειδών, συμμετέχουν στην

διαδικασία του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Okamoto and Isohashi, 2000).

Πρόσφατη μελέτη (Vareli et. al., 2000) που αφορά το βιολογικό ρόλο των δύο

α-θυμοσινών, έδειξε ότι η ParaTa σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα Τ24 από

ουροδόχο κύστη τοποθετείται στο πρωτόπλασμα του πυρήνα και βρίσκεται

συνδεδεμένη με περιοχές αντιγραφής, ενώ το κύτταρο βρίσκεται στην πρώιμη S-

46

φάση και αντιγράφει ενεργή χρωματίνη. Αυτό δείχνει ότι η παραθυμοσίνη έχει

κάποιο ρόλο στην DNA σύνθεση, σε συμφωνία με την παραδοχή ότι η πρωτεΐνη

ρυθμίζεται θετικά και μεταναστεύει στο πυρήνα κατά την S-φάση (Vareli et. al.,

2000).

Α. 2. Πρωτοταγής δομή της πρoθυμοσίνης α.

Ο προσδιορισμός της πλήρους αλληλουχίας του πολυπεπτιδίου έγινε μετά την

απομόνωση του cDNA από ανθρώπινα σπληνοκύτταρα (Goodall et. Al., 1986) και

από σπληνοκύτταρα επίμυος (Frangou–Lazaridis et. al., 1988). Η πρωτεΐνη εμφανίζει

μεγάλη συντηρητικότητα δομής και ο αριθμός αμινοξέων της ποικίλει (109-111

αμινοξέα) ανάλογα με το είδος από το οποίο απομονώθηκε. Δεν περιέχει αρωματικά

ή θειούχα κατάλοιπα αμινοξέων και His, ενώ είναι πλούσια σε όξινα αμινοξέα, που

είναι συσσωρευμένα στη κεντρική περιοχή του μορίου (51-83). Στο καρβοξυτελικό

άκρο της προθυμοσίνης (θέσεις 102-105) υπάρχει αλληλουχία οδηγός για την

μετακίνηση της πρωτεΐνης στον πυρήνα (Watts et. al., 1990, Clinton et. al., 1991)

Α. 2. 1. Οργάνωση του γονιδίου της προθυμοσίνης α.

Εφαρμογή της αποτύπωσης κατά Southern στο DNA του ανθρώπινου

γονιδιώματος για τον εντοπισμό του γονιδίου της ProTa οδήγησε στην ανίχνευση

μιας οικογένειας 6 γονιδίων. Από την οικογένεια αυτή ένα είναι το λειτουργικό

γονίδιο, που κωδικοποιεί για την προθυμοσίνη α, ενώ τα άλλα πέντε είναι

ψευδογονίδια.

Σχήμα 3: Δομή του λειτουργικού γονιδίου της προθυμοσίνης α από ανθρώπινο γονιδίωμα. Αποτελείται από 5 εξόνια, Ε1-Ε5, που διακόπτονται απο 4 ιντρόνια. Στην αλληλουχία του υποκινητή, Υ, σημειώνονται με βέλη 1: οι αλληλοδιαδοχές των βάσεων που αποτελούν τη θέση δέσμευσης για το ογκογονίδιο c-myc, 2: η περιοχή -300 έως -620 που είναι πλούσια σε GC και περιέχει 7 θέσεις δέσμευσης για τον παράγοντα SP1, 3:τον παράγοντα μεταγραφής E2F, 4: κουτί CAAT, 5: κουτί ΤΑΤΑ και 6: αλληλουχία υπεύθυνη για το εναλλακτικό μάτισμα. Το συνολικό μέγεθος είναι 6,9kb.

Το λειτουργικό γονίδιο αποτελείται απο πέντε εξόνια που διακόπτονται από

τέσσερα ιντρόνια, έχει σήμα πολυαδενυλίωσης στο 3΄ άκρο (σχήμα 3). Η πλήρης

1 2 3 4 5 6 5΄ ΄

Y E1 E2 E3 E4 E5

47

αλληλουχία της ρυθμιστικής περιοχής του ανθρώπινου γονιδίου επέτρεψε την

ανάγνωση 1792 βάσεων ανοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής.

Εντοπίστηκαν οι θέσεις των ρυθμιστικών αλληλουχιών TATA, CAAT και οι θέσεις

δέσμευσης για τους παράγοντες μεταγραφής SP1, AP2, CREB καθώς και θέση

δέσμευσης για το ομοδιμερές του ογκογονιδίου c-myc. Στην αλληλουχία

διαπιστώθηκε ότι υπάρχει θέση δέσμευσης για τον παράγοντα μεταγραφής E2F

(Βαρέλη Κ., 1995).

Α. 2. 2. Ιστική κατανομή της προθυμοσίνης α και η ενδοκυττάρια θέση της.

Η προθυμοσίνη α συναντάται σε όλα τα θηλαστικά που εξετάστηκαν όπως τον

άνθρωπο, τον χοίρο, την αίγα και τον επίμυ. Μελέτες ιστικής κατανομής στον

άνθρωπο έδειξαν ότι ο πλουσιότερος ιστός για την προθυμοσίνη α είναι ο θύμος και

ακολουθεί ο σπλήνας, ενώ το ήπαρ, το έντερο και ο μαστός είναι οι ιστοί με την

χαμηλότερη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη (Tsitsiloni et. al., 1993).

H πρώτη υπόθεση για την ενδοκυττάρια εντόπιση της προθυμοσίνης α

διατυπώθηκε με βάση τα δομικά της χαρακτηριστικά. Ο όξινος χαρακτήρας της και η

παρουσία μιας όξινης περιοχής στο κέντρο του μορίου της αποτελούν δύο σημαντικές

ομοιότητες με πυρηνικά εντοπιζόμενες πρωτεΐνες. Επιπλέον το καρβόξυτελικο τμήμα

της πρωτεΐνης περιέχει μία αλληλουχία αμινοξέων που αποτελεί σήμα πυρηνικής

μετατόπισης. Έτσι, χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοιστοχημείας η προθυμοσίνη α

ανιχνεύθηκε στoν πυρήνα αρκετών κυττάρων (Roson et. al., 1990). Στο ίδιο

αποτέλεσμα ως προς την πυρηνική τοποθέτηση της προθυμοσίνης α, κατέληξαν οι

επιστήμονες με μελέτες που περιλαμβάνουν ένεση της προθυμοσίνης α απο θυμό

βοός και από άνθρωπο σε ωοκύτταρα Xenopous (Watts et. Al., 1990, Clinton et. Al.,

1991).

Α. 2. 3. Βιολογικός ρόλος της προθυμοσίνης α.

Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη εμπλέκεται στον

κυτταρικό πολλαπλασιασμό, λόγω της αυξημένης παρουσία της προθυμοσίνης α σε

αναπτυσσόμενους και σε καρκινικούς ιστούς. Τα επίπεδα του mRNA της πρωτεΐνης

βρέθηκαν αυξημένα σε πολλαπλασιασμένα κύτταρα όπως σε θυμοκύτταρα και σε

λευχαιμικά κύτταρα (Gomez-Marquez et. al., 1989). Επίσης, αυξημένα επίπεδα

παρατηρήθηκαν σε καρκίνο του μαστού (Tsitsilonis Ο. E., et. al., 1998) και σε

νευροβλάστωμα (Sasaki H., 2001). Το νευροβλάστωμα που είναι ο πιο κοινός

48

θανατηφόρος καρκίνος στην παιδική ηλικία οφείλεται σε υπερέκφραση του

πρωτοογκογονιδίου Ν-myc. Με διαρκή έκφραση του Ν-myc σε ανθρώπινες

κυτταρικές σειρές που προέρχονται απο νευροβλάστωμα, είχε ως αποτέλεσμα την

αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της ProTa, δείχνοντας ότι η ProTa λειτουργεί ως

στόχος του myc γονιδίου. Ακόμα , βρέθηκε ότι η ProTa έχει προγνωστική αξία σε

καρκίνο του μαστού (Magdalena C, 2000). Σε μια πρόσφατη μελέτη (Μartini P. G.

V., 2001) βρέθηκε ότι τα οιστρογόνα, που είναι ένας κύριος διεγέρτης του

πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων απο μαστό που περιέχουν ER (estogen

receptor), λειτουργούν επίσης ως θετικός ρυθμιστής της έκφρασης της ProTa. Η

ProTa αλληλεπιδρά με ένα καταστολέα της δραστικότητας των οιστρογόνων, REA

(Repressor of ER activity) (Μartini P. G. V. 2000) και αυξάνει τη μεταγραφική

δραστικότητα των ER με ένα μηχανισμό ανάδρασης, όπου και η ProTa ρυθμίζεται

θετικά από οιστρογόνο.

Μελέτες που περιλαμβάνουν προσδιορισμό του mRNA της προθυμοσίνης α και

του c-myc (Vareli et. al., 1995) σε διάφορες κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι τα επίπεδα

των mRNA των δύο πρωτεινών σχετίζονται μεταξύ τους. Παρατηρήθηκε ότι το

γονίδιο της προθυμοσίνης α επάγεται απο το ογκογονίδιο c-myc που είναι γνωστό ότι

δρα σαν ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Η σύνδεση της προθυμοσίνης α με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ο οποίος

συνδέεται με τη διαφοροποίηση των κύτταρων, έθεσε το ερώτημα αν η προθυμοσίνη

α εμπλέκεται στην διαδικασία της κυτταρικής διαφοροποίησης. Με πειράματα

κυτταρικής διαφοροποίησης σε προμυελωτικά κύτταρα HL-60 και στην κυτταρική

σειρά ποντικού F9 έδειξαν μείωση της προθυμοσίνης α, η οποία οφείλεται στην

ταυτόχρονη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, η οποία σταματά μόλις

τα κύτταρα ανακτήσουν την ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται (Vareli et.al.,

1995). Απο την ίδια ερευνητική ομάδα, προσδιορίστηκε η φάση του κυτταρικού

κύκλου, στην οποία η προθυμοσίνη α εμφανίζει αυξημένα επίπεδα σε διάφορες

κυτταρικές σειρές. Διαπιστώθηκαν αυξημένα επίπεδα του mRNA της προθυμοσίνης α

στο τέλος της S και της G2/M φάσης στην ίδια μελέτη αναφέρεται ότι η προθυμοσίνη

α επάγεται απο το μεταγραφικό παράγοντα E2F (Vareli et.al., 1995).

Η δομή της πρωτεΐνης οδήγησε τους ερευνητές σε μια ακόμα λειτουργία της. Η

πρωτεΐνη περιέχει μια ισχυρά όξινη κεντρική περιοχή όμοια με άλλες πυρηνικές

πρωτεΐνες που σχετίζονται με την οργάνωση της δομής της χρωματίνης. Συνεπώς

πιθανό και η προθυμοσίνη να έχει παρόμοια λειτουργία. Στην παραπάνω εκδοχή

49

οδηγεί η παρατήρηση ότι η προθυμοσίνη α συνδέεται ειδικά μέσω της όξινης

περιοχής της με την συνδετική ιστόνη H1 (Papamarkaki and Tsolas, 1994) και

τροποποιεί την αλληλεπίδραση της H1 με τη χρωματίνη (Karetsou et. al., 1998).

Α. 2. 3. 1. Βιολογικός ρόλος της ProTa στην απόπτωση.

Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος ή απόπτωση είναι ένας μηχανισμός

ασφάλειας του κυττάρου, που οδηγεί το κύτταρο σε αυτοκτονία, όταν κάποιο από τα

συστήματα ελέγχου της κυτταρικής αύξησης υποστεί βλάβη. Διαφέρει από την

κλασσική νέκρωση, όπου ένα εξωγενές βλαπτικό ερέθισμα προκαλεί ανεπανόρθωτη

κυτταρική βλάβη και το κύτταρο υποκύπτει.

Η απόπτωση παίζει κρίσιμο ρόλο στη φυσιολογική ανάπτυξη και ομοιόσταση

των ιστών, όπου μαζί με τα ρυθμιστικά γονίδια της αύξησης, συμμετέχει στη

διατήρηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων σε φυσιολογικό όριο. Η

απορυθμισμένη έκφραση των γονιδίων απόπτωσης, μέσω ενεργοποίησης ή

απενεργοποίησης τους, μπορεί να συμβάλλει στην πολυσταδιακή διαδικασία της

καρκινογένεσης.

Μορφολογικά η απόπτωση χαρακτηρίζεται από κατακερματισμό του πυρήνα

που μαζί με τμήματα του κυτταροπλάσματος απομακρύνονται από την επιφάνεια του

κυττάρου. Τα κυτταρικά συντρίμμια φαγοκυτταρώνονται από γειτονικά κύτταρα

(ιστικά μακροφάγα κ.α.) και δεν δημιουργείται φλεγμονή.

Ένζυμα κλειδιά του αποπτωτικού μηχανισμού στα κύτταρα των ανώτερων

ζώων είναι οι κασπάσες. Υπάρχουν τουλάχιστον 13 κασπάσες και η ενεργοποίηση

τους έχει μορφή καταρράκτη. Αυτές που ενεργοποιούνται πρώτες ονομάζονται

initiator caspases (π.χ. caspase 8, caspase 9), ενώ αυτές που ενεργοποιούνται από τις

initiator καλούνται effector ή executioner caspases (π.χ. caspase 3).

Η ενεργοποίηση των initiator casppases μπορεί να γίνει με δύο τρόπους: (a)

κατά τη μιτοχονδριακή οδό απελευθερώνεται κυτόχρωμα c από το μιτοχόνδριο και

ενώνεται με και ολιγομερίζει τον παράγοντα apaf 1 δημιουργώντας το apoptosome.

Το apoptosome συνδέεται και ενεργοποιεί τη initiator caspase 9. Η ενεργοποίηση

αυτή υποβοηθείται από την πτώση του pH που διευκολύνει την απελευθέρωση του

κυτοχρώματος c. Η τελευταία εξαρτάται από την ανταγωνιστική δράση των

προαποπτωτικών και αντιαποπτικών παραγόντων της οικογένειας όπου ανήκει το bcl-

2 γονιδίου. (b) κατά την οδό υποδοχέα θανάτου το πρόσδεμα CD95 (που εκφράζεται

σε κύτταρα φυσικούς φονείς και ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα) προσδένεται στον

50

CD95 υποδοχέα (ανήκει στην οικογένεια TNF receptor) και αυτό έχει ως αποτέλεσμα

την μεταγωγή αποπτωτικού σήματος που διαμεσολαβείται δια μέσου μίας 70

αμινοξέων κυτοπλασμικής περιοχής DD (death domain) που βρίσκεται μεταξύ CD95

και TNF receptor I. Σήμερα έχουν περιγραφεί τρία διαφορετικά αποπτωτικά

μονοπάτια όπου διαμεσολαβείται ο παράγοντας CD95. Το πιο καλά μελετημένο

περιλαμβάνει τη πρωτεΐνη FADD (Fas-Associated Death Domain) η οποία

προσδένεται στη CD95. Σε ένα δεύτερο βήμα η προενζυματική μορφή της κασπάσης

8, προσδένεται στο CD95\FADD σύμπλοκο. Η πρόσδεση προκαλεί την ενεργοποίηση

της κασπάσης 8, που στη συνέχεια επάγει ένα καταρράκτη αντιδράσεων που

περιλαμβάνει πολλά μόρια κασπάσης. Τα δύο μονοπάτια συγκλίνουν στην

ενεργοποίηση της κασπάσης 3, η οποία ενεργοποιεί το τελικό βήμα που καταλήγει

στην αποσύνθεση και μετακίνηση του κυττάρου.

Η σχέση της πρωτεΐνης της προθυμοσίνης με την διαδικασία της απόπτωσης,

ελκύει την προσοχή της επιστημονικής κοινότητας. Tο γονίδιο της προθυμοσίνης

αποτελεί το γονίδιο στόχο του c-myc γονιδίου (Gaubatz S., et. al. 1995), είναι γνωστό

ότι το γονίδιο c-myc λειτουργεί ως ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και

ως επαγωγέας της απόπτωσης. Η πρωτεΐνη myc αναγνωρίζει και προσδένεται σε

αλληλουχίες E-box της προθυμοσίνης, ανοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής,

δια μέσου του ετεροδιμερισμού της πρωτεΐνης Max, για την επαγωγή της απόπτωσης

και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Gaubatz S., et. al. 1995).

Μια πρόσφατη παρατήρηση (Rontriguez P., et. al., 1999) έδειξε ότι μεταχείριση

HL60 κυττάρων με αντινοηματικά 5΄-ολιγονουκλεοτίδια, PAS που είναι

συμπληρωματικά με την αλληλουχία mRNA της ProTa σε συγκέντρωση 40 και 80

μM, προκαλούν αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επίδραση στην ίδια

κυτταρική σειρά με μεγαλύτερη συγκέντρωση 160 μ PAS, επάγουν απόπτωση των

κυττάρων. Η παρουσία υψηλής συγκέντρωσης PAS προκαλλεί κυτταρικό θάνατο με

τη διαδικασία της απόπτωσης, πιθανόν με αναστολή της μετάφρασης του mRNA της

προθυμοσίνης α. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της μελέτης (Evstafieva A. G.,

et. al., 2000) σε κύτταρα Hela, διαμολυσμένα με το cDNA ανθρώπινης προθυμοσίνης

α, έδειξαν ότι η προθυμοσίνη α συμμετέχει στην απόπτωση. Η ProTa διασπάται σε

κύτταρα που αποπίπτουν, στο καρβόξυτελικο άκρο από κασπάση -3 και –7, εντός της

περιοχής NLS, και η πρωτεΐνη ProTa αποτυγχάνει να συσσωρευτεί εντός του πυρήνα.

Αυτές οι δύο παρατηρήσεις οδήγησαν στο συμπέρασμα (Evstafieva A. G., et. al.,

2000) ότι η απομάκρυνση, εξάλειψη της προθυμοσίνης είτε φυσικά (με διάσπαση από

51

κασπάση) ή τεχνητά (με αναστολή της μετάφρασης της προθυμοσίνης α) μπορεί να

αποτελέσει την αφορμή για να αλλάξει την πορεία των κυττάρων από την διαδικασία

του πολλαπλασιασμού στη διαδικασία της απόπτωσης. Για το λόγο αυτό τα υψηλά

επίπεδα της ProTa σε καρκινικά κύτταρα έχουν ως αποτέλεσμα όχι μόνο αυξημένο

πολλαπλασιασμό αλλά επίσης προστατεύουν αυτά τα κύτταρα από την είσοδο τους

στο μονοπάτι της απόπτωσης. Μια πρόσφατη έρευνα έδειξε (Jiang X. et. al., 2003)

ότι η προθυμοσίνη α συμμετέχει στο μονοπάτι ενεργοποίησης κασπάσης κατά την

μιτοχονδριακή οδό. Το μονοπάτι αυτό ρυθμίζεται από τις ογκοκατασταλτικές

πρωτεΐνες PHAP και την ογκοπρωτεϊνη ProTa με δύο διαφορετικά βήματα: H ProTa

αναστέλλει. την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 με μπλοκάρισμα του σχηματισμού

του αποπτωσώματος. Οι PHAP πρωτεϊνές δεν επηρεάζουν το σχηματισμό του

αποπτωσώματος αλλά επάγουν την ενεργοποίηση της κασπάσης 9. η δράση της

προθυμοσίνης α αναστέλλεται από τη δράση της ουσίας PETCM η οποία διεγείρει το

σχηματισμό αποπτωσώματος και ενεργοποιεί κασπάση 3. Ακόμα στην ίδια εργασία

παρατηρήθηκε υψηλός ρυθμός απόπτωσης σε κύτταρα Hela με επίδραση με UV

ακτινοβολία, όταν ελαχιστοποιήθηκε η έκφραση mRNA της προθυμοσίνης α με RNA

interference.

52

Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ.

Η παραθυμοσίνη είναι ένα μικρό, όξινο πολυπεπτίδιο, με αδιευκρίνιστο

βιολογικό ρόλο. Σκοπός της μελέτης αυτής είναι η ο προσδιορισμός των κατάλληλων

συνθηκών για την ενίσχυση του γονιδίου της παραθυμοσίνης με τη τεχνική της

αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Σε ασθενείς με απλή οζώδη βρογχοκήλη.

απομονώθηκε ολικό γενωματικό DNA από θύμο αδένα και πραγματοποιήθηκε

ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της παραθυμοσίνης, σε μια περιοχή ανοδικά του

σημείου έναρξης της μετάφρασης, με τη τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης

πολυμεράσης.

Η προθυμοσίνη α είναι βιοχημικά πολύ καλά χαρακτηρισμένη. Σκοπός της

παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση της έκφρασης της πρωτεΐνης σε επίπεδο

mRNA και πρωτεΐνης στις κυτταρικές σειρές CHO-MT-UTR και CHO-MT-GSH.

Προηγούμενες μελέτες μας οδήγησαν στη μελέτη του ρόλου της πρωτεΐνης σε σχέση

με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, την απόπτωση. Για το λόγο αυτό

μετρήθηκε το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης στη κυτταρική σειρά Hela, σε

συνθήκες απόπτωσης.

53

Γ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Γ. 1. Απομόνωση ολικού γενωμικού DNA

Η απομόνωση του ολικού γενωματικού DNA έγινε σε δείγματα αίματος που

προέρχονται απο παρακέντιση του θυροειδούς αδένα σε ασθενείς με απλή οζώδη

βρογχοκήλη.

Πειραματική πορεία:

Σε 2ml δείγματος αίματος προστίθενται 3ml διάλυμα λύσης I (155mM NH4Cl,

10mM KHCO3, 1mM EDTA), για τη λύση του κυττάρου και το δείγμα τοποθετείται

για 30 min σε πάγο. Ακολούθει φυγοκέντριση στις 3000 rpm για 15min στους 40C.

Στο ίζημα προστίθενται 2ml διάλυμα λύσης I και τα δείγματα ανακινούνται

προσεκτικά. Κατόπιν ακολουθεί φυγοκέντριση όπως παραπάνω. Επαναλλαμβάνεται

το ίδιο βήμα με προσθήκη στο ίζημα 0.5ml διάλυμα λύσης I και φυγοκέντριση.

Στη συνέχεια προστίθενται στο ίζημα 0.6ml διάλυμα λύσης IΙ (400mM NaCl,

10mM Tris HCl pH 8.2, 2mM EDTA), 250μg/ml πρωτεϊνάση K και 0.6%. SDS.

Ακολουθεί επώαση στους 370C και ανακίνιση για 24 ώρες. Η πρωτεϊνάση K είναι μία

μη ειδική πρωτεάση σερίνης. Η δραστικότητα της μπορεί να αυξάνεται με προσθήκη

αποδιατακτικών παραγόντων όπως SDS και ουρία. Η πρωτεϊνάση Κ χρησιμοποιείται

για την απενεργοποιήση ενδογενών νουκλεασών όπως RNA ή DNA από ιστούς και

κυτταρικές σειρές. Η περιεκτικότητα του δείγματος σε DNA μπορεί να υπολογιστεί

με μέτρηση της απορρόφησής του στα 260nm με βάση τη σχέση: μία οπτική

πυκνότητα (OD) αντιστοιχεί σε 50μg/ml DNA. Στη συνέχεια αραιώνονται ώστε η

τελική συγκέντρωση σε DNA να είναι 50ng/μl πριν αποθηκευτούν στους -200C.

Γ. 2. Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, PCR

Πραγματοποιήθηκε ενίσχυση του γονιδίου της παραθυμοσίνης, σε ολικό

γενωμικό DNA, με τη τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR. Το

DNA απομονώθηκε όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Β. 1. από ασθενείς με απλή

οζώδη βρογχοκήλη και υγιείς. Ακολούθησαν επαναλαμβανόμενα πειράματα της

τεχνικής PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) για να καθοριστούν οι βέλτιστες

συνθήκες για την ενίσχυση του γονιδίου της παραθυμοσίνης.

Πειραματική πορεία:

Το μίγμα αντιδρώντων της αντίδρασης RCR για την ανίχνευση τμήματος του

γονιδίου της ParaTa περιλαμβάνει: MgCl2 50mM, κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα

10x (DNA polymerase buffer), ισομοριακό μίγμα dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNTP

54

mix) και Taq πολυμεράση 5U/μl. Όλα τα παραπάνω υλικά της αντίδρασης είναι της

CIRCO BRL. Επίσης, το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει εκμαγείο, που

προέρχεται από γενωματικό DNA και το ζεύγος των εκκινητών με την εξής

αλληλουχία:

Εκκινητής 1: HUMAN ParaT 5΄-TGC GGT CTC CGT CCA GA-3΄

Εκκινητής 2: ParaT 5΄-TTC TCC GAC ATG GTG CC-3΄

Ο εκκινητής 1 έχει σχεδιαστεί να είναι συμπληρωματικός με το εξόνιο 1 του

γονιδίου της παραθυμοσίνης, ενώ ο εκκινητής 2 είναι συμπληρωματικός με το εξόνιο

4 του γονιδίου της παραθυμοσίνης. Κατά τη διάρκεια των θερμικών κύκλων της RCR

το μίγμα αρχικά αποδιατάσσεται. Κατόπιν το μίγμα επωάζεται σε 30 θερμικούς

κύκλους που περιλαμβάνουν τρία βήματα: αποδιάταξη–πρόσδεση–επιμήκυνση. Το

στάδιο της πρόσδεσης είναι πολύ σημαντικό για την επιτυχή πρόσδεση των

εκκινητών στο DNA και δοκιμάστηκαν θερμοκρασίες απο 42οC έως 60οC.

Οι εκκινητές αραιώθηκαν με ddH2O σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ για κάθε

ολιγονουκλεοτίδιο. Η τελική συγκέντρωση του κάθε εκκινιτή στην αντίδραση είναι

0.5μΜ. Το μίγμα των τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοσιδίων (dNTP’s mix)

περιλαμβάνει 2.5mΜ από κάθε dNTP. Η τελική συγκέντρωση κάθε dNTP σε κάθε

αντίδραση PCR είναι 0.25mΜ.

Γ. 3. Κυτταρικές σειρές και συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας

Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η ανθρώπινη κυτταρική

σειρά Hela και οι κυτταρικές σειρές CHO – MT – GSH και CHO – MT – UTR.

Τα κύτταρα Hela έχουν μορφολογία επιθηλίου και προέρχονται από ασθενή με

καρκίνο μήτρας. Αναπτύσσονται προσκολλούμενα σε σταθερό υπόστρωμα και

καλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium).

Οι κυτταρικές σειρές CHO-MT-GSH και CHO-MT-UTR προέρχονται από

ωοθήκη κινέζικου Hamster (CHO) (Chineese hamster ovary). Η κυτταρική σειρά

CHO-MT-GSH είναι διαμολυσμένη με το γονίδιο της μεταλλοθιονίνης ενώ η

κυτταρική σειρά CHO-MT-UTR είναι διαμολυσμένη με το γονιδιακό δόμημα της 5΄-

μη μεταφραζόμενης περιοχής και τη κωδικεύουσα περιοχή της μεταλλοθιονίνης 1 και

φέρουν τη 3΄-μη μεταφραζόμενη περιοχή της υπεροξιδάσης της γλουταθιονίνης. Οι

δύο κυτταρικές σειρές καλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό HAM’S F12 (ICN

Biomedicals Inc) το οποίο εμπλουτίζεται με 1.176g/l NaHCO3.

55

Τα θρεπτικά υλικά DMEM και HAM’S F12 πριν τη χρήση τους εμπλουτίζονται

με L-γλουταμίνη (SIGMA) σε τελική συγκέντρωση 4 mΜ και γίνεται προσθήκη των

αντιβιοτικών Garamycin και Fungizone σε τελικές συγκεντρώσεις 80 μg/ml και 0.5

mg/ml αντίστοιχα. Στο θρεπτικά υλικά προστίθενται 10% ορός εμβρύου βοός (FCS)

(Gibco BRL).

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν προσκολλούμενα σε σταθερό υπόστρωμα μέσα σε

κατάλληλο επωαστικό κλίβανο στον οποίο η θερμοκρασία διατηρήθηκε σταθερή

στους 37 °C, όπου επικρατούσαν συνθήκες υγρασίας και η ατμόσφαιρα ήταν

εμπλουτισμένη με 5% CO2.

Γ. 4. Εκχύλιση πρωτεϊνών

Πραγματοποιήθηκε εκχύλιση των πρωτεϊνών στις κυτταρικές σειρές CHO-

MT-UTR και CHO-MT-GSH. Καθώς και στη κυτταρική σειρά Hela σε συνθήκες

απόπτωσης, μετά από επίδραση των κυττάρων με 20 μg/ml θρεπτικού υλικού cis–

Platinum για 5, 10 και 20 ώρες. Η εκχύλιση των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε όπως

περιγράφεται παρακάτω:

Τα κύτταρα αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό DMEM εμπλουτισμένο με 10%

FCS. Το θρεπτικό υλικό συλλέγεται. Ακολουθεί έκπλυση του κυτταρικού ταπητίου

με 10ml Hank’s, το οποίο συλλέγεται όπως πρωτύτερα και παράλληλα ακολουθεί

μέτρηση των κυττάρων με αιματοκυτταρόμετρο.

Στο κυτταρικό ταπήτιο προστίθενται 7ml Hank’s και τα κύτταρα

συγκεντρώνονται με scrapper. Τα κύτταρα του θρεπτικού υλικού, της έκπλυσης και

του ταπητίου ενώνονται και ακολουθεί φυγοκέντριση για 10 min στις 15.000rpm.

Επαναδιάλυση του κυτταρικού ιζήματος σε διάλυμα λύσης (1% SDS, 2mM

PMSF, 1μl Aprotin, 1μl Leupeptin, 1μl Pepstatin, σε PBS) και παραμονή στους 40C

για 15min. Στη συνέχεια ακολουθεί φυγοκέντριση για 1 min στις 15.000rpm.

Συλλέγεται το υπερκείμενο, προστίθεται 0.5ml Sample buffer και τα δείγματα

φυλάσσονται στους –200C.

Γ. 5. Ηλεκτροφόρηση πρωτείνών σε πηκτή SDS–πολυακρυλαμιδίου.

Με την ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου επιτυγχάνεται ο

διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Το ακρυλαμίδιο

πολυμερίζεται με προσθήκη υπερθειικού αμμωνίου και TEMED και δημιουργεί

τρισδιάστατο δίκτυο. Η προσθήκη του ανιονικού απορρυπαντικού SDS (θειικό

56

δωδεκακυλικό νάτριο) έχει ως αποτέλεσμα τη δέσμευση SDS-πρωτεϊνών και

προσδίδει στα μόρια καθαρό αρνητικό φορτίο ανάλογο με τη μάζα τους. Έτσι η

κινητικότητα των πρωτεϊνών πάνω στην πηκτή είναι αντιστρόφος ανάλογη του

μοριακού τους βάρους .

Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε σύστημα κάθετων γυάλινων πλακών. Η πηκτή

αποτελείται από δύο μέρη: από την πηκτή επιστοίβαξης και την πηκτή διαχωρισμού.

Η αναλογία όγκων πηκτής διαχωρισμού-πηκτής επιστοίβαξης είναι περίπου 5:1.

Για πηκτή διαχωρισμού 15% χρησιμοποιούμε:

Πηκτή διαχωρισμού:

Διάλυμα ‘Ογκος τελική συγκέντρωση

30% ακρυλαμίδιο, 0.8% Δις-ακρυλ. 5.0ml 15%w/v

Seperating Buffer 2.5ml 0.12M Tris pH 8.8, 0.09% SDS

H2O 2.5ml

0.1mg/ml υπερθειικό αμμώνιο 100μl 0.1% w/v

Το μίγμα πολυμερίζεται με 5μl TEMED.

Πηκτή επιστοίβαξης:

Διάλυμα Όγκος τελική συγκέντρωση

30% ακρυλαμίδιο, 0.8% Δις-ακρυλ. 0.75ml 4.5% w/v

Stacking Buffer 1.25ml 0.12M Tris pH 6.8, 0.09% SDS

H2O 3ml

0.1mg/ml υπερθειικό αμμώνιο 50μl 0.1% w/v

Το μίγμα πολυμερίζεται με 5μl TEMED. Ο πολυμερισμός της πηκτής γίνεται σε

θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα ξηραίνονται σε φυγοκεντρικό συμπυκνωτή

κενού, προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα 10-40μl (0.0625Μ Tris-HCl pH 6.8, 3% w/v

SDS, 10% v/v γλυκερόλη, 5% v/v 2-μερκαπτοαιθανόλη, 0.01% κυανό της

βρωμοφαινόλης) και θερμαίνονται για 5 λεπτά στους 680C. Φορτώνονται στη πηκτή

και η ηλεκτροφόρηση ολοκληρώνεται σε 200Volt και 50mA σε διάλυμα

ηλεκτροφόρησης (0.025Μ Tris-HCl pH 8.3, 0.169Μ γλυκίνη, 0.1% w/v SDS). Ως

δείκτης μοριακού βάρους χρησιμοποιείται 50ng καθαρής πρωτεΐνης προθυμοσίνης α.

57

Γ. 6. Μεταφορά και ανίχνευση πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη με

ανοσοαποτύπωση.

Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, ακολούθησε η μεταφορά των πρωτεϊνών

σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης σε 20mM CH3COONa. Το φίλτρο νιτροκυτταρίνης πριν

τη χρήση του τροποποιήθηκε έτσι ώστε η προθυμοσίνη α να συνδέεται ομοιοπολικά

σε αυτή. Η διαδικασία τροποποίησης της μεμβράνης σύμφωνα με τους (Lauritzen et.

al., 1990) έχει ως εξής: Η μεμβράνη επωάσθηκε για 1 ώρα σε διάλυμα αποτελούμενο

από 1.5 ml διβινυλοσουλφόνης, 3ml διμεθυλοφορμαμιδίου και 25ml 0.5Μ

NaHCO3/NaCO3 pH 10 και στη συνέχεια εκπλύθηκε με νερό. Ακολούθησε

τοποθέτηση της μεμβράνης για 30 λεπτά σε διάλυμα 1% v/v αιθυλενοδιαμίνης σε

νερό και ακολούθησε έκπλυση με νερό. Τελικά, η μεμβράνη επωάσθηκε επί 15 λεπτά

σε διάλυμα 1% γλουταραλδεϋδης σε 0.5 Μ NaHCO3/NaCO3 pH 10 και εκπλύθηκε με

νερό.

Συγχρόνως εμβαπτίζεται η πηκτή σε διάλυμα 20mM CH3COONa pH 4.5 ώστε

να εξουδετερωθεί το αλκαλικό pH της. Η μεταφορά των πρωτεϊνών στο

ενεργοποιημένο φίλτρο νιτροκυτταρίνης, γίνεται με τη χρήση ειδικής συσκευής υγρής

μεταφοράς (Biorad), με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου 7V και έντασης 45mA για

7 ώρες σε διάλυμα μεταφοράς 20mM CH3COONa. pH 4.5. Στη συνέχεια γίνεται

χρώση της πηκτής για να διαπιστωθεί το ποσοστό μεταφοράς των πρωτεϊνών.

Μετά την ολοκλήρωση της μεταφοράς η μεμβράνη εκπλένεται με 1x TBST

(20mM Tris-HCl pH 7.4, 0.9% NaCl, 0.1% Tween 20) για 30 λεπτά και στη συνέχεια

επωάζεται σε διάλυμα TBST-4% BSA για 12 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, ώστε

να καλυφθούν οι κενές θέσεις της. Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση με αντίσωμα του

Ν-τελικού άκρου σε αραίωση 1:50 και στη συνέχεια με το δεύτερο αντίσωμα του C-

τελικού άκρου σε αραίωση 1:5000. Η μεμβράνη πλένεται όπως προηγουμένως τρεις

φορές για 10 λεπτά με 1x TBST. Η εμφάνιση του προϊόντος της αντίδρασης έγινε με

την τεχνική της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Americium, Life Sience)

Γ. 7. Αντισώματα του C-τελικού άκρου και του Ν-τελικού άκρου.

Χρησιμοποιήθηκαν οι αντιοροί έναντι του καρβοξυτελικού άκρου της

προθυμοσίνης και έναντι του αμινοτελικού άκρου της. Ο αντιορός έναντι του C-

τελικού άκρου (anti-ct), αμινοξέα 87-109, ήταν ευγενική προσφορά της Δρ. Θ.

Παπαμαρκάκη. Παρασκευάστηκε από δύο θηλυκά κουνέλια με τη βοήθεια ενός

συνθετικού πεπτιδίου ct, ως αντιγόνο, που αντιστοιχεί στο καρβόξυτελικό άκρο της

58

προθυμοσίνης (αμινοξέα 87-109). Για την παραγωγή του Ν-τελικού άκρου της

προθυμοσίνης, από δύο θηλυκά κουνέλια, χρησιμοποιήθηκε ως αντιγόνο συνθετικό

πεπτίδιο θυμοσίνης α1, το οποίο αντιστοιχεί στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης

(αμινοξέα 1-28). Ακολούθησε καθαρισμός του αντισώματος του αμινοτελικού άκρου

και του αντισώματος του καρβοξυτελικού άκρου με χρωματογραφία αγχιστείας στη

συνέχεια πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός του αντισώματος του C-τελικού άκρου

της προθυμοσίνης με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης Western με καθαρή

προθυμοσίνη. Ηλεκτροφορήθηκαν 30ng, 50ng, 100ng καθαρής προθυμοσίνης και.

πραγματοποιήθηκαν δοκιμές με επώαση της μεμβράνης με το αντίσωμα το του Ν-

τελικού άκρου σε αραίωση 1:50 και 1:100 και του αντισώματος του C-τελικού άκρου

σε αραιώσεις 1:5.000 και 1:10.000. Η καθαρή προθυμοσίνη που χρησιμοποιήθηκε

στα παραπάνω πειράματα απομονώθηκε από όξινο εκχύλισμα ώριμου ιστού μετά από

δύο χρωματογραφικά βήματα, μοριακού ηθμού και χρωματογραφία υψηλής

απόδοσης και ανιχνεύθηκε με ραδιοανοσολογική δοκιμασία. Η ποσότητα της

προθυμοσίνης υπολογίστηκε σε 50 ng/g ιστού.

Γ. 8. Απομόνωση RNA σε κυτταρικές σειρές.

Απομονώθηκε ολικό RNA από τις κυτταρικές σειρές CHO-MT-UTR και

CHO-MT-GSH. Επίσης απομονώθηκε ολικό RNA στη κυτταρική σειρά Hela σε

συνθήκες απόπτωσης, με επίδραση των κυττάρων για 5h, 10h και 20h με cis–

Platinum σε συγκέντρωση 20 μg/ml θρεπτικού υλικού. Για την παρασκευή ολικού

RNA από κυτταρικούς πληθυσμούς εφαρμόστηκε η παρακάτω μέθοδος:

1. Εκχύλιση: η εκχύλιση πραγματοποιείται σε διάλυμα D (4Μ

ισοθειοκυανιούχος γουανιδίνη, 25 mΜ κιτρικό νάτριο pH 7.0, 0.5% Sarcosyl, 0.1Μ

μερκαπτοαιθανόλη), σε αναλογία 0.5 ml διαλύματος D/1-2x106 κύτταρα, που

αναπτύσσονται προσκολλημένα σε ειδική επιφάνεια. Μετά την αφαίρεση του

θρεπτικού υλικού και την έκπλυση γίνεται προσθήκη διαλύματος D κατευθείαν στο

κυτταρικό ταπήτιο και το εκχύλισμα μεταφέρεται σε σωλήνα Corex .

2.Απομάκρυνση του DNA και των πρωτεϊνών: για ένα όγκο διαλύματος D

προστίθενται κατά σειρά και με ανάδευση : 0.1 όγκοι οξικό νάτριο 2Μ pH 4.0, 1

όγκος φαινόλης, 0.2 όγκοι χλωροφορμίου ισοαμυλικής αλκοόλης 49/1 v/v. Το

ομογενοποίημα παραμένει στους 40°C για 15 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρείται

(20min, 10.000 rpm ) σε φυγόκεντρο Sorvall (κεφαλή SS34) στους 4°C. Μετά τη

59

φυγοκέντριση το RNA είναι στην υδατική φάση, ενώ το DNA στην μεσόφαση και οι

πρωτεΐνες στην οργανική φάση.

3. Πρώτη καταβύθιση του RNA: η υδατική φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα

Corex και το RNA καταβυθίζεται με προσθήκη ίσου όγκου ισοπροπανόλης και

παραμονή στους –200C για 2 ώρες τουλάχιστον. Ακολουθεί φυγοκέντριση όπως

προηγουμένως και το ίζημα επαναδιαλύεται σε 0.3-0.5 ml διαλύματος D και

μεταφέρεται σε σωλήνα eppedorf.

4. Δεύτερη καταβύθιση–διαλυτοποίηση του RNA: γίνεται με προσθήκη δύο

όγκων αιθανόλης, ακολουθεί παραμονή του δείγματος στους –200C για 2 ώρες

τουλάχιστον. Στη συνέχεια το δείγμα φυγοκεντρείται (20min, 12.000 rpm) σε

φυγόκεντρο Eppedorf και αποχύνουμε το υπερκείμενο. Ακολουθεί ξήρανση του RNA

και επαναδιάλυσή του σε H2O (0.3-0.5 ml) και μέτρηση της απορρόφησης. Το RNA

αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αποτύπωση κατά Northern (Northern Blot).

Γ. 9. Αποτύπωση κατά Νorthern (Νorthern Βlotting)

Aπό τη στιγμή που απομονώθηκε ολικό κυτταρικό RNA υψηλής καθαρότητας

είναι δυνατή η ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών. Η ανίχνευση χωρίζεται σε τρία

τμήματα: α) Ηλεκτροφόρηση του RNA παρασκευάσματος υπό αποδιατακτικές

συνθήκες σε πηκτή αγαρόζης–φορμαλδεΰδης, β) Μεταφορά του RNA από τη πηκτή

σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (ΝΚ) με φαινόμενα ανοδικής τριχοειδούς μεταφοράς,

γ) Ανάλυση υβριδισμού των ακολουθιών RNA που μας ενδιαφέρουν

χρησιμοποιώντας ραδιενεργά σημασμένο DNA ή RNA ανιχνευτή .

Γ. 9. 1. Ηλεκτροφόρηση του RNA

To RNA ηλεκτροφορείται για να γίνει έλεγχος της ακεραιότητας του

παρασκευάσματος. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης λαμβάνονται ειδικές

προφυλάξεις για τη προστασία του μορίου από την δράση των νουκλεασών. Για το

λόγο αυτό οι συσκευές ηλεκτροφόρησης παραμένουν σε διάλυμα 0.1Ν NaOH για δύο

ώρες τουλάχιστον πριν τη χρήση.

Η ηλεκτροφόρηση του RNA γίνεται σε πηκτή 0.8% αγαρόζης-2.2M

φορμαλδεϋδης. Η αγαρόζη προστίθεται σε διάλυμα ΜΕΝ (20 mM MOPS pH 7.0, 10

mM EDTA, 5 mM οξικό νάτριο) και τήκεται υπό ανάδευση στους 1000C. Το διάλυμα

της αγαρόζης ψύχεται μέχρι τους 550C προστίθεται 2.2M φορμαλδεΰδη και 10μg/μl

60

βρωμιούχο αιθίδιο. Aκολουθεί ανάδευση και το μίγμα χρησιμοποιείται για τη

δημιουργία οριζόντιας πηκτής.

Δείγματα 15μg RNA ξηραίνονται σε φυγοκεντρικό ξηραντήρα κενού και

κατόπιν επαναδιαλύονται σε 15μl διάλυμα μετουσίωσης (1x MEN, 2.2M

φορμαλδεϋδη, 50% φορμαμίδιο) και επωάζονται στους 650C για 5min. Τα δείγματα

τοποθετούνται στις υποδοχές της πηκτής αφού αναμιχθούν σε αναλογία 6v/1v με

διάλυμα χρωστικής 6xType III (40% γλυκερόλη, 0.2% μπλέ της βρωμοφαινόλης,

0.2% κυανό της ξυλόλης). Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου σε

διάλυμα 1x MEN με σταθερή τάση 90Volt. Aκολουθεί παρατήρηση της πηκτής σε

συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας για έλεγχο του παρασκευάσματος.

Γ. 9. 2. Επίπεδα mRNA της ProTa στη κυτταρική σειρά Hela σε συνθήκες

απόπτωσης.

Ο στόχος μας ήταν να διαπιστωθεί αν τα επίπεδα mRNA της προθυμοσίνης α

συμβαδίζουν με τα επίπεδα της πρωτεΐνης στις κυτταρικές σειρές Hela σε συνθήκες

απόπτωσης. Η μελέτη του γονιδίου της προθυμοσίνης α σε επίπεδο mRNA, με

αποτύπωση κατά Northern, πρόκειται να ολοκληρωθεί στο μέλλον.

Η ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών έγινε όπως περιγράφτηκε στο κεφάλαιο

(Β. 8.), και πραγματοποιήθηκε επίδραση τις κυτταρικής σειράς Hela με 20μg/ml

θρεπτικού υλικού cis-Platinum για 0, 5, 10 και 20 ώρες. Στη συνέχεια ολικό RNA

απομονώθηκε (κεφ. Β. 3.), μετρήθηκε και 15μg από κάθε δείγμα ηλεκτροφορήθηκαν

σε πηκτή αγαρόζης-φορμαλδεϋδης (κεφ.Β. 4.). Όπως φαίνεται στο σχήμα όλα τα

δείγματα RNA που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ποσοτικά ίσα. Η παράμετρος αυτή ήταν

καθοριστική για τη συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας που περιελάμβανε τη

μεταφορά του RNA σε μεμβράνες υβριδισμού.

Στο σχήμα φαίνονται τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή

αγαρόζης ολικού RNA που προέρχεται από τη κυτταρική σειρά Hela σε συνθήκες

απόπτωσης με cis-Platinum. Χρησιμοποιήθηκαν 15μg RNA και σημειώνονται οι

ριβοσωμικές υπομονάδες 28S και 18S.

61

Εικόνα 4: Ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης ολικού RNA της κυτταρικής σειράς Hela σε συνθήκες απόπτωσης με cis-Platinum. Ολικό RNA της κυτταρικής σειράς Hela μετά από επίδραση με 20μg/ml θρεπτικού υλικού cis-Platinum για 0 ώρες (διαδρομή 1), 5 ώρες (διαδρομή 2), 10 ώρες (διαδρομή 3), και 20 ώρες. (Διαδρομή 4) Χρησιμοποιήθηκαν 15μg RNA και σημειώνονται οι ριβοσωμικές υπομονάδες 28S και 18S.

Γ. 9. 3. Επίπεδα mRNA της ProTa σε κυτταρικούς πληθυσμούς υπό κανονικές

συνθήκες.

Στην παρούσα εργασία η μελέτη της έκφρασης του γονιδίου της

προθυμοσίνης έγινε σε επίπεδο mRNA, των κυτταρικών σειρών CHO-MT-GSH και

CHO-MT-UTR που αναπτύσσονται υπό κανονικές συνθήκες. Η μελέτη της έκφρασης

του γονιδίου της προθυμοσίνης α σε επίπεδο mRNA θα πραγματοποιηθεί στο μέλλον.

Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Β. 8. Στη

συνέχεια απομονώθηκε ολικό RNA από 1-2x106 κύτταρα με τη μέθοδο AGPC(κεφ.

Β. 3.), μετρήθηκε και 15μg από κάθε δείγμα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης-

φορμαλδεϋδης(κεφ. Β. 4.). Να σημειωθεί ότι η χρώση της πηκτής με βρωμιούχο

αιθίδιο αποτελούσε ένα επιπλέον σημείο ελέγχου της ποσότητας των δειγμάτων.

Όπως φαίνεται στο σχήμα όλα τα δείγματα RNA που χρησιμοποιήθηκαν ήταν

ποσοτικά ίσα. Η παράμετρος αυτή ήταν καθοριστική για τη συνέχεια της

πειραματικής διαδικασίας που περιελάμβανε τη μεταφορά του RNA σε μεμβράνες

υβριδισμού

Στο σχήμα φαίνονται τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή

αγαρόζης ολικού RNA που προέρχεται από τις κυτταρικές σειρές: CHO-MT-GSH,

CHO-MT-UTR που αναπτύχθηκαν σε κανονικές συνθήκες. Χρησιμοποιήθηκαν 15μg

RNA και σημειώνονται οι ριβοσωμικές υπομονάδες 28S και 18S.

28S

18S

62

Εικόνα 5: Ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης ολικού RNA των κυτταρικών σειρών CHO-MT-GSH και CHO-MT-UTR. Ολικό RNA του CHO-MT-GSH (Διαδρομή 1) Ολικό RNA του CHO-MT-UTR (Διαδρομή 2) Χρησιμοποιήθηκαν 15μg RNA και σημειώνονται οι ριβοσωμικές υπομονάδες 28S και 18S.

28S

18S

63

Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Δ. 1. Ενίσχυση του γονιδίου της παραθυμοσίνης

Πραγματοποιήθηκε ενίσχυση του γονιδίου της παραθυμοσίνης, σε ολικό

γενωμικό DNA, με τη τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR. Το

DNA απομονώθηκε όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Β. 1. από ασθενείς με απλή

οζώδη βρογχοκήλη και υγιή άτομα.

Στην παρούσα αντίδραση το ζεύγος των ολιγονουκλεοτιδίων σχεδιάστηκε με

βάση την αλληλουχία cDNA του γονιδίου της παραθυμοσίνης από ανθρώπινο νεφρό

(Clinton M., et. al., 1989), έτσι ο ένας εκκινητής αντιστοιχεί στη βάση 86 έως τη θέση

102 και ο δεύτερος εκκινητής στη βάση 301 έως τη βάση 313. Η αλληλουχία cDNA

του γονιδίου της παραθυμοσίνης από ανθρώπινο νεφρό, περιέχει 303 ζεύγη βάσεων

στη 5΄ μη μεταφραζόμενη περιοχή, τη πλήρη κωδικεύουσα περιοχή με 306 ζεύγη

βάσεων, 558 ζεύγη βάσεων στη 3΄ μη μεταφραζόμενη περιοχή (Clinton M., et. al.,

1989), ενώ το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης βρίσκεται στη θέση 301 bp. Έτσι,

με βάση την αλληλουχία αυτή, ενισχύεται τμήμα της παραθυμοσίνης, σε μια περιοχή

ανοδικά του σημείου έναρξης της μετάφρασης. Το 1992 απομονώθηκε ο

γονιδιωματικός κλώνος από βιβλιοθήκη ήπατος επίμυος που περιέχει το γονίδιο της

παραθυμοσίνης (Trompeter and Soling, 1992). Ανάλυση της αλληλουχίας του

γονιδίου έδειξε ότι η κωδικοποιός περιοχή αποτελείται από 5 εξόνια μεγέθους 157,

70, 76, 62, 363bp, τα οποία διακόπτονται από 4 ιντρόνια μεγέθους 2598, 191, 150,

167 ζεύγη βάσεων, αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση μεταξύ της

αλληλουχίας cDNA παραθυμοσίνης από άνθρωπο και επίμυ και παρατηρήθηκε 90%

ομολογία (Clinton M., et. al., 1989). Λαμβάνοντας υπόψη τη παραπάνω παρατήρηση,

υπολογίστηκε το μέγεθος του τμήματος της παραθυμοσίνης μεταξύ του 1ου εξονίου

και στην αρχή του 4ου εξονίου που αναμένεται περίπου 3.166bp.

Οι συνθήκες για την αντίδραση PCR, καθορίστηκαν μετά από

επαναλαμβανόμενες αντιδράσεις, στις οποίες μελετήθηκαν οι σημαντικότερες

μεταβλητές της αντίδρασης (πίνακας 1). Οι τελικές συνθήκες (temperature profile)

φαίνονται στον πίνακα 2.

Η θερμοκρασία πρόσδεσης των εκκινητών καθορίστηκε μετά από

επαναλαμβανόμενες αντιδράσεις και εξαρτάται από τις ιδιότητες υβριδισμού των

εκκινητών με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου. Οι ιδιότητες

αυτές έχουν σχέση με το διάγραμμα θερμικής αποδιάταξης και την χαρακτηριστική

θερμοκρασία Tm του εκκινητή που υπολογίζεται με βάση τους τύπους:

64

Tm = GC x μήκος αλληλουχίας x 4 + (1 – GC) x μήκος αλληλουχίας x 2 ή με το τύπο

Tm = 69.3 + 0.41 x GC % – 650 / μήκος αλληλουχίας όπου GC είναι το περιεχόμενο

σε GC. Σύμφωνα με τον παραπάνω τύπο υπολογίζονται οι χαρακτηριστικές

θερμοκρασίες Τm για τους δύο εκκινητές. Μετά από επαναλαμβανόμενες

αντιδράσεις, με δοκιμές σε ένα εύρος μεταξύ 42 έως 60°C, η θερμοκρασία πρόσδεσης

των εκκινητών με το DNA στόχο καθορίστηκε στους 50 °C. Οι συγκεντρώσεις των

αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν καθώς και οι τελικές συνθήκες του

θερμοκρασιακού προγράμματος της αντίδρασης PCR φαίνονται στους πίνακες 2 και

3.

Πίνακας 1: Οι μεταβολές που πραγματοποιήθηκαν στα αντιδρώντα και στις συνθήκες της αντίδρασης PCR. Μεταβλήθηκαν: η συγκέντρωση του DNA μεταξύ 2.5 έως 10 ng/μl, η συγκέντρωση του MgCl2 μεταξύ 1.5 έως 4.0 mM, η συγκέντρωση των εκκινητών μεταξύ 0.25 και 0.5 μΜ και η θερμοκρασία πρόσδεσης των εκκινητών μεταξύ 42 έως 60 οC.

Μεταβλητές της αντίδρασης Εύρος τιμών

Ποσότητα DNA 2.5, 5, 10 ng/μl

Συγκέντρωση των ιόντων Μαγνησίου 1.5, 1.75, 2.0, 2.5,3.0, 3.5, 4.0 mM

Θερμοκρασία πρόσδεσης των εκκινητών 42, 45, 48, 50, 52, 55, 58, 60 οC

Εκκινητές 0.25, 0.5 μΜ

Πίνακας 2: Συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Οι τελικές συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων της αντίδρασης PCR που χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχυθεί το επιθυμητό τμήμα του γονιδίου της παραθυμοσίνης.

Συστατικά Όγκος Cαντίδρασης Cstock DNA δείγματα 5 μl 5 ng/μl 50 ng/μl

PCR buffer 10x 5 μl 1 x 10 x

DNTP’s mix 5 μl 1 mM 10 mM

MgCl2 1.5 μl 1.5 mM 50 mM

Primer 2.5 μl 0.5 μΜ 10 μΜ

Primer 2.5 μl 0.5 μΜ 10 μΜ

Taq plymerase 0.25 μl 2.5 U/100μl 5 U/μl

dd H2O 28.25 μl

Total 50 μl

65

Πίνακας 3: Συνθήκες του θερμοκρασιακού προγράμματος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Οι τελικές συνθήκες του θερμοκρασιακού κύκλου της αντίδρασης PCR, όπου καταλήξαμε μετά από επαναλλαμβανόμενα πειράματα με αλλαγές της θερμοκρασίας πρόσδεσης των εκκινητών μεταξύ 42-60 0C.

Θερμοκρασίες Χρόνος

Preliminary denaturation 95 0C 5 min

Denaturation 94 0C 1 min

Annealing 50 0C 1 min

Extension 72 0C 1 min

Final extension 72 0C 3 min

Κύκλοι 30

Στο σχήμα 1 φαίνονται τα προϊόντα της PCR αντίδρασης μετά από

ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.2%. Παρατηρούνται στα δείγματα που

ενισχύθηκαν, με τη τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, ζώνες

μεγέθους περίπου 3.166bp. Αυτό σημαίνει ότι πραγματοποιήθηκε ενίσχυση τμήματος

του γονιδίου της παραθυμοσίνης μεγέθους 3.166 ζεύγη βάσεων, που περιλαμβάνει τα

τέσσερα πρώτα εξόνια και τα τρία πρώτα ιντρόνια.

Εικόνα 1: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων μετά από αντίδραση PCR σε πηκτή αγαρόζης 1.2%. Στις διαδρομές 2 έως 5 απεικονίζεται μια ζώνη μεγέθους 3.166 bp, για κάθε δείγμα. Στη διαδρομή 1: marker 1kb ladder. Στις διαδρομές 2, 3, 4 και 5: απεικονίζεται η ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της παραθυμοσίνης σε δείγματα αίματος από ασθενείς με απλή οζώδη βρογχοκήλη.

Δ. 2. Μελέτη της πρωτεΐνης της προθυμοσίνης στη διαδικασία απόπτωσης.

Ο στόχος μας είναι να διαπιστωθεί αν υπάρχει έκφραση της προθυμοσίνης α σε

επίπεδο πρωτεΐνης στη κυτταρική σειρά Hela σε συνθήκες απόπτωσης. Η κυτταρική

12.216bp

5.090bp

4.072bp

3.054bp

66

σειρά Hela μεταχειρίστηκε με 20μg/ml θρεπτικού υλικού cis-Platinum για 0, 5, 10 και

20 ώρες και ακολούθησε παρασκευή κυτταρικού εκχυλίσματος. Κατόπιν, 30x104

εκχύλισμα κυττάρων χωρίς την επίδραση του cis-Platinum (control)

ηλεκτροφορήθηκε στη θέση 2 (εικόνα 4) σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου 15%. Στη

θέση 3 φορτώθηκαν 30x104 εκχύλισμα κυττάρων Hela με επίδραση με cis-Platinum

για 5 ώρες, στη θέση 4, 42x104 εκχύλισμα κυττάρων με επίδραση με τον αποπτωτικό

παράγοντα για 10 ώρες και στη θέση 5, 42x104 εκχύλισμα κυττάρων με επίδραση με

τον ίδιο παράγοντα για 20 ώρες. Στη θέση 1 ηλεκτροφορήθηκαν 50ng καθαρής

πρωτεΐνης. Μετά την ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου ακολούθησε

μεταφορά των δειγμάτων σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ενεργοποιημένη με

γλουταραλδεϋδη. Η μεμβράνη επωάστηκε με το αντίσωμα του Ν-τελικού άκρου σε

αραίωση 1:50 και στη συνέχεια με το δεύτερο αντίσωμα του C-τελικού άκρου σε

αραίωση 1:5000. Το σήμα της αντίδρασης εμφανίστηκε με ECL.

Στην εικόνα 4 φαίνονται τα αποτελέσματα της ανοσοαποτύπωσης (Western)

της προθυμοσίνης σε κύτταρα που αποπίπτουν. Στα δείγματα όπου

πραγματοποιήθηκε επίδραση με τον αποπτωτικό παράγοντα για 10 και 20 ώρες

παρατηρήθηκε μία μικρότερη ζώνη κάτω από τη κύρια ζώνη της προθυμοσίνης. Αυτή

η μικρότερη ζώνη δείχνει μια πρωτεολυτική αποδόμιση της πρωτεΐνης της

προθυμοσίνης. Ανάλογες παρατηρήσεις έκαναν (Evstafieva A. G., et. al., 2000). όπου

παρατηρήθηκε διάσπαση της πρωτεΐνης στο καρβόξυτελικο άκρο από κασπάση -3 και

-7, σε κύτταρα Hela-B που αποπίπτουν, διαμολυσμένα με το cDNA ανθρώπινης

προθυμοσίνης α.

Εικόνα 2: Έλεγχος των επιπέδων έκφρασης της προθυμοσίνης α σε Hela κύτταρα σε συνθήκες απόπτωσης. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή 15% SDS-πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε μεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Διαδρομή 1: ηλεκτροφορήθηκαν 50ng καθαρής προθυμοσίνης α. Διαδρομή 2: 30x104 εκχύλισμα κυττάρων Hela χωρίς την επίδραση αποπτωτικού παράγοντα. Διαδρομή 3: 30x104 εκχύλισμα κυττάρων, με επίδραση με 20μg/ml θρεπτικού υλικού cis-Platinum για 5 ώρες, Διαδρομή 4: 42x104 εκχύλισμα κυττάρων, με επίδραση με cis-Platinum για 10 ώρες. Διαδρομή 5: 42x104 εκχύλισμα κυττάρων, με επίδραση με cis-Platinum για 20 ώρες. Η μεμβράνη επωάστηκε με το αντίσωμα του Ν-τελικού άκρου (1:100) και στη συνέχεια με το δεύτερο αντίσωμα του C-τελικού άκρου (1:5000). Το σήμα της αντίδρασης εμφανίστηκε με ECL.

Διαδρομές: 1 2 3 4 5

ProTa

67

Δ. 3. Μελέτη του γονιδίου της Pro Ta σε επίπεδο πρωτεΐνης στις κυτταρικές

σειρές CHO-MT-GSH και CHO-MT-UTR .

Σαν μια δεύτερη προσέγγιση στην προσπάθεια διερεύνησης των επιπέδων

έκφρασης της προθυμοσίνης α, πραγματοποιήθηκε έλεγχος των επιπέδων της

πρωτεΐνης, με τη τεχνική της ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών, στις κυτταρικές σειρές

CHO-MT-GSH και CHO-MT-UTR. Για το λόγο αυτό παρασκευάσθηκε εκχύλισμα

από τις κυτταρικές CHO-MT-GSH και CHO-MT-UTR. Τα παραπάνω κυτταρικά

εκχυλίσματα αναλύθηκαν σε πηκτή 15% SDS-πολυακρυλαμιδίου. 42x104 εκχύλισμα

κυττάρων CHO-MT-UTR ηλεκτροφορήθηκε στη θέση 2 (εικόνα 3), στη θέση 3

φορτώθηκαν 30x104 εκχύλισμα κυττάρων CHO-MT-UTR, στη θέση 4, 42x104

εκχύλισμα κυττάρων CHO-MT-GSH και στη θέση 5, 30x104 εκχύλισμα κυττάρων

CHO-MT-GSH. Στη θέση 1 ηλεκτροφορήθηκαν 50ng καθαρής πρωτεΐνης.

Ακολούθησε μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης

ενεργοποιημένη με γλουταραλδεϋδη. Η μεμβράνη επωάστηκε με το αντίσωμα του Ν-

τελικού άκρου (1:100) και στη συνέχεια με το δεύτερο αντίσωμα του C-τελικού

άκρου (1:5000). Το σήμα της αντίδρασης εμφανίστηκε με ECL.

Καμία όμως πρωτεΐνη δεν ανιχνεύθηκε στο φίλτρο νιτροκυταρίνης, ενώ

αντίθετα ανιχνεύεται η πρωτεΐνη της προθυμοσίνης α που χρησιμοποιείται ως δείκτης

μοριακού βάρους.

Εικόνα 3: Έλεγχος των επιπέδων έκφρασης της προθυμοσίνης α στις κυτταρικές σειρές CHO-MT-GSH και CHO-MT-UTR. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή 15% SDS-πολυακρυλαμιδίου.. Διαδρομή 1: 50ng καθαρής προθυμοσίνης α. Διαδρομή 2: 42x104

εκχύλισμα κυττάρων CHO-MT-UTR, Διαδρομή 3: 30x104 εκχύλισμα κυττάρων CHO-MT-UTR. Διαδρομή 4: 42x104 εκχύλισμα κυττάρων CHO-MT-GSH. Διαδρομή 5: 30x104 εκχύλισμα κυττάρων CHO-MT-GSH. Η μεμβράνη επωάστηκε με το αντίσωμα του Ν-τελικού άκρου (1:100) και στη συνέχεια με το δεύτερο αντίσωμα του C-τελικού άκρου (1:5000). Το σήμα της αντίδρασης εμφανίστηκε με ECL.

Διαδρομές 1 2 3 4 5

ProTa

68

Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η παραθυμοσίνη είναι ένα μικρό, όξινο πολυπεπτίδιο, με ευρεία ιστική

κατανομή, που συμμετέχει στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Συγκεκριμένα, μέτρηση

των επιπέδων της παραθυμοσίνης σε καρκινικούς και φυσιολογικούς ιστούς εντέρου

και μαστού έδειξαν αυξημένα επίπεδα στους πρώτους σε σχέση με τους δεύτερους

(Trompeter H-I., et. al., 1989). Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανίχνευση και η

ενίσχυση του γονιδίου της παραθυμοσίνης σε δείγματα αίματος ασθενών με απλή

οζώδη βρογχοκήλη Η απλή οζώδης βρογχοκήλη (ΑΟΒ) χαρακτηρίζεται από

κυτταρική υπερτροφία και υπερπλασία του θυροειδούς αδένα. Η αιτιολογία και η

παθογένεια της νόσου δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Η παραθυμοσίνη δεν έχει

μελετηθεί σε θυρεοειδικά κύτταρα ανθρώπου. Στη παρούσα μελέτη απομονώθηκε

ολικό γενωματικό DNA από ασθενείς με απλή οζώδη βρογχοκήλη, στους οποίους

έγινε παρακέντηση του θυροειδούς αδένα με λεπτή βελόνη και πραγματοποιήθηκε

ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της παραθυμοσίνης με τη τεχνική της αλυσιδωτής

αντίδρασης πολυμεράσης, PCR. Το γονίδιο της παραθυμοσίνης αποτελείται από 5

εξόνια που διακόπτονται από 4 ιντρόνια. Με επαναλαμβανόμενα πειράματα της

αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR βρέθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες για

την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της παραθυμοσίνης μεγέθους 3016bp, που

περιλαμβάνει τη περιοχή ανοδικά του σημείου έναρξης της μετάφρασης και τη

κωδικεύουσα περιοχή έως την αρχή του 4ου εξονίου. Παρατηρήθηκε ότι η

παραθυμοσίνη εκφράζεται στην ΑΟΒ και είναι πιθανό να συμμετέχει στις διαδικασίες

του κυτταρικού πολλαπλασιασμού συμβάλλοντας στην παθογένεια της νόσου. Το

τμήμα αυτό της παραθυμοσίνης που ενισχύθηκε μπορεί στο μέλλον να

χρησιμοποιηθεί για προσδιοριστεί η αλληλουχία νουκλεοτιδίων της περιοχής αυτής,

να προσδιοριστούν οι υποκινητικές ρυθμιστικές περιοχές ανοδικά του σημείου

έναρξης της μετάφρασης (όπως η αλληλουχία Kozak, ANNAUGG) και να

καθοριστούν τα ιντρόνια και εξόνια της περιοχής αυτής.

Στη παρούσα εργασία η μελέτη της ρύθμιση και της έκφρασης του γονιδίου

της προθυμοσίνης έγινε κυρίως σε επίπεδο κυτταρικών σειρών. Για μια τέτοια μελέτη

οι κυτταρικές σειρές δίνουν σημαντικά πλεονεκτήματα. Καταρχήν υπάρχει η

δυνατότητα επιλογής συγκεκριμένων κυτταρικών πληθυσμών, οι συνθήκες

ανάπτυξης των κυττάρων είναι ελεγχόμενες και μπορεί να μελετηθεί άμεσα η

επίδραση εξωγενών παραγόντων.

69

Η προθυμοσίνη α είναι βιοχημικά πολύ καλά χαρακτηρισμένη. Είναι μια

μικρή πρωτεΐνη, ιδιαίτερα όξινη με ισοηλεκτρικό σημείο pI 3,5 που έχει

ακετυλιωμένο το αμινοτελικό της άκρο. Μια πρώτη προσέγγιση στη μελέτη της

πρωτεΐνης της προθυμοσίνης α είναι ο έλεγχος των επιπέδων της πρωτεΐνης στις

κυτταρικές σειρές CHO-MT-GSH και CHO-MT-UTR που αναπτύσσονται σε ειδικό

θρεπτικό μέσο (HAMS modified). Δεν εντοπίστηκε η πρωτεΐνη της προθυμοσίνης α

στις παραπάνω κυτταρικές σειρές, όμως μελέτες που πραγματοποιήθηκαν αργότερα

έδειξαν έκφραση της πρωτεΐνης στα ίδια επίπεδα σε αυτές τις κυτταρικές σειρές,

δείχνοντας ότι δεν υπάρχει καμία μεταβολή στα επίπεδα της πρωτεΐνης. Επομένως, η

ανίχνευση της πρωτεΐνης δεν ήταν επιτυχής.

Η σχέση της πρωτεΐνης της προθυμοσίνης με την διαδικασία της απόπτωσης,

ελκύει την προσοχή της επιστημονικής κοινότητας. Έχει αποδειχθεί ότι η

προθυμοσίνη α είναι μια ουσιώδης πρωτεΐνη που συμμετέχει στη διαδικασία του

προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, την απόπτωση:

1. Η επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης, δια μέσου

της Myc πρωτεΐνης, εξαρτάται από την ενεργοποίηση γονιδίων στόχων, όπως του

γονιδίου της προθυμοσίνης α, δια μέσου πρόσδεσης της Myc πρωτεΐνης σε

αλληλουχίες E-box, ανοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής της προθυμοσίνης

α (Gaubatz S., et. al. 1995).

2. Ακόμα σύμφωνα με μια πρόσφατη έρευνα (Jiang X. et. al., 2003) η

προθυμοσίνη α αναστέλλει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 με αναστολή του

σχηματισμού του αποπτοσώματος. Ακόμα στην ίδια εργασία παρατηρήθηκε υψηλός

ρυθμός απόπτωσης σε κύτταρα Hela με επίδραση με UV ακτινοβολία, όταν

ελαχιστοποιήθηκε η έκφραση mRNA της προθυμοσίνης α με RNA interference

3. Μεταχείριση HL60 κυττάρων με αντινοηματικά 5΄-ολιγονουκλεοτίδια, PAS

που είναι συμπληρωματικά με την αλληλουχία mRNA της ProTa σε συγκέντρωση 40

και 80 μM, προκαλούν αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενώ σε

μεγαλύτερη συγκέντρωση 160 μΜ PAS, επάγουν απόπτωση των κυττάρων

(Rontriguez P., et. al., 1999). Η παρουσία υψηλής συγκέντρωσης PAS προκαλλεί

κυτταρικό θάνατο με τη διαδικασία της απόπτωσης, πιθανόν με αναστολή της

μετάφρασης του mRNA της προθυμοσίνης α.

4. Σε κύτταρα Hela-B που αποπίπτουν, διαμολυσμένα με το cDNA ανθρώπινης

προθυμοσίνης α, παρατηρήθηκε διάσπαση της πρωτεΐνης στο καρβόξυτελικο άκρο

από κασπάση -3 και -7 εντός της περιοχής NLS (Evstafieva A. G., et. al., 2000).

70

Αυτές οι δύο τελευταίες παρατηρήσεις οδήγησαν στο συμπέρασμα (Evstafieva

A. G., et. al., 2000) ότι η εξάλειψη της προθυμοσίνης α είτε φυσικά (με διάσπαση από

κασπάση) ή τεχνητά (με αναστολή της μετάφρασης της προθυμοσίνης α) οδήγησε τα

κύτταρα στο μονοπάτι της απόπτωσης. Για το λόγο αυτό, η παρούσα μελέτη

επικεντρώθηκε στη συμπεριφορά της προθυμοσίνης α σε κύτταρα Hela που

αποπίπτουν μετά από επίδραση με cis-Platin για 5, 10 και 20 ώρες. Παρατηρήθηκε

ότι μεταχείριση των κυττάρων με cis-Platin για 10 και 20 ώρες η προθυμοσίνη α

διασπάται, αποτέλεσμα που συμφωνεί με τη παραπάνω δημοσιευμένη εργασία

(Evstafieva A. G., et. al., 2000).

Στο μέλλον πρόκειται να ακολουθήσει μελέτη για να διαπιστωθεί αν τα

επίπεδα mRNA της προθυμοσίνης α συμβαδίζουν με τα επίπεδα της πρωτεΐνης.

71

ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Βαρέλη K. (1995) Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης της προθυμοσίνης α και

της παραθυμοσίνης σε κυτταρικούς πληθυσμούς. Διδακτορική διατριβή,

Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων.

2. Baxevanis C. N., Sfagos C., Anastasopoulos E., Reclos G. J., Papamichail M.

1990 Prothymosin-alpha enhances HLA-DR antigen expression on monocytes

from patients with multiple sclerosis. J. Neuroimmunol 27 (2-3): 141-147.

3. Baxevanis C. N., Thanos D., Reclos G. J., Anastasopoulos E., Tsokos G. C.,

Papamatheakis J., Papamichail M. 1992 Prothymosin alpha enhances human

and murine MHC class II surface antigen expression and messenger RNA

accumulation. J. Immunol. 148 (7): 1979-19784.

4. Brand I. A., Heinickel A. (1991) Key enzymes of carbohydrate metabolism as

targets of the 11.5-kDa Zn(2+)-binding protein (parathymosin). J. Biol. Chem.

266 (31): 20984-20899.

5. Clinton M., Frangou-Lazaridis M., Panneerselvam C., Horecker B. L. (1989a)

Prothymosin alpha and parathymosin: mRNA and polypeptide levels in rodent

tissues. Arch Biochem Biophys. 269 (1): 256-263.

6. Clinton M., Frangou-Lazaridis M., Panneerselvam C., Horecker B. L. (1989b)

The sequence of human parathymosin deduced from a cloned human kidney

cDNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 158 (3): 855-862.

7. Clinton M., Graeve L., el-Dorry H., Rodriguez-Boulan E., Horecker B. L.

(1991) Evidence for nuclear targeting of prothymosin and parathymosin

synthesized in situ. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 88 (15): 6608-6612.

8. Evstafieva A. G., Belov G. A., Kalkum M., Chichkova N. V., Bogdanov A. A.,

Agol V. I.,Vartapetian A. B.(2000) Prothymosin a fragmentation in apoptosis.

Febs Letter 467: 150-154.

9. Frangou-Lazaridis M., Clinton M., Goodall G. J., Horecker B. L. (1988)

Prothymosin alpha and parathymosin: amino acid sequences deduced from the

cloned rat spleen cDNAs. Arch. Biochem. Biophys. 263 (2): 305-310.

10. Gaubatz S., Imhof A., Dosch R., Werner O., Mitchell P., Buettner R., Eilers M.

(1995) Transcriptional activation by Myc is under negative control by the

transcription factor AP-2. EMBO J. 14(7):1508-1519.

72

11. Goldstein A. L., Low T. L. K., McAdoo M., McClure J., Thurman G. B.,

Rossio J., Lai C.-Y., Chang D., Wang S.-S., Harvey C. Ramel A. H. and

Meienhofer J. (1997) Thymosin a1: Isolation and sequence analysis of an

immunologically active thymic polypeptide, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,

725-729.

12. Gomez-Marquez J. , Segade F., Dosil M., Pichel J. G., Bustelo X. R., Freire M.

(1989) The expression of prothymosin alpha gene in T lymphocytes and

leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation. J. Biol. Chem.

264(15):8451-8454.

13. Goodall G. J., Dominguez F., Horecker B. L.(1986) Molecular cloning of

cDNA for human prothymosin alpha. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83 (23):

8926-8928.

14. Haritos A. A., Salvin S. B., Blacher R., Stein S., Horecker B. L (1985c)

Parathymosin alpha: a peptide from rat tissues with structural homology to

prothymosin alpha, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 82: 1050-1053.

15. Hooper J. A., McDaniel M. C., Thurman G. B., Cohen G. H., Schulof R. S. and

Goldstein A. L. (1975) Purification and properties of Bovine Thymosin, Ann.

N. Y. Acad. Sci. 249, 125-144.

16. Magdalena C., Dominguez F., Loidi L., Puente J. L 2000 Tumor prothymosin a

content, a potential prognostic marker for primary breast cancer. Br. J. Cancer

82: 584-590.

17. Μartini P. G. V., Delage-Mourroux R., Kraichely M., Katzenellenbogen B. S.

2000 Prothymosin a selectively enhances estrogen receptor transcriptional

activity by interacting with a repressor of estrogen receptor activity Mol. Cell

Biol. 120: 6224-6232.

18. Μartini P. G. V., Katzenellenbogen B. S. 2001 Regulation of prothymosin a

gene expression by estrogen in estrogen receptor- containing breast cancer cells

via upstream half pallindomic estrogen response element motifs Endocrinology

142 (8): 3493-3501

19. Okamoto K., Isohashi F. (2000) Purification and primary structure of a

macromolecular-translocation inhibitor II of glucocorticoid-receptor binding to

nuclei from rat liver. Inhibitor II is the 11.5-kDa Zn2+-binding protein

(parathymosin). Eur. J. Biochem. 267 (1): 155-162.

73

20. Papamarcaki T. and Tsolas O. 1994 Prothymosin alpha binds to histone H1 in

vitro. FEBS Lett. 345 (1): 71-75.

21. Piñeiro A., Cordero O. J., Nogueira M. 2000 Fifteen years of prothymosin a:

contradictory past and new horizons. Peptides 21: 1433-1446.

22. Rontriguez P., Vinuela J. E., Alvarez- Fernandez L., Gomez-Marquez J. (1999)

Prothymosin alpha antisense oligonucleotides induce apoptosis in HL-60 cells.

Cell Death Diff. 6 (1): 3-5

23. Roson E., Gallego R., Garcia-Caballero T., Heimer E. P., Felix A. M.,

Dominguez F.(1990) Prothymosin alpha expression is associated to cell

division in rat testis.Histochemistry 94 (6): 597-599.

24. Sasaki H., SatoY., Kondo S., Fukai I., Kiriyama M., Yamakawa Y., Fujii Y.

Expression of the prothymosin a mRNA correlated with that of N-myc in

neuroblastoma. Cancer Letters(2001) 191-195

25. Trompeter H. I., Brand I. A., Soling H. D. (1989) The primary sequence of the

PFK-1 inactivating zinc-binding protein as deduced from cDNA sequencing.

Identity of the zinc-binding protein with rat parathymosin. FEBS Lett. 253 (1-

2): 63-66.

26. Trompeter H. I., Soling H. D. (1992) Cloning and characterisation of a gene

encoding the 11.5 kDa zinc-binding protein (parathymosin-alpha) FEBS Lett.

298 (2-3): 245-248.

27. Trompeter H. I., Blankenburg G., Brugger B., Menne J., Schiermeyer A..,

Scholz M., Soling H. D. (1996) Variable nuclear cytoplasmic distribution of

the 11.5-kDa zinc-binding protein (parathymosin-alpha) and identification of a

bipartite nuclear localization signal. J. Biol. Chem. 271 (2): 1187-1193.

28. Tsitsiloni O. E., Stiakakis J., Koutselinis A., Gogas J., Markopoulos C.,

Yialouris P., Bekris S., Panoussopoulos D., Kiortsis V., Voelter W., et al.

(1993) Expression of alpha-thymosins in human tissues in normal and

abnormal growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 90 (20): 9504-9507.

29. Tsitsilonis O.E., Bekris E.,Voutsas I.F., Baxevanis C. N., Markopoulos C.,

Papadopoulou S-A., Konntzoglou K., Stoeva S., Gogas J.,Voelter W.,

Papamichail M.The prognostic value of a-Thymosins in Breast cancer.

Anticancer Research (1998) 18:1501-1508.

30. Vareli K., Frangou-Lazaridis M., van der Kraan I., Tsolas O., van Driel R.

(2000) Nuclear distribution of prothymosin alpha and parathymosin: evidence

74

that prothymosin alpha is associated with RNA synthesis processing and

parathymosin with early DNA replication. Exp. Cell Res. 257 (1): 152-161.

31. Watts J. D., Cary P. D., Sautiere P., Crane-Robinson C. (1990) Thymosins:

both nuclear and cytoplasmic proteins. Eur J Biochem. 192 (3): 643-651.

75

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ

ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

“Ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο p53 σε καρκίνο του μαστού με

τη μέθοδο DGGE”

Επίβλεψη:

Β. Μαλάμου Μήτση (Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής)

Χ. Ζαχαρίου (Μεταπτυχιακή, υποψήφια διδάκτορας)

76

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α. 1. Η πρωτεΐνη p53.

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, σημειώθηκε εκπληκτική

πρόοδος στην κατανόηση και ταυτοποίηση των διαδικασιών που συμβαίνουν σε

μοριακό επίπεδο οι οποίες οδηγούν στο μετασχηματισμό ενός φυσιολογικού

κυττάρου σε καρκινικό και στην εμφάνιση καρκίνου. Η ανάπτυξη και εξέλιξη του

καρκίνου είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει, εκτός άλλων,

ενεργοποίηση ογκογονιδίων και απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων.

Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 είναι το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο

σε ποικίλους καρκίνους και ιδιαίτερα στον καρκίνο του μαστού. Αυτό σημαίνει ότι το

p53 ογκοκατασταλτικό γονίδιο έχει ένα σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της

καρκινογένεσης. Το p53 είναι μία πρωτεΐνη, που λειτουργεί ως σημείο ελέγχου του

κυτταρικού κύκλου και δρα ως παράγοντας μεταγραφής, που ρυθμίζει γονίδια, που

συμμετέχουν στην κυτταρική ανάπτυξη, DNA διόρθωση και στην απόπτωση.

A. 2. Δομή του γονιδίου και της πρωτεΐνης του p53.

Η πρωτεΐνη p53 είναι μια φωσφοπρωτεΐνη, που ανακαλύφθηκε ως ένα

ογκογονίδιο προσδεδεμένο στο μεγάλο Τ αντιγόνο του ιού SV40 (Simian Virous-40),

σε μετασχηματισμένα με τον ιό SV40 κύτταρα (DeLeo et. al., 1979). Το γονίδιο p53

στον άνθρωπο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17p13.1 και αποτελείται από 11 εξόνια και

10 ιντρόνια.

Το p53 γονίδιο κωδικοποιεί για μια 53-kDa πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη, που

αποτελείται από 393 αμινοξέα (Levine et. al., 1991) και μπορεί να ομαδοποιηθεί σε

τρεις περιοχές με βάση τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους. Η μια περιοχή

περιλαμβάνει το αμινοτελικό άκρο (αμινοξέα 1-95), που είναι πλούσιο σε όξινα

αμινοξέα και περιέχει τη περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης, η δεύτερη περιοχή

περιλαμβάνει το καρβοξυτελικό άκρο (αμινοξέα 300-393), που είναι πλούσιο σε

βασικά αμινοξέα και συμμετέχει στη DNA πρόσδεση. Στη κεντρική συντηρημένη

περιοχή (αμινοξέα 102-292) εντοπίζεται η περιοχή πρόσδεσης του DNA και η

πλειονότητα των μεταλλάξεων έχει βρεθεί σε αυτή τη περιοχή (Levine et. al., 1991:

Hollstein M. et. al., 1991).

Η σημαντικότητα της κεντρικής περιοχής της p53 πρωτεΐνης στη DNA

πρόσδεση προσδιορίστηκε με μελέτες κρυσταλλογραφίας. Έτσι, αναγνωρίστηκαν

77

τέσσερα κωδικόνια που συμμετέχουν στην πρόσδεση ατόμων ψευδαργύρου. (Cho Y.,

et. al., 1994).

Σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων του p53 από άνθρωπο, ποντικό και

Xenopus laevis έδειξε πέντε συντηρημένες περιοχές I, III, IV, V (Sousi T., et. al.,

1987) που βρίσκονται εντός των εξονίων 2, 5, 7, 8, αντίστοιχα και τη συντηρημένη

περιοχή II που βρίσκεται σε δύο εξόνια 4 και 5. Αργότερα, το 1989, δείχθηκε ότι το

86% από 21 παρανοηματικές μεταλλάξεις συγκεντρώνονται σε 4 σημεία στα εξόνια 5

έως 8, που συμπίπτουν ακριβώς με τις συντηρημένες περιοχές (Nigro J. M., et. al.,

1989) (σχήμα 1a).

Σχήμα 1: (α). Μεταλλάξεις σε ανθρώπινους όγκους που απενεργοποιούν τη λειτουργία p53. Οι 5 συντηρημένες περιοχές δείχνονται με αριθμούς I, II, III, IV, V σε χρωματιστά κουτιά. Οι κάθετες γραμμές αντιπροσωπεύουν τη συχνότητα όπου βρίσκονται οι μεταλλάξεις σε διάφορους ανθρώπινους όγκους. Αυτές οι μεταλλάξεις συγκεντρώνονται στις συντηρημένες περοχές. (b). Δομή της πρωτεΐνης p53. Φωσφορυλίωση από διάφορες κινάσες στις θέσεις που δείχνονται με σταθεροποιούν την p53. Η mdm2 πρωτεΐνη προσδένεται στη θέση που δείχνεται, η οποία ρυθμίζει τη κανονική λειτουργία της p53. Η δραστικότητα της p53 επίσης αναστέλλεται με τη πρόσδεση ιϊκών πρωτεϊνών όπως η Ε6 του HPV (Human papillomavirus) και την E1b του αδενοϊού.

Με ανάλυση, Northern blot, δείχθηκε ότι το p53 mRNA έχει μέγεθος 2.8kb

(Matlashewski et. al., 1984). Ακόμα, στην ίδια μελέτη αναφέρθηκε ότι η ανθρώπινη

αλληλουχία περιέχει ένα στοιχείο Alu στο τέλος του 11ου εξονίου.

Η ενεργός μορφή του p53 είναι ένα τετραμερές με τέσσερις όμοιες

υπομονάδες που εντοπίζονται στο καρβόξυτελικο άκρο. Μια μη νοηματική σημειακή

μετάλλαξη σε ένα από τα δύο αλληλόμορφα του p53 σε ένα κύτταρο, μπορεί να

καταργήσει τη λειτουργικότητά του, επειδή ουσιαστικά όλα τα ολιγομερή θα

78

περιέχουν τουλάχιστον μία μη αποτελεσματική υπομονάδα και τέτοια ολιγομερή δεν

μπορούν να λειτουργήσουν ως μεταγραφικοί παράγοντες (Lodish H., et.al. Molecular

Cell Biology. Fourth Edition).

Η θέση πρόσδεσης της πρωτεΐνης mdm2 βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο της

p53 (σχήμα 1). Η φυσιολογική πρωτεΐνη mdm2 αλληλεπιδρά και ρυθμίζει την

έκφραση του άγριου τύπου της p53. Η φυσιολογική mdm2 με πρόσδεση στο

αμινοτελικό άκρο της p53, καταστέλλει τη μεταγραφική ενεργοποίηση του p21 και

άλλων γονιδίων και μεσολαβεί στην αποδόμηση της p53. Έτσι, η mdm2 αναστέλλει

τη λειτουργία του p53 να σταματάει τον κυτταρικό κύκλο και να οδηγεί το κύτταρο

σε απόπτωση (Lodish H., et.al. Molecular Cell Biology. Fourth Edition).

Α. 3. Βιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης p53.

Η p53 πρωτεΐνη λειτουργεί ως σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, που

επιστρατεύεται να δράσει, όταν το DNA υποστεί βλάβη. Έτσι, συσσωρεύεται στον

πυρήνα και προκαλεί, μέσω διαφόρων οδών, παύση του κυτταρικού κύκλου στη

φάση G1, έως ότου η βλάβη του DNA επισκευασθεί (Kastan M. B., 1992). Αντίθετα

με άλλες πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου, η p53 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε

φυσιολογικά κύτταρα επειδή είναι εξαιρετικά ασταθής και αποδιατάσσεται γρήγορα.

Η p53 ενεργοποιείται από γ ακτινοβολία (Hall P. A., 1993), ιοντίζουσα ακτινοβολία

(Kastan M. B., 1992), χημειοθεραπευτικά (Fritsche M. et. al., 1993) και άλλες

συνθήκες στρες. Έτσι, DNA βλάβη από διάφορες συνθήκες στρες οδηγούν σε

ενεργοποίηση κύριων κινασών, όπως ATM, που φωσφορυλιώνουν την p53 και

προκαλούν τη σταθεροποίησή της και μια σημαντική αύξηση της συγκέντρωσής της.

Η ογκοκατασταλτική λειτουργία της p53 αποδίδεται κυρίως στην ιδιότητά της

να ενεργοποιεί τη μεταγραφή πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων,

p21 (el-Deiry W.S. et. al., 1993), mdm2 (Momand et. al., 1992) και bax (Miyashita

and Reed, 1995). Η μεταγραφή της πρωτεΐνης του αναστολέα p21, που προσδένεται

και αναστέλλει σύμπλοκα κυκλίνης-κινάσης της G1 φάσης του κύκλου (Cdk-

κινάσης), επάγεται από τη p53. Έτσι, κύτταρα με βλάβη στο DNA παραμένουν στη

φάση G1 μέχρι να επιδιορθωθεί η βλάβη και να μειωθούν τα επίπεδα του p53 και p21

(Franks and Teich, 1999).

Η ικανότητα του φυσιολογικού τύπου της p53 πρωτεΐνης να προσδένει

συγκεκριμένες DNA αλληλουχίες (El-Diery W. S., et. al., 1992: Funk W. D., et. al.,

1992) και να διεγείρει τη μεταγραφή των ανασυνδυασμένων προαγωγών που

79

περιέχουν αυτές τις αλληλουχίες (Funk W. D., et. al., 1992: Kern S. E., et. al., 1992),

δείχνει ότι αυτό το μόριο παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού

πολλαπλασιασμού.

Στα περισσότερα κύτταρα η συσσώρευση της p53 πρωτεΐνης οδηγεί σε

διακοπή της διαίρεσης του μεταλλαγμένου κυττάρου και ενεργοποίηση των γονιδίων

απόπτωσης του κυττάρου. Ένας γνωστός μηχανισμός δια μέσου του οποίου η p53

ενεργοποιεί τη διαδικασία της απόπτωσης είναι με ενεργοποίηση της έκφρασης

γνωστών αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως η bax, που οδηγούν σε ενεργοποίηση

κασπασών και την τελική αποικοδόμηση του DNA.

Τέλος θα πρέπει να σημειώσουμε ότι λειτουργική απενεργοποίηση, χωρίς

απώλεια του p53 γονιδίου, μπορεί να προκληθεί από ορισμένες ιϊκές ογκοπρωτεΐνες.

Ένα τέτοιο παράδειγμα αποτελούν οι Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεΐνες του ιού HPV, οι

οποίες δεσμεύουν την πρωτεΐνη p53 και εξουδετερώνουν με αυτό τον τρόπο τη

φυσιολογική ογκοκατασταλτική της δραστηριότητα (Mietz J. A. et. al., 1992).

Α. 4. p53 και καρκίνος του μαστού.

Ο καρκίνος του μαστού προσβάλλει μία στις δέκα γυναίκες στις αναπτυγμένες

χώρες και έχει υπολογισθεί ότι το 16% των θανάτων από καρκίνο στο γυναικείο

πληθυσμό, οφείλεται σε καρκίνο του μαστού. Εκτός από τους κλασσικούς

προγνωστικούς παράγοντες, έχουν προταθεί μία πληθώρα νέων βιολογικών και

μοριακών δεικτών, συμπεριλαμβανομένου του p53. Η p53 πρωτεΐνη έχει πολλαπλό

λειτουργικό ρόλο, είναι ένας μεταγραφικός ρυθμιστής, αναστολέας της προόδου του

κυτταρικού κύκλου, γονιδιακός σταθεροποιητής και επάγει την απόπτωση. Η

ακύρωση της λειτουργίας του p53, θεωρητικά ίσως οδηγούσε σε ένα επιθετικό

φαινότυπο του καρκίνου του μαστού, λαμβάνοντας υπόψη τον πολλαπλό ρόλο του

και πράγματι οι περισσότερες μελέτες πιστοποιούν τη παραπάνω υπόθεση, με το

κίνδυνο του θανάτου να αυξάνεται περισσότερο από 50%, αν το p53 δεν είναι

λειτουργικό.

Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 είναι το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο

σε ποικίλους καρκίνους και ιδιαίτερα στον καρκίνο του μαστού και η ανίχνευση

μεταλλάξεων στην αλληλουχία του γονιδίου αποτελεί πλέον αντικείμενο έρευνας με

συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον. Στις περισσότερες περιπτώσεις οι μεταλλάξεις, που

απενεργοποιούν και τα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου p53, εμφανίζονται σε

σωματικά κύτταρα και έχουν παρατηρηθεί σε μια μεγάλη ποικιλία καρκίνων του

80

πνεύμονα, του μαστού, του οισοφάγου, της ωοθήκης, της ουροδόχου κύστης, και του

προστάτη (Nigro et al., 1989: Levine et. al., 1991: Hsu et. al., 1991: Hollstein et. al.,

1991). Απώλεια του ενός αλληλόμορφου στο κοντό βραχίονα του χρωμοσώματος 17

στη περιοχή του p53 γονιδίου (17p13.1) έχει δειχθεί στο 60% των περιπτώσεων του

καρκίνου του μαστού (Mackey et. al., 1988: Deville et. a;., 1989).

Σε σπανιότερες περιπτώσεις, η μία μετάλλαξη κληρονομείται στη γεννητική

βλαστική σειρά, όπως συμβαίνει σε άτομα με το σύνδρομο Li-Fraumeni. Αυτά τα

άτομα εμφανίζουν αυξημένη πιθανότητα να υποστούν και δεύτερη μετάλλαξη του

υπάρχοντος ενός φυσιολογικού γονιδίου p53 σε διάφορα σωματικά κύτταρα, με

αποτέλεσμα την ανάπτυξη ποικίλων κακοήθων νεοπλασμάτων,

συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού (Malkin et.al., 1990).

Το p53 ογκοκατασταλτικό γονίδιο συχνότερα παρουσιάζει παρανοηματικές

μεταλλάξεις (missense mutations), που οδηγούν σε υποκαταστάσεις αμινοξέων. Έτσι

περισσότερες από 85% των αναφερθεισών μεταλλάξεων του p53 σε ανθρώπινους

καρκίνους, μεταξύ αυτών και στον καρκίνο του μαστού, είναι παρανοηματικές

μεταλλάξεις που συμβαίνουν μεταξύ των εξονίων 5 και 8 (Hollstein et. al., 1994).

Ακόμα, έχουν παρατηρηθεί σε καρκίνο του μαστού σημειακές μεταλλάξεις, στις

συντηρημένες περιοχές του ανοιχτού πλαίσιου ανάγνωσης του p53 (Takahashi T. et.

al., 1990).

Ένα μικρό ποσοστό, 10%, των μεταλλάξεων του p53 σε μία μεγάλη ποικιλία

καρκίνων, οφείλεται σε ενδογονιδιακές απαλείψεις και παρεμβολές, που μπορούν να

διακόπτουν το πλαίσιο ανάγνωσης (Jeco N., et; al., 1993). Σε ασθενείς με καρκίνο

του μαστού, έχουν βρεθεί 3 περιπτώσεις με έλλειψη ενός τμήματος νουκλεοτιδίων

μεγέθους 13, 19 και 23bp (Blaszyk H., et. al., 1996: Berns E. M., et. al., 1998:

Patrinos G. P., et. al., 1999), που τοποθετούνται στο εξόνιο 5 του γονιδίου p53.

Η έλλειψη ομοφωνίας στα αποτελέσματα διαφόρων μελετών μπορεί να

οφείλεται σε διαφορές στην τεχνική, στο σχεδιασμό της μελέτης, στον πληθυσμό, σε

κληρονομικότητα και στην πολυπλοκότητα του καρκίνου. Όσον αφορά διαφορές στη

συχνότητα μεταλλάξεων σε διαφορετικούς πληθυσμούς, αναφέρθηκε (Saitoh et. al.,

1994) υψηλότερη συχνότητα μη λειτουργικών μεταλλάξεων (null) σε καρκίνους του

μαστού γυναικών από τις Ηνωμένες Πολιτείες, της Αμερικής, σε σύγκριση με δύο

ευρωπαϊκούς πληθυσμούς με καρκίνο του μαστού.

Η προγνωστική αξία του p53 έχει μελετηθεί εκτενώς στον καρκίνο του

μαστού. Η ικανότητα να προσδιορίσουμε το είδος των μεταλλάξεων στο p53 έχει

81

μεγάλη σημασία για να αξιολογηθεί η κλινική πορεία ενός νεοπλάσματος. Η κλινική

πορεία μπορεί να κυμαίνεται από ιάσιμη έως θανατηφόρα. Έτσι, πραγματοποιήθηκαν

μελέτες, σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού, με μεταλλάξεις του ογκοκατασταλτικού

γονιδίου p53 σε διαφορετικές λειτουργικές περιοχές του.

Α. Μεταλλάξεις στη περιοχή πρόσδεσης του ψευδαργύρου συσχετίσθηκαν με

βραχύτερη επιβίωση (Gentile M., et. al., 1999).

Β. Μεταλλάξεις στις συντηρημένες περιοχές II και V (Berg J. Et. al., 1995)

συσχετίσθηκαν με χειρότερη πρόγνωση σε σύγκριση με μεταλλάξεις που επηρεάζουν

τη περιοχή επαφής του DNA (Berns et. al., 1998).

Επιπλέον, η ανίχνευση μεταλλάξεων του p53 στη γαμετική σειρά, είναι

σημαντική για την αναγνώριση ασθενών, που ανήκουν στη κατηγορία υψηλού

κινδύνου ανάπτυξης νεοπλασίας (Beck J. S., et. al., 1993).

82

Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 είναι το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο

σε ποικίλους καρκίνους και ιδιαίτερα στο καρκίνο του μαστού και η ανίχνευση

μεταλλάξεων στην αλληλουχία του γονιδίου αποτελεί αντικείμενο έρευνας με

συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον.

Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της παρουσίας ή μη

μεταλλάξεων στα εξώνια 5 έως 8 του γονιδίου p53. Οι περιοχές αυτές των εξωνίων

θεωρούνται ως οι κύριες περιοχές συσσώρευσης μεταλλάξεων σε καρκίνους μαστού.

Περίπου το 20% των καρκίνων του μαστού περιέχουν μια μετάλλαξη στα εξώνια 5

έως 8 του p53 γονιδίου (Powell B., et. al., 2000). Η ανίχνευση μεταλλάξεων

πραγματοποιήθηκε με ανάλυση με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου με

κλίση αποδιατακτικών παραγόντων (DGGE: Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis).

83

Γ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Γ. 1. Απομόνωση DNA από νωπά ιστικά δείγματα μαστού.

Απομονώθηκε DNA από 10 νωπά ιστικά δείγματα από καρκινώματα μαστού

και τα αντίστοιχα 10 δείγματα παρακείμενου φυσιολογικού αδένα. Η απομόνωση

DNA από φρέσκα ιστικά δείγματα πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο

της εταιρείας Qiagen, QIAamp DNA Kit (Tissue protocol):

Το ιστικό δείγμα (~50mg) κόβεται σε μικρά τμήματα, τοποθετείται σε

σωληνάκια ependorf και προστίθενται 360μl διαλύματος ATL και 40μl πρωτεϊνάσης

Κ, για τη πέψη των πρωτεϊνών. Τα δείγματα επωάζονται στους 56οC με ανάδευση

μέχρι να διαλυθεί τελείως ο ιστός.

Στη συνέχεια τα δείγματα αναδεύονται σύντομα και προστίθενται 400μl

διαλύματος AL, ισχυρή ανάδευση και επώαση στους 70οC για 10 λεπτά. Ακολουθεί

καταβύθιση του DNA με προσθήκη 400μl 100 % ψυχρής αιθανόλης.

Το δείγμα μεταφέρεται σε στήλη, όπου προσδένεται το DNA στη στήλη και

φυγοκεντρείται για 1 λεπτό στις 8000 rpm. Ακολουθούν δύο πλύσεις: η πρώτη πλύση

πραγματοποιήθηκε με 500μl διαλύματος AW1 και φυγοκέντρηση στις 10.000 rpm για

1 λεπτό και η δεύτερη με προσθήκη 500μl διαλύματος AW2 και φυγοκέντριση στις

10.000 rpm για 3 λεπτά.

Ακολουθεί έκλουση του DNA από τη στήλη με 200μl διαλύματος ΑΕ και

συλλέγεται μετά από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά και ήπια

φυγοκέντρηση.

Γ. 2. Ενίσχυση των εξωνίων 5 έως 8 του γονιδίου p53 με την αντίδραση PCR.

Πραγματοποιήθηκε ενίσχυση των εξωνίων 5, 6, 7 και 8 του p53 γονιδίου, σε

δείγματα DNA από νωπά ιστικά δείγματα μαστού, με τη τεχνική της αλυσιδωτής

αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).

Η επιλογή των εκκινητών προσδίδει μια GC ουρά 40 βάσεων στο 5΄ άκρο των

PCR προϊόντων ώστε να είναι εφικτή η ανίχνευση μεταλλάξεων με τη μέθοδο DGGE,

που θα αναλυθεί παρακάτω. Τα ζεύγη των εκκινητών για την ενίσχυση του κάθε

εξονίου έχουν την εξής αλληλουχία:

§ Εξώνιο 5a:

sense primer: 5΄ -TTC CTC TTC CTG CAG TAC TC- 3΄

antisense primer: 5΄ -(GC –clamp)-TGG CGC GGA CGC GGG TGC CG - 3΄

84

§ Εξώνιο 5b:

sense primer: 5΄ - (GC –clamp)-TTC CAC ACC CCC GCC CGG CA - 3΄

antisense primer: 5΄ - CTG GGG ACC CTG GGC AA - 3΄

§ Εξώνιο 6:

sense primer: 5΄ - (GC –clamp)-GAG ACG ACA GGG CTG GTT - 3΄

antisense primer: 5΄ - CCA CTG ACA ACC ACC CTT - 3΄

§ Εξώνιο 7:

sense primer: 5΄ - (GC –clamp)-TGG CTC TGA CTG TAC CAC - 3΄

antisense primer: 5΄ - CAA GTG GCT CCT GAC CTG GA - 3΄

§ Εξώνιο 8:

sense primer: 5΄ - (GC –clamp)-ATC CTG AGT GGT AAT CT - 3΄

antisense primer: 5΄ - TAC CTC GCT TAG TGC TCC - 3΄

H αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε με τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων

που φαίνονται στον πίνακα 1.

Πίνακας 1: Συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων της PCR.

Συστατικά Cαντίδρασης

DNA εκμαγείο 300ng

PCR buffer 10x 1x

dNTP 0.2mM

MgCl2 1.5mM (1.25mM για το εξόνιο 7 και 5b)

Εκκινητής 3΄ άκρου 25 pmol/μl

Εκκινητής 5΄ άκρου 25 pmol/μl

BSA 0.2mg/ml

φορμαμίδιο 2.5% για εξόνια 6, 8 και 5% για τα 5 και 7

Taq polymerase 2.5U

dd H2O Μέχρι όγκου 50μl

Συνολικός όγκος 50μl

Στη συνέχεια ακολουθεί η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε θερμικό

κυκλοποιητή. Κατά τη διάρκεια των θερμικών κύκλων της PCR το μίγμα αρχικά

αποδιατάσσεται. Κατόπιν το μίγμα επωάζεται σε 30 θερμικούς κύκλους που

περιλαμβάνουν τρία βήματα: αποδιάταξη–πρόσδεση–επιμήκυνση. Οι συνθήκες που

85

επιλέχθηκαν για το στάδιο της θερμικής αποδιάταξης είναι για όλα τα εξόνια 95οC για

1 λεπτό. Για το στάδιο της πρόσδεσης των εκκινητών είναι: 58οC για τα εξόνια 5b, 6,

7, 8 και 56οC για το εξόνιο 5a για 1 λεπτό. Το στάδιο της επιμήκυνσης των αλυσίδων

DNA είναι 70οC για το εξόνιο 5a και 72οC για τα εξόνια 5b, 6, 7, 8 για 1 λεπτό.

Γ. 3. Ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο p53 με τη μέθοδο DGGE.

Η ηλεκροφόρηση σε κλίση πυκνότητας αποδιατακτικών παραγόντων (DGGE)

επιτρέπει την ανίχνευση απλών αλλαγών βάσεων και μικρά ελλείμματα, μερικών

δεκάδων βάσεων, στο μόριο του DNA. Η τεχνική αυτή βασίζεται στο διαχωρισμό δύο

τύπων δίκλωνου μορίου DNA, φυσιολογικός τύπος και μεταλλαγμένος, σε πήκτωμα

ακρυλαμιδίου, που περιέχει αποδιατακτικές ουσίες (ουρία και φορμαμίδιο) με

συγκεκριμένη κλίση συγκέντρωσης αυτών των αποδιατακτικών ουσιών.

Ο διαχωρισμός των δύο μορίων του DNA γίνεται σύμφωνα με τις διαφορές

στη θερμοκρασία αποδιάταξης (Τm), που εξαρτάται από τη συχνότητα των βάσεων

Α-Τ και G-C. Δύο όμοια τμήματα DΝΑ που διαφέρουν έστω και σε ένα μόνο

νουκλεοτίδιο θα έχουν και διαφορετική Τm. Αν κινηθούν πάνω στο πήκτωμα

ακρυλαμιδίου, αρχικά θα κινηθούν με σταθερή τροχιά, καθώς όμως κινούνται σε μια

κρίσιμη αποδιατακτική συγκέντρωση, μια ειδική περιοχή μέσα στο τμήμα του DΝΑ,

που ονομάζεται πλαίσιο, αποδιατάσσεται και παράγει μερικά αποδιαταγμένο DΝΑ.

Αυτό συνοδεύεται από μια ξαφνική μείωση της κινητικότητας του τμήματος

του DΝΑ, η οποία οφείλεται ακριβώς σε αυτά τα παρακλάδια του αποδιαταγμένου

DΝΑ, που παράγονται. Η ακριβής θέση πάνω στο πήκτωμα, όπου παρατηρείται η

μείωση της κινητικότητας, αντιστοιχεί με την Tm του πλαισίου. Η αποδιάταξη του

DNA έχει σαν συνέπεια τη ακινητοποίησή του κατά την ηλεκτροφόρηση πάνω στο

πήκτωμα του ακρυλαμιδίου. Κατά συνέπεια τα δύο τμήματα θα ακινητοποιηθούν σε

διαφορετικά σημεία του πηκτώματος, που θα αντιστοιχούν στις διαφορετικές Tm που

παρουσιάζουν. Η αποδιάταξη επιτυγχάνεται με προσθήκη στο πήκτωμα

ακρυλαμιδίου οργανικών αποδιατακτικών ουσιών, όπως το φορμαμίδιο και η ουρία.

Το μέγεθος των πολλαπλασιασμένων τμημάτων DΝΑ, που μπορούν να

αναλυθούν σε ένα τέτοιο πήκτωμα ακρυλαμιδίου, ποικίλουν από 100 μέχρι 1000

ζεύγη βάσεων.

Αλλαγή βάσης στην άκρη του τμήματος DΝΑ δεν είναι δυνατόν να ελεγχθεί,

γιατί καθώς αποδιατάσσεται το DΝΑ, υφίσταται πλήρη διάσπαση του κλώνου (οι δυο

κλώνοι αποχωρίζονται εντελώς). Το πρόβλημα αυτό λύνεται, εάν στο ένα από τα δύο

86

ολιγονουκλεοτίδια-εκκινητές προστεθεί ένα τμήμα, αποτελούμενο από 5 μέχρι το

πολύ 65 νουκλεοτίδια, που να περιέχει αποκλειστικά νουκλεοτίδια γουανίνης και

κυτοσίνης. Το τμήμα αυτό θα λειτουργήσει σαν σφυκτήρας στην άκρη του τμήματος

DNA που θα πολλαπλασιαστεί με PCR και θα προσδώσει στο προϊόν υψηλή Tm, που

το προφυλάσσει από την πλήρη του αποδιάταξη, ώστε να είναι δυνατή η ανίχνευση

μεταλλάξεων σε ποσοστό που αγγίζει το 100%.

Κατά την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης δημιουργούνται επαναδιατάξεις

των συμπληρωματικών μονόκλωνων μορίων DΝΑ (ομοδιμερή), αλλά και των μη

συμπληρωματικών τμημάτων (ετεροδιμερή). Τα ετεροδιμερή θα έχουν πάντα

μικρότερη Τm από οποιοδήποτε ομοδιμερές, επειδή έχουν μεγαλύτερη χημική

αστάθεια. Τα ετεροδιμερή μόρια σχηματίζονται με μίξη ίσων ποσοτήτων από

πολλαπλασιασμένα τμήματα DΝΑ, φυσιολογικού τύπου και μεταλλαγμένου και

προκύπτουν κατά το στάδιο της επαναδιάταξης (annealing). Έτσι, στην

ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα με κλίση πυκνότητας αποδιατακτικών παραγόντων

σχηματίζονται τέσσερις ευδιάκριτες περιοχές: φυσιολογικού τύπου ομοδιμερή,

μετάλλαξης ομοδιμερή, και δύο διαφορετικές ζώνες ετεροδιμεμών (σχήμα 2).

Σχήμα 2: Σχηματική απεικόνιση πηκτώματος ακρυλαμιδίου μετά από ηλεκτροφόρηση. Σε ομόζυγες καταστάσεις προκύπτουν μόνο ομόδιπλα μόρια DΝΑ ενώ σε ετερόζυγες προκύπτουν τέσσερα διαφορετικά μόρια DΝΑ (δύο ομόδιπλα και δύο ετερόδιπλα) ΦΤ: φυσιολογικός τύπος, ΕΤ: ετερόζυγος τύπος, ΜΕ: μετάλλαξη ομόζυγη.

Στην παρούσα εργασία η μέθοδος DGGE χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση

μεταλλάξεων στα εξόνια 5 έως 8 του γονιδίου p53. Η ανίχνευση μεταλλάξεων σε

κάθε εξόνιο απαιτεί διαφορετικές συνθήκες αποδιάταξης της πηκτής ακρυλαμιδίου

και διαφορετική συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, οι οποίες φαίνονται στο πίνακα 1.

87

Πίνακας 1: Συνθήκες αποδιάταξης και συγκεντρώσεις της πηκτής ακρυλαμι.δίου στα μελετηθέντα εξώνια

Εξώνια Πηκτή ακρυλαμιδίου (%) Εύρος αποδιάταξης (%)

5a 8 55-65

5b 6 60-80

6 6 50-70

7 8 50-75

8 8 50-75

Για τη δημιουργία της πηκτής σε διάφορες αποδιατακτικές συνθήκες

ετοιμάζονται πρώτα δύο διαλύματα με 0% και 80% σε αποδιατακτικούς παράγοντες,

που χρησιμοποιούνται σαν stock. Το 0% αποδιατακτικό διάλυμα (40% ακρυλαμίδιο,

1x ΤΑΕ: 40mM Tris, 20mM Acetic acid, 1mM EDTA pH 8.3) και το 80% διάλυμα

αποδιάταξης (40% ακρυλαμιδίο, 1x ΤΑΕ, 32% formamide, 5,6Μ ουρία)

φιλτράρονται σε φίλτρο 0,45μ.

Για την ετοιμασία της πηκτής ακολουθούμε τα εξής στάδια :

§ Σε δύο σωληνάρια (universal) τοποθετούνται οι αντίστοιχοι όγκοι των υψηλής και

χαμηλής πυκνότητας διαλυμάτων αποδιάταξης από τα stock διαλύματα, ώστε να

δημιουργηθούν οι επιθυμητές συγκεντρώσεις αποδιατακτικών παραγόντων. Στο

διάλυμα αποδιάταξης υψηλής πυκνότητας προστίθεται προαιρετικά 150μl Dcode

dye Solution ανά 5 ml διαλύματος, για να ελέγχεται οπτικά ο σχηματισμός της

διαβάθμισης πυκνότητας.

§ Στη συνέχεια σε κάθε διάλυμα προστίθενται N,N,N,N-Tetra-methyl

ethylenediamine (TEMED, BIO-RAD) και υπερθειϊκό αμμώνιο (APS) σε τελική

συγκέντρωση 0,09% (ν/ν).

§ Τα διαλύματα αναδεύονται και είναι έτοιμα για την κατασκευή της πηκτής.

Το διάλυμα ηλεκτροφόρησης (ΤΑΕ) θερμαίνεται στη συσκευή ηλεκτροφόρηοης

(Dcode Universal Deletion System, BIO-RAD) μέχρι τη θερμοκρασία των 60 οC.

Όγκος 20 μl από το προϊόντα PCR αναμιγνύονται σε αναλογία 5:1 με 6x διάλυμα

φόρτωσης (30% γλυκερόλη, 0,25% κυανού της βρωμοφαινόλης) και τοποθετούνται

στην πηκτή.

Η ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων πραγματοποιείται για 12-16 ώρες στα 65 Volt

και στη συνέχεια ακολουθεί χρώση της πηκτής με βρωμιούχο αιθίδιο σε τελική

88

συγκέντρωση 10μg/ml σε διάλυμα ΤΑΕ για 15 λεπτά και οπτικοποίηση του

αποτελέσματος σε συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας.

89

Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.

Δ. 1. Ενίσχυση των εξωνίων 5-8 του γονιδίου της p53.

Πραγματοποιήθηκε ενίσχυση των εξονίων 5 έως 8 του γονιδίου της p53, σε

γενωμικό DNA με τη τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Το

DNA απομονώθηκε από 10 νωπά ιστικά δείγματα (δείγματα 36-45) από καρκινώματα

μαστού και τα αντίστοιχα 10 δείγματα παρακείμενου φυσιολογικού αδένα, όπως

περιγράφεται στο κεφάλαιο Γ. 1.

Αναλύθηκαν συνολικά 10 δείγματα και πραγματοποιήθηκε ενίσχυση των

εξονίων 5 έως 8 με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, PCR.

Έτσι, με τους εκκινητές που επιλέχθηκαν και αναφέρονται αναλυτικά στη παράγραφο

Γ. 2., ενισχύονται τα εξόνια 5a, 5b, 6, 7, και 8 με μεγέθη 158, 208, 270, 163 και

191bp, αντίστοιχα. Στην εικόνα 1 φαίνονται τα προϊόντα της PCR αντίδρασης στα

δείγματα 36 και 37 μετά από ηλεκτροφόρηση σε 1.5% πηκτή αγαρόζης. Για το κάθε

δείγμα (36 και 37) ενισχύθηκαν τα εξόνια 5a, 5b, 6, 7, 8, από καρκινικό ιστικό δείγμα

μαστού (συμβολίζεται Τ) και από το παρακείμενο φυσιολογικό δείγμα του αδένα

(συμβολίζεται Ν) και παρατηρούνται οι ζώνες με τα μεγέθη που αναφέρθηκαν

παραπάνω για το κάθε εξόνιο (εικόνα 1).

Εικόνα 1: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης PCR σε πηκτή αγαρόζης 1.5%. διαδρομή 1: πρότυπο μοριακό βάρος, DNA Ladder 100bp. διαδρομές 2 έως 5: απεικονίζεται η ενίσχυση του εξωνίου 7 του γονιδίου p53 των δειγμάτων 36 και 37 από καρκινικό ιστό T και φυσιολογικό N, με μια ζώνη μεγέθους 163bp. διαδρομές 6 έως 10: απεικονίζεται η ενίσχυση του εξωνίου 8 του γονιδίου p53 των δειγμάτων 36 και 37 από καρκινικό ιστό T και φυσιολογικό N, με μια ζώνη μεγέθους 191bp. διαδρομές 11 έως 14: απεικονίζεται η ενίσχυση του εξωνίου 5a του γονιδίου p53 των δειγμάτων 36 και 37 από καρκινικό ιστό Tκαι φυσιολογικό N, με μια ζώνη μεγέθους 158bp. διαδρομές 15 έως 18: απεικονίζεται η ενίσχυση του εξωνίου 5b του γονιδίου p53 των δειγμάτων 36 και 37 από καρκινικό ιστό T και φυσιολογικό N, με μια ζώνη μεγέθους 208bp. διαδρομές 19 έως 23: απεικονίζεται η ενίσχυση του εξωνίου 6 του γονιδίου p53 των δειγμάτων 36 και 37 από καρκινικό ιστό T και φυσιολογικό N, με μια ζώνη μεγέθους 270bp.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

T N T N T N T N T N T N T N T T N T N

90

Δ. 2. Ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο του p53 με τη μέθοδο DGGE.

Στη παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε ανίχνευση μεταλλάξεων στα εξόνια

5 έως 8, που αποτελούν τη περιοχή που συναντώνται οι περισσότερες μεταλλάξεις σε

καρκίνο του μαστού (Powell B., et. al., 2000) και σε μία πληθώρα άλλων

νεοπλασμάτων (Levine et. al., 1991: Hollstein M. et. al., 1991). Η ανίχνευση

μεταλλάξεων πραγματοποιήθηκε με ανάλυση με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα

ακρυλαμιδίου με κλίση αποδιατακτικών παραγόντων (DGGE: Denaturing Gradient

Gel Electrophoresis). Όπως προαναφέρθηκε, ενισχύθηκαν τα εξόνια 5 έως 8 του p53

με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των

τμημάτων αυτών σε πηκτή ακρυλαμιδίου με διαβάθμιση στη συγκέντρωση των

αποδιατακτικών παραγόντων. Η συγκέντρωση των αποδιατακτικών παραγόντων στη

πηκτή ακρυλαμιδίου διαφέρει ανάλογα με το εξόνιο που εξετάζεται, όπως φαίνεται

αναλυτικά στη παράγραφο Γ. 3. Στην εικόνα που ακολουθεί (εικόνα 2) παρουσιάζεται

ενδεικτικά η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων του εξωνίου 8 σε 8% πηκτή

ακρυλαμιδίου με βαθμίδωση αποδιατακτικών παραγόντων 50-75%. Στη διαδρομή 1,

όπου έχει ηλεκτροφορηθεί το δείγμα 41, έχει ανιχνευτεί μετάλλαξη με την εμφάνιση

των χαρακτηριστικών ομόδιπλων και ετερόδιπλων ζωνών στο καρκινικό δείγμα. Στα

υπόλοιπα 9 δείγματα που εξετάστηκαν δεν ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις.

Εικόνα 2: Ηλεκτροφόρηση του εξωνίου 8 των δειγμάτων 38, 39, 40 και 41. (Τ:

καρκινικό, Ν: φυσιολογικό).

41Τ 41Ν 40Τ 40Ν 39Τ 39Ν 38T 38N

91

Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Τα τελευταία χρόνια εμφανίστηκαν αρκετά παραδείγματα άμεσης συσχέτισης

μεταξύ γονιδίων που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο και του καρκίνου. Μεταλλάξεις

σε γονίδια που αποτελούν τους βασικούς συντελεστές ρύθμισης του κυτταρικού

κύκλου αλλά και των σημείων ελέγχου του έχουν ανιχνευθεί σε πολλούς

ανθρώπινους όγκους. Μεταλλάξεις του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, υπεύθυνου

για το σημείο ελέγχου G1 του κυτταρικού κύκλου, βρέθηκε ότι συσχετίζεται με τη

δημιουργία πολλών καρκίνων.

Πολυάριθμες μελέτες σε ανθρώπινους καρκίνους έδειξαν ότι συχνά οι όγκοι

συνοδεύονται με απενεργοποίηση της ογκοκατασταλτικής λειτουργίας του γονιδίου

p53. Η απενεργοποίηση της πρωτεΐνης p53 πραγματοποιείται δια μέσου διαφόρων

μηχανισμών, όπως απώλεια των αλληλομόρφων στo p53 γενετικό τόπο (στο 17p13),

ελλείψεις, ενθέσεις, σημειακές μεταλλάξεις ή με σχηματισμό συμπλόκου με ιϊκές ή

κυτταρικές πρωτεΐνες. Αυτές οι μεταλλάξεις συχνά αναπτύσσονται σε σωματικά

κύτταρα. Ωστόσο, μεταλλάξεις του p53 μπορούν να είναι κληρονομικές με μια

προδιάθεση σε πολλαπλούς καρκίνους, όπως στο σύνδρομο Li-Fraumeni (LFS).

Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στην ανίχνευση παρουσίας ή μη

μεταλλάξεων στην περιοχή των εξονίων 5 έως 8 του γονιδίου p53. Οι περιοχές αυτές

των εξονίων θεωρούνται ως οι κύριες περιοχές συσσώρευσης μεταλλάξεων σε

καρκίνους του μαστού, καθώς επίσης και σε μία πληθώρα άλλων νεοπλασμάτων

(Levine et. al., 1991: Hollstein M. et. al., 1991). Περίπου το 20% των περιπτώσεων

καρκίνου του μαστού περιέχουν μια μετάλλαξη στα εξόνια 5 έως 8 του γονιδίου p53

(Powell B., et. al., 2000). Η ανίχνευση μεταλλάξεων πραγματοποιήθηκε με ανάλυση

με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου με κλίση αποδιατακτικών παραγόντων

(DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis).

Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι από τα 10 καρκινικά δείγματα

ασθενών που αναλύθηκαν, βρέθηκε μία μετάλλαξη στο δείγμα 41 στο εξόνιο 8, που

αντιστοιχεί σε ποσοστό 10% επί του συνόλου. Σε αυτό το καρκινικό δείγμα (δείγμα

41), βρέθηκε όμοιο πρότυπο μετάλλαξης και στο αντίστοιχο φυσιολογικό δείγμα.

Αυτό πιθανώς οφείλεται είτε σε ανάμιξη καρκινικού και φυσιολογικού ιστού κατά τη

λήψη των δειγμάτων ή σε πολυμορφισμό.

Για να εξαχθούν συμπεράσματα ως προς το συσχετισμό των μεταλλάξεων του

γονιδίου του p53 με τον καρκίνο του μαστού θα πρέπει να αναλυθεί μεγαλύτερος

92

αριθμός δειγμάτων ώστε να είναι δυνατή η στατιστική επεξεργασία των

αποτελεσμάτων.

93

ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Beck J. S., Kwitek A. E., Cogen P. H., Metzger A. K., Duyk G. M., Sheffield V.

C. (1993). A denaturing gradient gel electrophoresis assay for sensitive detection

of p53 mutations. Human Genet. 91:25-30.

2. Bergh J., Norberg T., Sjogren S., Lindgren A., Holmberg L. (1995). Complete

sequencing of the p53 gene provides prognostic information in breast cancer

patients, particularly in relation to adjuvant systemic therapy and radiotherapy.

Net. Med., 1:1029-1034.

3. Berns E. M., Van Staveren I. L., Look M. P., Smid M., Klijin J. G., Foekens J. A.

(1998). Mutations in residues of TP53 that directly contact DNA predict poor

outcome in human primary breast cancer. Br J Cancer 77: 1130-1136.

4. Blaszyk H., Hartmann A., Tamura Y., Saitoh S., Cunningham J. M., McGovern

R. M., Schroeder J. J., Schaid D. J., Ii k., Mondem Y., Morimoto T., Komaki K.,

Sasa M., Hirata K., Okazaki M., Kovach J. S., Sommer S. S. (1996). Molecular

epidemiology of breast cancers in Northern and Southern Japan: the frequency,

clustering, and patterns of p53 gene mutations differ among these two low risk

populations. Oncogene. 13:2159-2166.

5. Cho Y., Gorina S., Jeffrey P. D., and Pavltich N. P. (1994). Crystal structure of a

p53 tumor suppressor DNA complex: understanding tumorigenic mutations.

Science 265: 346-355.

6. DeLeo A.B., Jay G,, Appella E, Dubois G.C., Law L.W., and Old L-J- (1979)

Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and

other transformed cells of the mouse, Proceedings of the Natsona! Academy of

Sciences of ihe USA 76, 2420-2424

7. Deville et. Ap., Van Den Broek M., Kuipers-Dijkshoorn N., Kollurl R., Kharn P.

M., Pearson P.L. and Cornelisse C. J. (1989). At least four different

chromosomal regions are involved in loss of hetero zygosity in human breast

carcinoma. Genomics. 5:554-560.

8. el-Deiry W.S., Kern S. E., Pietnpol J. A. (1992). Definition of a consensus

binding site for p53. Nat. Genet. 1:45-49.

9. el-Deiry W.S., Tokino T, Velculescu V.F Levy D.B, Parsons R., Trent J.M., Lin

D., Mercer W.E., Kinzler K.W., and VogelsTein B. (1993). WAF1, a potential

mediator of p53 tumor suppression, Cell 75, 817-825

94

10. Franks LM. and Teich N,M. (1999) Cellular and Molecular Biology of Cancer,

third edition

11. Fritsche M. Haessler C., Brandner G. (1993). Induction of nuclear accumulation

of the tumor-suppressor protein p53 by DNA damaging agent. Oncogene.8:307-

318.

12. Funk W. D., Pak D. T., Karas R. H. (1992). A transcriptionally active DNA

binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell. Biol. 12: 2866-2871.

13. Gentile M., Jungestrorm M. B., Olsten K. E., Soderkvist P., Wingren S. (1999).

p53 and survival in early onset breast cancer: analysis of gene mutation, loss of

heterozygosity and protein accumulation. Eur. J. Cancer. 35:1202-1207.

14. Hall P. A., Mc Kee P. H, Menage H.D. (1993). High levels of p53 protein in UV-

irradiated human skin. Oncogene 8:203-207.

15. Hollstein M, Sidransky D., Vogelstein B, Hams C.C. (1991) p53 mutations in

human cancer's, Scrence 253, 49-53

16. Hsu I.C., Metcatf R.A.. Sun T, Welsh J.A.. Wang N.J,, Harris C,C, (1991)

Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinomas. Nature

350, 427-428

17. Jeco N., Thomas G., Hamelin R. (1993) Short direct repeats flanking deletions,

and duplicating insertions in the p53 gene in human cancers. Oncogene. 8:209-

213.

18. Kastan M. B., Zhan Q., el-Diery W.S. (1992). A mammalian cell cycle

checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia

telangiectasia. Cell. 71:587-589.

19. Kern S. E., Pietnpol J. A., Thiagalingam S. et. al. (1992). Oncogenic forms of p53

inibit p53-regulated gene expression. Science 256: 827-830.

20. Levine A.J., Momand J., Finlay C. (1991) The p53 tumor suppressor gene, Nature

351, 453-456

21. Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D, Darnell J. E.

Molecullar Cell Biology. Fourth Edition. W. H. Freeman and Company.

22. Mackey J., Steel C. M., Elder P. A., Forrest A. P. M. and Evans H. J. (1988).

Allele loss on short arm of chromosome 17 in breast cancers. Lancet. Ii, 1384-

1385.

23. Malkin D., Li F.P., Strong L.C., Flaumeni J.F., Nelson C.E., Kirn D.H., Kassel J.,

Gryka M.A., Bischoff F.Z., Tainsky M.A., Friend S.H. (1990) Germ line p53

95

mutations in a familial syndrome of breast cancer, sarcomas, and other

neoplasms, Science 250,1233-1238

24. Matlashewski G., Lamb P., Pim D., Peacock J., Crawford L., Benchimol S.

(1984). EMBO J., 3:3257-3262.

25. Mietz J. A., Unger T., Huibregtse J. M., et. al. (1992). The transcriptional

transactivation function of wild type p53 is inhibited by SV40 large T-antigen and

by HPV-16 E6 oncoprotein. EMBO J. 11: 5013-5020.

26. Miyashita T. and Reed J.C. (1995) Tumor suppressor p53 is a direct

transcriptional activator of the human bax gene, Ce// 80, 293-299

27. Momand, J., Zambetti, G.P., Olson, D.C., George, D., and Levine, A.J. (1992)

The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits

p53 mediated transactivation, Cell 69,1237-1245

28. Nigro J. M., Baker S. J., Preisinger A. C. Jessup J. M., Hostetter R. Cleary K.,

Binger S. H., Davidson N., Baylin S., Devilee P., Glover T., Collins F. C.,

Weston A., Modali R., Harris C. C., and Vogelstein B. (1989). Mutations in the

p53 gene occur in diverse human tumor types. Nature (Lond.). 342:705-708.

29. Patrinos G. P., Garinis G., Kounelis S., Kouri E., Menounos P. (1999). A novel

23bp deletion in exon 5 of the p53 tumor suppressor gene. J. Mol. Med. 77:686-

689.

30. Powell B., Soong R., Iacopetta B., Seshsadri R., Smith D. R. (2000). Prognostic

significance of mutations to different structural and functional regions of thw p53

gene in breast cancer. Clin. Cancer Res. 6: 443-451.

31. Saitoh S., Cunningham J., DeVries E. M., McGoven R. M., Schroeder J.J.,

Hartman A., Blaszyc H., Wolf L. E., Schaid D., Sommer S. S., and Kovack J. S.

(1994). Oncogene. 9:2869-2875.

32. Sousi T., de Fromentai C. C., Mechali M., May P., and Kress M. (1987). Cloning

and characterization of a DNA from Xenopus laevis coding for a protein

homologus to human and murine p53. Oncogene. 1:71-78.

33. Takahashi T., D’ Amigo D., Chiba I., et. al. (1990). Identification of intronic

point mutations as an alternative mechanism for p53 inactivation in lung cancer.

J. Clin. Invest. 86:363-369.

96

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Έκφραση της πρωτεΐνης κινητοποίησης που κωδικοποιείται

από την περιοχή ORF1 του πλασμιδίου pZMO3 του στέλεχος

ATCC 10988 του βακτηρίου Zymomonas Mobilis.

Υπεύθυνος: Κ. Δραΐνας (Καθηγητής)

Βαρσάκη Αθανασία (Υποψήφια διδάκτορας)

97

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α. 1. Το βακτήριο Zymomonas mobilis

Το Zymomonas mobilis είναι ένα αρνητικό κατά Gram αναερόβιο βακτήριο.

Ανακαλύφθηκε το 1923 στο Μεξικό από τον Lindner και βρέθηκε ότι είναι υπεύθυνο

για τη ζύμωση του ποτού pulque (σακχαρώδης αλκοολούχος χυμός από κάκτο της

οικογένειας Agave). Τα κύτταρα έχουν σχήμα ραβδοειδές, με μήκος 2-6μm και

πλάτος 1-1.5μm. Το 70% των στελεχών που μελέτησαν οι Swings και De Ley

(Swings and Delay, 1977) δεν είχαν κινητικότητα, ενώ το 30% έφεραν 1-4 πολικά

μαστίγια, στα οποία οφειλόταν η κίνηση τους.

Όλα τα στελέχη του Z. mobilis παρουσιάζουν ανθεκτικότητα σε ένα ευρύ

φάσμα αντιβιοτικών. Οι Swings and Delay αναφέρουν ότι κάθε ένα από τα 38

στελέχη που εξετάστηκαν ήταν ανθεκτικά σε τουλάχιστον εννέα αντιβιοτικά (Swings

and Delay, 1977). Ακόμα, αξιοσημείωτη παρατήρηση αποτελεί η μεγάλη

ανθεκτικότητα του Z. mobilis σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης. Πιθανώς η

ανθεκτικότητα στην αιθανόλη οφείλεται στη μεγάλη συγκέντρωση οπανοειδών στη

μεμβράνη, τα οποία ρυθμίζουν τη σταθερότητα και τη ρευστότητα της μεμβράνης,

γεγονός που σχετίζεται άμεσα με την ανθεκτικότητα του οργανισμού σε υψηλές

συγκεντρώσεις αλκοόλης (Βαρσάκη Α., 1999).

Το βακτήριο Z. mobilis έχει ένα μοναδικό χαρακτηριστικό. Ζυμώνει

σακχαρόζη, γλυκόζη και φρουκτόζη ακολουθώντας την πορεία Entner-Doudoroff. Η

ιδιότητα αυτή του Z. mobilis έχει μεγάλη σημασία σε βιομηχανικό επίπεδο.

Συγκεκριμένα μεταβολίζει πλήρως ένα μόριο γλυκόζης δίνοντας δύο μόρια αιθανόλης

και δύο μόρια CO2, για το λόγο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή

αιθανόλης σε βιομηχανικό επίπεδο. Ωστόσο, η παραγωγή της αιθανόλης σε

βιομηχανικό επίπεδο περιορίζεται, επειδή το βακτήριο του Z. mobilis ζυμώνει ένα

μικρό αριθμό υποστρωμάτων (σακχαρόζη, γλυκόζη, φρουκτόζη) (Swings and Delay,

1977; Rogers et.al., 1984).

Ένας μεγάλος αριθμός πλαμιδιακών φορέων έχει δομηθεί για το Z. mobilis,

ωστόσο οι περισσότεροι από αυτούς δείχνουν μικρή σταθερότητα, καθώς

εξαφανίζονται (Tonomura et. al.,1986) ή χάνουν την αρχική τους δομή μετά από

ορισμένες κυτταρικές διαιρέσεις (Byun et. al., 1988). Αυτή η έλλειψη σταθερότητας

μπορεί να οφείλεται στην ασυμβατότητα ή σε γενετικές επιδράσεις μεταξύ των

φορέων και των φυσικών πλασμιδίων του Z. mobilis. Έτσι, η μελέτη της δομής, της

λειτουργίας και της σταθερότητας των φυσικών πλασμιδίων του Z. mobilis καθώς και

98

η κατασκευή ανασυνδιασμένων φορέων, θα οδηγήσει στη γενετική βελτίωση αυτού

του σημαντικού για την βιομηχανία οργανισμού.

Α. 2. Το πλασμίδιο pZMO3 του στέλεχος ATCC 10988 του Z. mobilis.

Όλα τα στελέχη του Z. mobilis περιέχουν φυσικά πλασμίδια, τα οποία είναι

ιδιαίτερα σταθερά. Ορισμένα από τα πλασμίδια αυτά έχουν χρησιμοποιηθεί για τη

κατασκευή ανασυνδιασμένων φορέων, με σκοπό να αυξηθεί το εύρος των

υποστρωμάτων ζύμωσης, ώστε να χρησιμοποιηθούν σε βιομηχανικό επίπεδο για τη

παραγωγή αιθανόλης από το βακτήριο αυτό.

Το στέλεχος ATCC 10988 (ZM6) του Z. mobilis φέρει το μεγαλύτερο αριθμό

φυσικών πλασμιδίων. Αυτό το στέλεχος περιέχει τουλάχιστον έξι πλασμίδια, pZMO1,

pZMO2, pZMO3, pZMO4, pZMO5 και pZMO6, με μοριακά βάρη 1.6, 1.9, 2.7, 7.3,

16.7 και 31.6 kb, αντίστοιχα (Drainas et. al., 1983). Η παρούσα εργασία

επικεντρώνεται στο πλασμίδιο pZMO3.

Το πλασμίδιο pZMO3, μεγέθους 2.7 kb, έχει μία μονή θέση SphI και δε

παρουσιάζει ομολογία στην ακολουθία νουκλεοτιδίων με τα πλασμίδια pZMO1 και

pZMO2 (Scordaki and Drainas, 1987). Ακόμα, περιέχει μοναδικές θέσεις για τις

περιοριστικές ενδονουκλεάσες BglI και HindIII και τουλάχιστον τέσσερις θέσεις για

Sau3A. Η έναρξη της αντιγραφής βρίσκεται εντός του 1.54 kb Sau3A θραύσματος

(Scordaki and Drainas, 1990) (σχήμα 1).

Το pZM2 είναι το πρώτο πλασμίδιο του Z. mobilis που πραγματοποιήθηκε ο

προσδιορισμός της αλληλουχίας του (Misawa and Nakamura, 1989). Πρόσφατα,

βρέθηκε ότι το πλασμίδιο pZMO3 του στελέχους ATCC 10988 του Z. mobilis είναι

ισοδύναμο με το pZM2, συμπέρασμα που βασίστηκε σε ανάλυση περιορισμού και

δεδομένα αλληλουχίας νουκλεοτιδίων (Scordaki and Drainas, 1990: Arvanitis et. al.,

1995). Το pZM2, επομένως και το ταυτόσημο pZMO3, περιέχουν δύο ανοιχτά

πλαίσια ανάγνωσης (ORF1 και ORF2) που κωδικοποιούν για δύο πολυπεπτίδια,

μεγέθους 584 και 184 αμινοξέων, αντίστοιχα (Misawa and Nakamura, 1989) όπως

φαίνεται στο σχήμα 1.

Η έναρξη της αρίθμηση των νουκλεοτιδίων αρχίζει από το 5΄ άκρο που

βρίσκεται η αλληλουχία αναγνώρισης από το περιοριστικό ένζυμο HindIII (θέση 1).

Πιθανά στοιχεία προαγωγού (-35: TAGACC, -10: TATAAT) βρίσκονται στις θέσεις

2.423 bp έως 2.428 bp και 2.450 bp έως 2.555 bp, αντίστοιχα και η θέση πρόσδεσης

ριβοσώματος (AGC ή AGG) στη θέση 2.481 bp (σχήμα 2). Οι περιοχές ORF1 και

99

ORF2 που κωδικοποιούν για τα δύο πολυπεπτίδια βρίσκονται στις θέσεις 423-

2.177bp και 2.494-299 bp, αντίστοιχα (σχήμα 1).

Σχήμα 1: Χαρτογράφηση του πλασμιδίου pZMO3. Στο χάρτη αυτό φαίνονται οι θέσεις που αναγνωρίζουν τα περιοριστικά ένζυμα. Με το μικρότερο βέλος σημειώνεται η περιοχή κωδικοποίησης ORF2 και το μεγαλύτερο δείχνει τη περιοχή ORF1. Οι αριθμοί σε κόκκινο δείχνουν την αρχή και τέλος κάθε περιοχής ORF.

Α. 3. Ικανότητα κινητοποίησης του πλασμιδίου pZMO3

Το πλασμίδιο pZMO3 είναι ικανό να προκαλεί κινητοποίηση σε pUC19 σε

Escherichia coli μέσω επιβοηθούμενης βακτηριακής σύζευξης (Arvanitis et. al.,

1995). Το προϊόν που κωδικοποιείται από το ORF1, παρουσιάζει ομολογία στην

αλληλουχία αμινοξέων με κινητοποιήσιμες πρωτεΐνες Gram-θετικών και Gram-

αρνητικών βακτηρίων (Arvanitis et. al., 1995). Το 1999, πραγματοποιήθηκε

προσδιορισμός της ελάχιστης περιοχής που είναι απαραίτητη για τη διαδικασία της

κινητοποίησης και προσδιορίστηκε η θέση της oriT περιοχής του pZMO3 (Afendra

et.al., 1999). Έτσι, βρέθηκε ότι: (α) η περιοχή ORF1 είναι απαραίτητη για

κινητοποίηση, (β) η περιοχή καθοδικά του κωδικωνίου τερματισμού του ORF1 δεν

είναι απαραίτητη για κινητοποιήση και (γ) η περιοχή έναρξης της μεταφοράς oriT

τοποθετείται εντός της περιοχής ανοδικά του ORF1.

Επί πρόσθετα, στην ίδια μελέτη (Afendra et. al., 1999) δείχθηκε ότι η

κινητοποίηση του pZMO3 σε στελέχη E. coli απαιτεί δύο στοιχεία: (α) την πρωτεΐνη

κινητοποίησης που κωδικοποιείται από ORF1, η οποία δρα in trans και (β) την

περιοχή που βρίσκεται ανοδικά του ORF1, η οποία δρα in cis. Επίσης, μετά από

σύγκριση της αλληλουχίας του ORF1 με άλλα γονίδια (Arvanitis et. al., 1995),

διαπιστώθηκε ομοιότητα αλληλουχίας με άλλες ριλαξάσες, όπως με αυτή του

100

πλασμιδίου pMV158 (Priebe and Lacks, 1989) και του πλασμιδίου pTB19 (Oskam et.

al., 1991). Έτσι, η ομοιότητα με γνωστές ριλαξάσες καθώς και η ικανότητα

κινητοποίησης, δείχνουν ότι το προϊόν του ORF1 μπορεί να είναι μια ριλαξάση.

Η περιοχή έναρξη της μεταφοράς oriT, όπως προαναφέρθηκε, αποδείχθηκε

ότι βρίσκεται μεταξύ των νουλεοτιδίων 111 και 519 (Afendra et.al., 1999). Δύο

διαφορετικά τμήματα αυτής της περιοχής δείχνουν ομολογία με oriT περιοχές άλλων

κινητοποιήσιμων ή συζευκτικών πλασμιδίων (σχήμα 2). Το πρώτο τμήμα βρίσκεται

στη κωδικεύουσα περιοχή του ORF2 (θέσεις 190-199) και παρουσιάζει ομολογία με

την περιοχή oriT Gram θετικών βακτηρίων, των pUB110 και pMV118 (McKenzie et.

al., 1987; Priebe and Lacks, 1989). Το δεύτερο τμήμα τοποθετείται ανοδικά του

ORF1 (θέσεις 185 και 304), είναι πλούσιο σε ΑΤ ζεύγη, περιέχει δύο αντίστροφες

επαναλήψεις και εντός της οποίας παρατηρούνται τρεις περιοχές με ομολογία με την

συγκαταβατική αλληλουχία IncP (Lanka and Wilkins, 1995).

Σχήμα 2: αλληλουχία νουκλεοτιδίων τμήματος του pZMO3 (θέσεις 105-524) (Misawa and Nakamura 1989). Οι τέσσερις περιοχές με ομολογία με γνωστές oriT σημειώνονται I-IV και με σκούρα γράμματα. Αλληλουχίες προαγωγού (-35, CTAGGG, -10, TATTTC) και θέση πρόσδεσης του ριβοσώματος (AGC) είναι υπογραμμισμένες. Με βέλη σημειώνονται οι ανάστροφες επαναλήψεις.

Εντούτοις, κανένα από τα παραπάνω τμήματα που δείχνουν ομολογία με

γνωστές περιοχές oriT δεν είναι αρκετό για να επιτευχθεί η διαδικασία της

κινητοποίησης, δείχνοντας ότι και τα δύο τμήματα περιέχουν την ελάχιστη

λειτουργική oriT. Πιθανόν η λειτουργική oriT περιλαμβάνει και τα δύο τμήματα, είτε

περιλαμβάνει μια περιοχή oriT μη ομόλογη με άλλες γνωστές περιοχές (Afendra et.

al., 1999).

101

Α. 4. Ανταλλαγή γενετικού υλικού σε βακτήρια.

Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των βακτηρίων, η ικανότητα των βακτηρίων να

επιβιώνουν σε νέες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να εξηγηθεί με το φαινόμενο

της οριζόντιας μεταφοράς νέων γονιδίων. Έχουν αναφερθεί τρεις μηχανισμοί

οριζόντιας μεταφοράς (Davison J., 1999), με τους οποίους τα βακτήρια μπορούν να

ανταλλάσσουν γενετικό υλικό: α) μετασχηματισμός, κατά τον οποίο σε ένα

βακτηριακό κύτταρο εισάγεται “γυμνό” DNA και κατόπιν εκφράζεται η γενετική

πληροφορία που μεταφέρθηκε, β) μεταγωγή, είναι το φαινόμενο κατά το οποίο τμήμα

χρωμοσώματος ενός βακτηρίου μπορεί να μεταφερθεί σε ένα άλλο βακτήριο πάνω

στο χρωμόσωμα ενός φάγου, που παίζει το ρόλο του φορέα και γ) σύζευξη. Η

βακτηριακή σύζευξη απαιτεί επαφή των κυττάρων που συμμετέχουν στη διαδικασία.

Δότης ονομάζεται το κύτταρο που μεταδίδει το γενετικό υλικό και δέκτης το κύτταρο

που το αποδέχεται και μπορεί να διακριθεί σε αρκετούς τύπους: α) μεταφορά ενός

αυτόνομα μεταβιβάσιμου συζευκτικού πλασμιδίου με κλασσικό παράδειγμα το F-

πλασμίδιο και το πλασμίδιο RP4 του E. coli, β) συνενσωμάτωση, όπου δύο

διαφορετικά κυκλικά πλασμίδια μπορούν να συγχωνεύονται ώστε να γίνουν ένα, γ)

κινητοποίηση (mobilization) που θα μας απασχολήσει σε αυτή την εργασία, δ)

βακτηριακή σύζευξη μπορεί να πραγματοποιηθεί από συζευκτικά τρανσποζόνια

(Clewell et. al., 1995), τα οποία χρησιμοποιούν τους μηχανισμούς της πλασμιδιακής

κινητοποίησης και το σχηματισμό συνενσωματώματος.

Α. 5. Βακτηριακή σύζευξη

Σύμφωνα με το γενικό μοντέλο της βακτηριακής σύζευξης δύο διαφορετικά

κύτταρα έρχονται σε άμεση επαφή και μεταφέρεται μέρος των γενετικών ιδιοτήτων

του ενός κυττάρου (δότης) στο άλλο (δέκτης). Το φαινόμενο αυτό επάγεται από ένα

πλασμίδιο του δότη που ονομάζεται συζευκτικό πλασμίδιο και διαθέτει μια ομάδα

γονιδίων υπεύθυνων για τις εξής λειτουργίες:

1. κωδικοποιούν το σχηματισμό συζευκτικών τριχιδίων τα οποία καταλήγουν σε

ειδικούς υποδοχείς του δέκτη, με αποτέλεσμα το σχηματισμό μιας συνδετικής

κυτταροπλασματικής γέφυρας μεταξύ των δύο κυττάρων (pilin genes).

2. επάγουν ένα είδος αντιγραφής DNA (κυλιόμενου κύκλου) αποτέλεσμα της

οποίας είναι η μεταβίβαση ενός αντιγράφου του συζευκτικού πλασμιδίου, από το

κύτταρο δότη στο κύτταρο δέκτη. Η αντιγραφή πραγματοποιείται ως εξής: τα

κύτταρα έρχονται σε επαφή με ανάκληση του συζευκτικού τριχιδίου από το

102

κύτταρο δότη (Lanka E. and Wilkins B. M., 1995). Η γένεση του μονού κλώνου,

Τ-κλώνου, που πρόκειται να μεταφερθεί περιλαμβάνει κόψιμο σε μία μοναδική

“nick” θέση εντός της περιοχής oriT (origin of transfer) που καταλύεται από μια

πρωτεΐνη που καλείται ρηλαξάση. Η αντίδραση που καταλύεται από τη ριλαξάση

είναι μια τρανσεστεροποίηση. Κατά την αντίδραση αυτή, ο Τ-κλώνος συνδέεται

ομοιοπολικά στο 5΄ άκρο του με τη ριλαξάση, σχηματίζοντας το σύμπλοκο

έναρξης της βακτηριακής σύζευξης, το ριλαξόσωμα. Αυτό το ομοιοπολικό

σύμπλοκο λειτουργεί ως ενδιάμεσο στη μεταφορά. Ο Τ-κλώνος, μεταβιβάζεται

σε κατεύθυνση 5΄→3΄ στο κύτταρο δέκτη. Μετά το τέλος της μεταβίβασης του Τ-

κλώνου στο κύτταρο-δέκτη, τα άκρα του μεταφερόμενου κλώνου συνδέονται και

σχηματίζεται ένα κυκλικό DNA μόριο. Η βακτηριακή σύζευξη ολοκληρώνεται με

αντιγραφή από το ολοένζυμο DNA πολυμεράση III για να δημιουργηθεί ένα

αντίγραφο του πλασμιδίου στο κύτταρο δότη και ένα στο κύτταρο δέκτη (Lanka

E. and Wilkins B. M., 1995). Με τον τρόπο αυτό η αλυσίδα του συζευκτικού

πλασμιδίου του δότη που μεταβιβάζεται στο κύτταρο δέκτη, αναπαράγεται σε

πλήρες πλασμίδιο, μετατρέποντας το κύτταρο δέκτη σε δότη.

Χαρακτηριστικό παράδειγμα πλασμιδίου που ακολουθεί το μοντέλο της

βακτηριακής σύζευξης αποτελεί αυτό του πλασμιδίου F (σχήμα 3).

Σχήμα 3: Μοντέλο βακτηριακής σύζευξης του πλασμιδίου F. Ένας ειδικός κλώνος του πλασμιδίου κόβεται στην περιοχή oriT από την ενδονουκλεάση traYZ και μεταφέρεται κατά την κατεύθυνση 5΄→3΄ δια μέσου ενός πόρου. Η αλυσίδα που παραμένει στο κύτταρο δότη φαίνεται με λεπτή γραμμή. Η DNA ελικάση I μεταναστεύει στο μεταφερόμενο κλώνο προκειμένου να εκτυλίσσει το πλασμιδιακό δίκλωνο DNA. Η μεταφορά του DNA ολοκληρώνεται με σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας στο κύτταρο δότη και στο

103

κύτταρο δέκτη: και οι δύο διαδικασίες απαιτούν την σύνθεση πριμοδότη και το ολοένζυμο DNA πολυμεράση III (Willets N. And Wilkins B., 1984).

Το πλασμίδιο F είναι σχετικά μεγάλο σε μέγεθος (95-100kb) και περιέχει

γονίδια που συμβάλλουν στο σχηματισμό των συζευκτικών ινιδίων (sex pili). Τα

ινίδια αυτά χρησιμοποιούνται από κύτταρο που περιέχει το πλασμίδιο F (F+

βακτήριο) ώστε αυτό να προσκολληθεί σε ένα βακτήριο που δεν διαθέτει πλασμίδιο F

(F- βακτήριο). Διαμέσου αυτών των ινιδίων περνά ένα αντίγραφο, ο κλώνος Τ, του

πλασμιδίου F στο F- βακτήριο, το οποίο μετατρέπεται και αυτό σε βακτήριο F+. O Τ-

κλώνος του πλασμιδίου κόβεται στην περιοχή oriT από την ενδονουκλεάση traYZ και

μεταφέρεται κατά την κατεύθυνση 5΄→3΄ δια μέσου ενός πόρου. Η μεταφορά του

DNA ολοκληρώνεται με σύνθεση ενός συμπληρωματικού κλώνου στο κύτταρο δότη

και στο κύτταρο δέκτη: και οι δύο διαδικασίες απαιτούν την σύνθεση πριμοδότη και

το ολοένζυμο DNA πολυμεράση III (Willets N. αnd Wilkins B., 1984) (σχήμα 3).

Α. 6. Επιβοηθούμενη βακτηριακή σύζευξη ή συζευκτική παρακίνηση ή

κινητοποίηση (mobilization)

Στην επιβοηθούμενη βακτηριακή σύζευξη συμμετέχουν πλασμίδια, τα οποία

χαρακτηρίζονται κινητοποιήσιμα. Τα κινητοποιήσιμα πλασμίδια δεν έχουν τη

δυνατότητα να δημιουργήσουν συζευκτικά τριχίδια, διαθέτουν όμως αλληλουχίες

(mob περιοχή) που είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά τους από τον ξενιστή σε ένα

άλλο κύτταρο. Προϋπόθεση αποτελεί η συνύπαρξή τους με ένα συζευκτικό

πλασμίδιο. Έτσι, όταν δημιουργηθούν οι συνθήκες σύζευξης, παράλληλα με το

συζευκτικό πλασμίδιο μεταφέρεται και το κινητοποιήσιμο πλασμίδιο, με

μηχανισμούς μεταφοράς παρόμοιους με αυτούς του συζευκτικού πλασμιδίου. Τα

κινητοποιήσιμα πλασμίδια κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη κινητοποίησης, η οποία

επιδρά πάνω σε συγκεκριμένο σημείο (nick site) των αλληλουχιών κινητοποίησης

(oriT) του κινητοποίησιμου πλασμιδίου. Στο σημείο αυτό η πρωτεΐνη κόβει τη μια

αλυσίδα του κινητοποιήσιμου πλασμιδίου και μέσω της κυτταροπλασματικής

γέφυρας μεταφέρεται η αλυσίδα αυτή στο κύτταρο-δέκτη (Lanka E. and Wilkins B.

M., 1995).

Τα κινητοποιήσιμα πλασμίδια διακρίνονται σε : α) αυτό-κινητοποιήσιμα (self-

mobilizable), όταν περιέχουν όλες τις απαραίτητες για την κινητοποίηση αλληλουχίες

και απαιτούν την συνύπαρξη ενός βοηθητικού συζευκτικού πλασμιδίου και β) σε μη

104

αυτό-κινητοποιήσιμα πλασμίδια που απαιτούν τη συνύπαρξη ενός συζευκτικού

πλασμιδίου και ενός αυτό-κινητοποιήσιμου πλασμιδίου (Δραΐνας Κ., 1991).

Οι αλληλουχίες που είναι υπεύθυνες για την κινητοποίηση είναι δύο ειδών: α)

αλληλουχίες που κωδικοποιούν μία πρωτεΐνη κινητοποίησης, Μob και β)

αλληλουχίες οι οποίες αναγνωρίζονται από τη πρωτεΐνη κινητοποίησης, περιοχή oriT.

Τα αυτό-κινητοποιήσιμα πλασμίδια περιέχουν και τα δύο είδη αλληλουχιών, ενώ τα

μη αυτό-κινητοποιήσιμα περιέχουν μόνο τις δεύτερες. Τα συζευκτικά πλασμίδια, για

να διακρίνονται από τα κινητοποιήσιμα, καλούνται επίσης και αυτό-μεταβιβάσιμα

(self-transmissible) (Δραΐνας Κ., 1991).

Χαρακτηριστικά παραδείγματα κινητοποιήσιμων πλασμιδίων αποτελούν τα

RSF1010, ColE1 και CloDF13. Το πλασμίδιο RSF1010 (8.7kb) έχει συγκεντρώσει

έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον, καθώς αποτελεί το κύριο αντιπρόσωπο της IncQ

κατηγορίας πλασμιδίων ευρέως φάσματος ξενιστών. Τα IncQ πλασμίδια

παρακινούνται από τα P, I, W, M και X-τύπου συζευκτικά συστήματα σε μια

εντυπωσιακή πληθώρα δεκτών, ενώ έχει εξίσου παρατηρηθεί και μεταφορά τους σε

φυτικά κύτταρα (Buchanan-Wollaston et. al., 1987). Το πλασμίδιο RSF1010

κωδικοποιεί για τρεις πρωτεΐνες κινητοποίησης, Mob (mobilization), τις MobA,

MobB και MobC οι οποίες όλες λειτουργούν στο σύμπλοκο χαλάρωσης των

πλασμιδίων. Αξιοσημείωτος, στο RSF1010, είναι ο εντοπισμός των λειτουργιών

κινητοποίησης και αναδιπλασιασμού στην ίδια περιοχή: η πρωτεΐνη MobA (RepB)

δρα με το C- άκρο ως πριμάση της περιοχής oriV και με το Ν-άκρο ως τυπική

ενδονουκλεάση της περιοχής oriT (nickase) (Derbyshire et. al., 1987).

A. 7. Φύση των περιοχών έναρξης της μεταφοράς, oriT.

Το υπόστρωμα DNA στην αντίδραση της ριλαξάσης είναι η περιοχή έναρξης

της μεταφοράς, oriT. Η δομή της περιοχής oriT μελετήθηκε σε συγκεκριμένα

πλασμίδια από εντεροβακτήρια (Lanka E. and Wilkins B. M., 1995)και έχει δειχθεί

ότι οι περιοχές oriTs τοποθετούνται στο μεταφερόμενο γονιδιακό σύμπλοκο και

συμπεριλαμβάνουν διαγονιδιακά τμήματα με μέγεθος μεγαλύτερο από 500 bp.

Οι περιοχές έναρξης της μεταφοράς oriTs έχουν αρκετές κοινές ιδιότητες:

1. έχουν υψηλό περιεχόμενο ΑΤ σε σχέση με γειτονικές περιοχές, πιθανόν

διευκολύνουν το διαχωρισμό των κλώνων σε υπερελικωμένο DNA.

2. χαρτογραφούνται ασύμμετρα σε σχέση με τα γονίδια μεταφοράς, tra, έτσι ώστε η

πλειοψηφία των γονιδίων μεταφοράς εισέρχονται τελευταία στο κύτταρο δέκτη.

105

3. παρουσιάζουν εκτεταμένη δευτεροταγή δομή που οφείλεται σε άμεσες και

έμμεσες επαναλήψεις νουκλεοτιδικών αλληλουχιών. Στα πλασμίδια F και RP4

αυτή η δευτεροταγή δομή λειτουργεί ως θέση αναγνώρισης για συγκεκριμένες

DNA-προσδεόμενες αλληλουχίες.

4. περιέχουν ενδογενής καμπές–κλίσεις ως δυναμικές θέσεις για τη πρόσδεση

πρωτεϊνών, ώστε να ενεργοποιηθεί η περιοχή oriT και να γίνει ευκολότερη η

πρόσβαση των πρωτεϊνών στο σημείο nick.

5. περιέχει προαγωγούς για την έκφραση των γονιδίων μεταφοράς tra.

Η περιοχή nick, ορίζεται ως η θέση αναγνώρισης για τη ριλαξάση και είναι

μια μικρή περιοχή περίπου 10 νουκλεοτιδίων (Pansegrau, W., and Lanka, E.1996).

Αξιοσημείωτες ομοιότητες είναι ανιχνεύσιμες στη περιοχή nick μεταξύ διαφορετικών

κινητοποιήσιμων πλασμιδίων. Κατά την αντίδραση της τρανσεστεροποίησης, εντός

της περιοχής nick ένας συγκεκριμένος φωσφοδιεστερικός δεσμός κόβεται μεταξύ δύο

διαφορετικών νουκλεοτιδίων στις περισσότερες περιπτώσεις GC ή TG.

A. 8. Αντίδραση τρανσεστεροποίησης που καταλύεται από ριλαξάση.

Η ριλαξάση (Byrd D. R. and Matson S. W., 1997) είναι υπεύθυνη για το

κόψιμο του φωσφοδιεστερικού δεσμού στη θέση “nick” του Τ-κλώνου. Η αντίδραση

που καταλύεται από μια ριλαξάση καλείται τρανσεστεροποίηση. Από χημική άποψη

ο Τ-κλώνος που είναι κομμένος στη θέση “nick”, φέρει ένα μη τροποποιημένο 3΄-ΟΗ

άκρο και τη ριλαξάση ομοιοπολικά συνδεδεμένη στο τροποποιημένο 5΄-PO4 άκρο. Η

ριλαξάση προσδένεται ομοιοπολικά στο 5΄ άκρο του κομμένου DNA κλώνου δια

μέσου μιας φωσφοτυροσυλικής σύνδεσης (Guiney and Helinski, 1975). Η βιοχημεία

της αντίδρασης που καταλύεται από μια ρηλαξάση είναι παρόμοια με αυτή της

αντίδρασης που καταλύεται από τη τοποϊσομεράση ΙΑ (Wang, J., 1996). Η αντίδραση

της τρανσεστεροποίησης, περιλαμβάνει το σχηματισμό ενός ενδιάμεσου συμπλόκου,

του ρηλαξοσώματος, που συνίσταται από τη ριλαξάση, την ενζυμικά δραστική μορφή

του συμπλόκου και από πρωτεΐνες με ένα βοηθητικό ρόλο στην αντίδραση της

τρανσεστεροποιήσης.

Η ομοιοπολικά συνδεδεμένη ριλαξάση είναι ειδική για κάθε πλασμίδιο π.χ.

για το συζευκτικό πλασμίδιο RP4 είναι η traI, ενώ για το κινητοποιήσιμο πλασμίδιο

RSF1010 είναι η ΜobA (Matson, S., et. al., 1983; Pansegrau, W., et. al., 1990;

Scerzinger, E., et. al., 1992).

106

Το επόμενο βήμα στην αντίδραση τρανσεστεροποίησης, είναι η χαλάρωση

(ξετύλιγμα του DNA) (unwinding) της κομμένης στη θέση nick αλυσίδας από την

άθικτη συμπληρωματική αλυσίδα (Byrd D. R. and Matson S. W., 1997). Η χαλάρωση

πιστεύεται ότι συμπληρώνεται από μια DNA ελικάση είτε από ριλαξάσες (π.χ.

πλασμίδιο F, TraI) που έχουν δραστικότητα ελικάσης. Οι ριλαξάσες αυτές έχουν δύο

λειτουργικές περιοχές, μια αμινο-τελική περιοχή με ιδιότητα ριλαξάσης και μια

καρβόξυ-τελική περιοχή με ιδιότητα ελικάσης. Άλλες ριλαξάσες δεν έχουν

δραστικότητα ελικάσης και η ελικάση που συμμετέχει στην χαλάρωση του T-DNA

από τη συμπληρωματική αλυσίδα δεν είναι γνωστή. Πιθανόν να πρόκειται για

ελικάση που συμμετέχει στην διαδικασία της αντιγραφής του DΝA και να είναι

υπεύθυνη για την αντίδραση της χαλάρωσης (Lanka E. and Wilkins B. M., 1995).

Οι ριλαξάσες, όπως περιγράφηκαν παραπάνω, παρουσιάζουν συντηρημένες

περιοχές αμινοξέων με τις πρωτεΐνες RCR (Konberg and Baker, 1992), που δρουν

στην έναρξη αντιγραφής του πλασμιδίου. Και σε αυτή την περίπτωση η πρωτεΐνη

ρεπλικάση αναγνωρίζει τη κατάλληλη θέση σε μία από τις δύο αλυσίδες του DNA και

σε μια αντίδραση τρανσεστεροποίησης δημιουργεί ένα κόψιμο στο DNA σκελετό σε

συγκεκριμένη θέση.

Γενικά η αντίδραση ριλαξάσης σε μονόκλωνα ολιγονουκλεοτιδικά

υποστρώματα απαιτεί (Lanka E. and Wilkins B. M., 1995):

1. η nick περιοχή να έχει μήκος 10 νουκλεοτίδια

2. απαιτεί ιόντα Mg2+

3. δεν απαιτεί ούτε διεγείρεται από βοηθητικές πρωτεΐνες

4. παρουσιάζει τη κλασσική συμπεριφορά μιας αντίδρασης ισορροπίας

5. σχηματίζεται ομοιοπολική σύνδεση της πρωτεΐνης στο Τ-κλώνο δια μέσου

αντίδρασης τρανσεστεροποίησης.

6. η αντίδραση καταλύεται από την αμινο-τελική περιοχή του ενζύμου της

ριλαξάσης.

Οι ιδιότητες της αντίδρασης ριλαξάσης που προαναφέρθηκε προέρχονται από

ενζυμικές αναλύσεις των πρωτεϊνών TraI, TraI, VirD2, MobA των πλασμιδίων F,

RP4, Ti και RSF1010, αντίστοιχα (Pansegrau W., et. al., 1993; Scerzinger, E., et. al.,

1993; Pansegrau, W., et. al., 1993; Sherman J. A. and Matson S. W., 1994).

107

Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ.

Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της πρωτεΐνης κινητοποίησης,

που κωδικοποιείται από την περιοχή ORF1, του πλασμιδίου pZMO3 του στέλεχος

ATCC 10988 του Z. mobilis. Η ομοιότητα με γνωστές ριλαξάσες (Arvanitis et. al.,

1995) καθώς και η ικανότητα κινητοποίησης, δείχνουν ότι το προϊόν του ORF1

μπορεί να είναι μια ρηλαξάση.

Σκοπός είναι η κατασκευή κλώνου που να περιέχει τη περιοχή ORF1 του

pUZMO3.11 ενθετιμένη εντός ενός φορέα υπερέκφρασης, προκειμένου να επιτευχθεί

η υπερέκφραση της πρωτεΐνης κινητοποίησης και να αναλυθεί ως προς τη δομή και

λειτουργία της.

108

Γ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Γ. 1. Πλασμίδια.

Η κατασκευή κλώνου που να περιέχει τη περιοχή ORF1 του pZMO3

ενθετιμένη εντός ενός φορέα υπερέκφρασης, προκειμένου να επιτευχθεί η

υπερέκφραση της πρωτεΐνης κινητοποίησης, πραγματοποιείται ως εξής: το γονίδιο

της περιοχής ORF1, που κωδικοποιεί για μία πρωτεΐνη κινητοποίησης, του

πλασμιδίου pZMO3, υποκλωνοποιείται στον φορέα υπερέκφρασης pET3d. Οι φορείς

pET3a-d είναι τα πιο δυναμικά συστήματα για κλωνοποίηση και υπερέκφραση των

ανασυνδιασμένων πρωτεϊνών σε κύτταρα E. coli. Τα γονίδια στόχοι κλωνοποιούνται

σε πλασμίδια pET υπό τον έλεγχο ενός ισχυρού Τ7 μεταγραφικού και μεταφραστικού

συστήματος. Η έκφραση επάγεται από την Τ7 RNA πολυμεράση. Τα γονίδια στόχοι

αρχικά κλωνοποιούνται σε φορείς pET και εισάγονται σε ξενιστές που δεν περιέχουν

Τ7 RNA πολυμεράση, έτσι τα γονίδια δεν εκφράζονται και στην περίπτωση που τα

προϊόντα των γονιδίων είναι τοξικά, αποτρέπεται η καταστροφή των κυττάρων. Στη

συνέχεια τα πλασμίδια μεταφέρονται σε ξενιστές που περιέχουν ένα χρωμοσωμικό

αντίγραφο της Τ7 RNA πολυμεράσης γονιδίου υπό τον έλεγχο του lacUV5, και η

έκφραση επάγεται με προσθήκη IPTG.

Σε μια πρώτη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκαν τα πλασμίδια pET3dNCO ή

pETNCO το οποίο είναι ανθεκτικό σε αμπικιλλίνη και H2km2 (pDELZ3.13) που είναι

ανθεκτικό σε καναμικίνη.

Σχήμα 4: Χάρτης του πλασμιδίου pET-3d. Με βέλη δείχνεται η ένθεση του τμήματος NcoI (414 bp)-NcoI (1247 bp), με μέγεθος 834 bp. Το πλασμίδιο pETNCO συνίσταται από το

NcoI (414bp)

NcoI (1247bp)

NdeI

109

πλασμίδιο pET3d στο οποίο ενθέτεται στη θέση NcoI, τμήμα που ενισχύθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, PCR. Το μέγεθος του πλασμιδίου pETNCO είναι 5.471 bp.

Το πλασμίδιο pETNCO κατασκευάστηκε ως εξής: με αλυσιδωτή αντίδρασης

πολυμεράσης (PCR), ενισχύθηκε το τμήμα, 414 bp-1247 bp του πλασμιδίου pZMO3

και το τμήμα αυτό κλωνοποιήθηκε σε θέση NcoI στο πλασμίδιο pET3d (σχήμα 4). Το

μέγεθος του πλασμιδίου pETNCO είναι 5.471 bp (Αφένδρα Α., μη δημοσιευμένα

αποτελέσματα).

Λόγω αποτυχίας της παραπάνω πορείας αλλάχθηκε στρατηγική και

χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο pZMO3.11. Το πλασμίδιο pZMO3.11 προέρχεται

μετά από σύνδεση του πλασμιδίου pUZMO3 (με γκρι χρώμα) και του πλασμιδίου

pUC19 (χωρίς χρώμα) (σχήμα 5). Το πλασμίδιο pUC19 είναι ένα μικρό, με υψηλό

Σχήμα 5: Χάρτης του πλασμιδίου pZMO3.11. Το πλασμίδιο pZMO3.11 αποτελείται από το πλασμίδιο pUZMO3 (γκρι) και το πλασμίδιο pUC19 (λευκό).

αριθμό αντιγράφων πλασμίδιο του E. coli. Χρησιμοποιείται ως φορέας κλωνοποίησης

και έχει μέγεθος 2.686 bp. Ο χάρτης του πλασμιδίου pZMO3.11 δείχνει μερικές

περιοριστικές θέσεις, τις αλληλουχίες που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες και την

περιοχή έναρξης αντιγραφής του pUC19.

110

Γ. 2. Ανάπτυξη βακτηρίων σε υγρή καλλιέργεια και σε στερεό θρεπτικό υλικό.

Τα βακτηριακά στελέχη αναπτύσσονται σε θρεπτικό μέσο L.B Broth (Luria,

Bertani broth) (1% τρυπτόνη, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, pH 8.0 με NaOH)

σύμφωνα με τους Sambrook et. al.,1982.

Για ανάπτυξη καλλιεργειών σε στερεό θρεπτικό μέσο προστίθεται στο

παραπάνω υγρό θρεπτικό υλικό, 2% άγαρ. Το άγαρ είναι ένας φυσικός

πολυσακχαρίτης (αποτελείται κυρίως από D-γαλακτόζη, 3,6-άνυδρο-L-γαλακτόζη και

D-γλυκουρονικό οξύ). Η ικανότητα του να δρα ως στερεοποιητικός παράγοντας

οφείλεται στην ιδιότητα του να τήκεται σε θερμοκρασία βρασμού του νερού και να

στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία πέφτει κάτω από τους 40-42οC. Το άγαρ είναι

επίσης ένας καλός στερεοποιητικός παράγοντας επειδή οι περισσότεροι

μικροοργανισμοί δεν μπορούν να το αποικοδομήσουν.

Ο χειρισμός βιολογικών υλικών (προκαρυωτικά ή ευκαρυωτικά κύτταρα)

συνήθως απαιτεί ασηπτικές συνθήκες εργασίας. Στόχος των ασηπτικών συνθηκών

είναι η αποφυγή μολύνσεων του προς μελέτη βιολογικού υλικού από εξωγενείς

παράγοντες. Για το λόγο αυτό, τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται πρέπει να

είναι αποστειρωμένα. Η μέθοδος αποστείρωσης που χρησιμοποιείται για τα θρεπτικά

υλικά είναι η υγρή αποστείρωση. Πραγματοποιείται σε αυτόκαυστα, όπου στις

συσκευές αυτές αναπτύσσεται θερμοκρασία 121οC και πίεση 1.1 atm, για 15-20

λεπτά.

Οι υγρές βακτηριακές καλλιέργειες αναπτύσσονται στους 37οC υπό ανάδευση.

Ενώ, οι καλλιέργειες σε στερεό θρεπτικό μέσο αναπτύσσονται σε επωαστικό κλίβανο

στους 37οC.

Καναμυκίνη (50 μg/ml), αμπικιλλίνη (100 μg/ml) προστίθεται στο μέσο

ανάπτυξης όταν είναι απαραίτητο. Όλα τα στελέχη Z. mobilis παρουσιάζουν

ευαισθησία σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από 50 μg/ml καναμυκίνη, 5 μg/ml

ριφαμπικίνη ή 10 μg/ml τετρακυκλίνη και ανθεκτικότητα σε 100 μg/ml αμπικιλίνη.

Γ. 3. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA.

Η απομόνωση πλασμιδιακού DNA πραγματοποιήθηκε στα πλασμίδια που

αναφέρθηκαν παραπάνω (παράγραφος Γ.1) με το JETSTAR Plasmid Maxiprep Kit

της εταιρείας GENOMED Inc. USA. Η μέθοδος αποτελεί μια τροποποιημένη μορφή

της αλκαλικής λύσης των κυττάρων.

111

Ανάπτυξη 300 ml υγρής καλλιέργειας E. coli στους 37 οC για μία νύχτα. Το

πρώτο βήμα στη διαδικασία αυτή είναι η εξισορρόπηση της στήλης με 30ml

διαλύματος Ε4 (600mM NaCl, 100mM CH3COONa, 0.15% TritonX-100, pH 5.0 με

CH3COOH). Τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντριση σε φυγόκεντρο Sorvall, με

κεφαλή GS-3, στις 8.000 rpm, στους 4οC, για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα

επαναιωρούνται σε 10 ml διαλύματος Ε1 (50mM Tris, 10mM EDTA, pH 8.0 με HCl)

και ακολουθεί πολύ καλή ανάδευση μέχρι να ομογενοποιηθεί το εναιώρημα. Η

κυτταρική λύση πραγματοποιείται με προσθήκη 10 ml διαλύματος Ε2 (200mM

NaOH, 1%w/v SDS) και προσεκτική ανακίνηση μέχρι πλήρη ομογενοποίηση.

Ουδετεροποίηση με 10 ml διαλύματος Ε3 (3.1M CH3COOΚ, pH 5.5 με CH3COOH),

προσεκτική ανακίνηση και φυγοκέντριση στους 20οC στις 15.000xg για 10 λεπτά σε

φυγόκεντρο Sorvall.

Μετά την ουδετεροποίηση το μίγμα των λυμένων κυττάρων περνάει από την

στήλη ιοντοανταλλακτικής ρητίνης. Ακολουθεί έκπλυση της στήλης μια φορά με 60

ml διαλύματος Ε5 (800mM NaCl, 100mM CH3COONa, pH 5.0 με CH3COOH) και

κατόπιν έκλουση του δεσμευμένου DNA από τη στήλη με 15 ml διαλύματος Ε6

(1.250 mM NaCl, 100 mM Tris, pH 8.5 με HCl). Μετά την έκλουση από τη στήλη, το

DNA καταβυθίζεται με 10.5 ml ισοπροπυλικής αλκοόλης. Ακολουθεί φυγοκέντριση

στους 4οC στις 15.000xg για 30 λεπτά σε φυγόκεντρο Sorvall. Το πλασμιδιακό DNA

εκπλένεται με 70% αιθανόλη, φυγοκεντρείται στις ίδιες συνθήκες, ακολουθεί

ξήρανση του δείγματος στους 37οC και επαναδιάλυση του σε 300 μl TE10 pH 8.0

(10mM Tris–HCl pH 7.6, 0.1mM EDTA pH 8.0). Το DNA που απομονώθηκε

φυλάσσεται στους 4οC σε μικροφυγοκεντρικά φιαλίδια. Η περιεκτικότητα του

δείγματος σε DNA μπορεί να υπολογιστεί με μέτρηση της απορρόφησής του στα 260

nm με βάση τη σχέση: οπτική πυκνότητα (OD)260 ίση με τη μονάδα αντιστοιχεί σε 50

μg/ml διαλύματος DNA.

Γ. 4. Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς.

Η κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακό φορέα περιλαμβάνει τα ακόλουθα

στάδια:

1. Δημιουργία κολλώδων άκρων μεταξύ του πλασμιδιακού φορέα και του

ενθέματος DNA. Προϋπόθεση είναι η ύπαρξη συμπληρωματικών κολλωδών

άκρων. Αυτό επιτυγχάνεται μετά από πέψη με το ίδιο περιοριστικό ένζυμο.

112

2. Το DNA τμήμα εισάγεται στο πλασμίδιο με τη βοήθεια του ενζύμου Τ4 DNA-

λιγάσης, με το οποίο επιτυγχάνεται σύνδεση των άκρων του φορέα και του

ενθέματος DNA.

3. Μετασχηματισμός: τα μόρια του ανασυνδιασμένου DNA μπορούν να

εισαχθούν σε κατάλληλα βακτηριακά κύτταρα.

4. Επιλογή των βακτηριακών κυτάρων που φέρουν το ανασυνδιασμένο

πλασμίδιο γίνεται συνήθως με χρήση αντιβιοτικών.

Γ. 4. 1. Πέψη πλασμιδιακού DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες.

Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι βακτηριακά ένζυμα, που

αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες DNA 4-8 ζευγών βάσεων, που καλούνται

περιοριστικές θέσεις. Τα ένζυμα αυτά υδρολύουν ένα φωσφοδιεστερικό δεσμό σε

κάθε αλυσίδα της περιοχής αυτής και κόβουν τη διπλή έλικα DNA κατά δύο τρόπους.

Ο ένας είναι με τη δημιουργία μιας ουράς μονής αλυσίδας και στα δύο κομμένα άκρα

τα οποία ονομάζονται κολλώδη άκρα και ο άλλος είναι με τη δημιουργία απότομων

άκρων που δεν περιέχει μονές αλυσίδες.

Η πέψη του DNA (Sambrook et. al.,1982) πραγματοποιείται με προσθήκη

1/10 του όγκου κατάλληλου ρυθμιστικού διάλυματος, απαπαίτητο για τη δράση της

περιοπριστικής ενδονουκλεάσης 2-10U/μl του κατάλληλου ενζύμου και το DNA που

θα υποστεί πέψη (0,5-1 μg). Το μίγμα συμπληρώνεται με dsH2O, φυγοκεντρείται για

2-3 sec ώστε να συγκεντρωθεί στο πυθμένα του μικροφυγοκεντρικού σωλήνα και

επωάζεται σε υδατόλουτρο στους 37οC για 2-3 ώρες.

Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε 0.9 % πήγμα αγαρόζης και απομόνωση της

ζώνης που μας ενδιαφέρει με κόψιμο του πήγματος με τη βοήθεια αποστειρωμένου

νυστεριού. Τα μεγέθη των ζωνών DNA που προκύπτουν, υπολογίζονται

συγκρίνοντας τις αποστάσεις που διανύουν στο πήγμα αγαρόζης, με τις αποστάσεις

πρότυπων ζωνών DNA γνωστού μοριακού βάρους. Ως πρότυπο μοριακών βαρών

χρησιμοποιήθηκε DNA του φάγου λ που είχε υποστεί πέψη με HindIII.

Γ. 4. 2. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήγμα αγαρόζης.

Η ηλεκτροφόρηση σε πήγμα αγαρόζης χρησιμοποιείται για να διαχωρίσει

μόρια DNA. Τα μόρια DNA είναι φορτισμένα αρνητικά επειδή η φωσφορική ομάδα

κάθε νουκλεοτιδίου φέρει ένα αρνητικό φορτίο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα μόρια

του DNA να κινούνται προς το θετικό ηλεκτρόδιο κατά τη διάρκεια της

113

ηλεκτροφόρησης. Για την ανίχνευση των ζωνών του DNA το πήγμα επωάζεται σε

διάλυμα που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο, ένα επίπεδο μόριο που συνδέεται με το

DNA. Έτσι επίδραση του πήγματος με υπεριώδη ακτινοβολία, έχει ως αποτέλεσμα οι

περιοχές του πήγματος που περιέχουν το DNA να φαίνονται ως ροδόχρουν ζώνες και

να διαχωρίζονται από τις περιοχές που δεν έχουν DNA.

Στα δείγματα DNA που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν προστίθεται

ρυθμιστικό διάλυμα χρωστικής (0.25% w/v κυανούν βρωμοφαινόλης, 0.25% w/v

κυανολικό ξυλένιο, 30% γλυκερίνη) σε αναλογία όγκων 5:1. Ως πρότυπο μοριακού

βάρους χρησιμοποιήθηκε DNA του φάγου λ που είχε υποστεί πέψη με την

περιοριστική ενδονουκλεάση HindIII. Η πέψη αυτή δίνει τα εξης περιοριστικά

θραύσματα: 23.13, 9.42, 6.56, 4.36, 2.32, 2.03, 0.56 και 0.12 kb.

Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε ρυθμιστικό διάλυμα 1xΤΑΕ (50xTAE: 40 mM

Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0) σε τάση 1-4volts/cm.

Στο τέλος της ηλεκτροφόρησης το πήγμα τοποθετείται σε συσκευή

υπεριώδους ακτινοβολίας (302nm) όπου το σύμπλοκο DNA-βρωμιούχου αιθιδίου

είναι ορατό. Τα μεγέθη που προκύπτουν υπολογίζονται συγκρίνοντας τις αποστάσεις

που διανύουν με τις αποστάσεις πρότυπων ζωνών DNA γνωστού μοριακού βάρους.

Γ. 4. 3. Απομόνωση DNA από πήγμα αγαρόζης.

Η απομόνωση του DNA από το πήγμα αγαρόζης πραγματοποιήθηκε με τη

παρακάτω διαδικασία:

Η ζώνη του τμήματος DNA που μας ενδιαφέρει, τοποθετήθηκε σε

προζυγισμένο μικροφυγοκεντρικό σωληνάκι και υπολογίστηκε το βάρος του. Στη

συνέχεια προστέθηκαν 2 όγκοι 6 Μ NaI και το δείγμα επωάστηκε για 5min στους

55οC. Κάθε 2 λεπτά αναμιγνύεται το δείγμα σε συσκευή ανάδευσης για να διαλυθεί η

πηκτή. Κατόπιν προστέθηκαν 10μl αιωρήματος silica matrix, ακολούθησε επώαση

για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου και ανάμιξη κάθε 2 λεπτά, ώστε να προσδεθεί το

DNA στο Glassmilk.

Ακολούθησε φυγοκέντριση για 1min σε μικροφυγόκεντρο, αποχύθηκε το

υπερκείμενο και εκπλύθηκε το σύμπλεγμα silica matrix -DNA δύο φορές με 500μl

διαλύματος έκπλυσης (washing solution: 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH 7.5,

2.5mM EDTA, 50% v/v ethanol). Μετά τη τελευταία έκπλυση και αφού αφαιρέθηκε

τελείως το υπερκείμενο, ακολούθησε ξήρανση του δείγματος. Στη συνέχεια το ίζημα

επαναιωρήθηκε σε 10μl Η2Ο (ίσης ποσότητας με αυτή του Glassmilk), επωάστηκε

114

για 2min στους 55οC, φυγοκεντρήθηκε για 30sec και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε

νέο eppendorf όπου και φυλάσσεται στους 4οC.

Γ. 4. 4. Σύνδεση περιοριστικών τμημάτων DNA.

Στην τεχνολογία του ανασυνδιασμένου DNA, η DNA λιγάση χρησιμοποιείται

για να ενώσει ομοιοπολικά τα άκρα περιοριστικών θραυσμάτων. Αυτό το ένζυμο

μπορεί να καταλύσει τη δημιουργία ενός 3΄→5΄φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ

του 3΄-υδροξιλικού άκρου ενός περιοριστικού θραύσματος και του 5΄-φωσφορικού

άκρου ενός άλλος θραύσματος, που είναι συμπληρωματικά.

Κατά τη διαδικασία σύνδεσης περιοριστικών τμημάτων (Sambrook et. al.,

1982) σε μικροφυγοκεντρικό σωλήνα προστίθεται με τη σειρά που δίνονται: 2μl

ρυθμιστικού διαλύματος λιγάσης, 0.2μg ευθυγραμμισμένο πλασμίδιο, 0.8 μg DNA

που πρόκειται να εισαχθεί εντός του πλαμιδιακού DNA, dsH2O μέχρι ο τελικός όγκος

της αντίδρασης να είναι 20μl και 1μl ένζυμο T4 DNA λιγάση. Το μίγμα της

αντίδρασης φυγοκεντρείται για 2-3 sec, ώστε να συγκεντρωθεί στο πυθμένα του

μικροφυγοκεντρικού σωλήνα και επωάζεται σε υδατόλουτρο στους 16οC για 4-12

ώρες.

Γ. 4. 5. Μετασχηματισμός του βακτηρίου E. coli DH5a με πλασμιδιακό DNA.

Η μέθοδος αυτή του μετασχηματισμού βασίζεται στην πρόσληψη

πλασμιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα, τα οποία έχουν καταστεί επιδεκτικά

μετά από επίδραση με ιόντα ασβεστίου (Kushner et. al., 1978). Η διαδικασία που

ακολουθείται είναι η εξής:

Εμβολιάζεται μονή αποικία DH5a από τρυβλίο σε φιαλίδιο με 5ml LB και

ανάπτυξη όλη τη νύχτα στους 37οC υπό ανάδευση. Την επόμενη μέρα αραιώνεται η

καλλιέργεια κυττάρων, με ανάπτυξη 200 μl της καλλιέργειας DH5a σε 5ml LB,

μέχρις ότου η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας στα 600 nm να γίνει 0.1-0.2.

Σε μικροφυγοκεντρικούς σωλήνες φυγοκεντρούνται 1.5 ml καλλιέργειας στις

12.000 rpm για 1min. Στη συνέχει τα κύτταρα εκπλένονται με 1ml διαλύματος

πλύσεως Δ1 (10mM RbCl, 10mM MOPS, pH 7.0) και ακολουθεί φυγοκέντριση στις

ίδιες συνθήκες.

Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 1 ml διαλύματος ασβεστίου Δ2

(10mM RbCl, 100mM MOPS pH 6.5, 50mM CaCl2) και επωάζεται για 30 min σε

115

υγρό πάγο. Το εναιώρημα φυγοκεντρείται στις 12.000 rpm για 1 min και το ίζημα

επαναιωρείται πολύ ήπια σε 100 μl διαλύματος Δ2.

Ακολουθεί προσθήκη 10 μl του πλασμιδιακού DNA (ανασυνδιασμένο DNA)

στα βακτηριακά κύτταρα DH5a.

Το εναιώρημα των κυττάρων τοποθετείται σε υγρό πάγο για 30 min και

ακολουθεί θερμικό σοκ με την τοποθέτηση του μικροφυγοκεντρικού σωλήνα σε

υδατόλουτρο στους 43.5οC για 45 δευτερόλεπτα.

Το κυτταρικό εναιώρημα εμβολιάζεται σε 1-2 ml πλούσιου θρεπτικού υλικού

LΒ, και επωάζεται για 1 ώρα στους 37οC, έτσι ώστε τα κύτταρα να αναρρώσουν και

να τους δοθεί ο χρόνος να αντιγράψουν και να εκφράσουν το πλασμιδιακό DNA.

Μετά την ανάρρωση των κυττάρων, γίνεται εμβολιασμός 0.2 ml από τη

παραπάνω καλλιέργεια σε στερεό θρεπτικό μέσο, που περιέχει το κατάλληλο

αντιβιοτικό ως μέσο επιλογής μετασχηματισμένων κυττάρων. Στη συγκεκριμένη

περίπτωση είναι η αμπικιλίνη. Ανθεκτικές αποικίες εμφανίζονται στο τριβλίο μετά

περίπου 18 ώρες επώασης.

Γ. 4. 6. Επιλογή αποικιών που περιέχουν τα μετασχηματισμένα κύτταρα.

Το φαινόμενο του μετασχηματισμού επιτρέπει σε πλασμιδιακούς φορείς να

εισαχθούν και να εκφραστούν μέσα σε βακτηριακά κύτταρα του E. coli. Επιλογή

βακτηριακών κυττάρων που περιέχουν το ανασυνδιασμένο πλασμίδιο μπορεί να γίνει

με τη χρήση αντιβιοτικών ή με τη χρήση γονιδίων αναφοράς. Στη συγκεκριμένη

περίπτωση ο φορέας που χρησιμοποιούμε pET3d φέρει το γονίδιο που δίνει

ανθεκτικότητα στην αμπικιλίνη (ampR). Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί για την β-

λακταμάση, η οποία αδρανοποιεί την αμπικιλίνη. Έτσι τα κύτταρα του E. coli που

προσέλαβαν το πλασμιδιακό DNA, αναπτύσσουν αποικίες σε θρεπτικό υπόστρωμα

που περιέχει αμπικιλίνη και μπορούν εύκολα να επιλεγούν μέσα από ένα μεγαλύτερο

αριθμό κυττάρων που δεν περιέχουν το πλασμιδιακό φορέα και δεν αναπτύσσονται.

Γ. 4. 7. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από E. coli DH5a.

Σε 2ml LB που περιέχει αμπικιλίνη ως αντιβιοτικό, εμβολιάζεται μονή

αποικία κυττάρων E. coli DH5a, που έχουν μετασχηματιστεί με το πλασμιδιακό DNA

που πρόκειται να απομονωθεί. Η καλλιέργεια αναπτύσσεται στους 37 οC όλη τη

νύχτα υπό ανάδευση.

116

Σε μικροφυγοκεντρικό σωλήνα μεταφέρονται 1.5 ml καλλιέργειας και

φυγοκεντρούνται στις 12.000 rpm για 2 min σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα

επαναιωρούνται σε 100 μl διαλύματος I (50 mM γλυκόζη, 25 mM Tris pH 8.0, 10

mM EDTA, 5 mg/ml λυσοζύμη) για τη διάσπαση του κυτταρικού τοιχώματος και

ακολουθεί επώαση 5 min σε θερμοκρασία δωματίου.

Στη συνέχεια προστίθεται 200 μl διαλύματος II (0.2 N NaOH, 1% SDS) για τη

διάσπαση της κυτταρικής μεμβράνης, ακολουθεί ήπια ανάδευση και επώαση σε πάγο

για 5 min. Κατόπιν προστίθεται 150 μl διαλύματος III (3 M CH3COOK, 2 M

CH3COOH) και ακολουθεί ήπια ανάδευση και επώαση σε πάγο για 5min. Με τη

προσθήκη του διαλύματος III επιτυγχάνεται η καταβύθιση του χρωμοσωμικού DNA,

ένω το πλασμιδιακό παραμένει στο εναιώρημα.

Το μίγμα φυγοκεντρείται στις 12.000-15.000 rpm για 10 λεπτά σε

θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια 400 μl από το υπερκείμενο μεταφέρονται σε

νέο μικροφυγοκεντρικό σωλήνα, προστίθεται 320 μl ισοπροπυλικής αλκοόλης και

επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντριση στις

14.000 rpm για 10 λεπτά.

Το ίζημα επαναιωρείται σε 300 μl TE10 pH 8.0 (10mM Tris–HCl pH 7.6,

0.1mM EDTA pH 8.0) και 1.5 μl διαλύματος RNAάσης 10 μg/ml και επωάζεται για

30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.

Κατόπιν το πλασμιδιακό DNA καταβυθίζεται με 30 μl CH3COONa pH 5.5,

800 μl 95% ψυχρής αιθανόλης και επώαση στους -80 οC για 45 λεπτά.

Ακολουθεί φυγοκέντριση στις 14.000 rpm για 15 λεπτά στους 4οC, έκπλυση

του ιζήματος με 100 μl 70% αιθανόλη, ξήρανση του ιζήματος στους 37οC και

επαναιώρηση σε 55 μl αποστειρωμένου dH2O.

Γ. 5. Κλωνοποίηση με το TA Cloning Kit της εταιρείας Invitrogen

Στο δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση

του γονιδίου της ριλαξάσης της περιοχής ORF1 του πλασμιδίου pZMO3.11, με το TA

Cloning Kit της εταιρείας Invitrogen. Η μέθοδος βασίζεται σε πέντε στάδια:

1. Ενίσχυση του γονιδίου της ριλαξάσης με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης,

PCR με τις συνθήκες που αναφέρονται στη παράγραφο Δ. 1.

2. Σύνδεση του προϊόντος PCR στο πλασμίδιο pCR2.1, για τη παραγωγή

ανασυνδυασμένου DNA.

117

3. Ακολουθεί μετασχηματισμός του παραπάνω ανασυνδυασμένου προϊόντος

εντός επιδεκτικών κυττάρων που προσφέρονται από την εταιρεία.

4. Επιλογή των κατάλληλων αποικιών και ακολουθεί απομόνωση του

πλασμιδιακού DNA για περαιτέρω ανάλυση.

5. Ανάλυση του πλασμιδιακού DNA για τη παρουσία και τη κατεύθυνση του

προϊόντος PCR με ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα ή με αλληλούχιση.

Γ. 5. 1. Ενίσχυση DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

(PCR).

Πραγματοποιήθηκε ενίσχυση της περιοχής ORF1 του πλασμιδίου pZMO3.11,

που κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη κινητοποίησης, με τη τεχνική της αλυσιδωτής

αντίδρασης πολυμεράσης, PCR. Το πλασμίδιο pZMO3.11 προέρχεται από σύνδεση

του πλασμιδίου pUZMO3 και του πλασμιδίου pUC19 (παράγραφος Γ. 1).

Ακολούθησαν επαναλαμβανόμενες προσπάθειες για να καθοριστούν οι βέλτιστες

συνθήκες για την ενίσχυση του γονιδίου της ριλαξάσης, οι οποίες βέλτιστες συνθήκες

φαίνονται στη συνέχεια (στα αποτελέσματα).

Πειραματική πορεία:

Το μίγμα αντιδρώντων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, PCR για την

ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της ριλαξάσης περιλαμβάνει: MgCl2 50 mM,

κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα 10x (DNA polymerase buffer), ισομοριακό μίγμα

dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNTP mix) και Taq πολυμεράση 5 U/μl. Επίσης, το

μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει το πλασμίδιο DNA pZMO3.11 ως εκμαγείο και

το ζεύγος των εκκινητών με την εξής αλληλουχία:

Εκκινητής pNCO1: 5΄-ΑGΤ ΤΑΑ ΑCC ATG GCG AAC TAT GCA ATC-3΄

Εκκινητής pZMO3-end: 5΄-ACT GGG ATC CCG TCT ATC GCA CTT TC-3΄

Στην παρούσα αντίδραση το ζεύγος των ολιγονουκλεοτιδίων σχεδιάστηκε με

βάση την αλληλουχία DNA του pZM2, ένα 2.7kb πλασμίδιο του Z. Mobilis

ATCC10988 (Misawa and Nakamura 1989) που είναι ισοδύναμο με το πλασμίδιο

pZMO3 του στελέχους ATCC 10988 (σχήμα 4). Ο εκκινητής pNCO1 αντιστοιχεί στη

βάση 427 έως τη θέση 440 και ο δεύτερος εκκινητής pZMO3-end στη βάση 1.829

έως τη βάση 1.814 (σχήμα 6).

Κατά τη διάρκεια των θερμικών κύκλων της PCR το μίγμα αρχικά

αποδιατάσσεται. Κατόπιν το μίγμα επωάζεται σε 30 θερμικούς κύκλους που

περιλαμβάνουν τρία βήματα: αποδιάταξη–πρόσδεση–επιμήκυνση. Το στάδιο της

118

πρόσδεσης είναι πολύ σημαντικό για την επιτυχή πρόσδεση των εκκινητών στο DNA

και δοκιμάστηκαν θερμοκρασίες από 48οC έως 58οC.

Οι εκκινητές αραιώθηκαν με TE10 σε τελική συγκέντρωση 20μΜ για κάθε

ολιγονουκλεοτίδιο. Το μίγμα των τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοσιδίων (dNTP’s mix)

περιλαμβάνει 2.5mΜ από κάθε dNTP.

Οι τελικές συνθήκες της PCR αντίδρασης παρουσιάζονται στη παράγραφο Δ. 1.

Τα προϊόντα της αντίδρασης ηλεκτροφορούνται σε πηκτή 0.8% αγαρόζης και

αφαιρείται από τη πηκτή η ζώνη του προϊόντος PCR. Ακολουθεί καθαρισμός DNA

από πηκτή αγαρόζης όπως περιγράφεται στη παράγραφο Γ. 6.

Γ. 5. 2. Κλωνοποίηση εντός pCR2.1 του προϊόντος PCR.

Η αντίδραση σύνδεσης δύο τμημάτων DNA με τη βοήθεια του ενζύμου

λιγάση, βασίζεται στις αρχές που αναφέρθηκαν στη παράγραφο Γ. 7.

Χρησιμοποιήθηκε πρόσφατα παρασκευασμένο προϊόν PCR για τη κλωνοποίηση,

επειδή τα 3΄ Α-εξέχοντα άκρα του προϊόντος PCR αποδομούνται με το πέρασμα του

χρόνου. Ο pCR2.1 φορέας είναι ευθυγραμμισμένος με 3΄ Τ-εξέχοντα άκρα. Για τη

πραγματοποίηση της αντίδρασης σε μικροφυγοκεντρικό σωλήνα προστίθεται τα εξής

με τη σειρά που δίνονται: 1 μl του pCR2.1 φορέα (50 ng/μl), κατάλληλος όγκο

προϊόντος PCR ώστε να υπάρχει αναλογία συγκέντρωσης φορέα:ένθεμα 1:3 (150

ng/μl), 1 μl ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης (1x), κατάλληλο όγκο αποστειρωμένου

νερού ώστε ο τελικός όγκος της αντίδρασης να είναι 10μl, 1μl Τ4 DNA λιγάση (4.0

units). Οι συγκεντρώσεις στην παρένθεση δείχνουν τις τελικές συγκεντρώσεις των

αντιδρώντων. Τα αντιδρώντα που χρησιμοποιήθηκαν για την αντίδραση της

σύνδεσης, περιέχονται στο TA Cloning Kit της εταιρείας Invitrogen.

Το μίγμα της αντίδρασης φυγοκεντρείται για 2-3 sec, ώστε να συγκεντρωθεί

στο πυθμένα του μικροφυγοκεντρικού σωλήνα και επωάζεται σε υδατόλουτρο στους

14οC για 4-12 ώρες.

Γ. 5. 3. Μετασχηματισμός των κυττάρων INVaF΄ με το ανασυνδιασμένο

πλασμιδιακό DNA.

Σε αυτό το σημείο έχουμε ένα ανασυνδιασμένο προϊόν που περιέχει το

ένθεμα, το γονίδιο της ριλαξάσης, εντός του pCR2.1 φορέα, το οποίο πρόκειται να

μετασχηματίσει κύτταρα INVaF΄. Τα κύτταρα INVaF΄ δεν εκφράζουν το lac

καταστολέα, αλλά θα εκφραστεί από το pCR2.1 φορέα απουσία IPTG λόγω της

119

παρουσίας του lac προαγωγού. Το IPTG δεν έχει καμία επίδραση σε κύτταρα

INVaF΄. Προετοιμασία πριν την έναρξη της διαδικασίας: (1) ρύθμιση υδρόλουτρου

στους 42oC, (2) τριβλία με LB θρεπτικό υλικό που περιέχουν 100μg/ml αμπικιλίνη

εξισσοροπούνται στους 37oC και απλώνουμε στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού

20 mg/ml Χ-Gal, (3) φέρεται το μέσο SOC (2% τρυπτόνη, 0.5% εκχύλισμα ζύμης,

100mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2-6H2O, 20 mM γλυκόζη) σε θερμοκρασία

δωματίου.

Κατά τη διαδικασία μετασχηματισμού των επιδεκτικών κυττάρων INVaF΄,

τοποθετείται σε πάγο ένα φιαλίδιο αυτών των κυττάρων που η ποσότητα του

αντιστοιχεί σε ένα μετασχηματισμό. Στο φιαλίδιο αυτό προστίθεται 2 μl από το

ανασυνδιασμένο πλασμίδιο, προσεκτική ανακίνηση και επώαση για 30 λεπτά σε

πάγο. Ακολουθεί θερμικό σοκ για 30 δευτερόλεπτα στους 42oC και τοποθετούμε σε

πάγο.

Το κυτταρικό εναιώρημα εμβολιάζεται σε 250 μl SOC θρεπτικού υλικού, και

επωάζεται για 1 ώρα στους 37οC, έτσι ώστε τα κύτταρα να αναρρώσουν και να τους

δοθεί ο χρόνος να αντιγράψουν και να εκφράσουν το πλασμιδιακό DNA.

Μετά την ανάρρωση των κυττάρων, γίνεται εμβολιασμός 0.2 ml από τη

παραπάνω καλλιέργεια στο στερεό θρεπτικό υλικό, που περιέχει 100μg/ml αμπικιλίνη

και 20mg/ml Χ-Gal. Κύτταρα INVaF΄ που έχουν μετασχηματιστεί από το

ανασυνδιασμένο δόμημα προϊόν PCR-pCR2.1 φορέα δίνουν λευκές αποικίες.

Ανθεκτικές λευκές αποικίες εμφανίζονται στο τριβλίο μετά περίπου 18 ώρες

επώασης.

Γ. 5. 4. Απομόνωση και ανάλυση του ανασυνδιασμένου πλασμιδιακού DNA με

ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα και αλληλούχιση.

Για να προσδιορίσουμε την παρουσία και κατεύθυνση του ενθέματος

επιλέγουμε 10 λευκές αποικίες για πλασμιδιακή απομόνωση και ανάλυση με τη

βοήθεια περιοριστικών ενζύμων. Οι αποικίες αναπτύσσονται όλη τη νύχτα σε 5 ml

LB που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλίνη και ακολουθεί απομόνωση πλασμιδιακού

DNA όπως περιγράφεται στη παράγραφο Γ. 11. Κατόπιν ακολουθεί ανάλυση με το

περιοριστικό ένζυμο, EcoRI. Σύμφωνα με το χάρτη του pCR2.1 φορέα διακρίνονται

δύο EcoRI θέσεις που είναι όμορες με το ενθετιμένο προϊόν PCR σε κάθε πλευρά.

Έτσι επίδραση με το περιοριστικό ένζυμο EcoRI θα προκύψουν δύο DNA τμήματα,

1.441 και 3.885 bp, που αντιστοιχούν στο PCR προϊόν και στο φορέα pCR2.1.

120

Όταν γίνει ο έλεγχος για την απομόνωση του ανασυνδιασμένου πλασμιδίου

πραγματοποιείται αλληλούχιση που αποτελεί το αδιάσειστο κριτήριο επιβεβαίωσης

της επιλογής του ανασυνδιασμένου κλώνου.

Γ. 6. Μεταφορά DNA από πήγμα αγαρόζης σε νάυλον φιλτρο (υβριδισμός κατά

Southern).

Πραγματοποιήθηκε ανίχνευση συγκεκριμένων DNA αλληλουχιών, στη

συγκεκριμένη περίπτωση της περιοχής ORF1, με υβριδισμό, προκειμένου να ελεγχθεί

ότι τα κλωνοποιημένα ανασυνδιασμένα μόρια DNA περιέχουν τη περιοχή αυτή.

Η ανίχνευση χωρίζεται σε τρία τμήματα: α) Ηλεκτροφόρηση του DNA

παρασκευάσματος σε πήγμα αγαρόζης, β) Μεταφορά του DNA από το πήγμα σε

μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (ΝΚ) με φαινόμενα ανοδικής τριχοειδούς μεταφοράς, γ)

Ανάλυση υβριδισμού των ακολουθιών DNA που μας ενδιαφέρουν χρησιμοποιώντας

μη ραδιενεργά σημασμένο DNA ανιχνευτή.

Τα δείγματα του DNA υφίστανται ηλεκτροφόρηση σε πήγμα αγαρόζης όπως

περιγράφεται παραπάνω (παράγραφος Γ. 6). Ακολουθεί μετουσίωση του DNA με

εμβάπτιση του πήγματος σε 500 ml διαλύματος μετουσίωσης (0.5N NaOH, 1.5M

NaCl) για 45 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου και ήπια ανάδευση. Στη συνέχεια το

αλκαλικό περιβάλλον εξουδετερώνεται με εμβάπτιση του πήγματος σε 500 ml

διαλύματος εξουδετέρωσης (1M Tris-HCl pH 8.0, 1.5M NaCl) για 1 ώρα σε

θερμοκρασία δωματίου και με ήπια ανάδευση.

Γ. 7. Μεταφορά του DNA από το πήγμα αγαρόζης σε μεμβράνη νιτρικής

κυτταρίνης.

Στο δοχείο που θα γίνει η μεταφορά, τοποθετήθηκε υάλινη πλάκα που φέρει

στην επιφάνειά της 3 φύλλα διηθητικού χαρτιού Whattman 3MΜ σε σχήμα γέφυρας,

έτσι ώστε οι δύο άκρες του χαρτιού να εφάπτονται στη βάση του δοχείου.

Η μεταφορά πραγματοποιείται σε αρκετή ποσότητα διαλύματος μεταφοράς

10xSSC (20xSSC: 3M NaCl, 0.3M κιτρικό νάτριο). Tα φύλλα του διηθητικού

χαρτιού εμποτίστηκαν με το διάλυμα αυτό και οι φυσαλίδες αέρα απομακρύνθηκαν

με γυάλινη ράβδο. Στη συνέχεια το πήγμα τοποθετήθηκε ανεστραμμένο πάνω στα

φύλλα και οι φυσαλίδες απομακρύνθηκαν όπως προηγουμένως. Στην επιφάνεια του

πήγματος τοποθετήθηκε η μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης (ΝΚ) και δύο φύλλα

διηθητικού χαρτιού τα οποία εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα μεταφοράς 2xSSC και οι

121

φυσαλίδες απομακρύνθηκαν εκ νέου. Στην επιφάνεια των διηθητικών χαρτιών

τοποθετήθηκαν πολλά στρώματα απορροφητικού χαρτιού και στην κορυφή ένα

αντικείμενο βάρους 0,5 kg. Η μεταφορά από το πήγμα στο φίλτρο NK

πραγματοποιήθηκε με φαινόμενα ανοδικής τριχοειδούς μεταφοράς και

ολοκληρώθηκε μετά από 20 h.

Η μεμβράνη ΝΚ στη συνέχεια εμβαπτίζεται σε διάλυμα 6xSSC και

εκπλένεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με πολύ ήπια ανάδευση. Το φίλτρο

τοποθετείται σε επιφάνεια διηθητικού χαρτιού και αφού στεγνώσει πλήρως εκτίθεται

σε υπεριώδη ακτινοβολία (320nm) για 2-3 λεπτά. Με τον τρόπο αυτό το DNA

δεσμεύεται στο φίλτρο με ισχυρούς δεσμούς υδρογόνου.

Γ. 8. Μη ραδιενεργός υβριδισμός DNA-DNA.

Η εταιρεία Roche ανέπτυξε μία μέθοδο μη ραδιενεργής σύνδεσης και

ανίχνευσης του DNA. Στη μέθοδο αυτή χρησιμοποιείται η διγοξυγενίνη (ένα

στεροειδές απτένιο) για την ιχνηθέτηση DNA και RNA. Η μέθοδος αυτή

περιλαμβάνει τρία στάδια:

1. κατασκευή του DNA ιχνηθέτη

2. Σήμανση DNA ιχνηθέτη με digoxigenine-11-dUTP.

3. υβριδισμός του ιχνηθετιμένου DNA με το ακινητοποιημένο DNA σε φίλτρο

4. ανίχνευση του υβριδίου με χρωμογόνο αντίδραση.

Γ. 9. Κατασκευή του DNA ιχνηθέτη

Για τη κατασκευή του DNA ιχνηθέτη χρησιμοποιήθηκε τμήμα του πλασμιδίου

pZMO3.11. Το τμήμα αυτό περιλαμβάνει τμήμα της περιοχής ORF1 του πλασμιδίου

pZMO3 και ένα μικρό τμήμα του pUC19. Χρησιμοποιήθηκαν τα περιοριστικά

ένζυμα HindIII και SphI, αυτά τα ένζυμα κόβουν το DNA με τρόπο που να δίνουν

τμήματα με μεγέθη 1.227 bp, 4.208 bp και 6 bp. Το τμήμα DNA που μας ενδιαφέρει

έχει μέγεθος 1227 bp και περιλαμβάνει τμήμα του ORF1, HindIII (1, 446) έως SphI

(441). Η πέψη του DNA (Sambrook et. al.,1982) πραγματοποιείται όπως

περιγράφεται στη παράγραφο Γ. 4. 1.

Γ. 10. Σήμανση DNA με digoxigenine-11-dUTP (dig-11-dUTP)

Ο μη ραδιενεργός υβριδισμός DNA-DNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο της

εταιρείας Roche έχει ως εξής:

122

Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη δράση του τμήματος klenow της DNA

πολυμεράσης I, που έχει δράση πολυμεράσης στη κατεύθυνση 5΄→3΄, δράση

εξωνουκλεάσης στη κατεύθυνση 3΄→5΄, αλλά δεν έχει δράση εξωνουκλεάσης στη

κατεύθυνση 5΄→3΄. Το δίκλωνο μόριο του DNA αφού μετουσιωθεί και γίνει

μονόκλωνο, με τη βοήθεια του τμήματος klenow της DNA πολυμεράσης I συντίθεται

συμπληρωματικό DNA με αυτό του μονόκλωνου εκμαγείου. Για την έναρξη της

αντιγραφής δίνονται από την εταιρεία πριμοδοτικά μόρια, εξανουκλεοτίδια, τα οποία

συνδέονται με συμπληρωματικές αλληλουχίες των μονόκλωνων μορίων του DNA. Το

ένζυμο της πολυμεράσης αναγνωρίζει αυτές τις δίκλωνες περιοχές ως σημεία έναρξης

του πολυμερισμού και αρχίζει να συνθέτει τη νέα αλυσίδα ενσωματώνοντας και το

σημασμένο digoxigenine-11-dUTP.

Σε μικροφυγοκεντρικό σωληνάκι προστίθεται:

1. Κατάλληλη ποσότητα dH2O, ώστε ο τελικός όγκος της αντίδρασης να είναι 20 μl.

2. 10 ng-30 ng γραμμικού και μετουσιωμένου DNA.

3. 2 μl μίγματος εξανουκλεοτιδίων

4. 2 μl dNTP μίγμα σήμανσης που αποτελείται από dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dig-

11-dUTP pH 6.5.

Το μίγμα της αντίδρασης φυγοκεντρείται για 1-2 sec και επωάζεται στους

37οC για 15-20 ώρες. Η αντίδραση τερματίζεται με τη προσθήκη 2 μl 0.2M EDTA pH

8.0. Η καταβύθιση γίνεται με προσθήκη 2.5 μl LiCl 4M και 75 μl ψυχρής αιθανόλης

και παραμονή για 30 λεπτά στους -80οC. Το διάλυμα στη συνέχεια φυγοκεντρείται

στις 1.200 rpm/ 4oC/ 10min. Ακολουθεί έκπλυση του ιζήματος με 70% αιθανόλη και

φυγοκέντριση όπως προηγουμένως. Το ίζημα ξηραίνεται και διαλύεται σε 50μl TE

στους 37οC για 30 λεπτά. Προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα διαλύματος

προϋβριδισμού και το σημασμένο DNA μετουσιώνεται πριν χρησιμοποιηθεί με 10

λεπτά βρασμό στους 95οC και 10 λεπτά παραμονή σε πάγο.

Γ. 11. Υβριδισμός του ιχνηθέτη DNA με το ακινητοποιημένο DNA.

Αρχικά πραγματοποιείται προϋβριδισμός, που περιλαμβάνει επώαση της

μεμβράνης με διάλυμα προϋβριδισμού (5xSSC, 0.1% w/v N-λαυροϋλοσαρκονικό

νάτριο, 0.02% w/v SDS, 1%) (20 ml διαλύματος προϋβριδισμού για 100 cm2). Το

στάδιο του προϋβριδισμού ολοκληρώνεται με επώαση της μεμβράνης με το

παραπάνω διάλυμα, υπό περιστροφή, στους 68οC για 3 ώρες.

123

Μετά την ολοκλήρωση του προϋβριδισμού αφαιρείται το διάλυμα και

ακολουθεί ο υβριδισμός. Το διάλυμα υβριδισμού περιέχει το σημασμένο ανιχνευτή,

που έχουμε παρασκευάσει. Το στάδιο του υβριδισμού πραγματοποιείται όπως

προηγουμένως σε κλίβανο υβριδισμού στους 68οC για 18 ώρες.

Μετά το τέλος του υβριδισμού, το φίλτρο εκπλένεται αρχικά 2 φορές για 5

λεπτά (η κάθε πλύση) με 50 ml διαλύματος πλύσης I (2xSSC, 0.1% w/v SDS) και στη

συνέχεια 2 φορές για 15 λεπτά (η κάθε πλύση) στους 68οC με διάλυμα πλύσης II

(0.1xSSC, 0.1% w/v SDS).

Γ. 12. Εκπλύσεις και χρωμογόνος αντίδραση.

Η μεμβράνη υφίσταται εκπλύσεις σε θερμοκρασία δωματίου αρχικά με

διάλυμα I (100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5) για 1 λεπτό, στη συνέχεια για 30

λεπτά με διάλυμα II (0.5% w/v αντιδραστήριο αποκλεισμού σε διάλυμα I,

παρασκευάζεται στους 50οC-70οC, μία ώρα πριν χρησιμοποιηθεί). Ακολουθεί

έκπλυση με διάλυμα I για 1 λεπτό.

Στη συνέχεια, παρασκευάζεται το διάλυμα με το αντίσωμα (antibody-

conjugated solution) με διάλυση 4 μl του αντισώματος σε 20 ml διαλύματος I. Ως

αντίσωμα χρησιμοποιείται το fab τμήμα του αντισώματος της αντιδιγοξυγενίνης,

συνδεδεμένο με αλκαλική φωσφατάση (Anti-dioxigenin-AP, fab fragment).

Πραγματοποιήθηκε επώαση του φίλτρου με 20 ml διαλύματος με το αντίσωμα για 30

λεπτά και κατόπιν απομακρύνθηκε το μη συνεζευγμένο αντίσωμα με πλύσεις με

διάλυμα I, δύο φορές για 15 λεπτά.

Η ανίχνευση του υβριδίου γίνεται με χρωμογόνο αντίδραση. Το φίλτρο

εξισορροπήθηκε με διάλυμα IV (100mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 50mM MgCl2 pH

9.5). Στη συνέχεια, το φίλτρο επωάζεται στο σκοτάδι χωρίς ανάδευση με 10 ml

χρωμογόνου διαλύματος. Όταν εμφανιστούν οι επιθυμητές ζώνες το φίλτρο

εκπλένεται με 50 ml διαλύματος V (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) και

αφήνεται να στεγνώσει.

124

Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Δ. 1. Κλωνοποίηση της πρωτεΐνης κινητοποίησης στο φορέα υπρέκφρασης

pET3d.

Σκοπός είναι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης κινητοποίησης που

κωδικοποιείται από τη περιοχή ORF1, του πλασμιδίου pZMO3. Η στρατηγική για την

επίτευξη του στόχου είναι: το γονίδιο της περιοχής ORF1, του pZMO3,

υποκλωνοποιείται στον φορέα υπερέκφρασης pET3d, που είναι ένα δυναμικό

σύστημα για κλωνοποίηση και υπερέκφραση ανασυνδιασμένων πρωτεϊνών σε

κύτταρα E. coli.

Μια πρώτη προσσέγγιση του στόχου αυτού ήταν να εισέλθει εντός του

πλασμιδίου pETNCO (παράγραφος Γ.1) ένα τμήμα της περιοχής του pZMO3, που

περιλαμβάνει την ελάχιστη περιοχή που απαιτείται για τη διαδικασία της

κινητοποίησης και περιλαμβάνει τη περιοχή ORF1 (H2km2) (Afendra et. al., 1999),

ώστε να δομηθεί το πλασμιδιακό δόμημα pET3dH2km2. Το πλασμίδιο pETNCO

υπέστει πέψη με NdeI και BamHI, οπότε προκύπτει τμήμα 4676 bp, που συνδέεται με

το τμήμα NdeI/BglII του πλασμιδίου H2km2, μεγέθους 1300 bp. Μετά τη σύνδεση

των δύο τμημάτων αναμένεται να προκύψει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο

pET3dH2km2 με μέγεθος 5976 bp. Ακολουθεί μετασχηματισμός σε DH5a κύτταρα

και ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα που αναγνωρίζουν το αναμενόμενο

ανασυνδιασμένο πλασμίδιο σε μοναδικές θέσεις.

Με την επιλογή αυτού του τρόπου, για την επίτευξη της κλωνοποίησης της

πρωτεΐνης κινητοποίησης, δεν κατέστη δυνατό να προκύψουν ανασυνδιασμένοι

κλώνοι. Για το λόγο αυτό έγινε αλλαγή στρατηγικής που αναφέρεται αναλυτικά στο

κεφάλαιο υλικά και μέθοδοι (παράγραφο Γ.1) και τα αποτελέσματα της οποίας

φαίνονται παρακάτω.

Δ. 2. Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της ριλαξάσης της περιοχής ORF1.

Πραγματοποιήθηκε ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της ριλαξάσης, από το

πλασμιδιακό DNA pZMO3.11, με τη τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης

πολυμεράσης, PCR.

Στην παρούσα αντίδραση το ζεύγος των ολιγονουκλεοτιδίων σχεδιάστηκε με

βάση την αλληλουχία DNA του pZM2, ένα 2.7kb πλασμίδιο του Z. Mobilis

ATCC10988 (Misawa and Nakamura 1989) που είναι ισοδύναμο με το πλασμίδιο

pZMO3 του στελέχους ATCC 10988 (σχήμα 6). Ο εκκινητής pNCO1 αντιστοιχεί στη

125

βάση 427 έως τη θέση 440 και ο δεύτερος εκκινητής pZMO3-end στη βάση 1.829

έως τη βάση 1.814. Έτσι, ενισχύεται τμήμα της περιοχής ORF1, με μέγεθος περίπου

1.426bp.

Σχήμα 6: Χάρτης του πλασμιδίου pZMO3. Οι αριθμοί που είναι τοποθετημένοι κάθετα δείχνουν την αρχή και το τέλος κάθε περιοχής ORF. Τα μικρά βέλη δείχνουν τη κατεύθυνση μεταγραφής των κωδικεύουσων περιοχών. Τα μεγαλύτερα βέλη δείχνουν τις θέσεις που προσδένονται οι εκκινητές, βάση 427 έως 440 και ο δεύτερος εκκινητής στη βάση 1.814 έως 1.829, επομένως και το τμήμα του DNA που ενισχύεται.

Οι συνθήκες για την αντίδραση PCR, καθορίστηκαν μετά από

επαναλαμβανόμενες αντιδράσεις, στις οποίες μελετήθηκαν οι σημαντικότερες

μεταβλητές της αντίδρασης (πίνακας 1).

Πίνακας 1: Οι μεταβολές που πραγματοποιήθηκαν στη συγκέντρωση των αντιδρώντων και στις συνθήκες της αντίδρασης PCR. Μεταβλήθηκαν: η συγκέντρωση του εκμαγείου DNA μεταξύ 5 έως 10 ng/μl, η συγκέντρωση του MgCl2 μεταξύ 1.5 έως 4.0 mM, η συγκέντρωση των εκκινητών μεταξύ 0.1 και 1μΜ και η θερμοκρασία πρόσδεσης των εκκινητών μεταξύ 48 έως 58 οC.

Μεταβλητές της αντίδρασης Εύρος τιμών

Ποσότητα DNA 5, 10 ng/μl

Συγκέντρωση των ιόντων Μαγνησίου 1.5, 1.75, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 mM

Θερμοκρασία πρόσδεσης των εκκινητών 48, 50, 52, 55, 58, οC

Εκκινητές 0.1, 0.5, 1μΜ

Η θερμοκρασία πρόσδεσης των εκκινητών καθορίστηκε μετά από

επαναλαμβανόμενες αντιδράσεις με δοκιμές σε ένα εύρος μεταξύ 48 έως 58°C, η

θερμοκρασία πρόσδεσης των εκκινητών με το DNA στόχο καθορίστηκε στους 52°C.

Οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν καθώς και οι τελικές

συνθήκες του θερμοκρασιακού προγράμματος της αντίδρασης PCR φαίνονται στους

πίνακες 2 και 3.

126

Πίνακας 2: Συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Οι τελικές συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων της αντίδρασης PCR που χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχυθεί το επιθυμητό τμήμα του γονιδίου της ρηλαξάσης.

*Cstock: η συγκέντρωση των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκε.

Πίνακας 3: Συνθήκες του προγράμματος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Οι τελικές συνθήκες του προγράμματος της αντίδρασης PCR, όπου καταλήξαμε μετά από επαναλαμβανόμενα πειράματα με αλλαγές της θερμοκρασίας πρόσδεσης των εκκινητών μεταξύ 48-58 0C.

Θερμοκρασίες Χρόνος

Αρχική μετουσίωση 95 0C 5 min

Μετουσίωση 95 0C 1 min

Πρόσδεση 52 0C 1 min

Επιμήκυνση 72 0C 1 min

Τελική επιμήκυνση 72 0C 10 min

Κύκλοι 30

Στην εικόνα 1 φαίνονται τα προϊόντα της αντίδρασης PCR μετά από

ηλεκτροφόρηση σε πήγμα αγαρόζης 0.8%. Ως πρότυπο μοριακού βάρους

χρησιμοποιήθηκε DNA του φάγου λ που είχε υποστεί πέψη με την περιοριστική

ενδονουκλεάση HindIII. Η πέψη αυτή δίνει τα εξής περιοριστικά θραύσματα: 23.13,

9.42, 6.56, 4.36, 2.32, 2.03, 0.56 και 0.12 kb. Παρατηρούνται (εικόνα 1) στα δείγματα

που ενισχύθηκαν, με τη τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, ζώνες

Συστατικά Όγκος Cαντίδρασης Cstock*

DNA δείγματα 1 μl 5 ng/μl 500 ng/μl

PCR buffer 10x 10 μl 1 x 10 x

DNTP’s mix 10 μl 1 mM 10 mM

MgCl2 8 μl 2 mM 25 mM

Primer pZMO3-end 10 μl 1 μΜ 10 μΜ

Primer pNCO1 5 μl 1 μΜ 20 μΜ

Taq plymerase 0.8 μl 4 U/100μl 5 U/μl

dd H2O 57.2 μl

Total 100 μl

1

127

μεγέθους περίπου 1.426 bp. Αυτό σημαίνει ότι πραγματοποιήθηκε ενίσχυση τμήματος

της περιοχής ORF1 με μέγεθος 1.426 bp ζεύγη βάσεων.

Εικόνα 1: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων μετά από αντίδραση PCR σε πήγμα αγαρόζης 0.8%. Στις διαδρομές 2 και 3 απεικονίζεται μια ζώνη μεγέθους 1.426 bp, για κάθε δείγμα. Στη διαδρομή 1: λ marker. Στις διαδρομές 2 και 3: απεικονίζεται η ενίσχυση τμήματος της περιοχής ORF1 του pUZMO3.11.

Δ. 3. Μοριακή κλωνοποίηση του τμήματος DNA ORF1 που ενισχύθηκε με PCR.

Πραγματοποιήθηκε η κλωνοποίηση του γονιδίου της ριλαξάσης του pZMO3

με τη παρακάτω διαδικασία: αρχικά, πραγματοποιήθηκε ενίσχυση του DNA με

αντίδραση PCR με τις συνθήκες που αναφέρονται στη παράγραφο Δ. 1. Για τη

παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA, πραγματοποιήθηκε σύνδεση του προϊόντος PCR

σε πλασμίδιο pCR2.1, όπως περιγράφεται στη παράγραφο Γ. 5. 2. Ακολουθεί

μετασχηματισμός του παραπάνω ανασυνδυασμένου προϊόντος (παράγραφο Γ. 5. 3.)

εντός επιδεκτικών κυττάρων INVaF΄, που προσφέρονται από το TA Cloning Kit, της

εταιρείας Invitrogen. Επιλέγονται οι κατάλληλες αποικίες και ακολουθεί απομόνωση

του πλασμιδιακού DNA (παράγραφο Γ. 11) για περαιτέρω ανάλυση.

Ανάλυση του πλασμιδιακού DNA για τη παρουσία και τη κατεύθυνση του

προϊόντος PCR πραγματοποιήθηκε με ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα. Το

περιοριστικό ένζυμο που χρησιμοποιήθηκε στη περίπτωση του pCR2.1 φορέα είναι

το EcoRI. Σύμφωνα με το χάρτη του pCR2.1 φορέα διακρίνονται δύο EcoRI θέσεις

που συνορεύουν με το ενθετιμένο PCR προϊόν σε κάθε πλευρά. Έτσι επίδραση με το

περιοριστικό ένζυμο EcoRI θα προκύψουν δύο DNA τμήματα, 1.441 και 3.885bp,

που αντιστοιχούν στο προϊόν PCR και στο φορέα pCR2.1.

23.13bp

4.36bp 2.32bp 2.02bp

1 2 3

128

Εικόνα 2: Ανάλυση με το περιοριστικό ένζυμο EcoR1 σε αποικίες κυττάρων INVaF΄, που είναι μετασχηματισμένες με το ανασυνδυασμένο DNA: PCR προϊόν-φορέας pCR2.1. Δόμηση του ανασυνδιασμένου DNA με ένθεση του PCR προϊόντος εντός φορέα pCR2.1. Ακολουθεί μετασχηματισμός των επιδεκτικών κυττάρων INVaF΄ με το ανασυνδιασμένο DNA. Κατόπιν, επιλέγονται 10 λευκές αποικίες, στις οποίες απομονώθηκε το πλασμιδιακό DNA, ακολουθεί πέψη του πλασμιδιακού DNA με EcoR1 και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0.8%.

Διαδρομή 1: λ marker, διαδρομές 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14: πέψη με EcoR1 του ανασυνδιασμένου πλασμιδιακού DNA από αποικία 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, αντίστοιχα. Διαδρομές 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15: ανασυνδιασμένο DNA χωρίς να έχει υποστεί πέψη.

Εξετάστηκαν 10 λευκές αποικίες, δύο από τις οποίες έδωσαν τα επιθυμητό

αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα της παραπάνω διαδικασίας παρουσιάζονται στην

εικόνα 2. Έτσι, σε δύο αποικίες (αποικίες 5 και 6), που αντιστοιχούν στις διαδρομές

10 και 12, παρατηρήθηκε ότι το περιοριστικό ένζυμο EcoRI κόβει το πλασμιδιακό

DNA στα αναμενόμενα μεγέθη 1.441 και 3.885bp, που αντιστοιχούν στο PCR προϊόν

και στο φορέα pCR2.1.

Οι αποικίες 5 και 6 καλλιεργούνται και ακολουθεί απομόνωση του

ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA, το οποίο φυλάσσεται προκειμένου να

ακολουθήσει μελλοντικά αλληλούχιση, για να πιστοποιηθεί ότι το πλασμίδιο φέρει τη

κατάλληλη αλληλουχία του γονιδίου της ριλαξάσης. Ακόμα, στο μέλλον πρόκειται να

ακολουθήσει υποκλωνοποίηση του γονιδίου της ριλαξάσης του pZMO3 εντός φορέα

υπερέκφρασης pET3d, προκειμένου να επιτευχθεί η υπερέκφραση της πρωτεΐνης

κινητοποίησης και να αναλυθεί ως προς τη δομή και λειτουργία της.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

129

Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Τα τελευταία δέκα χρόνια σημειώθηκε πρόοδος στη μελέτη της βιοχημείας

της ριλαξάσης, της δομής της περιοχής έναρξης της μεταφοράς oriT και της δομής

του ριλαξοσώματος. Η πρωτεΐνη ριλαξάση των κινητοποιήσιμων πλασμιδίων

συμμετέχει στη διαδικασία της επιβοηθούμενης βακτηριακής σύζευξης. Στην

επιβοηθούμενη βακτηριακή σύζευξη τα κινητοποιήσιμα πλασμίδια με τη βοήθεια των

συζευκτικών πλασμιδίων μεταφέρονται στα κύτταρα δότες.

Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η πρωτεΐνη κινητοποίησης, που

κωδικοποιείται από την περιοχή ORF1, του πλασμιδίου pZMO3 του στέλεχος ATCC

10988 του Z. mobilis. Η περιοχή ORF1 του πλασμιδίου pZMO3 βρέθηκε ότι

κωδικοποιεί για μια κινητοποιήσιμη πρωτεΐνη που παίζει σημαντικό ρόλο στην

κινητοποίηση του πλασμιδίου pZMO3 μέσω επιβοηθούμενης βακτηριακής σύζευξης.

Δείχθηκε ότι η κινητοποίηση pZMO3 σε στελέχη E.coli απαιτεί δύο στοιχεία: (α) μια

πρωτεΐνη κινητοποίησης που κωδικοποιείται από ORF1 και (β) τη περιοχή έναρξης

της μεταφοράς oriT που τοποθετείται στη περιοχή ανοδικά του ORF1 (Afendra et.al.,

1999).

Επιλέξαμε δύο διαφορετικούς τρόπους για την επίτευξη της κλωνοποίησης

της πρωτεΐνης κινητοποίησης, από τους οποίους με τον πρώτο δεν κατέστη δυνατό να

προκύψουν ανασυνδιασμένοι κλώνοι. Με το δεύτερο τρόπο, πραγματοποιήθηκε η

κατασκευή κλώνου που περιέχει το ελάχιστο λειτουργικό τμήμα του ORF1 του

pZMO3 ενθετιμένο εντός του φορέα pCR2.1. Στο μέλλον πρόκειται να γίνει η

αλληλούχιση του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA, προϊόν PCR-πλασμίδιο

pCR2.1, για να ελεχθεί αν αποτελούν την επιθυμητή αλληλουχία (δηλαδή την

αλληλουχία του γονιδίου της ριλαξάσης). Κατόπιν αυτού πρόκειται να ακολουθήσει

υποκλωνοποίηση του γονιδίου της ριλαξάσης του pZMO3 εντός φορέα

υπερέκφρασης pET3d, προκειμένου να επιτευχθεί η υπερέκφραση της πρωτεΐνης

κινητοποίησης και να αναλυθεί ως προς τη δομή και λειτουργία της.

130

ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Afendra A. S.,Vartholomatos G., Arvanitis N., and Drainas C. (1999).

Characterization of the mobilization region of the Zymomonas mobilis

ATCC10988 plasmid pZMO3. Plasmid 41:73-77.

2. Arvanitis N., Afendra A. S. and Drainas C (1995). Zymomonas mobilis

ATCC10988 plasmid pZMO3 expresses mobilizations functions in

Escherichia coli JM83 and RR1. Biotechnolo. Lett. 17:681-686.

3. Βαρσάκη Α. Διατριβή μεταπτυχιακής ειδίκευσης. Τμήμα Χημείας.

Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. 1999.

4. Byrd D. R. and Matson S. W., (1997) Nicking by transestrerification: the

reaction catalysed by a relaxase. Mol. Microb. 25: 1011-1022.

5. Byun M. O.-K., Kaper T. B. and Ingram L. O. (1988).Construction of a new

vector for the expression of foreign genes in Zymomonas Mobilis. J. Ind.

Microbiol. 1:9-15.

6. Clewell D. B., Flannagan S. E. and Jaworski D. D., (1995) . Unconstrained

bacterial promiscuity: The Tn916-Tn1545 family of conjugative transposons.

Trends Microbiol. 3, 229-236.

7. Davison J., (1999). Genetic exchange between bacteria in the inviroment.

Plasmid 42:73-91.

8. Derbyshire K. M., Hatfull G., Willetts N. (1987). Mobilization of the non-

conjugative plasmid RSF1010: a genetic and DNA sequence analysis of the

mobilization region. Mol. Gen. Genet. 206(1):161-168.

9. Derbyshire K. M., Willetts N.S. (1987). Mobilization of the non-conjugative

plasmid RSF1010: a genetic analysis of its origin of transfer. Mol. Gen. Genet.

206(1):154-160.

10. Drainas C., Slater A. A., Cooggins L., Montague P., Costa R. G., Ledingham

W. M., and Kinghorn J. R. (1983). Electron microscopic analysis of

Zymomonas mobilis strain ATCC10988 plasmid DNA. Biotechnol. Lett.

5:405-408.

11. Δραΐνας Κ. (1991). Μοριακή βιολογία νουκλεϊκών οξέων. Σημειώσεις

παραδόσεων.

12. Guiney, D. G., and Helinski, D. R. (1975). Relaxation complexes of plasmid

DNA and protein. III. Association of protein with the 5΄ terminus of the

131

broken DNA strand in the relaxed complex of plasmid ColE1. J. Biol. Chem.

250: 8796-8703.

13. IIyina, T. and Koonin, E. (1992). Conserved sequence motifs in the initiator

proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from

eubacteria, eukaryotes, and archaebacteria. Nucleic. Acids. Res. 13: 3279-

3285.

14. Konberg, Α and Baker, T. (1992).DNA Replication. New York: WH Freeman.

15. Lanka E. and Wilkins B. M., (1995). DNA processing reactions in bacterial

conjugation. Annu. Rev. Biochem. 64: 141-169.

16. Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T. (1982). Molecular cloning:a

laboratory manual. Cold spring harbor laboratory. Cold Spring Harbor. NY.

17. Matson, S., Nelson, W., and Morton, B. (1983). Characterization of the

reaction product of the oriT nicking reaction catalysed by Escherichia coli

DNA helikase I. J. Bacteriol. 175: 2599-2606.

18. McKenzie T., Hoshino T., Tanaka T., and Sueoka N. (1987). A revision of the

nucleotide sequence and functional map of pUB110. Plasmid 17:83-85.

19. Misawa N., and Nakamura Κ. (1989). Nucleotide sequence of the 2.7kb

plasmid of Zymomonas mobilis ATCC10988. J. Biotechnol. 12:30-39.

20. Oskam L., Hillenga D. J. Venema G. And Bron S. (1991). The large Bacillus

plasmid pTB19 contains two integrated rolling circle plasmids carrying

mobilization functions. Plasmid 26:30-39.

21. Pansegrau W., Schoumacher F., Hohn B., Lanka E. (1993). Site-specific

cleavage and joining of single-stranded DNA by VirD2 protein of

Agrobacterium tumefaciens Ti plasmids: analogy to bacterial conjugation.

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 24:11538-11542.

22. Pansegrau, W., and Lanka, E.(1996). Common sequence motifs in DNA

relaxases and nick regions from a variety of DNA transfer systems. Nucleic

Acids Res. 19: 3455.

23. Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., and Lanka, E.(1990). In vitro

assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 87: 6555-6559.

24. Pansegrau, W., Schrοder W., and Lanka, E.(1993). Relaxase TraI of IncP

plasmid RP4 catalyses a site-specific cleaving-joining reaction of single-

stranded DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2925-2929.

132

25. Priebe S. D., and Lacks S. A. (1989). Region of the streptococcal plasmid

pMV118 for conjugative mobilization. J. Bacteriol. 171:4778-4784.

26. Rogers, P. L., Goodman, A. E., and Heyes, R. H. (1984). Zymomonas ethanol

fermentations. Mirobiol. Sci. 1:133-136.

27. Scerzinger, E., Kruft V., Otto, S. (1993). Purification of the large mobilization

protein of plasmid RSF1010 and characterization of its site-specific DNA-

cleaving/DNA-joining activity.Eur. J. Biochem. 217: 929-938.

28. Scerzinger, E., Lurz, R., Otto, S., and Dobrinski, B., (1992). In vitro cleavage

of double and single stranded DNA by plasmid RSF1010-encoded

mobilizations proteins. Nucleic Acids Res. 20: 41-48.

29. Scordaki A and Drainas C (1990). Analysis and stability of Zymomonas

mobilis ATCC 10988 plasmid pZMO3. Plasmid 23 (1): 59-66.

30. Scordaki A., and Drainas C. (1987). Analysis of natural plasmids Zymomonas

mobilis ATCC10988. J. Gen. Microbiol. 133:2547-2556.

31. Sherman J. A., Matson S. W., (1994). Escerichia coli DNA helikase I

catalyses a sequence specific cleavage/ligation reaction at the F plasmid origin

of transfer. J. Biol. Chem. 269:26220-26226.

32. Swings , J., and Delay, J. (1977). The biology of Zymomonas bacterial. Rev.

41:2851-2853.

33. Tonomura K., Okamoto T., Yasui M., and Yanase H.(1986). Shuttle vectors

for Zymomonas Mobilis. Agric. Boil. Chem. 50:805-808.

34. Wang, J., (1996). DNA Topoisomerases. Annu. Rev. Genet.14: 41-76.

35. Willets N. And Wilkins B., (1984). Processing of plasmid DNA during

bacterial conjugation. Microb. Rev. 48:24-41.