OKSIDACIJSKI STRES U BILJAKAOKSIDACIJSKI STRES U BILJAKA

REAKTIVNI OBLICI REAKTIVNI OBLICI KISIKA (ROS)KISIKA (ROS)

OKSIDACIJSKI OKSIDACIJSKI STRESSTRES

Intenzivna svjetlost

Starenje

Ranjavanje

Herbicidi

Onečišćenje (SO2, O3) Vodni stres

Patogeni

Ekstremne temperature

Teški metali

Solni stresUV-zračenje

ROS visoko reaktivni → djelomično reducirani i elektronski pobuđeni oblici kisika ROS → dvostruka uloga: negativna – velike količine → oštećenje lipida, proteina, DNApozitivna – male količine → regulacija rasta, programirana stanična smrt, signalni putovi hormona, kontrola aktivacije obrambenih mehanizamarazgradnja ROS → antioksidacijski sustav

RREACTIVE EACTIVE OOXYGEN XYGEN SSPECIES PECIES –– REAKTIVNI INTERMEDIJERI REAKTIVNI INTERMEDIJERI KISIKAKISIKA

uzrokuje ga svako stanje u kojem je narušena homeostazastaničnih redoks-reakcijaglavni izvori ROS – transportni lanci elektrona

STARENJE IZAZVANOSTARENJE IZAZVANO““SLOBODNIM RADIKALIMASLOBODNIM RADIKALIMA””

Zašto starimo?

STARENJE IZAZVANOSTARENJE IZAZVANOSKRASKRAĆĆIVANJEM TELOMERAIVANJEM TELOMERA

- Ponavljajući nizovi sekvence TTAGGGna krajevima kromosoma = TELOMERE

-Telomere se skraćuju pri svakom ciklusu DNA replikacije na 5’ kraju zaostajućeglanca, no do skraćivanja dolazi i zbog ROS

TEORIJA STARENJA IZAZVANOG TEORIJA STARENJA IZAZVANOG ““SLOBODNIM RADIKALIMASLOBODNIM RADIKALIMA””

oštećenje mtDNA – “lošiji” mehanizmi popravka,nedostatak zaštite histonima, blizina ROS →starenje (srce, mozak, mišići)

Endogeni izvoriKloroplastiMithondrijiPeroksisomiLipoksigenazeNADPH oksidazeCitokrom P450

Antioksidacijski sustavEnzimski

Superoksid dismutazaKatalazaAskorbat peroksidazaGlutation reduktaza

NenzimskiAskorbat(Vitamin C)Glutationα-tokoferol (Vitamin E)KarotenoidiFlavonoidi

Egzogeni izvoriIntezivna svjetlostSolni i vodni stresEkstremne temperatureTeški metali, herbicidi…UV zračenjeOnečišćenje –SO2, O3PatogeniRanjavanjeStarenje

ROS

HOMEOSTAZASmanjena fiziološka funkcija Smanjena fiziološka funkcija

Smanjen rastSmanjena obrana

Smanjena fiksacija CO2→ pojačana redukcija

fotosintetskogtransportnog lanca elektrona

Oštećenje biomolekula

biljne stanice

animalne stanice

REAKTIVNI OBLICI KISIKAREAKTIVNI OBLICI KISIKA

nespareni elektron

NAJVEĆA OPASNOST - izazivaju lančane reakcije

superoksidni radikalhidroksiperoksilni radikalhidroksilni radikal peroksil, alkoksil radikalivodikov peroksid singletni kisik

ROS

ROS

ROS

ROS

ROS

REAKTIVNI OBLICI KISIKAREAKTIVNI OBLICI KISIKA

2-4μs 1ms <1μst1/2>100s

- uslijed apsorpcije energije dovoljne da "obrne" spin jednom od nesparenih elektrona

- monovalentnom redukcijom (prijenos jednog elektrona)

4μs

○SIGNALNE MOLEKULE

○NAJREAKTIVNIJI

- u prisutnosti iona prijelaznih metala(Fe, Cu, Mn)

lipoksigenaza

IZVORI ROS U BILJNOJ STANICIIZVORI ROS U BILJNOJ STANICI

~ 1% od ukupne količine kisika O2 za proizvodnju ROS

Kloroplasti – najvažniji izvor u biljnoj staniciMitohondriji - najvažniji izvor u animalnoj staniciPeroksisomiGlioksisomiPlazma membranaStanična stijenkaEndoplazmatski retikulum, citosol

TRANSPORTNI LANAC ELEKTRONA U KLOROPLASTIMATRANSPORTNI LANAC ELEKTRONA U KLOROPLASTIMA

krajnji akceptor elektrona – CO2alternativni akceptor elektrona – O2 (rijetko biljke imaju brzinu asimilacije CO2 dovoljno visoku da se iskoristi >50% apsorbirane svjetlosne energije)

mjesta nastanka ROS u kloroplastu

TRANSPORTNI LANAC ELEKTRONA U MITOHONDRIJIMATRANSPORTNI LANAC ELEKTRONA U MITOHONDRIJIMA

- mjesta nastanka ROS

IZVORI ROS U BILJNOJ STANICIIZVORI ROS U BILJNOJ STANICI

Glavni izvor ROS – KLOROPLASTI - 3 mjesta “curenja” elektrona tj. nastanka ROS1. redukcija kisika u fotosistemu I (Mehlerova reakcija)→

superoksidni radikal2. fotorespiracija → RUBISCO katalizira oksigenaciju

ribuloza1,5bisP→ glikolat → oksidacija u peroksisomima pri čemu nastaje H2O2

3. direktna redukcija kisika na komponentama FSII → 1O2

Ostali izvori ROS- MITOHONDRIJI → NADH-DH, citokrom bc1 kompleks → ROS- PLAZMA MEMBRANA → NADPH oksidaza → stvaranje ROS

tijekom infekcije patogena→ lipoksigenaza → peroksidacija

lipida- ER, CITOSOL → ROS nastaje reakcijama detoksikacije koje

katalizira citokrom 450- STANIČNA STIJENKA → peroksidaze → ROS- KSANTIN OKSIDAZA → superoksidni radikal

zaštitni mehanizmi

LIPIDNA LIPIDNA PEROKSIDACIJAPEROKSIDACIJA

Posebno osjetljive nezasićene masne kiseline (zbog = veza)ROS oduzima vodikov atoma te nastaje pentadienil radikal Oksigenacijom nastaje peroksilni radikal kojeg tokoferol tj.vitamin Eprevodi do lipidnoghidroperoksidaNiz enzima “popravljaju”do kraja oksdidirani lanac masne kiseline

LIPIDNA PEROKSIDACIJALIPIDNA PEROKSIDACIJA- nespecifična sekundarna reakcija na različite vrste stresa koju potiču

primarni proizvodi stresa (ROS) →→ promjene u fizičkim osobinama i funkcijama membrane →→ ukazuje na oksidacijski stres

- glavne sastavnice membranskih lipida - polinezasićene masne kiselineposebno osjetljive na lipidnu peroksidaciju →→ štetni konjugirani dieni, lipidni peroksilni radikali i lipidni hidroperoksidi

- nije isključivo destruktivan proces →→ produkti mogu sudjelovati u kaskadi prijenosa signala koji upozoravaju da je organizam podstresom

MODIFIKACIJE PROTEINAMODIFIKACIJE PROTEINA- nastanak karbonilnih grupa (His, Lys, Ser, Pro, Arg) →→ gubitak

katalitičke aktivnosti, povećana osjetljivost na proteolizu

- stvaranje unakrsnih proteinskih veza, stvaranje “neželjenih” S-S mostova →→ ROS može eliminirati vodik iz Cys – tialni radikal

- inhibicija enzimske aktivnosti →→ oksidacija aktivnog Fe-S centra superoksidom

OOŠŠTETEĆĆENJE DNAENJE DNA- razgradnja baza →→ hidroksimetilurea, timinglikol …

- jednolančani lomovi →→ oksidacija šećernih komponenti sa OH•

- unakrsno vezanje DNA na proteine (timin-cistein adukti) sa OH•

- jedan od razloga izdvajanja DNA u jezgru →→ izbjegavanje oksidacijskog oštećenja?

ULOGA ROS U SIGNALNIM PUTEVIMA I REGULACIJIULOGA ROS U SIGNALNIM PUTEVIMA I REGULACIJIROS u rastu i razvoju- ROS nastali aktivnošću NADPH oksidaze: reguliraju rast stanice aktivacijom

Ca kanala, unakrsno povezuju prekursore lignina u reakciji kataliziranoj peroksidazama

ROS u starenju - razgradnja membranskih lipida i oslobađanje masnih kiselina →→ peroksidacijaperoksidacija→→ ROS – destabilizacija lipidnog dvosloja povećava stvaranje etilena →→ starenje

ROS kao signalne molekule u poticanju obrambenih mehanizama- predtretman s H2O2 →→ tolerancija na stres

ROS u posredovanju programirane stanične smrti (PCD)- ↑ H2O2 nakon napada patogena →→ djeluje direktno mikrobiocidno,

posredno utječe na učvršćivanje stanične stijenke, inducira ekspresiju gena za proteine uključene u obranu stanice ili inducira PCD

ROS kao sekundarnih glasnika u mnogim signalnim putevima posredovanih hormonima- H2O2 inducira nakupljanje etilena i salicilne kiseline- represija ekspresije gena za auksin preko kaskadnih reakcija potaknutih s H2O2

Slobodni radikali napadaju stanice: mehanizmi preživljavanja?

PRVA LINIJA OBRANE – izbjegavanje produkcije ROSTransportni lanac elektrona se održava u oksidiranom stanju:(I) održavanje ravnoteže između dostupnosti supstrata i

zahtjeva za ATP-om(II) aktivacija alternativne oksidaze u stresnim uvjetima

DRUGA LINIJA OBRANE – razgradnja ROSSuperoksid - razgradnja do H2O2 superoksid dismutazomH2O2 – razgradnja: (I) katalaza (H2O + O2)(II) askorbat-glutationski ciklus (H2O + 2 monodehidroaskorbat)(III) glutation peroksidaza(IV) tioredoksin(V) peroksireduktaza

TREĆA LINIJA OBRANE – popravak oksidacijskog oštećenja(I) hidroperoksidi masnih kiselina – glutation peroksidaza(II) proteini – npr. redukcija disulfidnih mostova(III) popravak DNA

ANTIOKSIDACIJSKI SUSTAVANTIOKSIDACIJSKI SUSTAV

EnzimskiSuperoksid dismutaza (SOD) – razgrađuje superoksidKatalaza (CAT) - razgrađuje vodikov peroksidAskorbat peroksidaza (APX) - razgrađuje vodikov peroksidGlutation reduktaza (GPX) - sudjeluje u regeneraciji

reduciranog glutationaNenzimskiAskorbat (Vitamin C) - uklanja ROS direktno ili

indirektno Glutation - sudjeluje u regeneraciji

reduciranog askorbataα-tokoferol (Vitamin E) -sudjeluje u popravku štete

nastale peroksidacijom lipida stanične membrane Karotenoidi -razgrađuje singletni kisikFlavonoidi -uklanjaju ROS direktno

ANTIOKSIDACIJSKI SUSTAVANTIOKSIDACIJSKI SUSTAV

ASKORBATASKORBAT--GLUTATIONSKI CIKLUSGLUTATIONSKI CIKLUS

ASKORBAT PEROKSIDAZAASKORBAT PEROKSIDAZA – najvažniji enzim za razgradnju H2O2 – fina regulacija, velika specifičnost tj. afinitet za H2O2KATALAZAKATALAZA – razgradnja velikih količina H2O2mala specifičnost za H2O2 ali velika brzina reakcije

ASKORBINSKA KISELINAASKORBINSKA KISELINA(VITAMIN C)(VITAMIN C)

kvantitativno dominantan antioksidansprisutna u svim biljnim tkivima osim u dormantnim sjemenkama~ 20 do 40% askorbata u mezofilnim stanicama lista nalazi se u kloroplastimadjeluje izravno na uklanjanje slobodnih radikala kisika (superoksidni ihidroksilni radikali, singletni kisik, H2O2) donirajući elektrone u velikombroju reakcija i neizravnoneizravno reciklirajući tokoferol iz tokoferoksilnogradikala donirajući mu kation (zajedno s tokoferolom štiti stanične membrane od LP) te donirajući elektrone u enzimskoj reakciji askorbatperoksidaze

GLUTATION

reducirani glutation – tripeptid sa slobodnomsulfhidrilnom grupom (GSH)

oksidirani oblik glutationa – dva tripeptida su vezana disulfidnom vezom (GSSG) →→ STRES povećava GSSGGSSG se reducira u GSH uz glutation reduktazui NADPH (izvor elektrona)

GSH regenerira reducirani oblik askorbata

sudjeluje u uklanjanju slobodnih radikala (redoks-aktivna sulfhidrilnaskupina

αα--TOKOFEROL TOKOFEROL (VITAMIN E)(VITAMIN E)

isključivo u kloroplastima

razgradnja OH• i 1O2 u reakcijskom središtu fotosistema II

reakcija s lipidnim peroksilnim radikalima – terminacija lipidneperoksidacije

samo jedna molekula štiti 1000 lipidnih molekula od lančanih reakcija

akumulira se na mjestima s više nezasićenih masnih kiselina

KAROTENOIDIKAROTENOIDI

najpoznatiji β-karoten

pigmenti u kompleksima za skupljanje svjetlosti (LHC)(najjače apsorbiraju svjetlost valnih duljina između 380 i 550 nm)

„gašenje“ pobuđenog stanja klorofila tj. razgradnja 1O2 u kompleksima za skupljanje svjetlosti fotosistema I i II

Flavonoidi iz crvenog vina smanjuju rizik od infarkta jer inhibiraju agregaciju trombocita i stvaranje ugrušaka.

djeluju kao snažan antioksidans (donori vodika i elektrona) stabiliziraju nesparene elektrone →→ zaustavljanje lančanih reakcija u ljudskoj hrani imaju glavnu ulogu u prevenciji starenja uzrokovanog slobodnim radikalimaantimikrobni i antikarcinogeni učinak, štite kardiovaskularni sustav

FLAVONOIDIFLAVONOIDI

OKSIDACIJSKI STRES – produkcija ROS veća od kapaciteta antioksidacijskog sustava

ANTIOKSIDACIJSKI SUSTAV– enzimski

SOD, katalaza, askorbat peroksidaza i enzimi koji sudjeluju u regeneraciji askorbata

– neenzimskiaskorbat, vitamin E, glutation, karotenoidi, flavanoidi, polifenoli

ROS – u svim odjeljcima– u malim količinama tijekom normalnog staničnog metabolizma– u velikim količinama u uvjetima stresa – dvostruka uloga: ↓ ROS - signalna/regulatorna,↑ROS - štetna