GENOMIKAGENOMIKA-- oblast molekularne biologijeoblast molekularne biologijekoja se bavi iskoja se bavi istratraživanjem živanjem strukturne i strukturne i

Strukturna oStrukturna oStrukturna oStrukturna organizacija eukariotrganizacija eukariotrganizacija eukariotrganizacija eukariotskih skih skih skih genomagenomagenomagenoma

koja se bavi iskoja se bavi istratraživanjem živanjem strukturne i strukturne i funkcionalne organizacije genomafunkcionalne organizacije genomaGENOM EUKARIOTAGENOM EUKARIOTA--skup naslednih skup naslednih informacija informacija jednejedne haploidne haploidne ćelijećelije

KARAKTERISTIKE GENOMA :KARAKTERISTIKE GENOMA :

VELIČINA VELIČINA –– broj baznih parova u haploidnoj garnituri hromozoma i broj baznih parova u haploidnoj garnituri hromozoma i označava se kao Coznačava se kao C--VREDNOSTVREDNOST

PARADOKS CPARADOKS C--VREDNOSTI VREDNOSTI --odsustvo korelacije izmedju Codsustvo korelacije izmedju C--vrednosti vrednosti i evolutivne složenosti eukariotskih organizma→i evolutivne složenosti eukariotskih organizma→povepovećanje veličine ćanje veličine i evolutivne složenosti eukariotskih organizma→i evolutivne složenosti eukariotskih organizma→povepovećanje veličine ćanje veličine genoma ne znači i povećanje broja genagenoma ne znači i povećanje broja gena

GUSTINA GENA GUSTINA GENA –– broj gena u sekvenci DNK dugoj 1Mb (milion broj gena u sekvenci DNK dugoj 1Mb (milion baznih parova)baznih parova)

Gustina genaGustina gena

kvasci

bakterije

Vinska mušica

Valjkasti crvi

virusii

97 x10 61.2 x 10 7 180 x 10 6

Šta je gen?Šta je gen?I I Region genoma koji se segregira tokom mejoze kao jedna jedinica i Region genoma koji se segregira tokom mejoze kao jedna jedinica i

dovodi do pojave jedne definisane fenotipske osobinedovodi do pojave jedne definisane fenotipske osobine--MendelMendel

II II Archibald Garrod jeArchibald Garrod je 1902. 1902. godgod.., , prvi put predloprvi put predlo žžio koncept da je io koncept da je II II Archibald Garrod jeArchibald Garrod je 1902. 1902. godgod.., , prvi put predloprvi put predlo žžio koncept da je io koncept da je gen odgovoran za produkciju specifigen odgovoran za produkciju specifiččnog proteinanog proteina:: Deo genoma Deo genoma koji diriguje sintezom jednog enzima/jednog proteinakoji diriguje sintezom jednog enzima/jednog proteina –– prva prva molekularna definicijamolekularna definicija

III III Deo DNK koji se transkribuje u iRNK koja kodira jedan Deo DNK koji se transkribuje u iRNK koja kodira jedan polipetidni lanac ili u strukturni RNK molekulpolipetidni lanac ili u strukturni RNK molekul ((rRNK ili tRNK)rRNK ili tRNK)

IV IV Niz nukleotida u DNK (ili RNK, kod nekih virusa) koji obavlja Niz nukleotida u DNK (ili RNK, kod nekih virusa) koji obavlja specifičnu funkcijuspecifičnu funkciju ::

STRUKTURNI GENISTRUKTURNI GENI --kodiraju polipeptidne lance ili RNK kodiraju polipeptidne lance ili RNK STRUKTURNI GENISTRUKTURNI GENI --kodiraju polipeptidne lance ili RNK kodiraju polipeptidne lance ili RNK molekulemolekule

REGULATORNI GENIREGULATORNI GENI --ne transkribuju sei predstavljaju ne transkribuju sei predstavljaju mesta vezivanja specifičnih regulatornih molekulamesta vezivanja specifičnih regulatornih molekula

Sekvence kompletnih genomaSekvence kompletnih genoma

pekarskog kvascapekarskog kvasca--Saccharomyces Saccharomyces cerevisae ( cerevisae ( 1.2 x 101.2 x 1077 bp DNK) Genom bp DNK) Genom cerevisae ( cerevisae ( 1.2 x 101.2 x 1077 bp DNK) Genom bp DNK) Genom S.cerevisae sadrS.cerevisae sadržiži oko 6000 gena: 5885 oko 6000 gena: 5885 protein kprotein koodirajućih sekvencidirajućih sekvenci (70%)(70%), 140 , 140 ribozomalnih RNK gena, 275 gena za ribozomalnih RNK gena, 275 gena za transportne RNK, 40 gena koji kodiraju transportne RNK, 40 gena koji kodiraju male jedarne RNK uključene u obradu male jedarne RNK uključene u obradu RNK.RNK. (1992(1992--1996)1996)

genom crva genom crva Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans (97 x10(97 x1066) ) sekvenciran je 1998. God.sekvenciran je 1998. God.--sadrži oko 19000 sadrži oko 19000 protein kodirajućih sekvenci, što čini oko 25 protein kodirajućih sekvenci, što čini oko 25 % genoma% genomaggenomenom DrozofileDrozofile ((180180xx101066 bpbp )) sekvenciransekvenciran jejeggenomenom DrozofileDrozofile ((180180xx101066 bpbp )) sekvenciransekvenciran jeje20002000.. godgod.. II otkrivenootkriveno jeje otprilikeotprilike 1360013600 gena,gena,sasa proteinprotein--kodirajućimkodirajućim sekvencamasekvencama kojekoje činečineokooko 1313%% genomagenoma..

OrganizmiOrganizmi vrsta vrsta broj hromozoma broj hromozoma broj broj gena gena

kodiraju ći %kodiraju ći %

Bakterije Bakterije Escherichia Escherichia coli coli

1 1 4377 4377 88 % 88 %

kvasackvasac Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae 16 16 6241 6241 70 % 70 %

crvicrvi CaenorhabditisCaenorhabditiselegans elegans

6 6 19,82019,820 27 % 27 %

mušicamušica Drosophila Drosophila melanogaster melanogaster

4 4 13,60113,601 20 % 20 %

MišMiš Mus musculus Mus musculus 20 20 ~30,000 ~30,000 < 3 % < 3 %

Humani Humani Homo sapiensHomo sapiens 23 23 ~30,000 ~30,000 < 3 % < 3 % Humani Humani genomgenom

Homo sapiensHomo sapiens 23 23 ~30,000 ~30,000 < 3 % < 3 %

Trend smanjivanja gustine protein kodiraju ćih gena, kako se pove ćava kompleksnost organizama- zbog pove ćanja dužine gena i dužine intergenskih sekvenci

Veličina genoma u ćelijama eukariota premašujeVeličina genoma u ćelijama eukariota premašujezbir gena koji kodiraju sve ćelijske proteine!zbir gena koji kodiraju sve ćelijske proteine!

Postojanje više kopija gena ?Postojanje više kopija gena ?

Kinetika renaturacije denaturisane Kinetika renaturacije denaturisane hromozomske DNKhromozomske DNK

Brzina reakcije drugog reda:Brzina reakcije drugog reda:

Co x t1/2=M/k mCo x t1/2=M/k m

Co=početnaCo=početna koncentracijakoncentracija fragmenatafragmenata jednolančanejednolančane DNK,DNK,

t1/2=vreme potrebno da se renaturiše 50% DNK,t1/2=vreme potrebno da se renaturiše 50% DNK,

M=relativna molekulska masa M=relativna molekulska masa ispitivane ispitivane DNK, k = konstanta brzine DNK, k = konstanta brzine reakcije i m = relativna molekulska masa niza nukleotidareakcije i m = relativna molekulska masa niza nukleotida (fragmenta)(fragmenta)koji je u ukupnoj DNK zastupljen u samo jednoj kopiji. koji je u ukupnoj DNK zastupljen u samo jednoj kopiji.

Kinetika renaturacije eukariotskih DNKKinetika renaturacije eukariotskih DNK

Jedinstvenim redosledima nukleotida odgovaraju Cot1/2 vrednosti veće od 100

1 kopija

45%

25%

500000 x 30%

100 x

Složena organizacija genoma kod eukariotaeukariota

PodsePodseććanje:anje: bakterijski genombakterijski genom

1 hromozom1 hromozomPo jedna kopija svakog genaPo jedna kopija svakog genaPo jedna kopija svakog genaPo jedna kopija svakog genaNizovi nukleotida koji se ponavljaju nisu Nizovi nukleotida koji se ponavljaju nisu zastupljenizastupljeni

U eukariotskom genomu se nalazesledeći tipovi gena:

1. Jedinstveni, proteinkodirajući nizovi

2. Ponovljene sekvence

3. Tandemske genske strukture

4. Familijegenai4. Familijegenai

5. Transpozabilni elementi

GENOM EUKARIOTAGENOM EUKARIOTA

Jedinstveni protein kodiraju ći geniJedinstveni protein kodiraju ći geni (45% (45% genoma)genoma):: nalaze u po jednoj kopiji po nalaze u po jednoj kopiji po genoma)genoma):: nalaze u po jednoj kopiji po nalaze u po jednoj kopiji po haploidnom genomu haploidnom genomu -- gengenii koji kodiraju koji kodiraju proteine , rRNK i tRNKproteine , rRNK i tRNK

Ponovljene sekvencePonovljene sekvence :: ponavljaju se u ponavljaju se u haploidnom genomu u nekoliko stotina do haploidnom genomu u nekoliko stotina do haploidnom genomu u nekoliko stotina do haploidnom genomu u nekoliko stotina do nekoliko miliona kopijanekoliko miliona kopija

1.1. INTERMEDIJERNI NIZOVIINTERMEDIJERNI NIZOVI2.2. SATELITSKE DNKSATELITSKE DNK

Satelitske DNKSatelitske DNKVISOKO PONOVLJIVE SEKVENCEVISOKO PONOVLJIVE SEKVENCEČine ih kratki nizovi nukleotida (5Čine ih kratki nizovi nukleotida (5--10, 1010, 10--100 u genomima 100 u genomima kičmenjaka i biljaka) koji se uzastopno ponavljaju 1000 00kičmenjaka i biljaka) koji se uzastopno ponavljaju 1000 00--milion puta kao TANDEMSKI PONOVCI (milion puta kao TANDEMSKI PONOVCI ( kopije postavljene kopije postavljene jedna uz drugu, u nizu: jedna uz drugu, u nizu: GTTACGTTACGTTACGTTACGTTACGTTAC......jedna uz drugu, u nizu: jedna uz drugu, u nizu: GTTACGTTACGTTACGTTACGTTACGTTAC......PrvaPrva satelitskasatelitska DNKDNK otkrivenaotkrivena jeje kodkod kraba,kraba, kodkod kojihkojih onaonapredstavljapredstavlja višestrukivišestruki ponovakponovak redosledaredosleda odod samosamo dvadvanukleotidanukleotida (A(A ii T)T) kojikoji činečine 3030%% genomagenoma krabekrabe..UkupnaUkupna dužinadužina 101055--101077

Satelitska DNK se Satelitska DNK se ne transkribujene transkribuje i uvek se nalazi u i uvek se nalazi u regionima konstitutivnog heterohromatinaregionima konstitutivnog heterohromatina, naj češće u , najčešće u regionu centromeraregionu centromeraUloge:Uloge: strukturnastrukturna--održavanje strukture i organizacije jedra održavanje strukture i organizacije jedra i hromozoma, sparivanje hromozoma tokom deobei hromozoma, sparivanje hromozoma tokom deobei hromozoma, sparivanje hromozoma tokom deobei hromozoma, sparivanje hromozoma tokom deobeRazlikuju se od glavnine hromozomalne DNK po Razlikuju se od glavnine hromozomalne DNK po nukleotidnom sastavu, izmedju vrsta po svojoj primar noj nukleotidnom sastavu, izmedju vrsta po svojoj primar noj strukturi i po lokalizaciji u hromozomustrukturi i po lokalizaciji u hromozomu-- geneti čki geneti čki nestabilne strukturenestabilne strukture

Satelitska DNK

Posebne satelitske DNK sisaraPosebne satelitske DNK sisara

3% genoma3% genomaKraće od tipi čnih satelita i rasute na više mestaKraće od tipi čnih satelita i rasute na više mestaKraće od tipi čnih satelita i rasute na više mestaKraće od tipi čnih satelita i rasute na više mestaMINISATELITIMINISATELITI: : 1515--100 nukleotida koji se ponavljaju 100 nukleotida koji se ponavljaju 1010--100 puta , ukupna dužina 100100 puta , ukupna dužina 100--10000 bp, kod 10000 bp, kod čoveka su u telomernim regionima. Pošto broj čoveka su u telomernim regionima. Pošto broj ponovaka varira od individue do individueponovaka varira od individue do individue--tandemsk i tandemski ponovci promenljivog broja (VNTR, ponovci promenljivog broja (VNTR, variable number variable number tandem repeats tandem repeats ))tandem repeats tandem repeats ))MIKROSATELITIMIKROSATELITI : 1: 1--4 nukleotida koji se ponavljaju 4 nukleotida koji se ponavljaju dajući regione dužine 10dajući regione dužine 10--100 bp. Rasuti po celom 100 bp. Rasuti po celom genomu pa i unutar kodiraju ćih nizova nukleotidagenomu pa i unutar kodiraju ćih nizova nukleotida

Intermedijerni nizovi nukleotidaIntermedijerni nizovi nukleotida

2525--40% sisarskih genoma40% sisarskih genomaumereno ponovljenumereno ponovljenee sekvencsekvence;e; dužine od dužine od nekoliko stotina (SINEsnekoliko stotina (SINEs--short interspersed short interspersed elements) do nekoliko hiljada (LINEselements) do nekoliko hiljada (LINEs --long long elements) do nekoliko hiljada (LINEselements) do nekoliko hiljada (LINEs --long long interspersed elements) nukleotida koji se interspersed elements) nukleotida koji se ponavljaju po nekoliko hiljada putaponavljaju po nekoliko hiljada puta;;

raštrkanraštrkanii po celom genomu po celom genomu Parazitske (selfish) DNKParazitske (selfish) DNK ,,mnogi od njih se transkribuju bilo kao deo velikih mnogi od njih se transkribuju bilo kao deo velikih RNK transkripta, koji se tokom obrade RNK RNK transkripta, koji se tokom obrade RNK RNK transkripta, koji se tokom obrade RNK RNK transkripta, koji se tokom obrade RNK isecaju,bilo kao kratki RNK molekuli. Samo isecaju,bilo kao kratki RNK molekuli. Samo interemedijerni nizovi koji čine tzv. spoljašnje interemedijerni nizovi koji čine tzv. spoljašnje margine ili grani čnike izmedju gena se nikada ne margine ili grani čnike izmedju gena se nikada ne transkribuju transkribuju Geni za rRNK,tRNK I 5S RNK, histone I sl.Geni za rRNK,tRNK I 5S RNK, histone I sl.

Uloge intermedijernih nizovaUloge intermedijernih nizova

mesta na kojima započinje replikacija,mesta na kojima započinje replikacija,signali za obradu primarnog transkripta,signali za obradu primarnog transkripta,nizovi nuklotida koji imaju regulatornu ulogu u transkripcijinizovi nuklotida koji imaju regulatornu ulogu u transkripcijipredstavljaju materijal od koga nastaju novi funkcionalni genipredstavljaju materijal od koga nastaju novi funkcionalni geniodržanje stabilnosti genomaodržanje stabilnosti genoma

Tandemski ponovljeni geniTandemski ponovljeni genivišestruko ponovljene kopije istog genavišestruko ponovljene kopije istog gena ((geni za hi stone, rRNK i geni za histone, rRNK i tRNKtRNK) ) Kod Drosophila, pet gena Kod Drosophila, pet gena za histone za histone su nagomilani u niz su nagomilani u niz dužine 5000dužine 5000--6000 bp, i svaka gomila se grupno pona vlja izmedju 6000 bp, i svaka gomila se grupno ponavlja izmedju 100 i 1000 puta100 i 1000 puta; ; Tri gena koja kodiraju 18S, 5.8S i 28S rRNK su Tri gena koja kodiraju 18S, 5.8S i 28S rRNK su grupisani zajedno čineći transkripcionu jedinicu koja se grupisani zajedno čineći transkripcionu jedinicu koja se transkribuje RNK polimerazom Itranskribuje RNK polimerazom I ;; 5S rRNK se sintetiše odvojeno 5S rRNK se sintetiše odvojeno ; ; transkribuje RNK polimerazom Itranskribuje RNK polimerazom I ;; 5S rRNK se sintetiše odvojeno 5S rRNK se sintetiše odvojeno ; ; njen gen njen gen je je u vidu tandemski ponovljenih sekvenci koje se u vidu tandemski ponovljenih sekvenci koje se razlikuju od onih prisutnih u ostala tri gena za rR NK. Kod X.laevis razlikuju od onih prisutnih u ostala tri gena za rR NK. Kod X.laevis ponovljeni blok čine 5S rRNK gen, pseudogen (segment 5S rRNK ponovljeni blok čine 5S rRNK gen, pseudogen (segment 5S rRNK koji se ne transkribuje) i jedan netranskribovani d eo promenljive koji se ne transkribuje) i jedan netranskribovani d eo promenljive dužine od oko 400bp. 5S rRNK se transkribuju van nu kleolusa dužine od oko 400bp. 5S rRNK se transkribuju van nu kleolusa RNK polimerazom III, a zatim se transkript transpor tuje u RNK polimerazom III, a zatim se transkript transpor tuje u nukleolus radi inkorporacije u veliku ribozomalnu s ubjedinicunukleolus radi inkorporacije u veliku ribozomalnu s ubjedinicu ..GGenom čoveka ima 350 gena za rRNK, nalaze se u sekundarnim enom čoveka ima 350 gena za rRNK, nalaze se u sekundarnim suženjima hromozoma13,14,15,21 i 22.)suženjima hromozoma13,14,15,21 i 22.)

Familije genaFamilije gena

Sastoje se od gena sli čne, Sastoje se od gena sli čne, ali ne identi čne primarne ali ne identi čne primarne strukturestrukturegenske familije vode genske familije vode poreklo od jednog poreklo od jednog zajedni čkog pretka čijom zajedni čkog pretka čijom duplikacijom i mutacijama duplikacijom i mutacijama tokom evolucije dolazi do tokom evolucije dolazi do pojave razli čitih ali srodnih pojave razli čitih ali srodnih formiformiformiformialbumin, alfa fetoprotein, albumin, alfa fetoprotein, serin proteaze, interferoni i serin proteaze, interferoni i imunoglobuliniimunoglobulini,aktin,,aktin, α i β α i β subjedinice hemoglobinasubjedinice hemoglobina

Geni koji kodiraju α i β varijante Hb subjedinica nalaze se u blokovima na različitim hromozomima. Kod ljudi i drugih sisara geni u globinskom bloku su aranžirani po redosledu hromozomima. Kod ljudi i drugih sisara geni u globinskom bloku su aranžirani po redosledu njihove ekspresije tokom razvića.

Alfa globinski blok zauzima oko 28 kb i sadrži 3 funkcionalna gena i 2 pseudogena

Beta globinski blok zauzima oko 50 kb i sadrži 5 funkcionalnih gena i pseudogene

PSEUDOGENIPSEUDOGENI--neaktivni geni, ne transkribuju se, nef unkcionalni zbog neaktivni geni, ne transkribuju se, nefunkcionalni zbog nagomilanih mutacijanagomilanih mutacija

Mobilni genetički elementiMobilni genetički elementi--skoči geniskoči geniBarbarBarbaraa McClintock McClintock (Nobelova nagrada 1983.)(Nobelova nagrada 1983.)-- sekvence sekvence koje se premeštaju kroz genom preko DNK ili RNK koje se premeštaju kroz genom preko DNK ili RNK intermedijera unutar istog ili razli čitih hromozoma. intermedijera unutar istog ili razli čitih hromozoma. Transpozon se ugradjuje u slu čajno odabrana mesta u Transpozon se ugradjuje u slu čajno odabrana mesta u hromozomu te može da narhromozomu te može da naruuši integritet vitalnih ši integritet vitalnih gena..gena..TTranspozicija replikativnim mehanizmom je ranspozicija replikativnim mehanizmom je odgovorna za programirane DNK rearanžmane koji reguli šu odgovorna za programirane DNK rearanžmane koji reguli šu ekspresiju gena.ekspresiju gena. ;p;p remeštanje je inicirano delovanjem remeštanje je inicirano delovanjem ekspresiju gena.ekspresiju gena. ;p;p remeštanje je inicirano delovanjem remeštanje je inicirano delovanjem mestomesto--specifi čnih nukleaza koje seku specifi čno ciljno specifi čnih nukleaza koje seku specifi čno ciljno mesto u kome se kopija transpozabilnog elementa ubac ujemesto u kome se kopija transpozabilnog elementa ubac uje . .

Cut-and -paste

Transpozicija – forma genetičke rekombinacije kojom se genetički elementi , transpozoni, premeštaju sa jednog na drugo mesto u DNK delovanjem transpozaza

Cut-and -paste transpozicija

Replikativna transpozicija

STRUKTURNA ORGANIZACIJA STRUKTURNA ORGANIZACIJA EUKARIOTSKIH GENAEUKARIOTSKIH GENAEUKARIOTSKIH GENAEUKARIOTSKIH GENA

Diskontinuiranost eukariotskih genaDiskontinuiranost eukariotskih gena

•1977.- replikacija adenovirusa u kulturi ćelija (Philip Sharp , Richard Roberts)

Količina DNK u genomu eukariota premašuje zbir gena koji kodiraju sve prisutne proteine u ćelijama

Richard Roberts)

•hibridi nekih gena adenovirusa i njima odgovarajućih iRNK sadrže jednolančane petlje što znači da se iRNK ne sparuje sa celom dužinom gena naspram koga se sintetišesintetiše

egzoni(eng. exons, regions that will be expressed)

introni (eng. introns, intragenic regions ili ''junk'' DNK)

Karakteristike intronaKarakteristike intronaPo definiciji gen počinje i završava se egzonima što Po definiciji gen počinje i završava se egzonima što odgovara 5' i 3' kraju iRNK. Introni su sekvence odgovara 5' i 3' kraju iRNK. Introni su sekvence izmedju egzona koje bivaju uklonjene u procesu izmedju egzona koje bivaju uklonjene u procesu obrade primarnog transkripta pri dobijanju zrele obrade primarnog transkripta pri dobijanju zrele iRNK. iRNK. iRNK. iRNK.

Introni se mogu naći i u 3' netranslatirajućem delu iRNK, u Introni se mogu naći i u 3' netranslatirajućem delu iRNK, u protein kodirajućem kao i u 5' lider regionu iRNKprotein kodirajućem kao i u 5' lider regionu iRNK..Dok neki geni mogu imati samo nekoliko introna, drugi mogu Dok neki geni mogu imati samo nekoliko introna, drugi mogu imati i preko 50 introna.imati i preko 50 introna.Njihova veličina može biti manja od 50 baznih parova, ali i Njihova veličina može biti manja od 50 baznih parova, ali i veća i od 200 000 baznih parova. Ukupna dužina introna u veća i od 200 000 baznih parova. Ukupna dužina introna u veća i od 200 000 baznih parova. Ukupna dužina introna u veća i od 200 000 baznih parova. Ukupna dužina introna u genu najčešće je veća od ukupne dužine egzona. Egzoni u genu najčešće je veća od ukupne dužine egzona. Egzoni u većini gena imaju izmeñu 100 i 250 baznih parova.većini gena imaju izmeñu 100 i 250 baznih parova.Broj introna u genima koji kodiraju iste proteine nije isti za Broj introna u genima koji kodiraju iste proteine nije isti za sve organizme, pa ni u istom organizmu (geni za insulin sve organizme, pa ni u istom organizmu (geni za insulin pacova npr.)pacova npr.)“genetički fosili”“genetički fosili”-- moguća uloga u rani fazama genetičke moguća uloga u rani fazama genetičke “genetički fosili”“genetički fosili”-- moguća uloga u rani fazama genetičke moguća uloga u rani fazama genetičke evolucijeevolucijeNestabilniji od egzona, podložni insercijama i delecijamaNestabilniji od egzona, podložni insercijama i delecijama

prokariotiprokariotidiskontinuirani geni prisustvo introna

prokariotiprokariotijedno ćelijskijedno ćelijskieukariotieukariotipekarskipekarski kvasackvasacvinskavinska mušicamušicaSisari, čovekSisari, čovek ––protenproten distrofindistrofin

•nisu prisutni

•mali broj

•4%

•83%

•više od 90%

retka pojava

mali broj

mali broj

gen sa 1-4 introna

veliki broj introna

Nediskontinuirani geni:Nediskontinuirani geni:

multipni geni koji kodiraju histone multipni geni koji kodiraju histone ; ;

gen kod kičmenjaka koji kodira interferongen kod kičmenjaka koji kodira interferon;;gen kod kičmenjaka koji kodira interferongen kod kičmenjaka koji kodira interferon;;mmitohondrijska DNK sisarskih ćelijaitohondrijska DNK sisarskih ćelija;;geni jednostavnijih eukariota, poput kvasca geni jednostavnijih eukariota, poput kvasca ;;geni za tRNK gena izuzev gena za tirozin tRNK, geni za tRNK gena izuzev gena za tirozin tRNK, fenilalaninfenilalanin--, serin, serin--,leucin,leucin--, izoleucin, izoleucin--,triptofan,triptofan--, prolin, prolin-- i i

lizin tRNKlizin tRNK..lizin tRNKlizin tRNK..

Genske karakteristike

karakteristike opis

CpG ostrvaMnogi geni imaju GC bogate uzvodne regione koji mogu da ukjuče prvi egzon. Za razliku od ostatka

genoma ne postoji deficit dinukleotida CpG.genoma ne postoji deficit dinukleotida CpG.

Egzoni Predstavljaju delove gena koji će se prepisati u iRNK nakon što se primarni transkript obradi.

Introni deo gena koji se uklanja iz primarnog transkripta splajsovanjem

šifarski region region gena koji nosi informaciju za sintezu proteina.

5'UTR Region egzona 1 izmeñu kapice i startnog kodona AUG od koga započinje translacija

3'UTR Region krajnjeg egzona izmeñu stop translacionog kodona i poli A mesta na kraju transkripta

VRSTE I FUNKCIJE RNK

iRNK - informacija za sintezu proteina

rRNK - strukturne komponente ribozoma

tRNK - adapteri u procesu translacije,

“prevodioci” geneti čke šifre

Osnovna gradja ista, razlikuju se po baznom sastavu ,

sekundarnoj strukturi i veli čini, sintetišu se u ćeliji u procesu

transkripcije

iRNK

Heterogene i po baznom sastavu, I po veli čini

rRNK unutar jedne vrste ista primarna struktura

S – sedimentacioni koeficijent, brzina sedimentacije molekula u gustinskom gradijentu, jedinica 1 Svedberg (S)

struktura

prokar.: 16 S (1600 n) + 23 S (3200 n) + 5 S eukar.: 18 S (2500 n) + 28 S (5500 n) + 5,8 S + 5 S

modifikacije baza

G-C sadr žajG-C sadr žaj

tRNK najmanje : 4 S (70-90 n)

modifikacije baza

Bogate G-C parovima

Svaka iRNK se sastoji iz:•5’ netranslatirajućeg regiona, 5’UTR (eng. Untranslated region, UTR) - deo iRNK od prvog nukleotida do protein kodirajućeg regiona.•Protein-kodirajućeg regiona -otvoreni okvir čitanja (eng. Open reading frame, ORF) i

•3’ netranslatirajućeg regiona, 3’UTR - deo iRNK od kraja protein-kodirajućeg regiona do zadnjeg nukleotida same iRNK

Prvi kodon u ORFPrvi kodon u ORF--u se naziva u se naziva startstart kodon, a poslednji kodon, a poslednji stopstop kodon. kodon. Startni kodonStartni kodon kod eukariota je uvek šifra za aminokiselinu kod eukariota je uvek šifra za aminokiselinu metioninmetionin i i nikada se ne nalazi na samom početku nikada se ne nalazi na samom početku 55--kraja iRNK, već mu kraja iRNK, već mu prethodi niz nukleotida koji se ne prevodi u protein, a naziva se prethodi niz nukleotida koji se ne prevodi u protein, a naziva se čeoni niz ili lider vodećačeoni niz ili lider vodeća-- sekvenca.sekvenca.Start kodoni kod prokariota su Start kodoni kod prokariota su 55’ AUG ’ AUG 33’ ili ’ ili 55’ GUG ’ GUG 33’, a nekada i ’, a nekada i 55’ ’ UUG UUG 33’, dok je start kodon kod eukariota uvek ’, dok je start kodon kod eukariota uvek 55’ AUG ’ AUG 33’. ’.

Start kodon ima dve važne funkcije:Start kodon ima dve važne funkcije:Start kodon ima dve važne funkcije:Start kodon ima dve važne funkcije:Odreñuje prvu ak koja će biti ugrañena u rastući polipeptidni lanac.Odreñuje prvu ak koja će biti ugrañena u rastući polipeptidni lanac.Definiše okvir čitanja za sve ostale kodone. Definiše okvir čitanja za sve ostale kodone.

Stop kodon definiše kraj ORF i predstavlja signal za terminaciju sinteze Stop kodon definiše kraj ORF i predstavlja signal za terminaciju sinteze polipeptida. Stop kodoni su polipeptida. Stop kodoni su 55’ UAG ’ UAG 33’, ’, 55’ UGA ’ UGA 33’ i ’ i 55’ UAA ’ UAA 33’. Nakon ’. Nakon stop kodona postoji deo koji se ne prepisuje u proteinstop kodona postoji deo koji se ne prepisuje u protein

TRANSKRIPCIJA

Sinteza RNK kao kopije ograni čenog regiona DNK, katalizovana RNK polimerazomRNK polimerazom

Transkripcija podrazumeva sledeće korakeTranskripcija podrazumeva sledeće korake::

(1)(1). . VVezivanje RNK polimeraze za mesto inicijacijeezivanje RNK polimeraze za mesto inicijacije ..DNK sekvenca koja predstavlja mesto inicijacije transkripcije se DNK sekvenca koja predstavlja mesto inicijacije transkripcije se naziva naziva promotorpromotor ..Prokariotske polimeraze mogu da prepoznaju same promotor i da se Prokariotske polimeraze mogu da prepoznaju same promotor i da se vežu direktno za njega ali eukariotske polimeraze da bi se vezale za vežu direktno za njega ali eukariotske polimeraze da bi se vezale za promotor zahtevaju prisustvo proteina koji se nazivaju transkripcioni promotor zahtevaju prisustvo proteina koji se nazivaju transkripcioni promotor zahtevaju prisustvo proteina koji se nazivaju transkripcioni promotor zahtevaju prisustvo proteina koji se nazivaju transkripcioni faktori faktori

(2) Rasplitanje, topljenje dvolan čanog molekula DNK(2) Rasplitanje, topljenje dvolan čanog molekula DNK može da može da ostvari enzim helikaza. Prokariotske polimeraze imaju helikaznu ostvari enzim helikaza. Prokariotske polimeraze imaju helikaznu aktivnost ali eukariotske polimeraze nemaju. Razmotavanje aktivnost ali eukariotske polimeraze nemaju. Razmotavanje eukariotskuh DNK se nalazi pod kontrolom transkripcionih faktoraeukariotskuh DNK se nalazi pod kontrolom transkripcionih faktora

(3)(3) Elongacija Elongacija -- sinteza RNK se sprovodi prema sekvencama sinteza RNK se sprovodi prema sekvencama zapisanim u DNK templetuzapisanim u DNK templetu -- matricimatrici . RNK polimeraza koristi . RNK polimeraza koristi zapisanim u DNK templetuzapisanim u DNK templetu -- matricimatrici . RNK polimeraza koristi . RNK polimeraza koristi nukleozid 5 trifosfate (NTPs) za sintezu RNK lanca nukleozid 5 trifosfate (NTPs) za sintezu RNK lanca

(4)(4) Terminacija sintezeTerminacija sinteze .. Prokarioti i eukarioti koriste različite Prokarioti i eukarioti koriste različite terminacione signale za zaustavljanje transkripcije. terminacione signale za zaustavljanje transkripcije.

Opšti pregled transkripcionih dogadjajaOpšti pregled transkripcionih dogadjaja

Transkripciona jedinica-segment DNK koji se prepisuje

1.Vezivanje RNK polimeraze za promotor

2.Odvijanje DNK (17n), povezivanje prva dva ribonukleozid trifosfata-ATP;GTP;CTP;UTP, (faza inicijacije)3. produživanje RNK lanca u smeru5’- 3’; (faza elongacije)

3. Terminacijai odvajanje RNK polimeraze i RNK produkta

Proizvodi transkripcije: iRNK, tRNK,rRNK, snRNK (mala nuklearna RNK), snoRNK (mala nukleolusna RNK) i druge nekodirajuće RNK

RNK produkta

Osnovna UOsnovnareakcija

transkripcijeFormiranje

fosfodiestarske veze

Orijentacija promotora iizbor lanca -matrice

Prepisuje se uvek samo jedan deo jednog lanca DNK , a drugi ne. Koji od lanaca će biti prepisan diktiraju enzimi polimeraze koji mogu da deluju samo u pravcu 5'-3' , znači da će lanac matrica biti u pravcu 3 '- 5'

Novosintetisani (“sense” ili smisleni lanac) lanac RNK je i po smeru i po redosledu nukleotida identi čan lancu DNK koji nije prepisan osim što umesto T ugradjuje U (“nonsense” ili besmisleni lan ac )

Transkripcija kod prokariotaTranskripcija kod prokariota

Kod prokariota transkripcija se odvija Kod prokariota transkripcija se odvija u nukleoiduu nukleoidu. . Kod prokariota transkripcija se odvija Kod prokariota transkripcija se odvija u nukleoiduu nukleoidu. . Sve tri vrste RNK prepisuje Sve tri vrste RNK prepisuje isti enzim, RNK isti enzim, RNK polimerazapolimerazaTranskripciona jedinicaTranskripciona jedinica --segment DNK koji se segment DNK koji se prepisujeprepisujeMolekul iRNK, koji nastaje na ovaj način se ne Molekul iRNK, koji nastaje na ovaj način se ne obrañuje, odmah po sintezi je funkcionalan, nosi obrañuje, odmah po sintezi je funkcionalan, nosi informaciju za sintezu obično više proteina, koji su informaciju za sintezu obično više proteina, koji su informaciju za sintezu obično više proteina, koji su informaciju za sintezu obično više proteina, koji su potrebni za obavljanje jednog metaboličkog procesapotrebni za obavljanje jednog metaboličkog procesa..Pošto se set susednih gena prepisuje na jednu RNK Pošto se set susednih gena prepisuje na jednu RNK koja onda kodira više proteina, ova RNK je označena koja onda kodira više proteina, ova RNK je označena kao kao POLICISTRONSKAPOLICISTRONSKAKod eukariotaKod eukariota--1gen1gen--1RNK1RNK--1 protein1 protein--MONOCISTRONSKA RNKMONOCISTRONSKA RNK

TRANSKRIPCIJA KOD PROKARIOTA

• Istovremeno sa translacijom

• iRNK - kratkožive će

• RNK polimeraza E.coli

•RNK polimeraza se kod prokariota sastoji iz 6 polip eptidnih lanaca; α, α΄, β,

β', δ i ω, u momentu kada gradi holoenzim. Jezgro enzima predstavljaju 5

subjedinice (α, α΄, β, β' ω), a kada se jezgru pridruži sigma subjedinica,

nastaje holoenzim; kanal širine dsDNK i dužine 16 bp.

Jezgro: αααα ββββ ββββ’ ωωωω-katal. centar: ββββ ββββ’ - nespecifi čno vezuje za DNK kanalom i klizi duž lanca. Ugradjuje 50 nukleotida /secSigma subjedinica ima ulogu u prepoznavanju promoto rskog regiona. Jezgro katalizuje formiranje fosfodiesterske veze

RNK polimeraze po svom obliku podese ćaju na rakova klešta . Ručice rakovih klešta se sastoje od dve najveće subjedinice β i β’ Kompletan enzim RNK polimeraza klizi duž DNK molekula dok sigma subjedinica ne prepozna specifičan redosled nukleotida, i koji se nalazi u okviru promotorskog regiona.

5 kanala: za ulaz i ugradnju NTP, za ulaz i izlaz DNK, za izlaz RNK

RNK polimerazaRNK polimeraza , za razliku od DNK pol, može , za razliku od DNK pol, može da inicira sintezu RNK molekula da inicira sintezu RNK molekula de novode novo, što , što zahteva da inicijacioni ribonukleotid uñe u zahteva da inicijacioni ribonukleotid uñe u da inicira sintezu RNK molekula da inicira sintezu RNK molekula de novode novo, što , što zahteva da inicijacioni ribonukleotid uñe u zahteva da inicijacioni ribonukleotid uñe u aktivno mesto gde će biti stabilno držan u aktivno mesto gde će biti stabilno držan u sparenom stanju sa matricom dok se ne doda sparenom stanju sa matricom dok se ne doda drugi ribonukleotid, odnosno dok se ne formira drugi ribonukleotid, odnosno dok se ne formira prva fosfodiestarka veza. Skoro svi RNK prva fosfodiestarka veza. Skoro svi RNK molekuli na početku imaju molekuli na početku imaju A A nukleotid, što je nukleotid, što je posledica toga što RNK pol može da uspostavi posledica toga što RNK pol može da uspostavi posledica toga što RNK pol može da uspostavi posledica toga što RNK pol može da uspostavi specifične intreakcije sa A ribonukleotidom, koje specifične intreakcije sa A ribonukleotidom, koje su dovoljne da stabilno održe početni nukleotid su dovoljne da stabilno održe početni nukleotid do ugradnje sledećeg.do ugradnje sledećeg.

Bakterijski promotori (E -coli)

Konsenzusni nizovi: 2 x 6 n nizova na rastojanju 16 -19 n koje prepoznaje σ subjedinica, na istoj strani 19 n koje prepoznaje σ subjedinica, na istoj strani DNK molekula

TTGACA (recognition domain; oko -35)

TATAAT (Pribnovljev blok; unwinding domain; oko -10)

Orijentacija promotora – zavisi od medjusobnog položaja dva heksanukleotidapoložaja dva heksanukleotida

iRNK

-35 -10 +15' – TAGTGTATTGACATGATAGAAGCACTCTACTATAAT CTCAATAGGTCCACG – 3'3' – ATCACATAACTGTACTATCTTCGTGAGATGATATTAGAGTTATCCAGGTGC – 5'

Transkripcija

5'

DNK

Mesto po četka transkripcije

Uzvodno

Nizvodno

Različiti bakterijski promotori

UP element vezuje ααααCTD

INICIJACIJA TRANSKRIPCIJE

I: “Zatvoreni kompleks “ σ subjedinice i DNK na poziciji -35

II: Lokalna denaturacija DNK (17bp) helikazom oko re giona -10 (AT parovi)10 (AT parovi)

III:Otvoreni kompleks RNK pol sa lancem matricom

IV: Disocijacija σσσσ subjedinice, jezgro ostaje vezano

ELONGACIJA LANCA RNK

Brzina 20-50 n/sVelika ta čnost Za vreme elongacije RNK polimeraza obavlja čitav niz funkcija:Za vreme elongacije RNK polimeraza obavlja čitav niz funkcija:

•Odmotova DNK ispred sebe•Sintetiše RNK•Disocira rastu ći lanac RNK od DNK matrice•Renaturiše DNK iza sebe

Transkripcija E.coli RNK polimerazom

TERMINACIJA TRANSKRIPCIJE

E.coli

5’ - CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTTAATGA - 3’ 3’ - GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAAGAAATTACT - 5’ DNK Transkripcija

5’ - CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU -3’-OH RNK Savijanje RNK

C

Invertovani ponovci

Simetri čni nizovi u kojima su nukleotidi čitani sa dva kraja u suprotnim pravcima komplementarni C

U C U G G ≡ C A ≡ U C ≡ G C ≡ G Intramolekulska zavojnica G ≡ C C ≡ G C ≡ G G ≡ C A A 5’ - CCCAC UUUU - 3’-OH

Poli-U/Poli A RNK-DNK hibrid ubrzo disosuje I RNK kao I RNK polimeraza se odvajaju

TRANSKRIPCIJA KOD TRANSKRIPCIJA KOD

EUKARIOTA

Razlike izmedju inicijacija transkripcije kod

prokariota i eukariota

• (1) Bakterije sadrže jedan tip RNK polimeraze dok eukariotesadrže 3 tipa koje transkribuju različite tipove gena.

• (2) Bakterijska RNK polimeraza može sama iniciratitranskripciju dok eukarioteske zahtevaju pomoć odredjenihproteina-transkripcionih faktora

• (3) Proteini koji regulišu ekspresiju gena eukariota mogu uticati• (3) Proteini koji regulišu ekspresiju gena eukariota mogu uticatina inicijaciju transkripcije i kada se vežu za DNK hiljadama

baznih parova daleko od promotora

• (4) Inicijacija transkripcije kod eukariota je kompleksnija i zbogpakovanja DNK u nukleozome.

Tranksripcija i translacija vremenski i prostorno Tranksripcija i translacija vremenski i prostorno odvojeneodvojene

RNK polimeraze (14RNK polimeraze (14--18 subjed.) 18 subjed.) Pored jedarnih Pored jedarnih eukariotske eukariotske ćelije sadrže RNK polimeraze i u mitohondrijama i ćelije sadrže RNK polimeraze i u mitohondrijama i eukariotske eukariotske ćelije sadrže RNK polimeraze i u mitohondrijama i ćelije sadrže RNK polimeraze i u mitohondrijama i

hloroplastimahloroplastima

RNK polimeraza IIRNK polimeraza II (geni koji kodiraju proteine; 20(geni koji kodiraju proteine; 20--40% ukupne aktivnosi))40% ukupne aktivnosi))RNK polimeraza IRNK polimeraza I (18S i 28S rRNK; (18S i 28S rRNK; RNK polimeraza IRNK polimeraza I (18S i 28S rRNK; (18S i 28S rRNK; 5050--70% ukupne aktivnosti))70% ukupne aktivnosti))RNK polimeraza IIIRNK polimeraza III (tRNK, 5S RNK; (tRNK, 5S RNK; ≈≈10% ukupne aktivnosti)10% ukupne aktivnosti)

RNK polimeraze u eukariotskoj ćeliji

lokalizacija produkti

RNK pol I

RNK pol II

lokalizacija produkti

nukleolus 28S , 18S , 5.8S rRNK

nukleus m(i) RNK i neke snRNK

RNK pol IIInukleus tRNK , 5S rRNK i neke snRNK

Za vezivanje RNK polimeraza za promotore neophodni su promotore neophodni su TRANSKRIPCIONI FAKTORI (TF)

Promotor - definiše se prema mestima za koje se vezuju TF mestima za koje se vezuju TF (promotorskim elementima)

PROMOTORI ZA RNK POLIMERAZU I

• Struktura specifi čna za vrstu, enzim date vrste može se vezati

samo za promotore iste, ili vrlo srodnih vrsta

• Sve rRNK - 1 transkripc. jed. - 1 promotor

• Promotor bipartitan - npr. humani• Promotor bipartitan - npr. humani

1. niz: -45 do +20 = “jezgro promotora”

2. niz: -180 do -107 = uzvodni kontrolnielement (UCE; pove ćava efikasnost)

Za promotorske sekvence se vezuju dva transkripciona faktora, uzvodni vezujući faktor (UBF) i selektivni faktor 1 (SL1) koji se kooperativno vezuju za promotor i zatim regrutuju polimerazu I za formiranje inicijacionog kompleksa.

Pošto promotor ribozomalnih RNK ne sadrži TATA blok, TBP se ne vezuje za specifičnu promotorsku sekvencu, već asocira sa rRNK genima preko vezivanja drugih proteina iz SL1 kompleksa

za promotor.za promotor.

PROMOTORI ZA RNK POLIMERAZU III• Intragenski ( prepoznaje promotore koji se nalaze unutar strukturnih gena) i bipartitni

(1) za 5S RNK - nizovi A i C (poz. +55 do +80)

(2) za tRNK - blokovi A i B(2) za tRNK - blokovi A i B

Potrebni TF:

TFIIIC – pomaže vezivanje TFIIIB

TFIIIB = TBP + 2 prot.; dovodi E•

RNK Pol IIIRNK Pol III

Uloga A bloka je da postavi polimerazu u položaj koji odredjuje Uloga A bloka je da postavi polimerazu u položaj koji odredjuje tačno mesto inicijacije transkripcije, dok se za B blok vezuju tačno mesto inicijacije transkripcije, dok se za B blok vezuju proteini koji učestvuju u regulaciji transkripcijeproteini koji učestvuju u regulaciji transkripcijeproteini koji učestvuju u regulaciji transkripcijeproteini koji učestvuju u regulaciji transkripcije

PROMOTORI ZA RNK POLIMERAZU II

Jezgro promotora ili min imalni promotor( ~ 40 bp; dovoljno za transkripciju na bazalnom nivou)

Čini ga 4 elementa :1) kratka inicijatorska (Inr) se kvenca (Py2ANPy5)koja okružuje transkripcioni po četak (A) , 2) TATA box, 3)BRE-TFIIB recognition element i 4) DRE-Downstream promoter el ement

Regulatorne sekvence genaPromotor: TATA blok + uzvodni promotorski elementi

-Proksimalni regulatorni (kontrolni) elementi ,leže uz promotor (elementi unutar 100-200 nukleotid a od startnog mesta) i vezuju regulatorne transkripcione faktore.

-Uzvodne promotorske sekvence-Uzvodne promotorske sekvence/GC blok: GGGCGG (konst. geni); CAAT blok (mnogi ge ni;odreñuje efikasnost); CACCC blok; Oct = oktameri (8 bp)/ ,

-- Distalni regulatorni (kontrolni ) elementi:

Pojačivači,(enhancers)-poja čavaju transkripciju i vezuju AKTIVATORE

- Utišiva či- Utišiva či(silencer)- inhibiraju transkripciju i vezuju REPRES ORE

- Koaktivatori (kontrolišu aktivnost i posreduju u int erakcijama izmedju aktivatora kompleksa RNK polimeraze vezane za promotor )

• Broj, raspored i kombinacija regulatornih sekvencirazli čiti od gena do gena

• Promotori su modularni

Podela TF prema ulozi:

• Opšti TF (faktori inicijacije; formiraju• Opšti TF (faktori inicijacije; formirajupreinicijacioni kompleks)

• TF koji se vezuju za UPE

• Inducibilni

Regulatorni proteini; aktivatori, represori

TTranskripcioniranskripcioni faktorifaktori predstavljajupredstavljaju veomaveomaheterogenuheterogenu grupugrupu proteinaproteina kojukoju činečine ::((11)) generalnigeneralni iliili opštiopšti transtranskripcionikripcioni--faktorifaktori ii((22)) inducibilniinducibilni transtranskripcionikripcioni faktorifaktori..((22)) inducibilniinducibilni transtranskripcionikripcioni faktorifaktori..Generalni transkripcioni faktori se vezuju za Generalni transkripcioni faktori se vezuju za promotore svih gena koji se transkribuju promotore svih gena koji se transkribuju gradećI preinicijacioni kompleks koji ostvaruje gradećI preinicijacioni kompleks koji ostvaruje bazalni nivo transkripcije gena.bazalni nivo transkripcije gena.TkivnoTkivno--specifični i/ili inducibilni transkripcioni specifični i/ili inducibilni transkripcioni faktori specifično prepoznaju pojačivače gena faktori specifično prepoznaju pojačivače gena faktori specifično prepoznaju pojačivače gena faktori specifično prepoznaju pojačivače gena u onim tkivima u kojima se ti geni u onim tkivima u kojima se ti geni eksprimirajueksprimiraju

Mehanizam delovanja transkripcionih faktoraMehanizam delovanja transkripcionih faktora

TipičanTipičan transkripcionitranskripcioni faktorfaktor sadržisadržiDNKDNK vezujućivezujući domendomen (DVD)(DVD) kojikoji jeje odgovoranodgovoran zaza specifičnostspecifičnostinterakcijeinterakcije sasa DNK,DNK,interakcijeinterakcije sasa DNK,DNK,multimerizacionimultimerizacioni domendomen odgovoranodgovoran zaza formiranjeformiranje homohomo-- iliiliheterooligomeraheterooligomera iidomen za aktivaciju/inhibiciju procesa transkripcije domen za aktivaciju/inhibiciju procesa transkripcije (transaktivacioni domen, TAD(transaktivacioni domen, TAD

DNK vezujući motiviDNK vezujući motiviStrukture DNKStrukture DNK --vezivnih domena vezivnih domena

TFTF11)).. motivmotiv cinkanihcinkanih prstijuprstijuStrukturuStrukturu ovogovog motivamotiva činičini jedinicajedinica:: XX33--CYSCYS--XX22--44--CYSCYS--XX1212--HISHIS--XX33,,44--HISHIS--XX44StrukturuStrukturu ovogovog motivamotiva činičini jedinicajedinica:: XX33--CYSCYS--XX22--44--CYSCYS--XX1212--HISHIS--XX33,,44--HISHIS--XX44gdegde XX predstavljapredstavlja bilobilo kojukoju aminokiselinuaminokiselinu.. UU okviruokviru oveove jedinicejedinice atomatom ZnZn sesetetraedarskitetraedarski vezujevezuje zaza 22 CysCys ostatkaostatka smeštenasmeštena uu ukosniciukosnici ii 22 HisHis ostatkaostatka iziz heliksaheliksaformirajućiformirajući petljupetlju dugudugu 1212 aa..kk.. TranskripcioniTranskripcioni faktorifaktori uvekuvek sadržesadrže viševiše ovihovih jedinicajedinica ((11--3737)) formirajućiformirajući prsteprste popo kojimakojima jeje ovajovaj motivmotiv ii dobiodobio nazivnaziv (TFIIIA(TFIIIA imaima 99 prstiju,prstiju, SpSp11imaima 33,, itd)itd)

22)) baznibazni helixhelix--petljapetlja--helixhelix motivmotiv (Helix(Helix--looploop--helix,helix, bHLH)bHLH)Ovaj motiv sastavljen je od 2 helična lanca koja su razdvojena Ovaj motiv sastavljen je od 2 helična lanca koja su razdvojena petljom nepoznate strukture. Unutar ovih heliksa na svakom 3petljom nepoznate strukture. Unutar ovih heliksa na svakom 3--4 4 položaju javlja se hidrofobna aminokiselina koja učestvuje u položaju javlja se hidrofobna aminokiselina koja učestvuje u položaju javlja se hidrofobna aminokiselina koja učestvuje u položaju javlja se hidrofobna aminokiselina koja učestvuje u formiranju dimera. Iza ovih regiona nalazi se trećiformiranju dimera. Iza ovih regiona nalazi se treći helikoidni helikoidni region bogat baznim aminokiselinama, argininom i lizinom, koji region bogat baznim aminokiselinama, argininom i lizinom, koji je odgovoran za vezivanje za DNK je odgovoran za vezivanje za DNK

33)) baznibazni heliksheliks--zavojzavoj--heliksheliks motivmotiv (Helix(Helix--turnturn--helix,helix, bb HTH)HTH)Sastavljen je odSastavljen je od33--4 helična regiona od kojih se po dva nalaze 4 helična regiona od kojih se po dva nalaze pod pravim uglom; jedan par je paralelan sa DNK zavojnicom i pod pravim uglom; jedan par je paralelan sa DNK zavojnicom i vezuje se za njuvezuje se za nju

4) 4) motiv leucinskog "rajfešlusa" (“Leucinemotiv leucinskog "rajfešlusa" (“Leucine--zipper”) zipper”) Strukturu ovog motiva čine 2 helična regiona od kojih je jedan na Strukturu ovog motiva čine 2 helična regiona od kojih je jedan na karboksikarboksi--terminalnom kraju i njega karakteriše prisustvo periodično terminalnom kraju i njega karakteriše prisustvo periodično rasporedjenih leucina, na svakoj sedmoj poziciji tako da su postavljeni rasporedjenih leucina, na svakoj sedmoj poziciji tako da su postavljeni uvek sa iste strane DNK lanca. Na aminouvek sa iste strane DNK lanca. Na amino--terminalnom kraju leucinskog terminalnom kraju leucinskog regiona nastavlja se region bogat pozitivno naelektrisanim amino regiona nastavlja se region bogat pozitivno naelektrisanim amino regiona nastavlja se region bogat pozitivno naelektrisanim amino regiona nastavlja se region bogat pozitivno naelektrisanim amino kiselinama, argininom i lizinomkiselinama, argininom i lizinom.. OOvaj bazni region prevashodno vaj bazni region prevashodno uključen u proteinuključen u protein--DNK kontakte, dok region bogat leucinom učestvuje DNK kontakte, dok region bogat leucinom učestvuje u dimerizaciji. Formiranjem dimera, dva leucinska regiona postavljaju u dimerizaciji. Formiranjem dimera, dva leucinska regiona postavljaju se sa obe strane DNK heliksa, što omogućava postavljanje dva DVD se sa obe strane DNK heliksa, što omogućava postavljanje dva DVD dimernog molekula u položaj dostupan za vezivanje za DNK.dimernog molekula u položaj dostupan za vezivanje za DNK.

POU motivHomeodomen

Homeodomen + heliks-zavoj-heliks

3 = “recognition helix”

Podela TF prema motivima preko kojih Podela TF prema motivima preko kojih dimerizujudimerizuju

(1)bZIP proteine koji imaju dimerizacioni (1)bZIP proteine koji imaju dimerizacioni domen tipa "leucinskog rajfešlusa", idomen tipa "leucinskog rajfešlusa", idomen tipa "leucinskog rajfešlusa", idomen tipa "leucinskog rajfešlusa", i(2) bHLH proteini kod kojih se dimerizacija (2) bHLH proteini kod kojih se dimerizacija ostvaruje preko "heliksostvaruje preko "heliks--petljapetlja--heliks" heliks" domenadomena

TAD TAD ––transaktivacioni domenitransaktivacioni domeni

: kiseli: kiseli (snažno negativno naelektrisanje (snažno negativno naelektrisanje uvećava transkripciju)uvećava transkripciju)uvećava transkripciju)uvećava transkripciju)bogati glutaminom Ibogati glutaminom Ibogati prolinom.bogati prolinom.

REGULACIJA EKSPRESIJE GENA

• Većina gena se ne eksprimira svo vreme

•Ekspresija gena = sinteza funkcionalnogprodukta

• Sve ćelije, od bakterija do sisara, imaju sposobnost da reaguju na signale iz spoljašnje

sredine tako što menjaju aktivnost gena u skladu sa svojim trenutnim potrebama.

• Regulacija je važan deo skoro svakog procesa u prirodi

• Šta aktivira gene? Šta ih isključuje/inaktivira?

• Šta odredjuje nivo aktivnosti gena?

REGULACIJA EKSPRESIJE GENA U PROKARIOT SKIM

ĆELIJAMA

• KONSTITUTIVNI GENI – geni koji su stalno aktivni • KONSTITUTIVNI GENI – geni koji su stalno aktivni (npr. Geni koji kodiraju enzime glikolize) i njihova ekspresija NIJE REGULISANA

• REGULISANI GENI- kodiraju enzime metaboličkih procesa (kataboličkih/degradativnih ili anaboličkih/sintetskih) koji nisu stalno potrebnianaboličkih/sintetskih) koji nisu stalno potrebni

•Adaptabilnost i ekonomičnost genoma bakterijske ćelije

Transkripcija itranslacija su spregnutetranslacija su spregnute

Fleksibilna organizacija bakterijskog genoma predstavljena

je transkripcionom jedinicom:je transkripcionom jedinicom:

OPERON

Francois Jacob Jacques Monod

Geni bakterija su grupisani tako da se jedan do drugog nalaze geni koji kodiraju funkcionalno povezane enzime, najčešće učesnike jednog biohemijskog puta. Ceo set takvih gena sadrži 1 promotor i transkribuje se kao 1 transkripciona jedinica, a iRNK je policistronska –

Set gena koji predstavlja jednu ekspresionu jedinicu, tj. uključuje strukturne gene i elemente koji kontrolišu njihovu ekspresiju, naziva se OPERON

Prednost operonske organizacacije- sinteza više polipeptida regulisana .

Prednost operonske organizacacije- sinteza više polipeptida regulisana jednim mestom

1

2

2

•Skoro kompletna regulacija ekspresije gena kod bakterija odvija se na nivou transkripcije mehanizmom cis-trans interakcija

•Gen je sekvenca DNK molekula koja kodira funkcionalni produkt (protein ili RNK) koji odlazi sa mesta sinteze i deluje negde drugde-trans-delujući genski produkt

•Geni unutar operona:

strukturni-bilo koji gen koji kodira proteinski produkt

gen regulator-strukturni gen koji kodira protein uključen u regulaciju ekspresije drugih gena

•Cis-delujuće sekvence- mesta u DNK (OPERATOR) koja regulišu ekspresiju gena kroz interakcije sa produktima regulatornih gena

•Regulacija ekspresije gena kod bakterija odvija se na nivou transkripcije •Regulacija ekspresije gena kod bakterija odvija se na nivou transkripcije kroz interakcije produkta regulatornog gena (trans-faktora) sa cis-delujućom sekvencom (promotor i operator)

•Regulacija može biti pozitivna (interakcija sa AKTIVATORIMA, regulatornimproteinima koji aktiviraju ekspresiju gena/ transkripciju) ili negativna (dolazi do gašenja genske ekspresije interakcijom sa REPRESORIMA, regulatornim proteinima koji inhibiraju transkripciju)

LAKTOZNI OPERONBakterijski operon za katabolizam laktoze.

25 n DNK

3'

Laktoza-beta galaktozid , izvor energije i atoma ugljenika

Lac I P O lacZ lacY lacA

iRNKiRNK

Galaktozid

25 n 5'

P1040 3510 780 82582

monocistronskapolicistronska

3'

Lac represor

β-galaktozidaza

Galaktozid permeaza

Tiogalaktozid transacetilaza

P-promotor,sekvenca koja kaže da transkripcija mora započeti i koji kontroliše njenu brzinu;ne prepisuje se u iRNK, O-operator, cis delujući element koji sadrži sekvencu od 14bp ograničenu sa obe strane nizom ACAA koju prepoznaju regulatorni represori

policistronska

Negativna kontrola laktoznog operona

RNK polimeraza

Lac I P O lacZ lacY lacA

U odsustvu laktoze represor se vezuje za O i sprečava vezivanje RNK pol

Transkripcija je blokirana(neaktivan operon)

vezivanje RNK pol

Lac represor u kompleksu sa DNK

Lac represor je alosterični tetramerni protein sa dva vezna mesta, za DNK i

za induktor-alolaktozu (izomer D-laktoze koji je u ćeliji prisutan kad i laktoza)

Laktoza Galaktozid permeaza

Alolaktoza je sporedni proizvod β-galaktozidazne reakcije –D-laktoza

Laktoza

ββββ-galaktozidaza

Alolaktoza

Galaktoza Glukoza

ββββ-galaktozidaza

Negativna kontrola laktoznog operona (Jer se transkripcija odvija u odsustvu represora)

RNK polimeraza

Lac I P O lacZ lacY lacA

U prisustvu laktoze njen izomer -alolaktoza

neakt.represor+ =

Transkripcija aktivna

iRNK

Enzimi

alolaktoza(induktor) vezuje se za represor,

menja mu konformaciju i slabi afinitet za operator (alosterična kontrola)

Derepresija

Represor može da:

� onemogući vezivanje RNK polimeraze (lac represor) jer � onemogući vezivanje RNK polimeraze (lac represor) jer se preklapa njegovo mesto vezivanja sa mestom RNK pol

� inhibira inicijaciju vezujući se za RNK polimerazu koju sprečava da se kreće duž DNK i započne transkripciju

� inhibira inicijaciju održavajući promotor u konformacijinepodesnoj za inicijacijunepodesnoj za inicijaciju

Alosterična kontrola Lac operona- alosteričnim represorom koji egzistira u dva konformaciona stanja od kojih je jedno aktivno a drugo neaktivno

Kompleks lac represor-DNK

“Zatvorena konformacija”

Konformaciona promena represora indukovana vezivanjem induktora

“otvorena konformacija”

O

Promotor

Neaktivan

U prisustvu induktora

represor se ne vezuje za operator

Strukturni geni

Induktor /efektor

može imati različite efekte na afinitet represora prema

operatoru

induktor

Neaktivanrepresor

+Aktivacijatranskripcije

O

Promotor

Strukturni geniU prisustvu

induktora

induktor

Inhibicija transkripcije

vezivanje represora za

operator je olakšano

� Regulatorni proteini (represori /aktivatori) su najčešće kontrolisani substancama-malim organskim molekulima prisutnim u ćeliji ili njenom okružen (induktori/efektori)- koje su medjuproizvodi metabolizma proteinskog medjuproizvodi metabolizma proteinskog produkta gena koga regulišu

�Efektori regulišu ekspresiju gena indukujući alosterne promene proteina

�Za kataboličke puteve efektori su skoro uvek substrati (laktoza npr.) koji indukuju ekspresiju gena i samim tim sintezu proteinagena i samim tim sintezu proteina

�Za anaboličke puteve efektori su obično krajnji produkti metaboličkog puta koji represuju gensku ekspresiju i sintezu enzima

Pozitivna kontrola Lac operona aktivatorima

operator

promotor

DNK

Kada je aktivator vezan za operator, RNK polimeraza se vezuje za promotor i započinje transkripciju:

aktivatorRNK polimeraza

Aktivan gen

U odsustvu aktivatora RNK polimeraza se ne vezuje za operator. Nema U odsustvu aktivatora RNK polimeraza se ne vezuje za operator. Nema transkripcije:

Neaktivan gen

Aktivatori• Većina aktivatora ima dva vezujuća mesta: jedno za

DNK i jedno za RNK polimerazu• Tipično, aktivator vezuje DNK i RNK polimerazu

istovremeno i drži RNK Pol dovoljno dugo da ona istovremeno i drži RNK Pol dovoljno dugo da ona započne transkripciju – mehanizam regrutovanja,okupljanja

• Ne aktiviraju se svi promotori na isti način. Nekad RNK Pol može efikasno da se veže za promotor, ali kompleks promotor-RNK pol nije efikasan da konvertuje otvorenu promotor-RNK pol nije efikasan da konvertuje otvorenu konformaciju za inicijaciju transkripcije. Tada se aktivator veže za ovaj kompleks i indukuje konformacione promene ili u DNK ili u RNK Pol, što vodi otvaranju DNK i otpočinjanju transkripcije

RNK polimeraza

Aktivan genaktivator

iRNKU prisustvu

induktora aktivator se

ne vezuje za

Induktor može imati različite efekte na afinitet aktivatora prema operatoru

proteininduktor

uklonjeniaktivator

ne vezuje za operator

RNK polimerazaaktivator

Aktivan gen

U prisustvu induktora

aktivator se vezuje za operator

induktor

CAP ili CRP AKTIVATOR

• CAP (catabolite gene activator protein) poznat i kao cAMP receptor protein (CRP) je dimerni protein, transkripcioni aktivator E.coli koji aktivira transkripciju mnogih gena uključenih u metabolizam šećera (laktoze, galaktoze, arabinoze) kada u ćeliji nema dovoljno glukoze, koja je osnovni izvor kada u ćeliji nema dovoljno glukoze, koja je osnovni izvor energije. Vezuje za DNK samo kad je u kompleksu sa cAMP i aktivira transkripciju interakcijom sa RNK Pol tako što povećava frekvenciju inicijacije transkripcije ili menjajući konformaciju DNK u oblasti promotora

• Manjak glukoze→više cAMP→CAP kompleksovanje→vezivanje za Lac ili druge operone u odsustvu represora→stimulisanje transkripcijerepresora→stimulisanje transkripcije

• Ovakav mehanizam regulacije omogućava bakterijskoj ćeliji da u odsustvu glukoze dodje do potrebne energije razgradnjom npr. Laktoze

• Fenomen represije katabolita

Niska glukoza

Catabolit Catabolit activator protein

+ L-arabinoza

Aktivator

protein AraC

Transkripciju regulišu kompleks CAP-cAMP i protein AraC koji vezuje L-arabinozu

ARABINOZNI OPERON (araBAD) Primer + i – kontrole istim proteinom (AraC)

-

Represor

araC araO2 araO1 CAP araI ara B ara A ara D

Strukturni genikontrolna mesta

Operator AraC

araC iRNK

Regulatorni gen araBAD iRNK

Enzimi za razgradnju arabinozeAra C

←

→Operator AraC

Odsustvo AraC

Regulacija transkripcije araBAD operona

Visok nivo glukoze=

cAMP ↓ i L-arabinoza ↓

⇒ AraC = represor

cAMP ↑ i L-arabinoza ↑ kompleksovanje AraC i arabinoze ⇒AraC i arabinoze ⇒AraC = aktivator

TRIPTOFANSKI OPERON-regulacija ATENUACIJOM

Sintetiše enzime biosinteze aminokiseline triptofan

Regulacija ekspresije na dva na čina:1. Interakcijom kompleksa represor (trpR gen) -korepresor (L -1. Interakcijom kompleksa represor (trpR gen) -korepresor (L -triptofan) ioperatora smanjuje se brzina transkripcije trp-opero na 70 puta2. Atenuacijom preko formiranja sekundarne struktur e (ukosnice) u molekulu iRNK indukovane atenuatorskim regionom tr p-operona

Čeoni niz

Strukturni geni

LL

L6720n

140n“Prerana terminacija transkripcije trp operona”

Regulacija transkripcije Trp operona

Regulacija transkripcije Trp operona

Sadrži 2 uzastopna kodona za Trp↓↓