Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji …. Bialas.pdf · 2013-12-01 · Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni

Optymalizacja procesu jednoczesnejhydrolizy i fermentacji natywnejskrobi metod¹ powierzchniodpowiedzi

Wojciech Bia³as, Dorota Wojciechowska, Daria Szymanowska,

W³odzimierz Grajek

Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ¯ywnoœci,

Uniwersytet Przyrodniczy, Poznañ

Optimization of simultaneous saccharification and fermentation of

the native starch by using response surface method

S u m m a r y

Ethanol production, by a simultaneous saccharification and fermentation

process (SSF) of native starch from corn flour, has been performed by

Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red) and granular starch hydrolyzing enzyme

(STARGEN 001). The quantitative effects of mash concentration, enzyme dose

and pH were investigated by the use a Box–Wilson central composite design

protocol. It was found that for native corn starch, maximum ethanol concentra-

tion of 110,36 g/l was obtained using a mash concentration of 25%, which re-

sulted in ethanol yield of 85,71%. The optimum conditions for the above yield

were found for the enzyme dose of 2,05 ml/kg and pH of 5.0. These results indi-

cated that by using the central composite design, it is possible to determine ac-

curate values of the fermentation parameters for maximum ethanol production.

Key words:

bioethanol, native starch, simultaneous saccharification and fermentation,

response surface method.

1. Wprowadzenie

Etanol uzyskiwany na drodze fermentacji biopolimerów ta-

kich jak skrobia i celuloza jest alternatyw¹ dla paliw pochodze-

nia kopalnego. G³ówne zalety jakie p³yn¹ z wykorzystania tego

P R A C E E K S P E R Y M E N T A L N E

Adres do korespondencji

Wojciech Bia³as,Katedra Biotechnologiii Mikrobiologii ¯ywnoœci,Uniwersytet Przyrodniczy,ul. Wojska Polskiego 48,60-627 Poznañ.

4 (87) 183–199 2009

rodzaju substratów zwi¹zane s¹ z ograniczeniem emisji gazów cieplarnianych jak

równie¿ aktywacj¹ terenów wiejskich poprzez zwiêkszenie produkcji rolniczej na

cele energetyczne oraz zwi¹zane z tym tworzenie nowych miejsc pracy (1).

Fermentacja skrobi jest procesem znacznie bardziej z³o¿onym ani¿eli fermenta-

cja cukrów takich jak glukoza czy sacharoza, bowiem skrobia musi zostaæ w pierw-

szym etapie przekszta³cona do cukrów fermentuj¹cych, które w kolejnych etapach

s¹ przekszta³cane do etanolu. W celu uzyskania praktycznie ca³kowitej konwersji

skrobi do cukrów fermentuj¹cych wymagane jest zastosowanie termostabilnej

�-amylazy oraz glukoamylazy (2). W przypadku technologii tradycyjnej surowiec

skrobiowy jest na wstêpie mieszany z wod¹ oraz termostabiln¹ �-amylaz¹ i pod-

grzewany do temp. 110°C. �ród³em ciep³a jest para wodna wprowadzana bezpo-

œrednio do surowca za pomoc¹ strumienicy, co pozwala na jego dok³adne wymie-

szanie i równomierne podgrzanie. Po up³ywie oko³o 15 min mieszaninê ch³odzi siê

do temp. 80-90°C i dodaje kolejn¹ porcjê �-amylazy. Wysoka temperatura oraz

obecny w mieszaninie enzym powoduj¹, ¿e skrobia ulega jednoczeœnie procesowi

kleikowania i up³ynniania, czemu towarzyszy wyraŸny spadek lepkoœci. Obserwowa-

ne zmiany s¹ rezultatem hydrolizy skrobi g³ownie do maltozy, maltotriozy oraz dek-

stryn. W kolejnej fazie procesu, po sch³odzeniu mieszaniny do temperatury oko³o

60°C dodaje siê glukoamylazê, co ma na celu konwersjê wymienionych zwi¹zków do

glukozy i maltozy (3). W trzecim etapie do zacieru, po jego uprzednim sch³odzeniu

do temperatury oko³o 30-32°C, wprowadza siê zawiesinê dro¿d¿y gorzelniczych

stanowi¹cych tzw. matkê dro¿d¿ow¹. Istotn¹ wad¹ procesu prowadzonego zgodnie

z technologi¹ tradycyjn¹ jest bardzo du¿e zu¿ycie energii podczas etapu zacierania,

co powoduje, ¿e ostateczne koszty wytwarzania etanolu s¹ znaczne. Wed³ug Lim

i wsp., (4) zapotrzebowanie na energiê w procesie zacierana siêga 30-40% ca³kowitej

wartoœci energii wymaganej do wyprodukowania etanolu. Aby zwi¹zek ten móg³

konkurowaæ z paliwami uzyskiwanymi na drodze przerobu surowców kopalnych wy-

magane jest znaczne obni¿enie kosztów jego wytwarzania.

Istnieje kilka alternatywnych rozwi¹zañ pozwalaj¹cych na znaczne zmniejszenie

zu¿ycia energii podczas produkcji etanolu. Jedn¹ z proponowanych metod jest za-

stosowanie enzymów amylolitycznych o ca³kowicie nowych w³aœciwoœciach, pozwa-

laj¹cych na hydrolizê natywnej skrobi, nie poddanej procesowi kleikowania. Stoso-

wane dotychczas amylazy wykazywa³y wysok¹ aktywnoœæ hydrolityczn¹ wy³¹cznie

w stosunku do skleikowanej skrobi, jednak ju¿ w 1954 r. Sandsted i Gates (5) dowie-

dli, ¿e istnieje mo¿liwoœæ hydrolizy natywnej skrobi, a stopieñ konwersji ziaren

skrobiowych zale¿y zarówno od pochodzenia enzymu jaki i botanicznego pocho-

dzenia samego substratu. W badaniach prowadzonych w kolejnych latach przez

Ueda i wsp., (6), Miah i Ueda (7) oraz Mikami i wsp., (8) sugerowano, ¿e Ÿród³em

tego rodzaju enzymów mog¹ byæ m.in. Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae oraz

Aspergillus kawachi. Dziêki postêpowi jaki dokona³ siê w ostatnich latach w biologii

molekularnej, na rynku pojawi³y siê dwa komercyjne preparaty enzymatyczne wyka-

zuj¹ce aktywnoœæ amylolityczn¹ w stosunku do natywnej skrobi, STARGEN 001,

Wojciech Bia³as i inni

184 PRACE EKSPERYMENTALNE

opracowany przez firmê Genencor International oraz BPX opracowany przez firmê

Nowozymes NA. Pierwszy z wymienionych preparatów stanowi kompleks dwóch en-

zymów: termostabilnej �-amylazy pochodz¹cej z Aspergillus kawachi, a produkowa-

nej przez Trichoderma reesei oraz glukoamylazy izolowanej z Aspergillus niger. Zasto-

sowanie tego preparatu umo¿liwia pominiêcie energoch³onnego etapu kleikowania

i up³ynniania skrobi prowadzonego na gor¹co, co tym samym znacznie zmniejsza

ca³kowite koszty procesu. Poza tym preparat ten nie wymaga stosowania dodatku

aktywatora, którym w przypadku wiêkszoœci amylaz s¹ jony wapnia. Warto dodaæ,

¿e eliminacja procesu kleikowania pozwala ponadto na stosowanie zacierów o znacz-

nie wy¿szych stê¿eniach, siêgaj¹cych nawet 40% (ww.), zaciery te maj¹ bowiem

znacznie ni¿sz¹ lepkoœæ. Warto zauwa¿yæ, ¿e eliminacja obróbki termicznej w pierw-

szej fazie procesu technologicznego mo¿e mieæ jednak negatywne skutki dla wydaj-

noœci fermentacji, zwiêksza siê bowiem ryzyko zaka¿enia mikrobiologicznego. Ob-

róbka termiczna bowiem poza tym, ¿e ma na celu skleikowanie surowca powoduje

równie¿ inaktywacjê niepo¿¹danej mikroflory bytuj¹cej na przyk³ad na jego po-

wierzchni. Wed³ug Nicols i wsp., (2006) wysoka temperatura sprzyja tak¿e uwalnia-

niu skrobi z jej po³¹czeñ z bia³kami oraz ca³kowicie eliminuje toksyczne dzia³anie

niektórych substancji zawartych w ziarnie zbó¿, co tym samym pozwala na uzyska-

nie wiêkszej wydajnoœæ fermentacji.

Poza badaniami, maj¹cymi na celu opracowanie nowych preparatów enzyma-

tycznych du¿o uwagi poœwiêca siê tak¿e optymalizacji samego procesu fermentacji.

Powszechnie wiadomo, ¿e hydroliza skrobi katalizowana przez enzymy amylolitycz-

ne podlega silnej represji przez uwalniany w jej trakcie produkt. Jednym ze sposo-

bów wyeliminowania tego zjawiska jest jednoczesna hydroliza i fermentacja (SSF,

ang. Simultaneous Saccharification and Fermentation), podczas której glukoza jest na

bie¿¹co metabolizowana przez komórki dro¿d¿y. Utrzymanie stosunkowo niskiego

stê¿enia glukozy w czasie fermentacji pozwala tak¿e znacznie ograniczyæ stres osmo-

tyczny dzia³aj¹cy na komórki. W rezultacie wiêkszoœæ reakcji przebiega z prêdko-

œci¹ zbli¿on¹ do maksymalnej, dziêki czemu mo¿liwe jest skrócenie czasu trwania

fermentacji. Poza tym produkcja etanolu oparta na technologii SSF pozwala znacz-

nie zredukowaæ koszty inwestycyjne, bowiem hydroliza i fermentacja prowadzone

s¹ w jednym bioreaktorze, wyposa¿onym w mieszad³o oraz uk³ad regulacji tempera-

tury (10). Mimo wielu niezaprzeczalnych zalet technologia ta posiada tak¿e pewne

wady, zwi¹zane g³ównie z ró¿nicami pomiêdzy optymalnymi temperaturami dla

dzia³ania enzymów i wzrostu komórek dro¿d¿y (11). W przypadku gluko- oraz

�-amylazy temperatura ta wynosi oko³o 60°C, podczas gdy dla wiêkszoœci ras dro¿-

d¿y gorzelniczych optimum zawiera siê w zakresie 30-32°C. St¹d te¿ temperatura

tego procesu oscyluje zwykle w okolicach 35°C, co stanowi kompromis pomiêdzy

optimum dla funkcjonowania enzymów i wzrostu dro¿d¿y. Wed³ug Philippidis i Smith

(12) szybkoœæ z jak¹ przebiega hydroliza decyduje o ostatecznej szybkoœci wytwa-

rzania etanolu w SSF, dlatego te¿ jedyn¹ metod¹ utrzymania jej na odpowiednim

poziomie jest podwy¿szenie temperatury dziêki zastosowaniu nowych ras dro¿d¿y

Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi

BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 185

oraz szczepów bakterii. Tego rodzaju rozwi¹zanie zaproponowa³ m.in. Ward i wsp.,

(13), który w procesie jednoczesnej hydrolizy i fermentacji skrobi prowadzonej

w temperaturze 45°C wykorzysta³ mieszan¹ kulturê, w sk³ad której wchodzi³y ter-

motolerancyjne dro¿d¿e Kluveromyces marxianus oraz termofilne grzyby strzêpkowe

Taloromyces emersonii.

Proces jednoczesnej hydrolizy i fermentacji, zastosowany na szerok¹ skalê po

raz pierwszy w latach siedemdziesi¹tych ubieg³ego wieku jest stosunkowo dobrze

poznany i opisany w literaturze przedmiotu, o czym œwiadcz¹ liczne prace naukowe

(14,15). Brak jednak informacji na temat optymalizacji jednoczesnej hydrolizy i fer-

mentacji substratu jakim jest m¹ka kukurydziana przy u¿yciu enzymów hydroli-

zuj¹cych natywn¹ skrobiê. Dlatego te¿ prezentowane badania mia³y na celu okreœle-

nie optymalnych warunków jednoczesnej hydrolizy i fermentacji gêstych zacierów

kukurydzianych nie poddanych wczeœniej procesowi kleikowania przy u¿yciu enzy-

mów hydrolizuj¹cych natywn¹ skrobiê i dro¿d¿y Saccharomyces cerevisiae, rasy Etha-

nol Red.

2. Materia³y i metody

2.1. Surowiec

Do badañ optymalizacyjnych stosowano m¹kê kukurydzian¹ (BIO CORN, Ziêbice,

Polska). Surowiec zawiera³ 90,06% skrobi. Œrednia granulacja surowca wed³ug da-

nych producenta wynosi³a 250 �m.

2.2. Dro¿d¿e

W badaniach stosowano liofilizowane dro¿d¿e gorzelnicze Saccharomyces cerevisiae,

rasy Ethanol Red (Lesaffre, Francja), zawieraj¹ce wed³ug danych producenta

� 20×109 jtk/g.

2.3. Enzymy

W badaniach wykorzystywano enzym STARGEN 001 zawieraj¹cy �-amylazê pocho-

dz¹ca z Aspergillus kawachi produkowan¹ przez zmodyfikowany szczep Trichoderma

reesei oraz glukoamylazê izolowan¹ z Aspergillus niger (Genencore International,

USA). Aktywnoœæ enzymatyczna preparatu wynosi³a �456 GSHU/g (ang. Granular

Starch Hydrolyzing Units). Poza tym stosowano kwaœn¹ proteazê GC 106 z Aspergillus

niger (Genencore International, USA), co mia³o na celu hydrolizê bia³ek obecnych



α α

α

⋅ ⋅ ⋅ ⋅

⋅ ⋅⋅ ⋅ ⋅

2.7. Eksperymenty walidacyjne

W celu przeprowadzenia walidacji wyznaczonych modeli regresji wykonano trzy

eksperymenty fermentacyjne o losowo wybranych wartoœciach zmiennych X1, X2

i X3 (zawartych w badanym przedziale zmiennoœci) oraz jeden eksperyment o para-

metrach optymalnych wskazanych na podstawie wspomnianych kryteriów. Nastêp-

nie porównano uzyskane wyniki eksperymentalne z wartoœciami przewidywanymi

przez modele regresji.

2.8. Analizy

Próby przed oznaczeniem stê¿enia glukozy oraz etanolu wirowano przy 4000 g

przez 10 min w temperaturze 4°C (Multifuge 3SR, Niemcy), a nastêpnie filtrowano

przez filtry o porowatoœci 0,22 �m (Millex – GS, Millipore, USA). Oznaczenia wyko-

nywano na chromatografie cieczowym (Merck Hitachi, Niemcy) wyposa¿onym w ko-

lumnê Aminex HPX-87P (Bio-Rad, USA) oraz detektor refraktometryczny (Model

L-7490, Merck Hitachi, Niemcy). Rozdzia³ prowadzono w temperaturze 30°C, sto-

suj¹c w charakterze eluentu 5 mM H2SO4, przy przep³ywie 0,6 ml/min. Stê¿enie

skrobi oznaczano korzystaj¹c z metody enzymatycznej opracowanej przez Holm

i wsp. (16). Ponadto do oznaczenia stê¿enia cukrów redukuj¹cych wykorzystano me-

todê z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym (DNS) opracowan¹ przez Millera (17).

3. Wyniki i dyskusja

Proces jednoczesnej hydrolizy i fermentacji jest bardzo z³o¿ony, bowiem w tym

samym czasie i œrodowisku maj¹ miejsce ró¿nego rodzaju wzajemnie ze sob¹ po-

wi¹zane przemiany prowadz¹ce w rezultacie do powstania produktu koñcowego ja-

kim jest etanol. O z³o¿onoœci tego uk³adu mo¿e œwiadczyæ to, ¿e zmniejszenie szyb-

koœci jednej z przemian powoduje zazwyczaj hamowanie kolejnej w skutek niedo-

boru substratu lub nagromadzenia jednego z poœrednich produktów. Dlatego te¿

poszukiwanie optymalnych warunków dla prowadzenia tego rodzaju procesów kla-

syczn¹, jednowymiarow¹ metod¹, gdzie modyfikacji podlega tylko jeden z czynni-

ków, podczas gdy pozosta³e przyjmuj¹ sta³e wartoœci jest bardzo czasoch³onne

i kosztowne. Poza tym istotn¹ wad¹ tego rodzaju podejœcia do badañ jest brak mo¿-

liwoœci wykrycia ewentualnych interakcji jakie mog¹ wystêpowaæ pomiêdzy po-

szczególnymi czynnikami. W takim przypadku alternatyw¹ dla podejœcia klasyczne-

go jest metoda powierzchni odpowiedzi (ang. RSM, Response Surface Method) stano-

wi¹ca zestaw technik matematycznych i statystycznych szczególnie u¿ytecznych,

wówczas gdy badane zjawisko podlega wp³ywowi wielu czynników i gdy celem jest

okreœlenie optymalnych parametrów procesu spe³niaj¹cych za³o¿one na wstêpie



kryteria (18). Z tego wzglêdu podjêto siê wykonania badañ z zastosowaniem tej me-

tody, które mia³y na celu okreœlenie optymalnych warunków jednoczesnej hydrolizy

i fermentacji gêstych zacierów kukurydzianych nie poddanych wczeœniej procesowi

kleikowania przy u¿yciu enzymów hydrolizuj¹cych natywn¹ skrobiê i dro¿d¿y

Saccharomyces cerevisiae, rasy Ethanol Red. W tabeli 3 zestawione zosta³y uœrednione

wyniki z 3 powtórzeñ eksperymentu wykonanych wg centralnego planu kompozy-

cyjnego, na podstawie których budowano modele regresji u¿yte nastêpnie do opty-

malizacji procesu.

3.1. Model powierzchni odpowiedzi dla stê¿enia etanolu (Y1)

Zgodnie z danymi zawartymi w tabeli 3 koñcowe stê¿enia etanolu w zacierach

odfermentowanych zawiera³o siê w zakresie 79,09-120,02g/L. Maksymalne stê¿enie

uzyskano w hodowli 10, w której stê¿enie zacieru wnosi³o 35%, podczas gdy dawka

enzymu by³a równa 3 ml/kg s.m. m¹ki. Natomiast minimalne stê¿enie uzyskano

w hodowli 13, o stê¿eniu zacieru równym 30% i dawce enzymu 0,3 ml/kg s.m. m¹ki.

Na podstawie tych danych sugeruje siê, ¿e najsilniejszy wp³yw na stê¿enie produktu

mia³a dawka stosowanego preparatu enzymatycznego. W celu weryfikacji tej hipo-

tezy wykonano analizê statystyczn¹ metod¹ regresji wielokrotnej. Na podstawie

uzyskanych wyników stwierdzono, ¿e modelem najlepiej dopasowanym do danych

doœwiadczalnych by³ zredukowany model kwadratowy, dla którego p < 0,0001,

a wielkoœæ poprawionego wspó³czynnika determinacji Adj. – R2 wynosi³a 0,841

(tab. 4). Ponadto wielkoœæ prawdopodobieñstwa wyznaczona dla testu braku dopa-

sowania (ang. Lack-of-fit) by³a równa 0,117, co jednoznacznie potwierdzi³o, ¿e przy-

jêty model regresji mo¿e byæ wykorzystany do predykcji badanej wielkoœci w przyjê-

tym na wstêpie zakresie zmiennoœci czynników wejœciowych.

T a b e l a 3

Wyniki doœwiadczeñ wykonanych wed³ug centralnego planu kompozycyjnego

Hodowla BlokWartoœci rzeczywiste Xi Zmienne zale¿ne Yi

X1 X2 X3 Y1 Y2

1 2 3 4 5 6 7

1 1 35,0 0,750 5,00 112,43 62,43

2 1 30,0 1,875 4,25 113,30 73,39

3 1 35,0 3,000 3,50 116,78 64,84

4 1 30,0 1,875 4,25 117,19 75,91

5 1 25,0 0,750 3,50 94,58 73,52

6 1 25,0 3,000 5,00 106,82 83,03

7 2 30,0 1,875 4,25 119,43 77,36


BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 191

powinno wynosiæ 121,709 ± 1,52 g/L, przy stê¿eniu zacieru i dawce preparatu enzy-

matycznego wynosz¹cej odpowiednio 34,37% i 2,08 ml/kg. Podobne wyniki uzyskali

Wang i wsp. (19), którzy porównywali iloœæ etanolu uzyskiwan¹ w technologii trady-

cyjnej z technologi¹ opart¹ na zastosowaniu preparatu STARGEN 001. Stwierdzili

oni, ¿e istotnie ró¿ni³ siê jedynie profil cukrów w trakcie fermentacji. W technologii

wykorzystuj¹cej preparat STARGEN 001 blisko trzykrotnie mniejsza by³a bowiem za-

wartoœæ glukozy, maltozy i maltotriozy. Znacznie szybszy w porównaniu z technolo-

gi¹ tradycyjn¹ by³ tak¿e proces ich konwersji do etanolu, dziêki czemu jego maksy-


BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 193

Rys. 1. Zmiany stê¿enia etanolu po procesie fermentacji (Y1) w zale¿noœci od: 1a – stê¿enia zacieru

(X1) przy sta³ej dawce enzymu równej 1,875 ml/kg oraz 1b – dawki preparatu enzymatycznego (X2) przy

sta³ym stê¿eniu zacieru równym 30%. W obu przypadkach pH wynosi³o 4,25. Symbole oznaczaj¹: � –

œrednia, ----- – 95% przedzia³ ufnoœci, 1 – b³¹d standardowy œredniej.

Rys. 2. Wykres powierzchni odpowiedzi

przedstawiaj¹cy wp³yw stê¿enia zacieru (X1)

i dawki preparatu enzymatycznego (X2) na stê-

¿enie etanolu po procesie fermentacji (Y1) wy-

znaczony dla pH = 4,25.

malny poziom uzyskiwano ju¿ w 50. godzinie trwania fermentacji. Istotn¹ rolê pre-

paratu enzymatycznego STARGEN 001 w procesie otrzymywania etanolu metod¹

SSF potwierdzaj¹ tak¿e wyniki badañ Suresh i wsp. (20). Jako substrat stosowali oni

natywn¹ skrobiê pszeniczn¹ oraz skrobiê izolowan¹ z sorga. Enzymy amylolityczne

pochodzi³y natomiast z Bacillus subtilis VB2. W rezultacie po 96 h fermentacji uzyska-

no oko³o 40 g/L etanolu, co stanowi blisko trzykrotnie ni¿sze stê¿enie w stosunku

do wyników prezentowanych w tej pracy.

Maj¹c na uwadze wspomnian¹ liniow¹ zale¿noœæ pomiêdzy wielkoœci¹ X1 a Y1

mo¿na by s¹dziæ, ¿e podobnie powinna siê kszta³towaæ zale¿noœæ pomiêdzy X1 a Y2,

czemu powinien towarzyszyæ wysoki wspó³czynnik korelacji r pomiêdzy tymi dwie-

ma zmiennymi zale¿nymi (Y1 i Y2). W praktyce okaza³o siê jednak, ¿e wartoœæ liczbo-

wa tego wspó³czynnika wynosi 0,22 (p = 0,35), co oznacza, ¿e brak istotnego

zwi¹zku pomiêdzy stê¿eniem etanolu i ca³kowit¹ wydajnoœci¹ procesu wyznaczon¹

w stosunku do wydajnoœci teoretycznej (Y2). Dla wielu hodowli zaobserwowano po-

nadto, ¿e zwiêkszaniu stê¿enia zacieru (X1) towarzyszy wzrost koñcowego stê¿enia

etanolu, przy jednoczesnym znacznym spadku wydajnoœci (tab. 3). W przypadku ho-

dowli o optymalnych parametrach procesu, zapewniaj¹cych maksymalne przewidy-

wane modelem regresji stê¿enie etanolu, prognozowana wydajnoœæ powinna wyno-

siæ oko³o 69,35%. Zak³adaj¹c, ¿e wydajnoœæ technologii tradycyjnej oscyluje zwykle

w granicach 90-95%, uzyskana wartoœæ jest stosunkowo niska i przyczynia siê do

zwiêkszenia strat substratu i tym samym wzrostu ca³kowitych kosztów procesu SSF.

Potwierdza to tak¿e, ¿e optymalizacja tego rodzaju procesu technologicznego bez-

wzglêdnie wymaga nie tylko uwzglêdnienia stê¿enia etanolu w zacierze odfermen-

towanym, ale tak¿e wzajemnych relacji jakie wystêpuj¹ pomiêdzy badanymi zmien-

nymi niezale¿nymi (X1, X2, X3) a wydajnoœci¹ (Y2).

3.2. Model powierzchni odpowiedzi dla wydajnoœci etanolu (Y2)

Maksymaln¹ wydajnoœæ procesu fermentacji Y2 wynosz¹c¹ 86,91% uzyskano

w hodowli o stê¿eniu zacieru równym 23% i dawce enzymu 1,875 ml/kg s.m. m¹ki,

natomiast najni¿sz¹ wydajnoœæ równ¹ 51,23% zanotowano, gdy stê¿enie zacieru wy-

nosi³o 30%, a dawka enzymu by³a równa 0,3 ml/kg s.m. m¹ki. Na podstawie danych

eksperymentalnych zawartych w tabeli 3 wyznaczono równanie regresji w postaci

zredukowanego wielomianu drugiego stopnia (tab. 4). Wyznaczony model by³ wyso-

ce istotny, o czym œwiadczy³a wartoœæ prawdopodobieñstwa (p < 0,0001) oraz po-

prawionego wspó³czynnika determinacji, Adj. – R2 równa 0,913. Wynik testu braku

dopasowania, podobnie jak w przypadku modelu wyznaczonego dla zmiennej Y1 by³

statystycznie nieistotny (p = 0,092), co potwierdza, ¿e równanie regresji mo¿e byæ

z powodzeniem wykorzystane do przewidywania wydajnoœci procesu jednoczesnej

hydrolizy i fermentacji w badanym zakresie zmiennych niezale¿nych. Na podstawie

danych przedstawionych w tabeli 4 wskazuje siê, ¿e wydajnoœæ procesu fermentacji



(Y2) by³a ujemnie skorelowana ze stê¿eniem zacieru X1, co oznacza, ¿e wraz ze

wzrostem wartoœci liczbowej tego czynnika obni¿a³a siê koñcowa wydajnoœæ fer-

mentacji (rys. 3a). Warto dodaæ, ¿e poza wysoce istotnymi efektami liniowymi

(p < 0,0001) wa¿ne by³y równie¿ efekty kwadratowe (p = 0,038). Podobnie jak

w przypadku zmiennej Y1, wp³yw pH uznano za nieistotny statystycznie (p > 0,05)

i dlatego te¿ usuniêto ten czynnik z modelu regresji. W przypadku dawki enzymu

(X2) za istotne statystycznie uznano zarówno efekty liniowe jak i kwadratowe, przez

co zale¿noœæ pomiêdzy tym czynnikiem a wydajnoœci¹ fermentacji mia³a kszta³t nie-

liniowy, z wyraŸnie zaznaczonym maksimum odpowiadaj¹cym dawce równej


BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 195

Rys. 3. Zmiany wydajnoœci procesu fermentacji (Y2) w zale¿noœci od: 3a – stê¿enia zacieru (X1) przy

sta³ej dawce enzymu równej 1,875 ml/kg oraz 3b – dawki preparatu enzymatycznego (X2) przy sta³ym

stê¿eniu zacieru równym 30%. W obu przypadkach pH wynosi³o 4,25. Symbole oznaczaj¹:� – œrednia,

----- – 95% przedzia³ ufnoœci, 1 – b³¹d standardowy œredniej.

Rys. 4. Wykres powierzchni odpowiedzi

przedstawiaj¹cy wp³yw stê¿enia zacieru (X1)

i dawki preparatu enzymatycznego (X2) na wy-

dajnoœæ fermentacji (Y2) wyznaczony dla pH = 4,25.

2,16 ml/kg s.m. m¹ki (rys. 3b). Warto zauwa¿yæ, ¿e zgodnie z wartoœciami liczbowy-

mi wspó³czynników regresji przedstawionymi w tabeli 4 zdecydowanie silniejszy

wp³yw na wydajnoœæ mia³o stê¿enie zacieru ani¿eli dawka preparatu enzymatyczne-

go. Jest to zatem odwrotna prawid³owoœæ do tej, jak¹ zanotowano w przypadku

analizy zmian stê¿enia etanolu. Na podstawie uzyskanych wyników potwierdzono

tym samym, ¿e czynnikiem decyduj¹cym o osi¹gniêciu wysokiego stê¿enia etanolu

Y1 jest dostêpnoœæ cukrów fermentuj¹cych zwi¹zana z szybkoœci¹ hydrolizy skrobi,

zale¿n¹ z kolei od zastosowanej dawki preparatu enzymatycznego. Zgodnie z wy-

kresem powierzchni odpowiedzi wyznaczonej na podstawie przyjêtego modelu re-

gresji (rys. 4) maksymalna przewidywana wydajnoœæ powinna wynosiæ 85,76 ± 1,19%,

przy stê¿eniu zacieru i dawce preparatu enzymatycznego wynosz¹cej odpowiednio

25,0% i 2,18 ml/kg. Wskazana jako optymalna zawartoœæ skrobi w zacierze jest

mniejsza od tej jak¹ wyznaczono bior¹c pod uwagê wy³¹cznie zawartoœæ etanolu po

procesie fermentacji. Podobne rezultaty uzyskali Suresh i wsp. (20) we wspomnia-

nym opracowaniu dotycz¹cym badañ nad fermentacj¹ zacierów zawieraj¹cych skro-

biê z pszenicy i sorga o stê¿eniu 10-30%. Autorzy cytowanej pracy stwierdzili, ¿e

optymalny stopieñ konwersji cukrów do etanolu, przy jednoczesnym utrzymaniu

wysokiej produkcji biomasy uzyskuje siê w przypadku zacierów o stê¿eniu 25%. Su-

geruje to, ¿e podczas optymalizacji nale¿y poszukiwaæ parametrów stanowi¹cych

kompromis pozwalaj¹cy na uzyskanie wysokiej koncentracji etanolu w zacierze od-

fermentowanym oraz wysokiej wydajnoœci przy mo¿liwie minimalnej zawartoœci

nieodfermentowanej skrobi oraz cukrów fermentuj¹cych.

4. Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji zacierówzawieraj¹cych natywn¹ skrobiê

Celem prezentowanych badañ by³a optymalizacja procesu otrzymywania etanolu

z zastosowaniem metody jednoczesnej hydrolizy i fermentacji prowadzonej za po-

moc¹ enzymów hydrolizuj¹cych natywn¹ skrobiê i dro¿d¿y Saccharomyces cerevisiae,

rasy Etanol Red. Zwykle procedura prowadz¹ca do rozwi¹zania tego problemu sk³ada

siê z dwóch etapów: w pierwszym nastêpuje wyznaczenie wartoœci przewidywanych

badanej zmiennej poprzez dopasowanie odpowiednich równañ regresji do uzyska-

nych w eksperymencie danych doœwiadczalnych. Nastêpnie poszukuje siê takich war-

toœci zmiennych niezale¿nych, które pozwalaj¹ na mo¿liwie najdok³adniejsze spe³nie-

nie kryteriów optymalizacyjnych. Zwi¹zek pomiêdzy przewidywanymi odpowiedziami

wielkoœci wyjœciowej a u¿ytecznoœci¹ odpowiedzi, czyli stopniem spe³nienia przyjê-

tych kryteriów jest nazywany funkcj¹ u¿ytecznoœci (ang. desirability function). Procedu-

rê s³u¿¹c¹ do okreœlenia zwi¹zku pomiêdzy przewidywanymi odpowiedziami wielko-

œci wyjœciowej i u¿ytecznoœci¹ odpowiedzi opracowali Derringer i Suich (21).

Na podstawie prezentowanych w pracy wyników wskazuje siê, ¿e stê¿enie eta-

nolu (Y1, g/L) oraz ca³kowita wydajnoœæ procesu (Y2, % teoretycznej wydajnoœci eta-



nolu) s¹ w g³ównej mierze funkcj¹ zmiennych X1 i X2. Dlatego te¿ zastosowano na-

stêpuj¹ce kryteria optymalizacji: stê¿enie zacieru (X1), dawka preparatu enzyma-

tycznego (X2) oraz pH (X3) przyjmowa³y wartoœci kodowe z ca³ego badanego zakre-

su zmiennoœci (od -1,0 do +1,0), podczas gdy zmienne zale¿ne, stê¿enie etanolu

i ca³kowita wydajnoœæ procesu powinny przyjmowaæ wartoœci najwiêksze spoœród

przewidywanych. Nale¿y dodaæ, ¿e zastosowana procedura zak³ada³a przekszta³ce-

nie wartoœci ka¿dej z czterech wielkoœci wyjœciowych w wartoœci u¿ytecznoœci, któ-

re mog¹ siê zmieniaæ od 0,0 dla niepo¿¹danych do 1,0 dla bardzo po¿¹danych. Dziê-

ki temu jednoczesna optymalizacja dwóch wielkoœci wyjœciowych uproœci³a siê do

znalezienia wartoœci wielkoœci wejœciowych, które maksymalizuj¹ ca³kowit¹ u¿y-

tecznoœæ odpowiedzi wielkoœci wyjœciowych. W rezultacie wykonanych obliczeñ

stwierdzono, ¿e optymalne parametry prowadzenia SSF to stê¿enie zacieru (X1),

dawka enzymu (X2) oraz pH (X3) wynosz¹ce odpowiednio: 25%, 2,05 ml/kg s.m. m¹ki

oraz pH równe 5,0.

5. Walidacja modeli regresji oraz wyników optymalizacji

W celu ostatecznej weryfikacji poprawnoœci przyjêtych modeli regresji oraz wy-

znaczonych na ich podstawie optymalnych parametrów badanego procesu wykona-

no cztery dodatkowe hodowle. Parametry trzech pierwszych hodowli stanowi³y lo-

sowo wytypowane kombinacje wartoœci zmiennych niezale¿nych le¿¹ce w badanym

przedziale, podczas gdy ostatnia z hodowli mia³a parametry odpowiadaj¹ce opty-

malnym, przyjêtym na podstawie wspomnianych kryteriów optymalizacji. Dla ka¿-

dego z eksperymentów wyznaczono, na bazie modu³u predykcji wystêpuj¹cego

w stosowanym oprogramowaniu statystycznym, przewidywane wielkoœci zmien-

nych zale¿nych Y1, Y2 oraz 95% przedzia³y ufnoœci i b³êdy standardowe. Nastêpnie

porównano wartoœci eksperymentalne z przewidywanymi (tab. 5). Stwierdzono, ¿e

uzyskane wyniki w wiêkszoœci przypadków mieszcz¹ siê w granicach wyznaczonych

przez odpowiednie przedzia³y ufnoœci, co potwierdzi³o poprawnoœæ przyjêtych mo-

deli regresji oraz wybór optymalnych parametrów procesu.

T a b e l a 5

Wyniki walidacji

Nr X1 X2 X3

Y1 – stê¿enie etanolu Y2 – wydajnoœæ procesu

Obs. Przew.Przedzia³ ufnoœci

Obs. Przew.Przedzia³ ufnoœci

-95% 95% -95% 95%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 26,04 0,87 4,0 101,14 99,94 96,48 103,39 75,66 75,21 72,78 77,63

2 32,92 2,79 5,0 115,02 117,49 114,45 120,53 67,91 69,22 67,02 71,42


BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 197

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3 33,66 1,95 3,6 115,18 120,7 117,61 123,78 66,46 69,88 67,72 72,05

4 25,00 2,05 5,0 110,36 110,79 107,31 114,26 85,71 85,72 83,13 88,31

Objaœnienie: Obs. – dane eksperymentalne (obserwowane); Przew. – dane przewidywane modelami regresji.

6. Podsumowanie i wnioski

W przeprowadzonych badaniach udowodniono, ¿e proces jednoczesnej hydroli-

zy i fermentacji mo¿e przebiegaæ wydajnie dla zacierów skrobiowych, bez stosowa-

nia wczeœniejszej obróbki termicznej, która mog³a zostaæ wyeliminowana dziêki za-

stosowaniu nowoczesnych preparatów enzymatycznych, scukrzaj¹cych skrobiê na-

tywn¹. Zaobserwowano, ¿e wzrost stê¿enia zacieru by³ dodatnio skorelowany z koñ-

cow¹ zawartoœci¹ etanolu i niestety ujemnie skorelowany z wydajnoœci¹ procesu.

Oznacza to, ¿e stosuj¹c gêste zaciery o stê¿eniu przekraczaj¹cym 25% otrzymywano

produkt odpadowy o stosunkowo wysokiej zawartoœci niewykorzystanego surowca.

Jednak dziêki zastosowaniu procedur optymalizacyjnych uda³o siê otrzymaæ zado-

walaj¹ce rezultaty. W wyznaczonym, optymalnym uk³adzie parametrów, po 72 go-

dzinach procesu, uzyskano wydajnoœæ 85,7% (w odniesieniu do wydajnoœci teore-

tycznej fermentacji) oraz stê¿enie etanolu wynosz¹ce oko³o 14% v/v (110 g/l).

Warto dodaæ, ¿e zastosowanie gêstych zacierów o stê¿eniu przekraczaj¹cym

35% w procesie jednoczesnej hydrolizy i fermentacji prowadzonym przy u¿yciu pre-

paratów enzymatycznych wykazuj¹cych aktywnoœæ w stosunku do natywnej skrobi,

takich jak STARGEN 001 jest teoretycznie mo¿liwe pod warunkiem, ¿e proces ten

bêdzie przebiega³ w uk³adzie bioreaktora membranowego wyposa¿onego w modu³

do destylacji membranowej (22) lub perwaporacji (23). Powszechnie wiadomo, ¿e

etanol stanowi czynnik limituj¹cy i jego maksymalne stê¿enie mo¿e wynosiæ 18% v/v

(24). Tego rodzaju rozwi¹zania mog¹ zatem do minimum ograniczyæ wp³yw etanolu,

dziêki czemu poszczególne przemiany bêd¹ przebiega³y z prêdkoœci¹ oraz wydajnoœ-

ci¹ zbli¿on¹ do maksymalnej. Wymaga to jednak dalszych badañ zwi¹zanych przede

wszystkim z zagadnieniami powiêkszenia skali tych procesów, bowiem w wiêkszoœ-

ci przypadków opisywane s¹ instalacje pracuj¹ce w skali laboratoryjnej.

Badania zosta³y sfinansowane ze œrodków Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wy¿szego (grant

nr 0619/P01/2007/02).

Literatura

1. Wyman C. E., (2003), Applications of corn stover and fiber. Corn Chemistry and Technology, 2nd ed. (Eds.

White P. J., Johnson L. A.) American Association of Cereal Chemists, St. Paul MN.

2. Senn T., Pieper H. J., (2001), Classical Methods in the Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Ap-

plications, Ed. M. Roehr, P 1, WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim.



3. Power R. F., (2003), Enzymatic conversion of starch to fermentable sugars. The Alcohol Textbook, 4th, Eds.

Jacques K. A., Lyons T. P., Kelsall D. R., Nottingham University Press, Nottingham, U.K., 23-32.

4. Lim L. H., Macdonald D. G., Hill G. A., (2003), Biochem. Eng. J., 13, 53-62.

5. Sandsted R. M., Gates R. L., (1954), Food Res., 19, 190-199.

6. Ueda S., Ohba R., Kano S., (1974), Starch/Starke, 26, 374-378.

7. Miah M. N., Ueda N. S., (1977), Starch/Starke 29, 235-239.

8. Mikami S., Iwano K., Shiinoki S., Shimada T., (1987), Agric. Biol. Chem., 51, 2495-2501.

9. Nichols N. N., Dien B. S., Bothast R. J., Cotta M. A., (2006), The Corn Ethanol Industry in Alcoholic Fuels,

Ed. S. Minteer, CRC Press, Boca Raton, Fl. 2006.

10. Kobayashi F., Sawada T., Nakamura Y., Ohnaga M., Godliving M., Ushiyama T., (1998), Appl. Bio-

chem. Biotechnol., 69, 177-189.

11. Öhgren K., Bura R., Lesnicki G., Saddler J., Zacchi G., (2007), Proc. Biochemistry, 42, 834-839.

12. Philippidis G. P., Smith T. K., (1995), Appl. Biochem. Biotechnol., 51/52, 117-124.

13. Ward C., Nolan A. M., O`Hanlon K., McAree T., Barron N., McHale L., McHale A. P., (1995), Appl.

Microbiol. Biotechnol., 43, 408-411.

14. Verma G., Nigam P., Singh D., Chaudhary K., (2000), Bioresource Technol., 72, 261-266.

15. Öhgren K., Rudolf A., Galbe M., Zacchi G., (2006), Biomass and Bioenergy, 30, 863-869.

16. Holm J., Björck I., Drews A., (1986), Starch/Stärke 38, 7, 224-226.

17. Miller G. L., (1959), Anal. Chem., 31, 426-428.

18. Montgomery D. C., Runger G. C., (2003), Applied Statistics and Probability for Engineers, 3rd ed., John

Wiley & Sons Inc., Hoboken, New Jersey.

19. Wang P., Singh V., Hue X., Johnston D. B., Rausch K. D., Tumbleson M. E., (2007), Cereal Chem., 84,

1, 10-14.

20. Suresh K., Kiransree N., Venkateswar Rao L., (1999), Bioprocess Engineering, 21, 165-168.

21. Derringer G., Suich R., (1980), J. Qual. Technol., 12, 214-219.

22. Gryta M., Morawski A. W., Tomaszewska M., (2000), Catal. Today, 56, 159-165.

23. Kaseno, Miyazawa I., Kokugan T., (1989), J. Ferment. Bioeng., vol. 86, no 5, 488-493.

24. Lentini A., Rogers P., Higgins V., Dawes I., Chandler M., Stanley G., Chambers P., (2003), The Impact

of Ethanol Stress on Yeast Physiology in Brewing Yeast Fermentation Performance, 2nd ed., Ed. K. Smart,

Blackwell Science.


BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 199

Documents

Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji …. Bialas.pdf · 2013-12-01 · Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni