Embed Size (px)
Citation preview
Úvod
Oxidačný a karbonylový stres
Definície
Zdroje a príčiny
Dôsledky
Markery
Úloha v patogenéze ochorení
Terapeutické ovplyvnenie
Definície
Voľný radikál
Free radical
Častica s nespáreným – voľným elektrónom vo
valenčnej vrstve
Reaktívny metabolit kyslíka/dusíka
Reactive oxygen/nitrogen species – ROS/RNS
Vysoko reaktívna molekula
Reakcie voľných radikálov
Voľné radikály ľahko reagujú s biologickými
molekulami za vzniku nových radikálov –
reťazové reakcie
Reakcia medzi dvoma radikálmi
Adícia radikálu na inú molekulu
Oxidácia a redukcia neradikálových látok
Odtrhnutie atómu vodíka z C-H väzby
Kyslíkové ROS
Voľné radikály
Superoxid .O2-
Hydroxyl .OH
Peroxyl ROO.
Alkoxyl RO.
Hydroperoxyl HO2.
Molekulárny kyslík O2
Iné
Peroxid vodíka H2O2
Kyselina chlórna HClO
Ozón O3
Singletový kyslík 1O2
Kyslíkové ROS
Kyslíkové ROS
Štvorelektrónová redukcia kyslíka
Fentonova reakcia
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + .OH + OH-
.O2
- + Fe3+ → O2 + Fe2+
Haber-Weissova reakcia
.O2
- + H2O2 → O2 + .OH + OH-
Katalytický účinok iónov prechodných kovov
Ďalšie neenzýmové reakcie
Autooxidácia hemoglobínu
Ionizujúce žiarenie
Glykácia
Vznik peroxinitritu
Dusíkové RNS
Voľné radikály
Oxid dusnatý .NO
Oxid dusičitý .NO2
Iné
Nitrozyl NO+
Kyselina dusitá HNO2
Oxid dusitý N2O3
Peroxynitrit ONOO-
Alkylperoxynitrit ROONO
Fyziologické funkcie RNS
Zatiaľ známe len pre .NO
Vazodilatácia
Parakrinná komunikácia
Neuromediátor
Nitrozylácia
Zdroje RNS
NO syntázy
Endoteliálna
Inducibilná
Neuronálna
Reakcie .NO a .O2-
Znečistený vzduch
Vzájomné reakcie voľných radikálov a
reaktívnych metabolitov
Endogénne zdroje ROS – reakcie
Autooxidácia (Fentonova reakcia)
Hemoglobín, myoglobín, redukované tioly,
cytochróm C, katecholamíny
Respiračné vzplanutie
NADPH oxidáza
Iná enzymatická produkcia
Prostaglandín syntáza, lipoxygenáza,
myeloperoxidáza, xantín oxidáza
Endogénne zdroje ROS – organely
Mitochondrie
Terminálna oxidácia & Oxidačná fosforylácia
Elektrónový transportný systém – cytochróm
oxidáza
Superoxidový aniónový radikál
Hyperoxia / hypoxia
NADH dehydrogenáza (komplex I) a cytochróm bc1 (komplex III)
sú hlavné miesta produkcie superoxidu
Prenášač elektrónov koenzým Q (ubichinon) sa behom prenosu
elektrónov oxiduje, potom redukuje pričom vzniká radikálový
intermediát (semichinon) a ten môže reagovať s kyslíkom za
vzniku superoxidu
Endogénne zdroje ROS – organely
Endoplazmatické retikulum
Oxidačno-redukčné reakcie
Metabolizmus xenobiotík
Cytochróm P450
Endogénne zdroje ROS – organely
Mikrozómy – Peroxizómy
Metabolizmus mastných kyselín
Peroxid vodíka
Exogénne zdroje ROS
Lieky
Nitrofurantoín, antracyklíny, metotrexát,
sulfasalazín
Žiarenie
RTG, rádioterapia, UV
Fajčenie
Ozón
Fyziologické funkcie ROS
Detoxifikácia xenobiotík
Monoxygenázy, cytochrómoxidázy
(indukovateľné)
pečeň ER
Signálne cesty
Fyziologické funkcie ROS
Imunitná odpoveď & Fagocytóza
Myeloperoxidázy
NADPH oxidáza
NADPH + 2O2 »NADP+ + H+ + 2O2
-
2O2
-
+ 2H+ » O2 + H2O2
H2O2 + CL-+ H+ » HOCl + H2O
Poškodenie spôsobené ROS
Lipidy
Lipoperoxidácia
XNA
Poškodenie báz – mutácie
Proteíny
Karbonylácia proteínov
Cross-linking
Molekulárne mechanizmy
Antioxidanty – rozdelenia
Antioxidačný status
Inhibícia produkcie
Vychytávanie, zhášanie
Korekčné mechanizmy
Antioxidanty – rozdelenia
Endogénne
Exogénne
Nízkomolekulové (neenzymatické)
Vysokomolekulové (enzymatické)
Vysokomolekulové antioxidanty
Enzymatické
antioxidanty
Superoxid dizmutáza
SOD
Kataláza
CAT
Glutatión
peroxidáza/reduktáza
Vysokomolekulové antioxidanty
Superoxid dizmutáza
Mitochondriálna
MnSOD
Cytoplazmatická
CuZn
Extracelulárna
CuZn
SOD
U všetkých aeróbnych organizmov
Aj u prokaryotov
.O2
- + .O2- + 2 H+ → H2O2 + O2
CAT
U všetkých aeróbnych eukaryotov
v cytoplazme
Dizmutácia peroxidu vodíka
2 H2O2 → 2 H2O + O2
Glutatiónový systém
Glutatión (GSH)
Glu-Cys-Gly
-SH skupina na cysteíne
Nízkomolekulový antioxidant
Vychytávač voľných radikálov
2 GSH + .O2- → GSSG + H2O
Najdôležitejší cytoplazmatický antioxidant
Glutatiónový systém Len u zvierat
Glutatión peroxidáza
Obsahuje selenocysteín
Redukuje peroxid vodíka pomocou glutatiónu
2 GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O
Glutatión reduktáza
GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+
Antioxidačná metabolická dráha
Nízkomolekulové antioxidanty
Glutatión
Vitamín C, E
Karotenoidy
Koenzým Q10
Taníny, Flavonoidy
Prolín
...
Rovnováha
Oxidanty Antioxidanty
Oxidačný stres
Nerovnováha medzi produkciou voľných
radikálov a antioxidačnými mechanizmami
Súčasť patogenézy...
...všetkého
Markery oxidačného stresu
Priama detekcia voľných radikálov = trapping
Poškodenie lipidov
Malondialdehyd, 4-OH-2-nonenal, 8-izoprostán
Poškodenie DNA
8-OH-guanín
Poškodenie proteínov
Dityrozín, karbonylované proteíny
Karbonylový stres
Maillardova reakcia 1912 neenzymatická glykácia
Karbonylový stres
Koncové produkty pokročilej glykácie
Advanced glycation end products
AGEs
Diabetes mellitus
Diabetická hyperglykémia
glykovaný hemoglobín (HbA1C)
Alkohol
Zlyhávanie obličiek
Melanoidíny
Oxidačný stres
Synergizmus
Downov syndróm
Trizómia 21
21q22.11 – gén pre SOD
150% génová dávka
Zvýšený oxidačný stres
Prečo?
Antioxidačná metabolická dráha
Ateroskleróza
Starnutie
Znížený antioxidačný status
Lipoperoxidácia
Tvorba lipofuscínu – stareckého pigmentu
Cross-linking proteínov
Indukcia chronického zápalu
Kumulácia poškodení DNA
Zníženie efektivity mitochondrií
Ako spomaliť čas?
Výhľad do budúcnosti
Nové antioxidanty
Kombinované prístupy
Antioxidačná génová terapia
Aminoguanidín a AGE-breakers
Klinické štúdie... !!!
Čas na prestávku ?
Saliva
Saliva
water
mucin
lysozyme
alpha amylase
lipase
sIgA
ions
buffer
> 2400 proteins
Advances in salivary research
Great potential
Non-invasive sampling
Easy repated sampling
Useful in elderly people and children
biomarkers
for research
???
Saliva
Testosterone
Other Steroids
Cytokines
markers of
oxidative
stress
???
Markers measured in tissue or plasma
AOPP
TBARS
AGES
FRUCTOSAMINE
GLUTATHIONE
saliva
???
TAC
FRAP/FRAT
• Established protocols
• 96 microtiter plate
• High through put
Parodontal status
217 consecutive stomatological patients (both
genders)
PBI, salivary TBARS
MDA by HPLC in saliva and plasma yes but...
Parodontal status
Intra and Interindividual variability
• 38 healthy volunteers (both genders, 18F, 20M)
• 30 days sampling, every day
Intra and Interindividual variability
Influencing factors
• Healthy young men volunteers (10)
• Saliva samples collected in the morning, afternoon and
evening 2 consecutive days
• Orall administration of ascorbic acid (250 mg)
• Sampling before and after tooth-brushing
Daily dynamics and ascorbic acid
Saliva processing
Effect of collection system
WS- whole saliva
CS- cotton sallivete
PS- polypropylene sallivete
cortisol
Food contamination
ABA
E
D
B
E
DC
A B
C D
E
C
Blood contamination
Clinical studies
Periodontitis
Gingivitis
Oral precancerosis
Sleep apnoea syndrome
Periodontitída
začervenané, opuchnuté
tkanivo prestáva vypĺňať
medzizubné priestory
-> zuby sa uvoľňujú, kostná
podpora postupne ubúda
ľahko krvácajú
Periodontitídazdravé ďasná
svetlo ružové
úplne vypĺňajú medzizubné
priestory
nekrvácajú
zapálené ďasná
Slinadiagnostická tekutina
jednoduchý, neinvazívny
odber
možnosť hľadania nových
markerov
možnosť monitorovania
ochorenia
súvislosť s
periodontálnymi
ochoreniami - viaceré
publikácie
Metódy
• 40 samcov potkanov
kmeňa Wistar
• CTRL
• MEL
• LIG
• LIG+MEL
Výsledky: melatonín v slinách
Výsledky: odhalenie zubného koreňa
Výsledky: odhalenie zubného koreňaμCT
Výsledky: Makroskopické skóre
Výsledky: Bakteriálna 16S rDNA a
zápalové markery
Výsledky: Oxidačný status v sline
Pacienti s chronickou periodontitídou
Melatonín v sline
Klinické parametre
Výsledky – oxidačný status
Obstructive sleep apnea syndrom (OSAS)
sleep-related breathing disorder
repetitive phases of partial or complete cessation of airflow
oxidative stress as a key pathophysiologic mechanism
OH
Nucleus
IGFR
EGFR
HER2
PI3K
FRAP
AKT
HIF 1HIF 1
HIF 1
HIF 1
PH
p53
B
O2
C
OHHIF 1
VHL
FIHHDAC
Ubi-l
C2
OH
OHHIF 1
Ubi
degradation
HRE
CBP
p300
HIF 1
HIF 1
vasoconstriction
antiapoptosis
antioxidative status
angiogenesis
glycolysis GLUT
VEGF
SOD
TGF
E-1
Gene expression
hypoxia
hypoxia
Sleep apnea
89 patients with CPAP treatment
Both genders
Clinical examination: before treatment, 1 and 6 months after treatment
ROS Markers: TBARS, AOPP, AGEs, FRUCTOSAMINE, TAC ,
FRAS/P
in plasma and saliva
Sleep apnea
Sleep apnea and shor-term treatment
Exosomes in saliva
Extracellular vesicles
40-100 nm
Cell to cell communication
Source of proteins and
nucleic acids
Potential therapeutics !!!
Different isolation methods
Analysis: electron
microscopy, SDS PAGE,
nanoparticle tracking
analysis
http://www.youtube.com/w
atch?v=dJ1WJ9WodlA
Further follow-up studies are needed to find
appropriate sampling frequency before saliva
can be used as a potential tool for the monitoring of the
treatment effects in OSAS
Limitations of saliva as diagnostic
fluid
Large molecular weight or charged molecules
Lower concentrations of molecules
Sensitive analytical methods
Higher sample volume
Bias by internal and external factors
Other biomarkers
Microbiome
Total microorganisms,
their genomes and
ecosystem in/on the
human body
Together
„supraorganism“
New genes with
advantages
Mouth, skin, gut....
Unique ecosystems
mother-to-child
transmission
modifying factors
„core microbiome“
„variable microbiome“
Personalized medicine
Host´s physiology
Health status
HUMAN MICROBIOME
PROJECT 2007
Mammalian virome
Viruses of eukaryotic cells (e.virome)
Bacteriophages infecting bacterial cells
(b.virome)
Viruses of archea (a.virome)
Virus-derived genetic elements in host
chromosomes
1031 members of virome
1% explored
Bacteriophages and their
potential Diverse group
Everywhere in nature
Classification
Life cycle
Oral Microbiome
Teeth, gingival
sulcus, toungue,
cheeks, hard and
soft palates and
tonisles
Dynamic biodiverse
environment
Biofilms
Oral hygiene and
salivary flow
Oral Microbiom in our hands
