127

· PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������������� �������������������� ���������������������������������������������������� ��������� ������� !�"#"##$%&!'"( ) %����*��������+,�-���������� .�/������ � �0�����1��������� �2������������3��������������+�����������+������4�� �������� ����5�����������4������1������ �6������ �����������2���������7��8������6������9�-�����9�2������������������:;<;����=�*��������-�����9�:;<;

Page 2: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

CONCORDIA UNIVERSITY

School of Graduate Studies

This is to certify that the thesis prepared

By:

Entitled:

and submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of

complies with the regulations of the University and meets the accepted standards with

respect to originality and quality.

Signed by the final examining committee:

Dr. Guillaume Lamoureux Chair

Dr. Peter Pawelek Examiner

Dr. Paul Joyce Examiner

Dr. Judith Kornblatt Supervisor

Approved by ________________________________________________

Chair of Department or Graduate Program Director

________________________________________________

Dean of Faculty

Date

Veronica P. Quiros

Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in

stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

Master of Science (Chemistry)

September 27, 2010

Page 3: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����� ����������� ���������� ��� ������������� ������ ������������������������������������ ����!"�������#����"$�"��� ��%&'()*+,-,.'/0123�45�67�89�12:�;05:<�=>?@@A?BCDE@FGH@FBFIJGJ?FK�032L5:0��:�M32N3�<2�O0�5�P�Q01�2R��P03<�45L�Q232Q01:�NS�L0�>TBFUTC@C@@VGHUWFVDCWJ?F�032L5:0��:�5�<0<15Q01�2R�P�Q01:7��X�Q01�4�032L5:0��:�5�N0LLY:<9P�0P�9O�Z9�<29:�[12<0�3\�S2N0]01�32<�Q94S��:�M32N3�5O29<�<S0�24<5Q01�4�[12<0�37��_S010R210�93P01:<53P�3�<S0�5Q�32�54�P:�<S5<�P0<01Q�30�Z95<01351a�:<194<910�429LP�[12]�P0��Q[21<53<��3R21Q5<�23�1051P�3��<:�12L07��b5:0P�23�<S0�41a:<5L�:<194<910�2R�O2<S�032L5:0:��<�N5:�Sa[2<S0:�c0P�<S5<�<S0�L22[�423304<�3�S0L�d�e�=feK�53P�:<153P�e�=geK�429LP�O0�10:[23:�OL0�R21�[10]03<�3�R21Q5<�23�2R�24<5Q01:��3�a05:<�032L5:0�=hS�301HFTH?ij�klleK7��m3�<S0�24<5Q01�4�032L5:0�<S�:�L22[�423<1�O9<0:�<2�<S0�P�Q01YP�Q01��3<01R540\�S2N0]01��3�a05:<�032L5:0�<S�:�L22[��:�:S21<01�P90�<2�<S0�[10:0340�2R�53�0d<15�<913�5<�<S0�03P�2R�fe7��_S0�25L�2R�Qa�[12n04<��:�<2�93P01:<53P��R�<S0�0d<15�<913�5<�<S0�03P�2R�fe�N�LL�P0:<12a�<S0�P�Q01YP�Q01��3<01R540�53P�[10]03<�<S0�R21Q5<�23�2R�24<5Q01�4�032L5:07��m3�21P01�<2�:<9Pa�<S0�0RR04<:�2R�<S0�0d<15�<913��3�<S0�24<5Q01�4�032L5:0�:�<0YP�104<0P�Q9<5030:�:�N5:�[01R21Q0P�23�<S0�feYge�L22[7���o0:�P90:�pqrYpqs�N010�4S530P�R12Q�ttuv�<2�wXxg�NS�4S�42110:[23P:�<2�<S0�5Q�32�54�P�:0Z90340�2R�a05:<�032L5:07��_S0�:5Q0�5Q�32�54�P:�N010�5L:2�4S530P�<2�wwww�:�340�5L53�30��:�M32N3�5:�5�S0L�dYR21Q�3�5Q�32�54�P7�yS5154<01�c5<�23�2R�<S0�Z95<01351a�:<194<910�Oa�535La<�45L�9L<15403<1�R95<�23�=wzyK�:S2N0P�<S5<�<S0�]51�53<�032L5:0�[12<0�3:�510�R21Q0P�Oa�5�

Page 4: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������� ������� ������� ������ ���������������������� ���� � ������������� �� ������������� ����������������������������������� ������� ����� ����������������������������������������������������������������� ������ ���� ��� � ���� ��������� ����������� ������������������������������������������������������ �������������� ������������� ��������� ������������������������ �������������� ���� ����� ����� ����������������������� ������� ��������� ������ �����������!��������������� �������������� ���� �������������������������������� � ����������� ��������� ��� ��� ������������������������������ ���������������� ������������������������������ ����������������������������������"��������� ����� ������#������ ����������������������$������������ �� ������� ����������������������� ���%���� �&'(&)*+��,-.- ������ ��� ��������� ������������ ��������������������� ����/0����/���������� �������������� ������������� ������������������������������������ ����������������� ������������!�������� � ������#� �������������� ���������������� 1�����

Page 5: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��� ���������� ����������������������������������������� ��!�"�#����$�%����& ��'�����( �������������'�������)������������%�*��%�����%����*������ ������ �� (�������� +���"�!��& ��'����,����������� ��-����������������������� ��������������������� -��%*����%��.��������)�(����������*�����������*��� �������%���%������%��*� (�'� ���������)��������������� (��� ����"������ �-����� ����������������� ���( ��!�"�$����/"�& ��'����"��0������ +����- ��%�������'�� ��������-��� �������(������������� ��"�1�������� ��( ����������%����������'�� �%����������������.��������� ������������� +��������������"��#����������*������%��( ��'�������*����������� +���"���- ��%������� ����������� �����������'����!�"�2����$ ������%�!�"�2�����2�-�����( ���������.����������**���� �����%��(( �������( �� -��*������� *����� (����- ��"�0���������*������ ��%�%��.�����*�%������ ���� ��������*������%������3�)���������*��������������' ����� ����"���- ��%������� �������4�%���5�� �� ����( ��������������(����%�������%�( �����3��*�������%����*������������"��6���� �*�%�����������7�'���%����� ((��������(������������*� ((�-���������������"���0���������� �- �%��� �������������'��%�7����( ��������� �%��� ����� ��)����� ��)���� ���*��������%���������)������������-������� ��%�,������%��� �*�������-�������"��������������( ����������%�'�����%�� �������������- �%��(���(����%��������(���������"���

Page 6: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������������� ��������������������� �������������������� ��� ��������������������� � ��������� ��� �������� ������������������������������������������������������ ������������������������������������� �������������������� ������� �������� �� ������������ ���� ��������������� ������������ ����� ���������� ����������������������� ������� �� ��������� �� ������������������������������� ������������������������������ ����������������� �������� ���� ���������� ��������������

Page 7: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����� ��������� �� ����� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ���������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ����������� ���� ������������������������������������������������������������������������������������������������������ ! �"#$#%&'��$(%)*+,(�)$-�.'/,)'/0�0�&$*�.'+,)$#).#$#0�0�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� � !1�2$)'&0#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� � !1! !�3#&0(�#$)'&0#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�1� !1!1!�4,(&5#%�,�#$)'&0#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�6� !6�7+'(�8'#0�%)'#0�)9�#$)'&0#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�:� !6! �;'&05�$).#$�%#,#8()%�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�<� !:�2$)'&0#�8%�5&%/�0#=+#$,#�,)58&%�0)$�>#(?##$�08#,�#0�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�@� !<�4�#%&''�0(%+,(+%#�)9�#$)'&0#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�A� !<! �BC#�DE(#%5�$&'�*)5&�$�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� F� !<!1�BC#�GE(#%5�$&'�*)5&�$�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� � !H�I+&(#%$&%/�0(%+,(+%#�)9�#$)'&0#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� 1� !H! �J�5#%�,�#$)'&0#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� 1� !H!1�4,(&5#%�,�#$)'&0#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� :� !@�J�00),�&(�)$�0(+*�#0�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� <� !K�G&(&'/(�,�5#,C&$�05�)�#%��#?�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� @� !K! �L,(��#�0�(#�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!� @�

Page 8: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������ ��������� �� �������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������� ������� ���������������������������������������������������������������������������������������������� ����������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������ !"#"""""$�� !%�&'"�()"$ ��*)'+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++"#,�����-�� ��.������������������������������������������������������������������������������������������������������������������/�����0��1���.���������������������������������������������������������������������������������������������������������/�����2��� ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������3���4�-�� ��.�567�8���������������������������������������������������������������������������������������������3���/�� ��������9:��.�; �����������������������������������������������������������������������������������3���3�7;��� �;������<��� � ����������������������������������������������������������������������������������=���=�>�?.���.��@�;� � �������������������������������������������������������������������������������������=�����-�� ��.�567���� �@��������<�2?/��ABC�������������������������������������������������������������D�����;���.�-D��������������������������������������������������������������������������������������������������567����;���<@�������������������������������������������������������������������������������������������E�;������������������������������������������������������������������������������������������������������������������>F@����;����567���������������������������������������������������������������������������������������������������G�0�:����� ��H��������������������������������������������������������������������������������������������������������������-�<�������������<����� �������������������������������������������������������������������������������������-�����8<� �����������������������������������������������������������������������������������������������������������-�����<@��������������������������������������������������������������������������������������������������������4����4�>5>?-70������������������������������������������������������������������������������������������������������������/����/�-�����.���: � ������������������������������������������������������������������������������������������������������3�

Page 9: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������� ��� �������� ��� � ���� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��!�"����#�$����%����������������������������������������������������������������������������������������������&�'��!���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������(�� ���!��� �)�� %���*�)�����#"����������������������������������������������������������������������������' �"����"�)"��� ���)%��� ��������������������������������������������������������������������������������������+���)"���*��#�������������������������������������������������������������������������������������������&�����������)��* �)���� ������������������������������������������������������������������������������������,(����,�-"���"���� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������,(����.��� �����/�%#������ %������������������������������������������������������������������������������������,�������0� �����)*������������������������������������������������������������������������������������������������������,����������#���"������ ���"���������������������������������������������������������������������������������,��12345678988888:6;<=5;8>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>8??����� �"����/����,�*��� � %�@)�� ������)�)�������������������������������������������������,,����������*���*��)�% ������������������������������������������������������������������������������,,�������A��� ��)�������� �������������������������������������������������������������������������������������,��������A��� ����������������������������������������������������������������������������������������.������,���� *������)�)��� �"�����B�����*�B� *�CD�+�������������������������������.�������������������!�����������������������������������������������������������������������������������������..��������*�� ��� �!"�����B��'C+�����������������������������������������������������������������.������������������ ����@)�� ������)�)��B����*�)�����#"�������������������������.&�����,������)��* �)���� ������������������������������������������������������������������������������

Page 10: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��� ���������� ��������� ��� ����������������� ������� ���������������������������������� � �� ����������������� ������������ �����! �"�#�����������������������������������������������$%"���&'(�)���������������������������������������������������������������������������������������������������*���� ���� � �� ��������+�����������,"���+ ���! �"�#������������������������-�������*���� ��+���������+��� ���������������������������������������������������������������������������.�����/�������� ������������� � ��� �,������������������������������������������������������������-0�������$��������� � ���� � � ��� ��������������������������������������������������������������������-��������� ���� � ������������� ������������ �1,�2/����������������������������������������-������-���� +���� �������� � �� ��3,�����������������������������������������������������������������-/�����4�%�+�������������� �����������������������������������������������������������������������������-������5 ��� ������� �� �#����� ����������������������������������������������������������������������������������--������������+ �� ������6 ��� �����������7������ �#�8#�'�����������������������������-4������������+ �� ������6 ��� �����������7������ �#�8��'�����������������������������40������������+ �� ������6 ��� �����������7������ �#�9�"*:�;�����������������������4������/�< �� �#����� +������� �#�=%,������������������������������������������������������������������4/�>?@ABCDEFEEEEEGHIJKIIHLMENNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNEOP�/������ #������7���� ������������������ ��������������������������� �#�!/"�/� �������+ � �#�������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������4��/�����%������������������������������+��� ���������� +� ���� � � �������� ����� � � �������������������������������������������������������������������������������������������������������44�/�����$�� � �� �+����7������� ������+������� ���������������������������������������������.0�

Page 11: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������������ ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��!��������������� ����!��"��������������������������������������������������������������#�$%&'()*+%&,-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------,./�0)1)23,4%25,--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------,..�637323&'3*,----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------,898����������������

Page 12: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����� ���������� ������������������������������������������� �!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�"#���������"���$����%�����&��%��������� �'����� ��&������ ��&��%���&&������ (���� !�!!!!!!!!!!�)#���������*���+�(��(� �������&������ �� �������� �&��%���&&������ (���� !�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!��,#���������-���.�(�������&���������� � !�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!��"#���������/���+����������&��0����%���������� ��&��%���� ��1�234!(��5!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!��*#���������6���.0�� ����������&�����%���������� ��&���789:;<=>?;@A<�1�B6.!(��5!�!!!!!!!!!!!!!��-#���������C���4����������� ����D��E��&��0����������������&�F�"G�����789:;<=>?;@A<9����%�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!��)#���������)���+��(E� ��%��0��� %��&������ �!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�",#���������H���4���� �� �(���%(� ������&��%�789:;<=>?;@A<������%���%������ �!�!!!!!!!!!!!!!�"*#��������,���I�� %�� � 0�E������ �������������%������ ��� !�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�-6#������������$���� ������1�J5� 0�E�����0���� ��� ��&��0�� ����������&�%������� �� ������ �������������%������ ����!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�-6#��������"���4�������(��&�����&�E���K��(������� ��&��%��0��3�K3.$�����%�!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�-)#��������*���+L+KI$M4��&�(���&��������&������� ��&�E���K��(������%���������� �!�!!!!!!!!!!!�-)#��������-���4�������(��&�����&�$LN+������ ��&��%��0��3�K3.$�����%�!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�-H#��������/���+L+KI$M4��&�(���&��������&������� ��&�$LN+������ �!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�-H#��������6���4�������(��&�����&��0��$$$$�D������!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�/,#��������C���+L+KI$M4��&�(���&���������&�$$$$������ �!�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�/,#��������)���F� � (�����%��&�(���&�������%���������� � !�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�/*#��������H���I�(����K�����OP�������������0����� (�������&�E���K��(�Q�$LN+�����$$$$!�/-#�������",���+(���&�������D���������� ��������� ������������ !�!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!�//#

Page 13: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� � �!"#�����!!!!� ����������������������$���������%���"����������������������&���������������� ����������'��(�)�*+������������������������,���������+���(�)�*+�������&���������&������������� � �!"#�����!!!!��������������������������-.�������������/�� ������������������������������'��������������������� �������� �������������-����������-���0����������������������������������!"#�&����������!�%.����������������������������-%�������������0����������������������������������!!!!�&����������!�$.����������������������������-����������$���!�������������1��������������&���������������������������������������������������-����������,���"�2!03����(����������4������ �)����������4�����������(��4����������������-$��������%.��5����� ������������������������������ ��������������)����������4������������-,��������%���*&�����������������67�)������������������� ���������������������������������������(����������4������ �)����������4�����������(��4�����������������������������������.��������%���� ����������&�������(����������4������ �)����������4�����������(��4��������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������%%���(�)�*+�������&���������&��������������� ����������� 4���+�����������������������������������������%+���(�)�*+�������&���������&����� 4����+�����$�-���������������������������������������������������%��������%����)�� ����������������������������&���������������������8(�)�*+9���������������������+��������%-���"����������������������&���������������������������'��(�)�*+���������������������������������%����/�� ���������������������'���������������������� �������� ��������������������������-��������%$���:��������������������������������85��;9����������������20!����������������������������,��������%,���:��������������������������������85��;9����������������20!���������������������������$��������+.���:��������������������������������8��20!9�������5�5��;��������������������������������$%��������+���</)���� �����232=20!���������������������������������������������������������������������������$�>

Page 14: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����� �������� ������������������������������������������������ ������!�"#����!� $�!�����$$�������� ��!�!�%%%%�&'�������(���)��* �#��� ����!�#!���$ ��+���,���������-#��*���!�!%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�(&'�������.���/����!��������0����#��!�$ ������!���,����������#��*���!�!%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�(&'�������1���)��* �#��� �����$ ���/2%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�(3'�������4���/����!��������0����#��!�$ ���/2%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�.5'�������6���/ �0���! �� $���������#����������������0����������� ���#������!!�!� $���������,��0�7�89:+�����8888� ���������0� ����!%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�4�'�������;���+�� ������!��#��#���0�������*�!�����������������9</=2)>?@�%%%%%%%%%%%%%%%%%%�41'�������&���+#������$ ������!���������� ��� �$$������!� $�����,��0�������� ��������!%�%%%�4&'�������3���+#������ $�!���������� ����� �����!� $�!��0��!���#����$� ������A�:/�*���$������� ��� �#��%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�61'�������5��+#������ $���B������������������������ ������������#!�$ ��!0����!�!�0�������$� ��8888��������%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�64'����������-�����*����0����#��!� $�C,���������=�!,��*7�/,���������=�!,��*�����C �=�!,��*%%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�;;'�������(��D�������0��������!�$ ��-*(E� $� ����������� ��!�%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�;&'�������.��D�������0��������!�$ ��-�(E� $� ����������� ��!�%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�&5'�������1��D�������0��������!�$ ��(,�F8� $� ����������� ��!�%�%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%�&('�������4��@�����*�0��������!�$ ������C,���������=�!,��*���������������<�/%�%%%%%%%%%%%%%%%%�&1'��

Page 15: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ���������� ������������� ������������� !"��#�"$�%&%'%� () !"�#*�+� )"�#��,��" -���./� ()�"�"��"*��'� ())�*"0)�� !�0�1#- �2&� (*#��-"�#��3�-!#� *-!"10�#-"�*���/� 4#� ��#"!�&5� +"!�0�#!�6"��!�"�)�&7�� +#�1�"*- �-"*#��#�8#�"* �������#-#� �9:�;� 6"�-"�� $�<#- !�5�'� 6�*#)"���"��-���#-- !"*��5=� 6 ���!">�*0�� "��#�"$�9=?�� $ ���!">�*0�� �-"$ �-!"������#- �@� A�� �0�#!� �-"*�-"�*��� 11"�" *-�BCDEFGHD IJKLMNOKLOPQKRSOQT5?� U-��� * $"#)"* - -!##� -"��#�"$�T'7�V�?;W� U� �-!���!#��"�*"X#-"�*��Y0#$!0��� �-") ��1�1�"��-�T�;:� U-�#*���W��&� Z#�-��!�- "*��"[0"$���!�)#-��!#����\D ]!#�"-��0*"-��1�!�� *-!"10�#��1�!� �:T�T'� _�����$!��� -���a�b��"� !#X"* -�#* �0�1�*"��#�"$�:���?�c� �����"�-"$"* �-#��

Page 16: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������� �� ������������� ���� ����� ��� ���������� ������� ���� ���������� ����������� ��������� � !���"#���������$���%&'� ("� �)� ��� ��������* �������$�%+,-.�/0� ��1��������������23 4� 5��� ����6������* ��#� ����� � 1����* ����� ��27.� 5����� �������������$��-8� 9)������$�������:3;� < ��������������������� ��:&:� <� �)� �� �)�������:=.>� <� �)� � ���� ��$� �������'8'?:.@&����� A $���$ $�������*����) ����������$��1��������� )� ������7.&� ���BC������BD�C�7&%&8� 5E5E5FE5F"�����"��������������$�������7�� ������1����)�������7G�H� ����I��$� ��������J����� ���������KL� M������ ����L��N� ���������� ������ � �

Page 17: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��� ����������� ����� ��� ����������� ����� ������ ������������ �� ��������������� �� ��!"#�$#!%&�� ��'%!"(%��!"%!���)*#+!���)#�$��#�,�#��-�.�,���#� )!��!(��$��#�,�#���-�'�+,*%!#/��0)�!" ��'+��#���!"#+#� ��%�)#!�'+�1,�! �)��-�!(��$��#�,�#���-�234�5-�+$��-�#)#+.��-�+�!"#��#��67�%)1�!(��$��#�,�#���-�829:�5(" �"��%)�'+�1,�#�%11 ! �)%��$��#�,�#���-�2346/��;)1#+�%#+�& ����)1 ! �)7�'�+,*%!#�#)!#+��!"#�!+ �%+&�<�� ��%� 1�����#�!��'+�1,�#�%11 ! �)%��234�%)1�829:/��0)���)!+%�!7�.�,��)#�.#)#� �� ��!"#���)!"#� ���-�.�,���#�-+�$�'�+,*%!#7�( !"�!"#���)�,$'! �)��-�2347�829:7��34�%)1�(%!#+�5=#+.>?@>ABC7�DEED6/���3"#�'+��#����-�.������� �� ���%++ #1��,!�&��!#)�1 --#+#)!��%!%��! ��+#%�! �)��(" �#�.�,��)#�.#)#� �� ��%�'%!"(%����)� �! ).��-�#�#*#)�+#%�! �)�/��3"#+#� ���)����)#��!#'� )�!"#�.������! ��%)1�.�,��)#�.#)#� ��'%!"(%���!"%!��%!%��F#�%�1#"�1+%! �)G"�1+%! �)�+#%�! �)/��3" ��+#*#+� &�#�1#"�1+%! �)�+#%�! �)� ���%++ #1��,!�&��%)�#)F�$#��%��#1�#)��%�#�5�%++#!>?@>ABC7�DEEH6/����I� J� ����K)��%�#�5DL'"��'"�L9L.���#+%!#L"�1+��%�#M�KN�O/D/�/��6� ��%�,& P, !�,��#)F�$#�+#�'�)� &�#�-�+�!"#� )!#+��)*#+� �)��-�DL'"��'"�.���#+ ��%� 1�5DL4�26�%)1�'"��'"�#)��'�+,*%!#�54K46/��3"#�#)��%�#�+#%�! �)� )�.������� �� )*��*#��!"#�+#$�*%���-�%�(%!#+�$��#�,�#�!��-�+$�!"#�#)����!+,�!,+#��-�4K47�(" �#� )�.�,��)#�.#)#� �� !��%!%��F#1�!"#�+#*#+�#�+#%�! �)�5Q .,+#��6/��K)��%�#� ��%�$#!%���#)F�$#7�(" �"�"%��%)� )1 �'#)�%&�#�+#P, +#$#)!�-�+��#+!% )�1 *%�#)!�$#!%�� �)��%����-%�!�+��-�+� !��%�! * !�/��3"#�)%!,+%����-%�!�+�R.DS�. *#��!"#�" ."#�!�%�! * !��5T��17��UHV6/��0)�%11 ! �)�!��!"# +�+��#�� )�!"#�

Page 18: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������������� ��������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������ !"#�������� !$%&�� ''((()(*+,- '-+(- '((()(*+,'-+' .�/0��������� 1�2345 363 �789:;<===>===?<@AB8CD=A@B@EFG<H=IF=<DCE@J<K=�� 6������������ �����L���L�����������L�������������M����������������� N������������������� �����L����������O�������P����L���������� QN%&��6����������������������������L�M��������� ��������L����L����L���������������L������� ���LL�������M������������L�����L��M����L��������� ����������������&��6�������������� ����R����������L������ ����������������������������M��M�����!S����SS�TU��L �L��M�������M�����&��V�� �����M�������� W"�XY�Z[\]��\��_\]����������L�����L���R���������������������M���������������"$S�TU���������������������V�����M����������� W"%&������>KaK>Kb c<@JB=<DCE@J<=d��������L������L�L���������L���L�����������e� Y�Zf[g�]��Z�h_]_��i&��j��������������L������ ����������N"Q����L��� ������������L������������������� �R�������!!�TU�&��d������������2T����M��������������������������������L����L�����������������������6k/�%���L������

Page 19: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������������� ��������������������������� ��� ���������������� !��"��# ���#�$��� ��%�#���� !��"�� #&&�������$��'�&�(�)���#���"# ���*%#��������������������������#���%��&���+%#"%�%���,����,����"%���"���#-� ��� ������.����#/�$���! #� ���0�����"���$���%��$�����1�����%�����/��� ��%����%���������%�����%���1�����&��������"�� ������23���� �3�4������33����33���� ��33����5�$ �������������������33��%�/��,����&!� ����%+�%#1%��� !��"��# ���#�$�+#�%�,�%��%��������� ������1������6#�#����������''�����7���%���������'8���� ����$����'8��#��+���"�&#��� ��%���������#��"�4�� �&��+�# ���#"���!,!�#���&�"#�1���"%��%���#��������#24�������������6�,# ��������������9�:��"������������'����;%����#�����#1�#&#"������!���&�#�&����#���,!��$�����������#�"! #�1�#�����"%��#����� ����!"�!�����:�/����"�$�������!"�!����&��$�����������%�/��,�����/� �#�"! #�1�������"�4�.���+#�%<+#�%!���!,���������� �"�4�.���+#�%�#�%#,#������ �+#�%� #&&������������,!� �#=����1���#!������1�������"�"#!����� �-#�"��� ��%�������!"�!���������/�#�,��#���%��5���#��>����?��=��%��4@<<+++�4 ,��1����ABCBCBD EFGHIJKLFMJNOPHQJM�"�����#"�������%���,����&!� �#����&�+�4�=��$�#"��4�"#����!"%���@�R�ST��UV�V���WX�Y�WZX[YT�UV��\������������������(���]Y�WZX�X��Z�WT�TZ��_SYUWT�������a�bccde��R�ST��UV�VUf�T�TV�_g��h��RWXij�������a�bccke���W�[�XSXSSUV�[j�UZXjT��_lYTj�W�������a�mnnoe���� �]Y�WZUV��pU��TSUV��?����������������q�9�:��+�1�������������q������r�#�1���"�����#"��"4$��� �#��1��4�"���#�1�:"%!�#1���������������4�/# � �����1��/# ��"���%����%��������&���]Y�WZX�X��Z�WT�TZ��#�������1� ���������������&� #�������;%#��+���"�&#��� ������,$��%#�1�����������''(��+%����%��"�$�������!"�!���&��W�[�XSXSSUV�[j�UZXjT��������+����/� ��

Page 20: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��� ������������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ���������������������������������������������������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� !" #$%��&''()���������!" #$% �&''()������������������������������������������������������������������������������������������������������������ �������������������������������������������������������� �����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������*% +,$-����������������������������.����� ���������������������������������������� !" #$%��&''()��/012 34567859:;<=59:;=>;9?=5@:9;A��������������������������������������������.��������������B����������������������������������������� ������������� ������ ��������C��������������������������������������� �.����������������������������������������������������������������������������������������D�������������������� ����������E�����. !" #$%��&''F)��������������������������������������������������� ������ ����������������������������������������������������G"H!I",+,++JK IL!JM,L-#!��G"H!I",+,++JK IN,O!L!KP G"H!I",+,++JK #O#$#+"-#!P ��������������������������� �� !" #$%��QRR&S��� ��� !" #$%��

Page 21: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������� �� ��������������������������������������������������������� ������������ �!����!���"�#��!��$�������#��������������������� ����������������������#�������%�����&����� �!�����������#'����������������������������������(&��!��$�#������)*������ �� ��������+����,������-�������� �!������������-������.�/010� ��213�/4� 5 ##��!�'�����������������6�6�!���������-��������� �������!���'�&�������#��������#������.�/010� ��213�/4����$������&'���������� ����'�����)7�$������ �� ��������8����%��� �$���!����������������������!�����(�����������&!��������&����6�!����6�������#����'���&�� ��� �����9���������6���6�����!�!������)������ �� �������������,�������������&�����!�������!���������(��9�#������)%�!� �� �������������%���!!����������������� ��������������&�����-�������������&��!�����'��9���������!������������ �� ������!������$�����#���&���#������#����������������#����)������ �� ���������������:��������������������!��������������#������$�������#������&�����������'���6����$���!�-������������������;�!������!��$��������������#������$�������#���-����#�6�!�� ��� �������������& ��&����������!�����������������������<=>=<? @ABCDEFGHIFJKILIMNGKJ���#������$����'�����#��'���� ��O ��������������P��!��������&'�!����6��$���&�����������!����6��$�������������������������������$�������������������$�����������$��(�����$�'�#������-��������� ��������������9"��)*�������� �� �������������!�������������6��#��� ������#���������%�������6�������6�6��������� ��#������$�������6������!�&��!��$��������� �������),��$�� �� ��������+������������������#�������$����������������Q'�$���#������$�������� ������������#�����$���&����'������!����&�'�����������������$�������!������'�&'����#����'���������������������� �(�'#��)��7����

Page 22: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������ ��������������������������������������������������������������������������������������������� � ���!��������������������������������������!�����"���������������������������!��� ������!�����#�������$!��!���������� ������������������%&'%()*�����+��������������������������!������������� ������������ �,-%.,./��������������������������� ���� ���������������!������������� ��!�0����������������0��1��2������ %&'%()*�����3����4�����!���!�$���!���$!�������������������������� ������������������� �����������!��������������������������������������������������� ������������������ ���������� ���!��������567������������8����2%&'%()*���++9:�4�!��%&'%()*�����;����<���++�����������!������������������������������!������� ����=0����������������������������!�$��!���!�������������������� ���������������������>!��$������ ��!� ����0������������������������������������������?��%&'%()*���++�����=�����!���������������2������!��� ���� ���������!�������� �����������2���������������������!�������������@������������������������A'B&C'/D/DDEF%C-&EG/-,(H�������������������������>!������������������� ����������!����������� ����������������������������������$!�������������$��!��!���������������� ����������������%&'%()*�����+����<���!�������!�������������������� ��������������������������������<�����������!����������������������������������� ��������������� � ����!������������������������ ����������������������������I������%&'%()*����������

Page 23: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������� ����� ������ �������� ��������� ������� ������� �������� ���!����" �#�"$�#%&�'�%������($���%)��)�#%�$*��+��,�"%�����'��-.�#�-�����������.%����"%'���/-��"���"���!��+�-�'�%��$ ��01200�3456�'�$�!����7 $$,899�(,��*:" 9";%<!%�9�,#�$<���#" <'�=:��>�$ �$ ��,#%.�#*���/-��"����'�$ ��$�#$%�#*��$#-"$-#���#��"���%'�#�'�$��!���)��-$%���#%�*�"����#)�'��.��;��,�"%���7?���@�ABCADEFG�HIIJ=:��K%;-#��H�� �L��$ ����/-��"����%;�.��$��+���������+#�.��%(��,�"%��8�$L�� �)��!����%'��$%+%�'�����"$�.�#%"�7MCNBOCPQPQQRSAOTBRUPTVDWAMCNBOCPQPQQRSAOXPYBTBS=WA��'�+�-#�L%$ ���'%.�#%"�/-�$�#��#*��$#-"$-#��7ZTCBNPQPQQRSA[VNDBWAZSQ[BNVQ[VDAQPEVWAMDQQ[DNPUXQBSAQBNB\VSVDBWA��'���!�$�#=:�] _abcdedfgggghijjklmnopqmrlipstukrqmqmnkqisovspshmuisoiksqwqomqrplslxipnrgyzg] _ed{|be}~dgghijjklmnopqmrlipstukrqmqmnkqisovspshmuisoiksqwqomqrplslxipnsgyzg�_�}�~dggggggghijjklmnopqjrlipstukjqmqmnkqisovspshmuisoiksqnqomqrplslxopnsgyzg�_�b�}gggggggghixjmxjjspqjjlipstukmqoqmwrqssvmshooouisoiksipqorqrplslxipvrgyzg]_�d�d�}f}~dgg�homixmnopimnlipstukmqmqrkkqxsmv�pijmuisoiksmwqorqhplslxix�hg��gr������gggggggg��ijkxmvopkjvlipstukmqmlrnkixsrv�poomuisoiksmwqorqhplslxixnwg��ggggggggggggggggggg�g��g��g�g������������gg�g�g�gg�g��������gg�������������gg] _abcdedfggggsrsk�xomltmttjjoqojjs��nlmpl��ojlpohjorlskutxsxrsotojrsmijomg���g] _ed{|be}~dggsrsk�xomltmttjjoqojjs��nlmpl��ojlpohjorlskutxsxrsotojrsmijomg���g�_�}�~dgggggggsxsmkxomltmttjjoqojjs��nlmpl�hojlxohjorlskutxsxrsotojrsmijomg���g�_�b�}ggggggggsxsmkxomoomtsujo�orjs��xloxl�osjlxjhjlrlskqtxixvsotojromirotg���g]_�d�d�}f}~dggsxsmrwomxtmtlmjouovmxotjlmxl�xomllvrjirlskotxixrsotojrsmiroog���gr������ggggggggsximvtomxtmtlmjmuqjjxisrxmk��xq�lqvh�xrlskqtxiirsotojrsmirojg���gggggggggggggggg�g��g���gg���g��gg��gggg��g��ggg�gg�gg����g����������������gg] _abcdedfggggopooolnrqmurnknrssvt�����kxmrukuhhtjjtssiwiloujov�qvhjhumsoug���g] _ed{|be}~dggopooolnrqjurninrssvt�����kxmrukuhhtjjtssiwiloujov�qvhjrumsoug���g�_�}�~dgggggggopooolnrqmurnwnrssvt�����kxmrukuhhtjjtssiwoltijlv�qvhjhumsoug���g�_�b�}ggggggggoxoooooxshurnqwjoqrtsk�usxnihumuhhtjjtssqwolttmlj�qvhj�umsoxg���g]_�d�d�}f}~dggipooooqxtmurnxwrolrixixkiunmrumuvrtmrtssiwossoror�qvhjouksoxg���gr������gggggggg�xosooqrsjurnpwjotrot��nlqmjrumuovtmjtssiwostxroh�qvhjruksokg���gggggggggggggggg�����gggg����g���g�ggggggggg����g�����������gg�g������g����gg] _abcdedfggggkvxqsrp�soqmvworxxjrxqps��rmkomslqssvouxvqskqlsmqkjrxojqoosng���g] _ed{|be}~dggkvxqorpnsoqjvworxxjrxips��rqkomslqssvoupvqskqlsmqkjroojqoosng���g�_�}�~dgggggggkvxqorphsoqmvworoojrxips��rokimslqssvoutrsitqqsvqmjjqojqxosng���g�_�b�}ggggggggkmxqojphsiqmvwwroxmrxoxs��htkomslqssnoutrsitoqoromjoqomxoosng���g]_�d�d�}f}~dggkvoqorpjsiqmnwtrxirkxxpnsoiostmslqssmoutj�koqqorlrjmlojxooswg���gr������ggggggggivkqohphskqmnwwrxomjxopvsrlokomslqssvoutjrttxlorlrj�qojxxosng���gggggggggggggggg��g����g������g�gg�g�g�ggggggg������g����gggg���gg�gg���g���g] _abcdedfggggqosqtsjhjsvl�oiiqvnl�xqpxmnlnkxvqsqsoompkioq�mlnrqqrmtxnujjkg��zg] _ed{|be}~dggmusxl�mvrsvl�oiiqvnl�xqpxmnlnkxvqsqsoompkioq�jlnrqqrmtxnujjkg���g�_�}�~dgggggggmusxl�mmrohlooiiqvnl�xqxsmn���mrolisqsqxkklqhjxvnqqrmixnujjig��yg�_�b�}ggggggggqrsxl�jkrohl�ooiqvnx�lsxnmr�����osqstxovkiqqvkwvrqqrkx�nujmig���g]_�d�d�}f}~dggl���sxmxjsrl�oiiqvvx�lsxnlrlvxtutilxix�rksu�rolrnwirhxpnujmig���gr������ggggggggk���sxjqjshlmooiqvnx�ttjnlrlvxkottlsi�xjisl�rplhnhqv�xlvujmig���gggggggggggggggggggg�g�g����g�������g�ggggggggggg��ggggg�gg�gg�ggg��g�g�����g

Page 24: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������� ����������������������������������������� ������� � ���� ����� �����!"�#$�� ����������������������������������������� ������� � ���� ����%&�'��(#)$������� ����������������������������������������� ��� ��� � ���� ����%*�'��+�,#�������� ���������������������� ������������� ���� ��� ��� � ���� ����%-����+).#�#$�� ��/����������0���11��� � ���������/�� ��� �������������� �����2��345678�������� ��/��������������11��� � ���������/�� ��������9�9������� ����� ����������������:::�;�;<::;�;����<�����;:;:<::;�:::<<�;��<;;;��<<<;:;:<::::;�������������������� �������������0��������� �� �������� ���������� ������%= �����!"�#$��������� �������������0��������� �� �������� ���������� ������% &�'��(#)$�������������� �������������0��������� �� �������� ���������� ������% *�'��+�,#��������������� ����������� �0��������� ����������� �����������������% -����+).#�#$������ ����������������0��������� ����������� ����/������������%=2��345678������������ ��0�������������0�������9� �������9��� ����/9�����������%= ����������������;;:;;�:���;���:;�<;;:::::::::��:;:;<:<��;::::::;�<:;;:;::�::���������������� ������������ ��������1�%�������!"�#$����� ���������������������1�%�%�'��(#)$���������� �����������������������%�2�'��+�,#��������� � ��������/������ ����11�%�2����+).#�#$����� ������������1���00�����%�>��345678�������� �� ������������1�����/�11�%������������������;;:::;�::<�:�;�:�;<;�������?@ABCDE???F???GHABIJEIK?LM?NJAIL?NOAP?QERCEIOEQ?LM?EILHNQE?MDLJ?PAMMEDEIK?QSEOAEQT?UVWXYZ[Y\�]_�a[\[b�c_WYX�\d[�][e�_[af[a�YVg_W_�\hhV�iVc_\Vjkl�mahZ�\d[�ncaho[Y�pWhWYmhaZ\W_�qY_\W\c\[l�npq�rd\\ostt]]]u[eWuucvtwhhV_tVc_\V]ktxu��UZWYh�Wb_�a[�hVhca�hb[bl�_ZVV�dgbahodheW�ZWYh�Wb_�a[�a[oa[_[Y\[b�WY�a[bl�WbW�ZWYh�Wb_�WYbW\[b�WY�eVc[l�e_W�ZWYh�Wb_�_dh]Y�WY�ZX[Y\l�dgbahygVl�ZWY[�Yb�e_W�ZWYh�^Wb_�WY�Xa[[Yl�Yb�h\d[a�ZWYh� Wb_�a[�WYbW\[b�WY�Xagu��wd[�hY_[Y_c_�_gZehV_�cYb[a�\d[�VWXYZ[Y\_�a[oa[_[Y\s�z{|�Wb[Y\WV�ZWYh� Wb_�WY�VV�_[}c[Y[_�hm�\d[�VWXYZ[Y\l�zs|�hY_[af[b�_ce_\W\c\WhY_l�Yb�zu|�_[ZW~hY_[af[b�_ce_\W\c\WhY_u����wd[�o[a[Y\�Wb[Y\W\g�]_�V_h�hZoa[b�ZhYX�_o[W[_�c_WYX�\d[�VWXYZ[Y\�\hhV�p�U�wl�p_W��h V�UVWXYZ[Y\��[ad�whhVl� \��ipq�r [__[b�mahZ�d\\ostt]]]uYeWuYVZuYWduXhfxu��U�hZoaW_hY�e[\][[Y�o[a[Y\X[_�a[�_dh]Y�WY�weV[��u���� ����������������������???????�������????????�������������??��L�QKED??������������ ���� ���� ���� ���� ������������������ �� ���� ���� ���� ������������� �� �� ���� ���� ������������ �� �� �� ���� ������������������ �� �� �� �� ����� N�HE??¡???¢EDOEIK?APEIKAK£?�EK¤EEI?K¥E?NJAIL?NOAP?QERCEIOEQ?LM?QA¦?PAMMEDEIK?EILHNQEQ??

Page 25: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� �������������������� ������������������������������������������ ����������������� ���� ����������������� ���������������������� ���� ���������� ��!� ������"#$%&#'('(()*+&,'-%.%*���������������/0��"1+&,'-%.%*��"1+&.%)2'.34%+ ��51+63$4%�������������� ��� ���� ��������������������7�!889:/� ����������������� ������ ��� ����;�� ���<��=>�������<������������������������������� ����� ��������51+63$4%������� ��������������������<�� ���������������51+63$4%�� ����������������������������0���?@AB CDEFGHHIJKFLMKLFEINOIEPNHGJEI�����������<����Q�� <���<�� ������������ � �� ����������� ��������� ��0����������������� ��������� ���0=�R����������������"1+&.%)2'.34%S��<�T������%#+4U1�!�==�/0��V���� ���� �����������������W������X � �Y Z�!����[\\0���0���/����������WXY����<�]� �_0����������� ������������������� �������+"1+&.%)2'.34����������������� ���<�������� ���������<� ���!�:T/����������!�WXa/��51+('U3�!�T�V/� ��5.#%$'('(()*+63$4%+!�VbQ/0��9��������������� ��������������������������� ��������������������������������������� ����0������� �����������������������������������������������c����������������� ���� ������������� �0����

Page 26: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������������������ ���� �� ��� ���������������� ������������������������������ !�"#$%&'()*&+,$-��./0�1�2���-3���4/0�5 6�����-65��/0�7#$8*9+�-1�55 :/�24.�7&;'<*8*88(=$>+<,'$-�124/�-?@A43��$';$,9#0�B��C/D��E55��4 52����������������F ���.�@2G���A!A52����6�4A��� 5.A43��@2�2����A��A��D��?2�@�HA.4�1I�@2F�.�! 4 !��� ���4 52���A��!2.���F� ���: �. !2A4�J��@���!255���KI���!A425�. !2A4�:@A�@�A4�"#$%&'()*&+,�A4�5�.������A.�����I�CL�24.��@��52�3���MI���!A425�. !2A4�� !F�A�A43����A.�����CCICLC�-?@A43��$';$,9#0�B��C/�N�O�NP QR�ST��������� �����?4@A3���';$,9$-B��C/�.����A6��2��!255�KI���!A425�. !2A4��� !����A.������� ��CL�-62��.� 4��@��"#$%&'()*&+,���U��4��/D��V��6�2���2��@���I���24.�.�24�AF2�255�5�WI�@����-��I�L/�:A�@��A3@�����4�0��@�4�� 4�A4����:A�@�� ���XI@�5A����-Y�IYC/D���E�����24251ZA43��@��[\]������A5��-�_ a/��� !��@��bI�21���1��25����������� �� ��2!��A���4 52��0�2�.A�����4���

Page 27: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������� ���������������� ��� ������ ����������������� �� ���������������������� ��!������������ ���"���� ��� �� ���#����������������"������������� ���������� ����������"���������� ����� ���������������������������������$�%&''()�������� � ������������� � �������������������������� ��"����� ��"��������� � ����� ���������������$�� ���� �����"�����������������������������������������"������������� ���������� ���� �*+,+-. /01234516789:;2<=7:892>���?������������������������"������ ���� ��((�(@(���� � � ��"��������� �������������A������� ��>��������� ��������A��������� ��"��B�����������������"���������������������������� �%C��D��������$#�&''�) ��>����������������"���������� ��"��������� �� ����"������������ �������&�&%��)E����������%F�����������$#��GHG) ��!������(����� ���� �����������������������"�������� � ��>�� ����������� ���""������"���������� ����%��)H�"������������>IJ������ ��>���%��)H�������"���#����>IJ�������"����� ������"������� ����������"����� ����� ������ ���� ��%�?�K @ � �) ��>���%��)H������� ���������"������D���� � � ��"��������� ���� ������������������������������ �%L����������$#��GMK) ��N������������� ��������������� �������� ����&�&%��)E���������#��������CK������ �����NK��"������������������������� �B����������������������������������������� ���� ���������������� � ����������������>IJ�������%�������������$#�&''() ���

Page 28: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������� ����������������������������������������� �!��"#����$��%�&��&��'���� �%��� �!��&��( ���"��!$������������&��)�&�*%+����%�&��&��,���� �%��-��.&��(*/����*%!�*%������ � �����&��0����1%� *�!�1 %�� �!��&��2����1%� *�!�1 %�-�3������& ��+& �#��+��4��1 �%���/����(%�!%�#��4��&���/(��� ��� ���* (�*�!�(*/��"(�������'5� �!�'67�'8� �!�,97� �!�':� �!�,�$�";/&��*<=><?@A7��BB�$-�� .&��1 C���1�(%*��*������4����* ��� ����&��*�����+����+�%�#�':�,�7��&%+&�+*���������&�� +�%D���%��7�'5�'6� �!�'8�,9�"�&����%��(*/��%��4%#/��� (�D�$-��.&����*������* E� ��%1���� �����*��%���&��+*���!� �!������+��4��1 �%�����4��&�� +�%D���%���";/&��*<=><?@A7��BB�$-���F�GH I��J�������J��KJ����������������&�������D%�/�*E7��&��( �%+�4�*!��4� �1���1���%���&��� 1��%�� **����+%��7�&���D��7��&��L/ ���� �E����/+�/���+ ��(���%�&���!%1��%+�����+� 1��%+�!����!%�#�����&����# �%�1-���F�G�FH M�N���K�������O� ������* ��7� *��#��%�&����* ���4��1���&������+%��7�& �� �!%1��%+�L/ ���� �E����/+�/����%�&�����%!���%+ *��/(/�%��-��.&��L/ ���� �E����/+�/�������1(*����& ���4� �(/����4*E-��.&��+�E�� *����/+�/����4�E� ������* ���%��%**/��� ��!�%��P%#/���6-�

Page 29: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ����������� ��������������� ������������������������� �!"#�$%##&�'("#%#'�%#(%#'#&)�)"#�*$+,�-)�)"#�-.)/0#�'/)#'1��2/$3%#�$#&#%-)#4�3'/&$�5"/6#%-�78881.$913.':1#431."/6#%-;<1��=&#�(>%)/>&�>:�)"#�?@')%-&4'�>:�)"#�A@)#%6/&3'�/&)#%-.)'�8/)"�)"#�9-%$#�4>6-/&�>:�)"#�>)"#%�'3B3&/)1��*>')�>:�)"#�.>&)-.)'�-)�)"#�6>&>6#%@6>&>6#%�/&)#%:-.#�>:�)"#�4/6#%�-%#�B#)8##&�)"#�-)>6'�>:�?@')%-&4'�C��-&4�C+�>:�>&#�'3B3&/)�-&4�)"#�'/4#�."-/&'�>:�)"#�9-')�"#9/D�7E�+<�>:�)"#�B-%%#9�4>6-/&�>:�)"#�'#.>&4�'3B3&/)�7F#B/>4-GHIGJKLM��NON<1��P&>9-'#M�:%>6�-99�'(#./#'�')34/#4�'>�:-%�"-'�'/6/9-%�'3B3&/)�.>&)-.)'�-)�)"#�6>&>6#%@6>&>6#%�/&)#%:-.#�8/)"�-�B3%/#4�'3%:-.#�-%#-�>:��QRQ�S+�7T#-')<M��RUV�S+�79>B')#%<M���+V�S+�7WLGXYKZ<1��!"/'�/&)#%-.)/>&�-..>3&)'�:>%��+[�>%���[�>:�'>90#&)�-..#''/B9#�'3%:-.#�-%#-�7\3]3#%%>TGHIGJKLM��NNQ�_3"&#9GHIGJKLM�+VV�<1��

Page 30: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� ��� ����� ��������������������� ��!������ ��"�#$%&'()*+',-(�.�"�!���������/�����!�������������� ��"�.�0���������"���� �.1"���2��34��4�"�5����"��� ��"���� �����!�.��1!6��17���4�8�9�:4�����4��;5���"1!���� ����4���0�!1��1��������.���:��.���4����!����� ��4���1!6<�:41����4���5���"1!���.�"�1!�� ��"��4���������1!6�=>41!6��%(?%-@$<�ABB�C2��D16����E�1������������4��/�����!��������������� �����"��1���!�����2��D16����E�4164�164����4��.1"��1��8���1�!<�:41�4�1���1"1��������4��/�����!��������������� �.1"��1���������!�����2���F�GH� �������IJ ���HH� ��K���� ��� ����� �K���LMNOPQRSTPUVQ�W�X�I�YZ[\��]1"���������4�:!�1!�.1 ���!�������2��34��6���!��84�������8����!���4��6A_�����4�����1���1��2���D16����6�!�����.���1!6��41"����=:::2�6�2��� 2�.�2�41"���aC2���

Page 31: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������������������� ������������������������ ��������� ����������������������������������������������������������������� ����������������������� ���������������������������������� �������������������!���"#����$%���!�&'(&)*+���"",-�������������������� ����������������������������������!������ ����������������.����������������������������������� �����/����������������!0�����1���$2������������3##-������1�,�$2,������������"���-����������������������2,�����������4,�$2,4,�������������������,�-����������!����������������������������!���������������������������������������������� ��������������������������� �����5�����������������������!�����1��"�$2�"������������"���-�������������������������������!������������������������$%���!�&'(&)*+���"",6�7������&'(&)*+���"�"-�����89:; <=>>?@=AB=?CD>BEF=G>DD������������������ ���������������������������������1��������������� ������������!�������H����� �����������������������������������������������������������������������������4����������������������������������������������������� ����������I���������� ���������������������������������!������������������ ����������������������/������������������������������������������������������� �������� �����������������������!����������������$7�������&'(&)*+���"",-������� ���� ����� �������������������������������������������������������������������� ��������������!����!J�K��������������H�75��$����������������-������������������ �����H�%.�L�$��������������������������������������� �������������-����������������� �H!�M���N������� ������������������������������������������� �����O������������������������������������������������������������������ �������

Page 32: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����������������� ������ �������� ������������������������� !��"#���������$����������� %%������&�'�����(�������������� !��"#����$��������&����#���������������������� ����)�������� ���#���*&�����$�&��������$����� %���#������������������ �!��"#����������������$��������&����������%������#������������%���� ���#�������#��������%���������������������������� !����+��������,�����#���������#���� %��#��$�����������������&����������������������$������������&� �����%������������������������-!,�.�/�+������%�� ������$��0-�12!��3�����%#&������#�����*���������4�����&������� ����%�������������������������3�%#��4��#������%#������%��&�������%���������������������������� ���#������$�&!��5�����������#����������������$������������������������6����*��78�&�����������,� !��5��#���������#���� %����� ������%�� ��������������&����������������$����������!��5�����������#������� ����9-:�����������������������&���� ��������0-�.�/�+���������0-�;2!��"#����������������������������&���������������#������� �������#� ������������������ ������ ���4%���������<����������,= !�"#����������������������� �����82�>0�����(��#���%���������� ����������$������������6������������������ !��82�>0���������$�����%�� ���#���� � �����������#���������(����#��%�����?���� � ��������������&��������������#&���%#���������������������������#��#&���������#��� ������ ���������2������������������9 �����&������� ����������&���%��������������#����&��$� �����#����������#��%��������#�#��������� ���������5�(�������������@ !�<&�������%���� ������������������������������&���������#��� ����������������������������������$������������6��������������@--0 !��"#�����#��� ��

Page 33: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������� ������������������������������������������� ����������������������������������������� ���� ����������� !�����"#��$%��������������������������������� ������&��������������������������������������'���� �������#��(����%������������������������������������������������ �������� ��������������������������������������������'���� ������� !�����"����������'���� ������� !�)**+"�������&�������,������������������������������������ ���� �#�-������ �!���������������������������� ���������������&���������� ��#��(��������������������%����������.�/ 0+������������������������������������ ����#��.�/ 0+���������������������������������������������������������&���������������������������'������������� !�)*�*"#������1234 5676897:;<=>;?6@:A=<BC>DC:>E<<$������&����������+!��� ������������������������ ������%����������������������!����������������������������������������������� ������������#��F������������������������� ������������� �������������������!������� �������������� ���������������������� ��#��123214 G;7:C><A:7><F�������������� ����������������������������� ���������/H����� ���������IJ���� #��(����������� ������������������� �������������.J����� ��������������� ��&� �����������K��������������� ��������������&��������������������&�����L����������� !�����"#��(������� ������������� �������� ����!�M NO�P!����!�M �QPR��!�����������S �TU�VWOUP��������������������������&� ��

Page 34: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������� � ��������������������������������������� ��!��"#"������������$��%"�����������������% ���&���������������'�(��"�������������)��"�����"&&��*�+�������,��-������+���"�+�����+����"��+����".������ ������&�����.�+"&�(������������"+�������+����".�������+"+���/��0����+".��������&"���*��.�1��23�45637���+��������"**���+��8��9���+�������.-&�+�&����� -���"�������+"���"&&��������"+��(��:�-�� ���;& ������:�-�$���"��<�&&�"��+�����<"+���.�&�� &����������������������� )/���� �=>?@ABC===D===EFCGHBIJ=KCJL?HM=N?CO=IP=HQC=GIIBK?JRH?IJ=IP=S@TU=?J=VWXYZ[\] Z_[XCJaMbCW=8��9������-�����+�������&&�</��c����������"+�������&��:�-�� ���;& ������:de�$���"��+�����<"+���.�&�� &����������������������� )/�fghgTi SCHRFL=RL=GIPRGHIBL==:��.��+�����-���� �&������&"������"�.�+"&&���j�.����� ������+<���"&��+������-���"�+�����+��+��-�� ����"+"&�+���"�+��+�/��c<��(��������+����"��(����*��."&&���(�����(��kl�"������+"&&���"-����m��#�������������� ��n�"�������������� )/��o���

Page 35: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������������� �������������������������������� ����������������� �������������������������! ��"#��#���� ��������#������������$ ����� "#" ������! ������������� ���������� !�����!# ��#�!������#� #"�� ���#� ������% � �����������&'(�)�����������������&*���� ��! ��#�������� ������������������"�� ���� ��"�� ��������"�������������������������������������#�������������� ���#���������������������+������ ,"� ������ � ��� �#�����������##" ��� �������������������������������#���� ��������#����������� ����������������� � �� �������"�������#����$��������������$���#��#� ����������$������������������������#�$�������� �������������(�-��� �$����������������� � �� ����� �� #� ������! �!�����! ��#�������� ������������������% � �����������&.(�/���������������&'(����� �����������������"������� ������������!"����0� � �� #��� �"!�����$����� ��������� ��������� �������"��������� � �"�������#����#�����#���! ��"#������������1��� ���������*''����2�����"#��������������+��#��#����"���#��������#3�������� ���$���������������$������"�����! �$����#�$���������������� �� �� �#�����4�#�$�� �5���6������ �������������"#�����#��#�"����� �"��� �#�!! �� �������������"�������! ��"#��+����#��#�$��������� �� �� �#�����4�����#�$�� �5��% � �����������&.���7898:; <=>?@ABCDBEF@=GADCC/� ����"��������� �#�����#��������"������������������������� �� ���*H1IJ�����$�!���!�����!� "$��! �#��������K�L�� �#���� ���)���������������'������ ��� ����������� �#������������� ��"����� ������#�������! �!#�$���#�"���� ,"� ������� �#��������� ���$������H�#���#�! ������

Page 36: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ ����������� ��������� �������� ������������������������������� �������� �������� �!��"#�������� ��� � �� �������� ���������$�� ������� ��������� ������������ �������������������������!��%����������������&� �� ��� ���� ��������������������������'()��������� �� �� ����!��*���������������������������� �������������$���#$����� �� ����������� �������� ��� ������������������� ����!��+�� ��$&��������� ���������� �����,�����-./-012&�34536�7����� -./-012&�3443�!��*�������������������������������+�� ����!� �89:;<=>888?888@A>BC:D>8E>FGHI:DE8JK8>IJLHD>M8)�� ����&�"N����O$� ����� �����P���-./-012&�344Q�!�*������ ��������� �$��� ������� ����$�����#�� ��������� � ������������������ ���R� ���� � �$������������ ���������� ������������ ��!��*��������� ���� ��� ����� �������������� ����� ���� ������������� ���������� ������ ���� � �$��������������������7$���ST!��*���������� ����������������� ��������������� �� �������������� ���������#����������������� �����$���# � ����'�)��&� ������������������������!��'�)�����U��������������������� �� �������������� ��� ��� ���#$� ������������ ����� �������)�������-./-012&�34�S�!��*������ �� ����������'�)��������#��������� �������������������'()��� �������#���������7$���ST��7$���S�����V2-WX.YZ[X\0.���������� ���#$� ��������$��������

Page 37: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����������������� ������ � ������������������������������������������ �������� ��� ������������� �������� ��������� � ��������� !�" ��#$%#&'(���))*+���,� ���������-�������������������� ��������������������������$%#&'(� �)).+��-���� ��� ������������ ��-������������������������ ���� ���/�01� 2�013+������ 2���3+�����4*. 54*.�+6����������� �������������������������������������� ������� �����-����� �� � ����������� ���� ����������� � � ��������������- ����������� ����,��2�013�����2���3���� �����-��������������7�������������������������8��- ���9�:��-� �����54*.����� ������ �����������7��� ��� ����������������� ���������$%#&'(# �))0+#�������� ����������������������� ������ � �" ��������� � ����:����������4��� � �����2�� �������������� ����2��� �������������-����������������� ���-��������� ���� ���� � � ��������������� ������ �� ��������- ������;�2���3�<<�2�013�<�54*.����= ��� �� ���� ����������������������7��� � ��� ����-�����������8��� �����&>%?������� ������ ��-������������������������������ ���� �������������������� ����� ����8��������8������ ���������� ��� �������4*.����� ����� �������������������������������8������ � ��� �������������������4�:����,����������� ������ ��� ��������4*.� ������ ����������������� ������8������� ���������������������������� �� ����#$%#&'(���))0+������@ABC DEFEGHIJKLMNEIOPQEFKKKKK9 �� ������������������ ����������������������� ���� ��� ��������� ������� ���� ��� ����������������,������������������������������� �����������R(#S>$TUV>?&$�������� ��������� ������ ������� ��� ���W���������

Page 38: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������������� ���� ��������� ���������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� !!"#�������������� �������������� $%& $"#�� �������������������'����������������������� �����������(��)������������**+#��)���������������������'�,������������)����������������������)����-�+��.+#������������+��/+#�������'����������'��� ������,�����)��������� ����������������������������0�������������������������������� �������������&����������� ���1���,������������������������������������������������������������ �����-�������������������� �.+���(��)��2����������)��������������������'��������)�������������������������� �.+�������������������������������������������&����������� �����������,������� ���������� ��������������0���������������'��������)�����������)�������� $3#������'��4���������������� ����-����������������������������������������������������#�������������)��������� �,���������������������� �.+���������)�����-�������������������� �.+������������,������������ ����������(��)������������**+#����5�������)����� ��������6����������'������������������ �����-�������������������� �.+���������������������&����������� �����������,������� ���������� ���������������������7�������������������������������������������'������������������&4���� ����� ���������������������8�)����!������������������������� ���������� ����9��:;�<=>;?���������������5������� ������������������ �)���������������������������&����������� �������������)�������������������������� $%& $"����'����������������0������������4#������������������������������������� �����)����������������������������������������������������������@AB/#������������������������������������������'���#����)��������)��������������������������������)�����CC8D#����0��������������������� ������ ������-������������

Page 39: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������� ����������������������������������������������� ������������������������������������������� �������������������������������!!"#����$%&������� ����������������������������������� �'������(�������� ������$ �������������)������������������������������ ��������$$$$��������� ���������*��������������������������� �'���������������� ����� �*� (�������������'���������������� �'����� �+,-./01112111345678018.90/,:958,;,541</5:1=>[email protected]:545:0/1L078;1H9,4MJN�� ������������������������� �����������������������������������$������������������������� ���������� �����O ����������*���� ���O�������������P����������O������ ���(�������)��������������������������� ������������P��������� �����������������������������������Q���������� (P��������� ����������������������������O� ��(������������������������������� �������� (P����������������

Page 40: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ����������� ����������������� ���� ���� ��������������������� �!�"��#���$����% � ����� ���� ��&�'� (�����)� ����� �� &�������� �'*$+,��( ���������������� ����-+� ������'��)�����&�� ��%�./��+�%0#��1�/��+�%�������������&������������'��� &�������� �'��� ��#��$������������������)����'�� &������2����� �������&�� �./��0�� ��&� �� ��� ������ �-����3�� ������������ �'��� ��#��$�������+�%��)����� ������� &�)����������&�� 4� �� ������������ ���� �� ��(������� ��%�����%�'��� � �#��-�����)���� � ��%��� ������& &����������� �'��� ���'����������� ��� ������ �����&��%�������)����-�+-$1�� ���#���$� �� ���&�%�����������'��5 ���������& � ���� ��� �� ���� �'� � �� ������ �/��+�%��� �� &��� �������)�������� ���� ���� #��6��� ��� �/��+�%�������� &����� �-+� ������������&��� �� �� ������� �4�� ���)��������� ������ �'��� ���������������� ���� ������� (% #�$���( ���� ���������� �% ���� �% � �������� ���� ���� ������� �� &�������'*$+7�.80�( ��������������� ���3+� ������/��+�%���������������� ��%�������������� ��������%��� �� ��(������� ��%#�������& �������)9 ������9��������&����' ������� ������ &����&������� ����� ���� ���� #��$����&��������������������� &�)�� &�� �������( �����)�����%���)���������� ������%�����.1:30#��1������� ����& ������������&� ��� � �' ����� &�������'� ��� �-+� �������3+� �������&�-��/��+�%�'��� �������& � ���� ��� � �� �������� �/��+�%����'��� ���������)#���;

Page 41: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����� ��������������� ��������������� ����� ����� ������������� !"#$%�&'()!$($(*�)+,�*,(,�-'.�'&)!#,.$&�,(' !",�-.'#�/0123045455678394:2;27�<!"�!�*,(,.'="�*$-)�-.'#�>.?�@$A!B�C!(&+' $�D>,�!.)#,()�'-�C!)+' '*BE�F+$'�G)!),�H($I,."$)BE�J' =#�="E�F+$'E�HG�K?���+,�.,"= )$(*�� !"#$%�&'%,"�-'.�!��.'),$(�<$)+�!(�L�),.#$(! �+$"�)!*E�-' '<,%��B�!� $(M,.�&'()!$($(*�!�)+.'#�$(�& ,!I!*,�"$),?����NO854PQ�").!$(�RS��T =,�<!"�=",%�-'.��.'�!*!)$'(�'-�)+,�� !"#$%�!(%�").!$(�TS��D>�UK�<!"�=",%�-'.�,V�.,""$'(�'-�)+,��.'),$(?����������� W�X����� Y��S=.$!��.')+�DSTK�<!"��.,�!.,%�="$(*��Z�D[\]K�).B�)'(,E��!&),.$' '*$&! �*.!%,E�?�Z�B,!")�,V).!&)�DT$'"+'��J!(!%!E�_(&?K�!(%��Z�L!J �D�?J?G?�*.!%,E�$"+,.�G&$,()$-$&K�%$""' I,%�$(�%$")$ ,%�<!),.�D%a�FK�!(%�!%A="),%�)'��a�b?�="$(*�L!Fa?��ST�� !),"�<,.,��.,�!.,%�="$(*��?�Z�D[\]K�!*!.�D),&+($&! �*.!%,E�FV'$%�S)%?K�%$""' I,%�$(�ST?��T')+�ST�#,%$=#�!(%�!*!.�#$V)=.,�-'.�)+,�� !),"�<,.,�"),.$ $c,%�="$(*�)+,� $d=$%�U�&B& ,��.'*.!#�$(�)+,�!=)'& !I,�D�#"&'e�J,()=.B�f�G@����G&$,()$-$&�C.,I!&==#�G),.$ $c,.K?���-),.�"),.$ $c!)$'(E�)+,�"' =)$'(�'-�ST�!(%�!*!.�-'.�)+,�� !),"�<!"�&'' ,%�="$(*�!�<!),.��!)+�!)��U�gJh�!#�$&$ $(�<!"�)+,(�!%%,%�)'�!�-$(! �&'(&,().!)$'(�'-�� �i*j#S?���+$"�"' =)$'(�<!"��'=.,%�$()'�C,).$�� !),"�(,V)�)'�!�- !#,�="$(*�"),.$ ,�),&+($d=,"?��C !),"�<,.,�! '<,%�)'�"' $%$-B�!(%�)+,(�")'.,%�!)���gJ?����B�$&! BE�!�� �#*j#S�")'&M�"' =)$'(�'-�!#�$&$ $(�<!"��.,�!.,%�$(�"),.$ ,�%a�FE�"),.$ $c,%��B�-$ ).!)$'(�="$(*�!�?���i#�L! *,(,�"B.$(*,�-$ ),.�!(%�")'.,%�!)����gJ?�

Page 42: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������� ���� ���� ����������������������������������� !"#$%�&'�()*+,-����.'(/&�01�21�1����1�34���503����6�����51�(�7�����*89�����(::�7'�����;1��1���1��5���1�1���51��������<:����0�1�=������21��34���>:��15����;1����;�5?������<��@A�2��1��3��;B��C�1���1�'&��1��0��)(::�7'-�2������1�������;1�51����21�1�6��2�����,D�@A=���E���������(BE�;�0��B���;1�=��E�7'����50��0�1�21�1�����1�����'&��6���5��������6�:B(��6F�'�����5�����B��G���1��21�1���503��1���H1���6;�����,D�@AB���;1������2��6�������6=�����1��21�1�5;15?1������5�����1����������1�����<�@AB����I� JK���L�MNO�PQ��R�� �G�������*89�2���1S���5�1�������(:��'��������H1���6;��50��0�1�0���6��;1�T�U���V�W$XY!Z�����1���*89�G0����5������C4��1�������G���16�B���;1������5����������0������0�1�������;1���������*89�1S���5�����21�1����H��1��2��;��;1��4��1�B��[�51��;1�*89�1S���5�����2���5����1�1�=��;1�*89�2�������1�������1���1��������1��2��1�����/�:�@AB���;1�*89�5��51���������2����1�1����1��34�\]��3���3��51����0���6����[*��:����(�5���1����������E:�76F�'������03�1�������1��*89B��*89��0���4�2���5�����1�1�����31��1�����3�1�2;1���;1�������[*��:F�:�2����3�H1�(BD�)C��3���?!_!a$ =�(>>-B����b� cP����R�� �Pde�P�L�fP��� ��g1����5�����1�U4�1���0�5;��1�������h1��1�����'��1�C5�1�51=�G���16�=����812�+�6�����&��'�3��21�1�0�1����������1�1����0����1�=���5�0���6��;1�H1����5������������1/���15�1���0��61�1���B��*89�)i:BE�76-�2�����61��1�������������H��0�1�����:�7'�2��;�(�7'�)(:�0����-�����1����5�����1�U4�1�������7'��������������1�30��1�����H��1��34��;1��0����1��

Page 43: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������������� ��������������������������������������������� �!"#� �$%�� �$�%� �$�%�� �!%&� ����'%(���)*+, -./01234.3543536701891032:24;<�����<���������=��������>�����������=������������?@;�AB�C���DE#FE�GH ��IJIK���L�����M�<�� �N�O�<����<�����>��>��<����A� P�Q��������K����������R������ON��S��T��;U�C����� �VN��P������AQ�����=� �� ����K ��N��P����������AUP?�PK �������P�U?�;�AL��D�Q�������DK��=��J�N �C������<����������������������>R����;�������<�����>��������R�� ���������C�������>�������������������������W<X�S�������<���>�����>����������������B�=����>���������������<�����W�����YT�C���X���<�������<�����AZ����<K��������������>�������U�����=��������>����������������T��;U�C�������IN[�NN�\��������������<�����������������������������<�� �==��T���������������Q����>����R�������������<��]\[�����������A;�=����������L�������� L �K�����������������������D��������>��S�C��A_K�?@;�A%&a�Xb(c"���K�=�������������L�������S����B���������)*d, e:73fg:03673g4hi7/.3j32:24B��[����������<�������>����������������<����k��D ��<�������������B�<����AS�l��� � ; �]B;K���m��<������������>��������<������������������C�����k��D ��<��B��[?�������P�<�������n��A����������P���K���m��<������������>�������������������ZS �=��������C��Q�� ��=�AP����� �k K���������=����������ON�W���������������m����������������������������<�����������>������������C���������<�m?�YN �������<���m?�YN������������=����������W<X�S�������<�����������

Page 44: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������� ������������������������������������������������������������������������������� ����������� !"#$ $$$$$$$$$$%&$$'( )!"�*(+!� ,+#$-&$ .+#�/ *� !"$0"123+#$$$4��5678���99999999999999::;;<<:<<=>;:==:=:;===<;=:;;::==:;::9?@AB�C��5�7D���99999999999999::;;<<:<<=:;:EFG=:;===<;=:;;::==:;::9?@AB�H�I5J7C�K�99999999:=:;;=::;;<<:<EG:;:=<:=:;===<;;:;;::==:;::9?@AB�H�I5L7C���99999999:=:;;=::;;<G:<=::;:=<:=:;===<;=:;;::==:;::9?@AB�CCCC� ::=:;;;=:=:;;=::;;<G:<G:FGFFG:=:;===<;=:;;::==:;::9?A@BB�$M�N(+$$O$$$'( )!"�*(+!� ,+#$�#+,$P!/$Q �+R, /+*�+,$����)+"+# #S$T�����������������������������K������������������������������������������������������������������������ �����������������K���������������U���������� ���������������I����������K��U��������������H���C�KV�8WX�DI������6YY�U����CKK���������I����� �����������������Z����������������LY�����U�����������������������YY�����U�����������������[\C��YY�] ��\�8���Z�Z�_a���UU���������������DTb�����L��������U�_a�[\C�K��I��������c���������4�U��D��������������U�����d�������U�YY�]4����������� ������_a������������U��������������������������������K�����L�eW ��������5��������������K�������������������I��������� �$M�N(+$$-$$$f2*(+#$�",$�+3g+/���/+#$P!/$�h+$# �+R, /+*�+,$3���)+"+# #S$� Q�+g$ M+3g+/���/+$ M 3+$ i�3N+/$!P$*2*(+#$j" � �($,+"���/�� !"$ �L�eW� L����� �k+"���/�� !"$ �L�eW� Y L����� J�l""+�( ")$ Lb�eW� Y�����0m�+"# !"$ 6��eW� b�����

Page 45: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������������ �������������������������� ���������������� � ���!����"#�� #��$��������������%&�'()��*����������+(,�����#���������� ���� ��� ���-!�./����01234562#� ���� ��#����)��*����� ���� ��� ����#��������������������#��7��� ���#��� ��)%)����8��#��� �������������#��� �� �#������ �����8�������� ����7���#� �� � ��9� !�!/:������� � �������� ��#���� ������� ��#� #� ����� ��������;�< !)��(�������������� ��8�� ������ ����=���� #�7��������9��� :�%&�'()��+�� ����������>��#������ ������?�@�A�B5CD2�� �����������+�����#��� �"���� ����#��� ��)E$)�����FGHI JKLMNOPQRSTQUVWMXYZUXOVWQOWQ[\]_FabcQdeUXVYQQ� ������������#� ������ ��f*.�E7�8�#��������f*.9�7�g$����#��#���������h�� #������� #���������(.��� � ��i��.*������������ 7� �#��8�������)���FGHGjI kKVWOWlQLWPQJkmQ*����#� ���#�� ������� ��� ��f*.�E7�8�#������� �������7������ �����#�� ���#��� ��+(,$���� ����������� �#��������� �*7���E)��*�����>���� � ������������#����� �����������h�� #�������������#��� ������������������� ����#=��� �:����#������� �������������� �� ������� ���8�#���)�,�����#��� �� @� �� nKOlVWZUKeVXOPeM�B36�� oo(�o((�(�*o*(��*��*��(*o�*o�pq3�� ((oo�*(o�o(*(*******��o**�*�o��*o�Q]LKeQQrQQQnKOlVWZUKeVXOPeQsVYQJkmGQ,�����#��� �� @� ��#��������� ���� �)�

Page 46: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ����������� ����������������������������������������������������� ���������������������� ������� !�"����������������#$%���������&����� !��������' ���&�����������(��� ����������)*������� !�+�&�����������������������������&�����,��-.*����"�����&��+&����� �������&�� �&������'���&��&��������./*��01234500600078945:02;<0=5>?5@2=A@5:0BC@0D7EF0� �����./��������+�&����&���+�������&�����GHI�J��+�K�������L�)�"M�����NOGI�J��� �P�� ���&�)���#�����&M����Q�R.�����������*���������&���&� ���&�+����&��������"'������&�����������������&&�J#������*SM*������K�T��"JUM�J������&������ ���(����M�+�&����&���+�������&����VGWI�����NOGI����Q�R.�����������*���������*���)����.I���J�������&������X��������&����&������ ���M�+�&�������������K�T��"JUM����&��� ������������"������������������ ���&����Q�R.*���������&���&� ���&�+��������&��������"'������&�����������������&&�J#������*SM*�������Y=5?0 15>?5@2=A@50 1Z>50 [A>35@0CB098945:0\;Z=Z240<5;2=A@2=ZC;0 ,��-.� �� �� ��]5;2=A@2=ZC;0 ,��-.� �*�� �� ���;;524Z;_0 �%�-.� �*�� ��a=5;:ZC;0 Q��-.� %� ��bZ;2405a=5;:ZC;0 Q��-.� ��� �� ��

Page 47: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ���� ������������ ������������� !"#�$ � �%&�'�' (���)������)# �� *#�&#'!��"+ �%+ !)*��� , -���."&� �� "+)(�/0 $# 123425678��99�:��#��)('�' (�;1���<�=�&*�>)1. ���)&%�/?+ �'#"�1��!(�0').+ �'#"�1�� %��"� !"��"�?)!.)�('��@!'A �#'"1:<����" ��"+ � * ."�)%+)� #'#�$�#�.)�%* " 8�"+ �( #'� (���������� !"#�$ � � B.'# (���)��"+ �� *��!(�%*�. (�'!��<C��'.�). !"�'�&� �"&; <��D+ !8�CEE�F*�)��%+ !)*�$�#��(( (��!(�A)�" B (�A'�)�)&#*1<��D&; #�$ � �'!.&;�" (��"�-GE�H?��)���E��'!&" #8��)**)$ (�;1���$�" ��;�"+�'!.&;�"')!��"��I�H?��)���E��'!&" #<��D+ �A)�" B'!�8��� ,'!���!(�"+�$'!��%�). (&� #�$ � �� % �" (���# .)!(�"'� <��� B"8�JEE�F*�#" �'* �(KJL��!(�JE�F*��M���L�.�/N)('&���. "�" :��"�%K�C<J�$�#��(( (�")�"+ �"&; ��!(�A)�" B (8��)**)$ (�;1���. !"�'�&��"')!��"��O8EEE�B�P8��)��C��'!&" #��"�O�H?<��D+ ��Q& )&#�#)*&"')!�$�#�"��!#� �� (�'!")���! $��'.�). !"�'�&� �"&; <��=+ !)*�$�#��(( (�/CEE�F*:8�A)�" B (��!(�. !"�'�&� (��#�; �)� ��!(�"��!#� �� (�'!")��!)"+ ��"&; 8�"+'#�#" %�$�#�� % �" (�"$'. <��D+ !8�CEE�F*�)�� "+ ��$�#��(( (8�A)�" B8�. !"�'�&� (��!(�"+ �")%�*�1 ��$�#�('#.��( (8�"+'#�%�). (&� �$�#�% ��)�� (���# .)!(�"'� <��D+ !8�"+ �����$�#�%� .'%'"�" (�;1��(('!��"$)�A)*&� �)��99R� "+�!)*�/S"LK:��!(�#")�'!���"�-GE�H?��)���"�* �#"�)! �+)&�8��!(�� .)A � (�;1�. !"�'�&��"')!<��D+ �% ** "�$�#�$�#+ (�&#'!��GER�S"LK��!(�"+ �#��%* �$�#�( #'..�" (��)���E��'!&" #<��D+ �% ** "�$�#�"+ !�� #&#% !( (�'!�JE�F*�#" �'* �(KJL<�����T� U�� ����=?V�%�)(&."#�('� #" (�$'"+�WXYZ��!(�[5XZ�$ � �'!# �" (�'!")�%SD-CJ;/\:�('� #" (�$'"+�]XZ��!(�[5XZ<���%%�)B'��" *18�JEE�!��)��"+ �'!# �"��!(��EE�!��)������A .")��$ � �*'��" (�'!��_�*'��# �;&�� ��.)!"�'!'!����&!'"�)��DO�����*'��# �/ �� !"�#�a'� �N.' !. #:�

Page 48: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ ��������������������������������������������� �������������������������������������������������� !"���������������������������� � �#$%& '()*(+,-+./01/234/567���8�������������������������9�"���:;��<�� �=�������>�?�����@ ��������8�����������������������������������A�������567�����������"�7:����� ���������������������������������9���������������������������������������������8�����������A��A��9�����������>�������������9��������������������������������������� �#$BC& DEF,(G0E/HI0,J/K��!�9A��������������567�������������������������� !"������A���������������L����������������������������A�����=�"�������A������A����@�������������������������M�N� ��O������������������8��>���������9������������������������������ ������������"������ ���P�����A����� ���������������������������������������M�N����������Q������������������L��A� ��R��������������������������� !��������"���AA���������������A����� ����������������������������������R5S����������������������� S>�=�AA��������9��������@ ��T9���������Q�������A��A������9��������M��������������������L������� U ���������"P�9�����=7 � : ������>�V������:���������@ ��T9���������Q�����������������!W����������������9����������� �����#$BB& XG(YZGZI-0+/01/,0[Y(I(+I/,(EEH/�"�A����>�����������A�����>�����������Q�����������9���������Q�����������"�� =5\�@������ !"�� �]������������������������M���>���������� ��O������������

Page 49: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ ����������������������������������������������� ����������� �������������������������� ������� ������� ��������� ����������� �����������������������������!!�������������������������������"�������������������������������#$�%!���������!�&�'!����������������������������"������������ ���(!��������������������������� �������!!!�����)*+'�!,� ���(������������-������� ����'�������.���"��������������������������������� ����������������������������������������������(!!����/ ����)���������������'����������-���,������������������������ ��������!!!�����)*+'�!,� �������������-�������������������������������������������������������������������/ �������������"�����������������������������"������������ ������������������������������������������ ��������������"��������������������������������������0����������������������������������1����� ��!2� ��������(��������������&������� ��3�#�)�������������������������������������������.����������'����������-���,���+����4���������!!�5����������� ���������������������������������� ������������������"����������� ������-���������� ������� ������� ������"�������� �����������4�����������������'1!�������������������������"������� ����$���6���*������������������� ���� �������� �7897:;<�)(%�%,=�$� ���7897:;<�)(%�%,=����������"�� 7897:;<�)(%�-,��>?@>A BCDEFGHIFJKCFLLGDHI6�������$M+���������� �����������N<7OP;Q����()$R�,������������������������������������������)�����������,���������4�������� ��������������������������������������������(!!����� �����������������������������-!!�5 S��������������������������� ����������� ������������������������������ ������� ������� �(!����� ������� ����������������������������(�����������������������-!!�5 S����������������

Page 50: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����������������������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������� ���!�!"���� ���!"�������#$%&'(�!������������)�*�!������$�����&������!�������������������+,������������������ ���������������������������������������-�������"��������� �������������!��#./0+�(�������������������1����&��������!�����������������0+������������������������23456 789:;<=>?@8<A<BC:<9=>&��������!��������������!���������D���E������������/�#+��� �FG%G*������� �H����D��� �����I����D�� �� ���������������!F����(�������� ������ ����H���$�#J������ ������(���������� ���JH���/�#)�*�!������$��(���&������!��������������������� ��)�������������+������"����������������&����������������������������D������������ �������������������������������������� �!��������&����"��������������� �����D�������!��#./0D�(������������������������&�����!����������!!��������D���E�H�0H&/�#������0�����������������������K� ��(������ �!�"�������!��-����"��L����������������������/���/���������� �������������������-���������������/�������� �+��� �����I��������!����������������������������)�#+��� �FG%G*������� �H����+���� �����I����D�� �� ���������������!F����(���G�I"������"����-������������������"I���-���� ��� �����+��0-��������& G��������#���� �&�����D�� �� ����������������D�� �G�&/���!F����(���M�������������� ��!��������������������!����"������!������%����"����������������"�*�*0%/'G����������������+N�O+���#�����-��D�������������������!����(���%������������������������������!����!���������N�P����������������

Page 51: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������� ���� ������������������������ �!��"#�$�%�� ������&'(��� #)*������%�+(� ��,-����!#).�,�.)�$�%����)�/0��$$)�1�&23456��78�� ��,-������)��� �!��!���%�� ����&6��$0�%9':1�;�4�<0�46��=�7�� �9>)�!9�;6?1��'��<0��4(��,�.)�$�%�@A� 1�&'6��<0�&4(����1�'��<0�&4(����1���<0�7�=��6��78���� #)*������)�,#������%�&63�$0�%9':1�&6'��$0�&6��=�7�� �9>)�!9�?6?1�'�$0��4(��,�.)�$�%�@A� 1�'��<0�&4(����1��4�<0�&4(����1���<0�7�=���/A�#�B�%56���� �#,-� #)���#��#"��4(��,�.)�$�%�@A� ��� �!��!���%�� ����'26'(�#"��,�.)�$�%��/�)�,��#!8#�� � ����%�1�A�# 8#!�>���%�1�C�,65���%�46?(�#"�DEDE�F� �$��8.)�����,�.)�$�%��/�)�,��#!8#�� � ����%�1�A�#�B�%5�78��A�#�B�%�=�����B:7��DG�7������)�,��#!8#�� � � . ��$��� �� �$F)�%�� �%� ,��F�%�F.�$���"�,�����E ��� ���,��#� 6����#����� �$!)� ������%�)���%�&H&�/IJI5���� �$!)��)#�%����F�""���/&'6��$=�7�� �9>)1�!9�;6?1�'(��).,��#)1�+(����1�&(�'�K�$��,�!�#��8��#)1�46&(�F�#$#!8��#)�F)��56����$!)� ������F#�)�%�"#��&�$������!��#���#�)#�%���6����)��)�,��#!8#�� � ��� �,�����%�#������'44�L����&M��)�,��#%����������F�""���/46�(�7�� 1�&6++(��).,���1�46&(��������!9�?6�56���)�,��#!8#�� � ��� � �#!!�%��8����8��F�#$#!8��#)�F)������,-����%.��$������%�#""��8���� #)*������)6��78��A�#�B�%�)#��������$#)�,�)�������8��!�#�����F��% �/!8# !8#�.)� ��F�23+44���1� ���$��)F�$���;;'44���1�#*�)F�$���+�444���1�,��F#��,���8.%�� ���&444���1���.! �����8�F��#��'&�44���1�). #N.$��&++44���5������� �%��#�� ��$�����8��$#)�,�)�������8� �#"�!�#���� �����8�� �$!)� 6��78����)��� � �����%����8�����A)��7=���#���������������#)���#��/O��$���� �0�"���,���� 5�� �����8��"� �� ��������!�#�#,#)6��78����)��� �"�� ���� 8�%����8�&44�$0�%9':���%�$�,�#��*�%�"#����$�����P��8� �!�#,�%������ ���!����%��8������$� ����8�+�$����� ������*�)�F��������� 8� 6��78��1�'4�$0�#"� ����� #)���#���� ��%%�%���%��8����)��� �

Page 52: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������������� ������ �������� ������������������������������ ���� ������� ������������������������������������������ !"#$%&'(%)*+,%,'-� ��������������������� �� �����������./�����/�������0�12�����������������3� ���� ����������� ��������4������.��������5�������/������.���6��0�� ��78�8�������������9�������� ������������������� ��� ��:�;<������=����������� �>� <�������5�.�������. ������� ������������������ ������7�?�@<5�����0�12���>�� ������A�������.���������������� � ����/������������������B� C$#$!D%&)#%"&'"E'F!"#$%&'G"&G$&#!)#%"&'-� ����� ������� ���������������� ������.� �.��������:�����5����H����� �� ������������������������./�����@H-�IJ������6���=KLL����H=��/� ��L���3.�L=� �=���9����������-� �-�����==������ ���5����H����� �� ������������������������0�����?37�37�� ����������3�/=��=� ��������M� NOPQRQSTU'D),,',F$G#!",G"F+'V��������� � ���� ��������.������� ������=��� ����./�@IW3X35�Y������=���� ���/���I�=�������������/Z����������8��?�� ���.����. ����6Y��;��>� ����;�9A����������������� ��������� ������� � ��8�[?���8�\����� �������������\�� �����������5�����������]���� ���� ������������ �� ��������������������� ���5����������� �������������������� �������������?���/H�� �������6����� �0��A�����A�?��� ������9����?�����=���� ���������/���������

Page 53: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������������� ������������������������������������������������������������������������������������������� !"# $%&'()*+',+-.%+/012-)3+4��5�������������6�� �� ���5���������7��5����6����������6�� �� �������������������������� �� ��������������8 �������9:�7���� ������6������;���������<==�>?�@���;������AB=����C���D�A=����C�E7@FBD�A�G����H7E@FBD�E������H���D����E=�>?����I;����6�������������5G=�J�����@;��������������6������;����6�� �� �������A�;�������� ��������������A�>������������������G� �;��������A<�J��6������� ���@�������6�������������������<=�KL���;���������������;�����������M����������;����������������E�A�����������B� �;�������������D�� ����������6���������� ��;� ���A��?�C�5C8��� ���������� �����;����I;��������6�� �;���������8 ��D���������6�������M��������� ����������E==5���;�������8�:���@���������������������6�����������D������6���������������������G<N�������;���;��������������������B�J����� !O# PQ-0(0-R+)11)R+:����������������6������������������������ �����;���������@:@����EB=����;�������S������������A��S5��������������� ������������������6������������������A�=����I;���M��;�������7�����������������������;�����������;��������������<=����7:@:���T�� ��D�A�����������;���������D��7���<D���������6�� �E�C�HF7���:�� ����������������A��?����������;��������A����E5@9��������������������6���������������� ����������������������8 �����;��������M�������� �����������6�����������������������D����;����������������������6�� ������U��������=�A�� ������������������������;���������

Page 54: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������������� ������������������������������������ ������� �������������������� ��� ����������������������������� ������������������� ���!����"#$"%&'��())�*����+��,�-��. ��������/0/12 3456789578:4;<=84>;=:?8<@;ABC6DE:C57B;���� �F�� ���� �� ��G�,�� ���������� ����!H��F��I����F�*����J,K����������������� ������G�LI���K� ������������� ������())M� ������ ��J,K���N�O�G��P����������������������������Q������� ��������� �������� �������� ����������� ��)�� �)�G�,�R�I�SG���J���������� ������ �������� ������(�O�T,���������������� �����U��LI�� �()M(G�� �������V� �������� ����������������� ������������Q��������� ����������������������������� ����������������������/0/W2 X45EY7865E;<E7C56B47C8Z<>578:4;����������� ����� ����������������������� �����������[��F����S������\]MU��������������������������� ������ �� ������������ ����������������������������(�)��]�����M\ �I �������������������������������������� ������������������� ��)�G��T���������������������� ���� �������� �� ��(��T,�!_U�)����]*����������������(�)���� �(�O�T,�!_)�UG����]*����������������((�M(�)������������������ ��� �������������� �����������������������������������K+HQJ������ ��UU���!�����F��()))*���[��������������������� ��������������������������������!����������� ������������ �*�� ���������� ��U�)O�!+��[��N������J��]��������-������ �������������������� �a��,[���������*���J������������ �����������

Page 55: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������������� ������������������������������������������������������������������������� ��! "#$%&'($)*#%+$,#-.)-/0%1$,-%,/2)3�456�7�������������������������������8���9������������������������������4���������������9����������������:������;< �=>?������������������@� ���A�>�����������������@< 4�< �������8�� � @���B���C�����������������4<@D��������������������������������������������������E8����������������F�������������� �G7����8��8����������H����������������8����������E8������������������������������I�D����9������� ���A������������ �����������������������@�����������������@�����������8������������9������������������;@ �����?���J8�����������������8������������C����������������������������:�������������8��������������8�����������������8��������8������������������������������8������:���������������������;9�������@�D�� K?��:�������������������������������������������8���L7MNOPJQ����4��������9�����������������������8����������������9�������������Q��F��F�7��������5��9����������>������9��������8���IAA��8�������������F���F�;>�����RSTRUVW��� �X�P8������RSTRUVW��� K?���N����������������������8���������9�������:7O�@�D �;���8����9���?���������E8������������8�����������7�::EN����8�N��������:���YX�������C�������@<D4�K ����;��9��RSTRUVW��@�<Z?��

Page 56: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������� ����� �������� ��� ����������������������������� �!�"�##� ���$%����������&��'��('��&�!��"��'��)*�!�&��#����+�,�����!��&��'��-.����$#�������������/����&���0�����'��������"���������������(���!�� �!�12�3)�����'����"������45��3)0�����'����!���!��������!��� �!��0+2�!�(���!6�$��� ���'�1���6���������('�����0+�3)�����!��!���7��%�!������!�������0���8��01�(��(�##� �!��!�����&��'��� ��'���2����!��(��0��8�����9:��#�;�����"��������������(��(�����������"��02��&<�:�����'�!�'����$�""��� �!��!��0�������=� >�?�@�? �� ����A�!����������#�;����('������&���'%�BAC:)D� �!��!������!���������#�&�����(�"���!��"��'���������0��C���������'��"�#���������E��������6�1�:��"��F+G�����1�:��"��HI�$�""��� ����"�#������������&�!!��0��J������E�+���FK�BLI�F��#�'(���D�&�#�"�#��������(�#���� �!�(����(����������MN�8����"���O�B8���!'����'�����$����('D�AC:)�!%!���0���'��J������E�+���(�#�����!������##%�!���������+�P���'���#0��+�P���'���#� �!� �!'������� ��'�� ��(�#����7�#���!�B2��:D��"��F+G�"�##� ���$%�� ��(�#����7�#���!��"��;��#�$�������$�""���B�HID������"#� �������"��02��#<���0��Q�����##%6�+���9:��"�!���#�� �!���R�(����������'��AC:)�!%!���S�"�##� ���$%��HI�$�""��6� ��'���"#� �������"��0����:<���� ��'������!!�����"�102��HC�0��8$!��$��(�� �!��������������+,���������+T����0��A��(����!� ��'���7�#�����"��0���:� ����(�##�(���0���'�!��E��������� �!����"�������������������������0��'��!�"� �����!������(�##�(���������#%U������� �!�VWQ)GKW��01+0����

Page 57: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������� ���� �������� ������������������� �!�� "#����$�%&'�(�!�)!"*� +��"�!)#"� �"���*#+*�������#�*�)!�+,� �"�!"-�#� "*�!��-�"�,#+�� �"��"��,�� #� �+��".-"#��"� /���%&��"�!)#"�"� !�("#"�-"#,+#�"*�)!�����������0#+���! #)�"� �$1�� �2"���+�+��3�&�� ��4�#5�#�3�673�8&7'�(� �� �"��"����+�-�# �"� !�#"�)�� "*� +�9:�;6/���� ��(�!���<)�#"*�����:�!"�+�*��� "#=��!�,+#�"="#��!��-�"������>"*/��0#+ "����+��"� #� �+��=�#�"*�,+#�"����!��-�"�"�) "*�,#+�� �"��"��,�� #� �+���+�)��/�?.-"#��"� !�("#"�-"#,+#�"*�5���#/�@/A/�B+#�5�� /����C� D���� E�E�FG��E�?�>��� ����� �=� ��+,� �"�+� ��"#���"�+��!"�$HI "#������J�!I ��3�6I "#��������*��+�J�!I ��'�("#"�".����"*�5���+�� +#���� �"�-#+*)� �+��+,�0?0�� �9�:���/��2�"������"�����5!+#5���"�(�!��+�� +#"*�,+#������) "3�5) �K)! � �"����"�#�-+# �+��+,� �"��)#="�(�!�"�-�+�"*�,+#�#� "�����)�� �+�/��7����!!��!�("#"�*+�"����*)-���� "/��2�"�5),,"#!�)!"*�,+#�L��" ��!�".-"#��"� !�("#"�"� �"#��::��@�J?0?&�+#�9M��@�@?&���*�9M��@�2#�!�� �-J�N/�/��4),,"#!�("#"�-�!!"*� �+)�� ���O:��%��+�)���+,���"�".��::�#"!���$4�+IP�*'/��&��-�"!�+,�"�+��!"�("#"���!+���"�� "*�)!���������%��+�)��/��0��! ����+� ���"#!�("#"�)!"*���! "�*�+,����!!�,+#�! +#��"�+,�5),,"#!����+#*"#� +�#"*)�"��+� ����� �+��5��*�=��"� ��� �+�!/��0��! ����+� ���"#!���*��)=" "!�("#"�!+�L"*����9:Q��� #������*�$R�!�"#�&��"� �,��'�,+#�� ��"�! �9��+)#!���*�#��!"*� �+#+)�����(� ��*J9S�-#�+#� +�)!"/��&"="#���! +�L��+��"� #� �+�!�$:/:�@3�:/�@3��@'�+,�@�$S7�'9���*�$���@3��:��@3��::�@3��@'�+,�@�6�9�("#"�-#"-�#"*/��?�>R� "#�$4�+!+, '�(�!�)!"*� +�,� � �"�L��" ���*� �� +� �"�@����"��!I@"� "��"<)� �+��+#� +� �"��+*�,�"*�!)5! #� "�����5� �+��"<)� �+�/�

Page 58: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ���������� ��������������������������������������������������������������������������������������� !�"�"��#$� !�%"�"�#$������"�"�#&'������������ �������(����������������"��#���������������"������'��)(���*������������������+�����������"��#�,������������(��"��(������"�����*�����-�� ��.������ ������"���������������������������������+���������(���������������������(��������*�����-� ��/(���� �����(�����������������$�012�����(�����������������(����������������������$�3�������(������� �������$�3������(����������� �������$�.�����(��"��(����������������.������(���(�������������'��)(������ �������$�,�������������������������(������������*�����-�� ��/(����4��!�����(����������������������������������������������'55�"�����'��

Page 59: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������� ���� ����� ������� ��� �������������� ���� �!�"���� ����#�$�%&'�(����)����"����"��(�*� !+���,-.�%&�/ "��&���� ������$/ "��&��%/��!"0'����12�3&0��-���� !�)���( ��#4�(� !�/567%� ��8*99���) ��������::��:� ����( ;���!�������0��%���:���� !�"�!"�!���� �!�)����::��< �����#��=�>/0��?����*� �!��9��!��@* � 8� *��� <�*����9�-5-7-A?�)���:��:���(�8#�( ����; !+�-5-� !�8*99���$/567%� �B�1��/�/!&�C'������9 !���"�!"�!���� �!��9�1��/0��%����"�*���"�!"�!���� �!��9�-5-�)���(����� !�(�8#�����*� !+� ����8���8�!"�����C�=�!�0��?�2�DE����:����9�"�!"�!�����(��"����� "��!������)����((�(����-5-B��!(������ <�*���)��� !"*8���(��;��! +��������F&0��?8���8�!"�����C�=�!��)�������*��(��+� !��!(�����"�!"�!���� �!��9�-5-7-A?�)���(����� !�(0��6��:������*� �!��!(�8*99���)����(�+����(�:� ���������( !+� !����������:���"�����!(� !G�"� �!��#� !+�0��%���9 ���� !G�"� �!�)���C�DE��9�-5-7-A?����*� �!B�9����)�(�8#�HI� !G�"� �!���9��DE0��%���(����)�����!��#4�(�) ���J� + !���9�)����$K�������:��!B�/���0'�*� !+������!��� �����(��0���

Page 60: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ���������� ������ ����������������������� ����������� �� ���� �!"#$%�&'#%�(!�%�"$�&#() *%�"+,(-, .�%� �. $"/+�(!�%0(� +(-'$ �,'#"'+%$1���� �,'#"'+%$�0 # �*�'#'*% #"2 .�"+�(#. #�%(�. % #3"+ �%� �$"/+"!"*'+* �(!�'+� 4%#'�%5#+�'%�%� � +.�(!�� -"4���(+�%� �. % #3"+'%"(+�(!�65'% #+'#7�$%#5*%5# �(!�(*%'3 #"*� +(-'$ 1�������� 8���9��������� ����������� � +(-'$ �/ + �!#(3�:;<=>?@ABAC<�'.�D +�&# ,"(5$-7�*-(+ .�"+%(�%� �35-%"&- �*-(+"+/�$"% �(!�&E�FG�D�, *%(#�D %0 +�%� �# $%#"*%"(+� +273 �*5%�$"% $�HIJKL�'+.�MNAL1���� �*(3&- % �&-'$3".�*(+%'"+"+/�%� �/ + �!(#�%� �(*%'3 #"*� +(-'$ �"$�*(3&($ .�(!�OPQR�D&S�0� # �%� �"+$ #%�"$�GRGT�D&�'+.�%� �, *%(#�"$��UUG�D&�"+�$"2 1����� �&#(% "+�*(. .�!(#�D7�%�"$�&-'$3".��'.�%0(�'3"+(�'*".$�."!! # +%�!#(3�%� �$ 65 +* �'%�%� �V'%"(+'-�W +% #�!(#�X"(% *�+(-(/7�L+!(#3'%"(+�YVWXLZ�[ ! # +* �\ 65 +* Z�V]TU_POP1G1���� �$ 65 +* $�."!! # .�'%�&($"%"(+$�GRQ�'+.�RUR1��]($"%"(+�RUR��'.�D +�*(## *% .�!#(3�/-7*"+ �Ya�%(�/-5%'3"*�'*".�YE�D7�b'#�'.�c'#D'$$"1���� �$ *(+.�'3"+(�'*".�$5D$%"%5%"(+�'%�&($"%"(+�GRQ�0'$�*(## *% .�!#(3�- 5*"+ �Yd�%(�&� +7-'-'+"+ �Yb�5$"+/�e5"fW�'+/ �$"% F."# *% .�35%'/ + $"$1��g-"/(+5*- (%". $�0 # �. $"/+ .�%(�"+%#(.5* �'�35%'%"(+�%�'%�0"--�*�'+/ �'+�'3"+(�'*".�'+.�"+$ #%�'�$"- +%�35%'%"(+�+ '#D7�%(�/ + #'% �'�# $%#"*%"(+�$"% �%(�". +%"!7�$5** $$!5-�,'#"'+%$1��]#"(#�%(�$"% F."# *% .�35%'/ + $"$S�%� �&E�FG�D�, *%(#�'+.�"+$ #%�*(+%'"+ .�(+ �:hIL�# $%#"*%"(+�$"% 1��i"%��%� �"+%#(.5*%"(+�(!�'�$ *(+.�# $%#"*%"(+�$"% �!(#�:hILS�."/ $%"(+�!#'/3 +%$�(!�GPG_�D&�

Page 61: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������������������� ������ �� ��������� ����� ����������� ������������ ���������� ��������������� ��� ������������������ ����� �������������� � ������������� �� ������ ������������ !�� !"���������������##$%� ���&'(���(���� ������������)���������������&���*������������������������������� !+�������� ��������� ��������������)���������������� ���� ���,��� ��� ����� � ������������������� ��� ������������������ ������ ��������� ������� ��-./0��� ��� �����1����� ��� ���$��� �����������2%3� !"����������� �������2(3�� �� ������ ���������-./0��� ��� ������ ���,���������� � ������������ ����������������������2#3� !4� ������� ��������2&3����� ���� ������� ��-./0��� ��� ���$��������������� !��2#3������ � �� ���������2�3�� �� ������������ ������� ��-./0��� ��� ����,�������������� ���� ����������� ����������5������ �������������� !�� !"���������� ���������������2�3���,���������� � ��������� ������������������������������� ���������� �������� ���� ����� ������� ���� ��� ������ �����-/.00���,���6,� ����� ���� �� ������ ������� �������-/.00��� ��� ������ 7� ����������� ������� ���� ����)������������ �����������&%������������������������������ �����8+!������$����� ������� �� �� ������������ ��-./0�����(���00��� ��� �����1����� ��� ������ ������������� ����� ���� ����������$����� �������������������� �� ����������&%������ �����-./0����� ���&'(������� �����-/.00����� ������������� �����9��� ��-./0��� ������ ��������� �� ���&'(������� � �������� ������������������� ���� ��-./0��� ����������� ��������������������������&%������������������������������ ������!���

Page 62: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������� ��������������������������������������������� �� �!�"#��$$%&��"�'��('�� &'��)�*+�,�$-.�#/'�" -�*012�/$"&3�-&�&(�4��('�5678��'&���9��� �&��')�:+�****�/$"&3�-�&(�4&��("���('� '4�9%��&��'�;���57688�4�$$�$� '"��<'��('�9��9%$"��/$"&3�-)�� �������=�������� >?@�������������� ���A�������������A�����������������������������������������1" '�BC�1"3D-"�EF+�0G*�-�!'&�'-�4��(�H6IJ8�" -�KLMN888�3"�O'�P�1" '�QC����!� "$�/$"&3�-�% 9%�P�1" '�RC����!� "$�/$"&3�-�-�!'&�'-�4��(�5678P�1" '��C�1BRST�E �4�4�$-.�#/'+�-�!'&�'-�4��(�5678P�1" '�UC�GBRV2�-�!'&�'-�4��(�5678�E;��&��3%�"��� ����9�'"�'�*012+P�1" '��C�WBRU0�-�!'&�'-�4��(�5678P�1" '�SC�WBRU*�-�!'&�'-�4��(�5678P�1" '�VC�****�X"��" ��-�!'&�'-�4��(�57688)������

Page 63: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� ���� � ��� ����������������� !�"��� #"���!�#��$ ������%&���'"(����$��)�!��$"�*�&�!��"!�$�� !�����$" �+,-./012�3456%789*�# ���"�$"�#����:�������! "��$��&�!���;�!�������$����!)��"����## !��$<�" �"����! #��=!�����#!�>����$���#"� $�5:65:�������! "��$���;�!������# $"��$���%��;�*�?;@��'"�<:��A=!���#�"� $��! ��"���#!=����;"!�#"�&����#���)���=��$<���B�'B�C�%D��<�$*�#�! ��" <!���(�# �=�$�������#!�>����$���#"� $�5:69:��B�C� ##=������ =!� ��"�����;���<�$��>�$��$<���"����$�"���# !��$�"� $�����!�� ��"���$�#E���� $F����)�$<�"& ���"����!���" ��$"�!�#"�&�"��"���?;@��'"�<:�����������G ���# $#�$"!�"� $�&����$#!�������$� !��!�" ���="��"�������!����! "��$:��H�$#��"���?;@��'"�<��! "��$��#�$�$ �� $<�!�# ���"���<��$�"������G ���� !�"���>�$��$<���"�� ��"���B�'B�C�!���$F��! "��$��&����>����="��:��8�="� $��!�#"� $��# $"��$�$<��! "��$�&�!��� $�" !���>(�"���!��>� !�"� $��"�5IJ�$�:��K�<=!���65F�6�F��$��6?��� &���#��!�#"�!��"�#���="� $��! ������ !�&���'"(��F�C74H��$��CCCC��! "��$��!����#"�)��(:��������<=!����� &�"& ������!�$"��� "�F�&��!�� $��('�;������"����>� !>�$#���"�5IJ�$���$��"�����# $��('�;������"����$G(��"�#��#"�)�"(� ����#���!�#"� $�# ���#"��:��C���;��#"��F�"���<!��"�!�"����>� !>�$#���"�5IJ�$�F�"���<!��"�!�"����#"�)�"(�%LM75�JN��$N�4*:��������="� $��! ������� !�����"�!����! "��$��&�!��!���"�)��(�������!:�K�<=!���69F�6O��$��6���� &��$�H7H'ACP8� ��"����!�#"� $��&�"��<!��"��"��>� !>�$#���"�5IJ�$��� !�&���'"(��F�C74H��$��CCCC��! "��$�:��8�#���!�#"� $�&������! ;���"��(�Q��4��$�) �=��F��$�� $�(�"����!�#"� $��&�"��"�����<���"��>� !>�$#�F��#"�)�"(F��$���=!�"(� >��!)���>(�H7H'ACP8��$��!�"� � ��C>�5IJN5?J�R�6:��&�!��� ����" <�"��!:���(��#���(F��> ="�IJ'6JJ��<� ���! "��$�&��� >"��$����! ����6�4�#=�"=!��� !�"���&���'"(��� #"���!�#��$ ����:��

Page 64: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������� ���� � � � � � � � �� �� ������������ ������� �������������� ��������� ������������������������������ �� ������������������������������������ �!"#$%&'()'''*+$,"-.'/%-0"+&'-0'1"+23,4/&'&.-+56&'0%-7',8&'9"39:;'<-+$7.=''''�!"#$%&'(>'''?@?3A;B*'-0'/$%"0"<5,"-.'0%5<,"-.6'-0'1"+23,4/&'-<,57&%"<'&.-+56&='��C��D����EF���G����F�H�H�������I�G�FFJ��KF����D����������H���G����EF�H��L��I��J�

Page 65: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������� ���� � � � � � � � �� �� ������������ �������� ���������� ���� �������� !�������������������� �� ����������������������������������� ! �"#$%&'()*(((+,%-#./(0&.1#,'(.1(2345('/.,67'(1&.8(-9'(:#;:<2(=.,%8/>((((�"#$%&'()?(((535;@2A+(.1(0%&#1#=6-#./(1&6=-#./7(.1(2345('/.,67'>(��B �C����DE���F����E�G�G�������H�F�EEI��JE����C��������K����G���F����DE�G��L��H��I�

Page 66: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������� ���� � � � � � � � �� �� ������������ ���� �������������� ��������� !���!������������������ �� ������������������������������������ �"#$%&'()*(((+,%-#./(0&.1#,'(.1(-2'(3333(45&#5/-6( �"#$%&'()7(((898:;3<+(.1(0%&#1#=5-#./(.1(3333('/.,5>'6(��?��@����AB���C����B�D�D�������E�C�BBF��GB����@��������H����D���C����AB�D��I��E��F�

Page 67: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ���� ��������������������������������� !"��#�$%&'�()��$$$$�*(��()!+������()(�",���-"�.'/ 0 �12�3(++�+��4!�53�!�"6������35��4��(�����7�!+������4(�4��(!����+�)7�!���.89$'"�+��*�����!��!���:53��!���/;<��!55��=�!!�>;;4(6�8�(+"65�7;!55�+;��?!55�6�!3�@6���(-���A�+�5�+�!���4(�4��(!���35��4��(��3(++�+�()��!����8����3�)!(��35��4��(��3(++�+�5������ !"���54!(3���4��)5�(+��()��*(��()!+6�������B�CD���E���F������ �G�H����D�ID��J�� J�H���K������ �D��D��ID����������G�H��L�DJM���N�OPQR�� J�OOOO������������� ����� 2�7�����S�+�5�+�!���3(++�+��4!�(���53����� !"��#�$%&'�()��$$$$���5!��)+�7�)��(!���-"�!���<(++&")8�+5�!�(��6��'�)4��!���35��4��(��3(++�+�5��!���4(�4��(!���()���8����3�)!(���(!(�(����)�755��(7���3�)!#��!�4()�-��45)4������!�(!�!���45���4!�3�!(!�5)+�������)!�5��4����)�!���$%&'�()��$$$$�*(��()!+6�����+���(!(�(�+5�45��5-5�(!���!���%T$�+�U��)4�)7���+��!+6�����R���D��� F�D�ID��J��D��ID��������VP�W��� XK������ �D��D��ID��������VP�W� P�GG��� ���VP�W�Y�DJM���� Z[\SS6�� Z[\SS6]� ]6��OPQR� Z[\[[6�� Z[\[[6]� ]6��OOOO� Z[[_6Z� Z[[�6[� �6��

Page 68: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������� ���� ��

Page 69: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������� �������� ������������������������������������������������ �!"#$�%�&'(')*+�$�,,�,-./0"#$.0"1���,0"2$.�0�3./#�42 �0.3�5�06�7�,,81�9�,#!05�".:�;<�=� 3'01-.�><�;?8��4�"���0�@<�;;;;�4�"���0:�� A���BC D������E�����������E����FE��������GF����HIG�J�)6.�-.-0�3.'K#�3�LM�/�"/2 �"�3�/6"#�/�,-./0"2$�#!�5� 3'01-.�#/0�$."�/�.�# �,.�5�,�/#$-�".3�5�06�06#,.�#!�06.�05#�4�"���0,:��N"#0.��,����,# 20�#��5.".�$#��0#".3����06.�"���.�#!�OPQ'RPQ��$:��=�4. .��06,�!"#$�OSQ�0#�R�Q��$�/#"".,-#�3�0#�06.�3�!!.".�/.�����K,#"-0�#��K.05..�� .!0���3�"��60'6��3.3�/�"/2 �" 1�-# �"�T.3� ��60�32.�0#�06.��$�3.'K#�3:��@?�,-./0"���".�,.�,�0�4.�0#�06.�,./#�3�"1�,0"2/02"� �/#�!#"$�0�#��#!�06.�-"#0.��U�,2/6��,�V'6. �/.,U�W',0"��3,U���3�W'02"�,U�56�/6�6�4.�3�,0��/0�4.�-�00."�,�X�/6$�3U�OSPS<:��+��2".�OS�,6#5,�06.�-.-0�3.'K#�3�,-./0"��#!�06.�5� 3'01-.�-"#0.�����3�K#06�4�"���0,:��

Page 70: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������� ����������������������������������� ������������������������������ ������������������������������������������������������������ �������� ���������������!� ������������������������"����#� �������$��%��� ��� ��� ��� �&� ���'(�)����$�����������% ��������*� #����"���(+,���� �-./0123453336278.92:;<=93>[email protected]@0AB139.@C1<.@3D72@81B3<E3F.A9:8G72H3IJKL3B=93IIIIM333 ,������"������������������������������� ��������������������(N'OPQ#RS�$Q������������ ���������� ��������������������������������!�� ������������TUU����� ����"����V�����V%���������W���� ���������������������������!�X������!������������������������YB;A233Z333L2@<=9B1G3D810@80123721@2=8B/2D392821[.=293F.8C3J\] _ abc3LB[7A2D3 d:C2A.@2D3 e:D8B=9D33 Y01=D33 >=<19212933a.A9:8G723 �&�f� ���f� ���f� ���f�IJKL3 ���f� ���f� �&�f� ���f�IIII3 ���f� �W�f� ���f� ���f�

Page 71: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ����� ����� �� �������������������������� ��!��!"����#��#��$������"��#�%�&'()*��#��''''+���"��,�#���"���-#��"�%�,���"���#�����#%.��/#0�,��������������"������#%���"��!�"��",���-%�#1��2�,3�4/5/*�$-���"������6�,3�7 58'��#��6�,3����3179��%��:!���#����#�*�����#�7.6;.�����%����#��#�"����#%���"��%��������$���-%�������!"������%��-"�������#��#�"����#����$��������������#�������#��#��%-$%�"���<��������"��$����"�=-�"�����"������!��,����������������������� ��!���#����"��#�%�!"����#%.��>����%��$%�"�������������������������'()*��%����"��%�����#%���"�$������#���,!�"�������������� ��!���#0�,�.������������������''''����"��%������#�,�"�����#�������������'()*�!"����#.���������"�1��%!��������������������������� ��!��!"����#���%�����-���������$��72?.@�AB(7C2D,�#D,1.��'()*�������������"��%���$����E���,!�"�������������� ��!�<��������%!�������������������;C.��AB(7C2D,�#D,1.����������������������''''���"��#����%�����-���������$��F2.@�AB(7C2D,�#D,1<��������%��#�@�E����"��%����,!�"�������������� ��!��!"����#.�� G��� ��!� '()* ''''�HB( 7C2D,�#D,1� 27��2I�62267�6�26I�72277� �JKLM��NO�������� �����LPQ�M��� PQ MQ� �� ��RPQ�RP���

Page 72: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� ����� ����������������������� ��!"���#$%#&'��(&%��%�"���)�� ��*+,��"�-�****�."%�"��'�/"'��&���'��� ��%&0��&(�� ��0&&#����-���%!����)�1$"��%�"%2�'�%$��$%�3�"�"02���"0�$0�%"����%�($)"��&��4*567�/"'�"���!#&%�"������ ��1$�����&%-�%��&��&!#"%��� ��1$"��%�"%2�'�%$��$%�'�&(�/�0-8�2#��"�-�."%�"���#%&����'9��*56� "'�� ��":�0��2��&�!�"'$%��� ��-�'�%�:$��&��&(�� ��'"!#0��/ �0������'�'#�����)�"�� �) �.�0&���29����-�!���"��&��.�0&���2��'�"��"�"02���"0�$0�%"����%�($)"��&��!�� &-�� "��!�"'$%�'�� ��%"���"��/ �� �!&0��$0�'�!&.�����%�'#&�'���&�"�����%�($)"0�(&%���"##0��-�&��� �!9��; �'�'�-�!���"��&��%"���#%&.�-�'���(&%!"��&��":&$��� ��!&0��$0"%�/��) ��"�-�' "#��&(�� ��'#����'�#%�'�������� ��'"!#0��4<"0'�&�3�=>>?79���; ��-&$:0�8'���&%���00'�&(�� ��*56�"00&/�� ��$'�%��&��"@�����&�"��&$���'&0.����":'&%#��&�9��*�'"!#0��&(�� ��#%&�����'&0$��&���'�#0"��-����&���'���&%3�"�-�"�'"!#0��&(�� ��'&0.�����'�#0"��-����� ��'��&�-�'���&%9��*00�'"!#0�'�/�%������%�($)�-�$�-�%�� ��'"!���&�-���&��"'�-�'�%�:�-����'����&��A9A=9��*��&!#"%�'&��&(�� ��'�-�!���"��&��.�0&�����'�&(�/�0-8�2#��#%&�����"�-�� ���/&�."%�"��'�/"'�#�%(&%!�-�"��A?�BC�4=�!)D!,79���E�)$%��A=�' &/'�"�'�"#' &���&!#"%�'&��&(�� ��A�� �'�"��&(�"00�� %���'"!#0�'9��; ��#%�'�����&(�"�'��)0��:&$�-"%2���-��"��'�� ��#%�'�����&(�"�'��)0��'#����'3�"'�' &/������ ��/�0-8�2#�9��C$0��#0��:&$�-"%��'�'$))�'��� ��#%�'�����&(�!$0��#0��'#����'�/ �� �'�-�!����"��-�((�%����%"��'3�"'����� ���"'��&(�:&� �."%�"��'3�*+,��"�-�****9��; ��#�"@'�"��#&'���&�'��9F�"�-��9=��!�%�#%�'����� ��!���'�$'�&(�� ��'"!#0�3�"�-�� �2�-&��&��&.�%0"#�-$���&�� ��("���� "��� ����00'�/�%���&��(�00�-�/�� �� ��'"!��.&0$!�3�:$��� �'�-�((�%�����-&�'��&��"((����� ��-���%!��"��&��&(�� ��'�-�!���"��&���&�((������9����

Page 73: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������� ������������ ��� ��� ��� ��� ��� ��� ������ �������������� ������� ���������� !���� �"#$%&'(")*"""+,-./012"13"-,-452$6-4"&42'-6(,2'$3&%-2$1,"'&,"7/6-,")89:";<���� ���������=�>?�@�������AB�����=�������������;���� � ����������CD������������EA���F�� A��� �������������"� G�BA������< @���<���������� �� ��������� ���� ����������������B��<������A���B�!H�GI;���;�������< @���<���J����B���� ���� ��G�BA�������K�L� A����A����<�L��< @���<��� ������� ����<���������M@� ������N�������OPQORSTM��������������A���� �������� ����<�L��< @���<����<����������A�A��������������������M@�� ��������U<� OPQORSTM����������

Page 74: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� �������������� �������������� � � � � �� �� �� �� �� �� �� ���������� ����������� ���!��!�� "�#�$%&���'(������������������ �)*+,-./00///1.2*3.4565*74/87.99*8*.45/79/:*;2<5=>.?/@AB1/642/@@@@/>-75.*4CD/E������F���#%G���H���I��J'KLM���� �F��H��� �F� ���I�N������'����%����O������%���F�����F������H���I������F&��� �F���� � C0P?:� Q� 1>.8*.C�R*;2<5=>.// !S��!� � ���� ����F��@AB1// S���� ���!�� ������F���� � ��S�� ����F��T�US� !�ST� $�!S�T�� �T�TU� ����F��@@@@// S�S � �!���� ������F����� � !S���� ����F����!�� T���� $�!S�T!� SS�!!� ����F��/V6W;.//X///1,336-=/97-/5Y./C.2*3.4565*74/87.99*8*.45C/79/:*;2<5=>./642/5:7/Z6-*645CD/�F��H���F�N��&�[����F�����IF������N��\����������O#H����F�����F�������

Page 75: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ����� �������� ������� ��� ��������������������� ������ !�"#� $�%&'%(�)%$#��*%(%�!"((�%+� ,#�,��$-�."/0123�*4�!4����"�*%"5�!4" #( '�!�"-%$#�,�%+�'(%6� ,�07��$�"�$,)8%(� 9�%$ 0"�%��#,+�%��:;"(8"���<=><?@A3�BCDCE�; ($80"##<=><?@A3�D��FE�G(%'"$�%(<=><?@A3�D��CE�H4" <=><?@A3�BCCIJK��L#,+�%�� $�7%"�#�%$ 0"�%�4"6%��4 *$�#4"#�+��� !�"#� $�*�#4�."/012�'( !%%+��*�#4 ,#�,$9 0+�$-�"$+�#4"#�#4���+��� !�"#� $�! ,0+�8%�9 00 *%+�87�"�+%!(%"�%��$�%$M7)%�"!#�6�#7K��N#����"0� �5$ *$�#4"#�."/012�+��� !�"#%�� !#")%(���$# ��$"!#�6%�) $ )%(��:;"(8"���<=><?@A3�BCDCJK���O$ 0"�%�"#�"�! $!%$#("#� $� 9�BKP�QR�*"���$!,8"#%+��$�GRO�8,99%(�! $#"�$�$-�6"(7�$-�! $!%$#("#� $�� 9�."/012K��L")'0%��*%(%�"��"7%+�9 (�%$M7)"#�!�"!#�6�#7�"#�B2C�$)E�9 00 *%+�87�"$"07���� 9��%+�)%$#"#� $�6%0 !�#7�,��$-�ST/K��U�-,(%�BV��4 *��#4"#�#4%�0 ��� 9�"!#�6�#7�! ((%0"#%��!0 �%07�*�#4�9 ()"#� $� 9�) $ )%(�K�W."/012X�RYZY YZ[ YZ\ YZ] YZ YZ_�S!#�6�#7� (� $ $�) $ )%(�!�'( #%�$ CBC2CFCICDCCDBC �S!#�6�#7�. $�) $ )%(�!�'( #%�$ �a�b����c��������� ����������� �d� �����e���f �������������g�h�ij��1'%$�!�(!0%�3��"!#�6�#7E�!0 �%+�!�(!0%�3��$ $k) $ )%(�!�'( #%�$K���$ $k) $ )%(�!�'( #%�$�!"0!,0"#%+�"��DCC �k��) $ )%(�!K�C�R�."/012����! $��+%(%+�"��4"6�$-�DCC �"!#�6�#7�"$+�DCC � !#")%(�!�*�0+k#7'%�%$ 0"�%K���

Page 76: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ����������� ����������� ������������������������������� � ����������������� ������������� ������ ���� ���� ������ ��� ����!������� ����������� �������������� �������� ������������������������� "�� ������������#��� �$������������� ����%&'(����%%%%����������� ��������� �������� ����� ��������������������!��� ���� ������ ��������� ����� �������������������� )��� ������� ������ �� �� ��� �������������" �����*�� � ����� �%&'(��������� )��� �������+���� �����,������������� ������������� ���#����� �%%%%������� � ������������������� � ������� ����� �������������� �%&'(��� -������.����� ��, ��$ ��/ ���0�%������� �$�����1�,�� 2������� �%&'(�%%%% �3456789:;999<=>?@;94A=BC4D=C4EA9B67D89FE79G4?HICJK8L9MNOP9=AH9MMMMQ9R��� ����� �����������$�S�T���� ��� ����U�V� ��� ������������������ ���������V"�� ��������������� ���� ���� ���� ������� ��� �� ������������ ��������������RVR����$�������������� �� ����� �����

Page 77: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� ������ ��� �������������������������� ��� ����!��"#$#�%��&�'#$�(�%�������"�� �)��#���������#�!*�� ��$�!!��&�+( �$#��$�!#,��$����-./�����!���&0���#����&���������0���'�!����#������0!#�,��#��0$����#� ��#��!������!���%1�2!�� ����������0���#�����!�!*���$�!!�#��!�������%�!��0��0������0�!1��3 ����$�#�,���������0���43�5�#!����!#���������"��� ���#���#����&�� ������!#�#���"��'�������#)�����������0���������#�1��3�������0��������0���#���'�!����#����������6!*��1.�����7181��9���$�!�'��������������������������#��!��&�.1:��,;�<�#��� �!� ����"0&&��1��= �!� ����"0&&���'�!�0!���#�!������&�3�#!�"0&&��*�"���0!��� ���>���&�� �!� ����"0&&��������!�����!�$�'���)��#�"#$#�%��!���&0���#����&���������0��1��?�$�#�,���������0��!�'����������#����"%���$�0$��#�,�� ��&#�!�����#)��#)���&�� ��!�������0!#�,�� ��@�!���9�������2��$%!#!�!�&�'���1��A#$�(�%��������#������6��1.�! �'!���!����������0���#����0�)�*�#��#���#�,�����������#)��0�&�$�#�,�'#� ���3���&������B#����$%��/18�CD1��E��� ���� ��� ���*�� ��2F<9�����2222�)��#���!�! �'������0�)��'#� ��'������!#�#���!����!1��3 ��3��&���� ��2F<9�)��#����'�!�������#�������"��G81��CD����� ��&#�!��#�&$�B#�����#�������:�1��CD����� ��!�����1�3 ��3��&���� ��2222�)��#����'�!��!�#���������"��G.18�CD�����:81/�CD*����� ��&#�!������!����������!#�#�����#��!*���!����#)�$%1��2��#B�0����&�!���#�!���%�����0���&���� ���#&&�������#��! �����&�� �������0���#����0�)���"!��)��*�!#����� ��!���$��#!��$����%�����#�$$%��#!!��#�������#��������������0��������0���#��1���90���#!#�,$%*�' ���� ����������0��������0���#��!�'�������&����������6�718*��$$�� ����!���$�!�!�����������!#!��� ������$���������!!��&������0���#��1��2"�0��G.H��&�� ��DF�!#,��$�'�!�$�!�*������ ���� ���0�)���$����0��1��A#$�(�%�������2F<9�! �'�����!#�#�����#��!��&��-18�CD�����8�1.�CD*���!����#)�$%I�' #$�*�2222�! �'!��'������!#�#�����#��!����G81��CD�����8/1��CD1����������

Page 78: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������������� � � � � � � ���������������������� �� �� �� �� �� �� ����� ��!�"#!!!! �$%&'()*+,***-)./)(01'()*2)301'(01%43*2)1)51)2*67*5%(5'80(*2%59(4%5*:/)51(4:54/7;*#������������ ���� ���������<=>��?=�����������@�>����� ����=�� ����?=������<������=����A�#=����������������������������������������B��A ��������<������������������������������������������������B��A�A�C;D;,E F)/0(01%43*4G*:/)5%):*%3*HIJF*032*HHHH*K0(%031*/(41)%3:*L���?�����=��>�������=���������<����??��������M����=?�!�"#�����!!!!���=�����=@���N������<��!����O�����������M�=���A�A��A��P����M<�M���Q�� �R"�=?���=�����������>�����S�M�����=�<��TU"��M=���M���=���#�����O�� �M=����������M��@��������M�=���A��A��V��=��?��M�=���>�����=��=�������� ������� ���A���� �<������?�����=��M<�=��=�����?=��<��!�"#�N�������T����������<=>��>=������M����W�A��B=>�N��Q���>���=@���N���<��<����M=������W�������?�=��N�� ��=�� ��������X������=����W�� �������=�<��������M��=?��������@@@�����S�M�����=�<��� ������������������=�����A���<���@�=�@��M������ �>����������<��������M�����O��������Q�@�M����<������������� �>��������N�� ��=>������=�� A��T��M�=���>�<�<��<��<����@�=�@��M��?=����M<����W��YZ�����Y���>��������M���?=����[ ���M��M�N� ����� �Q�!���

Page 79: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ ����������������������������������������������������������������������������������������������������� !�"������������������������������������������������ ��#��������������������������������������$!��������������������������������������� ���� �%&'()*+,-+++.*/+0&/1)21&34+56)37213')27+30+16*+89:;+<2)&241+21+8,=>+47?+� #����������������@��������������������������������������������������"���AB ��CD�$EFG���G�� ��#���� ���������H���������������@����������������������������I$A �CD�$EFG���G����������������������������������������������������������������� ��#�������@��������$����������������������������������������������������"������@�������E �$�CD�$EFG���G����������������������������������� �#������������"���������������������JKL ����������������@����������������������������������������J����������"����������������������������������������������� ��#���� �����������������$F�"�������������������������������������@�������������������������� ��M������������� �����"��������@��������AF N����������������������������

Page 80: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ �������������� ������������������������������������������� ������������������� � !"#$% &'()*% +% �"$,-$&%./0�%1-2345$%67%&"$,-$&%% ���� �8��� ������ ����� 99�9� ����� ����� 9��� :�9��9� ����� ������� �;<% ���� 9���� ������ ���9� ���� ����� �:� :� :�9���� �8�=� ������� �;'%% ��8� ����� ������ �:� :� :�:� :� :�9���� ���� ������� �> ?#$%%<%%%�4!! 5@%67%&$A-!$B3 3-6B%C$#6,-3-$&%67%& !"#$&%$#43$A%756!%3D$%EF0G%H$#%7-#35 3-6B%,6#4!BI%�J�����JKL����� � �������������� ��������MNOPQ��R������� ���������������������������� ����� ���S�NOP������ ������� �����������������T�� �� �������������������� ����������T�� ���J������ ���������� �������� T������������� ���� ������� ������U��������=��� �������������������T ���� T����V��NOP������������W�� �����T ��� � ����������������V��������������X��T �NOP��R������� ����������� ��������� ��������MY��V� �Z[\Z]_���898Q���U������������ �������������������T �����T������� ���=������W�� ������� ���� ��������� �� �������� ����� ������� ����� ���W����������JNOP� �������� �������������������T ��������������������������������������� ��� ���� T� ��������X����T � ����� �������� ���������V����������JKL��R����������������W��� �����R��������T ����������������� ����������T����������JJJJ�X��������W����������������V��������� T����V ��V���������8�����������JJJJ�X������

Page 81: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������� ��� ������� ��������� ��������������������� ����������� ���� ������������ ������������������������ ������ �������� ��� ����!"#����� �������$#%���������!��#�����&'(�)���%���"����"# � ���� �*+,-./0120003/405+46.76+890:;.8<768,.7<08506;/0====0>7.+7960760=1?@09<A0� B��"� �� �%%���$ �����$#%���������!��#������������ �� ��������%���������������C������ ������������� ��������""#����������������!��#������#����#��%�������� � ��� ������������� ��� ����� ������ ������������%� ��������C������ ������$#%���������!��#����� ���#�D��E���������#����#��%�������� ��" ������ ��������������� ����E���"#�� �� ��#���B�� �%�� ��������� �%�"�� � %�""����� �$�����" ���%����� ���B� ������ ��� �������F��"�����%��������� ��� �� ����������"���!"#� "��"#��������� C����� � C������ �00 (����#�����!��#�GH&C�I%��I%�� J#����#��%�������� ���%�� (����#�����!��#�GH&C�I%��I%�� (����#�����!��#�GH&C�I%��I%�� J#����#��%�������� ���%��� �� ���K� ��� ��L� C��K� ������ ��C� L�K� ���� �L� L���M7N4/0O@00P-<<7.Q0850/9RQ<76+:07:6+>+6Q079S0;QS.8SQ97<+:0.7S+-T058.0TU/:+/T0T/U7.76/S05.8<0====0>7.+796A0

Page 82: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������� ������� �� ���������������������������������������������� !"#�$%&'�!(�'�)��$&!*� '�+%��'!��',#-�'����((� '��!(�'���.)�/'%0�!"�'����'%1)2)'-�!(�! '%3�&) ��"!2%��4������0�"��(!&�+)2#/'-$��! '%3�&) ��"!2%���5,��#�)"�'���()&�'�$%&'�!(�'���$&!*� '6�+�) �� %&&)���%"�7/'�&3)"%2�.)�/'%0�+%��)"��&'�#�)"'!�%�8� '!&�+�) ��)"'&!#, �#�%�9/'�&3)"%2�.)�/'%04����)��&��,2')"0�$&!'�)"�+%���:$&����#;�$,&)()�#�%"#�'&�%'�#�+)'��'�&!31)"�'!�&�3!8��'���'%04��7/'�&3)"%2�.)�/'%0;�9/'�&3)"%2�.)�/'%0�%"#�7!�.)�/'%0�$&!'�)"��+�&�� !3$%&�#�)"�!&#�&�'!�#�'�&3)"��)(�'���'%0�%((� '��<,%'�&"%&-��'&, ',&%2��'%1)2)'-4��������=� >?@�A�BCD�E��� ������$&)3�&��,��#�'!� 2!"��'���0�"��(&!3�$F�/GH1�8� '!&�)"'!�$F�/IJ15K6�8� '!&�%&��2)�'�#�)"��� ')!"�J4L4G4��M)&�';�'���! '%3�&) ��"!2%���0�"��)"�$F�/GH1�8� '!&�+%��%3$2)()�#�1-�N9O;�+)'��!2)0!", 2�!')#���#��)0"�#�'!�)"'&!#, ��PQRS�%"#�TUQS�&��'&) ')!"��)'��4����)��&��'&) ')!"��"V-3�� &�%'����') W-��"#��+�) ��+�&��,��#�2%'�&�'!�2)0%'��'���)"��&'�)"'!�'���$F�/IJ15K6�8� '!&4��PQRS�%"#�TUQS�+�&��,��#�'!�#)0��'�'���)"��&'�X7Y;�%"#�ZQ[S�%"#�TUQS�+�&��,��#�'!�#)0��'�'���8� '!&4��PQRS� 2�%8%0�� &�%'���'��� !3$2�3�"'%&-��') W-��"#�(!&�'���ZQ[S�#)0��'�#�X7Y4��Y0%&!���0�2��5G\6�+�&��,��#�'!� �� W�'���#)0��'�#�)"��&'�%"#�8� '!&�X7Y�5M)0,&��JL64������ !3$2�'��$2%�3)#�X7Y� !"'%)")"0�'���0�"��)���H]]�1$�2!"0;�+��&��'���)"��&'�)��G]GG�1$�%"#�'���8� '!&�)��IGJJ�1$4��M&%03�"'��(&!3�'���0�2�+�&���:'&% '�#;�$,&)()�#;�%"#�2)0%'�#4��, ���(,2� 2!")"0�+%��8�&)()�#�1-�X7Y���<,�" )"04��

Page 83: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ���������� ���������������������������� ������������������ ������� !"#�$%�&!'�()*�+,-�*!�+�(,!.�/012�)3+�4502�$6788�9:'�)3+�,3*�#!�$#,-.!'�()*�+,-�*!�+�(,!.�;0<2�)3+�4502�$7=77'>��) .�-�%�*."(*�?)@9+)�$A'�BCD�+,-�*!�+�(,!.�E01F2�)3+�G<HI222J�� K��L M������N������ ���� ����O�� ������PQ���O�� �R��Q� �S.��:%)*@,+�&"#�" !)@�#, ��3"%)*�� )##T,3-�!.��U,*V!)-�)!�,!*�WV!�#@,3X*�()*�!#)3*&"#@�+�,3!"�EYZ01[<�\?87$B]='� "@:�!�3!� �%%*J��S.��:#"!�,3*�(�#���:#�**�+�)3+�:X#,&,�+�)*�+�* #,9�+�,3�*� !,"3�8J78�)3+�8J7=J��S.���%X!,"3�:#"&,%��"9!),3�+�()*�*,@,%)#�!"�!.)!�"&�(,%+V!T:���3"%)*��,3�!.��:#�_,"X*�*� !,"3J��D�!"!)%�"&�7aa��@-�"&�:#"!�,3�()*�"9!),3�+�:�#�7?� X%!X#�J���� S.��:X#,&,�+�:#"!�,3�()*�!#�)!�+�(,!.�!.#"@9,3�:#"!�)*��!"�#�@"_��!.��.,*!,+,3��!)-J��S.#"@9,3� %�)_�*�!.��)@,3"�) ,+�9) b9"3��9�!(��3�:#"%,3��)3+�)#-,3,3��,3�!.��&"%%"(,3-�*�cX�3 �d�?�XV�)%Ve#"VD#-Vf%TVg�#J��D&!�#� %�)_)-�>�:#"!�,3�()*�+,)%Th�+�!"�

Page 84: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ �������� ����������� ����������������� ���� ��������������������������������� ��� ��� �������� ����������������� ������������ �� ��!"!�#�$%������&�������������&���������������������� ������������������ ����&��������'������������ ���������� ��� ������(���� ������ ����&���������������)��� ���������������� ���*�&� ��� ����� ����� ��� ��������&��������+�," ���&&����������� ����������-������� ��(���� ������������� �./01234564447879:;<=4>?4@9A32B/CDE4F/G9AD0H4I9A32B/CDE4F/G9AD04DCJ4@>4F/G9AD0K4��L�!"!����� ���� ����������&�����&�������� ������� ����M��� �� ����������� �� ������ �,�����% ��� ��������� ���� ����N�� �����O�P���&�������������

Page 85: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ���� ����������������������������� ������!�"�#������$�!%���&'��� �!�"�(�#'��%�)�#�#�*+����������"�����#,��$���!�-����!� �##�#,����� ���$����.����$���#� �"���"��� �##/��0!��������������� �!���1�� �"���"��� �##2�����������!+�����!� ��1���)�#��#����#���#���*����!�3�����!�4/56/��71�� �"���"��� �##�)�#����!�����*��8��6�/6�9��:;�%����<=>2�)1��1��#����������!������5/5�9���� ,���������1���?,������ �"���"��� �##����8��66/@�9�2���"��"�������� ��1��� �!��������� ,�#����!/������ ��A�BC����D��E���������C��F���������� G�����H������I�J�K���LM���� �G�N��M�B��3�%!�"���� �O30'P'7Q;� �##�#,����� ���$��!#��� �!������!.�"�����)��1�R�##S$!?�#���)����

Page 86: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� ��������������������������������� ��!��"�#���$%&�'� �(&�&�)& $��&!��*�'"&�+ �,-.��&/�#*�0&'(&&*�12�� *!�32��*)4��5%&�'� �$"#(� �$) ���!�++&�&*�&��*�'"&��*'&*$�'6�#+�'"&��7�$�/* �� '�189�*)�0&'(&&*�'"&�:,'&�)�* ��;�$,' /�%�#'&�*� *!�'"&��,'&�)�* ��;�$,' /�%�#'&�*4��<"�$�$��/"'�= �� '�#*��$�)#$'���>&�6�!�&�'#� �$) ���!�++&�&*�&��*�%�#'&�*��#*�&*'� '�#*�?@�/��&�A1B4���C =&�&*/'"�?*)B�12� 3�� 33� 3D� 3E� 32��7��*�'$�?)����!&/�&&$B ,1��1�3�A� :,'&�)�* ��;�$,' /�,'&�)�* ��;�$,' /�:#�;�$,' / F�G�H����I���JK������L��M�G��NOP��������� �M����Q��R�����L��M��M�����Q����������STN��Q�����U��N��HV��N��Q�����U��N��H��� �T��U��N��HW���7�$%&�'� �(&�&�#0' �*&!�+�#)�2��XY�#+�$ )%�&� '� ��#*�&*'� '�#*�#+�14��)/Z)Y��*� ��4�1��)��&��$4���

Page 87: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� �� ������������������ ������������� ! ���"�#����#$%�&�'���(� �(% �)��*���(�!�%# (��(+�,-.*(#.*()/���% ���� &�01234��(�.*(#.*(��(/.�%$!����01�14����,56����$�&�%�#��$%���&��(�����%�� (�#�(+�,-123���&�7),8�0���7�,-123���&�9��7�(+�7),84:��;*��%�#$/�#�('�� ��&�&��(�#�%�����*����*��#.�� + ����� ! ��� #��(���++����&�'���*��.%�#�����(%�.(# � (��0<-�(%�=-���%� ��/4�(+��*��> #-��):��3#�#*("�� ���*��.%�! ($#�#��� (�?��*���!�%�)��#.�� + ����� ! ���+(%��*��<-��%� ��/�> #-��)�.%(�� ��"�#���/�$/���&��(�'��,6@:A�BCD,56E� �E�):�F��"�#�&���%� ��&��(�'��,65:A�BCD,56E� �E�)�+(%��*��=-��%� ��/�> #-��)���&�,6A:6�BCD,56E� �E�)�+(%��*��<(�> #-��):��;*�%�� #��'($����,G�& ++�%����� ��#.�� + ����� ! ���'��"�����*�#��������#�%�#$/� �)�+%(���H.�% �����/��%%(%:��I )$%��J,�#*("#���* #�()%���" �*��*��#.�� + ����� ! � �#�(+��*���*%���������#:��<-��%� ��/�> #-��) =-��%� ��/�> #-��) <(�> #-��)�KCD ,56E� �E�) 6,996�9�66�,9�96��9,66,,9,96 �L�MNO�������P������������������QR��OS����T� R��MU�VR��OS����T� R��M��W�Q�T� R��M���� ���O��� ��

Page 88: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� ��������� ���� ���������������� �������� !"#�$�!%&$'!&$���()�*!+ ,-�!�.�!�! )&$%! �/ &0!%#�&0$1/2!&$���3#0#�/"#.�&��%�45!0#�"&!($ $&$#"��1�&6#�&60##�50�&#$�"�7*8&#04$�! �9$"8&!2:�+8&#04$�! �9$"8&!2�!�.�*��9$"8&!2;<��="�"6�3��50#'$�/" ):�&6#�#�>)4!&$%�$�!%&$'!&$���()�&6$"�%6!�&0�5$%�!2#�&�%�00# !&#"�3$&6�&6#�?/!&#0�!0)�"&0/%&/0#�.$""�%$!&$��<��@6#0#1�0#:�!1&#0�$�%/(!&$���$��*!+ ,-:�"!45 #"�3#0#�&#"&#.�1�0�#�>)4!&$%�!%&$'$&)�!&��-A��4�!�.�&6#��!�! )>#.�()�=B+�71� �3$�2�"#%&$��;<��@6#�#�>)4!&$%�!%&$'$&)�.!&!�"6�3�&6!&�&6#�+8&#04$�! �9$"8&!2�!�.�*��9$"8&!2�0#?/$0#� �3#0�%��%#�&0!&$��"��1�*!+ ,-�&6!��&6#�*8&#04$�! �9$"8&!2�1�0�%�45 #&#�$�!%&$'!&$��<��@6#"#�0#"/ &"�"/22#"&�!�"&!($ $>!&$����1�&6#�*8&#04$�! �9$"8&!22#.�50�&#$�<� C*!+ ,-D�EA<A A<F A<� A<G A<-H�=%&$'$&) A�A-AIAJAFAA *8&#04$�! �9$"8&!2+8&#04$�! �9$"8&!2*��9$"8&!2 �KL���������� ������ ��M �������M������N���N����O������ ��OP�Q�����R��<��SE�50�&#$��"!45 #"�3#0#�$�%/(!&#.�1�0�FJ8�-�6�/0"�!&�$�%0#!"$�2�%��%#�&0!&$��"��1�*!+ ,-�710�4�A�E�&��A<-�E;�!&�59��<-<����

Page 89: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������������� ������������������������������������������������ ���������� �������� ��������� ���������������� �� ����� ��������������� !"����������#��"�������������������������������� ��������������������� ��������� ��������� �����������$��%������ ����������� ��������� ������� ����" ������������!���� �������������#���������������������$����� ������$��%������ ��������������������� ����������������������������&�%������������������ ����#���� ����#�����������$����� ������$��%�� ��������$��%����������������� �������������$����� ������$��%����������#��������#������������ ����#���� ����#�����������$��%������������'����� ������� (���)������*�+,�, ,�- ,�. ,�� ,��/�0���#��" ,.,�,�,�,-,, �$����� ������$��%������$��% �1234567189111:;<=>913?;@A3B;A3C?1@56B71;A1DEF1GH91;?I1JHKH1��������"������������ ����������������� ��� ��"����������������������� �������� ��������� ������������-�����.��������������������� !"�������#��"���������� ��������

Page 90: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� ����� �������������������������� !"#$� ��!%�&��'�(')*&!��%�('�+!,$-��!'%�! !.�%��/���'0."!�()�!)�(1(�.2�!'!$.�()!$�*$��!)�'��(�*3!�(/'�4! �#���/�"�%��/�%����"('��5*!���'!�.� ��*)�*��6���'!$. ( �/���7,� �%("�'�!�(/'�1�$/)(�.�%!�!�* ('3�89:;<=� �/4�%���!��!��>�?�+!,$-��������( �/'$.�/'�� #�)(� �#�� �'�2�!'%�(��( �/)�!"��()6��+@���"('!$�A( @�!3�#�/��('�!��>6B��?�+!,$-��( �"!('$.�"/'/"��()2��/4�1���!##�/C("!��$.�DEF� �($$�( �/)�!"��()6��<'�)/'��! ������,@���"('!$�A( @�!3�#�/��('�( �D>>F�"/'/"��()�!��>6B��?�+!,$-�6��8("($!���� *$� �4����/& ��1�%��/������+/�A( @�!3�#�/��('�! ���/ ��/&�!('�%��/������,@���"('!$�A( @�!36��;(3*���GE� �/4 ����� �%("�'�!�(/'�)/���()(�'� ��/������+@���"('!$�A( @�!3�!'%�,@���"('!$�A( @�!3�!��>�?�!'%�>6B��?�+!,$-�6�� � � ��8�%("�'�!�(/'�,/���()(�'��H B>24IE D> DE B>�7,�7'(� >6>>6B>6�>6J>6KD6>D6BD6� +@���"('!$�A( @�!3,@���"('!$�A( @�!3 ��L�MNO��P������Q�O�R� ��S��T�R�� ����� �������������SSO ��UV���WXY��� �8/$(%�$('��H���������I���#�� �'� � !"#$� �(')*&!��%�!��>�?�+!,$-��!'%�%! ��%@$('� �H����������I��������#�� �'�� !"#$� �('�>6B��?�+!,$-�6��

Page 91: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������������ ������������������������������������������������������������� ���������������������� ���������������������������� ���������������������������������������������������������������� �������� ����������!�"�������#������������������$��������������������� ������ �����������������������������!������������� ������������������������ %�����&�'(�( (�) (�* (�� (��+�,��� ��#���� ��������������������� (*(�(�(-()(()*( �������������������������������������������� �./01234564447/889:/;</9=4;=>4/=;:</?;</9=49@49:<;A32/:43=9B;834CD4E;FBGHI4������#����J4+����� ��#J����� ��#�����+�������������������������+�������������������������������� ����)((+���+�������������� ������������!������������������������������������������ ��#��� �������������������������������!����������������� ���'�����!�������������������������������������������������������� ��J�������������!���������������� �������������� ������� ������ �������������������������������� �����K����� ��#����������K�����#��+������������������ ��#��������������� �������)(+�����������������#�����!������� ��������������!!����������

Page 92: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ��� ������ ��� ���������������������������������������������� ��!��"��#��� �!�������$�����%�!&�#'� ���("�!�#���"��#!�������� ��#�(���!�#)�*��+��$�������,+��-���� ��#�(������#�(�#������. �������!������ ��$���������#**������� ������!�/0&������#*�%�!&�#'-�1&������#*�%�!&�#'�#���0�&�#'23��4������ ��#�(���!"#���#!� ��$��������� ��#!!�(�� ��! �#���)($$���#��������$$������ %!-��35�#����363��7�'(���8��!���!�����"(�9�!��)�#�����#��)���� %!�$���#**������� ������!�!�(����3�� 4�� ��#�(���:1;5 85 65 <5 �5 �5 =51>�?���!�/��**���'��!!2 &�5&<5&65&85&;5&@55 0&������#*�%�!&�#'1&������#*�%�!&�#'0��%�!&�#' �A�B����C������ ������ ��� �����DE�F��F�G ����FH���I�I�F���IF��E��J�'�#*������!��+�#��;5=�����!�!�����$���#**������� ������!3�J�*���*����/����������2��� ��!���!�!#� *�!�#�� %��35�#����#!���&*���!�/�������������2��� ��!���!�!#� *�!�#�� %��363��4���!�# ���$�#**�"(�9�!�#�� %��35������!��#���#�"�� ��#��9��(�$�*���'� ��"�!!�$���#**������� ������!3�4���!�#**���$$����"������**� ��"��+��)!��9���#������)�'�����'��$�������#!(���������!(*�!�$����!�#**�9#��#����!������,+���"��"����#�����)�������!#� *�!3�

Page 93: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� �������������� ����� ������������������������������������������������ ��� ��������������� ������ ����������������� !���"��� !������#��� !��� ����$%�� ���������%����!%�� ���������%��������������%���� �������� ��������������&��� ������������������������ �����������������������������$�!�'���� ������������ �����������(������������$%�� ���������%���� ����������&���� ��� �������� ������������������������� ������� ������������� ���������������������� ������������������ ������ ����������������� ������������� ������������������������������������������������������������������������&�����##������ �(������&���������������������� ���������������������������)*+,-./ 0-//12/345/ 6788.9.*:./89;-//////<=>.9-7*?@/27A=>?B/ 0-//12/C4D/ 6788.9.*:./89;-//////<=>.9-7*?@/27A=>?B/$%�� ���������%��� ����� !� %%%%%%%� �"��� !� %%%%%%%�!%�� ���������%��� �"��� !� %�E��� !� E���� !� %����� !�$�����%��� �#��� !� %����� !� E���� !� %�E��� !��0?F@./GG//H.@>7*B/>.-1.9?>I9.A/;8/<=>.9-7*?@/27A=>?BJ/K=>.9-7*?@/27A=>?B/?*L/<;/27A=>?B4//M��� �������������������� ����� �����������������������������������������N�����O���� ��P�������������� ������Q4QRS7*.>7:A/?*L/F7*L7*B/A>IL7.A//&� ��� ���������������������������������������������� �������������T�������� ��������� �U������������������������� ������ ��������������������������� ���� �� ���������T&!���&����(��������������������������� �����������V$%�� ���������%����!%

Page 94: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������� ������������ ��������������������������������������������������������� �������!���������������������������������!������������ �"#$��%&%&'( )*+*,-./0+.1/21324./*+.5251/6+0/+6278*/290,:./;2<;=>2#���!�����������������������������������������������������������������?����� $�@��A����@��A���������������������?����B����A�BCD������������������������E��A�� �"#�$��F����������������������������������E�������$����GH�������������������������������������������A������ A�������I���������!�����������������$�J$��D����������������������������������� ���������� ��K�F ���������� ������������ ��K������������������������������������!�������������������L���������������$������������������������!���������������������������A��M$���D���L���������������������������������G������D���E�$��H������N����������������������������������������G������������A������ A����������$��O��������������K�������������������������������������������������$�P/Q:-*2 R-2ST<U2 V-0W2XYZ)=[\]-./2 450+26_'2� ���������� ��� N�$E�a�EJ$�� $E@E�a� $ �� EN$�a�N$E�F ���������� ��� N �$��a�$E� $E�E�a� $ E� E@E$@�a�E$�������� ��� ��E$��a��$� $E���a� $ E� E��$N�a�E$��2b0cd*2'=22R./*+.52e0,0-*+*,6231,2<;=>213215+0-*,.52*/1d06*&2�������������������������E ��A�����B����E��A�� �"#$��#�������������������������f $ E�gA��������$��

Page 95: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ���������� ����������������� ������ ������������������������� �!"#$%&'()*�+',"#)-.�/ �0"#$%&'()*�+',"#)-�0 �!1�+',"#)-2�

Page 96: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ����� ��� ������ ������ �� ����� ����� ��� ������� �!�" #$��"�%&'(��)�*&�)&��"��!+�!�� '& �+�"�,�'��&-"+�.�'/+'*�$0��1&�)&��"��2&"�3������%�" �)& �$�&"�&�!+/&! +'�����#*�'+#"��4.�'�*�� "�,� 2�(�&" ���+-&"�0��5��(�&" ���+-&"�6�1�78��"� 2��!& �+��,2�!2�)�%�"���� 2��2�)2�" �&! �%� (�&/ �'�1)780������ �!�&""&("�,�'��.�'/+'*�$���� 2��"&*��3#//�'�&�$�79:;<�!+�!�� '& �+��&"�$�"!'�3�$����"�! �+��=0=0>0��?&3-��>=�$�".-&("� 2��@��� �!�.&'&*� �'"�+3 &���$�3(�/� ��)� 2��'&,�$& &� +� 2��*+$�/��$�"#3" '& ����2�3� �+���A#& �+���+ �$����"�! �+��707B0��?2�'��&'���+�"�)��/�!&� �$�//�'��!�"�3� ,���� 2��.&'&*� �'"�+3 &���$�/+'� 2��C9 �'*��&-�D�"9 &)6�E9 �'*��&-�D�"9 &)�+'�C+�D�"9 &)0���F G���� ���H� I��JK�L� I��JK�L� M��N�OPQ��RST�� U� �����VW�C9 �'*��&-�D�"9 &)� 1�78� X07�Y��0X� B>70>�Y���0=���0>>Z�Y��0����XB0=�Y�=0=��C9 �'*��&-�D�"9 &)[� 1�78� =07�Y��07� X770\�Y�X=0\��0�]��Y��0��7��=B0\�Y��0Z�E9 �'*��&-�D�"9 &)� 1�78� =0>�Y��0>� =]707�Y�=X0X��0>>X�Y��0��7�==0��Y��0\�C+�D�"9 &)� 1�78� B07�Y��07�� =\=0]�Y�7]0���0>=��Y��0��7�\=0B�Y�>0����_H��W���I� ��������������� ��������������� �H�����a&*.-�"�,�'��&""&(�$����>���*1�Db:ba�+'�\��*1�1ba9?'�"0��c[d�'�.'�"�� "�"&*.-�"�&�&-(e�$����1ba9?'�"�3#//�'0��<�.'+ ����!+�!�� '& �+��+/�f�0�=�g1�,&"�#"�$�/+'�&--�"&*.-�"0��� a&*.-�"�&�&-(e�$����1ba9?'�"�3#//�'�"2+,"�"�*�-&'�'�"#- "�!+*.&'�$� +� 2+"��&�&-(e�$����Db:ba0��a&*.-�"�,�'��&�&-(e�$����1ba9?'�"�3#//�'�3�!&#"���4.�'�*�� "�/+'�5?E�,�'��.�'/+'*�$���� 2�"�3#//�'0�h�)#'��=]��<6�i�&�$�E�"2+,"� 2��/� �/+'� 2��C9 �'*��&-�D�"9 &)6�E9 �'*��&-�D�"9 &)�&�$�C+�D�"9 &)� +� 2��*+$�/��$�"#3" '& ����2�3� �+�0��?2��'&,�$& &�!+''�-& ��,�--�,� 2� 2��/� �$�$& &0���

Page 97: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ���������� ����������������� ������ ��� ��������������������� �!"#$%&'()*�+',"#)-.�/ �0"#$%&'()*�+',"#)-.�0 �!1�+',"#)-2�

Page 98: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ������ ��������������������� ���������� �������������� !"#$!%�&$'(!#&�)"�$*#�#++#%$�)+��,-./�%)"%#"$01$!)"�)"�#"234#�1%$!5!$3�6#0#�7#0+)04#(�1$�1�+!8#(�%)"%#"$01$!)"�)+�9:�;�)0�9"�;<��="2341$!%�1%$!5!$3�61&�4)"!$)0#(�!"�$*#�&14#�+)04�1&�(#&%0!>#(�!"�&#%$!)"�?<?<@�1"(�?<?<�<��A1>B#�@C�&'4410!2#&�$*#�D!"#$!%�%)"&$1"$&�)>$1!"#(�5103!":��,-./�%)"%#"$01$!)"<��E)�!"*!>!$!)"�61&�)>&#05#(�1$�*!:*�%)"%#"$01$!)"&�)+��,-./<��/&�#87#%$#(F�*!:*#0� 4�1"(�D%1$�51B'#&�6#0#�)>$1!"#(�1$�+!8#(�%)"%#"$01$!)"&�)+�9:�;�%)4710#(�$)�9"�;<��G!4!B10�51B'#&�6#0#�)>$1!"#(�+)0�$*#�D!"#$!%�%)"&$1"$&�6*#"�%)4710!":�1BB�$*0##�70)$#!"&F�&'::#&$!":�$*1$�$*#�70#&#"%#�)0�7)&!$!)"�)+�$*#�*!&,$1:�()#&�")$�1++#%$�$*#�%1$1B3$!%�1%$!5!$3�)+�$*#�70)$#!"<��H�I��� J�� K� L��MJ�� N O�PQR��STU��V� �� ����W�E,$#04!"1B�X!&,$1:�� Y�49�9:�;� Z[<Z�\�?<Z� ]<@@Y�\�]<]]Z� @?<Z�\�@<@�_,$#04!"1B�X!&,$1:��� Y�49�9:�;� @<?�\�?<C� ]<@@C�\�]<]]@� @C]<�\�@<�E)�X!&,$1:�� Y�49�9:�;� Y[<�\�@<C� ]<@C?�\�]<]]�� @[<@�\�@<@�E,$#04!"1B�X!&,$1:�� Y]�9�9"�;� �C<��\�@<� ]<]Z��\�]<]]@� ?�<Y�\�]<Y�E,$#04!"1B�X!&,$1:�a� Y]�9�9"�;� �@<C�\�@<]� ]<]�]�\�]<]�]� ??<Y�\�]<C�E,$#04!"1B�X!&,$1:�a� @�49�9"�;� @[<]�\�]<[� ]<]?�\�]<]]C� @�<]�\�]<@��b cK��WS��L�������d �������������������� �������K ����G147B#&�6#0#�1&&13#(�!"�@]]�49�X=-=G�)0�Y]�49�9=G,A0!&<��eaf�0#70#&#"$&�&147B#�1"1B32#(�!"�9=G,A0!&�>'++#0<��/�70)$#!"�%)"%#"$01$!)"&�)+�g]<]@Y9�+)0�Y�49�9:�;F��]<]?]@�9�+)0�Y]�9�9"�;�1"(�g]<]Y�9�@�49�9"�;�6#0#�'&#(<��� h"�)0(#0�$)�*15#�%)47101>B#�(1$1�+)0�hA_�#87#0!4#"$&F�D!"#$!%�71014#$#0&�+)0�#")B1&#�1$�5103!":�%)"%#"$01$!)"�)+��,-./�1$�$6)�%)"%#"$01$!)"&�)+�9"�;�6#0#�#47B)3#(<��G!4!B10� 4�51B'#&�6#0#�)>$1!"#(�1$�Y]�9F�1"(�@�49�9"�;�%)"%#"$01$!)"&�6*!B#�D%1$�(#%0#1&#(�1$�&1$'01$#(�%)"%#"$01$!)"�)+�@�49�9"�;F�70)>1>B3�('#�$)�$*#�+1%$�$*1$�1$�$*!&�%)"%#"$01$!)"�$*#0#�!&�1�B10:#�(#:0##�)+�!"*!>!$!)"<��

Page 99: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������������� ������������������ ����� ����������������������� !�"#$%&'()*+�,(-#$*./�0!�1#$%&'()*+�,(-#$*./�1!�"2�,(-#$*.3�

Page 100: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������ ����� �� ��� �������������������� !�"#�� �#�$�% !��#����&�'�"%(�) ��*��+����+�����#$��,#$+#$-�. � �������#$/!*+#$-��$�� !.&�'01(2��$���.&�'34(2��� /�#�$����#/�#�����&�'$(2� $+�,#$+#$-�/�$�� $���'5(�6���78����#$ !�1#�8� -��/� ���#/��$�! ��9��"�#���:.��#��$����;*#����������$#���#$-��6������� ��/� $-���*.�$� ��#�� ��+��*,��� ���,#$+#$-���������$<&��9��"���/ !��#����#/��#�� �#�$�) ��.��6����+�#$�=>��?�?@48"�#��,*66���)#���A��?�?$BC9��"����*,��� ���,#$+#$-�/�$�� $��) ���,� #$�+�*�#$-� $��;*#!#,�#*���#:��6�D@DEDFG9��G�.����#$�/�$/�$�� �#�$��6���9H�I?�) ��*��+� $+� �/�$/�$�� �#�$��6�>9JHK�I?�6���D@D9����?#/��% !�L�#-#$���6�) ���) ��*��+����#$��-� �������� )�+ � � $+�����/*�*! �#M���� ��) ��.!����+� - #$����*,��� ���/�$/�$�� �#�$9��"������*!���)����6#���+���� ��$��,#$+#$-��#�����+�!�,�/ *��� �,������6#�� $+�!�)����� $+ �+�������� ����,� #$�+9��" ,!��A=�!#�����������*!����,� #$�+�6��������#�� �#�$��6��*,��� ����������78����#$ !�1#�8� -�.����#$9�� ��� NOP� � �����%�#8�;* ��+�� B=�A� �7� >9Q�KQ�R�>9>>Q� �5� A9JB:A>J�R�B9=B:A>=�� 58A�31� 8AB=B�R�AK9Q��� / !E��!�34� B�9BA�� / !E5���OSP �TU���������O�O� � ���VW���X �YZ� ���OP�[��Z�O�� � ��� �S\�������� "���5+�) ��+�����#$�+����,��>9JA�I?�)�#/��#��/�$�#+�� ,!&�!�)����� $�����5��M !*����,� #$�+�6����$�! ���M �&#$-�]B8DFG�#$�����.����$/���6�?$BC9��_#-*����A�+#�.! &������� )� $+�6#���+�+ � �6���������"%��:.��#��$�9��

Page 101: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ��������� ����������������������������������� !"�#$%�&!'!(�)��)*+&*+,�*-.'/012�3*''0&�'.�!�.+0�-*'0�2.&045��61!7/�"!-�,0+01!'0&�8-*+,�9*:1.%!4�;1*,*+�-.3'"!105��

Page 102: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� �������� ����� ����� ��� ��������� ��������������� ������������������������ ������� ������ � �� ������!��������"#�$%&'()&%*�%+,-(%,.�/0,+1�2,1#'+-�#',32'3,%�)4�56789:;<=9>?�%&)-+#%�@+#�#@)A&�'@+'�+�-))B�2)&&%2'(&C�DE0FE�(#�(&G)-G%*�(&�'@%�*($%,0*($%,�(&'%,+2'()&�HI@(&C%,7:J7?K6.�LMMENO��F',32'3,+-�#3B%,($B)#('()&�)4�1%+#'�*($%,(2�%&)-+#%�+&*�56789:;<=9>?�)2'+$%,(2�%&)-+#%�HP(C3,%���QN�*%$)&#',+'%#�'@+'�(&�1%+#'�%&)-+#%�'@%,%�(#�)&%�%R',+�'3,&�+'�'@%�%&*�)4�DE.�+&*�'@+'�'@%�DE0FE�-))B�(#�#@),'%,�S1�T0U�+$(&)�+2(*#�2)$B+,%*�')�'@%�#+$%�-))B�(&�)2'+$%,(2�%&)-+#%O��I@(&C%,�:J7?K6�HLMMEN�B,)B)#%*�'@+'�2,%+'(&C�+&�%R',+�'3,&�+'�'@%�%&*�)4�DE�(&�)2'+$%,(2�%&)-+#%�$+1�B,%G%&'�'@%�4),$+'()&�)4�)2'+$%,#O��V&�),*%,�')�'%#'�'@(#�@1B)'@%#(#.�'A)�G+,(+&'�B,)'%(&#�A%,%�#322%##43--1�2,%+'%*O��W@%�4(,#'�G+,(+&'�A+#�2+--%*�"XYF.�#(&2%�+$(&)�+2(*#�ZTU0ZT[�H\\P]N�A%,%�2@+&C%*�')�"XYF�H'@%�+$(&)�+2(*�#%3%&2%�(&�1%+#'�%&)-+#%NO��V&�'@%�#%2)&*�G+,(+&'�'@%�#+$%�+$(&)�+2(*#�A%,%�2@+&C%*�')�4)3,�+-+&(&%#.�A@(2@�+,%�_&)A&�')�@+G%�+�@(C@�@%-(2+-�B,)B%&#('1O������`(-*0'1B%.�"XYF�+&*�""""�%&)-+#%�B,)'%(&#�A%,%�B,%B+,%*�3#(&C�a3(_b@+&C%�#('%0*(,%2'%*�$3'+C%&%#(#O��X]"�#%3%&2%�+&+-1#(#�#@)A%*�'@+'�'@%�*%#(,%*�#3S#'('3'()&#�@+*�(&*%%*�S%%&�(&',)*32%*.�+&*�3&A+&'%*�$3'+'()&#�@+*�&)'�S%%&�(&2),B),+'%*O��W@%�,%2)$S(&+&'�B,)'%(&#�A%,%�2),,%2'-1�%RB,%##%*�+&*�B3,(4(%*�3#(&C�](0]W"�2@,)$+')C,+B@1�2)-3$&O��V&�C%&%,+-.�+BB,)R($+'%-1�ZMM�$C�)4�A(-*0'1B%�)2'+$%,(2�%&)-+#%�A+#�)S'+(&%*�B%,�Z�Y�23-'3,%O��W@%�-%G%-�)4�B3,('1�)4�'@%�A(-*0'1B%�B,)'%(&�A+#�@(C@%,�'@+&�A@+'�A+#�)S'+(&%*�4),�S)'@�"XYF�+&*�""""�B,)'%(&#O��W@%�B3,(4(2+'()&�)4�S)'@�G+,(+&'#�A+#�($B,)G%*�S1�(&2,%+#(&C�'@%�2)&2%&',+'()&�)4�($(*+c)-%�(&�'@%�A+#@�

Page 103: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������� �������������������������������������������������������� ������������������!��"���������������������������������������������� ������������������������������������������������� ��������������#$#�%"&'� (������)������)��!��*����������������� ����������������������+��������������������������������,������������������������������ -$������������������������������������� ".-�!��"������������-$������������������������������� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��������� (������)/�!��"��� �������������-$������������������������"$0#�����""""� ��������������������������������������������-$���������������������������������)/���!��$1-2345'6������������������7������-$�����������������!��$1-2345'6������������� �������������������������������������-$������������������������ ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������+��������������� 5������89:8;<=����>�!��"�������������������������������������������������������������������?��������!��*��������������?��������������������������������@A�����������������������������>/A��������"$0#� ������B���������������������������� ��������������������������""""��>�A!��4�������������������������� ���������������������������������������������������������)�A� ��������������)A�����>A�����"0$#�����""""� �������!��#���������� �������������������������������������������������������������������������������������?����������������������������������������!��*���$1-2345'6�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������,�������������������� C���89:8;<=������!��*����@A�?���������������������� �������������������������������������+������!��"�������������������������������������D=8EF9GHIFJ;98 )5@*!��������������������������

Page 104: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ ���������������������������������������������������������������������������������������������������� !"#$%$&'�������(�������������������)*����+�������������,���-�����,��������������������.������������,�(�����������/01234-56�����,��������������,�����������������7�����(��8������������������������������9���������������������:�����������������������������������������������������������������������9��������������������������9� ������������������������������9����(�������������������������2������'����.������������,����������������,���9�����(��������������������������������������������������7����������������������������������������������8����'����������,�(������������������,������������������������9�����9��������(�����������/01234-56�����,���������������������������������������,�����������������4��������(����������������������������,�������(�����������;�������������������������������������������������������������0������(�������������������,�����������;�����(���(������������<=���9����>?���,�$@�AB�'�C��DE���7��������,���������������(�����������2�����9���9���������(������������������������(���(�������1�����,'�������:���������������(���������������������������������������������������,�����������������������,����������'������������������������������������������9�����1/�����������FGHGHI JKLMLNNLOPMQNMPKLMRSTUMVWXMRRRRMYZPVP[QW\MQWMLW]YVP[OMVOP[_[PMVWXMaQPL[WM\PVb[c[PMd�����;,�������������������(��������������������������(�������������,���������������������������������,�����7(����.D������;,�������������,�������������������7/e����������������������������������������������������������:������,��D������;,�������������,�����������������7777�����������d������������������������,����������������

Page 105: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������� �������������������������������������������� �������������������������������������������������������� ������� �����!"�#��$$%���&� ���'()�������*����������� ������������������������� ����� ������� ��+,)����������������������-������������� ������ ����� ���������� ��� ��������.����� �� �������������������� �����������������������������������������/����������� ��������������� ����������������������������� � ��������������������������� ����� ����� ��������� �������� ��� ���#��0������������������#�������������� � �������������������� ������������1�� &,����� �� ���#��������*����������� ���������������������� ������� ��� ������������ ������������23456789:9;��� ���!<�������49=4>?3��$(@(%���A���������������������� ���� ������� ������������1�� &,� ��������������� �/��������������������� ��������������� ������������������� � ����������������������������������������� ������� ��������������� �/������&�������� ��������������������������������������������������� ��������������������������������� ����������� ��������� ���������� B��������������������������� ��� ������� ��������� ���� �� ������������1�� &,�����*������-�������# ���� ��������������� ���#������ �/����� ����� ��� ������������� ����1�� &,������������ ������� � �������������������������� ����� ���#��������������#����������������������������� ������������������������C���#��������/����������� ����������������� �����C������������� ������� ��������� ����##���������������� ���������23456789:9;��������� ��������������������������� �������D�E�(������ �/������ ���������������� ������������ ���#���� ������� ������������������������������ �����������

Page 106: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������� ����������� � �������������������������������������� � �������� ��������������� ��������� ����������������������������������������������������� ������������� ���� ��������������������� �� �!������ �"�� �������������#����$%�&�'"����������(������������� ���"�� �������������#���� )�&�'"���*��������������������������������� ����+������(�,�!�������"�� ���������������� ������������������������(�$�!�������� �������������������������������� ������#����$��%�'"����� %�-�'"���� �������(����������������������������������������������������������� ���� ���������� ��� ��(���������������������� ������� ���� �.����� ���������� /�� �������(� ������������������(��+������� ���������������������������������� ������� ���������� ���������������������������� ����012134 567898:;87<=:>?@>>A=BC>D8>B=E;F<=?G>=HI;8IA?B=JK�"����������������� �� ����� ����������� ���� ��������������������� ���L��������������������������������������(������������+������������ ���� �������������� M����� ����������� ���������������������������� ���� �N������������� ���� ����������(N������O��������(� ���������� �����P"������������������������������(��+������� � ��������������� �� ���������������������������� ������(������������*�������������������� ����� �������������� �� ��(�����������#�� ���� ��� �������� �����������(��������������������� ��������(���(����������� ���&�Q����������������� ������������������� ����� ������������&�%�����������RSTUVWXYZYT������������� ��.[���� �TY\T]S��Q�)�/���#��������������������� ��� ��������(���(����������� ��������� �������������� ������� ���� ���#����������������� ������� ������ ���� ���������P"��+������� ��������� �������O�������������������� ���� �� � �����#�����N(�������������(���������������������� �������������%-���� ���

Page 107: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������������� ������� ������������������������ ������������� ��������������������������� ����������������������������� �����!���� ������������������� ��������"�������#�����$� � ���� �������%�����������&����'����������� ����� ������ � ������������������� ������� ���$� ���"������� �������������������������������������&����'����������� ����� ��'��������"������� � �����'���������(�������'������� ������������� ����� ���������������������������)*+,���������������������� ������������������������+-���������������� ������������������ ���������������������'���������������������'���� ��&����'�������(�� ������������ ������ �'������������������������ ��������������������� ����.������������ ��� �'���������������������������������������� �'����������������������� �&��������(�� ������������������� ��/01�/!�������������������������������������������2������� �������������������'��������� ������ �'�����'���������������"������������������.���� ���������������������$���� ������������������������ ��������'���� ������������"������������������.��������������'���� ���� ������������� ��������'��3�������������� ���$���������������� ������ �' �����'��������������� ����������4�� ������������������������� ���'��3������������������������'����� ���� ����3������� ��������������������������������������������� ����5678 9:;<=>=?;:=@A8<B8:CD8EF:DGH=A;>8I=JF:;K8L���������� ����������� ����� ������������������������'����������� �� �������� ���������MN��OPQORST����!�U���*��������������������������������� �������� ������ ������������������ �������� ���� ���������'����������� � ���� ����3������������� � ���������������������������M.���� OPQORST������U��� �������� ����&������

Page 108: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ ����������������������������� ������������������������������������������� �������� ����������������������������� ������������������������������ ������������ ��� !"#$%&'(')����*���� ����� �������������������� ����������������������������������������������� ����������������+*�,����*������� ���� ������� �������������� �-�� ��������*.�� ����� ������������� ������ �����������/��������� ������������������������������� ���������� ����� ������� ����������������� �-�� ����������� ������������� ��� ���������0�� �������1�� ������2 ����� ���34�����/��� ��������5�/��� ���6���������������������� ������� ������ ����������-����������� �������������������� �������7����,�������� ������� ������������ ��� ��������� �������*������������ ����������� ���������������������������������������������� ���������������� ��������*����� ���������������������������� ������8��� ��� ���������������������� ����� ��������������������������������� ��������*����� ���������������� ��������� �������� ������������� ��� ������9��� ���������������� ���������������������� ��� �������� ��������������������*����������� ������������������������������������� ����������������+*�:��0;6����� ���*������������ ������������2�� ���������������� �������*��2�� ������������������ ��������������������� ��������������� � ��������������<����������������������������=��� ��������/�������� ��� ������� �����������>�9����������������������������� �����������������������-��� �� ��� ��� ����7�������� ��������� ������������������������������������������������������������� ����������������� ��������������� ����8�������� �� �����������2�79���������������7����

Page 109: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������� ����������������������������������������������������� ������ ��������������������������������������������������� ��������������������������������������������� ������ ������������������������������ ������� ��������������������� � ������������!���"#���������!��������������������������������� ��������������� ��� �������� �������������������������������������������������������$%������&#'������������(�����������������������������)�*����������+�#����������������������������������������!����������������������������������������+�#��������������������������)�*���,����-���������������������(��������*�.�$!����/01/234��&..#'�������������-�������������� ������ �������������������������������������������������������������������������� ���������������5������������������������������������ ����������������������������� ��������������������������������������������������� �������������� ������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ���������� �� � �������$����/01/234��&.6.'���,����������������������������������������������� ������������������������������������� ���������������������������������� ��������������������������������������������(�������������� �� � ������������������������������������������������������������������ ������ ��������������������!������������������������������������������������������������������������(�����������,������������ ����������������������������������*�.�$!����������������������!�����������'������ �������������������������������������������$%�������+'���7������������������������������ ����������� ��������������������$����������6���'���,��� �� ������,����������!������������������������������*�*�8�������������������������������������������9�*�8������������������������

Page 110: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ���������� ���������������������������������� !��������"���������������� ���������������������� !��������"����������! ���������� ���������������#$%$%& '()*+(,-./)0.1()0()2.3+40(*-.5�������������������������������������������"������������������������������6���������������������������������������������7��������������������������������������������������������������������������������������������������� �������8����������"������������������������7���������������������9:�;<����:�;<=������"������9; >?�=������������"7�������� �������������������������������������������������"���������������� �����������������"�����@������������������95�=�����������������"���96��=���>��������6������������������7���������������������������"���������������5������:�;<����AB ������������7��������������������������������5�������������������:�;<����7�������������������������������"���������������5�����6�������"������������������������5�����:��;<����A; �������������������������������������7������������C�"������6����������������������������������������; >?�����"����7������������������������������������������������:�;<����:�;<����D��������������������������������������������������������������7�9E�!=���E�!����"�������������������������������������"�����������"���������������������������������� �����"��������������������F���������������������������������������������������������������8�����������������������F���������������"�����������������������������������������������������������������������������������������������"7��������������"���"���������������������"��������7��"����������F���������"7���������������

Page 111: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

�������������� ��������������������������������� ��������!!����������������"#���������������!���!�$�����!�������������#�������������������� ���������%��!�����&$���#�����'����$�����#�!�������()�$�������*��*������������!�+�#)����)��,���-������'���*��*��������������)��,�'�������!��'��'������� ������� ��������!�!������!����#������./�'���� �����!���/�'�0�����&$���#�����'����"���������������0�� ����$�����#�!����#�*����'���*��*��������������1+����()����!�����0���������������2���� ���#�!����*�������*���������3!����!�./�'������������*��!�����������#���������������������� ��!�������)��,����#�*��'��4�������*��#���*����������������!����*�������*���������3!�������#������������'�������"�������"#�� ��!������������"#�1�� �������*�#$��&���5�����#�����"#�����������"#���*����*�������&�� �����#$���)�*������1)������4�����*�����'��*��$��!�*�����#�����������������1��#���������$��������������3#������#��������3!����5������������"#����3#�*��� ���������!�����������$$��&�#����#���������� ��!�����������"�������� ����������������"#����/�'�0�����2���� ���#�!����*�������*�����������������*��#���*���������'�������!���� ����6+�()�'��*�����7�1���!���'������������3#����������������������������������*����"��*����$����!�������������������� ������� ��!������������������������������*��� �����!�� �����������"#���������"����#�����)�*�������*���������������89:9;< =>?@>ABCDA>EF>GBCDABCHIGEBCE@JEK98E-��������!"����������� �����������������/��1����$����������$���������#$��������!������������*��0���'����� ���0�!����$/�L�������#$��������!���������������$/�6����**���������*��$�����0��#��������M�����������"��'������#������&$���#�����'����$�����#�!����$/�L���� ������������!��������NO��������'�����������!��������$�������'���$��������$����+���PN��������#����"��&$���#�����$�����#�!���������� ���0����������'�!���#����������������$/�

Page 112: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������������������������� ����������������������������������������� �� ������������������������������������ ��������� ������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ���������� ������������������������������������������ �� ��������� ����� �������������������������������������������������������������������������� ����������� �����������������������������������!"���� �����#��$%���&������� ���'��������������� ����������������������� ����� �� �����!��(%���������������������������������������������������������� �� �� ������������� �� ����������������������� �����������������������)�����'��������������������������������������������������������������� ������������������������������������������ �� �������* �������������������������������������������������������������������+���,����������������������������������������������������������������������� ������,���������������� ���� ��������� ������������������������������������������������&� ����������� ��������������� ���������-���� ������ ��������������.��������������������������������������"������������ ������������������ �������� ����� �����-���� ����������������!���� ���/01/234��5���%���6����������� ���������� ����� ����� ������������������������������������������7�-#8������� ���������� ��9*#(���������� �� ������������:-�����������-���������������� �������������������� ���� �� �'� ��������-������ ������������� ��:-����������������������������� ������������������������ ����������������������!���� ���/01/234��5���%���&� ������������������ �������������.��������������� ����;� ����� ����� ���� �����-���� ����������������<:=-��������!����/01/234��#���%���&��� ���� ��� ����������� ����'������������������������������ ����� ������������������������� �����-�����������������������!<������,�/01/234��#��7>�<������,�/01/234��5��$>�)����/01/234��5��5%�?

Page 113: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ���������� ��� ������� ����������������������������� ������������������ ������������� �������� ��!�� ����������� ��������� ����� ���� "�� ����������� ������� ��#$%&'()*+*,-�� ��.��-�����������������.�������� ������� ������"���� �������-������ ���/"���� ���������� ���0 ������������������������ ������1������������2� ������������������2�3� ���*4%56$�����7�������*4%56$�8��2��"�����������������1�����"������9:���2������ 2����������;�����������������������.���� �������� ����� � �8���<=>?�����<<<<�.���������� ����������� ������������������ ��9:���������������������� ������� ��� ���������9:�����?:�@ABC;ABDE����2������� ������� ����������/"�������2����"��"��� �� ����������� ���� ��F��� �"������� ���� "������ �������"�����"�� �-��������� �������� �������������2��������������� ����� �� �� ������� ��<=>?�����<<<<�.���������1�����������1�"��� �� �������-�� � ����-�������-������ �����2� ������������������ ��7� ����� ���������� ����� ������ ���������1��"��.��2� ���� ������� ������ ��<�����.� "�� ����.��� ��-���������������;����������������������G����-������������ ���"������G������ ������� � ��������������� ��8����� ��-�������2���������� ������������"��"������������ ����������� ���� ����1�������"������ ��������������;��������������� ���8�������"��������"���� �� ������<=>?�����<<<<�.���������� ���� ��������� ������"�� �������� ���� ��F�������������������������������� ����������"��������"���� ������� � ����������������"�� ��������-�� �� �����2�����"�� ������ ������ ������� ������ 0� ��������� �������� �������� ��������� ���"������������9��;�����������H;������"�� �� ����������� ������������I��������� ��������"��"�� ��8�����������I��� �� ��"�������9�� :��"��� �����D J-������� �������������������������������I��� �� ��"���������������������������

Page 114: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������������� ������������� ���������������������� ������������������������������� ���������������� ��� ��������������� �������������������������������������� �������� �������!�� ���������""���������������#������� ����������������������� ��������"�� ���������������������������������$�%�� ����� ���� ��������������������������� �����#�$�&������������� ���� �������������������������������������� ��� �� ���������"�� ���������������������������������� �������� ����"�������������"�������!�� ����������������� ���������'�� ������"���� ���������������"����������������� ���������������������������$�%��������������������'���"������������!����������������������������"�������������(���������������������������������������!��������������������������"������������ ���������"���������������������'��� ��� ������������� �)%%�&�!�� �����������'�"������������������������ *��������������"������������#��������� ���� ���� ������� ����������� �� ����������������"�+�,-���� �.����������������������"���,�/0�������������"������������������"����1234567898:��������������"����#������ �;�������������������������������<*=�"���/>/�����"���������?%�"��������� ���� �*��"���� �����������������

Page 115: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���� ������������ ������������������������������������������������������������������� �����!�����������������������"�#�!�$%��&��������'��������������������������������������������������!��������'�()��*���*���##� ����*�������������������##����������������������+������*����������#����� ����������*��������������%���#���()��*���*���##� ����*����������#�)�*����������������#�������������"��)�� ��������,)�����������##�����������+�������#������#���+���������������������������������� ��������������������������+#��-��������*����������%��.���#��������������������*���##�/����������#�����������#�)�*��������������� '�+���������/����������������*���##�/�����������������������-�����%������������������+����������������"��)�� ����+�#�/�������-��������*���������������"�0%$�+�������1%2'��!��������������"�2%3�����#����������������������������+��������������������������+�#�/�������������������������������������������%��,�4#5$���������������!������������##�+������������������������������������������������#����+������������������6���%����������*��������������#*�������� ��74".589:����������������������+������������������� �����;)��#�������#��#��������������4�������������������������� ����#��#����������������*���#����������%��7�����������������������������������������������������������/�#��������<�#�������������������#��� ����������,�),&���������� ����*���#��������������������'�������!��������������#��+���������������� ���#�)�*����������������#��������9&)=�����������������!���������������"��)�� %��9�������� ���������������������������������������������#������'��!�����������������������������#����#��������������������������������������������������;)��#����%���

Page 116: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����� ���������� ��������������������������������������������� ������������������������������������������������������� ������������������������������������������� ������������������������ ��������������������������������������������������� �������������������������������������������������� ��� ����������������������!������������������������� ����������������� ����������� ������������������������������������"������������������������������������� ���� ����������������������������������������������������������������� �����������������������������������������������������#�����������������������������������������������������$$

Page 117: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����� ����������� ������������������������������������ ����������� !"��#��$%������%��&� ��%�������'(���)�����������*+,-./01,23456*78��9"��9::�;9: <�����'���������=���>�$$?��������@%���'����������������A���@�&���%%���B���������������������<"��C ��%�)�$�%�����)���'�($��;����$��%� ��������������&����$����D����E��%�����)�$�� � ����F�$������ ������ ���$%�%��'�%��)���E�E�E%� ����%�&G$�%�$��*H/0*I-J4KLM*-N*OKN0.3,-J2*P,20L2026*QR8�S"��< !;<��������T�D���U�����U�&��?�))��@��B����� 9"�����)����%������%���$%������)�E��%�����D�%?����%�����$��$��%��%� ����(%�����*+,-./01,23456*7Q�9V"��<V!V;<VV9���A�������W������A���&�������������%�T���X�������?����E���W��������'��������C�����������C�����������������Y���>(�%?�����Z������&����Z��W���[))�� ��#��������� ����Z��W���������G��@��X�����:V"��@%�($%(����)�$?�$T���&(�$���%������E?��E?�%�����&������ �%��&��� �$�G�%����'��E?�$���G��%�9�V�\�'�%��&������(%����(���'��&�����$� ���](��$�� �%��*L3J406*7__�VV��"��<��;<�!���A�������=��W�����@%���D�'����������:S"����������)��&�%?��%?��&�E?����H/041J2�;��*+,-./01,23456*Q7� "���VV�;�V<V���A��'��Z���UG&�$aT���Z�����@%�G����=���9��9"��+,-./01,2345��>�)%?�� �"���Y��>���&����� ���&E��G���A��'&�����@���#�? ��������??�%D����X��@�����Y�&&���$?&� %��@���9���"����E?�;���������)�b340c3-.-..J2*cK0J1-K,L0������E���&����'��";F�� ��'�E��%���� ��E��G� ����%?��F�$%������$�����(�)�$��*d-M0.JML4*d,.4-e,-M-f56*gh�<"���9:S;�9 :���A�D��G��i������Z�?���������������Y())��Z����������"��#�E� ������%������ �E(��)�$�%�����)�WB��)��&��'������'���j�U?��E?����;)���a�;)��$%(���&�%?� �*+,-H0./K,kJ026*Qh�<"��:9!;:9V���

Page 118: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ ���������������������������������������������������������������������� !"#$ %&''&()* +,-������.�/��������������0�1��������2����� ������3���������������������������������������������������������������3���4���5�����������6�������������������� 789(:;< 8= >:8(?;:@A #@8AB&C@)'(D* +E��������.�F/��������������0�G������H�I��� �J��J�H.������3����������������������6����3�������������3K�������K�����4����������������� 789(:;< 8= >:8(?;:@A #@8AB&C@)'(D* +,�����L�.����������������0�M�K����N��� F���O�����6����K������������������������������� P(8A&&Q@:?) 8= 'B& R;'@8:;< SA;Q&CD 8= $A@&:A&) 8= 'B& T:@'&Q $';'&) 8= SC&(@A;* UV�������F.��J��������������1���������W�X��1��������2����I36�������1��1������1��0�I��Y����������I�Y��� �J����3������������6����4������������6����4�����������K�����4����������������� 789(:;< 8= >:8(?;:@A #@8AB&C@)'(D* +V�J������.�FL���������1�2��23�������H�W��������4���������������2��1������H���0�Z�������M�M��� ���X��������������[3������������3��3����������������K�����������3��3���������6��3�����������������������������������������������#;A@<<9) )9\'@<@) 789(:;< 8= P(8'&@: ]B&C@)'(D* +��������.�FF���������O�X��� ���_8<&A9<;( \@8<8?D %;\!;�����I��4���a�Xb�X��������H�����c�����������������������H3K��������W����1���4������0�d�����1�M��� L ��H������������3��[3��������K���������������4������4�����������")AB&(@AB@; A8<@����������� 789(:;< 8= _8<&A9<;( #@8<8?D* +-�����LJ.�L��1���������1�e��H�������G��f���5���e��e�����W�Z��0�����������e�e�����/��c�������������������������������������.K�����4�����������������3���������������������3���3��3� _@A(8\&) ;:Q >:=&A'@8: g >:)'@'9' P;)'&9(* h�F���F�/.F����

Page 119: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������ ������ ������� ��������������������������������� !"#$%�&'�(')*+#,#-*.�/0�1!�2 ��345�6�����7� ������ �89���9 ����:� ���;�< ������������=7��������><���?���>���@�A�������������B" �C#DE'F,�#G�H&#,#-&IF,�2" +&%!E*.�JKL��� ���665���M�����7� �:� ����9��� ����N� �OP����� �N��Q� ������� �R��S�����6����T�>��9�������>�9������>�������������@��7��U�A�7A<9�������@��7���7�����A9�U��������9��>7����9A��@��7���������9��>�����C#DE'F,�#G�!" �V+ E&IF'�2" +&IF,�W#I& !*.�XJ���� �M��45M���������� �Y���Z���������5�����9�����>��9�[������@��7�������������A�������@\9�57������������<�������9���<�����] +F!#,#-*��!" �($DIF!&#'�1E#-EF+�#G�!" �V+ E&IF'�W#I& !*�#G�] +F!#,#-*_V+ E&IF'�W#I& !*�#G�] +F!#,#-*_($DIF!&#'�1E#-EF+.� ��5�������� ���Y� ���;��7�\���7 �:��;������4���=7����@�����9��@@�>����<��7��\�7�U��9��@�����9�������9@�>����aDFE! E,*�b c& d%�#G�H&#e"*%&I%.�f/�M� ��Z�5MZZ������� ���:� ���89���9 ����:������Z����9>��9�<>79������Y�����<������A�����������[�S>�U�����\A�<U�����>�������C#DE'F,�#G�g'#E-F'&I�H&#I" +&%!E*.�fh��� ��45Z������9i �S���� ���9�> �j� ������9�>7�<� �j� ��\� �8� ����>7� �k� �8����>7 ����Q� ���\���� ����k� �Yl�� �T��N� �S?��� ����S� ���;�i�9 �:������Z������Y�@�����7����9�>��9��\�����@�7���������������\�<���\A���9����>�>>����9@�>����������B" �C#DE'F,�#G�H&#,#-&IF,�2" +&%!E*.�J/m�Z4� ��6�Z�5�6��6����9��7��� �=��N����������1E#! &'%n�W!EDI!DE %�F'$�+#, ID,FE�eE#e E!& %��j�>��<��<����T���o�9i[�;�����9��������<�������A���Y�\9���i �j� �����9�S79�� �8���Z����������� ��l�9����� ���<���9@>������@��7����35�����<�7A��95�7�9�����\��<p=�����@9���1*E#I#IID%�d# % &���(%I" E&I"&F�I#,&[�S��>������������1E#! &'�(qeE %%&#'�F'$�1DE&G&IF!&#'.�rf��� �6Z56����

Page 120: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������ ��� ������ ����������������������������� �!��"#�$�%&�������'���%���� �$���(����������!�$�����%�����������)�������(�*+,-./012+,-.34+56/0��������������"#�$�%&������178291:538+5.5891;363<589=1>?�@� �AB@�AA������ ��� �C� ���D��%��� ����������E����F��%�� �!�����������������%�������%���!����$��G���������$��������(�H08+,-58+5918365���%%�1I,<,=1J��� �K@�K��������G� �D��L� ���M�&�� �F��������E����'���$���$������(��������%���������������������1N3/-<9613O1:5363P58961Q+,.502-R=1S>J���� ��B�A��B�@�����T�����& ��� �L��� �L� �������� ��������B���U���&������������!�����%&��������������(�%���������%���1:538+,.502-R=1V>�@�� ��KB�@��KBK@���D��� �� ��� ��������� �W���� �M�� ���� ��� �X���������!� ��� ���X���) ����W���K������F%������ �������!�� ��%$������%���(�����2-,4238388/014<,/.3<59,Y�L�&��%������������!��G�%��������(�$%������ �������!�� �����1N3/-<9613O1Z36,8/69-1:5363PR=1V>V��� ���E����B����D%%���� ����'� ���M���� ����C����������M��!�� ��(����������&�����%����&�������%���1N3/-<9613O1[<3-P9<581:538+,.502-R=1\S��� �@K@�@@����]�%%�� ����� �M����!& �M��C� ������� �#��C� ���D�%% ����U�����EE���C� ������������T���������(���&�������%�������G��&�1:538+,.502-R=1\J��E� �@�A��@�A����_����� ��� ���_����� �L���K��B���:538+,.502-R�����!��!���������M����aL�%����_������ ���X� ���W�����! �D��W�����A����DT��%���������!�����������!������������G����%��!�����������(�&�������%����&�������%��%��1:538+,.502-R=1b���� ��KA���KE����X�� �c� �W��! �� �]�� �C� ���L���%��� �L��D����������L%���� ��d$����� ���!�����������%�����������)�������(���d�����!������ �!����������$�������1*+,1N3/-<9613O1:5363P58961Q+,.502-R=1Se>�KK� ��B@�B��B@�����

Page 121: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������� ����������������������������������������������������� � ������� ��������� ��!��� ������"�� ������������� ������"��������" � ��������������#�#���� ����������$ %&'$ ()*+,-.$ )/$ 0&1234-.$ 5&'6327+189:$ ;;<��=�� >?@@">?@A�����B�������CD#����E�������F���G������� �H��I�JK��� ������L�������M����������L�� �J��������J�������� ���J�����������J�������!������ �����J#����>�" ����J�!�J��$5*++',7$NO3,3),$3,$93)7'4&,).)P1:$;Q�@��E?="E>������JJ�����������JJ���������R��JJ�S���������F ���T�������A>����R���#��K���� �������� ��!�������� �����J� ������ ����K�J���� ������������U�����������!J��F���������� ��!���� �����J� �������J�����J������"E"#�� #���������������� ������ �$%&'$()*+,-.$)/$93).)P34-.$5&'6327+1:$QVW�E���E>�"�EA������JJ�K���I�������A?E���R���� ���!�� ��#������#��� ����K�� ������ ����������!���� �����J� ���������X�K�����JJ���������K���K�� �$93)4&3634-$Y7$93)O&1234-$Z47-:$[Q\�����?="�>����������������]��������L��S������������L�������������A���R���_"���K���J��� "����������������K ��������#���� ��!!�������� �����K���J�#��#����� ��!�7-O&1.)4)44*2$-*+'*2�J�#� ��#�����������Y24&'+34&3-$4).38$()*+,-.$)/$a).'4*.-+$5-7-.1232$9b$Y,c16-734:$W;�E"@���A@"��������� �F��R���������R���K����d����L����F������������E���H�� ��J� ����������!�Y,7'+)4)44*2$&3+-'����J� �������>����� �J������$()*+,-.$)/$93)4&'6327+1:$;[[�=��>�?">�E�������� ��������������H��e������f��I�J ���M����� �J����T������ �g��_��f� ���M��������� �����M�� ��������M��!���������S�����h�������i����R����������������� ����M��h�J�K���M��S����L�������J����f����������d�����!���������!�K�D��������� ��!����#������ ��!�7+'O7)4)44*2$-P-.-473-'�$j,/'473),$-,k$j66*,371:$\l�E�����@"���A���

Page 122: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������� ������������� �� ������������������������������������������������������������������������������������������� ����!���"�����������#$%&'()*#%+#,-'%.)/%0')1-23#455��67� 689���:�������������������:�����;6����������� ����<�������������8;���������������������������=>4���9���������?�@�����A���A�@��B��?���?����B��A�����C��@��B��A���9��;���B��������������������� ����� ��DEF���� �� �������������� @�G���G���� "G��# HI/)#,'2J/)**%0')1-KI)LMNI/K%(#O3#PK%*%0KI)*#,'2J/)**%0')1-23#QR�S�������6� �6T��?��!������U���V�������W���S��������W�����?��!������X��A���9�������������������������������������������ML#12%0N(NJ# �������������!���"��������#Y*%M#Z(N3#4�����;;�����?��G��B��X���A���� ��A�����S�����E��C���9��6��������������G��������!G��������������������#PK%I-K.KI)#[/#PK%1-2JKI)#HI/)3#>\4>�9������ �7����?��"�� E�@G��B�����F�����]�����T�������������������G�������������������������#PK%I-N.KJ/'23#>5��7���96�� 96�;���?��!������X��A���_� ������_�����?��!������A��_���������� ��������������������������������!!������������� �����������������"�����������������#[&'%1N)(#$%&'()*#%+#PK%I-N.KJ/'2#a#b[PM3#c=Q�����T; ;8���?��!������X��A���d�@��]�����e��G��C������;���C������������G������������"G������������Gf#[&'%1N)(#$%&'()*#%+#PK%I-N.KJ/'2#a#b[PM3#c4>�7���TT6 T;����?��!������X��A���d�@��]�����e��G��C���9��8���g������G���������������������������h���h�����������G���������#[&'%1N)(#$%&'()*#%+#PK%I-N.KJ/'2#a#b[PM3#c\>������7;�T 7��8��?�����?�����d������e��U���9������C�G��������������������[JI-N'KI-K)#I%*K�]E_��@��������������������#$%&'()*#%+#i%*NI&*)'#PK%*%023#=>=�7���6;7 6�9��

Page 123: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

��������������� ���������������������������������������������������������� �����������������������������!"�#$%&'()*#++,�-.-���/0�1/0-�������������2�3����4�����00����� ���������������������������������������������������� �������5������������������������������������#$%&'()*#666�/��"��/071/0/�������������2�3����4����������8������������������9�!����� �������������������������18�.�:�1.1��������� ������;������������ �������������<����.�.1=�����������#>?@AB)C?D&(E*#6F�����.0��1.0..�������������3����4��2�4��G���H��8�����0����!���������������� ����������������.�.-1I������������=��01�����J�:�K1�������G�����������JJKK��JK�/�������� �#LB)#M@'(N%O#@P#>?@O@Q?A%O#RB)C?D&(E*#+ST����7/0-17/�7�������������U��8��2�������3��V������"���!����������������W%OC@N)OO%#&EXB?C'(?'C�� �����������< ��������������#M@'(N%O#@P#>%A&)(?@O@QE*#YYZ�7�����.1���"������[��\�������=��H�����3��=��]���������V��2������U��H���.��-�������������������������� ����������������������������������� �����!]1�����������������������������1������������_�������������W%AAB%(@CEA)D#D)ND'#D&(?A&@�������<��++�7�����1��.������� �=�� ����������2� �������4��=���.��.���a�b]c U49�=������������G������������������ ��������������������� ����������������������������������������#>?@?NP@(C%&?AD#defP@(g*#hNQO%Ngi*#Yj����.��1.�.�������k1=����� �]���������������b�G�� �3��8������8��l��������\��H����8��8������U��8�������=��2�l���k�H���.��7������������������������������������������������������� �������������������� �������������1��������#mC)(?A%N#M@'(N%O#@P#n)C%&@O@QE*#,+�"��.7"1.".���8���������\��2�H������� ����H������0����o�������������������������������������������������������������� ����������������������������������������#mN%OE&?A%O#>?@AB)C?D&(E*#YS,�����/10-���

Page 124: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������������� �������� ��������������������������������������������� ��!���"������# !�$��%�� �&# ����'���(�#��#���)����*��+,��,-���#..���� #����..�( ��.���!#�� �/�� � !��01���2�%1 ���#�#3�4��( #������ �2#���&# !���(���#��� �!����������� ����.���#��56789:;<7=>?@A5BC+D�-�EFF�1EFGF����#����H������!����/�%���������(#�����4���I������ �����'����&����4��+�EE�-��������.�(���1���.�(���)�#����#��J����#��/����#�2#�/� ��(����3�"2�� #.#(� #����.���J!�1�������������(��2#2� ��J����#��/�����(�J ���56789:;<7=>?@A5KL+M-��M�,1�ME����0���������H��'�%�N�������+,��F-��O;:P7PQ;?5R?7P97ST;=58U56789:;<7=>?@�+4��� !��2�-�V�� ��4�������������2#�#�������'�V��������+�E��-����������1#�2�(�2�������#����2#���(#� #����.���������56789:;<7=>?@A5WL+E-�,G�X1,GED������(!��#�$��+,���-����� #.��( #�������J!�1�������3�" �������#��2#�������5Y;TTZT[?5[P\5]8T;9ZT[?5O7U;597;P9;=5_5Y]OA5a+X-�E�,1E,�������(!��#�$��'�4#�(!� #�$����+�EE�-���J!�1����������������� ���/�J����#�+�/��-��#�2#�/�J�� �#����� !�����.�(���.�J� !�/��#(�>?;S>898997�5b:;5c8Z?P[T58U5678T8Q79[T5Y:;<7=>?@A5WdK+,D-��FG�D1�FG�G�������II�����4����������'��(�J�II��H��+,��F-��*!����2)���#(���.�J�� �#�1�#/��2�#� ���( #���3� #� ��)�J�����(����2�.� ������J�( ��5c8Z?P[T58U5e;9;S>8?5[P\57QP[T5b?[P=\Z9>78P5e;=;[?9:A5WB+�1,-��1G,�����)����������%�����2�V��V��'����2���� ��+,���-��������.��� ���#����#��(� ��)�#���)��������3�����2���2��#�� #(���(!��#���.������#�/������� �� ����I)���56789:;<7=>?@A5BL+,X-����E1���X�����)����������H��/!�#��H��*����&�������'����2���� ��+�EEM-��*�&��2�#2�� #.#(� #����.��(#2f�����(� ��)� ��#�� !���( #����# ���.��������3�%��J��#�����.� !��J��J�� #����.��DFG���M�����2��,�������#�� ��56789:;<7=>?@A5K+G-��ME,1�MEE���

Page 125: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

���������������� ������������������������������������������� � �������!�"#����$#"������!��#��%���%��&'����()**+),-./*012*0,03414)05�6������$#"���"��"#���"���"�� �� ���!���"��� ����$��!�� �����!���78"���%�������9� "�����������2���:��;<�8;=>��? ��"���@������;���ABC,-DE*C4-B2C-2FB)G/C4*)G2HGC,)*0BC,4IEJ)C4-B��K���% ��L��"��%��"�5������"�����?����"M�6���N����K��������N��������O��������6�����������#��������!� ������ ��8��� "���%�����������9� �%���$���7�����$�"��������2PE,-Q0)B2R-E,B)G2-I2S4-*+0.41C,/T2UUV��8>��:�<8:�����?����@�� ���������?��?��� ��������O��W����������������? �%��"�L������X����"���"�� �� ���%��# ���"����"�������!����� ���2YE,,0BC2ZQ4B4-B24B2(C,E*CE,)G2S4-G-J/T2[�X��<;X8<:;���� #���@�����\��#�"�O��?��� #���@�������\ ������>��=��� �%���$��%������$��!�]/*-QG)1.)2QB0E.-B4)0����� ��� ����"��%������ ����"�� �"����N�"#�#�% ��9� �%���$���2S4-4BI-,.)C4-BT2�����=8>;���� %7����������"��#��������O �� "���������=����]-G0*EG),2*G-B4BJ_2F2G)-,)C-,/2.)BE)G������������"�����������9���$� �7���� 7�� "��������������#%�����&�����=���������� �����#����%��L������������$#"���������a,-C04B21C,E*CE,0b2F2Q,)*C4*)G2)QQ,-)*+��>�������99��>��8>=����cd!���5�L?������������#��������>��������M�8���"��7�"���� � �������!�% ���%���������7������%��" "����e�����"����"� ���"��!�$ "���� ���� %%���� "����%������$�2S4-Q+/14*)G2R-E,B)GT2Vf�;���X�X8�X�������#���$� ��?�"� "�g��? �#���?����� �������?����������c�" %��������� ���!��%�"#��#�9��"#��%�9#�����7 �"����%�h+0,.-C-J)2.),4C4.)5�����!�� "�����# � �"���M "���� ����% $��9��������$�2a,-C04B2(*40B*0_2:�>��>>=8>;X���

Page 126: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

������������������ ��������������� ����������� � �������������� �������� !���!�� � "#�� ��� �������� ����� ��$ ���!���!��� ������ "#�� ��� �%���� "#�� ��� � &���� '()*+,-.')/'0).12*.-+'3-4-.5676'89':,;5<-472='>?�@���AA B���� ���C����D E������D���FF���� ��� �����G��G� ����� �����!� ��#�� ���������� ��#G����'()*+,-.')/'0).12*.-+'87).)H5='?II������@� �JB���� ##K�" ���L��M���#G�����������C��� ���D�N���FA@����� ������E# � ��#�� �������� � O�� � ��� ���!��# �PQ1+<*6'-R*-472*6�ST �'87)2Q1<764+5='I?�B������� ���F��T� !��� ���N��U��"��M����V���E#�������W���FF���T� ���#� ���G� �������������������������%����������������#���� ��#�� X�L%�� �� ������� ������������������% ������ ��'Y+2Q7Z16')/'87)2Q1<764+5'-,['87)\Q56726='?]>������A� �AA�� ��� � ��_���������%������C���G��L��C �������M�����_�����������FBJ��L���������##������% ��GEG��������8-27..*6'641-+)4Q1+<)\Q7.*6� ��#�� �E�G������� !����� 'a,41+,-47),-.'()*+,-.')/'b1\47[1'-,['b+)417,'c161-+2Q='?d�e�����A �e��������%��N�����f�K�&��T���FFF����# ���������F����� ���� ��#�� �����#����'87)2Q1<764+5='>]�@A������@B ���JF��U � &�����W�L������ ��������� �������������� ����g���FFJ��M� #���������� ��� �@F�����"�h�#���� ����"�� ������ �����% ���� ���� ��#�� X����G��G� ������ �E����"�h�����!# O����� ���� ��#�� ������� ���� �� ���� ����#�"�!���!������ �������O���� ������ �� ��#G����'87)2Q1<764+5='>>�@����F@@@ F@J���U ��� ����L�U������D���������FeJ���!G��������������E� K ��i�����E�& ��i�� ���� ��#�� ��� #���"������"# �����% ����!�� ��'PQ1'()*+,-.')/'87).)H72-.'3Q1<764+5='?>j���JeJ �JeB��U������ ��D����U�##�� ��C������J��NgM�� ULC�������#�� �� �% ������!��� ���� �����������G��G� ����#�� �����������G#��������������! �������!�������'k*2.172'Y27[6'c161-+2Q='>?�U E�� �% �����G ���UeeB A@��

Page 127: · PDF fileVeronica P. Quiros Exploring the role of the H4-S4 loop and of the N-terminal His-tag in stabilizing quaternary structure of enolase from Streptococcus pyogenes

����������������� �������������������������������������������������������� �!"#$%&'�"(�)*"'"+*,&'�-� .*/0$12�334� ��5�56578���9�:��;��;���<���=�>���9���?�@�A�����B���8 ��CD����������E���������A��������E�:�:������>����F��� ��<��� ������G��� �H����=�6:�AE�A����������H������������������EE��������A�����=A�:����I%&'10*,&'�)*",� .*/0$12�JKL� ����6������G���=��C���M�������N���OA�>�A��B��N���?�P�H������P���Q ��F�������������������H�����=�����������R�;����A��������A����A���E�����������6N�7S6:���:������������A�T���������:��T����7�Q6U�A�����������)*",� .*/0$12�LL7V ��W7�6W5VV���G���������F�����O������?�X�A�H������N��B��7VV8 ��CEE������E�����Y5�WC�����Y���Z���������������������H�������E��������������66��������E�A������������������������E����������� �[\)]�!"#$%&'2�34� ���6�VW����