PARTIO DE GLUTENINA DE FARINHA DE TRIGO ESPECIAL EM SISTEMAS AQUOSOS BIFSICOS

INGRID SILVA BARBERINO DO NASCIMENTO

2008

INGRID SILVA BARBERINO DO NASCIMENTO

PARTIO DE GLUTENINA DE FARINHA DE TRIGO ESPECIAL EM SISTEMAS AQUOSOS BIFSICOS

Dissertao apresentada Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao de Mestrado em Engenharia de Alimentos, rea de Concentrao Engenharia de Processos de Alimentos, para obteno do ttulo de Mestre .

Orientador (a): Jane Slia dos Reis Coimbra

Co-orientador(a): Renata Cristina Ferreira Bonomo

ITAPETINGA BAHIA - BRASIL

2008

iii

Aos meus amados pais, Cludio (in memoriam) e Miriam;

minha av Aurelina;

Aos meus irmos talo e Claudiane;

Aos meus cunhados Andr e Yvean;

Aos meus sobrinhos Joo, Jlia, Beatriz, Sofia e Isabela,

Por me fazerem to feliz.

Dedico

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, em Quem tenho crido e estou certa que Poderoso, minha imensa e eterna gratido pelo

seu amor e fidelidade.

minha me, pelo exemplo de vida, honestidade e justia. Pelo seu amor incondicional, apoio,

fora, proteo, oraes, carinho, conselhos e presena constante.

minha av pela torcida e incentivo.

Aos meus irmos pela cumplicidade, amor fraternal e conselhos, sempre to sbios.

Aos meus cunhados pelas palavras de incentivo e torcida constante.

Aos meus sobrinhos pelos momentos de alegria.

Universidade Estadual do Sudoeste de Bahia (UESB) e o Programa de Ps Graduao em

Engenharia de Alimentos (PPG-EAL), pela oportunidade concedida.

FAPESB e minha me pelo auxlio financeiro.

Universidade Federal de Viosa (UFV) e ao Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA)

pela oportunidade e pelas condies de realizao do trabalho.

minha orientadora, Profa. Jane Slia dos Reis Coimbra. Pela orientao, incentivo, amizade,

presena, confiana e, sobretudo pacincia.

Aos professores e amigos, Renata Bonomo, Paulo Bonomo e Rafael Fontan, pela confiana, apoio,

incentivo, orientao, motivao e amizade.

Ao professor Lus Henrique Mendes da Silva, pela ateno, cuidado, apoio, incentivo e orientao.

Ao professor e amigo Marcos Antnio Couto, pelo incentivo, confiana e exemplo.

professora Mnica Pirozi, pelo conhecimento compartilhado, material concedido e ateno

constante. Muito obrigada!

Ao Professor Antnio Modesto Chaves, pelo apoio e confiana.

Aos colegas de curso, Rafael, Ellen, Hallana, Tatiana, Daniela, Andria, Eron, Michelle, Gabrielle,

Lidiane, Cndida e Alex, pelo respeito e companheirismo.

Aos amigos do Laboratrio de Processos de Separao (LPS), Aline, Rosana, Fabola, Bruna Mara,

Janana (Jaj), Roney, Priscilla, Toninho e Carol, pelos momentos agradveis.

s amigas Daniela e Rita por todo apoio, generosidade e amizade.

Ao meu amigo de todas s horas, Leandro. Pela presena constante, generosidade, exemplo de f,

tranqilidade, por todos os conselhos e incentivo.

Ana Carolina Cordeiro, pelo cuidado, carinho, ateno, generosidade e amizade.

Gabriela Poliana pela torcida constante, amizade, companheirismo e cumplicidade.

v

s minhas eternas irms, Shirley, Mrcia, Cilia, Yure, Elis, Vernica, Carmem, Roberta (in

memoriam), Dmella, Danielle, Dyala, Alana, Juliana, Manuela, Karyna e Thas que embora no

estejam to prximas, esto sempre presentes. Obrigada pela amizade.

Aos amigos Andria, Rogrio, Ivan, Iago e s meninas do 101 , pelos momentos de alegria.

Aos funcionrios do DTA-UFV pela pacincia, dedicao e lealdade.

Brbara (MEALI-IT) pela pacincia, compreenso e fidelidade.

A todos que contriburam de alguma forma para realizao desse trabalho e no foram aqui citados,

meus sinceros agradecimentos.

vi

Valeu demais, o tempo e o contratempo que essa histria traz; todos os vo momentos ficaram

cheios de esperana e da certeza da presena do Senhor em cada passo por onde eu for...

(Autor desconhecido)

vii

RESUMO

NASCIMENTO, Ingrid Silva Barberino do, Partio de Glutenina de farinha de trigo especial usando sistemas aquosos bifsicos. Itapetinga-BA: UESB, 2008. 68p. (Dissertao - Mestrado em Engenharia de Processos de Alimentos).*

Neste trabalho, estudou-se a aplicao da extrao lquido-lquido para a separao de glutenina de farinha de trigo especial, por meio de sistemas aquosos bifsicos (SAB), compostos por polietileno glicol (PEG), sais inorgnicos e gua. Esta tcnica pode ser usada para purificao de biomolculas em larga escala pela possibilidade de partio seletiva com altos rendimentos. Os sistemas so formados pela adio, gua, de dois polmeros ou de um polmero e um sal em concentraes determinadas. A partio da glutenina foi conduzida em sistemas de diversas composies, a (5, 25, 35 e 45)C, e o comportamento da protena nesses sistemas foi avaliado por meio do coeficiente de partio, em funo do tipo de sal (fosfato de potssio, sulfato de ltio e sulfato de sdio), massa molar do polmero (PEG 1500 e PEG 4000) e concentrao das fases, a fim de se obter o melhor sistema para a separao da biomolcula. O contedo protico em cada fase foi quantificado por espectrofotometria por meio da leitura da absorbncia a 595 nm. Os resultados mostraram que o coeficiente de partio variou entre de 0,2 e 8,0 (oito), ou seja, a protena migrou preferencialmente para a fase superior, rica em PEG. Os maiores valores do coeficiente de partio foram obtidos em sistemas compostos por PEG 4000-Sulfato de ltio a 45 C, seguido do PEG 1500 fosfato de potssio a 25 C. As diferentes tendncias apresentadas pelo coeficiente de partio em funo das propriedades dos sistemas mostra que possvel separar adequadamente a protena da mistura, o que define esse sistema como uma alternativa a ser considerada no planejamento de processos de recuperao e purificao de biomolculas da farinha de trigo.

Palavras-chave: Protena, glutenina, sistemas aquosos bifsicos (SAB).

_________________________

*Orientador (a): Jane Slia dos Reis Coimbra, D.Sc., UFV e Co-orientadores: Renata

Cristina Ferreira Bonomo, D.Sc., UESB e Lus Henrique Mendes da Silva, D.Sc., UFV.

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ABSTRACT

NASCIMENTO, Ingrid Silva Barberino do, Partitioning of gluten in flour of wheat special using aqueos two-phase systems. Itapetinga: UESB, 2008. 68p. (Dissertao - Mestrado em Engenharia de Processos de Alimentos).*

In this work, separation of gluten in was studied using liquid-liquid extraction with aqueous two-phase systems (ATPS) composed by poly (ethylene glycol) (PEG) and an inorganic salt. This technique is an advisable purification process applied to large scale since it provides a selective partition with high yields. The systems are formed by the addition, water, two polymers or a polymer and salt in a certain concentrations. The partition behavior of gluten in ATPS was investigated studying the influence of the type of salt (potassium phosphate, lithium sulfate or sodium sulfate), polymer molar mass (PEG1500 and PEG4000), phase concentrations (tie line length) and temperature in the system. The amount of protein in each phase was made by spectrophotometer through the reading of extinction to 595nm. The results showed that the partition coefficient ranges from 0.2 to 8.0 of (eight), or the protein preferentially migrated to the upper stage, rich in PEG. The highest values of the partition coefficient were obtained in systems composed of PEG-4000 lithium sulphate at 45 C, followed by phosphate potassium - PEG 1500 at 25 C. The different trends for the partition coefficient according to the properties of the systems shows that it is possible to separate the properly protein of the mixture, which states that system as an alternative to be considered in the planning processes of recovery and purification of biomolecules.

Keywords: Protein, glutenin, aqueous systems two-phase.

_________________________

* Advisor (a): Jane Slia dos Reis Coimbra, D.Sc., UFV and Co-guiding: Renata Cristina Ferreira

Bonomo, D.Sc., UESB and Luis Luis Henrique Mendes da Silva, D.Sc., UFV.

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LISTA DE TABELA

Tabela 1: Classificao do trigo............................................................................................. 5

Tabela 2: Sistemas aquosos bifsicos tpicos....................................................................... 13

Tabela 3: Aplicaes de extrao de biomolculas com SAB............................................. 14

Tabela 4: Teor protico total da farinha de trigo.................................................................. 34

Tabela 5: Concentrao de glutenina em soluo de cido propinico ............................... 34

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Gro de trigo ........................................................................................................................ 5

Figura 2: Representao planar parcial da molcula de PEG com os stios disponveis para as

interaes com os demais componentes do sistema. ......................................................................... 15

Figura 3: Diagrama de fases genrico para um sistema contendo PEG e sal, expresso em

coordenadas retangulares................................................................................................................... 19

Figura 4: Espectro de radiao eletromagntica, com destaque para a regio do visvel.................. 27

Figura 5: Influncia da massa molar do PEG sobre k, em funo da temperatura, para SABs

formados por PEG- FFP. ................................................................................................................... 37

Figura 6: Influncia da massa molar do PEG sobre k, em funo da temperatura, para SABs

formados por PEG Sulfato de Ltio. ............................................................................................... 38

Figura 7: Influncia da massa molar do PEG sobre k, em funo da temperatura, para SABs

formados por PEG Sulfato de Sdio. ............................................................................................. 38

Figura 8: Influncia da temperatura sobre k, em funo da massa molar do polmero, para SABs

formados por PEG Sulfato de Ltio. ............................................................................................... 40

Figura 9: Influncia da temperatura sobre k, em funo da massa molar do polmero, para SABs

formados por PEG Sulfato de Sdio. ............................................................................................. 41

Figura 10: Influncia da temperatura sobre k, em funo da massa molar do polmero, para SABs

formados por PEG Fosfato de Potssio. ......................................................................................... 41

Figura 11: Influncia do tipo e concentrao do sal sobre k, para SABs formados por PEG 1500,

Sais de fosfato de potssio (FFP), sulfato de ltio (SL) e sulfato de sdio (SS) a 5 C. ................... 43

Figura 12: Influncia do tipo e concentrao de sal sobre k, para SABs formados por PEG 1500,

Sais de fosfato de potssio (FFP), sulfato de ltio (SL) e sulfato de sdio (SS) a 25C . .................. 44

Figura 13: Influncia do tipo e concentrao de sal sobre k, para SABs formados por PEG 4000,

Sais de fosfato de potssio (FFP), sulfato de ltio (SL) e sulfato de sdio (SS) a 5C. ..................... 44

Figura 14: Influncia do tipo e concentrao de sal sobre k, para SABs formados por PEG 4000,

Sais de fosfato de potssio (FFP), sulfato de ltio (SL) e sulfato de sdio (SS) a 25C. ................... 45

Figura 15: Influncia do tipo e concentrao de sal sobre k, para SABs formados por PEG 4000,

Sais de fosfato de potssio (FFP), sulfato de ltio (SL) e sulfato de sdio (SS) a 35C. ................... 45

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

SAB - Sistemas Aquosos Bifsicos;

pI - Ponto Isoeltrico;

BSA - Albumina do Soro Bovino;

PEG Polietilenoglicol;

Kp - Coeficiente de Partio

[P]sup - Concentrao de equilbrio da protena particionada nas fase superior;

[P]inf - Concentrao de equilbrio da protena particionada nas fase inferior;

TLL - Comprimento da Linha de Amarrao;

[ PEG] - Diferena de concentrao de PEG nas fases superior e inferior expressa em % em massa;

[ Sal] - Diferena de concentrao de sal nas fases superior e inferior expressa em % em massa;

K2HPO4 - Fosfato de Potssio Dibsico;

KH2PO4 - Fosfato de Potssio Monobsico;

Li2SO4 - Sulfato de Ltio

Na2SO4 - Sulfato de Sdio;

VS - Volume da fase superior;

VI - Volume da fase inferior.

xii

SUMRIO

1. INTRODUO.............................................................................................................................................1

2. REVISO DE LITERATURA.....................................................................................................................4

2.1 O Trigo ......................................................................................................................... 4

2.1.1 Classificao do trigo............................................................................................ 5

2.1.2 Caractersticas Nutricionais do Trigo.................................................................... 6

2.1.3 Protenas do Trigo ................................................................................................. 7

2.2 Tcnicas de Fracionamento em Protenas .................................................................. 10

2.2.1 Flow Field Flow Fractionation............................................................................ 10

2.2.2 Cromatografia Lquida de Alto Desempenho ..................................................... 10

2.2.3 Sistemas Aquosos Bifsicos................................................................................ 11

2.2.4 Partio de Protenas em SABs........................................................................... 22

2.3 Espectrofotometria ..................................................................................................... 26

2.3.1 O mtodo de Bradford......................................................................................... 29

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL....................................................................................................30

3.1 Materiais..................................................................................................................... 30

3.2. Mtodos..................................................................................................................... 30

3.2.1 Escolha dos sistemas de trabalho ........................................................................ 30

3.2.2 Quantificao do Contedo Protico Total da Farinha de Trigo ........................ 31

3.2.3 Preparo da Soluo de Glutenina usando cido Propinico .............................. 31

3.2.4 Preparo dos Sistemas Aquosos Bifsicos............................................................ 31

3.2.5 Quantificao da Protena presente nas Fases dos SABs.................................... 32

3.2.6 Clculo do Coeficiente de Partio ..................................................................... 32

3.2.7 Clculo do Comprimento da Linha de Amarrao ............................................. 32

4. RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................................................34

4.1 Quantificao do contedo protico total da farinha de trigo .................................... 34

4.2 Quantificao de protena em soluo de cido propinico....................................... 34

4.3 Estudos dos Sistemas Aquosos Bifsicos .................................................................. 35

4.3.1 Determinao do Coeficiente de Partio da Protena........................................ 35

xiii

4.3.2 Efeito da Temperatura sobre o K ........................................................................ 39

4.3.3 Efeito do Eletrlito sobre o K ............................................................................. 42

5. CONCLUSES ...........................................................................................................................................47

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................................................48

1

1. INTRODUO

Entre as farinhas de cereais, apenas a farinha de trigo tem a capacidade de formar uma

massa forte (ideal para panificao) e coesa que retm gs e produz produtos assados aerados e

leves. Acredita-se que as protenas do trigo, e mais especificamente as protenas do glten so

responsveis por essa caracterstica especial do trigo trigo (MACRITCHIE, 1992; SHEWRY,

1995; SHEWRY et al, 1994, 1995; SHEWRY e TATHAM, 1997; GIANIBELLI et al,

2001).

Um dos objetivos da cincia dos cereais relacionar a composio do gro de trigo s suas

propriedades funcionais. Sabe-se que a composio protica do trigo controla propriedades

especiais que tornam a farinha de trigo adequada para a obteno de produtos fermentados. Atribui-

se glutenina a capacidade de conferir, massa da farinha, resistncia extenso. Entretanto, ainda

esto sendo estudadas as razes dessa relao, e por isso, tem se tornado relevante, determinar o

comportamento individual, ou em misturas complexas, das protenas do glten, de maneira que

essas possam ser diretamente aplicadas para melhorar a qualidade do processamento. Acredita-se

que, do ponto de vista tecnolgico, somente a determinao da composio protica quanto

quantificao das subunidades de protenas so importantes (MACRITCHIE et. al., 1997).

Vrios trabalhos de pesquisa publicados nas ltimas dcadas trazem o perfil de composio

protica de trigos produzidos em diversos pases (LAWRENCE et al, 1987; NG & BUSHUK, 1988;

MANSUR et al, 1990; DONG et al, 1992; MARGIOTTA et al, 1996; GIANIBELLI et al, 1998;

MARGIOTTA et al, 2000), porm, no Brasil ainda no foi concludo um trabalho extensivo de

identificao das subunidades proticas mais diretamente relacionadas com a qualidade de

panificao. Estudos iniciais indicam que a qualidade tecnolgica em algumas variedades de trigo

brasileiro, pode estar relacionada presena de subunidades ainda no apontadas como as

responsveis por quaisquer caractersticas de qualidade (PIROZI, et. al., 2002).

Muitas tcnicas tm sido utilizadas para separar e quantificar as protenas do glten, como

Flow Field-Flow-Fractionation (Flow FFF) e a Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

(CLAE).

Flow Field-Flow-Fractionation (Flow FFF) uma tcnica que permite o fracionamento de

macromolculas por tamanho. A separao atingida pela eluio dos componentes atravs de um

canal fino em forma de fita, sujeito a um campo (centrfugo, eltrico ou trmico) perpendicular ao

fluxo do canal. Componentes que apresentam maior resposta fora exercida pelo campo so

deslocadas para regies mais distantes do centro, em direo parede do canal. Flow FFF foi

aplicada para o fracionamento de protenas do trigo por Stevenson e Preston em 1995. Os estudos

2

demonstraram claramente o tamanho extremamente grande dos maiores polmeros de glutenina e o

potencial promissor da Flow FFF para a caracterizao das gluteninas polimricas na farinha de

trigo (STEVENSON e PRESTON, 1995).

A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) uma tcnica valiosa na

caracterizao da composio de protenas. A aplicao da tcnica para protenas de cereais foi

iniciada por Bietz em 1986. Em combinao com ultrasom, a CLAE por excluso molecular uma

tcnica muito utilizada para caracterizao de protenas do trigo (MacRITCHIE, 1999) e uma das

mais difundidas atualmente. Dados de CLAE por excluso molecular tm sido usados com sucesso

para demonstrar a relao entre cada subunidade protica do trigo com sua funo tecnolgica

(GUPTA, BATEY E MACRITCHIE, 1992; MACRITCHIE, 1999; ANTES & WIESER, 2001). O

princpio de separao baseia-se na habilidade de um componente em penetrar os poros do

empacotamento da coluna cromatogrfica. Molculas com dimetros menores penetram nos poros

menores, que so inacessveis quelas de maiores dimetros, sendo assim separadas.

A dificuldade, porm, na utilizao das tcnicas citadas para as protenas do glten, reside

em separ-la da farinha, de forma intacta ou nativa, pois, devido ao tamanho relativamente grande,

essas protenas so fracionadas antes de serem separadas. Tal condio tem levado ao

desenvolvimento e/ou melhoria de uma tcnica de separao que possibilite a extrao de tais

protenas em condies que mantenham sua estrutura nativa, evitando que ocorra seu fracionamento

e a conseqente perda da sua funcionalidade.

Nos ltimos anos, tem adquirido importncia na biotecnologia a concentrao e separao

de protenas usando os Sistemas Aquosos Bifsicos (SABs).

O emprego de SABs nos processos de separao de biomolculas constitui-se uma

metodologia vivel, pois permite isolar protenas de misturas complexas (como o complexo do

glten) e oferece vantagens como rapidez na separao, alta relao massa da protena/volume total

da soluo, possibilidade de separao das fases em modo contnuo, assim como baixo custo e

facilidade de aplicao em grande escala (ALBERTSSON, 1986).

A extrao da glutenina utilizando Sistemas Aquosos Bifsicos (SABs) surge como uma

alternativa vivel para a sua purificao, uma vez que a tcnica vem sendo utilizada com sucesso no

isolamento de protenas e de outros materiais de origem biolgica sem que haja perda de sua

atividade biolgica (ALBERTSSON, 1986).

Os SABs resultam da incompatibilidade de dois polmeros em solues, ou entre um

polmero e um sal. O material a ser separado se divide entre as duas fases aquosas do sistema sendo

o grau de separao quantificado por meio do coeficiente de partio (K). Este coeficiente funo

de uma srie de variveis experimentais como pH, temperatura, presena de sais, massa molar,

3

concentrao dos polmeros, como tambm caractersticas da protena. Assim, por meio do controle

dessas variveis pode-se separar a protena de interesse.

O presente trabalho buscou determinar as melhores condies de separao da glutenina em

sistemas aquosos bifsicos compostos por polmeros e sais, em funo da massa molar do polmero

e de sua concentrao, do tipo de sal e da temperatura.

4

2. REVISO DE LITERATURA

2.1 O Trigo

O trigo o nome comum dado aos cereais pertecentes famlia Gramneae, gnero

Triticum. uma planta anual, com altura mdia de 1,2 metros e folhas que aparecem apenas no

incio do desenvolvimento, seguidas pela emergncia de uma haste esguia a qual termina numa

espiga formada por gros. considerado um dos mais importantes gros para a humanidade. O

cereal matria-prima utilizada em larga escala na elaborao de vrios produtos, principalmente

na indstria alimentcia (COLLE, 1998; ROSSI et. al., 2004). O tipo de maior interesse comercial

o Triticum aestivum L. (trigo comum) utilizado na panificao, produo de bolos, biscoitos, massas

e produtos de confeitaria.

As primeiras sementes de trigo foram trazidas ao Brasil por Martin Afonso, em 1534 , as

quais foram plantadas na Capitania de So Vicente, hoje correspondente ao Estado de So Paulo. A

partir de ento se estenderam pelo planalto na direo Sul, onde as condies climticas eram mais

favorveis sua cultura. De acordo com SANTOS (2001), a cultura do trigo se desenvolve melhor

em temperaturas de clima temperado e frio.

A partir de 1969/70, a cultura do trigo expandiu-se para as reas de solos mais frteis do

norte e oeste do Paran e, em 1979, o estado assumiu a liderana na produo de trigo no Brasil. A

maior rea semeada e a maior produo foram registradas em 1986/87 quando, em 3.456 mil ha., o

pas produziu 6 (seis) milhes de toneladas do gro.

A produo mundial de trigo representa cerca de 30% da produo total de cereais (FAO,

1999). Seu cultivo bastante disseminado no mundo inteiro. A produo de trigo na Amrica do

Sul representa apenas 2,5% da produo mundial. O Brasil, apesar de contar com somente 16% da

produo total da Amrica do Sul, ocupa o lugar de segundo maior produtor da Amrica latina.

O trigo consumido no Brasil de procedncia nacional e importado. Os estados brasileiros

de maior produo so Paran, Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul e So Paulo. H cinco anos,

o pas tornou-se o maior importador mundial de trigo (SANTOS, 2008). Segundo o Departamento

de Agricultura dos Estados Unidos, esta liderana vem se consolidando desde a safra 1999/00. De

acordo com a estimativa do Governo, as importaes brasileiras de trigo bateram recorde na safra

2006/07 e as despesas com as importaes superaram US$ 1,2 bilho (ROCHA, 2007). As

principais importaes provem dos Estados Unidos, Argentina, Canad e Alemanha.

Os cereais tm um papel de destaque na produo agrcola da maioria dos pases devido a

sua importncia na nutrio humana. O trigo, juntamente com o arroz e o milho, constitui-se numa

importante fonte de calorias e protenas na nutrio humana.

5

Figura 1: Gro de trigo

O gro de trigo (figura 1) contm em mdia: Endosperma (80% do gro), Casca (17,5% do

gro) e Germe ou Embrio (2,5% do gro).

O Endosperma a fonte de farinha de trigo branca. Contm a maior parte da protena do

gro inteiro, e ainda carboidratos, ferro, algumas vitaminas do complexo B, como riboflavina,

niacina e tiamina, amido e fibras. O germe o embrio da semente, contm mnimas quantidades de

protenas, mas grande parte de vitaminas e traos de minerais.

2.1.1 Classificao do trigo

De acordo com a Normativa n 07 do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

(MAPA), os cultivares esto classificados (de acordo com a alveografia e o ndice de Queda) em

cinco classes:

Tabela 1: Classificao do trigo

Classe Alveografia (10-4J) (mnimo)

Nmero de Quedas (segundos) (mnimo)

Trigo Brando 50 200 Trigo Po 180 200 Trigo Melhorador 300 250 Trigo para outros usos

Qualquer < 200

Trigo Durum - 250 Fonte: MAPA (2003)

6

Alveografia o teste que analisa as propriedades de tenacidade e de

extensibilidade da massa. Considera somente o parmetro que indica a fora ou trabalho mecnico,

necessrio para expandir a massa. Esse parmetro determinado a partir da curva obtida pelo

equipamento (alvegrafo), segundo o mtodo padro indicado pelo fabricante.

ndice de queda ( Falling Number ) a medida indireta da concentrao da enzima alfa-

amilase determinada pelo mtodo de Hagberg, descrito pela Cereal Chemistry (1991). O teste no

quantifica a atividade enzimtica, mas permite a comparaao entre diferentes farinhas,

discriminando aquelas que apresentam nveis adequados para panificao (AACC, 1983;

GUARIENT, 1996). O valor expresso no Falling Number dado em segundos. Quanto menor o

tempo, maior o teor de enzima.

As diferentes classes de trigo so utilizadas para fins distintos, conforme segue:

Em trigo brando, so enquadrados os gros de gentipos de trigo aptos para a

produo de bolos, bolachas (biscoitos doces), produtos de confeitaria, pizzas e

massa do tipo caseira fresca.

Na classe trigo po, esto os gros de gentipos de trigo com aptido para a

produo do tradicional pozinho (do tipo francs ou d gua) consumido no Brasil.

Esse trigo tambm pode ser utilizado para a produo de massas alimentcias secas,

de folhados ou em uso domstico, dependendo das caractersticas de fora do

glten.

A classe de trigo melhorador, envolve os gros de gentipos de trigo aptos para

mesclas com gros de gentipos de trigo brando, para fim de panificao, produo

de massas alimentcias, biscoito do tipo crackers e pes industriais (como po de

forma e po para hambrguer).

Na classe do trigo durum, especificamente os gros da espcie Triticum Durum L.,

esto os gros de gentipos de trigo para a produo de massas alimentcias secas

(tipo italiana).

Trigos para outros usos so os destinados alimentao animal ou uso industrial.

Estes envolvem os gros de gentipos de trigo com qualquer valor de fora de

glten, mas no enquadrados em nenhuma das outras classes, por apresentarem

nmero de queda (falling number) inferior a 200.

2.1.2 Caractersticas Nutricionais do Trigo

Os alimentos derivados do trigo, tanto os bsicos resultantes da moagem, quanto os

industrializados com ingredientes adicionais esto largamente presentes nas mesas dos brasileiros.

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So boas fontes de carboidratos, vitaminas, ferro, zinco, traos de outros elementos, e ainda, so

considerados como uma das principais fontes de protena na nutrio humana. So normalmente

pobres em gordura e acar. Entre produtos incluem-se pes, biscoitos creme crackers, massas secas

(macarro, espaguete, etc.) frescas, recheadas, etc. e outros.

2.1.3 Protenas do Trigo

Tradicionalmente, as protenas do trigo so divididas em dois grupos, um deles formado

pelas albuminas e globulinas (no formadoras de glten), representando 15% das protenas totais do

trigo e outro, formado pela gliadinas e gluteninas (formadoras de glten), que compreendem os 85%

das protenas do gro. As gliadinas e gluteninas combinadas possuem a propriedade de formar com

gua, associada energia mecnica, uma rede tridimensional viscoelstica, denominada glten,

extremamente importante devido sua capacidade de influenciar a qualidade dos produtos finais em

panificao. Orth & Bushuk (1972) detectaram que a qualidade de panificao de uma farinha est

intrinsecamente relacionada qualidade das protenas formadoras do glten.

As protenas formadoras do glten apresentam diferenas estruturais que interferem na

funo que as fraes proticas desempenham na massa obtida com a farinha de trigo.

As gliadinas so um largo grupo de protenas com propriedades similares. Tm a massa

molar mdia de 40.000 Da e extremamente pegajosa quando hidratada. Constituem-se de cadeias

polipeptdicas simples (monomricas) apresentando apenas ligaes intramoleculares. Esta

conformao confere uma baixa elasticidade a estas protenas, as quais parecem ser as responsveis

pela coesividade da massa que formam (HOSENEY, 1998).

As gluteninas so um grupo heterogneo de protenas polimricas formadas por

subunidades ligadas por ligaes dissulfeto . Essas subunidades podem ser divididas em dois grupos

de acordo com suas massas molares: subunidade de glutenina de alta massa molar (HMW

GS)

com massas molares entre 90-140 KDa ( BUSHUK, 1994) e subunidades de glutenina de baixa

massa molar (LMW

GS) cujos massas molares esto entre 40-50 KDa. (LEW et. al., 1992). So

fisicamente, elsticas e flexveis. A elasticidade uma propriedade caracterstica do glten de trigo

prprio para a panificao e, segundo HOSENEY (1990), nenhum outro cereal apresenta protenas

com capacidade para a formao de massa como a do trigo.

As protenas do glten so as protenas de reserva do trigo. Elas so facilmente isoladas em

forma relativamente pura, pois so insolveis em gua. Quando isolado a partir da farinha de trigo,

o glten contm (em base seca), aproximadamente 80% de protena e 8% de lipdios, o restante

composto por carboidratos e cinzas.

8

O glten responsvel pela estrutura do po. Forma uma rede elstica e contnua que retm

o gs carbnico liberado durante o processo de fermentao da massa pelas leveduras, permitindo,

assim, sua expanso (MANDARINO, 1993). Acredita-se que as protenas do glten so

responsveis no apenas pelas propriedades viscoelticas da massa de farinha de trigo, mas tambm

pela capacidade de reteno de gs durante a fermentao, e ao menos em parte, pelo

endurecimento da massa durante o cozimento (HOSENEY, 1998).

Ainda desconhecido porque as protenas do glten interagem entre si para formar uma

massa forte. Entretanto, vrios fatores podem estar relacionados com essa capacidade, como:

proporo glutenina-gliadina; distribuio mdia da massa molar, presena de certos grupos de

glutenina com alta massa molar, e presena de certas subunidades de gliadina.

As protenas classificam-se ainda de acordo com sua solubilidade: Hidrossolveis

(albuminas), solveis em soluo salina (globulinas), solveis em lcool (prolaminas) e solveis em

soluo cidas e lcalis (glutelinas). A prolaminas e glutelinas do trigo so conhecidas como

gliadinas e gluteninas, respectivamente (POMERANZ, 1987). As gliadinas so prolaminas

monomricas que podem ser divididas em trs grupos com base no contedo de enxofre e massa

molare: As -, e -gliadinas. As gluteninas contem dois grupos de subunidades; os de baixa massa

molar (LMW) e de alta massa molar (HMW) (SHEWRY et al., 1986). As subunidades de

gluteninas LMW tm pesos moleculares de 40000 a 50000. As subunidades de gluteninas HMW

tm pesos moleculares de 95000 a 136000 (SHEWRY et al., 1986). A massa molar de uma

molcula de glutenina polimrica pode ser de vrios milhes (WAHLUND et al., 1996). As

subunidades diferem em hifrofobicidade, sendo as LMW as mais hidrofbicas e as MMW as menos

hidrofbicas (SEILMEIR et al., 1987).

2.1.3.1 Protenas Monomricas

As protenas monomricas so aquelas que apresentam cadeias com ligaes simples ou

que apresentam em sua estrutura apenas ligaes dissulfdicas intramoleculares. Existem trs

classes principais neste grupo de protena: albuminas, globulinas e gliadinas.

Albuminas e globulinas so compostos com baixa massa molar, sendo na maioria enzimas

ou enzimas inibidoras. Apresentam massa molar inferior os encontrados para as gliadinas (< 30000

Da). A composio de aminocidos difere das protenas do glten. Apresentam baixa quantidade de

cido glutmico e muita lisina (MACRITCHIE & LAFIANDRA, 1997; GIANIBELLI et al, 2001).

As gliadinas so prolaminas monomricas que podem ser divididas em quatro grupos com

base na mobilidade em Acid-PAGE , -(mobilidade mais alta), -, -, e -gliadinas (mobilidade

mais baixa). A massa molar varia de 30000 a 40000 Da para os tipos -, - e -gliadinas, e 60000 a

9

80000 Da para o tipo -gliadinas. Apresentam extensivo polimorfismo podendo ser utilizadas na

identificao de cultivares de trigo hexaplide e tetraplide (MECCHAM e KASARDA, 1978;

MacRITCHIE e LAFIANDRA, 1997; GIANIBELLI et al, 2001).

As gliadinas so geralmente correlacionadas s caractersticas de viscosidade e

extensibilidade do glten. Embora, alguns autores associem gliadinas especficas com qualidade de

panificao, estas protenas no devem ter um efeito direto na qualidade do trigo em termos de fora

da massa (GIANIBELI et al, 2001). Segundo Pyler (1988) fraes de gliadina com massa molar

mais elevada afetam significativamente as propriedades de mistura e reolgicas da massa de trigo.

2.1.3.2 Protenas Polimricas

Protenas polimricas so aquelas que apresentam ligaes dissulfdicas intramoleculares e

intermoleculares. So considerados trs grupos principais, albuminas de alta massa molar, triticinas

e glutenina (SANTOS, 2008).

As gluteninas so protenas polimricas de elevada massa molar, variando de 100000 Da a

milhes Da. So formadas por dois grupos de subunidades, as de baixa massa molar (LMW-GS) e

de alta massa molar (HMW-GS) (SHEWRY et al., 1986). As subunidades de gluteninas LMW-GS

se subdividem de acordo com a mobilidade em SDS-PAGE em dois grupos, subunidade B e C, com

peso molecular igual a 40000Da e 50000Da, respectivamente (SING e SHEPERD, 1988). As

subunidades de gluteninas HMW-GS ou tipo-A tm massa molares de 95000 a 136000 Da

(SHEWRY et al., 1986).

As subunidades LMW-GS representam 60% do total de gluteninas presente no endosperma

do trigo, entretanto recebem menos ateno por parte dos pesquisadores que as HMW-GS. Isto

ocorre em parte pela similaridade de massas molares com as gliadinas o que dificulta a identificao

em SDS-PAGE unidimensional (BIETZ e WALL, 1973; GIANIBELLI et al, 2001) A composio

de aminocidos e a estrutura das LMW-GS so consideradas similares as -gliadinas (KASARDA,

1989).

As subunidades de HMW-GS embora seja um dos componentes minoritrios das protenas

do endosperma de trigo so primordiais no processo de panificao, por ser o principal determinante

da elasticidade do glten (TATHAM et al 1985). Muitas variedades apresentam quatro ou cinco

subunidades de HMW-GS. Frequentemente elas diferem em mobilidade em SDS-PAGE podendo

ser divididas em tipo x e y (PAYNE et al., 1984). Em variedades com cinco subunidades, trs delas

apresentam elevada mobilidade (subunidade x) e duas de baixa mobilidade (subunidade y). Em

variedades com quatro subunidades, duas so tipo y e duas x (KASARDA, 1989). Subunidades de

HMW-GS apresentam contedo elevado de prolina e glicina e baixo contedo de lisina.

10

2.2 Tcnicas de Fracionamento em Protenas

Osborne (1907) realizou uma das primeiras reportagens cientficas no fracionamento das

protenas dos cereais. Por adio de uma soluo salina farinha, as fraes de albumina e

globulina foram extradas. A partir desse extrato, as globulinas foram precipitadas por dilise. Em

um passo seguinte, as prolaminas foram extradas com soluo aquosa de etanol (70%) e as

gluteninas foram posteriormente extradas por uma soluo de cido actico diludo. Essas fraes

foram denominadas de Classes Proticas de Osborne . Mais tarde, outros procedimentos de

fracionamento foram desenvolvidos com diferentes solventes, como uria (POMERANZ, 1965),

dodecil sulfato de sdio (SDS) (DANNO et. al., 1982; BOTTOMLEY et. al., 1982), bem como,

outras tcnicas foram utilizadas, que no baseadas na solubilidade das protenas, como as que

seguem.

2.2.1 Flow Field Flow Fractionation

Flow Field-Flow-Fractionation (flow FFF) uma tcnica que permite o fracionamento

de macromolculas por tamanho. A separao atingida pela eluio dos componentes atravs de

um canal fino em forma de fita, sujeito a um campo (centrfugo, eltrico ou trmico) perpendicular

ao fluxo do canal. Componentes que apresentam maior resposta fora exercida pelo campo so

deslocadas para regies distantes do centro, em direo parede do canal. Uma vez que o fluxo

laminar atravs do canal produz um perfil parablico, a ordem de eluio dos componentes

determinada pela posio relativa. A linha de fracionamento, a resoluo e o tempo de corrida

podem ser ajustados variando o fluxo do canal e a fora do campo.

Flow FFF foi aplicado para o fracionamento de protenas do trigo por Stevenson e Preston

em 1995. Os estudos demonstraram claramente o tamanho extremamente grande dos maiores

polmeros de glutenina e o potencial promissor da flow FFF para a caracterizao das gluteninas

polimricas na farinha de trigo. Entretanto, necessrio o fracionamento da glutenina em suas

subunidades para a aplicao desta tcnica. Adicionalmente, o tamanho reduzido das amostras

utilizadas na tcnica (aproximadamente 1 g) pode ser uma desvantagem quando o isolamento da

protena solicitado para estudos posteriores (STEVENSON & PRESTON, 1995).

2.2.2 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) uma tcnica valiosa na quantificao

da composio de protenas. A aplicao de CLAE para protenas de cereais foi iniciada por Bietz

em 1986. Em combinao com ultrasom, a CLAE por excluso molecular uma tcnica poderosa

para caracterizao de protenas do trigo (MacRITCHIE, 1999).

11

A tcnica tem sido extensivamente utilizada em estudos de protenas do endosperma de

cereais, particularmente no trigo, para analisar a distribuio molar das protenas polimricas

(Gupta et al. 1993), alguns parmetros como a percentagem de protenas polimricas (PPP),

percentagem de gliadinas (PG), relao glutenina/gliadina (GLU/GLI), protenas polimricas na

farina (FPP), e porcentagem de protenas polimricas no extraveis (%UPP), e parmetros

utilizados para medir a qualidade da farinha em panificao (HUEBNER & WALL, 1976;

DACHKEVITCH & AUTRAN, 1989; MacRITCHIE & LAFIANDRA, 1997).

O princpio de separao baseia-se na habilidade de um componente em penetrar os poros

do empacotamento na coluna de extrao. Molculas com dimetros menores penetram nos poros

menores, inacessveis quelas de maiores dimetros, sendo assim separadas. A dificuldade reside

em separ-la da farinha, em forma intacta ou nativa, para que possa ser devidamente caracterizada

em termos funcionais.

Assim como na Flow-FFF, nessa tcnica existe a necessidade de quebrar a protena em suas

subunidades, o que impossibilita estudos de suas propriedades em seu estado nativo. Tal condio

tem levado necessidade do desenvolvimento ou melhoria de uma tcnica de separao que

possibilite a extrao da protena em condies que mantenham a sua estrutura evitando seu

fracionamento e a conseqente perda da funcionalidade.

2.2.3 Sistemas Aquosos Bifsicos

O primeiro pesquisador a detectar e relatar a possibilidade de formao de duas fases em

que o principal constituinte de ambas a gua foi Beijerinck, em 1896.

Ao misturar gar e gelatina, em gua, observou a formao de duas fases: uma inferior rica

em gar e uma superior rica em gelatina. Posteriormente, obteve a formao de fases aquosas com

um sistema gua-amido-gar. Porm, apenas em 1956 Albertsson iniciou os estudos sobre a partio

de compostos de origem biolgica por meio de tais sistemas e descreveu uma srie de compostos

que, quando em soluo aquosa, promovem a formao de fases; normalmente, pares de polmeros

ou um polmero e um sal cujas solues apresentam miscibilidade parcial entre si.

Desde ento, as pesquisas na rea tm-se aprofundado, tornando a utilizao dos SABs,

importante ferramenta na partio e concentrao de compostos como clulas vegetais ou animas,

microorganismos, fungos e seus esporos, cloroplastos, enzimas, protenas, vrus, entre outros

(HATTI-KAUL, 2001), de maneira que se tm acumulado conhecimentos sobre caractersticas de

partio de diversas substncias nesses sistemas.

Os Sistemas Aquosos Bifsicos so capazes de promover a partio de solutos em um meio

pouco agressivo de forma que substncias, como, macromolculas, partculas virais, fragmentos de

12

clulas ou mesmo organelas celulares possam ser particionadas e purificadas sem perda de atividade

biolgica. A descrio de diversos SABs tipo polmero-polmero e polmero-sal, com representativo

nmero de dados para o equilbrio de fases e partio/purificao de diferentes compostos,

encontrada na literatura (ALBERTSSON, 1971; ZASLAVSKY, 1995).

Os SABs so formados por duas fases lquidas que se encontram em equilbrio

termodinmico. Resultam, por exemplo, da incompatibilidade de dois polmeros em solues, como

polietilenoglicol (PEG) e dextrana ou entre um polmero e um sal (PEG e Fosfato de Potssio)

(COIMBRA, 1995; ALBERTSSON, 1986). Essas espcies qumicas quando misturadas em

determinadas composies e temperaturas, dividem-se em duas fases de composies diferentes,

porm em equilbrio termodinmico. As fases possuem propriedades termodinmicas intensivas

distintas, como ndice de refrao, composio e densidade. Essas fases so separadas por uma

interface que a regio onde as propriedades termodinmicas intensivas de cada fase transitam para

valores diferentes, sempre tendendo ao valor daquela propriedade no seio da oura fase em equilbrio

(CARVALHO, 2004). A purificao resultado de uma partio diferenciada da molcula-alvo e

impurezas entre as duas fases lquidas.

Dentre os diferentes SABs, o mais estudado e comumente empregado aquele composto

por PEG, dextrana e gua. Separaes de macromolculas biolgicas, membranas celulares e

clulas, realizadas com esses sistemas, geram uma fase superior rica em PEG, e outra inferior rica

em dextrana. As fases contm entre 80% e 90% de gua o que favorece a estabilidade de

biomolculas durante a separao, quando comparada com sistemas de extrao orgnicos

tradicionais (TJERNELD, 1992). Os SABs apresentam ainda, outras vantagens em relao aos

mtodos de separao e purificao de biocompostos, como: simplicidade e rapidez na preparao;

baixo custo e possibilidade de aplicao em grande escala e ainda, permite concentrar a protena de

interesse em uma das fases controlando o volume das mesmas.

As biomolculas, ou solutos, presentes nos SABs distribuem-se entre as duas fases aquosas

segundo o coeficiente de partio, Kr, definido como:

.inf

.sup

M

Mk r (1)

Onde [M]sup e [M]inf. so as concentraes do soluto na fase superior e inferior. Essa

distribuio governada por um grande nmero de fatores, tais como: natureza e tamanho da

partcula alvo; constituio, tamanho e estrutura molecular do polmero; temperatura; natureza do

eletrlito e pH do sistema (ALBERTSON, 1986).

13

O Kr depende tanto das caractersticas da biomolcula que se distribui (massa molar, carga,

hidrofobicidade superficial, etc.) quanto da natureza do SAB usado, como reagentes que formam as

fases, massa molar, concentrao dos reagentes, pH, forca inica, entre outras. Embora a

manipulao das propriedades do sistema, tornando predominante um tipo de interao, venha a ser

uma forma de controlar a partio, a predio e a interpretao da partio de biopartculas em

sistemas aquosos bifsicos ainda uma difcil tarefa (HATTI-KAUL, 2001).

Os SABs podem ser classificados em dois grupos principais: os compostos por diferentes

polmeros e os que contm apenas um polmero. A tabela 2 apresenta alguns exemplos de SABs.

Tabela 2: Sistemas aquosos bifsicos tpicos

Polmero Polmero

Polietileno glicol Dextrana (Dx)

Ficoll

Hidroxipropil-amino (HPS)

Polivinil lcool (PVA)

Polivinil pirrolidona (PVP)

Maltodextrina (MD)*

Maltodextrina**

Polipropileno glicol Polietileno glicol (PEG)

Polmero Sal

PEG-copolmeros (NH4)2SO4

NH2CO2NH4

Na2HPO4

K2CO3

K3PO4

K2HPO4, KH2PO4

Na2SO3

FeSO4

(ROGERS, 1999; MACHADO, 1999).

Em princpio, todos os tipos de SABs podem ser empregados na separao de biomolculas,

embora para uso em escala industrial, a dextrana apresente custo muito alto. Os sistemas PEG - Sais

14

apresentam custo reduzido e propriedades fsicas favorveis operao em larga escala, como por

exemplo, elevada seletividade e diferenas de densidade e viscosidade entre as fases adequadas para

o trabalho com equipamentos de extrao disponveis no mercado (SINH, 1996). A separao de

fases atingida mais rapidamente em funo da menor densidade da fase salina em relao fase

polimrica, o que facilita o uso de sistemas polmero-sal em aplicaes industriais. Estes sistemas

so formados a temperatura ambiente, sendo a fase superior rica em PEG e a fase inferior rica em

sal (HUSTED, 1985; ZUIGA, 2000). A purificao de protenas, em grande escala, empregando

SABs em uma das etapas do processo considerada uma tcnica alternativa e economicamente

vivel aos processos tradicionais de purificao de biomolculas.

Algumas aplicaes de SABs so listadas na tabela 3.

Tabela 3: Aplicaes de extrao de biomolculas com SAB

Biomolcula Sistema

Pululanase

Formaldeido desidrogenasse

Fumarasse

-galactosidade

-glucosidade

Superxido dismutase

Lactato desidrogenasse

PEG-Dx

PEG-Dx

PEG-fosfato

PEG-fosfato

PEG-fosfato

PEG-fosfato

PEG-aquafase

(COIMBRA, 2003).

2.2.3.1 Fundamentos sobre a formao dos SABs

A formao de duas fases durante o processo de mistura de solues aquosas de dois

polmeros (ou de um polmero e de um sal) depender das interaes intermoleculares - expressas

em termos da energia livre - entre os constituintes formadores do sistema. Sero tambm estas

mesmas interaes as responsveis por todas as propriedades fsico-qumicas presentes nas duas

fases, como por exemplo, a distribuio dos diferentes componentes no sistema, da relao de

volumes entre as fases, da diferena de potencial eltrico e do excesso de energia livre associados

interface, do coeficiente de partio de um soluto especfico, etc. (DA SILVA & LOH, 2006).

Para cada sistema, tm-se pares de componentes que possuiro interaes

termodinamicamente favorveis e pares que geraro interaes que aumentaro a energia livre do

15

sistema e, por isto, sero consideradas desfavorveis. Naturalmente estas interaes sero

dependentes do estado termodinmico do sistema, isto , da composio, temperatura e presso (DA

SILVA & LOH, 2006).

Para que ocorra a separao de fases entre duas solues aquosas de polmeros necessrio

que a energia livre de Gibbs do sistema, quando os polmeros esto em fases distintas, seja

minimizada.

O critrio termodinmico fundamental para o equilbrio de fases a igualdade dos

potenciais qumicos ou eletroqumicos dos componentes em todas as fases do sistema (SMITH et

al., 2000; LEVINE, 1995).

Existem na literatura muitos modelos para representar o comportamento de fases dos

SAB s. Estes tm sido desenvolvidos para descrever o mecanismo de separao de fases na

ausncia de dados experimentais. Esta tentativa visa facilitar a compreenso das interaes que

governam a partio de solutos e partculas em sistemas aquosos bifsicos (ZASLAVSKY, 1995).

O mecanismo molecular para a formao dos sistemas aquosos bifsicos que ser

apresentado a seguir foi proposto por Da Silva & Loh (2000) para sistemas formados por PEG

3350, sulfato de ltio ou sulfato de sdio e gua. Este modelo fundamentado em dados

calorimtricos e em dados de equilbrio.

Para uma melhor compreenso do mecanismo proposto, deve-se conhecer a estrutura

molecular do polmero, no caso do presente trabalho, o polietilenoglicol (PEG) [HO-(CH2-CH2-

O)n- H]. O polietileno glicol, (Figura 2), formado por unidades de xido de etileno, em que cada

unidade contm stios ativos (oxignios portadores de pares de eltrons livres), onde so formadas

as interaes com as molculas de gua e com os ons dissociados do sal (ctions e nions).

Figura 2: Frmula estrutiral do polietilenoglicol.

Quando inicialmente, PEG, sal e gua so misturados, uma soluo formada em

decorrncia da energia livre de Gibbs (G) da soluo ser menor do que o somatrio das energias

livres de Gibbs dos componentes puros, como relacionado pela Equao :

Gsol. < G*

peg + G*

sal + G*gua (2)

sendo Gsol. a energia livre de Gibbs; da soluo, o asterisco corresponde cada componente no seu

estado puro.

16

Quando em determinada proporo os trs componentes so misturados, forma-se um

sistema aquoso bifsico. As duas fases lquidas sero formadas aps o tempo necessrio para que o

equilbrio seja atingido. A formao do SAB ocorre, pois o somatrio da energia livre de Gibbs de

cada fase menor do que a energia livre de Gibbs do sistema homogneo naquelas concentraes

de polmero e de sal (Equao 3).

G + G < Gsol (3)

sendo G e G as fases do sistema aquoso bifsico.

Desta forma, pode-se dizer que os SAB s so formados para diminuir a G de uma soluo

aquosa de PEG, sal e gua, pois em determinadas propores destes componentes, o sistema

formado por duas fases separadas apresenta menor nvel energtico, sendo mais favorvel do que a

soluo. Sabendo-se que G funo da entalpia e da entropia, pode-se concluir que so estas duas

propriedades termodinmicas que determinam a separao das fases em sistemas aquosos bifsicos.

Os SAB s so formados a partir da compensao dos fatores entlpicos e entrpicos de forma que

se minimize a energia livre de Gibbs, temperatura e presso constantes.

Para que a anlise entlpica de SAB s compostos por polmero-sal-gua seja feita, deve-se

comparar os tipos e magnitudes das interaes intermoleculares antes e depois da separao das

fases. Primeiramente, para que ocorra a mistura dos componentes puros, necessrio o rompimento

das interaes entre as molculas de gua (gua-gua), assim como das interaes entre as

molculas do polmero (PEG-PEG) e do sal (on-on). Para romper estas interaes, deve-se

fornecer energia ao sistema. E, medida que estas interaes so quebradas outras interaes so

formadas, com liberao de energia, como as interaes PEG-gua, on-gua e PEG-on. Desta

forma:

solH= a-aH+ p-pH+ s-sH + a-pH+ a-sH + p-sH (4)

endotrmicas .... exotrmicas

sendo H a variao da entalpia. O subscrito a-a corresponde s interaes entre as molculas de

gua, p-p entre as molculas do polmero, s-s entre as molculas do sal, a-p entre a gua e o

polmero, a-s entre a gua e o sal e p-s entre o polmero e o sal.

E, segundo dados experimentais de entalpia de soluo, a dissoluo de eletrlitos em

soluo aquosa de PEG um processo exotrmico (DA SILVA & LOH, 2000). Isto significa que na

formao de uma soluo aquosa de PEG e sal a liberao de energia na formao das interaes

(PEG-gua, on-gua e PEG-on) maior do que a quantidade de energia absorvida na quebra das

interaes entre os componentes puros.

17

Para avaliar o efeito entrpico, deve-se analisar a entropia de duas maneiras: em relao

configurao (nmero de formas diferentes de se arranjar as molculas na soluo) e em relao

conformao (estrutura molecular).

Quando se mistura PEG, sal e gua aumenta-se a entropia configuracional do sistema em

relao aos componentes nos estados puros, pois o aumento do tipo e da quantidade de substncias

aumenta o nmero de formas diferentes de se arranjar as mesmas na soluo. No entanto, as

interaes PEG-gua so caracterizadas pela formao de camadas de solvatao ao redor das

molculas de PEG, diminuindo a entropia translacional das molculas de gua. O mesmo vlido

quando as interaes on-gua so estabelecidas, ou seja, o grau de liberdade translacional das

molculas de gua diminui devido solvatao dos ons do sal. Mas, como ao mesmo tempo so

formadas interaes on-PEG, a entropia configuracional do sistema aumenta, ou seja, para que os

ons se aproximem da cadeia do polmero, as molculas de gua que antes solvatavam os ons e o

PEG devem ser afastadas (quebrando as camadas de solvatao e liberando as molculas de gua no

meio) possibilitando a aproximao do sal com o polmero e a interao on- PEG. medida que as

molculas de gua so liberadas das camadas de solvatao, o grau de liberdade translacional das

mesmas aumenta, com conseqente incremento da entropia configuracional do sistema.

A entropia conformacional do polmero ir variar com a sua concentrao na soluo. Em

solues diludas do polmero, as ligaes carbono-carbono esto na forma TRANS, devido sua

interao com as molculas de gua, tornando a cadeia da macromolcula linear. Ao concentrar

uma soluo polimrica, a conformao muda espontaneamente para a forma CIS, pois as ligaes

passam da forma TRANS para a CIS (enovelada e mais energtica) aumentando a diferena de

entropia entre as fases do sistema (CARVALHO, 2004).

A partir da definio da energia livre de Gibbs pode-se vincular os efeitos entlpicos e

entrpicos:

mixG = mixH T mix S (5)

sendo H a entalpia, S a entropia, T a temperatura e o subscrito mix relativo mistura.

Desta forma, a variao da entalpia de soluo na formao da soluo aquosa de PEG e sal

exotrmica, ou seja, negativa e favorvel para a minimizao de G, mas ainda no se sabe se a

entropia do sistema positiva ou negativa. Ento, se pode dizer apenas que para que ocorra a

formao da soluo aquosa de PEG e sal necessrio que a compensao dos fatores entlpicos e

entrpicos resulte na minimizao da G.

Para que ocorra a separao de fases na soluo deve-se aumentar a concentrao do sal at

que ocorra a saturao do polmero pelo sal. Esta saturao no implica que todos os stios do PEG

18

estejam ocupados pelos ons do sal, mas sim que o sistema atingiu um estado energtico no qual a

formao de mais interaes PEG-sal no favorvel. O ponto de saturao aquele em que a

densidade de cargas eltricas (dos ctions e nions) ao longo da cadeia do polmero atingiu um

ponto mximo. Este estado energtico desfavorvel, que leva saturao do polmero, pode ser

explicado pelo surgimento de foras de carter repulsivo devido aproximao de cargas de mesmo

sinal ou devido a mudanas na estrutura molecular da macromolcula. As variaes na estrutura

molecular do polmero, e ento na entropia conformacional do mesmo, podem ser provocadas por

alteraes na concentrao da soluo.

A adio de sal ao sistema saturado faz com que os ons fiquem livres na soluo e voltem a

ser solvatados pelas molculas de gua provocando a diminuio da entropia do sistema, com

conseqente aumento da G. Neste ponto, o estado energtico da soluo aquosa de PEG e sal no

mais favorvel. O sistema, ento, divide-se em duas fases, formando o SAB, sendo cada fase uma

soluo aquosa de polmero e sal. Na maioria dos sistemas formados, o componente em maior

quantidade nas duas fases a gua, estando na sua maioria livre na soluo, aumentando a entropia

do sistema. As molculas de gua foram liberadas das camadas de solvatao ao redor do PEG e do

sal para que novas interaes, principalmente do tipo PEG-PEG na fase superior e on-on na fase

inferior, pudessem ser formadas, o que aumenta a entropia do sistema.

A dissoluo de eletrlitos em soluo aquosa de PEG um processo exotrmico,

entretanto no momento em que ocorre a saturao do PEG pelo sal ocorre um aumento da entalpia,

caracterizado por uma descontinuidade (ou seja, um salto) na curva que representa a entalpia de

dissoluo do sal em uma soluo de PEG (DA SILVA & LOH, 2000). Por conseguinte, para

minimizar a G e formar o SAB, considerando que a variao da entalpia neste processo positiva e

desfavorvel, pode-se dizer que a variao da entropia deve ser positiva. Por conseguinte, a

formao de SAB s governada por fatores entrpicos.

A mesma anlise pode ser feita para a adio de PEG ao sistema, considerando que a

proporo PEG/sal necessria saturao a mesma nos dois casos. A soma de G da fase superior

com a G da fase inferior, e ainda com a G da interface (onde existe um excesso de energia em

relao s duas fases) ainda menor do que a energia livre de Gibbs da soluo.

2.2.3.2 Diagrama de fases

Para a utilizao de SAB necessrio o conhecimento do comportamento das fases nos

sistemas. Para isto so construdos diagramas de fases para os componentes, nos quais as

composies dos constituintes para a separao das fases so determinadas.

19

Nestes diagramas tm-se inmeras informaes, todas relacionadas minimizao da

energia livre do sistema. Por exemplo, pode-se obter em quais composies globais o sistema

monofsico ou bifsico, sendo estas duas regies demarcadas por uma linha denominada curva

binodal. Tambm so representadas as linhas de amarrao ("tie lines"), que so retas que ligam

pontos no diagrama que representam composio das duas fases em equilbrio. Qualquer conjunto

de pontos que pertenam regio bifsica e que estejam sobre a mesma linha de amarrao

fornecer fases superiores que possuiro propriedades termodinmicas intensivas iguais (densidade,

volume molar, entalpia molar, etc.), entretanto, sendo distintas as suas variveis termodinmicas

extensivas (massa, volume, etc). Aplica-se o mesmo raciocnio para as fases inferiores formadas a

partir de composies globais localizadas sobre uma mesma linha de amarrao (DA SILVA &

LOH, 2006).

A Figura 3 apresenta um exemplo de diagrama de fases mostrando a composio das fases

em equilbrio. Convencionalmente, os componentes presentes em maior quantidade nas fases

inferior e superior so representados no eixo das abscissas e das ordenadas, respectivamente. A

quantidade de gua calculada por diferena. A curva que divide a regio em duas fases chamada

de curva binodal ou curva de equilbrio. A regio acima da curva binodal chamada de bifsica e a

abaixo, monofsica.

Figura 3: Diagrama de fases genrico para um sistema contendo PEG e sal, expresso em

coordenadas retangulares.

Para se estudar a separao de fases em SAB, faz-se uso de uma medida numrica de

referncia para a composio das fases. O comprimento da linha de amarrao, usualmente referido

como TLL, um valor emprico adequado para a utilizao como tal medida. O comprimento da

20

linha de amarrao, TLL, um importante parmetro termodinmico, geralmente utilizado como

varivel determinante dos processos de partio dos solutos em SABs formados por diferentes

componentes e calculado pela Equao:

2 2[ ] [ ]TLL PEG Sal (6)

onde onde [ PEG] e [ Sal] correspondem a diferena de concentrao de PEG e sal nas fases

superior e inferior expressa em % em massa, respectivamente. Com o aumento do valor do

parmetro TLL, aumenta-se a diferena entre a fase superior e a inferior, em termos de propriedades

termodinmicas intensivas

Outra caracterstica importante dos diagramas de fases a inclinao da linha de amarrao,

usualmente definido como STL. A STL uma medida de como a composio das fases pode variar

com a alterao de uma propriedade fsico-qumica, como a temperatura e a massa molar, por

exemplo (CARVALHO, 2004). O valor da inclinao pode ser calculado por:

PEGSTL

Sal (7)

onde [ PEG] e [ Sal] foram definidas acima.

Outra particularidade de um diagrama de fases o ponto crtico (Pc). O ponto

crtico aquele no qual as propriedades fsico-qumicas (composio e volume, entre

outras) das duas fases so teoricamente iguais (ALBERTSSON, 1986). Quanto mais a

composio do sistema se aproxima do ponto crtico, menor a diferena entre as fases, ou

seja, no ponto crtico as composies e os volumes entre as fases so teoricamente iguais.

No entanto, nas proximidades do ponto crtico, pequenas alteraes na composio dos

sistemas provocam drsticas mudanas, levando o sistema de uma para duas fases e vice-

versa (ALBERTSSON, 1986).

2.2.3.3 Constituintes das fases dos SABs

2.2.3.1 Polietilenoglicol (PEG)

O polietilenoglicol, HO-(CH2-CH2-O)n-H, um polmero sinttico, no inico que

juntamente com os outros polmeros sintticos, constitui a base para as indstrias de plsticos,

embalagens, fibras, adesivos, tintas e esmaltes (MURRAY & JENKINS, 1994).

21

Devido ao seu carter no txico, pode tambm ser usado em cosmticos, alimentos e

produtos farmacuticos. O PEG teve sua utilizao em alimentos aprovada pelo FDA (Food and

Drug Administration), por ser considerado no antignico e no imunognico. A indstria de

alimentos regulamentou sua utilizao como veculo em adoantes de mesa (Portaria n 38, de 13 de

janeiro de 1998) e suplementos vitamnicos e/ou minerais (Resoluo RDC n 2, de 2 janeiro de

2001) (COIMBRA, 1995).

Pode ser empregado na separao de macromolculas biolgicas por meio de extrao

liquido-liquido e de precipitao; considerado um excelente agente precipitante na produo de

cristais de protenas, etapa decisiva na determinao da estrutura molecular das mesmas

(ANNUNZIATA et al, 2002).

2.2.3.2 Sais

Os sais normalmente usados para formao das fases so o Sulfato de Sdio, Sulfato de

Ltio, Fosfato de Potssio monobsico e Fosfato de Potssio dibsico.

O sulfato de Ltio (LiSO4), possui solubilidade de 356,4 g L-1, em gua a 18 C. um

componente de interesse tecnolgico com aplicaes na deteco de radiao a laser, como um

elemento tico de transmisso de imagens, na fabricao de cristais de alta resistncia e na indstria

farmacutica. Em elevadas temperaturas, apresenta altos valores de condutividade inica, o que

torna possvel a sua aplicao na armazenagem de energia e em sistemas de converso. Pode ser

recuperado de solues atravs da adio de agentes precipitantes (como anti-solventes), sendo esta,

uma alternativa para a tcnica de cristalizao por congelamento e vaporao (TABOADA, 2002).

O sulfato de Sdio (Na2SO4) um sal branco, cristalino, com solubilidade em gua de 168,6

g L-1 a 18 C. Apresenta pH entre 5,2 e 9,2 a 20 C quando em soluo de 50 g L-1 de sulfato de

sdio em gua (MERCK, 2004). Possui larga aplicao industrial e em particular nas indstrias

txtil, de papel, detergente e vidro.

O Fosfato de Potssio dibsico (K2HPO4) branco, higroscpico, solvel em gua e

ligeiramente solvel em lcool. Pode ser convertido em pirofosfato por ignio. A soluo aquosa

formada com este sal ligeiramente alcalina (pH entre 8,7 e 9,3 quando em soluo de 50 g/L de

gua). Possui solubilidade em gua igual a 1600 g L-1 a 20C (SIGMA-ALDRICH, 2001). O fosfato

de potssio monobsico (KHPO4) tambm possui a cor branca e granulado. Apresenta

solubilidade em gua igual a 222 g L-1 a 20C. insolvel em lcool. Apresenta pH entre 4,4 e 4,7

quando em soluo de 50g L-1 de gua.

22

2.2.4 Partio de Protenas em SABs

Em geral, a distribuio de protenas entre as duas fases aquosas dos SABs caracterizada

por um parmetro denominado coeficiente de partio, Kr (DA SILVA & LOH, 2006).

Inmeras propriedades fsico-qumicas do sistema e da protena determinam o valor de Kr.

Exemplos de fatores associados protena que influenciam sua distribuio entre as fases so: o

tamanho, a conformao (estruturas secundria, terciria e quaternria) e a composio (estrutura

primria), presena de carga eltrica e hidrofobicidade (COLLEN et. al., 2001). Existem ainda

propriedades importantes das fases que contribuem nesta distribuio, como por exemplo, a

natureza qumica dos componentes formadores dos SABs (DA SILVA et. al., 2001), a massa molar

e a concentrao dos polmeros, a presena de ligantes ao longo da cadeia polimrica que possam

interagir especificamente com stios da protena (BROOKS et. al., 1994), pH e temperatura

(WAZIRI et. al., 2004).

Os mecanismos que governam a partio de materiais biolgicos no so ainda entendidos

por completo. Sabe-se que o coeficiente de partio resultante de foras de Van der Walls,

hidrofbicas, ligaes de hidrognio e interaes inicas das biomolculas com as fases do sistema

(GUNDUZ & KORKMAZ, 2000).

2.2.4.1 Variveis que Influenciam a Partio de Protenas em SABs

Inmeras so as variveis que influenciam a partio de biomolculas entre duas fases dos

SABs. Estas podem ser classificadas como variveis inerentes ao prprio sistema (por exemplo:

componentes do sistema, massa molar do polmero, concentrao do polmero ou do sal, pH e

temperatura) ou protena alvo (por exemplo: hidrofobicidade, distribuio de cargas, ponto

isoeltrico e massa molar) (COSTA et. al., 1998; COSTA et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2001;

OLIVEIRA et. al., 2003; TUBIO et al., 2004).

Entretanto, ao se fazer um estudo da partio de biomolculas necessrio conhecer os

dados de equilbrio para todos os sistemas. Para cada sistemas, seja polmero/polmero ou

polmero/sal existe um diagrama de fases que define as propores entre os componentes

formadores das fases (SOUZA, 2008). Alguns desses diagramas esto disponveis na literatura

(ALBERTSSON, 1986).

2.2.4.1.1 Efeito da Massa Molar (MM) do polmero sobre a Partio

A massa molar do polmero exerce influncia sobre a partio, alterando o equilbrio e o

nmero de interaes entre o polmero e a protena.

23

Em geral, o aumento da MM do polmero, que enriquece uma das fases, causar a migrao

do biocomposto para a outra fase. Entretanto, este efeito diminui com o aumento da cadeia

polimrica. O efeito da alterao da MM do polmero por sua vez dependente da MM da protena

a ser particionada. Protenas de grandes MMs, so mais influenciadas por mudanas da MM do

polmero do que as protenas com baixas MMs. Por exemplo, ALBERTSSON (1986), usando os

sistemas PEG 6000 + Dex 40 e PEG 6000 + Dex 500 para partio do citocromo C, observou que o

coeficiente de partio da biomolcula foi pouco afetado (de 0,18 para 0,17) com a elevao da MM

da dextrana. J para a -galactosidase, de maior MM que o citocromo C, o coeficiente de partio

aumentou de 0,24 para 1,59 nas mesmas condies. Polmeros com diferentes MMs podem ser

usados para otimizar a separao de protenas de tamanhos variados.

MACHADO (1999), utilizando um sistema PEG + Maltodextrina (MD) para partio de

clulas microbianas, observou que, com o aumento da MM do PEG, as clulas migraram para a fase

inferior, rica em MD, diminuindo o Kr. Um aumento da MM do PEG de 4.000 para 8.000 Da

provocou um decrscimo de 70 vezes no valor do coeficiente de partio.

GIRALDO-ZUIGA et. al. (2001), empregando em SAB formado por PEG + fosfato de

potssio (FFP) para a separao de protenas do soro de queijo, observaram que os coeficientes de

partio da -la diminuram com o aumento da MM do PEG. Para a -lg foi verificada uma

tendncia inversa, isto o crescimento de K com a elevao da MM do PEG, exceto para PEG

8.000.

2.2.4.1.2 Efeito da Concentrao dos polmeros sobre a Partio

Partculas como organelas e clulas fragmentadas so adsorvidas mais fortemente na

interface de SAB com o aumento da concentrao dos polmeros. A elevao na concentrao dos

polmeros normalmente provoca o deslocamento da curva binodal e do ponto crtico alm de alterar

a composio das fases. Como resultado, substncias solveis, a exemplo de protenas, so

distribudas preferencialmente para uma das fases, modificando assim o coeficiente de partio

(ALBERTSSON et. al., 1990).

Na avaliao da partio de clulas microbianas em SAB formados por PEG 4000 + MD,

MACHADO (1999) observou que o aumento da concentrao de PEG diminuiu Kr, ou seja, quanto

maior a concentrao de PEG maior nmero de clulas de microbianas migraram para a fase

inferior, rica em maltodextrina.

2.2.4.1.3 Efeito do Potencial Hidrogeninico sobre a Partio

O Potencial Hidrogeninico (pH) altera as cargas da superfcie das protenas e,

conseqentemente, o seu coeficiente de partio (LEHNINGER, 1976). Um exemplo clssico a

24

desnaturao de protenas devido reduo do pH. A distribuio de protenas desnaturadas em

solues lquidas diferente daquela obtida em seu estado natural, por apresentarem rea superficial

significativamente maior que na forma nativa. SCHMIDT et al (1994), constataram o aumento do

Kr da -amilase, de 0,7 para 20, com a elevao do pH de 5,3 para 9,5. Geralmente, a partio de

protenas desnaturadas diferente da partio das mesmas protenas na forma nativa, o que pode ser

atribudo no s a maior rea superficial da forma desnaturada, mas tambm ao fato da superfcie

exposta desta ser muito mais hidrofbica (ALBERTSSON, 1986). Como regra geral s protenas

carregadas mais negativamente (nos casos em que o pH superior ao pI) tem maior afinidade pela

fase superior que rica em PEG.

2.2.4.1.4 Efeito da Adio de Sais sobre a Partio

A presena de sais em SAB polmero + polmero, importante para o sucesso da partio

de praticamente todas as espcies de molculas e partculas celulares (ASENJO, 1990).

ALBERTSSON (1960) observou que a separao de fases em misturas contendo polieletrlitos

depende fortemente da fora inica e do tipo de on presente no sistema. Em 1986, estudou com

detalhes a influncia da adio de diferentes tipos de sais sobre o coeficiente de partio de

protenas em SAB formado por PEG + Dextrana.

A adio de sais, em SABs polimricos, em concentraes de (0,1 a 0,2) mol/L, gera uma

diferena de potencial entre as fases, resultante da preferncia dos ons salinos por uma das fases. A

presena de ctions e de nions monovalentes diminuiu o K de protenas carregadas negativamente

nas ordens Li+ < NH4 < Na+ < Cs+ < K+ e F- < Cl- < Br < I-, respectivamente. Para protenas

carregadas positivamente a ordem acima invertida. A presena de nions divalentes fosfato,

sulfato e citrato aumentaram o Kr da protena relativo aos nions monovalentes (ALBERTSSON et

al, 1990). No caso de clulas microbianas, para sistemas PEG 400 + MD, foi verificado que o K

diminuiu com a adio de sal. Quando foi feita a adio de 0,9% de NaCl, o Kr das clulas caiu

drasticamente de 0,84 para 0,08 (MACHADO, 1999).

Segundo Hatti

Kaul (2001), a contribuio do nion mais importante do que do ction

na induo da formao de fases. Este comportamento pode ser analisado considerando dois ctions

(ou dois nions) de mesma valncia. Considerando dois ons de raios diferentes e, portanto

diferentes densidades de cargas, o on de menor raio (e maior densidade de cargas) ir interagir

como PEG em maior proporo favorecendo a interao sal - PEG, resultando na maior quantidade

de sal necessria saturao da cadeia do polmero e na diminuio da regio bifsica

(CARVALHO, 2004).

25

Han e Lee (1997) observaram, para SAB PEG + Dex, que a incorporao de sais de fosfato

ocasionou uma reduo do Kr da BSA (Albumina de Soro Bovino) cuja superfcie carregada

negativamente. No entanto o Kr da lisozima, que carregada positivamente, aumentou com a

adio de fosfato.

2.2.4.1.5 Efeito da Carga dos polmeros sobre a Partio

Polietilenoglicis carregados ionicamente, tm sido usados para direcionar a partio de

protenas. Carregados positivamente, como na forma de trimetilamina-PEG (TMA-PEG),

concentram compostos com carga negativa na fase superior, rica em PEG. Os compostos com carga

positiva so ento excludos da fase rica em PEG. Polietilenoglicis carregados negativamente

apresentam uma tendncia de atuao inversa (ALBERTSSON, 1986).

2.2.4.1.6 Efeito dos Grupos hidrofbicos sobre a Partio

Quando so usadas baixas concentraes de PEG carregados com grupos hidrofbicos (em

torno de 1 mM), como por exemplo o palmitato, ocorre uma elevao da afinidade de protenas com

stios hidrofbicos pela fase superior (ALBERTSSON et al, 1990).

Diversos estudos relataram que o Kr de algumas protenas com baixa hidrofobicidade no

foi significativamente afetado pela presena de polmeros hidrofbicos e sais na constituio das

fases. No entanto o Kr de uma protena com alta superfcie hidrofbica foi fortemente influenciado

pelo aumento da hidrofobicidade do polmero constituinte do SAB.

2.2.4.1.7 Efeito da Temperatura sobre a Partio

A influncia da temperatura sobre a partio de biomolculas percebida de maneira

indireta. A temperatura pode levar a mudanas na viscosidade das fases ou na estrutura dos

polmeros alterando a forma da curva binodal no diagrama de fases (CARVALHO, 2004).

A influncia da temperatura bastante complexa devido ao seu efeito na composio das

fases em equilbrio, assim como a alterao da estrutura da biomolcula e desnaturao

(SARUBBO, 2000). Os sistemas com constituio prxima da composio do ponto crtico so

mais afetados por mudanas de temperatura, devido instabilidade inerente a essa regio. Um

deslocamento da curva binodal pode levar, facilmente, o sistema para a regio monofsica

(BAMBERGER et al., 1985).

FORCINITI & HALL (1991); ZASLAVSKY (1995) observaram para o sistema PEG e sal,

que o aumento da temperatura favorece o aumento da concentrao de PEG na fase superior do

sistema e conseqentemente ocorre uma reduo da concentrao do polmero na fase inferior.

26

O efeito da temperatura varia de acordo com o tipo de sistema, polmero / polmero ou

polmero / sal. Para SAB PEG + MD, foi observado um aumento da inclinao das linhas de

amarrao com a elevao da temperatura do sistema (MACHADO, 1999). O mesmo

comportamento foi observado para sistemas PEG + Sal (SILVA, 2000).

Inmeros trabalhos relatam um aumento do coeficiente de partio com a temperatura

(JOHANSSON et al., 1984); outros entretanto, no evidenciam a existncia da relao entre o

coeficiente de partio e a temperatura (TJERNELD et al., 1985). Tal condio demonstra a

necessidade de estudos mais aprofundados para se esclarecer o real efeito deste parmetro sobre a

partio.

2.3 Espectrofotometria

O desenvolvimento de metodologias e estudos comparativos de metodologias

espectrofotomtricas para a determinao de protenas totais sempre foram de grande interesse para

profissionais, tanto ligados indstria de alimentos, laboratrios de anlises clnicas, como para

pesquisadores de diversas reas.

O termo espectrofotometria designa um mtodo de anlise baseado em medidas de absoro

de radiao eletromagntica.

A tcnica que aqui se descreve est restrita a uma pequena regio de comprimento de onda

da radiao eletromagntica, que corresponde luz visvel ou ultravioleta.

Quando a radiao interage com a matria, certo nmero de processos pode ocorrer,

incluindo reflexo, espalhamento, absoro, fluorescncia/fosforescncia (absoro e reemisso), e

reaes fotoqumicas (absoro e quebra de ligaes qumicas). Como a luz uma forma de

energia, a absoro de luz pela matria faz com que a quantidade de energia das molculas (ou

tomos) aumente. O processo de absoro ocorre em nvel molecular. A absoro da radiao pela

molcula se d, quando a energia que ela transporta igual diferena entre dois nveis de energia;

nessa situao, a energia da radiao transferida para a molcula.

Cada molcula caracteriza-se por possuir nveis de energia moleculares quantizados, os

quais podem ser ocupados pelos eltrons das molculas. Molculas de substncias diferentes tm

diferentes nveis moleculares de energia, de maneira que cada substncia absorve a radiao

peculiarmente. Dito de outra forma, os comprimentos de onda que as substncias absorvem so

caractersticos da sua estrutura. Se forem levantados dados referentes intensidade de luz absorvida

por uma substncia, em funo dos comprimentos de onda da radiao, obter-se- uma curva

chamada espectro de absoro da substncia. Cada substncia tem um espectro caracterstico e,

27

desse modo, para se identificar um material desconhecido, pode-se faz-lo a partir de sua curva de

absoro, comparada com curvas de substncias conhecidas.

Uma vez conhecido o espectro de absoro de uma dada substncia pode-se tambm

determinar em que quantidade essa substancia se apresenta em uma soluo. Isso feito atravs da

medida da intensidade de luz que atravessa a amostra. Uma soluo quando iluminada por luz

branca, apresenta uma cor que resultante da absoro relativa dos vrios comprimentos de onda

que a compem (ver figura 4).

Figura 4: Espectro de radiao eletromagntica, com destaque para a regio do visvel.

Quando luz passa atravs de uma amostra ou quando ela refletida de uma amostra, a

quantidade de luz absorvida a diferena entre a radiao incidente (I0) e a radiao transmitida (I).

A quantidade de luz absorvida expressa tanto como transmitncia quanto absorbncia.

Transmitncia dada normalmente em termos de uma frao da radiao transmitida (I) ou

como uma porcentagem e, definida como:

Io

b

I

28

T = I/I0 ou %T = (I/I0) 100 (8)

A absorbncia definida como:

A = - log T (9)

A primeira formulao matemtica relacionando transmitncia da luz com concentrao de

uma substncia foi atribuda a Lambert em 1760, embora tenha sido comentado que Bouguer j

tenha verificado este efeito em 1729:

T = I/Io = 10-kb (10)

A lei de Lambert idntica lei de Bouguer, exceto que est relacionada com a

concentrao. A quantidade de luz absorvida proporcional ao nmero de molculas que absorvem

atravs da passagem da luz.

Combinando as duas leis resulta na lei de Beer-Bouguer-Lambert:

T = I/I0 = 10-kbc (11)

onde: c = concentrao das espcies absorvedoras (expresso normalmente em g L-1 ou mg L-1).

De acordo com a Lei de Lambert-Beer intensidades da radiao incidente e emergente

podem ser relacionadas com as concentraes do material presente na soluo bem como a

distncia percorrida pelo feixe luminoso atravs das amostras. Ou seja, a absorbncia da luz a

cada comprimento de onda

diretamente proporcional concentrao da soluo contida na

cubeta, contudo, esta linearidade deixa de ocorrer a concentraes muito elevadas da substncia.

Muitos mtodos espectrofotomtricos tm sido propostos ao longo dos anos, para a

determinao de protenas totais, entretanto, no existe uma metodologia considerada de uso

universal para todos os meios. Os mtodos geralmente mais utilizados so o do biureto, de Lowry

(LOWRY et. al., 1951), do "Coomassie brilliant blue" BG-250 ou reagente de Bradford

(BRADFORD, 1976), do BCA ou reagente de Smith (SMITH et. al., 1985), e de absoro de

protenas no ultravioleta (STOSCHECK, 1990). O mtodo de Bradford muito difundido por ser

rpido e bastante sensvel.

29

2.3.1 O mtodo de Bradford

O mtodo de Bradford (BRADFORD, 1976), uma tcnica para a determinao de

protenas totais que utiliza o corante de "Coomassie brilliant blue" BG-250. Este mtodo baseado

na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contm aminocidos de

cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso

molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma

aninica, que absorve fortemente em 595 nm (COMPTON, 1985).

O mtodo de Bradford (BRADFORD, 1976) mais rpido e sensvel que o de Lowry e

Cols (LOWRY et. al., 1951), e tem sido utilizado para a determinao de protenas totais em

diversos meios: plasma ou soro sangneo (HUNN et. al., 1990; NISHI et. al., 1985), lqor

(HISCHE et. al., 1982), saliva humana (JEZANO et. al., 1986), produtos alimentcios (RICHARD

& PAQUIN, 1990), leite humano (KELLER & NEVILLE, 1986), tecidos de plantas (MARKS et.

al., 1985; MATTO et. al., 1987), suspenses de clulas (GOGSTAD & KRUTNES, 1982), avidina

e estreptavidina (SHARMA & TIHON, 1988) e detergentes (ROSENTHAL, 1983).

30

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

O trabalho experimental foi realizado no Laboratrio de Processos de Separao (LPS) do

Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA), da Universidade Federal de Viosa (UFV),

Viosa MG.

3.1 Materiais

Reagentes

Polietilenoglicol 1500 g mol-1 (SYNTH, Brasil);

Polietilenoglicol 4000 g mol-1 (ISOFAR, Brasil);

Fosfato de potssio (monobsico e dibsico, VETEC, Brasil);

Sulfato de Sdio (ECIBRA, Brasil);

Sulfato de ltio (VETEC, Brasil);

cido Propinico (ISOFAR, Brasil);

Iso Propanol (VETEC, Brasil);

Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico, no necessitando de maiores

purificaes.

Equipamentos

Balana analtica (M-310, DENVER INSTRUMENT, USA);

Agitador magntico (FISATON, Brasil);

Centrfuga (5804, EPPENDORF, Alemanha);

Banho termosttico (TE-184, TECNAL, Brasil);

Espectrofotmetro ( Cary 50 , Varian, Austrlia)

3.2. Mtodos

3.2.1 Sistemas de trabalho

Os dados de equilbrio para os sistemas aquosos bifsicos utilizados neste trabalho se

basearam nos diagramas de fases de sistemas compostos por polietilenoglicol, sal e gua obtidos por

CARVALHO (2004). A partir dos sistemas contendo PEG de massas molares (1500, e 4000 gmol-1)

e do sal formador da fase (fosfato de potssio, sulfato de ltio e sulfato de sdio), foram obtidos os

31

coeficientes de partio da Glutenina, nas temperaturas de (5, 25, 35 e 45) C em funo da

concentrao do PEG (14, 16 e 18) % em massa e do tipo de sal. Apenas para o fostato de sdio e

sulfato de ltio, as anlises foram feitas (5 e 25) C, pois no haviam dados de equilbrio para as

demais temperaturas. As anlises foram conduzidas em duplicata.

3.2.2 Quantificao do Contedo Protico Total da Farinha de Trigo

Amostras de farinha de trigo foram utilizadas para determinao do teor protico total da

farinha, quantificado pelo Mtodo de Kjedahl (AOAC, 1995).

3.2.3 Preparo da Soluo de Glutenina usando cido Propinico

O preparo da soluo de glutenina em cido propinico foi realizado a partir de uma

adaptao da metodologia descrita por Sapirstein & Fu (1996), baseada no princpio da solubilidade

das protenas do trigo em soluo de propanol-1 50%. As amostras foram preparadas misturando

aproximadamente 26,0 g de farinha de trigo com 17,0 g de gua deionizada, formando uma massa.

Foram ento pesadas 8,0 g dessa massa e adicionados 10 mL de propanol-1 50%. As amostras

foram centrifugadas a 2500 rpm por 15 g e o sobrenadante descartad