Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu:

1. Detektor spektrofotometrik

Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sampel yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detektor yang sangat mahal. Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri.

Detector UV. Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati kolom lalu dilewatkan Flow-cell. Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi oleh sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini sifatnya spesifik, artinya hanya dapat digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang biasa digunakan adalah 254 nm. 

2. Detektor Fluorometrik

Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya.

3. Detektor Elektrokimia

Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solute yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik.

4. Desain detector

Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa mikroliter.

6. Analisis Kuantitatif

Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut, konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas sinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram.

Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan

membuat kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition.

Detektor

Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam KCKT adalah

a) Detektor Universal· Detektor Ultra Violet – Visible (Sinar Tampak)

Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.

Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang.

· Detektor Indeks BiasDetektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun,

termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g) dan umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :Ø Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen dan

bebaskan dari gas terlarutnya.Ø Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai detektor

stabil.Ø Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka tempatkanlah

detektor indeks bias pada urutan terakhir.Ø Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner diameter)

yang besar tapi pendek.Ø Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.Ø Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.Ø Sel pembanding harus diisi dengan pelarut yang telah dilewatkan melalui kolom,· Detektor Spektrometer Massa· Detektor Spektrometer Inframerahb) Detektor Selektif· Detektor Fluoresensi

Didasarkan kepada prinsip bahwa molekul-molekul tertentu dapat menyerap energi pada panjang gelombang yang lebih pendek membentuk suatu keadaan tereksitasi dan kemudian secara hampi bersamaan turun kembali ke keadaan dasar (ground state) dengan memancarkan energi pada panjang gelombang yang lebih panjang.

· Detektor Konduktivitas ListrikDetektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri)

dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. Adapun persyaratan detektor yaitu: cukup sensitif, stabilitas, dan keterulangan tinggi, tidak erusak cuplikan, respon linier terhadap solut, reliabilitas tinggi dan mudah digunakan.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :a) Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibelb) Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar sangat

kecilc) Stabil dalam pengoperasiannyad) Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pitae) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luasf) Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak

Prinsip kerja instumentasi HPLCHPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah

campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.

Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer.

Cara kerja instumentasi HPLCPrinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom

kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari

kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

5. DetektorAda dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap

golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam KCKT adalah

a) Detektor Universal· Detektor Ultra Violet – Visible (Sinar Tampak)

Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.

Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :a) Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibelb) Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar sangat

kecilc) Stabil dalam pengoperasiannyad) Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pitae) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luasf) Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak

6. Rekorder

Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.

Hasil PengukuranØ Pengukuran deret standar

Vitamin CDeret Konsentrasi Area Tr

1 2.2184667 1.98

3 6.6536315 2.08

4 8.8742976 1.99

5 11958751 2.08

Natrium BenzoatDeret Konsentrasi Area Tr1 5.6 23143 4.383 16.8 123628 4.484 22.4 131803 4.465 28 232308 4.53

B. Perhitungan

1. Pembuatan Larutan KH2PO4

Massa KH2PO4 yang diperlukann = MxVm = n x Mm = M x V x MmMassa KH2PO4 = 0,01 M x 0,5 L x 136 g/mol = 0,68 gram

2. Pembuatan Larutan standar 10 mL dari 1 mL larutan indukV1 M1 = V2 M2

1 mL x 100 ppm = 10 mL x M2

M2 = 10 ppm· standar 10 mL dari 2 mL larutan induk

V1 M1 = V2 M2

2 mL x 100 ppm = 10 mL x M2

M2 = 20 ppm· standar 10 mL dari 3 mL larutan induk

V1 M1 = V2 M2

3 mL x 100 ppm = 10 mL x M2

M2 = 30ppm· standar 10 mL dari 4 mL larutan induk

V1 M1 = V2 M2

4 mL x 100 ppm = 10 mL x M2

M2 = 40ppm· standar 10 mL dari 5 mL larutan induk

V1 M1 = V2 M2

5 mL x 100 ppm = 10 mL x M2

M2 = 50 ppm

Kafein

DeretKonsentrasi Area Tr

1 10.4 461895 2.543 31.2 1391986 2.824 41.6 1891473 2.555 52 2398312 2.84

3. Pembuatan Larutan Baku Vitamin C 1000 ppma. vitamin CKonsentrasi (ppm) =

1000 ppm = Massa Vitamin C = 22 mgb. kafeinKonsentrasi (ppm) =

1000 ppm = Massa kafein = 104 mgb. Natrium BenzoatKonsentrasi (ppm) =

1000 ppm = Massa Natrium Benzoat = 56 mg

2. Pembuatan Deret Larutan Standar Vitamin CØ Larutan Standar 1 mL

V1 M1 = V2 M2

1 mL x 22 ppm = 10 mL x M2

M2 = 2,2 ppm

Ø Larutan Standar 2 mLV1 M1 = V2 M2

2 mL x 22 ppm = 10 mL x M2

M2 = 4,4 ppm

Ø Larutan Standar 3 mLV1 M1 = V2 M2

3 mL x 22 ppm = 10 mL x M2

M2 = 6,6 ppm

Ø Larutan Standar 4 mLV1 M1 = V2 M2

4 mL x 22 ppm = 10 mL x M2

M2 = 8,8 ppmØ Larutan Standar 5 mL

V1 M1 = V2 M2

5 mL x 22 ppm = 10 mL x M2

M2 = 11 ppm

3. Pembuatan Deret Larutan Standar kafein

Ø Larutan Standar 1 mLV1 M1 = V2 M2

1 mL x 104 ppm = 10 mL x M2

M2 = 10,4 ppm

Ø Larutan Standar 2 mLV1 M1 = V2 M2

2 mL x 104 ppm = 10 mL x M2

M2 = 20,8 ppm

Ø Larutan Standar 3 mLV1 M1 = V2 M2

3 mL x 104 ppm = 10 mL x M2

M2 = 31,2 ppm

Ø Larutan Standar 4 mLV1 M1 = V2 M2

4 mL x 104 ppm = 10 mL x M2

M2 = 41,6 ppmØ Larutan Standar 5 mL

V1 M1 = V2 M2

5 mL x 104 ppm = 10 mL x M2

M2 = 52 ppm

4. Pembuatan Deret Larutan Standar natrium benzoat

Ø Larutan Standar 1 mLV1 M1 = V2 M2

1 mL x 56 ppm = 10 mL x M2

M2 = 5,6 ppm

Ø Larutan Standar 2 mLV1 M1 = V2 M2

2 mL x 56 ppm = 10 mL x M2

M2 = 11,2 ppm

Ø Larutan Standar 3 mLV1 M1 = V2 M2

3 mL x 56 ppm = 10 mL x M2

M2 = 16,8 ppm

Ø Larutan Standar 4 mLV1 M1 = V2 M2

4 mL x 56 ppm = 10 mL x M2

M2 = 22,4 ppmØ Larutan Standar 5 mL

V1 M1 = V2 M2

5 mL x 56 ppm = 10 mL x M2

M2 = 28 ppm

5. Perhitungan hasil analisis# Vitamin C

Berdasarkan kurva kalibrasi didapat persamaan garis y = 252891x – 26551Luas area vitamin c = 1779127y = 252891x – 265511779127 = 252891x – 26551x = x = 7,140 ppm

Konsentrasi vitamin c dalam sampel = 7,140 ppmMassa vitamin c = 7,140 mg/L x 10 mL = x 10 mL = 0,0714 mgKadar vitamin c = 0,0714 mg/10 mLMaka dalam 500 mL sampel mizone, kadar vitamin c = x 0,0714 mg = 3,57 mg

# Natrium BenzoatBerdasarkan kurva kalibrasi didapat persamaan garis y = 63567x –31197Luas area natrium benzoat = 15581524y = 63567x –3119715581524 = 63567x –31197x = x = 245,610 ppm

Konsentrasi natrium benzoat dalam sampel = 245,610 ppmMassa natrium benzoat = 245,610 mg/L x 10 mL = x 10 mL = 2,4561 mgKadar natrium benzoat = 2,4561 mg/10 mLMaka dalam 500 mL sampel mizone, kadarnatrium benzoat = x 2,4561 mg = 122,805 mg