PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN - repository.vnu.edu.vnrepository.vnu.edu.vn/bitstream/VNU_123/33538/1/01050003461(1).pdf · Hình2.2. Các bƣớc thực hiện thí nghiệm phân

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------------

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN

VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4

Ở LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------**------------


PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN

VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4

Ở LÚA (Oryza sativa)

Chuyên ngành : Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Đỗ Thị Phúc

Hà Nội, 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ

Thị Phúc, người đã hướng dẫn, quan tâm và tận tình chỉ bảo, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Cảm ơn cô,

người đã luôn truyền cảm hứng và niềm tin cho tôi trong từng thí

nghiệm, từng công việc.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô công tác tại

Bộ môn Di truyền học đã quan tâm và tạo mọi điều kiện

thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn. Các thầy cô đã chỉ bảo cho tôi

sự cẩn thận, kiên trì và nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới CN. Trần Xuân An, CN.

Phạm Quỳnh Hoa, CN. Ngô Thị Hạnh đã luôn giúp đỡ tôi

trong các thí nghiệm. Các em đã luôn quan tâm và truyền đạt cho tôi

những kinh nghiệm quý báu trong thực nghiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Protein và Enzyme; Học viện Nông

nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực

hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người

thân, những người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt

nhất để tôi học tập. Cảm ơn mọi người đã luôn động viên, khuyến

khích tôi trong quá trình học tập và thí nghiệm.

Hà Nội, tháng 11 năm 2016


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3

1.1. Giới thiệu về cây Lúa (Oryza sativa) .............................................. 3

1.2. Giới thiệu về họ protein vận chuyển ion xuyên màng HKT ở

thực vật và ở lúa ...................................................................................... 4

1.2.1. Họ protein HKT ở thực vật ....................................................... 5

1.2.2. Họ protein HKT ở cây lúa ......................................................... 8

1.2.3. Gen OsHKT2;4 .......................................................................... 9

1.2.4. Tình hình nghiên cứu gen OsHKT2;4 ..................................... 10

1.3. Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa hình nucleotide .................... 11

1.3.1. Phƣơng pháp RFLP-PCR ........................................................ 11

1.3.2. Phƣơng pháp giải trình tự ........................................................ 14

1.4. Phƣơng pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen ....................... 16

1.4.1. Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ ......................... 16

1.4.2. RT-PCR và Real-time PCR ..................................................... 17

1.4.3. Các phƣơng pháp sử dụng chip ............................................... 19

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................... 20

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, hóa chất và thiết bị ................................... 20

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................. 20

2.1.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị .................................................... 21

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................. 22

2.2.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình gen

OsHKT2;4 ............................................................................................. 22

2.2.2. Các phƣơng pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen ....... 26

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 30

3.1. Phân tích đa hình gen Oshkt2;4 ở lúa ........................................... 30

3.1.1. Tách chiết DNA tổng số .......................................................... 30

3.1.2. Khuếch đại gen OsHKT2;4 bằng PCR .................................... 31

3.1.3. Giải trình tự gen OsHKT2;4 .................................................... 32

3.1.4. Phân tích đa hình gen OsHKT2;4 ............................................ 33

3.2. Phân tích biểu hiện gen ................................................................. 43

3.2.1. Kết quả trồng lúa thủy canh và xử lý mặn .............................. 43

3.2.2. Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA ........................... 43

3.2.3. Phản ứng Real-time PCR và phân tích mức độ biểu hiện

gen OsHKT2;4 ...................................................................................... 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 50

KẾT LUẬN .............................................................................................. 50

KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 51

Phụ lục 1

Phụ lục 2

Phụ lục 3

Phụ lục 4

DANH MụC BảNG

Bảng 1.1. Các protein họ HKT đã đƣợc biết ........................................................ 6

Bảng 1.2. Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) ........................................................ 9

Bảng 2.1. Các giống lúa trong nghiên cứu ......................................................... 20

Bảng 2.2. Các cặp mồi đặc hiệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ...................... 21

Bảng 3.1. Hai nhóm giống lúa phân chia theo các đa hình nucleotide .............. 33

Bảng 3.2. Vị trí các đa hình nucleotide ở nhóm 2 .............................................. 35

Bảng 3.3. Các đa hình amino acid tƣơng ứng với đa hình nucleotide ............... 36

Bảng 3.7. Giá trị Fold change mẫu tách chiết từ lá giống Nipponbare và

Pokkali tại các thời điểm ............................................................................... 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa ............................... 3

Hình 1.2. Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp ứng stress

mặn ở thực vật .................................................................................................. 5

Hình 1.3. Gen OsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome .................................... 10

Hình 1.4. Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu di truyền

phân tử ............................................................................................................ 13

Hình 1.5. Kỹ thuật giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger cải biến ................... 14

Hình 1.6. Các bƣớc cơ bản trong phƣơng pháp Northern blot ............................ 17

Hình 1.7. Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR ............ 18

Hình 1.8. Sử dụng chip Microarray trong phân tích biểu hiện ............................ 19

Hình 2.1. Các bƣớc thí nghiệm nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 .................. 23

Hình2.2. Các bƣớc thực hiện thí nghiệm phân tích biểu hiện gen

OsHKT2;4 ...................................................................................................... 26

Hình 2.3. Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn ....................................................... 27

Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá của 14 giống

lúa ................................................................................................................... 31

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen OsHKT2;4 ....... 31

Hình 3.3. Kết quả giải trình tự đƣợc phân tích bằng phần mềm Bioedit ............ 32

Hình 3.4. Một phần kết quả so sánh các trình tự bằng công cụ MultAlin ........... 34

Hình 3.5. Mô hình dự đoán cấu trúc bậc ba protein OsHKT2;4 ........................ 37

Hình 3.6. Phân bố góc quay của các amino acid trong mô hình cấu trúc

3D qua phân tích Ramachandran Plot ............................................................ 38

Hình 3.7. Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 53 và 253 ............ 39

Hình 3.8. Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 342 ...................... 40

Hình 3.9. Mô hình dự đoán cấu trúc xuyên màng ............................................... 41

Hình 3.10. Filter pore của protein OsHKT2;4 ở hai nhóm giống lúa ................. 42

Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số .............................................. 44

Hình 3.12. Biểu đồ Association curve thể hiện nhiệt độ gắn mồi ....................... 45

Hình 3.13. Biểu đồ Amplification curve các mẫu gen OsHKT2;4 ...................... 46

Hình 3.14. Đồ thị biểu hiện mức độ thay đổi nồng độ mRNA của các mẫu

xử lý mặn so với mẫu đối chứng ở giống Nipponbare (A) và giống

Pokkali (B). .................................................................................................... 48

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

HKT High-affinity Potassium Transporter

DNA Deoxyribonucleic Acid

RNA Ribonucleic acid

cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid

bp Basepair

PCR Polymerase Chain Reaction

RFLP-PCR Restriction Fragment Length Polymorphism -

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate (Deoxynucleotide)

ddNTP Dideoxynucleotide

Fw Forward

Rv Reverse

Luận văn thạc sĩ khoa học


QH.2014.T.CH - 60420121 1

MỞ ĐẦU

Tình hình biến đổi khí hậu trên thế giới đang diễn ra ngày càng phức tạp.

Việt Nam là một trong những nƣớc chịu các tác động tiêu cực nặng nề của biến đổi

khí hậu. Với đƣờng bờ biển dài hơn 3.260 km, cùng với hệ thống sông ngòi chằng

chịt đổ ra biển qua rất nhiều cửa sông, tình hình xâm nhập mặn, một trong những hệ

quả của biến đổi khí hậu đang ảnh hƣởng mạnh đến tình hình sản xuất nông nghiệp

của nƣớc ta. Ở đồng bằng sông Cửu Long tình hình xâm nhập mặn lấn sâu vào đất

liền qua các con sông đến 70 km, và dự báo đến tiếp tục tăng. Hạn hán và đất nhiễm

mặn đã và đang ảnh hƣởng đến trên 30 tỉnh thành của nƣớc ta.

Đất nhiễm mặn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sự sinh trƣởng và phát triển

của cây trồng, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl

-, tăng cƣờng peroxide

lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy nhƣ các gốc superoxide và

hydroxyl.

Để cải thiện năng suất trong điều kiện stress mặn ở thực vật nói chung và ở

lúa nói riêng, việc hiểu đƣợc các cơ chế phân tử của các đáp ứng stress mặn là hết

sức quan trọng. Khả năng chịu mặn là tính trạng đƣợc kiểm soát bởi nhiều gen.

Việc tìm hiểu mối liên hệ giữa gen quan tâm và khả năng đáp ứng với stress mặn có

vai trò rất quan trọng trong lai tạo giống chịu mặn.

Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính

trong các cơ chế chống chịu mặn. Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K

+ liên

quan đến tính trạng chống chịu mặn, họ protein HKT (High-affinity potassium

transporter) có vai trò quan trọng trong đáp ứng với stress mặn. OsHKT2;4 thuộc

nhóm 2 họ protein HKT, OsHKT2;4 đƣợc biết đến với vai trò đồng vận chuyển Na+

và K+.Tuy nhiên, các nghiên cứu phân tử về genmã hóa cho protein OsHKT2;4 trên

các giống lúa Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của genOsHKT2;4 ở lúa



QH.2014.T.CH - 60420121 2

(Oryza sativa)” với mục tiêu:Phân tích đa hình genOsHKT2;4 và nghiên cứu mức

độ biểu hiện của genOsHKT2;4 ởmột số giống lúa có khả năng chịu mặn khác nhau.



QH.2014.T.CH - 60420121 3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIớI THIệU Về CÂY LÚA (Oryza sativa)

Lúa (Oryza sativa) là một trong năm loại cây lƣơng thực chính của thế giới,

cùng với ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz)

và khoai tây (Solanum tuberosum L.)[39]. Lúa thuộc bộ Poales, họ Poaceae, chi

Oryza; ngƣời ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên

siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các

châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa, hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại

thuộc chi này và 2 loài lúa đã đƣợc thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa

châu Phi (Oryza glaberrima) [70,73].

Hình 1.1. Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa [73]



QH.2014.T.CH - 60420121 4

Lúa (Oryza sativa) có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng Đông Nam

Á; sau đó đƣợc nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và

Japonica. Japonica đƣợc trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới và ôn

đới trong khi Indica đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á. Hai nhóm sinh thái

này đƣợc phân biệt bởi các đặc điểm về hình thái (Hình 1.1.), sinh lý và đặc điểm

sinh thái; Indica có lá bản rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài mảnh,

còn Japonica có lá hẹp và xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung

bình, hạt tròn ngắn.

Lúa (Oryza sativa) có rất nhiều giống thích nghi với nhiều điều kiện môi

trƣờngvà đƣợc gieo trồng làm cây lƣơng thực trên khắp thế giới [70].Với tầm quan

trọng trong cung cấp lƣơng thực toàn cầu, việc nghiên cứu tăng năng suất của cây

lúa đang ngày càng đƣợc chú trọng; nghiên cứu đáp ứng mặn ở cây lúa là một trong

những hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng.

1.2. GIớI THIệU Về Họ PROTEIN VậN CHUYểN ION XUYÊN

MÀNG HKT ở THựC VậT VÀ ở LÚA

Đất nhiễm mặn là một trong những vấn đề thách thức nền nông nghiệp các

quốc gia trên thế giới.Cây trồng bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi đất nhiễm mặn ở

nồng độ muối cao [9]. Stress mặn ở thực vật có thể phân ra các giai đoạn gồm mất

cân bằng thẩm thấu xảy ra ở giai đoạn sớm, gây độc do tích tụ ion Na+ và Cl

-.

Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính

trong các cơ chế chống chịu với các stress do các nhân tố sinh học và phi sinh học

gây ra (Hình 1.2.). Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K

+ liên quan đến tính

trạng chống chịu mặn [40;49], họ protein HKT có vai trò quan trọng trong sự

chống chịu mặn ở thực vật [17;18;51].



QH.2014.T.CH - 60420121 5

1.2.1. Họ protein HKT ở thực vật

Schachtman và Schroeder là hai ngƣời đầu tiên đã phát hiện ra các protein

HKT (High-affinity Potassium Transporters) chỉ có ở thực vật nhƣng có trình tự và

chức năng tƣơng tự với lớp protein vận chuyển cation TrkH / TrkB ở vi khuẩn và

nấm [56].

HKTs thuộc lớp các protein màng quan trọng (IMP), tham gia vào quá trình

vận chuyển cation qua màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia vào

khả năng chống chịu mặn ở thực vật [63]. HKT là nhân tố chính trong sự chống

chịu mặn ở thực vật bằng cách loại bỏ Na+ khỏi xylem, giảm sự thẩm thấu của các

ion theo gradien nồng độ [15;26;30].

Hình 1.2. Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp

ứng stress mặn ở thực vật [75]



QH.2014.T.CH - 60420121 6

Các nghiên cứu về chức năng đã chỉ ra rằng protein vận chuyển HKT có

chức năng vận chuyển các cation hóa trị 1, với sự chọn lọc cation khác nhau giữa

các thành viên cụ thể trong họ gen HKT [51;57]. Một số protein HKT có tính chọn

lọc cao với Na+, trong khi một vài protein HKT có khả năng vận chuyển cả Na

+ và

K+; thậm chí, một số protein HKT có thể thay đổi tính chọn lọc của nó tùy thuộc

vào các ion trong môi trƣờng [57].

Bảng 1.1.Các protein họ HKT đã đƣợc nghiên cứu [57]

Protein Loài Mã số

AtHKT1;1 Arabidopsis thaliana Q84TI7.1

BdHKT1 Brachypodium distachyon XP_003560515.1





CaHKT1 Cochlearia anglica AFH37929.1

DfHKT Diplachne fusca AEM55592.1

EcHKT1;1 Eucalyptus camaldulensis AF176035_1

EcHKT1;2 Eucalyptus camaldulensis AF176036_1

EsHKT1 Eutrema salsugineum AFJ23835.1

GmHKT1 Glycine max XP_003540998.1

HbHKT Hordeum brevisubulatum AER42622.1

HvHKT1;5 Hordeum vulgare ABK58096.1

HvHKT4 Hordeum vulgare AEM44690.1

HvHKT2;1 Hordeum vulgare AEM55590.1

McHKT1;1 Mesembryanthemum crystallinum AF367366_1

McHKT1;2 Mesembryanthemum crystallinum AAO73474.1

MtHKT1;5 Medicago truncatula AES77170.1

OgHKT1 Oryza glumipatula ABD15858.1



QH.2014.T.CH - 60420121 7

OrHKT1 Oryza rufipogon AAY33540.1

OsHKT1;1 Oryza sativa Q7XPF8.2

OsHKT1;3 Oryza sativa Q6H501.1

OsHKT1;5 Oryza sativa A2WNZ9.2

OsHKT2;1 Oryza sativa A2YGP9.2

OsHKT2;2 Oryza sativa Q93XI5.1

OsHKT2;3 Oryza sativa Q8L481.1

OsHKT2;4 Oryza sativa Q8L4K5.1

PaHKT1 Phragmites australis BAE44384.1

PtHKT1 Populus trichocarpa EEF03794.1

PutHKT2;1 Puccinellia tenuiflora ACT21087.1

SbiHKT1;5 Sorghum bicolor EES02856.1

SbiHKT1;3 Sorghum bicolor EES04614.1

SbiHKT2;3 Sorghum bicolor EER90327.1

SbHKT1 Salicornia bigelovii ADG45565.1

SmHKT1 Selaginella moellendorffii EFJ18587.1

SsHKT1 Suaeda salsa AAS20529.2

TaHKT1;5-D Triticum aestivum ABG33949.1

TaHKT2;1 Triticum aestivum AAA52749

TaHKT1;5-B1 Triticum aestivum ABG33947.1

TaHKT1;5-B2 Triticum aestivum ABG33948.1

TmHKT1;5-A Triticum monococcum ABG33946.1

ThHKT1 Thellungiella halophila BAJ34563.1

VvHKT1 Vitis vinifera XP_002270986.1

VvHKT1;3 Vitis vinifera XP_002267717.1

ZmHKT1 Zea mays AEK27028.1

ScTRK1 Saccharomyces cerevisiae AAA34728

ScTRK2 Saccharomyces cerevisiae AAA35172

VpTrkH Vibrio parahaemolyticus Q87TN7.1



QH.2014.T.CH - 60420121 8

Dựa vào khả năng vận chuyển đặc hiệu ion, họ protein HKT đƣợc chia thành

hai nhóm: nhóm vận chuyển chọn lọc với Na+ (nhóm I) và nhóm đồng vận chuyển

Na+ và K

+ (nhóm II) [16;18;57].

1.2.2. Họ protein HKT ở cây lúa

Ở lúa (Oryza sativa), họprotein HKT cũng đƣợc chia ra hai nhóm và đƣợc

mã hóa bởi 7 – 9 gen tùy theo các giống. Trong đó, họ protein HKT nhóm I đƣợc

mã hóa bởi các genOsHKT1;1, OsHKT1;2, OsHKT1;3, OsHKT1;4, OsHKT1;5 và

nhóm II đƣợc mã hóa bởi các genOsHKT2;1, OsHKT2;2, OsHKT 2;3, OsHKT2;4

[57].

OsHKT1;5 đƣợc xác định nằm trên locus định lƣợng SKC1 mã hóa cho một

protein tham gia vào vận chuyển Na+, có chức năng quan trọng trong mô xylem,

nhằm giúp thu hồi Na+ từ mạch gỗ, do đó làm giảm tích lũy Na

+ trong thân bẹ của

cây. OsHKT1;1 có thể đƣợc biểu hiện ở chồi và rễ. OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở

thân lá, ít biểu hiện ở rễ [8;24;45;57]. OsHKT2;1 có mặt ở vỏ rễ, và có khả năng thu

thập Na+ trong điều kiện thiếu K

+, cung cấp ion nội mô [25;35;43;57]. Dƣới điều

kiện mặn sự biểu hiện của gen này sẽ đƣợc điều hòa giảm hoạt động [35;61].

Protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+ vào trong rễ, nhƣng hoạt động của nó bị giảm

xuống ở những cây xử lý mặn 30mM NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na+ gây độc

cho cây [31]. Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng đƣợc biểu hiện trong lá [23;35;44].

OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na+ và K

+ [64]. Cây lúa xử lý mặn ở

150 mM NaCl làm tăng cƣờng biểu hiện của gen này ở lá, đặc biệt là ở các tế bào

diệp lục. Các gen OsHKT2;3 và OsHKT2;4 biểu hiện mạnh trong mô thân bẹ, ít

biểu hiện ở rễ [25;29;33].



QH.2014.T.CH - 60420121 9

Bảng 1.2. Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) [8;57]

Gen Mã số Nucleotide Nhóm Mã số protein

OsHKT1;1 AJ491816 Nhóm I CAD37183

OsHKT1;2 AJ506745 Nhóm I -



OsHKT1;5 AK108663 Nhóm I BAB93392

OsHKT2;1 AB061311 Nhóm II BAB61789

OsHKT2;2 AB061313 Nhóm II BAB61791

OsHKT2;3 AJ491820 Nhóm II CAD37187

OsHKT2;4 AJ491855 Nhóm II CAD37199

1.2.3. GenOsHKT2;4

GenOsHKT2;4 nằm trên nhiễm sắc thế số 6, dài 1749 bp, trình tự mã hóa

CDS dài 1530 bp mã hóa cho chuỗi 509 amino acid [1;2;74].Gen OsHKT2;4 ít biểu

hiện ở rễ và bông con, chủ yếu đƣợc biểu hiện ở các mô lá, bẹ lá, các chồi phân

sinh. Gen OsHKT2;4 thuộc nhóm II họ gen HKT, quy định các protein đồng vận

chuyển Na+ và K

+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na

+ khi ion này ở nồng độ cao [31;32].



QH.2014.T.CH - 60420121 10

Hình 1.3. GenOsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome [74]

1.2.4. Tình hình nghiên cứu họ genOsHKT

Hiện nay, một số thành viên trong họ gen OsHKT đã đƣợc nghiên cứu ở các

giống lúa Việt Nam: Đa hình của gen OsHKT1 (OsHKT2;1) trong công bố năm

2016 của Hoa và cộng sự (Pham Quynh Hoa, Rice Science 23:334-338); đa hình

của gen OsHKT1;2 công bố năm 2016 của Phúc và cộng sự (Đỗ Thị Phúc, VNU

Journal of Science: Natural Sciences and Technology 32: 189-193); đa hình của gen

OsHKT1;4 công bố năm 2015 của Hoa (Đặng Ngọc Hoa, Tạp chí Khoa học,

ĐHQGHN, số 31, 129-135); nghiên cứu mức độ biểu hiện của OsHKT2;1 công bố

năm 2016 của Phúc và cộng sự (Đỗ Thị Phúc, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt

Nam, số 2, 54-58) [66-69].

Trên thế giới có một số nghiên cứu về gen OsHKT2;4 nhằm đánh giá về mối

liên hệ của gen này và các quá trình đáp ứng stress mặn ở lúa. Nổi bật là các nghiên

cứu của T. Horie và các cộng sự tại Đại học Shinshu, Nhật Bản. Trong nghiên cứu

công bố năm 2011[32], tác giả đã phân tích khả năng vận chuyển chọn lọc cation

của OsHKT2;4, OsHKT2;4 thể hiện cách thức chọn lọc và vận chuyển ion K+ và

Na+ tƣơng đối khác biệt so với các protein vận chuyển HKT khác.



QH.2014.T.CH - 60420121 11

Tác giả đã mô tả sự chọn lọc ion của nhóm II họ gen HKT thông qua protein

vận chuyển của lúa OsHKT2;4 biểu hiện trên nấm men và trên trứng ếch châu Phi

(Xenopus laevis). Ở nấm men đột biến làm giảm khả năng hấp thụ K+, OsHKT2;4

đã khắc phục đƣợc khiếm khuyết trong phát triển của nấm men. Ở tế bào trứng

ếch,OsHKT2;4 biểu hiện khiến các tế bào trứng có khả năng thẩm thấu K+ mạnh

mẽ. Tuy nhiên các tế bào trứng biểu hiện OsHKT2;4 thẩm thấu K+ không yêu cầu

sự kích thích ngoại bào bởi Na+, điều này không giống với các protein vận chuyển

HKT lớp II khác. Hơn nữa, OsHKT2;4 thể hiện khả năng thẩm thấu cả Mg2+

và

Ca2+

khi không có sự cạnh tranh của ion K+, nhƣng khả năng thẩm thấu các cation

hóa trị 2 là không đáng kể khi có mặt K+. Điều này chứng tỏ OsHKT2;4 giống với

một kênh vận chuyển K+ chuyên biệt, không phụ thuộc vào ion Na

+, khác với các

kênh vận chuyển HKT nhóm II khác, vốn là kênh đồng vận chuyển ion K+/Na

+ [32].

Hiện nay chƣa có nghiên cứu về gen OsHKT2;4 thực hiện trên các giống lúa

Việt Nam. Do đó những thông tin về đa hình hay mức độ biểu hiện của gen

OsHKT2;4để phục vụ cho nghiên cứu chọn giống lúa ở Việt Nam còn rất hạn chế.

1.3. MộT Số PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU ĐA HÌNH

NUCLEOTIDE

1.3.1. Phƣơng pháp RFLP-PCR

Phƣơng pháp RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism-

Polymerase Chain Reaction) sử dụng kỹ thuật phát triển trên cơ sở phản ứng PCR

(Polymerase Chain Reaction) nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA.

1.3.1.1. Phản ứng PCR

PCR là phƣơng pháp đƣợc xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980.

Phản ứng đƣợc thực hiện dựa trên khả năng tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với

trình tự khuôn DNA ban đầu của DNA polymerase. Enzyme này chỉ có khả năng

kéo dài mạch nhờ gắn thêm một nucleotide vào nhóm chức3’-OH tự do của



QH.2014.T.CH - 60420121 12

nucleotide trƣớc đó, do đó nó cần có trình tự mồi chứa đầu 3’- OH tự do để thực

hiện kéo dài chuỗi. Điều này dẫn đến sự đặc hiệu của phản ứng PCR trong việc

khuếch đại một vùng DNA mong muốn bằng cách thiết kế mồi đặc hiệu.

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bằng máy gia nhiệt, giúp tăng giảm chính xác

nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng một cách nhanh chóng tại các khoảng thời gian xác

định ở mỗi chu kỳ. Đầu tiên, hai sợi của phân tử DNA kép phải đƣợc tách ra để cho

phép các cặp mồi bám vào khuôn, đƣợc gọi là giai đoạn biến tính DNA (94OC –

98OC). Sau khi tách sợi, nhiệt độ đƣợc làm giảm đến nhiệt độ gắn mồi, cho phép

mồi xuôi và mồi ngƣợc liên kết với các sợi DNA đơn. Tùy vào mục đích nghiên

cứu, cặp mồi có thể đƣợc thiết kế gắn ngẫu nhiên hay gắn đặc hiệu dựa trên trình tự

của vùng DNA quan tâm. Tiếp theo enzyme DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp

đoạn DNA mới từ mỗi sợi đơn theo chiều 5’ - 3’ ở nhiệt độ kéo dài chuỗi

(72OC).Quá trình này đƣợc lặp lại sau khoảng 25 - 40 chu kỳ. Phản ứng có thể tổng

hợp đƣợc rất nhiều bản sao của trình tự gen mong muốn chỉ trong thời gian vài giờ

[72].

Ở nhiệt độ biến tính DNA (khoảng 95OC), các polymerase của đa số sinh vật

đều bị phân giải và mất hoạt tính; vì vậy enzyme sử dụng cho phản ứng PCR cần là

enzyme chịu nhiệt. Ngƣời ta đã phân lập đƣợc một số vi khuẩn phát triển trong điều

kiện nhiệt độ cao, có thể lên tới 100OC, nhƣ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus

aqaticus và tách đƣợc polymerase của vi khuẩn này (Taq polymerase). Việc tìm ra

enzyme chịu nhiệt đã mở ra bƣớc tiến quan trọng cho phản ứng PCR và các kỹ thuật

ứng dụng phản ứng PCR trong xét nghiệm chẩn đoán và nghiên cứu phân tử.



QH.2014.T.CH - 60420121 13

1.3.1.2. RFLP-PCR

RPLP-PCR là phƣơng pháp phát triển trên cơ sở phản ứng PCR thƣờng đƣợc

sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền. Phƣơng pháp sử dụng phản ứng PCR

nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA, sau đó tiến hành phân cắt

đoạn DNA bằng enzyme cắt giới hạn. Đa hình di truyền của các mẫu DNA đƣợc

phân tích dựa trên sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sản phẩm

cắt bằng enzyme cắt giới hạn [72].Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy

điện di sẽ cho biết sự đa hình đoạn DNA phân tích.

Ƣu điểm của phƣơng pháp này là ít tốn kém, thao tác đơn giản, dễ thực hiện,

có thể ứng dụng trong phân tích đa hình đơn nucleotide. Tuy nhiên, nhƣợc điểm là

không xác định đƣợc chính xác trình tự gen, trình tự và vị trí đa hình. Mỗi enzyme

Hình 1.4.Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu

di truyền phân tử [79]



QH.2014.T.CH - 60420121 14

giới hạn thƣờng chỉ nhận biết và cắt tại một trình tự đặc hiệu nên sẽ khó có thể phân

tích đƣợc các gencó tính đa hình cao, do đó phƣơng pháp không thích hợp cho phân

tích các gen có mức độ đa hình cao, đòi hỏi sử dụng nhiều enzyme cắt.

1.3.2. Phƣơng pháp giải trình tự

Kỹ thuật giải trình tự là một trong những công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu

di truyền phân tử. Từ phƣơng pháp giải trình tự đầu tiên của Sanger, đến nay các

phƣơng pháp giải trình tự ngày càng đƣợc phát triển để đáp ứng với yêu cầu về độ

chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao [73].

Phƣơng pháp giải trình tự DNA đầu tiên đƣợc mô tả bởi Sanger và Coulson

đƣợc gọi là phƣơng pháp “cộng và trừ” [54]. Phƣơng pháp này sử dụng DNA

polymerase từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 với các nucleoside

triphosphate khác nhau [19;20]. Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase đƣợc điện di

trên gel acrylamide. Do sự không hiệu quả của phƣơng pháp này, nên 2 năm sau đó

ông và cộng sự đã mô tả một phƣơng pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự các

oligonucleotide thông qua chuỗi trùng hợp bằng enzyme [55].

Hình 1.5. Kỹ thuật giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger cải biến[76]



QH.2014.T.CH - 60420121 15

Phƣơng pháp này đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và đƣợc biết

đến nhƣ phƣơng pháp Sanger hay phƣơng pháp dideoxynucleotide. Bao gồm một

enzyme xúc tác phản ứng trùng hợp các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) bổ

sung với các mẫu DNA quan tâm. Phản ứng sẽ đƣợc kéo dài cho đến khi các

enzyme kết hợp một dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) đƣợc đánh dấu vào

chuỗi đang tổng hợp. Do các ddNTP không chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ

không thể xúc tác gắn thêm nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết

thúc. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 4 ống khác nhau, mỗi ống ngoài thành phần

của phản ứng PCR thông thƣờng sẽ chứa một loại ddNTP đƣợc đánh dấu.

Sau quá trình tổng hợp, sản phẩm gồm hỗn hợp các DNA kích thƣớc khác

nhau đƣợc điện di trên gel polyacrylamide biến tính theo 4 đƣờng chạy song song

và đƣợc đọc bằng phóng xạ tự ghi. Các phƣơng pháp giải trình tự bằng enzyme

khác cũng đƣợc sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu

di truyền [27].

Vào năm 1977, hai nhà khoa học ngƣời Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert

đã phát minh ra một phƣơng pháp hóa học có thể xác định đƣợc trình tự các

nucleotide trongchuỗi DNA. Theo phƣơng pháp này, trƣớc hết phân tử DNA đƣợc

đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, tạo ra những đoạn có thể đƣợc phát

hiện bằng hình ảnh phóng xạ. Sau đó các nucleotide trong phân tử DNA đƣợc đánh

dấu sẽ đƣợc xử lý với các hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử DNA tại

những vị trí nucleotide khác nhau. Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C,

và C. Kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1

base [41]. Các đoạn này đƣợc điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy

phóng xạ tự ghi, huỳnh quang hay các phản ứng màu nhờ enzyme [4;53].

Tổng hợp các kết quả, ta thu đƣợc trình tự các nucleotide trên mạch đơn

DNA, từ đó ta biết đƣợc trình tự sắp xếp các nucleotide của gen.

Ngày nay, việc giải trình tự đƣợc thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của

máy giải trình tự tự động. Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của

phƣơng pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP không đƣợc đánh dấu phóng



QH.2014.T.CH - 60420121 16

xạ mà đƣợc đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại

ddNTP. Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính nhƣ: hệ mao quản,

hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ

đƣợc phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu

sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G [73].

1.4. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MứC Độ BIểU HIệN CủA

GEN

1.4.1. Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ

Phƣơng pháp lai Northern blot đƣợc ra đời vào năm 1977, là một kĩ thuật

đƣợc sử dụng để phát hiện và định lƣợng các phân tử RNA cụ thể trong một hỗn

hợp các RNA. Northern blot đƣợc ứng dụng để phân tích các mẫu RNA từ một mô

hay tế bào cụ thể để định lƣợng mức độ biểu hiện của những gen quan tâm.

Phƣơng pháp Northern blot sử dụng mẫu RNA đã đƣợc biến tính thành các

sợi đơn. Các phân tử RNA này sau đó đƣợc phân tách theo kích thƣớc nhờ điện di.

Sau khi điện di, RNA trên các băng đƣợc chuyển lên màng thấm. Các màng thấm

này sẽ đƣợc lai với các mẫu đầu dò đƣợc thiết kế sẵn, có trình tự bổ sung với chuỗi

RNA quan tâm trong mẫu. Các đầu dò đƣợc phát hiện và định lƣợng nhờ đƣợc gắn

các nhãn phóng xạ nhờ đó xác định đƣợc kích thƣớc và nồng độ của phân tử RNA

quan tâm [34].

Cùng với sự phát triển của khoa học, các cải tiến trong lai Northern blot cũng

đƣợc ra đời. Tiêu biểu là việc sử dụng huỳnh quang thay thế cho các nhãn phóng xạ.

Ƣu điểm của huỳnh quang là an toàn, ít đòi hỏi các thiết bị máy móc phức tạp nhƣ

sử dụng nhãn phóng xạ [78].



QH.2014.T.CH - 60420121 17

Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ là phƣơng pháp mạnh mẽ nhằm

định tính và bán định lƣợng mức độ biểu hiện gen; phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng

rãi trong nghiên cứu di truyền phân tử. Tuy nhiên lai Northern blot đòi hỏi một

lƣợng mẫu tƣơng đối lớn, do đó phƣơng pháp khó áp dụng cho các trƣờng hợp gen

có mức độ biểu hiện thấp hay mức chênh lệch biểu hiện giữa các giống là tƣơng đối

nhỏ.

1.4.2. RT-PCR và Real-time PCR

Phƣơng pháp RT-PCR và Real-time PCR phát triển từ phản ứng PCR cơ bản

nhằm phân tích và định lƣợng chuỗi RNA quan tâm một cách đặc hiệu. Với ƣu

điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, đặc hiệu và độ nhạy

cao, có thể phân tích với lƣợng mẫu rất nhỏ, phƣơng pháp RT-PCR và Real-time

PCR đang ngày càng phổ biến và phát triển trong nghiên cứu di truyền phân tử [3].

Hình 1.6. Các bƣớc cơ bản trong phƣơng pháp Northern blot [78]



QH.2014.T.CH - 60420121 18

Phản ứng RT-PCR đƣợc sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen thông

qua quá trình tổng hợp cDNA từ RNA bằng enzyme phiên mã ngƣợc. cDNA sau đó

đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Sản phẩm của RT-PCR có thể đƣợc

định lƣợng nhờ điện di trên gel agarose sau khi chạy phản ứng PCR hoặc sử dụng

phản ứng Real-time PCR. Real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản

phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đánh dấu huỳnh

quang, nồng độ sản phẩm đƣợc phân tích dựa trên cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang,

từ đó tính toán đƣợc nồng độ khuôn ban đầu [3;70].

Real-time PCR cho phép định lƣợng nồng độ sản phẩm và nồng độ khuôn

với độ chính xác và độ nhạy cao. Phƣơng pháp Real-time PCR có thời gian thực

hiện ngắn với ít thao tác thí nghiệm, nhờ đó tránh đƣợc hiện tƣợng nhiễm hay suy

thoái mẫu so với sử dụng phản ứng RT-PCR. Nhờ những đặc điểm ƣu việt, Real-

time PCR đƣợc xem là một công cụ mạnh mẽ trong định tính và định lƣợng các

mẫu sinh học phân học phân tử [10;22].

Hình 1.7. Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR [77]



QH.2014.T.CH - 60420121 19

1.4.3. Các phƣơng pháp sử dụng chip

Phƣơng pháp sử dụng chip Microarray là những phƣơng pháp dựa trên

nguyên tắc lai phân tử, trong đó các đoạn đầu dò mang chỉ thị đƣợc gắn lên bề mặt

rắn bằng các liên kết hóa học. Các dạng phân tử quan tâm sẽ đƣợc chạy qua giá thể

gắn đầu dò. Quá trình lai phân tử diễn ra một cách đặc hiệu giữa đầu dò và phân tử

cần quan tâm, nhờ các chỉ thị nhƣ phóng xạ hay huỳnh quang gắn trên đầu dò,

ngƣời ta xác định đƣợc chính xác vị trí và trình tự của phân tử.

Phƣơng pháp này có thể thực hiện để định tính và định lƣợng cùng lúc nhiều

gen trong một thời gian ngắn, với hiệu quả và độ nhạy rất cao. Tuy nhiên phƣơng

pháp này đòi hỏi hệ thống máy móc phức tạp cùng chi phí vận hành cao [71].

Hình 1.8. Sử dụng chip Microarray trong phân tích biểu hiện [71]



QH.2014.T.CH - 60420121 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Anh

1. Ali S., Delphine M., Imran K., Bertrand M., Isabelle G., (2012), “The Rice

Monovalent Cation Transporter OsHKT2;4: Revisited Inonic

Selectivity”, Plant Physiology, 160, pp. 498-510.

2. Albright R. A., Joh K., Morais-Cabral J. H. (2007) “Probing the structure of

thedimeric KtrB membrane protein”,J Biol Chem 282, pp. 35046–35055.

3. Alwine J. C., Kemp D. J., Stark G. R., (1977), “Method for detection of

specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper

and hybridization with DNA probes”. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A, 74 (12),pp. 5350-5354.

4. Ansorge W., Rosenthal, A., Sproat B., Schwager C., Stegemann J., Voss H.

(1988),“Nonradioactive automated sequencing of oligonucleotides by

chemical degradation”, Nucleic Acids Res., 16, pp. 2203-2206.

5. Apse M. P., Aharon G. S., Snedden W. A., Blumwald E. (1999), “Salt

tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H

+ antiport in

Arabidopsis”. Science 285, pp. 1256–1258.

6. Barish M. E. (1983) “A transient calcium-dependent chloride current in the

immature Xenopus oocyte”, J Physiol 342, pp. 309–325.

7. Bassil E., (2011), “The Arabidopsis intracellular Na+/H

+ antiporters NHX5 and

NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and

development”, Plant Cell, 23, pp. 224-239.

8. Ben A. S., Brini F., Sentenac H., Masmoudi K., Véry A. A. (2014),

“Functional characterization in Xenopus oocytes of Na+ transport systems

from durum wheat reveals diversity among two HKT1;4 transporters”. J

Exp Bot. 65(1), pp. 213–222.

9. Boyer J. S., (1982)“Plant productivity and environment”, Science, 218, pp.

443-451.

10. Bustin S. A., Benes V., Nolan T., Pfaffl M. W. (2005), “Quantitative real-time

RT-PCR a perspective”. J. Mol. Endocrinol. 34 (3),pp. 597-601.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC431715




http://jme.endocrinology-journals.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=15956331

http://jme.endocrinology-journals.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=15956331



QH.2014.T.CH - 60420121 52

11. Byrt C. S., Platten J. D., Spielmeyer W., James R. A., Lagudah E. S., Dennis

E. S.,Tester M., Munns R. (2007),“HKT1;5-like cation transporters

linkedto Na+ exclusion loci in wheat, Nax2 and Kna1”. Plant Physiol

143, pp. 1918–1928.

12. Børresen A. L. (2002), “Mismatch detection using heteroduplex analysis”,

Curr Protoc Hum Genet, 7(3).

13. Chauhan S., Forsthoefel N., Ran Y., Quigley F., Nelson D. E., Bohnert H. J.

(2000),“Na+/myo-inositol symporters and Na

+/H

+-antiport in

Mesembryanthemum crystallinum”. The Plant Journal 24, pp. 511–522.

14. Coskun D., Britto D. T., Li M., Oh S., Kronzucker H. J. (2013), “Capacity and

plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of

barley and Arabidopsis”. Plant Physiol 162, pp. 496–511.

15. Corratgé C., Zimmermann S., Lambilliotte R., Plassard C., Marmeisse R.,

Thibaud J-B., Lacombe B., Sentenac H. (2007) “Molecular and

functional characterization of a Na+-K

+ transporter from the Trk family in

the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum”. J Biol Chem

282, pp. 26057–26066.

16. Davenport R. J., Munoz-Mayor A., Jha D., Essah P. A., Rus A., Tester M.

(2007), “The Na+ transporter AtHKT1;1 controls retrieval of Na

+ from

the xylem in Arabidopsis”. Plant Cell Environ 30, pp. 497–507.

17. Dinneny J.R., Long T.A., Wang J.Y., Jung J.W., Mace D., Pointer S., Barron

C., Brady S.M., Schiefelbein J.,Benfey P.N. (2008),“Cell identity

mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress”. Science

320, pp. 942–945.

18. Doyle D. A., Morais C. J., Pfuetzner R. A., Kuo A., Gulbis J. M., Cohen S. L.,

Chait B. T., MacKinnon R. (1998), “The structure of the potassium



QH.2014.T.CH - 60420121 53

channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity”. Science 280,

pp. 69–77.

19. Englund P. T. (1971). “Analysis of nucleotide sequences at 3’ termini of

duplex deoxyribonucleic acid with the use of the T4 deoxyribonucleic

acid polymerase”. J. biol. Chem. 246, pp. 3269-3276.

20. Englund P. T. (1972). “The 3’-terminal nucleotide sequences of T7 DNA”. J.

molec. Biol. 66, pp. 209-224.

21. Fairbairn D. J., Liu W., Schachtman D. P., Gomez-Gallego S., Day S. R.,

Teasdale R. D. (2000) Characterisation of two distinct HKT1-like

potassium transporters from Eucalyptus camaldulensis”. Plant Mol Biol

43, pp. 515–525.

22. Fink L., Seeger W., Ermert L., Hanze J., Stahl U., Grimminger F., Kummer

W., Bohle R. M. (1998), “Real-time quantitative RT-PCR after laser-

assisted cell picking”. Nature Medicine 4, pp. 1329–1333.

23. Fukuda A., Nakamura A., Tagiri A., Tanaka H., Miyao A., Hirochika H.,

Tanaka Y. (2004),“Function, intracellular localization and the importance

in salt tolerance of a vacuolar Na+/H

+ antiporter from rice”. Plant and

Cell Physiology 45, pp. 146–159.

24. Galvan-Ampudia C. S., et al. (2013), “Halotropism is a response of plant roots

to avoid a saline environment”, Curr. Biol. 23, pp. 2044–2050.

25. Garciadeblas B., Senn M.E., Banuelos M.A., Rodriguez-Navarro, (2003),“A.

Sodium transport and HKT transporters: The rice model”. Plant J. 34, pp.

788-801.

26. Gregoire C., Rémus-Borel W., Vivancos J., Labbé C., Belzile F., Bélanger R.

R. (2012), “Discovery of a multigene family of aquaporin silicon

transporters in the primitive plant Equisetum arvense”. Plant J. 72, pp.

320–330.

27. Griffin H. G. & Griffin A. M. (1993),“DNA sequencing - recent innovations

and future trends”. Appl. Biochem.Biotechnol. 38, 147-159.



QH.2014.T.CH - 60420121 54

28. Haferkamp I., Linka N. (2012), “Functional expression and characterization of

membrane transport Proteins”. Plant Biol. 14, pp. 675–690.

29. Hauser F., Horie T. (2010), “A conserved primary salt tolerance mechanism

K+, Mg

2+, and Ca

2+ Transport by OsHKT2;4 from Rice mediated by HKT

transporters: a mechanism for sodium exclusion and maintenance of high

K+/Na

+ ratio in leaves during salinity stress”. Plant Cell Environ 33, pp.

552–565.

30. Hedrich R. (2012), “Ion channels in plants”. Physiol. Rev. 92, pp. 1777–1811.

31. Horie T, Costa A, Kim TH, Han MJ, Horie R, Leung HY, Miyao A, Hirochika

H, AnG, Schroeder JI. (2007), “Rice OsHKT2;1 transporter mediates

large Na+ influx component into K

+-starved roots for growth”. EMBO

Journal 26, pp. 3003-3014.

32. Horie T., Dennis E. B.,Costa A.,Kaneko T., Fiorella L. S., Katsuhara M.,Julian

I. S. (2011), “K+ Transport by the OsHKT2;4 Transporter from Rice with

Atypical Na+ Transport Properties and Competition in Permeation of K

+

over Mg2+

and Ca2+

Ions”, Plant Physiology 156, pp. 1493–1507.

33. Jabnoune M., Espeout S., Mieulet D., Fizames C., Verdeil J. L., Conejero

G.,Rodrıguez-Navarro A., Sentenac H., Guiderdoni E., Abdelly C.

(2009),“Diversity in expression patterns and functional properties in

therice HKT transporter family”. Plant Physiol 150,pp. 1955–1971.

34. Jump S. S., Michalski C. W.,Erkan M., Kleeff J., Friess H. (2009). "Northern

blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer

cells and tissues". Nat Protoc 4(1), pp.37-43.

35. Kader M. A., Seidel T., Golldack D., Lindberg S. (2006), “Expressions of

OsHKT1, OsHKT2, and OsHVA are differentially regulated under NaCl

stress in salt-sensitive and salt-tolerant rice (Oryza sativa L.)

cultivars”. Journal of Experimental Botany;57, pp. 4257-4268.

36. Kazuko Y. S., Kazuo S. (1994), “A Novel cis-Acting Elenent in an

Arabidopsis Gene Is Inviloved in Responsiveness to Drought, Low-

http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2008.216






QH.2014.T.CH - 60420121 55

Temperature, or High-Salt Stress”, American Society of Plant

Physiologists, 6, pp. 251-264.

37. LanW. Z.,WangW.,Wang S. M., Li L. G., Buchanan B. B., Lin H. X., Gao J.

P., Luan S. (2010),“A rice high-affinity potassium transporter (HKT)

conceals acalcium-permeable cation channel”. Proc Natl Acad Sci USA

107, pp. 7089–7094.

38. Lu C. A., Lim E. K., Yu S. M. (1998) “Sugar response sequence in the

promoter of a rice alpha-amylase gene serves as a transcriptional

enhancer”. J Biol Chem. 273, pp. 10120.

39. MaH.,Chong K., Deng X.W.(2007). “Rice research: past, present and

future”. J. Integr. Plant Biol. 49, pp. 729-730.

40. Maathuis F. J. M. (2006),“The role of monovalent cation transporters in plant

responses to salinity”. Journal of Experimental Botany 57, pp. 1137–

1147.

41. Maxam A. M., Gilbert W. (1977),“A new method for sequencing DNA”. Proc.

natn. Acad. Sci. USA 74, pp. 560-564.

42. Mazel A., Leshem Y., Tiwari B. S., Levine A. (2004), “Induction of salt and

osmotic stress tolerance by overexpression of an intracellular vesicle

trafficking protein AtRab7 (AtRabG3e)”. Plant Physiol. 134, pp. 118–

128.

43. Marassi F. M., Das B. B., Lu G. J., Nothnagel H.J., Park S. H., Son W. S.,

Tian Y., Opella S.J. (2011), “Structure determination of membrane

proteins in five easy pieces”. Methods 55, pp. 363–369.

44. Muller P. Y., Janovjak H., Miserez A. R., Dobbie Z. (2002),“Processing of

gene expression data generated by quantitative real-time RTPCR”.

BioTechniques 32, pp. 1372–1379.



QH.2014.T.CH - 60420121 56

45. MunnsR.,Tester M. (2008),“Mechanisms of salinity tolerance”. Annu. Rev.

Plant Biol. 59, pp. 651–681.

46. Møller I. S., Gilliham M., Jha D., Mayo G. M., Roy S. J., Coates J. C.,

Haseloff J., Tester M. (2009) “Shoot Na+ exclusion and increased

salinity toleranceengineered by cell type-specific alteration of Na+

transport in Arabidopsis”. Plant Cell 21, pp. 2163–2178.

47. Nugent T., Jones D.T., (2012),“Membrane protein structural bioinformatics”.

J. Struct. Biol.179, pp. 327–337.

48. Ohgaki R., Fukura N., Matsushita M., Mitsui K., Kanazawa H. (2008), “Cell

surface levels of organellar Na+/H

+ exchanger isoform 6 are regulated by

interaction with RACK1”. J. Biol. Chem. 283, pp. 4417–4429.

49. Plett D.C., Møller I.S. (2010), “Na+ transport in glycophytic plants: What we

know and would like to know”. Plant Cell Environ. 33, pp. 612-626.

50. Pyo Y. J., Gierth M., Schroeder J. I., Cho M. H. (2010),“High-affinity K+

transportin Arabidopsis: AtHAK5 and AKT1 are vital for seedling

establishmentand postgermination growth under low-potassium

conditions”. PlantPhysiol 153,pp. 863–875.

51. RenZ.H.,(2005), “A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a

sodium transporter”. Nat. Genet. 37, pp. 1141-1146.

52. Rengasamy P.,(2006), “World salinization with emphasis on Australia”. J.Exp.

Bot. 57, pp. 1017-1023.

53. Richterich P. (1989),“Non-radioactive chemical sequencing of biotin labeled

DNA”. Nucleic Acids Res. 17, pp. 2181-2186.

54. Sanger F., Coulson A. R. (1975),“A rapid method for determining sequences

in DNA by primed synthesis with DNA polymerase”. J. molec. Biol. 94,

pp. 441-448.



QH.2014.T.CH - 60420121 57

55. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977). “DNA sequencing with chain-

terminating inhibitors”. Proc. natn. Acad. Sci. USA 74, pp. 5463-5467.

56. SchachtmanD.P., Schroeder J.I.,(1994), “Structure and transport mechanism of

a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants”. Nature

370, pp. 655-658.

57. Shane W., Matthew G., Maria H. (2013), “Plant High-Affinity Potassium

(HKT) Transporters Involved in Salinity Tolerance: Structural Insights to

Probe Differences in Ion Selectivity”, Int. J. Mol. Sci. 14, pp. 7660-7680.

58. Sharpe R. G., Hims M. M., Harbach R. E., Butlin R. K. (1999) “PCR-based

methods for identification of species of the Anopheles minimus group:

allele-specific amplification and single-strand conformation

polymorphism”, Med Vet Entomol., 13(3), pp. 265-273.

59. Sunarpi H., Horie T., Motoda J., Kubo M., Yang H., Yoda K., Horie R., Chan

W. Y., Leung H. Y., Hattori K. (2005), “Enhanced salt tolerance

mediated by AtHKT1 transporter-induced Na unloading from xylem

vessels to xylem parenchyma cells”. Plant J 44, pp. 928–938.

60. Takahashi N., Goto N., Okada K.,Takahashi H. (2002), “Hydrotropism in

abscisic acid, wavy, and gravitropic mutants of Arabidopsis thaliana”.

Planta 216, pp. 203–211.

61. Wenli L., Michael O. (2013), “Current analysis platforms and methods for

detecting copy number variation”, Physiol Genomics, 45(1), pp. 1-16.

62. Xiayu R., Xuelin H., Zhicheng Z., Xin L. (2013), “An improvement of the 2ˆ(–

delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain

reaction data analysis”, Biostat Bioinforma Biomath, 3(3): 71–85.

63. Yi S., Weigui L., Wanhuang L., Liying M., Mohammed H. K. (2015), “Model

of Cation Transportation Mediated by High-Affinity Potassium



QH.2014.T.CH - 60420121 58

Transporters (HKTs) in Higher Plants”, Biological Procedures Online

17(1), pp. 1-13.

64. Yao X., Horie T., Xue S., Leung H-Y., Katsuhara M., Brodsky D. E., Wu

Y.,Schroeder J. I. (2010),“Differential sodium and potassium transport

selectivitiesof the rice OsHKT2;1 and OsHKT2;2 transporters in plant

cells”.Plant Physiol 152,pp. 341–355.

65. Yoo S. D., Cho Y. H., Sheen J. (2007), “Arabidopsis mesophyll protoplasts: a

versatile cell system for transient gene expression analysis”. Nat Protoc

2, pp. 1565–1572.

66. Hoa P. Q., Tran X. An., Trang N. T. N., Anh T. T. T., Yen H. H., Van N. T.

H., Hanh T. T., Phuc D. T. (2016), “Investigation of polymorphisms in

the coding region of OsHKT1 gene in relation to salinity in rice”. Rice

Science 23, pp. 334-338.

67. Phuc D. T., Minh N. V., Yen H. H. (2016),“Assessment of natural variation in

OsHKT1;2 gene in rice (Oryza sativa)”. VNU Journal of Science: Natural

Sciences and Technology 32: 189-193

Tiếng Việt

68. Đặng Ngọc Hoa, Đỗ Thị Phúc (2015). “Nghiên cứu đa hình và phân tích các

yếu tố cis thuộc vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở lúa”. Tạp chí Khoa

học, ĐHQGHN, số 31, 129-135.

69. Đỗ Thị Phúc, Phạm Quỳnh Hoa (2016). “Nghiên cứu mức độ biểu hiện của

gen OsHKT2;1 đáp ứng điều kiện mặn ở cây lúa bằng phƣơng pháp RT-

PCR bán định lƣợng”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 2,

54-58

Website

70. https://aem.asm.org/content/64/7/2572/F1.expansion.html

Documents

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN - repository.vnu.edu.vnrepository.vnu.edu.vn/bitstream/VNU_123/33538/1/01050003461(1).pdf · Hình2.2. Các bƣớc thực hiện thí nghiệm phân