PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS GÂY CHẾT SÂU KHOANG ĂN TẠP

(SPODOPTERA LITURA) VÀ XÁC ĐỊNH HIỆU LỰC CỦA

CÁC CHỦNG THU NHẬN ĐƢỢC

ĐẶT VẤN ĐỀ

MỤC TIÊU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

KẾT LUẬN

PHƢƠNG PHÁP/ KẾT QUẢ

Thu thập các chủng NPV sâu khoang tại thành phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa – Vũng Tàu và định danh.

Đánh giá hiệu lực trừ sâu của chủng để làm cơ sở cho việc sản xuất và sử dụng các chủng này trong phòng trừ

sâu khoang hại cây trồng.

HỘI NGHỊ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC KHU VỰC PHÍA NAM LẦN III - 2013

Tiểu ban: Công nghệ Vi sinh

Mã số báo cáo: P1-22

Hai chủng virus được phân lập từ sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) vùng trồng cà chua và bắp tại thành phố Hồ Chí Minh và Bà Rịa, Vũng Tàu. Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, thể vùi được thu hồi và

tinh sạch từ xác sâu, DNA tổng số được trích ly, polyhedrin gene được khuếch đại bằng PCR với mồi đặc hiệu polh gene và giải trình tự. Tra cứu trên Ngân hàng gene (NCBI Genbank) cho thấy trình tự nucleotide của polh

gene và amino acid của sản phẩm protein tương ứng của hai chủng phân lập có độ tương đồng cao, đồng thời cũng tương đồng với các chủng SlNPV khác của Ngân hàng Gene. Điều này khẳng định 2 chủng virus phân lập

này đều là Spodoptera litura nucleopolyhedrosis virus. Định lượng DNA trong thể vùi bằng phương pháp real-time PCR cho thấy điểm khác biệt giữa hai chủng phân lập. Số lượng DNA trong thể vùi SlNPV H2 cao hơn hẳn số

DNA trong thể vùi SlNPV H1, cụ thể là 500-1000 copies/OB so với 7-18 copies/OB. Thử nghiệm hoạt tính trong phòng thí nghiệm cho thấy giá trị LC50 của SlNPV H1 và SlNPV H2 trên sâu tuổi 3 là 8,84 x 102 PIB/ml và 6,21 x

102 PIB/ml tương ứng.

Từ khóa: hiệu lực trừ sâu, LC50, nucleopolyhedrosis virus, polh gene, PCR, Spodoptera litura,

Chúng tôi đã phân lập được 2 chủng virus NPV phòng trừ sâu khoang gây hại trên cây trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và Bà Rịa –

Vũng Tàu (ký hiệu là SlNPV H1 và SLNPV H2)). Kết quả định giải trình tự polh gene và so sánh với cơ sở dữ liệu trên Ngân hàng

gene cùng với các sản phẩm protein của chúng cho thấy cả 2 chủng SlNPV H1 và SlNPV H2 có mối quan hệ gần nhau và có tỷ lệ

tương đồng cao (99%) với các chủng Spodoptera litura nucleopolyhedrosis virus trên GenBank. Giá trị LC50 đối với sâu khoang tuổi 3

của SlNPV H1 và SlNPV H2 tương ứng là 8,84 x 102/PIB/ml và 6,21 x 102 PIB/ml thể hiện hiệu lực trừ sâu tiềm năng. Nghiên cứu tiếp

theo là đánh giá hiệu lực diệt sâu của virus NPV trên đồng và trên các loài cây trồng.

Sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) là đối tượng gây hại nghiêm trọng trên phạm vi toàn thế giới cũng như ở Việt Nam.

Chúng xuất hiện khá phổ biến trên các cây rau, màu tại thành phố Hồ Chí Minh và các vùng phụ cận. Phạm vi ký chủ của sâu

khoang ăn tạp (Spodoptera litura) khá rộng với trên 290 loài cây bao gồm cả cây thực phẩm, rau quả, cỏ dại và cây cảnh. Tuy

nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng Spodoptera litura đã phát triển tính kháng chống lại hầu hết các nhóm thuốc trừ

sâu được sử dụng [1]. Trong số các loài thiên địch của sâu khoang, nucleopolyhedrosis virus (NPV) được coi là tác nhân triển

vọng nhất vì khả năng diệt sâu và mức độ lây lan trong quần thể cao nhưng lại rất chuyên tính và an toàn đối với con người và

môi trường [4].

Kết quả định danh các mẫu thu thập đƣợc

Nguyễn Thị Hai*, Nguyễn Hoài Hương, Lâm Hữu Lộc

Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh

Thu sâu khoang các tuổi (sâu tuổi 3 trở lên) trên các cây trồng và đem về nuôi riêng từng cá thể .

Thu sâu chết có triệu chứng như: cơ thể mọng nước, sâu có màu trắng, lớp da mềm dễ vỡ, không có mùi hôi và dịch cơ thể

có màu trắng đục, đem ly tâm và định danh.

Địa điểm thu

nhận

Đặc điểm của các chủng virus thu thập được

Kết quả nhiễm lại các chủng virus trên sâu ký chủ

Tên

Chủng

Tuổi sâu

chết

Triệu chứng sâu chết Sâu khoang

Sâu xanh đục

quả

Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh

SlNPV H1

2,3,4,5

Không có mùi hôi, cơ thể màu trắng đục, căng

phồng và dễ vỡ

95 0

Bà Rịa - Vũng Tàu

SlNPV H2

2,3,4,5 Không có mùi hôi, cơ thể màu trắng đục, căng

phồng và dễ vỡ

97 0

STT Protein Số lượng

amino acid

Tỉ lệ trùng với

polh gene

SlNPV H1/

SlNPV H2 (%)

Tỉ lệ trùng với

polyhedrin

protein SlNPV H1/

SlNPV H2 (%)

Mã số truy cập

gene/protein

1 Spodoptera litura

NPV G2 249 99,9/99,2 99,9/98,7

AF325155.1/

AAL01689.1

2 Spodoptera litura

NPV 249 99,9/99,2 99,6/98,7

NC003102.1/NP

258269

3 Spodoptera litura

NPV 249 99,7/99,4 99,7/98,7

AF037262/AAC

09246.1

4 Spodoptera litura

NPV G10-3 249 99,7/99 99,1/98,3

AY549964.1/

AAS90121.1

5

Spodoptera littoralis NPV

AN1956

248 94,0/93,7 99,6/98,7

JX454574.1/

AGE89856

6 Spodoptera

littoralis NPV Az 249 94,2/93,8 99,6/98,7

AY600451.1/

AAT10182.1

7 Spodoptera litura

NPV 249 94,2/93,8 99,6/98,7

DQ350142.1/AB

C71077.1

8 Spodoptera litura

NPV 249 93,8/93,4 98,3/97,4

DQ152923.1/

AAZ78353.1

9 Spodoptera exigua

MNPV 246 79,5/79,4 84,7/84,7

NC003094.2/

NP037761.1

10

Helicoverpa armigera NPV

PAU

246 74,2/74,4 85,8/85,1 FJ157291.1/

ACI05102.1

Bảng 3. Kết quả so sánh trình tự polh gene và amino acid polyhedrin protein của một số chủng NPV

Đánh giá hiệu lực diệt sâu của 2 chủng virus SlNPV1 và SlNPV2 trên sâu tuổi 3

Thu thập các chủng NPV gây chết sâu khoang tại thành phố Hồ Chí Minh và

các vùng lân cận

Địa điểm Cây

trồng

Tổng số

sâu thu

Tỷ lệ (%) sâu chết

Do vi sinh vật Do côn trùng

Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh Cà chua 340 5,59 3,24

Bà Rịa – Vũng Tàu Ngô 637

8,48 9,26

Bảng 1. Kết quả thu thập tác nhân gây chết sâu khoang gây hại cây trồng

Bảng 5. Hiệu lực diệt sâu tuổi 3 của chủng SlNPV H2 ở các nồng độ thí nghiệm

Bảng 6. Giá trị LC50 của 2 chủng virus SlNPV1 và SlNPV2 trên sâu khoang

Bảng 4. Hiệu lực diệt sâu tuổi 3 của chủng SlNPV H1ở các nồng độ thí nghiệm

PHƢƠNG PHÁP/ KẾT QUẢ

Hình 4. Đánh giá hiệu lực

diệt sâu của NPV được thực

hiện trên cơ sở phương pháp

nhúng lá (leaf dip bioassay)

HÌnh 6. Đếm PIB bằng buồng

đếm hồng cầu

Hình 1. Sâu khoang bị chết do NPV

Cả 2 chủng đều rất

chuyên tính. Chúng chỉ

gây chết trên sâu khoang

và không gây chết sâu

xanh.

Theo Bergold et al. (1963)

và Ravishankar et al.

(2010), đặc điểm gây chết

sâu là do NPV gây ra

Định danh virus phân lập

Hình 2. Quy trình chuẩn bị mẫu

virus định danh.

Bảng 2. Đặc điểm của các chủng virus thu thập được và kết quả nhiễm lại các

chủng virus trên một số loài sâu ký chủ

Hình 3. Quy trình định danh virus

bằng giải trình tự polh gene.

Polyhedrin gene (polh gene) là gene mã hóa

trình tự amino acid tạo nên thể vùi baculovirus,

có ảnh hƣởng lớn đến sự tồn tại và bền vững

của virus trong môi trƣờng tự nhiên trƣớc khi

bị sâu ăn vào.

Trình tự amino acid quyết định cấu trúc không

gian và khả năng thấm nƣớc của thể vùi.

Protein này khá ổn định về trình tự và thƣờng

đƣợc sử dụng để định danh baculovirus theo

Woo et al. (2005).

Hai chủng virus phân lập có tỉ

lệ trùng với polh gene của

Spodoptera litura NPV G2

(AF325155.1), Spodoptera litura

NPV (NC003102.1), Spodoptera

litura NPV (AF037262.1),

Spodoptera litura NPV G10-3

(AY549964.1) > 99%, trùng với

polh gene của SpliNPV nhƣ

Spodoptera littoralis NPV

AN1956 (JX454574.1),

Spodoptera littoralis NPV Az

(AY600451.1) và hai chủng

SlNPV khác Spodoptera litura

NPV (DQ350142.1), Spodoptera

litura NPV (DQ152923.1) là 93-

94%. Trong khi đó tỉ lệ trùng với

polh gene của SeNPV và HaNPV

chỉ khoảng 70-80%.

Không có sự khác biệt đáng

kể nào giữa trình tự amino acid

trong polyhedrin gene của

SlNPV, cũng nhƣ khi so với

SpliNPV. Ngƣợc lại, khi so với

SeNPV và HaNPV thì tỉ lệ sai

khác rất rõ rệt.

Nồng độ virus

(PIB/ml)

Hiệu lực diệt sâu (%) của SlNPV H1 sau … ngày phơi nhiễm

4 5 6 7 8

6,4 x 103 25,00 48,33 56,67 68,34 70,00

3,2 x 104 38,33 60,00 68,33 75,00 76,67

1,6 x 105 33,33 51,66 58,33 75,00 85,00

8 x 105 40,00 70,00 83,33 90,00 93,33

4 x 106 43,33 75,00 88,33 95,00 98,33

Nồng độ virus

(PIB/ml)

Hiệu lực diệt sâu (%) củaSlNPV H2 sau … ngày phơi nhiễm

4 5 6 7 8

6,4 x 103 31,67 51,67 65,00 70,00 71,67

3,2 x 104 33,33 55,00 73,33 81,66 86,66

1,6 x 105 33,33 58,33 75,00 88,33 93,33

8 x 105 35,00 60,00 78,33 93,33 96,66

4 x 106 51,67 80,00 91,67 98,33 100,00

Chủng virus LC50

(PIB/ml)

Giới hạn 95% Độ dốc

Độ lệch

chuẩn X2 df

Dưới Trên

SlNPV1 8,84 x 102 4 x 101 3,64 x 103 0,510 0,387 1,162 3

SlNPV2 6,21 x 102 2 x 101 2,85 x 103 0,511 0,130 0,389 3

Hiệu lực diệt sâu của

chủng SLNPV H2 cao hơn

hiệu lực của chủng

SLNPV H1.

Giá trị LC50 của 2 chủng

này khá thấp so với các

nghiên cứu của Tran Thi

Kieu Trang et al (2002)

[14] và chứng tỏ hiệu lực

diệt sâu của 2 chủng này

cao hơn nhiều

1. Nguyễn Văn Đĩnh, Hà Quang Hùng, Nguyễn Thị Thu Cúc, 2012.Côn trùng và động vật hại nông nghiệp Việt Nam. NXB nông

nghiệp. Hà Nội. 2. Bergold, G. H., 1963a. Fine structure of some insect viruses. Journal Insect Pathology, 5: 111 – 128. 3. MartinsT.etal.,2005.Occurrence and characterization of nucleopolyhedrovirus from Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctu

idae) isolated in the azores. J Invertebr Patho. 89:185-92. 4. Ravishankar B. S. and Venkatesha M. G., 2010. Effectiveness of SlNPV of Spodoptera litura (Fab.) (Lepidoptera:Noctuidae)

on different host plants. Journal of Biopesticides 3 (1 Special Issue): 167 – 171. 5. Tran Thi Kieu Trang and S. Chaudhari , 2002. Bioassay of nuclear polyhedrosis virus (NPV) and in combination with

insecticide on Spodoptera litura (Fab). Omonrice 10: 45 – 53. 6. Woo S. D. , Jet Y. H., Jin B. R., 2005.Characterization of the Polyhedrin Gene of Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus

Isolated in Korea. J. Asia-Pacific Entomol. 8: 257-262.

ăn

* 475A Điện Biên Phủ, P. 25, Q. Bình Thạnh, Tp.Hồ Chí Minh E-mail: nguyenthihai12@gmail.com

Điện di gel agarose đoạn gene khuếch

đại bằng PCR với mồi đặc polh gene

TÓM TẮT