T R Ầ N L I N H T H Ư Ớ C

P H Ư Ơ N G P H Á P P H Â N T Í C H

V I S I N H V Ậ T

T R O N G N Ư Ớ C ,

T H Ự C P H Ẩ M V À M ĩ P H Ẩ M

(Tiái bản lần thứ hai)

N H À X U Ấ T B Ả N G I Á O Đ Ú C

B ả n q u y ề n thuộc N h à xuất bản G i á o dục

604-2006/CXB/8-1291/GD Mã số: 7K499t6-DAI

L Ờ I N Ó I Đ ầ u

gô độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên, trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gáy ra các vụ ngõ dóc thức phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có nguồn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của dóc lố tiết ra bởi các ví sinh vật này trong nước uống, thực phẩm Ngày nay, an toàn, nhất là vế phương diện vi sinh vật, trở thành một trong những yêu cầu không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm.

Việt Nam là mót nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủy hải sản, thực phẩm. Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho gần 80 triệu dân, thực phẩm và thủy sản của nưóc ta cũng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới. Dặc biệt, thủy, hải sản chế biến

của Viét Nam đã có được thị phần quan trọng tại Bắc Mỹ, châu Âu, Nhật Bản..., là một trong những ngành kinh tế mang lại ngoại tệ quan trọng cho đất nước, giải quyết việc làm cho một số lượng lán người lao động ở cả nông thôn và thành thị. Do nhận thức ngày càng được nâng cao của người tiểu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự tăng cường về

quản lý nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng, việc phân tích vi sính vật gây bênh và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vế vi sinh vật ngày càng được các đơn vị sản xuất, chế biến thực phẩm nội địa quan tâm DỐI với thủy hải sản xuất khẩu, để đáp ứng tiêu chuẩn nghiêm ngặt về vi sinh của các thị trường thế giới và tảng cường năng lực cạnh tranh, trong những năm gần đây, các đơn vị sản xuất chê biên thủy hải sản xuất khẩu Việt Nam đả rất chú trọng đến việc đáu tư đổi mới cóng nghệ, thực thi các chương trinh quản lý đảm bảo chất lượng như HACCP1', trong đó viêc xảy dựng phòng phân tích, kiểm định và đào tạo cán bộ phân tích, kiểm định vi sinh vật ngày càng được quan tâm.

Như vậy. hiện nay đang có một nhu cẩu thực tiễn rất lân về phía nhà sản xuất cùng như về phía người lao động về đào tạo cán bộ phân tích vi sinh vật gày bệnh trong thực phẩm. Nhà sản xuất có phòng thi nghiêm phẫn tích tốt, có đội ngủ phàn tích có tay nghề cao sẽ dễ thuyết

phục. tạo được niềm tin ở đối tác để kỷ kết các hợp đổng sản xuất quan trọng. Cán bộ kỹ thuảt. kỳ thuât viên được đào tạo, nâng cao kỹ nàng về phân tích vi sinh vật sẻ dễ củng cố vai trò và sự cần thiết của mình đối với đơn vị. Thanh niên, học sinh, sinh viên được đào tạo về

phân tích vi sinh vật gảy bệnh trong thực phẩm sẻ có lợi thế hơn trong tìm việc làm trong lĩnh

vực sản xuất, chế biến thực phẩm, đặc biệt là thủy hải sản xuất khẩu

Mát khác, sau thực phẩm, nhu cẩu về làm đẹp đã trở thành mối quan tâm rất quan trọng của xã hôi khi đời sống kinh tế ngày càng được cải thiên Thị trường và chủng loại mỹ phẩm được sản xuất và tiêu thụ tại Việt Nam ngày càng được mỏ rông. Mặc dù không được

''' HACCP : Hazard Analysis and Critical Control Points (Phân tích mối nguy và điểm kiếm

soát tới hạn).

3

đưa vào đường tiêu hóa. nhưng sự tiếp xúc trực tiếp. thường xuyên của mỹ phàm lên da. mặt, mắt. cơ thể... là điều kiện rất tốt cho sự tấn cóng của VI sinh vát gây bênh. gảy hại lén người sử dung Sự hiên diên của vi sinh vật, nhất là vi sinh vát gây bênh trong mỹ phàm tạo ra mối nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng. rất đang được quan tâm Trên thực tế, ngày nay. các hãng mỹ phẩm lớn, có uy tin rất COI trọng việc kiểm soát VI sinh vật trong mỹ phẩm Do vây, tuy quy mô không được tương xứng như ở lĩnh vực thức phàm. nhưng củng đang có một nhu cầu thực tiền khá lỏn vé đào tạo cán bộ phân tích VI sinh vật trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm,

Quyển sách 'Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nưdc, thực phẩm và mỹ phẩm" được biên soạn nhàm đáp ứng các nhu cầu thực tiễn nêu trên. Sách cung cấp các kiên thức cô đong về các vi sinh vát gây bênh. các chỉ tiêu vi sinh vát thường được kiêm soát trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, các yêu cầu cơ bản trong việc thành lập vả vận hành một phòng kiểm nghiệm vi sinh vật. Phần quan trọng nhất được dành cho các nội dung vế phương pháp thu. bảo quàn và chuẩn bi mẫu. các kỹ thuảt cơ bản trong phân tích. kiểm nghiêm VI sinh vật. quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh vát thường được yêu cẩu trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm Dể tham khảo và tạo điều kiên tiếp cân các kỹ thuât và phương pháp mới. ngoài các phương pháp, quy trình chuẩn, sách củng giới thiêu các phương pháp mới như các phương pháp thử nhanh, phương pháp miền đích. phương pháp lai phân tử, phương pháp PCR -. được gọi chung là các phương pháp không truyền thống, đang ngày càng được sử dụng rông rãi và có khả nâng được công nhặn là phương pháp chuẩn trong tương lai.

Dây là tài liêu được biển soạn trên cơ sở các tài liêu thực tập về vi sinh vật hoe đai cương, phân tích vi sinh vát trong thực phẩm được giảng dạy trong thời gian qua tại Khoa Sinh học Trường DH Khoa học tự nhiên. Dại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, cùng các tài liêu tham khảo trong và ngoài nước khác. Sách có thể được sử dụng một phần hay toàn bộ làm giáo trinh về phân tích, kiểm nghiêm vi sinh vật thực phẩm trong các trường trung học chuyên nghiêp, cao đẳng và đại học. Sách cũng thích hợp cho kỹ thuật viên các phòng phân tích, sinh viên. học viên sau đại học đả được trang bị kiến thúc về vĩ sinh học đại cương để thực hiện các thi nghiêm, phân tích các chỉ tiêu vi sinh vát trong nước, thực phẩm hay mỹ phẩm.

Tác giả xin chân thành cảm ơn Nhà Xuất bản Giáo dục đã tạo điều kiện thuận lợi cho viêc xuất bản quyển sách này. Tác giả cùng cảm ơn các anh chị học viên cao học đã có nhiều

đóng góp trong quá trinh chuẩn bị bản thảo.

Lần xuất bản đáu tiên của quyển sách chắc chắn không tránh khỏi nhiều sai sót. Rất mong được các đống nghiệp và bạn đọc góp ý để lần xuất bản sau sách được hoàn thiện hơn

TÁC GIẢ

4

MỤC LỤC Trang

Lời nói đầu 3 Mục lục 5 CHƯƠNG ì CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIÊM SOÁT

TRONG NƯỚC, THỰC PHÀM VÀ MỸ PHẨM 1. Vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phàm 7 2. Các chí tiêu vi sinh vật trong nước 18 3. Các chí tiêu vi sinh vật trong thực phàm 21 4. Các chi tiêu vi sinh vật trong mỹ phàm 21

CHƯƠNG li. YÊU CẨU Cơ BẢN CỦA PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT 1. Các quỵ tắc an toàn trong phòng kiêm nghiệm vi sinh vật 30 2. Dung cụ, thiêt bị 32

CHƯƠNG IU PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MAU 1. Đặc điếm cùa mẫu 36 2. Thu, báo quán và chuẩn bị mẫu nước 37 3. Thu, báo quán và chuẩn bị mẫu thực phẩm 38 4. Thu, bao quan và chuẩn bị mẫu mỹ phẩm 41

CHƯƠNG IV. KỶ THUẬT c ơ BẢN TRONG PHÂN TÍCH, KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

1. Pha chẽ môi trường và các kỹ thuật vô trùng 43 2. Quan sát vi sinh vặt bằng kính hiên vi 60 3. Phương pháp đinh lượng vi sinh vật 63

3.1 Phương pháp đếm trực tiếp 63

3.2 Phương pháp đêm khuẩn lạc 65 3.3 Phương pháp màng lọc 67 3.4 Phương pháp MPN 68 3 5 Phương pháp đo độ đục 69

4. Thứ nghiệm sinh hóa 71 4.1. Các thứ nghiệm sinh hóa quan trọng 74

4.1.1 Thứ nghiệm khá năng lên men 74 4.1.2 Thứ nghiêm khá năng ôxi hóa - lẽn men 77

4 1.3 Thứ nghiệm Bile Esculin 79 4.1.4. Thứ nghiệm khá năng biến dưỡng citrate 79 4.1.5. Thứ nghiệm khả năng biên dưỡng malonate 81 4.1.6. Thứ nghiệm catalase 81 4.1.7. Thứ nghiệm decarboxylase 83 4.1 8. Thứ nghiệm coagulase 84 4.1.9. Thứ nghiệm urease 85 4.1.10. Thứ nghiệm gelatinase 86 4.1.11. Thứ nghiệm khá năng sinh H2S 87

5

4.1.12. Thư nghiệm khá năng sinh indol 88 4.1 13 Thử nghiệm KIA, TSI 89 4.1.14. Thứ nghiệm nitratase 91 4.1.15. Thứ nghiệm oxidase 92 4.1.16. Thứ nghiệm ONPG 93 4.1.17. Thứ nghiệm MR (Methyl Red) 94 4.1.18. Thứ nghiệm VP (Voges-Proskauer) 95 4 119 Thứ nghiệm CAMP 96 4.1.20. Thư nghiệm tính di động 98

4.2. Các bộ kít sinh hóa định danh vi sinh vật và các hệ thống 99 định danh tự động

CHƯƠNG V. QUY TRÌNH PHẢN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT 1. Tông sô vi khuân hiêu khí lo i 2. Coliíbrms và Escherichia coh 105 3. Staphylococcus aureus 113 4. Feacal Streptococcus 117 5. Salmoneìla 120 G.Shigella 127 7. Vibno 131 8. Listeria monocytogenes 137 9. Bacillus cereus 141 10. Clọstridium 147 l i . Pseudomonas aeruginosa 149 12. Tông nám men nám mốc 156 13. Candida albicans 160

CHƯƠNG VI. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THÔNG 1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 166 2. Phương pháp ELISA 169 3. Phương pháp lai phản tứ 171 4. Phương pháp PCR 173 5. Một số phương pháp thứ nhanh khác 180

5.1. Kỹ thuật phân tách và tàng mật độ 180 5.2. Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp <DEFT) 181

và màng lọc lưới kỵ nước 5.3. Kỹ thuật màng petrifilm Igi 5.4. Kỳ thuật Redige! 182 5.5. Kỹ thuật độ dẫn điện, trớ kháng 133 5.6. Kỹ thuật đo VI lượng caìorie lg4 5.7. Kỳ thuật do mức phóng xạ lg4

Phụ lục 1 8 5

1. Anh màu 185 2. Mót sỏ môi trường và thuỏc thứ thõng dụng 197 3. Bang tra MPN 227

Tài liệu tham khảo 230

6

CHƯƠNG Ị

C Á C C H Ỉ T I Ê U V I S I N H V Ậ T T H Ư Ờ N G Đ Ư Ợ C

KIỂM SOÁT TRONG NƯỚC, THỰC PHÀM

VÀ MỸ PHẨM

1. VI SINH VẬT TRONG NƯỚC, THỰC PHÀM VÀ MỸ PHÀM

1.1. V i s i n h v ậ t g â y b ệ n h t r o n g n ư ớ c v à t h ự c p h ẩ m

Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có t h ể gây ngộ độc hoặc n h i ễ m bệnh cho con người do có t h ể chứa các dộc t ố v i sinh v ậ t độc t ố hóa học hoặc chứa các v i sinh vậ t gây bệnh. Có r ấ t nhiều vụ ngộ độc hay n h i ễ m bệnh gây ra bở i v i sinh v ậ t h i ệ n d iện trong nước và thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm thường được h iểu là các t r i ệ u chứng gây ra bới độc t ố của v i sinh v ậ t h i ệ n d iện trong thực phẩm và n h i ễ m bệnh bới v i sinh v ậ t trong thực phẩm là t rường hợp n h i ễ m bệnh do sử dụng thức ă n chứa các v i sinh v ậ t gây bệnh. Tuy n h i ê n h i ệ n nay, k h á i n i ệ m ngộ độc thực phẩm còn bao gồm t rường hợp thức ăn có chứa các v i sinh v ạ t gây bệnh h i ệ n d i ệ n ở m ậ t độ r ấ t thấp trong nguyên l i ệ u hay bị n h i ễ m vào trong quá t r ì n h chế b i ến vì trong quá t r ì n h chế b i ế n hay bảo quản các v i sinh v ậ t n à y và độc t ố của chúng có t h ể t ă n g l ên nhanh đến mức gây ngộ độc.

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thờ i ở nhiều người, tạo ra những t r i ệ u chứng chung sau kh i tiêu thụ thực phẩm. Tuy nh i ên mức độ tác động sẽ khác nhau phụ thuộc khả n ă n g đáp ứng với độc t ố và t h ể t rạng khác nhau của từng người. Các t r i ệ u chứng thường gặp của ngộ độc thực p h à m là t iêu chảy, chóng mặ t , nôn mửa, đau nhức người, sốt, đau đầu. T r iệu chứng này thay đ ổ i ở các vụ ngộ độc khác nhau tùy thuộc vào tác n h â n v i sinh v ậ t và được gây ra bởi dộc t ố do vi sinh vậ t tạo ra và t i ế t vào thực phẩm ( trường hợp này được gọi là ngoại độc tố) hay bởi độc tố nằm trong t ế bào v i sinh vậ t (nội độc tố) .

Đối với nước và thực phẩm, các v i sinh vậ t được quan t â m cần k i ể m soát là các v i sinh vậ t gây ngộ độc và gây bệnh. Các v i sinh vậ t gây ngộ dóc hay gây bệnh ở người kh i bị đào t h ả i ra khỏ i cơ t hể bằng đường p h â n sẽ làm ó n h i ễ m nguồn nước bị n h i ễ m p h â n này. Nước trở t h à n h môi

7

trường p h â n tán , lan t ruyền mầm bệnh cho người kh i nước được SỪ dụng mà không được t i nh sạch đúng quy cách. Nước là môi t rường sống. môi trường nuôi t rồng các loài thủy sản n ê n kh i nước bị ỏ n h i ễ m thì v i sinh vật gây bệnh có t h ể n h i ễ m vào các loài thúy sản, l àm n h i ễ m nguồn nguyên l iệu của các thực phẩm thủy h ả i sản chế b iến . Đó là một trong những con đường n h i ễ m vi sinh vậ t gây bệnh vào thực phẩm. M ặ t khác , trong quá t r ì nh sản xuất, chế b i ến thực phẩm, vi sinh vậ t gây bệnh cũng

có thê n h i ễ m vào thực phẩm thông qua t i ếp xúc với bề m ặ t t h i ê t bị, công nhân . Mặc dù đế có t h ể gây ngộ độc, số lượng t ế bào v i sinh h i ệ n d iện hoặc độc t ố cùa chúng t i ế t ra trong thực phẩm khi được sử dụng phả i đủ lớn Tuy mật độ vi sinh vậ t ban đầu trong nước, trong nguyên l i ệ u hoặc trong thực phẩm có thê r ấ t thấp nhưng ớ những điều k i ệ n nhấ t đ ịnh thích hợp cho sự t ă n g t rưởng và tạo độc tô của vi sinh vậ t trong quá t r ì n h chê biên hoặc báo quản thực phẩm, mật độ vi sinh v ậ t được n h â n lên nhanh đến mức đù đê gây bệnh hay sản xuất đủ lượng độc t ố gây h ạ i . Do vậy, mật độ cho phép của v i sinh v ậ t gây bệnh trong nước, thực phẩm là r ấ t thấp, trong đa sô các trường hợp là bằng không.

Sau đây là một sô đặc đ iểm l iên quan đến các v i sinh v ậ t gây ngộ độc, gây bệnh chính hoặc một sô n h ó m vi sinh v ậ t có l iên quan khác thường được quan t â m trong nước và thực phẩm :

Salmonella

Salmoneỉla có t h ể gây ngộ độc thực phẩm kh i h i ệ n d iện đ ế n mức cả t r i ệ u t ế bào trong một gram thực phẩm. Các t r i ệ u chứng do Salmoneỉla gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ k h i t iêu thụ thực phẩm bị n h i ễ m cho đ ế n k h i các t r i ệ u chứng được biểu h i ệ n là 12 - 36 giờ. Tr iệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 -7 ngày. Không phả i t ấ t cả mọ i người k h i t iêu thụ thực phẩm bị n h i ễ m Salmoneỉla đều bị ngộ độc. Các loạ i

thực phẩm có nguy cơ bị n h i ễ m Salmonella cao là th ị t gia cầm, s á n phẩm th ị t , t rứng và các sản phẩm từ t rứng, thủy sản. Nguồn gây n h i ễ m các loạ i thực phẩm này thường là p h â n người và động vật , được n h i ễ m gián t i ếp

hay trực t i ếp . Đặc b iệ t nguy h i ể m cho người là các loài Salmonella ty phi s. paratyphi A, B, c gây sốt thương h à n .

Hình 1.1 Salmonella (ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử)

8

Campylobacter

Ccimpylobacter gây bệnh viêm n h i ễ m đường ruột, h i ệ n d iện khắp nơi, đặc b iệ t trong hệ vi sinh vậ t cứa nhiều loạ i động vậ t và chim. Tuy nh iên các dòng Campylobacter gây ngộ độc thực phẩm thuộc loại ưa nhiệ t bắ t buộc, không t h ể p h á t t r i ể n ớ nhiệ t độ thấp hơn 30°c. Các t r i ệ u chứng ngộ độc do vi sinh vật này gây ra là đau nhức, t iêu chảy, sốt, đau Hình 1.2 Campylobacter (ảnh chụp qua đầu. khó chịu, chuột rút , l ạnh cóng, kính hiển vi điện tử) mê sang, t h ính thoang có những biêu h iện bệnh giông như cảm cúm. Thời gian ủ bệnh từ 2 - l i ngày. Các sản p h à m sữa. th ị t gia cầm, nước là nguồn có t h ể gây nên ngộ độc do Campylobactcr. Campylobacter có t h ể h iện diện trong các loại thực phẩm hút chân không. Các loài này rấ t nhạy cảm với nhiệ t độ và acid nên có thê bị t iệ t t r ùng hoàn toàn bằng phương pháp thanh t rùng Pasteur và không t ă n g trướng được trong thực p h à m có t ính acid.

Clostridium períringens

c. perfringens được t ìm thấy trong đất , trong p h â n người. Trước đáy người ta cho r à n g chỉ các dòng c. perỹringens k h á n g nh iệ t , tạo bào tư và k h ô n g l àm tan máu mới có thê gây ngộ độc thực phẩm. Ngày nay, đả có những ghi nhận các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra bới các dòng c. pcrfnngens nhay cam với nh iệ t , không l àm tan máu. Các t r i ệ u chứng ngộ độc do độc tô cua v i sinh vậ t này gây ra là đau t h ắ t vùng bụng, t iêu chay. Thời gian ù bệnh từ 12 - 24 giờ. Nguồn thực phẩm có thê chứa các vi sinh vậ t n à y thường là t h ị t gia cầm, n h ấ t là gia cầm dông l ạ n h sâu, th ị t trong các h ầ m chứa và các loạ i thực phẩm khác . Bào tử của c. perfringen có t í nh bền đôi với nh iệ t n ê n chúng có t h ể sông sót qua quá t r ì n h nâu chín, đặc b iệ t là k h i đun nấu thức ăn ở nh iệ t độ thấp và thời gian ngắn. Các bào từ sống sót này k h i gặp điều k i ệ n th ích hợp sẽ

nảy m â m , t ă n g trướng.

Clostridium botulinum

Loai vi sinh vật này p h â n bó khắp nơi trong đất , nước, trong đường ruột các gia súc và các loài thúy sán. Vi sinh vậ t này sinh độc tô botulin gáy ngộ độc th ị t l àm thực p h à m cho người. Tr iệu chứng lâm sàng kh i ngộ độc la ói mưa, buồn nôn, sau đó có những biêu h iện r ố i loạn thần kinh

9