PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI filedalam kehidupan penulis. Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penelitian ini. Oleh karena itu Penulis sangat mengharapkan

VALIDASI METODE DAN PENETAPAN KADAR KUERSETIN TOTAL

DALAM DAUN TEH SEGAR (Camellia sinensis O.K), TEH HIJAU DAN

TEH HITAM MENGGUNAKAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhin Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Anastasia Filipa Veritas da Silva

NIM : 088114060

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

VALIDASI METODE DAN PENETAPAN KADAR KUERSETIN TOTAL

DALAM DAUN TEH SEGAR (Camellia sinensis O.K), TEH HIJAU DAN

TEH HITAM MENGGUNAKAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhin Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Anastasia Filipa Veritas da Silva

NIM : 088114060

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

"Karena itu Aku berkata kepadamu: Janganlah kuatir akan hidupmu, akan apa yang hendak kamu makan atau minum, dan janganlah kuatir pula akan tubuhmu,

akan apa yang hendak kamu pakai. Bukankah hidup itu lebih penting dari pada makanan dan tubuh itu lebih penting dari pada pakaian? (Matius 6:25)

Sebab itu janganlah kamu kuatir akan hari besok, karena hari besok mempunyai kesusahannya sendiri. Kesusahan sehari cukuplah untuk sehari." (Matius 6:34)

Serahkanlah segala kekuatiranmu kepada-Nya, sebab Ia yang memelihara kamu.

(I Petrus 5:7)

“Aku akan menyertai engkau; Aku tidak akan membiarkan engkau dan tidak akan meninggalkan engkau” (Yos 1:5b)

Kupersembahkan karyaku ini untuk :

Papa mama tersayang

Kakakku tersayang Advent dan Viany

Adikku tersayang Vano

Sahabat dan teman-temanku

Kamu, dia dan mereka

Almamater yang kubanggakan


v


vi


vii

PRAKATA

Puji syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus atas segala kasih dan

karunianya sehingga penelitian yang berjudul “Validasi Metode dan Penetapan

Kadar Kuersetin Total dalam Daun Teh Segar (Camellia sinensis O.K.), Teh

Hijau, dan Teh Hitam dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Fase Terbalik” dapat terlaksana dengan baik.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah

membantu pelaksanaan penelitian ini:

1. Ipang Djunarko, M. Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata

Dharma, Yogyakarta.

2. C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Pharm., Apt. selaku Kepala Program Studi

Fakutas Farmasi Sanata Dharma yang telah memberikan ijin penelitian di

dalam lingkungan fakultas farmasi.

3. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt selaku dosen pembimbing yang telah

memberikan informasi, bimbingan, pengarahan, saran, dan koreksi selama

pelaksanaan penelitian.

4. Dr. Ir. Ngadiman, M. Si selaku dosen pembimbing lapangan atas bimbingan,

saran, dan koreksi selama proses pengambilan sampel.

5. Yohanes Dwiatmaka, M Si dan Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si selaku

dosen penguji atas pengarahan, informasi, saran, dan koreksi selama

pelaksanaan penelitian ini.

6. Mas Bimo, Pak Parlan dan Pak Kethul yang telah banyak membantu selama

penulis melakukan penelitian.


viii

7. Semua pihak di PT Pagilaran atas bantuannya dalam proses pengambilan

sampel.

8. Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan ilmu selama masa kuliah.

9. Bapak Sanjaya dan Angelia Puspita, S.Farm, Apt. yang telah banyak

membantu dalam penyusunan skripsi dan sumbangan ilmu yang telah

diberikan selama penulis melakukan penelitian.

10. Gregorius da Silva, Maria Anastasia Iing Susilowati, orang tua yang selalu

memahami dan memberikan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan

pendidikan sampai menjadi seorang sarjana dengan pribadi yang kuat dan

tegar.

11. Fransiskus Borgias Adventus da Silva, Maria Stella Viany da Silva, dan

Silvester Rosario Valentino da Silva yang selalu memberikan dorongan

semangat dan doa terutama saat kejenuhan datang.

12. Teman seperjuangan Alfonsus Heppy Rosario Dwiyoga, Adi Wirasaputra,

dan Paulus Setya Dharma atas suka duka, bantuan, serta dukungannya selama

ini.

13. Sahabat-sahabat penulis Ayen, Gina, Tia, Paulina, Tiwi, Putri, Arni, Betty ,

Efa, Ida, Vita atas bantuan, semangat, dukungan, dan doanya.

14. Arni, Putri, Betty, Shafiera, Wilda untuk warna-warni pengalaman yang kita

buat dari masa SMF.

15. Teman-teman kelompok antistress Vica, Seco, Dimbek, Usy, Sasa, Ike, Yuni,

Elisa, Novi untuk keceriaan, semangat dan masukan selama penelitian.


ix

16. Teman-teman kost Alma mbak Nia, Tika, Winda, dan Venti atas

keceriaannya dan yang diberikan selama ini.

17. Teman-teman KKN kelompok 19 Anggit, Mas Kresna, Cik Lita, Fany, Sari,

Blesta, Ayu, Gita untuk keceriaan, semangat dan dukungan selama ini.

18. Teman-teman angkatan 2008 khususnya FST A terima kasih atas bantuan,

kenangan, dukungan, dan semua kebersamaan saat kuliah.

19. Kamu, dia, dan mereka yang telah memberikan doa, semangat dan warna

dalam kehidupan penulis.

Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penelitian ini. Oleh

karena itu Penulis sangat mengharapkan kritik, saran, dan pendapat dari berbagai

pihak guna penyempurnaan penelitian ini di masa datang. Akhir kata semoga

penelitian ini dapat memberikan manfaat kepada semua pihak. Atas perhatiannya

penulis ucapkan terima kasih.

Penulis


x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING............................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN..................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA......................................................... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA.......... vi

PRAKATA...................................................................................................... vii

DAFTAR ISI................................................................................................... x

DAFTAR TABEL........................................................................................... xvi

DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................... xvii

INTISARI.......................................................................................................

ABSTRACT....................................................................................................

xx

xxi

BAB I PENDAHULUAN............................................................................... 1

A. Latar Belakang.................................................................................... 1

B. Rumusan Masalah............................................................................... 3

C. Keaslian Penelitian.............................................................................. 3

D. Tujuan................................................................................................. 4

E. Manfaat............................................................................................... 4

1. Manfaat Teoritis........................................................................... 4

2. Manfaat Praktis............................................................................ 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA............................................................. 5


xi

A. Kuersetin............................................................................................. 5

B. Teh...................................................................................................... 6

1. Keterangan Botani........................................................................ 6

2. Deskripsi Tanaman...................................................................... 6

3. Kandungan Kimia........................................................................ 6

4. Jenis Teh...................................................................................... 7

C. Ekstraksi.............................................................................................. 14

1. Ekstrak.......................................................................................... 14

2. Ekstraksi........................................................................................

3. Soxhlet..........................................................................................

14

14

4. Cairan Penyari............................................................................... 15

5. Solid Phase Extraction.................................................................. 15

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi...................................................... 17

1. Definisi dan Instrumentasi........................................................... 17

2. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif.............................................. 19

E. Landasan Teori.................................................................................... 19

F. Hipotesis............................................................................................. 21

BAB III METODE PENELITIAN................................................................. 22

A. Jenis dan Rancangan Penelitian.......................................................... 22

B. Variabel Penelitian.............................................................................. 22

C. Definisi Operasional........................................................................... 22

D. Bahan-bahan Penelitian...................................................................... 23

E. Alat-alat Penelitian.............................................................................. 23


xii

F. Tata Cara Penelitian............................................................................ 23

1. Pengambilan dan Pembuatan Sampel...........................................

2. Penetapan Kadar Air dan Kadar Abu............................................

24

24

3. Pembuatan Larutan Penyari..........................................................

4. Ekstraksi dan clean-up..................................................................

25

25

5. Pembuatan Fase Gerak................................................................. 26

6. Pembuatan Larutan Baku Kuersetin............................................. 26

7. Pembuatan Kurva Baku Kuersetin................................................

8. Penetapan nilai % recovery...........................................................

27

27

9. Penetapan Kadar Kuersetin dalam Sampel................................... 28

G. Analisis Hasil......................................................................................

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................

A. Pengambilan dan Pembuatan Sampel.................................................

B. Penetapan Kadar Air dan Kadar Abu..................................................

C. Ekstraksi dan Hidrolisis......................................................................

D. Clean-up..............................................................................................

E. Pembuatan Fase Gerak........................................................................

F. Analisis Kualitatif Kuersetin...............................................................

G. Validasi Metode..................................................................................

1. Akurasi..........................................................................................

2. Linearitas dan Limit of Quantitation.............................................

H. Penetapan Kadar Kuersetin dalam Daun Teh Segar, Teh Hijau, dan

Teh Hitam...........................................................................................

28

30

31

31

33

36

37

38

42

43

44

45


xiii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.........................................................

A. Kesimpulan.........................................................................................

B. Saran...................................................................................................

48

48

48

DAFTAR PUSTAKA.....................................................................................

LAMPIRAN....................................................................................................

BIOGRAFI PENULIS....................................................................................

49

52

111


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Jumlah flavonol teh...................................................................... 7

Tabel II. Hasil penetapan kadar abu........................................................... 32

Tabel III. Hasil penetapan kadar air............................................................. 32

Tabel IV. Data peningkatan tinggi peak pada tR Kuersetin.......................... 41

Tabel V. Rata-rata %recovery..................................................................... 43

Tabel VI. Nilai Koefisien Korelasi............................................................... 44

Tabel VII. Nilai Limit of Quantitation (LOQ)............................................... 45

Tabel VIII. Kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam... 46

Tabel IX. Kesalahan random........................................................................ 47

Tabel X. Kesalahan sistematik.................................................................... 47


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur kuersetin..................................................................... 5

Gambar 2. Struktur flavonol...................................................................... 7

Gambar 3. Proses pelayuan........................................................................ 9

Gambar 4. Proses penggulungan............................................................... 9

Gambar 5. Proses pengeringan.................................................................. 10

Gambar 6. Skematik prosedur SPE.......................................................... 16

Gambar 7. Peralatan KCKT...................................................................... 18

Gambar 8. Reaksi hidrolisis dengan HCL................................................. 35

Gambar 9. Kromatogram baku kuersetin dan sampel................................ 38

Gambar 10. Kromatogram sampel yang telah dispiking.............................. 40

Gambar 11. Gugus polar dan nonpolar kuersetin........................................ 41

Gambar 12. Gugus auksokrom dan kromofor pada kuersetin..................... 42


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis kuersetin.......................................... 53

Lampiran 2. Surat Determinasi....................................................... 54

Lampiran 3. Penimbangan sampel teh segar.................................... 55

Lampiran 4. Penimbangan sampel teh hijau.................................... 56

Lampiran 5. Penimbangan sampel teh hitam..................................... 57

Lampiran 6. Penimbangan kuersetin yang ditambahkan kedalam

sampel teh segar dari awal proses................................. 58


sampel teh hijau dari awal proses................................ 58


sampel teh hitam dari awal proses............................... 59


sampel teh segar dari proses clean-up........................... 60


sampel teh hijau dari proses clean-up.......................... 61


sampel teh hitam dari proses clean-up.......................... 61

Lampiran 12. Data kadar air............................................................ 62

Lampiran 13. Data kadar abu teh segar.............................................. 62

Lampiran 14. Data kadar abu teh hijau.............................................. 63

Lampiran 15. Data kadar abu teh hitam............................................. 64


xvii

Lampiran 16. Kromatogram sampel teh segar tanpa adisi................... 64

Lampiran 17. Kromatogram sampel teh segar dengan adisi kuersetin

dari awal proses.......................................................... 67

Lampiran 18. Kromatogram sampel teh segar dengan adisi kuersetin

dari proses clean-up...................................................... 71

Lampiran 19. Kromatogram sampel teh hijau tanpa

adisi.......................................................................... 75

Lampiran 20. Kromatogram sampel teh hijau dengan adisi kuersetin

dari awal proses......................................................... 78

Lampiran 21. Kromatogram sampel teh hijau dengan adisi kuersetin

dari proses clean-up................................................... 82

Lampiran 22. Kromatogram sampel teh hitam tanpa adisi................... 86

Lampiran 23. Kromatogram sampel teh hitam dengan adisi kuersetin

dari awal proses........................................................... 88

Lampiran 24. Kromatogram sampel teh hitam dengan adisi kuersetin

dari proses clean-up....................................................... 92

Lampiran 25. Data kadar kuersetin teh segar dan contoh perhitungan

kadar kuersetin........................................................... 96

Lampiran 26. Data kadar kuersetin teh hijau dan contoh perhitungan

kadar kuersetin........................................................... 97

Lampiran 27. Data kadar kuersetin teh hitam dan contoh perhitungan

kadar kuersetin.......................................................... 99

Lampiran 28. Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan


xviii

kadar kuersetin dalam teh segar.................................. 100


kadar kuesetin dalam teh hijau.................................... 101


kadar kuesetin dalam teh hitam..................................... 102

Lampiran 31. Data recovery untuk proses clean-up sampel teh

segar............................................................................ 103


hijau................................................................................ 104


hitam........................................................................... 105

Lampiran 34. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh segar untuk

keseluruhan proses......................................................... 106

Lampiran 35. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hijau untuk


Lampiran 36. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hitam untuk


Lampiran 37. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh segar untuk

proses clean-up.............................................................. 108

Lampiran 38. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hijau untuk

proses clean-up............................................................. 108

Lampiran 39. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hitam untuk

proses clean-up.............................................................. 109


xix

Lampiran 40. Random error.................................................................. 109

Lampiran 41. Systematic error.............................................................. 110


xx

INTISARI

Telah dilakukan penelitian tentang validasi metode dan penetapan kadar kuersetin total dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam untuk mengetahui kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dn teh hitam.

Ekstraksi dilakukan dengan soxhletasi dilanjutkan proses clean-up yang dilakukan dengan solid phase extraction. Kemudian kuersetin dianalisis dengan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik. Validasi metode dilihat dari parameter % recovery dan penetapan kadar kuersetin total dilakukan berdasarkan analisis data AUC sampel dan kurva baku kuersetin.

Dari penelitian ini diketahui kadar kuersetin dalam teh hijau dan te hitam berturut-turut yakni 1431,8863 µg/g dan 2201,1904 µg/g. Nilai % recovery keseluruhan proses untuk daun teh segar, teh hijau dan teh hitam berturut-turut yakni 119,79%, 98,57% dan 102,40% dan nilai %recovery untuk proses clean-up berturut-turut yakni 141,55%, 108,92% dan 135,78%. Berdasarkan hasil tersebut proses clean-up pada daun teh segar dan teh hitam tidak memiliki akurasi yang baik.

Kata kunci : kuersetin, daun teh segar, teh hijau, teh hitam, KCKT fase terbalik.


xxi

ABSTRACT

Has been done research on validation of analytical procedure and determination of total quercetin in fresh tea leaves, green tea and black tea to determine quercetin in the fresh tea leaves, green tea and black.

Extraction is done by soxhletasi and clean-up process is done by solid phase extraction method. Then analyzed by of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Reversed phase. Seen from the parameter validation method is % recovery and the determination of total quercetin based on AUC data analysis of samples and standard curve of quercetin.

Of this study green tea and black tea containing quercetin total 1431,8863 µg/g and 2201,1904 µg/g. Overall recovery process for fresh tea leaves, green tea and black tea respectively are 119,79%, 98,57% and 102,40% and recovery for clean-up respectvely are 141,55%, 108,92% and 135,78%. Based on these results the clean-up process for fresh tea leaves and black tea does not have good accuray. Key word : Quercetin, fresh tea leaves, green tea, black tea, HPLC reversed phase


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Teh merupakan salah satu minuman yang dekat dengan kehidupan kita

sehari-hari, yang sering dikonsumsi sebagai minuman penyegaran. Tidak hanya

sebagai minuman kesegaran tetapi teh telah lama diyakini khasiatnya bagi

kesehatan tubuh karena kandungan antioksidan di dalamnya. Ada banyak jenis teh

yang diperdagangkan seperti teh wangi, teh hitam dan teh hijau.

Berdasarkan pengolahannya, teh dibedakan menjadi teh hijau dan teh

hitam. Teh hijau dibuat dengan cara non-fermentasi. Pada proses pengolahan

tersebut terjadi inaktivasi enzim oksidase atau fenolase yang ada dalam pucuk

daun teh segar, sehingga oksidasi enzimatik terhadap kandungan fenol dapat

dicegah. Sebaliknya teh hitam dibuat dengan cara fermentasi dengan

memanfaatkan terjadinya oksidasi enzimatik terhadap kandungan polifenol teh.

Di dalam teh terdapat banyak kandungan senyawa aktif yang memiliki

manfaat positif bagi masyarakat. Zat bioaktif yang utama terdapat dalam teh,

adalahgolongan flavonoid. Berdasarkan struktur dan konformasi cincin C molekul

dasarnya, flavonoid dapat digolongkan menjadi 6 kelas, yaitu flavon, flavanon,

isoflavon, flavonol, flavanol dan antosianin. Adapun jenis flavonoid utamayang

ditemukan pada teh adalah flavanol dan flavonol. (Hartoyo, 2003). Flavonol

dalam daun teh terutama kuersetin. Kuersetin dalam tanaman terdapat dalam

berbagai bentuk glikosida dan dapat pula bentuk aglikonnya (Erlund, 2002).


2

Kuersetin memiliki banyak manfaat bagi kesehatan antara lain sebagai

antioksidan, antikanker, antiinflamasi, antiplatelet, dan antihistamin. Menurut

Hartoyo (cit., Septianingrum, dkk 2009) terdapat perbedaan kadar fenol pada teh

hijau dengan teh hitam. Perbedaan ini disebabkan karena terdapat perbedaan

dalam proses pengolahannya. Karena perbedaan inilah maka dilakukan penetapan

kadar kuersetin dalam teh hijau, dan teh hitam untuk mengetahui kadar kuersetin

dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam serta untuk mengetahui apakah

proses pengeringan memiliki pengaruh terhadap kadar kuersetin.

Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas

untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel (Gandjar dan

Rohman, 2007). KCKT memiliki kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa

tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif sehingga KCKT menjadi suatu sistem

pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi (Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Metode KCKT bersifat selektif dan

sensitif sehingga cocok digunakan dalam analisis kuantitatif beberapa senyawa

secara simultan (Khopkar, 1990). Kelebihan metode KCKT inilah yang

dimanfaatkan oleh peneliti untuk memisahkan kuersetin dari senyawa-senyawa

yang memiliki kepolaran yang mirip dengan kuersetin di dalam daun teh, teh hijau

dan teh hitam.


3

B. Rumusan Masalah

Permasalahan yang dapat dirumuskan berdasarkan latar belakang tersebut

yakni berapakah kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam?

C. Keaslian Penelitian

Berbagai penelitian terhadap kuersetin telah banyak dilakukan, mulai dari

proses ekstraksi, isolasi, aktivitas farmakologisnya. Penelitian dengan judul

“HPLC–UV And GC–MS Characterization Of The Flavonol Aglycons Quercetin,

Kaempferol, And Myricetin In Tomato Pastes And Other Tomato-Based Products”

pernah dilakukan untuk mengidentifikasi dan mengkuantifikasi lima flavonoid

dalam tomat (Tokusoglu, 2003). Penetapan kadar flavonoid total terhitung sebagai

kuersetin pernah dilakukan dengan menggunakan metode kolometri dalam teh

hijau dan teh hitam [merk X] (Pertiwi, 2006). Namun penetapan kadar kuersetin

aglikon dalam daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam dengan menggunakan

metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik belum pernah

dilakukan sebelumnya.


4

D. Tujuan

Mengetahui kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam.

E. Manfaat

1. Manfaat teoritis

Memberikan informasi mengenai kandungan kuersetin yang memiliki

banyak khasiat dalam tanaman yang telah mengalami pengolahan seperti

proses pengeringan, proses fermentasi.

2. Manfaat praktis

Memberikan informasi mengenai proses penetapan kadar kuersetin

dengan menggunakan metode yang valid.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kuersetin

Gambar 1. Struktur kuersetin

Kuersetin merupakan senyawa berwarna kuning dan menjadi anhydrat

pada suhu 95 - 97° C. Kuersetin larut dalam asam asetat glasial, dalam larutan

aqueous alkaline dan praktis tidak larut dalam air (The Merck Index, 1989).

Kuersetin memiliki gugus fungsi karbonil dan hidroksil sehingga dapat

membentuk kompleks dengan beberapa ion logam (Makasheva, 2005).Kuersetin

memiliki banyak manfaat bagi kesehatan manusia antara lain antioksidan,

antiinflamasi, antiplatelet, antikanker, antivirus, dan antihistamin (Paulsen, 2003).

Banyak tanaman yang mengandung kuersetin antara lain brokoli, wortel,

bawang merah, bawang putih, paprika, buncis, bunga kol, dan teh (Miean dan

Mohamed, 2000). Kuersetin dalam tanaman terdapat dalam berbagai bentuk

glikosida dan dapat pula bentuk aglikonya (Erlund, 2002). Flavonoid yang secara

umum terdapat sebagai glikosida, jika dihidrolisis dengan asam dalam suasana

panas akan menghasilkan suatu aglikon dan sebagian kecil gula (Cuppett, 1998).


6

B. Teh

1. Keterangan Botani

Menurut Steenis (2002), tanaman teh termasuk dalam famili theaceae dengan

spesies Camellia sinensis O.K.

2. DeskripsiTanaman :

Tanaman teh berbentuk pohon. Tingginya biasanya mencapai belasan

meter. Namun, tanaman teh diperkebunan selalu dipangkas untuk memudahkan

pemetikan sehingga tingginya 70 cm. Mahkota tanaman teh berbentuk jorong atau

agak bulat telur terbalik. Tepi daun bergerigi, daun tunggal dan letaknya hampir

berseling. Tulang daun menyirip, permukaan atas daun muda berbulu halus

sedangkan permukaan bawahnya bulunya hanya sedikit. Permukaan daun tua

halus dan tidak berbulu lagi. Bunga teh berwarna putih dengan serbuk sari

berwarna kuning. Tanaman teh mengalami pertumbuhan tunas yang silih berganti.

Tunas tumbuh pada ketiak atau bekas ketiak daun. Tunas yang tumbuh kemudian

diikuti dengan pembentukan daun. Tunas baru pada teh memiliki daun kuncup

(Nazaruddin dan paimin, 1993).

3. Kandungan Kimia

Daun teh memiliki banyak kandungan senyawa kimia yang merupakan zat

bioaktif. Zat bioaktif yang ada dalam teh, terutama merupakan golongan

flavonoid. Adapun flavonoid yang ditemukan pada teh terutama berupa flavanol

dan flavonol (Hartoyo, 2003). Flavonol utama yang ada di dalam daun teh adalah

kuersetin, kaempferol dan myrycetin. Flavonol ini, terutama terdapat dalam


7

bentuk glikosidanya (berikatan dengan molekul gula) dan sedikit dalam bentuk

aglikonnya.

Tabel I. Jumlah Flavonol Teh (Hartoyo, 2003)

Jenis Flavonol Jumlah (g/kg) Teh Hijau Teh Hitam

Myricetin 0,83 – 1,59 0,24 – 0,52 Quercetin 1,79 – 4,05 1,04 – 3,03

Kaempferol 1,56 – 3,31 1,72 – 2,31

Gambar 2. Gambar struktur flavonol

Selain flavonoid, daun teh juga mengandung alkaloid purin (metil

santin): kafein, teobromin, teofilin; katekin : epikatekin, epigaloketekin,

epigalokatekin galat, teaflavin, tearubigen; derivat asam kafeat: asam klorogenat

dan teogalin; minyak atsiri : linalool (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan, 2010).

4. Jenis teh

Ada tiga tipe utama pengolahan teh, yaitu teh hijau, teh oolong, dan teh

hitam. Secara umum teh hijau merupakan teh yang tidak difermentasi, teh oolong

merupakan teh yang mengalami fermentasi sebagian dan teh hitam merupakan teh

yang mengalami fermentasi penuh (Panuju, 2009).


8

a. Teh Hijau.Daun teh di dikeringkan dari daun Camellia sinensis. Teh hijau

dibuat dengan cara menginaktivasi enzim oksidase atau fenolase yang ada dalam

pucuk daun teh segar, dengan cara pemanasan atau penguapan menggunakan uap

panas, sehingga oksidasi enzimatik dapat dicegah. Aktivitas antioksidan teh hijau

enam kali lebih besar dibanding teh hitam (Gruenwald dkk, 2007).

Proses pengolahan teh hijau di kebun PT. PAGILARAN, Samigaluh,

Kulonprogo terdiri dari proses pemetikan, pelayuan, penggulungan, pengeringan,

sortasi dan pengepakan.

1. Pemetikan

Pemetikan adalah pemungutan hasil pucuk tanaman teh yang memenuhi

syarat-syarat pengolahan.Pengambilan pucuk dilakukan dengan sistem p+2

yakni tumbuhnya dua helai daun setelah peko. Proses pemetikan ini

dilakukan jika tanaman sudah berumur 18 bulan karena pada umur ini

dianggap kandungan dalam daun teh sudah optimal.

2. Pelayuan

Pucuk teh yang telah dipetik selanjutnya dilakukan proses pelayuan. Daun teh

yang telah dipetik dilayukan dengan melewatkan daun tersebut pada silinder

panas sekitar 5-8 menit dengan suhu 90-100° C. Tujuan dilakukannya proses

pelayuan yakni untuk menginaktivasi enzim polifenol oksidase yang ada

dalam daun teh itu sendiri, sehingga dapat dicegah terjadinya proses oksidasi

serta menurunkan kandungan air dalam pucuk menjadi 60-70% (Syah, 2006).


9

Gambar 3. Proses pelayuan

3. Penggulungan

Pucuk teh yang telah melalui proses pelayuan selanjutnya dilakukan

penggulungan dengan mesin roller press selama 10-14 menit. Lamanya

proses penggulungan ini tergantung dari jenis pucuknya. Proses

penggulungan ini dilakukan untuk memecah sel-sel daun sehingga cairan di

dalam sel keluar di permukaan daun sehingga seduhan teh yang dihasilkan

memiliki rasa yang lebih sepet (Syah, 2006).

Gambar 4. Proses penggulungan


10

4. Pengeringan

Proses ini dilakukan dengan menggunakan alat repeat roll dengan suhu 70-

80° C selama 2,5 – 3 jam. Proses pengeringan dilakukan untuk mengurangi

kadar air dalam pucuk teh yang sudah digulung hingga kadar air tersisa

kurang lebih 2%. Selain itu proses pengeringan juga dilakukan untuk

memperkuat bentuk dan aroma dari teh hijau.

Gambar 5. Proses pengeringan

5. Sortasi

Teh yang berasal dari proses pengeringan masih bercampur baik bentuk

maupun ukurannya. Selain itu teh juga masih mengandung debu, tangkai

daun, dan kotoran lain yang akan sangat berpengaruh pada mutu teh nantinya,

sehingga diperlukan proses sortasi. Proses sortasi dilakukan secara manual.

Proses ini dilakukan dengan memisahkan daun teh yang rusak dan tangkai

daunnya.

6. Pengemasan dan pengepakan

Teh Hijau yang telah mengalami sortasi selanjutnya di lakukan proses

pengemasan.


11

b. Teh Hitam. Teh hitam merupakan teh yang berasal dari pucuk daun teh segar

yang dibiarkan sebelum digulung, kemudian daun-daun tersebut dibiarkan selama

beberapa jam sebelum dipanaskan dan dikeringkan. Selama itu, enzim yang

terdapat pada daun-daun teh akan mengkatalisis reaksi oksidasi senyawa-senyawa

yang ada dalam teh sehingga menghasilkan warna, rasa, dan aroma (Hartoyo,

2003).Selama proses oksidasi, adanya enzim pada teh mengubah beberapa

polifenol yang memiliki aktivitas terapetik menjadi senyawa yang kurang aktif

(Gruenwald, 2007).

Proses pengolahan teh hitam di kebun PT. PAGILARAN, Batang terdiri

dari proses pemetikan, pelayuan, penggulungan atau penggilingan , fermentasi,

pengeringan, sortasi dan pengepakan.

1. Pemetikan

Pemetikan adalah pemungutan hasil pucuk tanaman teh yang memenuhi

syarat-syarat pengolahan (Arifin, 2009).

2. Pelayuan

Daun-daun teh yang telah dipetik dari kebun segera dibawa ke pabrik dan

kemudian dimulai proses pelayuan yang dilakukan dalam withering truck

selama 10 – 18 jam. Hal ini dilakukan untuk mengurangi kadar air dari daun

teh serta untuk membantu proses pengeringan agar lebih cepat, serta membuat

daun teh agar lebih lentur dan mudah digulung, sehingga memudahkan proses

penggulungan. Pada proses pelayuan, selama 1 – 2 jam pertama daun teh

yang telah dihamparkan dalam withering truck dialiri dengan udara dingin

(suhu 24° C) dan selama 10 – 18 jam berikutnya dialiri dengan udara panas


12

(suhu 28° C). Setiap 2 – 3 jam sekali tumpukan daun teh diaduk agar

pelayuan berlangsung sempurna pada setiap petikan daun teh (Haryanto,

2012).

3. Penggulungan dan penggilingan

Proses penggulungan dilakukan dengan menggunakan mesin open top roller

selama ± 40 menit. Tujuan proses penggulungan ini adalah untuk meremas,

menggulung dan merobek sel sehingga cairan didalam sel keluar ke

permukaan daun sehingga air menempel di permukaan. Daun teh yang telah

mengalami tahap sampai tahap penggulungan berwarna hitam

kecoklatan.Kelembapan di ruangan penggulungan ini harus diatur dengan

menggunakan humidifier untuk menghambat proses oksidasi, sehingga proses

oksidasi terjadi dalam waktu yang tepat. Kelembapan diatur sebesar 90 - 95°

dan suhu ruangan 20 - 22° C.Dari hasil penggulungan, selanjutnya

dimasukkan kedalam rotary roll breaker untuk proses pengayakan. Dari

proses ini dihasilkan teh hitam dengan kualitas no. 1. Serbuk yang masih

kasar dimasukkan kembali ke dalam rotorvane untuk dipotong dengan

menggunakan pisau tumpul sehingga cairan yang masih ada dalam sel keluar

ke permukaan.

4. Fermentasi

Proses fermentasi terjadi di ruang oksidasi.Tujuan proses oksidasi ini yakni

untuk menjaga kestabilan dan membentuk rasa asli dari teh hitam. Warna

akhir produk yang dihasilkan yakni hitam.


13

Ruang oksidasi diatur sedemikian karena pada tahap ini merupakan tahap

pengendali mutu teh hitam yang dihasilkan. Teh hitam didiamkan dalam

ruangan oksidasi selama minimal 2 jam, maksimal 3 jam. Dilakukan selama

2-3 jam karena jika kurang dari 2 jam ataupun lebih dari 3 jam dapat terjadi

kerusakan pada teh hitam.

5. Pengeringan

Tujuan dari proses pengeringan ini adalah untuk mengurangi kadar air hingga

kadar air dalam teh hitam kurang lebih 3%. Proses pengeringan ini dilakukan

selama 22 – 23 menit. Suhu selama proses pengeringan yakni 100 °C pada

waktu dimasukkan ke dalam mesin pengering dan 50 °C pada waktu keluar

dari mesin pengering. Penurunan suhu ini dilakukan agar teh hitam yang

dihasilkan tidak gosong, sehingga hasilnya menjadi tidak baik.

6. Sortasi kering

Proses sortasi ini dilakukan berdasarkan warna, kasar halusnya serbuk teh

hitam yang dihasilkan, berat jenis.

7. Pengepakan

Setelah selesai proses sortasi, dilanjutkan ke tahap pengepakan.

Pada proses pembuatan teh hitam, glikosida kuersetin tidak mengalami

oksidasi, hal ini terjadi karena ketidakmampuan kuersetin untuk mengalami

oksidasi yang mungkin disebabkan karena kelarutan bentuk aglikonnya yang

sangat rendah dalam air (Gruenwald, 2007).


14

C. Ekstraksi

1. Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,

kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang

tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995).

2. Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu

campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent

(Harborne, 1987).Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat

dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung

simplisia (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).

3. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah

pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Penyarian dengan

soxhletasi menggunakan larutan yang dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif

yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat

dan Makanan, 2000).


15

4. Cairan Penyari

Senyawa fenolik umumnya diekstraksi menggunakan air, metanol, etanol

aseton, etil asetat maupun kombinasi dari pelarut-pelarut tersebut. Keberadaannya

yang tertempel dengan gula cenderung untuk menyebabkan senyawa fenolik lebih

larut dalam air, dan dengan demikian kombinasi pelarut diatas dengan air cocok

untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon,

flavanon, dan flavonol cenderung untuk lebih larut dalam pelarut non-aquaeous

(Escribano dan Santos, 2010).

5. Solid-Phase Extraction

Solid Phase Extraction merupakan alternatif metode yang cepat, mudah,

dan ekonomis karena secara signifikan mngurangi volume pelarut organik yang

dibutuhkan. SPE digunakan untuk mengekstrak senyawa dari cairan matriks dan

dapat juga digunakan sebagai metode pemurnian / fraksinasi(Escribano dan

Santos, 2010).

Keunggulan SPE dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair adalah:

a. Proses ekstraksi lebih sempurna

b. Pemisahan analit dari pengganggu yang mungkin ada menjadi lebih efisien

c. Mengurangi pelarut organik yang digunakan

d. Fraksi analit yang diperoleh lebih mudah dikumpulkan (Gandjar dan

Rohman, 2009).

Ada 4 tahap dalam prosedur SPE, yaitu:

a. Pengkondisian. Cartridge (Penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk

membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama,


16

sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel

dimasukkan dapat dihindari.

b. Retensi (tertahannya) sampel.Larutan sampel yang dilewatkan ke cartridge

baik untuk menahan analit yang dituju, sementara komponen lain terelusi atau

untuk menahan komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang dituju

terelusi.

c. Pembilasan. Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang

tidak tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.

d. Elusi. Tahap ini merupakan tahap akhir untuk mengambil analit yang dituju

jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).

Gambar 6. Skematik prosedur SPE

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Definisi dan Instrumentasi

Menurut Hendayana (2006), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

adalah teknik pemisahan campuran senyawa berdasarkan interaksi dengan fase


17

diam di bawah aliran fase gerak, dimana fase gerak dialirkan dengan bantuan

tekanan menuju kolom secara cepat dan dideteksi dengan detektor yang sesuai.

Ada dua fase dalam kromatografi yaitu fase normal dan fase terbalik.

Fase normal apabila fase diam lebih polar dari fase gerak, sedangkan fase terbalik

yaitu apabila fase diam lebih non polar dari fase geraknya (Munson, 1991).

Menurut Harris (2011), komposisi pokok dari instrumentasi KCKT yakni

kolom, sistem penghantar pelarut, katup penginjeksian sampel, detektor, dan

perekam atau komputer untuk menampilkan hasil pemisahan.

a. Kolom.Kolom merupakan bagian KCKT yangmana terdapat fase diam untuk

berlangsungnya proses pemisahan solut/analit (Rohman, 2009).

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling

banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan

kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih

pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar (Rohman, 2009).

Kolom kromatografi dapat dipanaskan untuk mengurangi kekentalan dari

pelarut. Kekentalan pelarut yang berkurang ini mengakibatkan tekanan menurun

atau mempercepat aliran (Harris, 2011).

b. Wadah fase gerak. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Fase

gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada

pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain

terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Adanya

pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi.

Adanya partikel yang kecil dapat berkumpul dalam kolom atau dalam tabung


18

yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau

tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih

dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Gandjar dan Rohman, 2007).

c. Tempat penyuntikkan sampel.Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan

secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju

kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat

(Rohman, 2009).

d. Detektor.Idealnya suatu detektor harus mempunyai karakteristik mempunyai

respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel, mempunyai sensitifitas yang

tinggi, stabil dalam pengoperasiannya, signal yang dihasilkan berbanding lurus

dengan konsentrasi solut, tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir

fase gerak (Gandjar dan Rohman, 2007).

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam, dan sifat komponen–komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 7. Peralatan KCKT


19

2. Analisis Kualititatif dan Kuantitatif

Analisis kualitatif KCKT berupa pengamatan waktu retensi (tR) senyawa

baku dan senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi

(Gandjar dan Rohman, 2007).Masing-masing senyawa memiliki waktu retensi

yang spesifik pada kondisi tertentu seperti kolom, suhu, dan laju sehingga dapat

digunakan sebagai salah satu dasar uji kualitatif (Noergrohati, 1994). Selain itu

analisis kualitatif KCKT juga dilakukan dengan cara spiking. Spiking dilakukan

dengan menambah sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan

diselidiki dengan senyawa baku pada kondisi kromatografi yang sama. Jika pada

puncak tertentu yang diduga mengandung senyawa yang diselidiki terjadi

peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah di-spiking dibandingkan dengan

tinggi puncak /luas puncak yang tidak dilakukan spiking, maka dapat

diidentifikasi bahwa sampel mengandung senyawa yang kita selidiki (Rohman,

2009).

Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran

luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau

area larutan standar.(Gandjar dan Rohman, 2007).

E. Landasan Teori

Daun teh merupakan salah satu tanaman yang banyak digunakan sebagai

minuman yang dipercaya memiliki banyak khasiat. Berdasarkan proses

pengolahannya teh dibagi menjadi teh hijau dan teh hitam. Teh hijau diproduksi

dengan menguapkan air dari daun teh segar dan proses pelayuan dilakukan


20

sesegera mungkin untuk mencegah terjadinya proses oksidasi. Teh hitam

diproduksi dengan mengoksidasi bagian daun. Selama proses oksidasi, adanya

enzim pada teh mengubah beberapa polifenol yang memiliki aktivitas terapetik

menjadi senyawa yang kurang aktif tetapi senyawa kuersetin tidak mengalami

proses oksidasi karena sifat kuersetin yang sukar larut dalam air sehingga

kuersetin tidak mampu mengalami proses oksidasi.

Kuersetin merupakan senyawa yang berwarna kuning yang larut dalam

asam asetat glasial, etil asetat, sukar larut dalam alkohol dan praktis tidak larut

dalam air. Kuersetin merupakan salah satu senyawa alam yang terdapat dalam

tanaman teh yang merupakan kelompok flavonoida golongan flavonol. Kuersetin

memiliki banyak manfaat bagi kesehatan antara lain antioksidan, antiinflamasi,

antiplatelet, antikanker, antivirus, dan antihistamin. Kebanyakan flavonoid di

alam terdapat sebagai glikosida. Untuk dapat mengetahui kadar kuersetin total

yang terdapat dalam daun teh maka perlu dilakukan proses hidrolisis untuk

memecah ikatan antara kuersetin aglikon dengan gula yang terikat.

Proses ekstraksi dilakukan menggunakan metode soxhletasi dan proses

fraksinasi menggunakan solid-phase extractiondengan cartridge C18.Selanjutnya

dari hasil fraksinasi dilakukan analisis dengan metode KCKT.

Analisis kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau,dan teh hitam dapat

dilakukan dengan metode KCKT karena metode ini selektif dalam memisahkan

senyawa multikomponen dengan waktu yang relatif singkat. Penetapan kadar

kuersetin total dalam daun teh segar, teh hijau,dan teh hitam dilakukan untuk


21

mengetahui apakah proses pengeringan dan proses fermentasi berpengaruh

terhadap kadar kuersetin pada daun teh.

F. Hipotesis

Daun teh segar, teh hijau dan teh hitam mengandung kuersetin.


22

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental deskriptif, karena

terdapat intervensi terhadap subyek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas pada penelitian ini adalah jenis teh yang digunakan

2. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar kuersetin yang terdapat

dalam daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam.

3. Variabel pengacau pada penelitian ini adalah

a. Kemurnian pelarut yang digunakan, sehingga digunakan pelarut pro

analysis yang memiliki kemurnian cukup tinggi.

b. Suhu saat proses ekstraksi, dapat diatasi dengan menentukan suhu yang

akan digunakan dan menjaganya dalam keadaan konstan yakni 90° C.

C. Definisi Operasional

1. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang digunakan dalam

penelitian ini menggunakan kolom fase diam oktadesil silika (C18) dan

komposisi fase gerak metanol - aqua bidestilata – asam fosfat 5% (54 : 45 :

1) dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit, suhu oven 30° C, λ 370 nm.


23

2. Teh yang digunakan yakni daun teh segar, teh hijau yang diperoleh dari

perkebunan PT. PAGILARAN, Samigaluh dan teh hitam yang diperoleh dari

perkebunan PT. PAGILARAN, Batang.

D. Bahan-bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yakni baku kuersetin

(Sigma Aldrich), metanol pro analysis (E. Merck), Butyl Hidroksi Toluen (E.

Merck), asam klorida, asam fosfat, aquabidestilata, sampel daun teh segar, teh

hijau, dan teh hitam.

E. Alat-alat Penelitian

Alat yang digunakan seperangkat alat KCKT fase terbalik terdiri :

seperangkat alat KCKT dengan detektor UV, Shimadzu LC-2010C, kolom C18

merek SHIMADZHU, Dimensi 150 x 4,6 mm, 5 m, seperangkat komputer

(chasing merek Dell B6RDZ1S Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP

France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730), degassing

ultrasonikator (Retsch tipe T460 no V935922013 EY), organic solvent membrane

filter Whatman (0,45m), membran filter Whatman ukuran pori 0,5 µm dan

diameter 47 mm, neraca analitik dengan kepekaan 0,001 (Ohaus Carat Series PAJ

1003), milipore, mikropipet, indikator pH, Moisture Balance, Rotary evaporator,

seperangkat alat gelas, solid-phase extraction cartridge C-18.


24

F. Tata Cara Penelitian

1. Pengambilan dan pembuatan sampel

Sampel yang digunakan berupa lembaran pucuk daun teh segar, teh hijau,

dan teh hitam. Teknik pengambilan daun teh segar diambil secara acak mewakili

setiap deret tanaman teh di lahan perkebunan teh PT. PAGILARAN. Sampel teh

hijau dan teh hitam diambil secara acak dari hasil produksi di pabrik PT.

PAGILARAN selanjutnya dilakukan proses pencacahan daun teh segar dan proses

penyerbukan teh hijau dan teh hitam.

2. Penetapan Kadar Air dan Kadar Abu

a. Daun Teh Segar:

a.1. Uji Kadar Air. 5 gram teh segar yang telah di blender ditimbang seksama,

masukkan ke dalam krus yang telah ditara sebelumnya, masukkan ke dalam

alat gravimetri, catat kadar air yang terukur pada alat gravimetri.

a.2. Uji Kadar Abu. 3 gram teh segar yang telah di blender ditimbang

seksama, masukkan ke dalam krus platina yang telah dipijarkan dan ditara.

Ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga aran habis, dinginkan, timbang. Jika

dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas, saring

melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus

yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot

tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di

udara.


25

b. Teh Hijau dan teh hitam. Dilakukan dengan cara yang sama seperti penetapan

kadar abu dan kadar air dalam daun teh segar.

3. Pembuatan Larutan Penyari

Larutan penyari yang digunakan untuk proses ekstraksi dan fraksinasi

dalam penelitian ini adalah metanol-air (90-10) yang mengandung 1,85 M HCl.

HCl 1,85 M dibuat dengan mengambil sebanyak 163,40 mL HCl 11,32 M dengan

menggunakan buret kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 mL,

kemudian ditambahkan dengan metanol-air (90-10) hingga batas tanda, kocok

homogen.

4. Ekstraksi dan Clean-up

a. Sampel daun teh segar. Masing-masing ditimbang kurang lebih 8 gram

dengan seksama daun teh segar yang telah di blender, teh hijau dan teh hitam

yang telah dihaluskan. Kemudian dimasukkan kedalam teabag dan

dimasukkan dalam tabung soxhlet dengan 240 mL larutan penyari dalam labu

erlenmeyer. Kedalam larutan penyari ditambahkan Butil Hidroksi Toluen

(BHT) sebanyak 240 mg. Proses ekstraksi ini dilakukan pada suhu 90° C

sebanyak sirkulasi yang telah dioptimasi pada proses optimasi ekstraksi yakni

18 kali sirkulasi. Ekstrak yang diperoleh selanjutnya dimasukkan kedalam

labu takar 250 mL dan ditambahkan dengan larutan penyari hingga batas

tanda.


26

25 mL ekstrak dipekatkan hingga volume 5 mL. Sebanyak 0,1 mL

dimasukkan kedalam cartridge C-18 yang telah dikondisikan dengan larutan HCl

pH 3. Selanjutnya elusi dengan metanol 6 mL. fraksi yang diperoleh ditampung

dalam flakon.

5. Pembuatan fase gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol-

aquabidestilata-asam fosfat(54:45:1). Larutan asam fosfat 5% dibuat dengan

mengambil sebanyak 29,4 mL asam fosfat 85% menggunakan buret 50 mL ke

dalam labu takar 500 mL dan ditambahkan dengan akuabides hingga batas tanda.

Kemudian disaring menggunakan anorganic membran filter (Whatman). Fase

gerak ini selanjutnya didegassing selama 15 menit menggunakan ultrasonicator.

6. Pembuatan larutan baku kuersetin

a. Pembuatan larutan stok. Kuersetin baku ditimbang lebih kurang 25 mg dengan

seksama serbuk kuersetin dan dilarutkan dengan metanol p.a dalam labu takar

25,0 mL hingga batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi 1000 ppm.

b. Pembuatan seri larutan baku kuersetin. Lima seri larutan baku kuersetin dibuat

dengan konsentrasi10, 20, 30, 40 dan 50 ppm dengan cara mengambil larutan

intermediet kuersetin dengan mikropipet100, 200, 300, 400 dan 500µL kemudian

diencerkan dengan methanol p.a dalam labu takar 10,0 mL hingga batas tanda.

Larutan disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit dengan

ultrasonikator.


27

7. Pembuatan kurva baku kuersetin

Seri larutan baku dengan konsentrasi 10, 20, 30, 40, dan 50 ppm, masing-

masing larutan disaring dengan menggunakan millipore kemudian didegassing

dengan ultrasonikator selama 15 menit dan 20 µL dari masing-masing larutan

diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik dengan fase diam C18 dan fase gerak

metanol-aquabidestilata-asam fosfat (54:45:1) pada kecepatan alir 1,0 mL/menit.

Dari kromatogram diperoleh luas area kuersetin untuk masing-masing

konsentrasi. Luas area ini kemudian diplotkan terhadap konsentrasi kuersetin

untuk memperoleh regresi linier dengan persamaan y = bx + a.

8. Penetuan nilai % recovery

a. % Recovery keseluruhan proses. Kedalam masing-masing sampel

ditambahkan kuersetin baku 5mg, 10mg, 15mg dan 20mg. Masing-masing

sampel yang telah diadisi dengan kuersetin baku kemudian di ekstraksi

dengan metode soxhletasi dan dilakukan proses clean-up dengan

menggunakan SPE cartridge C18. Selanjutnya sampel disaring dengan

milipore dan didegassing selama 15 menit. Sejumlah 20µL diinjeksikan

kedalam sistem KCKT. Nilai AUC yang diperoleh selanjutnya dimasukkan

kedalam persamaan kurva baku sehingga akan diperoleh kadar kuersetin

dalam sampel. Kemudian dihitung nilai % recovery menggunakan rumus

sebagai berikut :

% recovery = ௗ ௗ ௗ௦ି ௗ ௧ ௗ௦ௗ ௨ ௬ ௗ௧

x 100%

b. Recovery proses SPE. Kedalam masing-masing ekstrak yang akan dilakukan

proses clean-up ditambahkan kuersetin baku 5mg, 10mg, 15mg dan 20mg.


28

Masing-masing sampel yang telah diadisi dengan kuersetin selanjutnya

disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Sejumlah 20µL

diinjeksikan kedalam sistem KCKT. Nilai AUC yang diperoleh selanjutnya

dimasukkan kedalam persamaan kurva baku sehingga akan diperoleh kadar

kuersetin dalam sampel. Replikasi dilakukan 2 kali.

9. Penetapan kadar kuersetin dalam sampel

Sampel yang digunakan yakni fraksi metanol daun teh segar, fraksi

metanol teh hijau dan fraksi metanol teh hitam. Fraksi metanol kemudian disaring

dengan millipore, kemudian didegassing selama 15 menit dengan ultrasonikator.

Sampel yang telah dipreparasi diinjeksikan sebanyak 20 µL ke dalam sistem

KCKT yang telah dioptimasi sehingga didapatkan kromatogram sampel dan

dibaca AUC dari masing-masing replikasi. Masukkan hasil AUC ke persamaan

kurva baku kuersetin dari hasil validasi sehingga diperoleh kadar kuersetin dalam

sampel. Replikasi dilakukan 5 kali.

G. Analisis Hasil

Metode yang valid yang akan digunakan untuk penetapan kadar kuersetin

dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam dilihat dari parameter akurasi yang

dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (% recovery) .

Analisis kualitatif dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan

baku kuersetin dan dengan cara spiking, kemudian dilihat terjadinya peningkatan

tinggi puncak/luas puncak setelah di spiking. Analisis kuantitatif dapat dihitung


29

dengan memasukkan AUC sampel ke dalam persamaan regresi linear yang

diperoleh dari kurva baku kuersetin hasil validasi y = bx + a sehingga di dapat

kadarnya. Satuan kadar kuersetin adalah %bbൗ .


30

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Dharma

(2012) mengenai optimasi proses ekstraksi kuersetin total, Dwiyoga (2012)

mengenai optimasi dan validasi penetapan kadar kuersetin total dalam teh hijau,

Wirasaputra (2012) mengenai optimasi jenis fase diam dan komposisi fase gerak

proses clean-up dengan metode solid phase extraction.

Dari hasil optimasi yang dilakukan oleh Dharma (2012) diperoleh proses

ekstraksi yang optimum yakni menggunakan proses soxhletasi sekaligus dengan

proses hidrolisis dengan menggunakan larutan penyari metanol-air (90-10) yang

mengandung HCl 1,85 M pada suhu 90°C. Proses ekstraksi dengan metode

soxhletasi ini dilakukan hingga tercapai 18 sirkulasi.

Dari hasil optimasi yang dilakukan oleh Wirasaputra (2012) diperoleh

proses clean-up yang optimal yakni tahap conditioning menggunakan air-HCl,

tahap elusi menggunakan metanol 100% sebanyak 6-10 mL

Dari hasil optimasi yang dilakukan oleh Dwiyoga (2012) diperoleh

sistem KCKT yang optimum yakni menggunakan fase diam oktildesilsilan (C-18),

campuran fase gerak metanol:aquabidest:asam fosfat 5% (54:45:1), kecepatan alir

1,0 mL/menit, suhu oven 30° C. Penelitian ini juga didasarkan pada validasi

HPLC yang dilakukan oleh Dwiyoga (2012) yang telah memenuhi persyaratan

validasi.


31

A. Pengambilan dan Pembuatan Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian yakni daun teh segar, teh hijau,

dan teh hitam. Teknik pengambilan sampel untuk daun teh segar dilakukan secara

acak mewakili seluruh tanaman teh perkebunan teh, Kulonprogo, hal ini dilakukan

untuk mendapatkan hasil yang representatif. Sampel teh hijau berupa tanaman

kering, teknik pengambilan sampel dilakukan secara acak mewakili seluruh hasil

produksi teh hijau. Begitu pula pada teknik pengambilan sampel teh hitam. Teh

hijau dan teh hitam diperoleh dari pucuk daun teh segar yang diolah di pabrik PT.

PAGILARAN, selanjutnya diserbukhaluskan dan kemudian diayak untuk

mendapatkan ukuran partikel yang lebih kecil dan seragam.

Daun teh segar yang diperoleh selanjutnya dilakukan sortasi basah untuk

membuang bahan lain yang tidak diinginkan, selanjutnya dilakukantahapan

pencucian. Daun teh yang sudah disortasi dan dicuci selanjutnya diblender untuk

memperkecil ukuran partikel sehingga luas permukaan kontak dengan larutan

penyari semakin besar dengan demikian jumlah senyawa yang tersari semakin

besar. Kemudian ditimbang kurang lebih 8 gram dengan seksama masing-masing

sampel dan dimasukkan kedalam tea bag.

B. Penetapan Kadar air dan Kadar Abu

Daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam yang akan ditetapkan kadarnya

harus memenuhi syarat kadar abu dan kadar air yang telah ditetapkan, oleh

karena itu perlu dilakukan penetapan kadar abu dan penetapan kadar air untuk


32

mengetahui kelayakan dari daun teh segar, teh hijau dan teh hitam yang akan

dianalisis.

Penetapan kadar abu dilakukan untuk mengetahui tingkat pengotoran

oleh logam dan silikat. Tabel II menyajikan data mengenai kadar abu dari daun

teh segar, teh hitam, dan teh hijau. Sebelum digunakan krus platina dipijarkan

terlebih dahulu untuk menghilangkan logam dan silikat yang mungkin masih

terdapat dalam krus platina sehingga dapat meningkatkan kadar abu dari teh yang

ditetapkan kadar abunya.

Tabel II. Hasil penetapan kadar abu

Sampel Kadar abu (%) Daun teh segar 2,01

Teh hijau 2,95 Teh hitam 0,83

Dari data diatas dapat dikatakan seluruh sampel yang akan digunakan memenuhi

syarat kadar abu yakni kurang dari 4 % (Rahardian, 2011).

Penetapan kadar air dilakukan untuk mengetahui seberapa besar

kandungan air dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam. Tabel III menyajikan

data mengenai kadar air dari daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam.

Tabel III. Hasil penetapan kadar air

Sampel Kadar air (%) Daun teh segar 78,04

Teh hijau 6,07 Teh hitam 7,88

Kadar air daun teh segar yakni lebih dari 70%, hal ini menunjukkan

bahwa sebagian besar kandungan dalam daun teh segar yakni air. Hal ini karena

daun teh segar belum mengalami pengolahan apapun seperti proses pengeringan

sehingga kandungan air pada daun teh segar sangat tinggi. Berbeda dengan kadar


33

air pada teh hijau dan teh hitam, kadar air pada teh hitam yakni 7,88 % dan pada

teh hijau kadar air nya yakni 6,07 %. Menurut Rahardian (2011), jumlah ini masih

memenuhi syarat yakni kurang dari 8,00 %.

Dilihat dari parameter kadar abu dan kadar air, daun teh segar, teh hijau

dan teh hitam memiliki mutu yang baik.

C. Ekstraksi dan Hidrolisis

Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat

larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair.

Dengan diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan

mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (Direktorat

Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1986). Proses terekstraksinya zat aktif

dari sel tanaman adalah pelarut organik akan berdifusi menembus dinding sel dan

masuk kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam

pelarut organik tersebut sehingga perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif

didalam sel dan pelarut organik diluar sel, maka larutan akan terdisitribusi keluar

sel dan proses ini terulang terus sampai terjadi kesetimbangan antara konsentrasi

cairan zat aktif didalam sel dan diluar sel (List dan Schmidt, 1989).

Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah sokletasi.

Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru umumnya

dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah

pelarut yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2000). Prinsip metode sokhletasi yakni


34

pelarut terkondensasi dari labu menuju pendingin, kemudian jatuh membasahi

sampel dan mengisi bagian tengah alat sokhlet. Tabung sifon juga terisi dengan

larutan penyari dan ketika mencapai bagian atas tabung sifon, larutan tersebut

akan kembali ke dalam labu.

Kebanyakan flavonoid di alam terdapat sebagai glikosida. Flavonoid

glikosida menunjukkan kelarutan yang baik dalam air dibandingkan dengan

aglikonnya. Beberapa senyawa flavonoid seperti flavon dan flavonol, umumnya

tidak tertandai sebagai senyawa utuh, tetapi dalam bentuk aglikonnya. Kuersetin

di dalam daun teh terdapat dalam berbagai bentuk glikosida antara lain kuersetin-

3-glukosida (isokuersetin), kuersetin-3-rhamnoside (kuersitrin) dan kuersetin-3-

rutinoside (rutin). Karena alasan tersebut, prosedur hidrolisis diperlukan untuk

memecah ikatan glikosida selama proses ektraksi (Escribano dan Santos, 2010).

Suhu yang digunakan selama proses ekstraksi yakni 90 °C. Dalam proses

sokhletasi dibutuhkan pelarut yang dapat menyari zat yang diinginkan. Dari

proses optimasi ekstraksi yang telah dilakukan sebelumnya, pelarut yang

digunakan selama proses penyarian yakni metanol-air (90-10) yang mengandung

HCL 1,85 M (Dharma, 2012). Menurut Markham (1988), adanya sejumlah gugus

hidroksil atau mempunyai gugus gula, flavonoid juga bersifat polar dan karenanya

cukup larut dalam pelarut polar seperti metanol. Kuersetin memiliki sejumlah

gugus hidroksil, sehingga inilah alasan digunakan metanol sebagai cairan penyari.

Pada suhu 90 °C metanol dalam larutan penyari akan menguap dan

terembunkan kembali membasahi tea bag sehingga dapat menyari daun teh

tersebut. Analit yang ingin di ekstraksi yakni kuersetin. Senyawa-senyawa yang


35

tersari dalam metanol akan tertampung dalam labu yang berisi larutan penyari

yang mengandung HCl. Senyawa-senyawa tersebut akan mengalami proses

hidrolisis.

Proses hidrolisis ini dilakukan untuk merubah kuersetin bentuk glikosida

menjadi kuersetin bentuk aglikonnya dalam suasana asam. Larutan HCl berfungsi

sebagai katalisator yang dimaksudkan untuk mempercepat terjadinya reaksi

hidrolisis serta untuk mempertahankan kuersetin tetap dalam bentuk molekulnya.

Menurut Harborne (1987), flavonoid umumnya terdapat dalam tumbuhan dalam

beberapa bentuk glikosida dan aglikon flavonoid yang mungkin saja terdapat

dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida, karena alasan

itulah, maka dalam menganalisis flavonoid biasanya lebih baik bila memeriksa

aglikon yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis sebelum

memperhatikan kerumitan glikosida yang mungkin terdapat dalam ekstrak asal.

Dalam daun teh, kuersetin terdapat dalam bentuk glikosida dan aglikonnya, untuk

dapat mengukur kuersetin total maka diperlukan proses hidrolisis untuk

memutuskan ikatan antara glikosida dengan aglikonnya sehingga diperoleh

kuersetin aglikon.

O

OO gula

HO

OH

OH

OHO

OOH

HO

OH

OH

OH

GulaH2O/H +

Gambar 8. Reaksi hidrolisis dengan HCl

D. Clean-up


36

Ekstrak yang diperoleh selanjutnya dilakukan proses clean-up untuk

mendapatkan kuersetin dengan jumlah pengotor yang sedikit. Proses clean-up ini

dilakukan dengan menggunakan kolom solid phase extraction cartridge C-18.

Proses ini dimaksudkan untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang bersifat

lebih nonpolar dibandingkan dengan kepolaran kuersetin yang dapat mengganggu

analisis dengan metode KCKT.

Proses clean-up dilakukan dengan menggunakan Solid Phase Extraction

(SPE) yang didasarkan pada polaritas dan keasaman. Secara umum SPE

digunakan untuk menghilangkan senyawa phenolic non polar (Mumper dan Dai,

2010). Sebanyak 25 mL ekstrak metanol-air dipekatkan hingga volume 5 mL.

Sebanyak 0,1 mL sampel dimasukkan kedalam cartridge yang telah dikondisikan

terlebih dahulu dengan larutan HCl yang memiliki pH 3. Larutan HCl yang

digunakan memiliki pH 3 dimaksudkan untuk membuat kuersetin berada dalam

bentuk molekul dimana pada kondisi asam kuersetin berada dalam bentuk

molekul utuh. Sifat kuersetin yang bersifat asam ditunjukkan dari adanya gugus –

OH pada struktur kuersetin.

Pengkondisian dengan larutan HCl ini dilakukan untuk memastikan

interaksi yang terjadi antara analit yakni kuersetin dengan fase diam berlangsung

secara konsisten sehingga memberikan hasil pemisahan yang optimal. Selanjutnya

dilakukan proses elusi dengan metanol. Cartridge C-18 bersifat nonpolar sehingga

akan menahan senyawa-senyawa dalam sampel yang cenderung bersifat nonpolar

dan senyawa-senyawa yang cenderung bersifat polar, yang larut dalam metanol


37

akan terelusi keluar dari kolom. Kuersetin merupakan senyawa yang bersifat polar

sehingga akan terelusi dengan metanol.

E. Pembuatan Fase Gerak

Pada tahap analisis dengan KCKT digunakan fase diam C-18 dan fase

gerak metanol : akuabides : asam fosfat 5% (45:54:1). Fase gerak bersifat lebih

polar dibandingkan dengan fase diam sehingga pada penelitian ini digunakan

metode KCKT fase terbalik.

Metanol dipilih sebagai salah satu komposisi fase gerak karena metanol

memiliki viskositas yang lebih kecil dibanding dengan etanol karena jika

viskositas terlalu besar dapat meningkatkan tekanan pompa pada KCKT. Dari

hasil optimasi jenis dan komposisi fase gerak digunakan pula akuabides agar

kuersetin dapat terpisah dari senyawa-senyawa yang bersifat lebih polar dibanding

kuersetin sehingga senyawa-senyawa polar dapat terelusi lebih dulu. Penggunaan

asam fosfat pada komposisi fase gerak dimaksudkan untuk mengurangi tailing

pada puncak kuersetin.

Masing-masing komposisi dari fase gerak disaring dengan menggunakan

kertas Whatman untuk mengilangkan partikel-partikel dalam fase gerak yang

mungkin dapat menyumbat kolom. Selanjutnya larutan didegassing dengan

ultrasonikator untuk menghilangkan gelembung udara yang dapat memperngaruhi

tekanan pada pompa KCKT.


38

F. Analisis Kualitatif Kuersetin

Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi

kuersetin baku dengan waktu retensi kuersetin dalam sampel. Waktu retensi (tR)

dapat digunakan untuk analisis kualitatif karena masing-masing senyawa memiliki

waktu retensi yang spesifik pada kondisi tertentu (Noegrohati, 2004). Dari hasil

kromatogram menunjukkan tR kuersetin baku, daun teh segar, teh hijau, dan teh

hitam berturut-turut yakni 15,746 ; 15,858 ; 15,775 ; 15,657. Gambar 9.

menunjukkan adanya kemiripan antara waktu retensi kuersetin baku dengan

waktu retensi kuersetin dalam sampel sehingga dapat dikatakan bahwa didalam

sampel daun teh segar, teh hijau dan teh hitam mengandung kuersetin.

(a)

(b)

Gambar 9. (a) kromatogram baku kuersetin 30 ppm, (b) kromatogram

sampel teh segar

Kuersetin

Kuersetin


39

(c)

(d)

Gambar 9. (c) kromatogram sampel teh hijau, (d) kromatogram sampel teh

hitam

Analisis kualitatif juga dilakukan dengan menspiking sampel dengan

baku kuersetin sehingga terjadi peningkatan tinggi puncak (Rohman, 2007). Dari

kromatogram yang diperoleh dapat dilihat terjadi peningkatan tinggi puncak pada

tR kuersetin. Tabel IV. menunjukkan peningkatan tinggi puncak pada tR kuersetin

sehingga dapat dikatakan bahwa sampel daun teh segar, teh hijau dan teh hitam

mengandung kuersetin.

Kuersetin

Kuersetin


40

(a)

(b)

(c)

Gambar 10. (a) Kromatogram Daun teh segar yang telah dispiking (b)

Kromatogram teh hijau yang telah dispiking (c) Kromatogram teh hitam yang telah

dispiking

Kuersetin

Kuersetin

Kuersetin


41

Tabel IV. Data peningkatan tinggi peak pada tR kuersetin

Sampel Tinggi puncak sebelum dispiking

Tinggi puncak setelah dispiking

Daun teh segar 1985 8318 Teh hijau 5599 37177 Teh hitam 6741 33139

Waktu retensi suatu analit dipengaruhi oleh interaksi analit dengan fase

diam dan fase gerak. Pada penelitian ini digunakan fase diam C-18 yang bersifat

non polar dan fase gerak campuran metanol:akuabides:asam fosfat 5% yang

bersifat lebih polar dibandingkan dengan fase diam. Sistem fase gerak bersifat

lebih polar dibanding fase diam maka senyawa-senyawa yang bersifat polar akan

terelusi lebih dulu dibandingkan dengan senyawa yang bersifat lebih non polar

karena senyawa yang bersifat lebih polar akan berinteraksi lebih kuat dengan fase

gerak dibandingkan dengan fase diam, sehingga akan terlelusi lebih dahulu dan

senyawa yang bersifat lebih nonpolar akan terelusi lebih lama. Dilihat dari

kromatogram kuersetin bersifat lebih non polar dibanding dengan senyawa-

senyawa yang bersifat lebih polar sehingga kuersetin lebih lama tertahan di fase

diam dan memiliki tR yang lebih lama dibanding senyawa-senyawa yang bersifat

polar.

Gambar 11. Gugus polar dan non polar kuersetin


42

Senyawa yang dapat di baca oleh detektor UV harus memiliki gugus

kromofor dan auksokrom. Kuersetin memiliki gugus kromofor dan auksokrom

sehingga dapat memberikan serapan pada panjang gelombang ultraviolet. Gugus

kromofor merupakan gugus yang bertanggung jawab pada penyerapan ultraviolet,

sedangkan gugus auksokrom merupakan gugus yang bertanggungjawab terhadap

pergeseran panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum kuersetin.

Gambar 16. menunjukkan gugus auksokrom dan kromofor yang terdapat pada

kuersetin

Gambar 12. Gugus auksokrom dan kromofor pada kuersetin

G. Validasi Prosedur Analisis

1. Akurasi

Validasi merupakan suatu pembuktian terhadap suatu pearameter

berdasarkan hasil laboratorium bahwa parameter tersebut memenuhi syarat untuk

penggunaannya (Gandjar dan Rohman, 2007). Parameter validasi yang digunakan

dalam penelitian ini adalah ketepaatan (akurasi), linieritas dan LOQ (limit of

Quantitation).

Auksokrom Kromofor


43

Akurasi adalah ketepatan prosedur analisis yang menyatakan kedekatan

antara suatu nilai yang sebenarnya. Dalam penelitian ini akurasi ditentukan

dengan metode penambahan baku (standard addition method). Metode

penambahan baku dilakukan dengan menambahkan sejumlah tertentu

baku/standar ke dalam sampel. Akurasi dinyatakan dengan % recovery.

Recovery merupakan presentase analit yang dapat diekstraksi dan

dianalisis dari sampel yang telah ditambahkan analit pada konsentrasi tertentu

(Anonim, 2003). Penetapan % recovery ini dilakukan untuk mengetahui bahwa

keseluruhan metode maupun metode clean-up yang digunakan untuk penetapan

kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam tidak

menghilangkan kuersetin selama proses analisis. Nilai AUC yang diperoleh dari

sampel yang diadisi selanjutnya dimasukkan kedalam persamaan kurva baku

yakni y = 15390.57648 + 49597.53525x untuk kuersetin yang memiliki nilai

AUC antara 48032 – 235472 dan y = -368905.21654 + 61531.85173x untuk

kuersetin yang memiliki nilai AUC antara 255785 – 2705929. Tabel V.

menunjukkan hasil penetapan % recovery kuersetin untuk keseluruhan proses

analisis dan Tabel VI. menunjukkan hasil penetapan % recovery kuersetin untuk

proses clean-up.

Tabel V. Rata-rata % recovery

Sampel % recovery keseluruhan proses

% recovery proses clean-up

Daun teh segar 119,79 141,55% Teh hijau 98,57 108,92% Teh hitam 102,40 135,78%


44

Dari hasil yang diperoleh hanya sampel teh segar adisi 5 mg dan 20 mg

yang tidak memenuhi persyaratan recovery berdasarkan Codex guideline yakni 70

– 110. Sedangkan untuk sampel adisi dari proses clean-up seluruh sampel tidak

memenuhi syarat recovery berdasarkan Codex guideline.

2. Linearitas dan Limit of Quantification (LOQ)

Data konsentrasi dan AUC dari matriks sampel yang telah dispike dengan

baku kuersetin selanjutnya dimasukkan kedalam program powerfit untuk dapat

mengetahui sebaran seluruh data adisi kuersetin baku kedalam matriks sampel

sehingga diperoleh persamaan regresi linier.

Linearitas merupakan kemampuan prosedur analisis untuk memperoleh

hasil percobaan yang berbanding lurus dengan konsentrasi analit di dalam sampel

(ICH, 2005). Hubungan yang linier ini dilihat dari nilai koefisien korelasi (r) yang

menyatakan korelasi antara jumlah analit dengan AUC yang dihasilkan.

Tabel VI. menunjukkan nilai r yang diperoleh dari masing-masing

sampel dan masing-masing proses. Dari hasil tersebut dapat dilihat bahwa hanya

teh hijau untuk keseluruhan proses dan teh segar untuk proses clean-up yang

memenuhi kriteria yang ditetapkan untuk jumlah sampel 10 yakni r ≥ 0,682

(FAO,1993).

Tabel VI. Nilai koefisien korelasi

Sampel r keseluruhan proses r proses clean-up Daun teh segar 0,97178 0,98217 Teh hijau 0,98608 0,92047 Teh hitam 0,97245 0,89729

Limit of Quantification (LOQ) merupakan konsentrasi terkecil dari analit

dalam sampel uji yang dapat dianalisis secara kuantitatif. Tabel VII menunjukkan


45

nilai LOQ untuk masing-masing sampel. Nilai LOQ inilah yang nantinya akan

digunakan sebagai batas bawah pengukuran sampel.

Tabel VII. Nilai Limit of Quantitation (LOQ)

Sampel LOQ keseluruhan proses (µg/g)

Rata-rata kadar sampel (µg/g)

Daun teh segar 1416,1943 1370,6028 Teh hijau 240,824 1431,8863 Teh hitam 341,8556 2201,1904

Kadar kuersetin dalam daun teh segar memiliki nilai lebih kecil dari nilai

LOQ sehingga kadar kuersetin yang dalam daun teh segar tidak dapat diyakini

kebenaran kadarnya. Nilai LOQ yang diperoleh untuk sampel teh hijau dan teh

hitam memiliki nilai lebih kecil dari kadar kuersetin yang diperoleh sehingga

kadar kuersetin teh hijau dan teh hitam dapat terukur secara kuantitatif.

H. Penetapan Kadar Kuersetin dalam Ekstrak Metanol Daun Teh Segar,

Teh hijau, dan Teh Hitam

Analisis kuantitatif dilakukan dengan menghitung kadar kuersetin dalam

ekstrak daun teh segar, teh hijau dan teh hitam. Perhitungan kadar kuersetin

dilakukan berdasarkan persamaan kurva baku yang diperoleh dari proses validasi

yakni y = 49597,53525 x + 15390,57648 untuk kuersetin yang memiliki nilai

AUC antara 48032 – 235472 dan y = 61531,85173 x – 368905,21654 untuk

kuersetin yang memiliki nilai AUC antara 255785 – 2705929

Presisi sampel merupakan suatu kedekatan nilai data satu dengan yang

lainnya dalam suatu kondisi analisis yang sama didalam matriks sampel. Nilai

presisi dinyatakan dengan nilai Coefficient of Variation (CV). Semakin kecil nilai


46

CV menunjukkan nilai presisi yang semakin baik. Tabel VIII menunjukkan kadar

kuersetin dalam sampel teh segar, teh hijau dan teh hitam serta nilai SD dan %

CV.

Tabel VIII. Kadar Kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam

Sampel

Kadar kuersetin

(ppm)

Kadar kuersetin (µg/g)

Rata-rata kadar

kuersetin (µg/g)

SD CV (%)

Teh

segar

Replikasi 1 1,7116 1361,4924

1370,6028 7,1662 0,4922 Replikasi 2 1,7106 1373,2426 Replikasi 3 1,7304 1372,6168 Replikasi 4 1,7445 1367,2428 Replikasi 5 1,7407 1378,4194

Teh

hijau

Replikasi 1 7,1779 1432,0742

1431,8863 1,2257 0,0856

Replikasi 2 7,1532 1430,2418 Replikasi 3 7,1641 1433,5993 Replikasi 4 7,2085 1432,1468 Replikasi 5 7,1806 1431,3695

Teh

hitam

Replikasi 1 10,8269 2195,6801

2201,1904 3,7747 0,1715 Replikasi 2 10,8398 2203,4247 Replikasi 3 10,8439 2201,7638 Replikasi 4 10,8513 2205,5130 Replikasi 5 10,8035 2199,5704

Dari data penetapan kadar diperoleh rata-rata kadar kuersetin dalam daun

teh segar yakni 1455,8785 µg/g dengan CV 0,4922 %; rata-rata kadar kuersetin

dalam teh hijau yakni 1431,8863 µg/g dengan CV 0,0856 %; rata-rata kadar

kuersetin dalam teh hitam yakni 2201,1904 µg/g dengan CV 0,1715 %. Kadar

kuersetin yang diperoleh merupakan kadar kuersetin dalam berat kering sampel

yang digunakan.

Nilai %recovery dan kadar kuersetin teh segar yang lebih kecil dari LOQ

dapat disebabkan karena adanya kesalahan yang sering terjadi dalam analisis


47

kuantitatif. Kesalahan yang terjadi yakni kesalahan random dan kesalahan

sistematik.

Kesalahan random adalah kesalahan yang selalu terjadi dalam analisis

dikarenakan adanya sedikit variasi yang tidak dapat dikontrol (Gandjar dan

Rohman, 2007).

Tabel IX. Kesalahan random sampel S2 total S2 clean-up

Daun teh segar 2,2590 x 109 3,6502 x 1010 Teh hijau 3,3705 x 109 1,3961 x 1011

Teh hitam 8, 0587 x 109 1,5583 x 1011

Kesalahan sistematik memiliki sifat yang konstan, serta dapat

mengakibatkan hasilnya menyimpang dari rata-rata. Kesalahan ini dapat

disebebakan oleh matriks sampel yang bervariasi, metode atau kesalahan

personal.

Tabel X. Kesalahan sistematik

sampel % Recovery total

% Recovery Clean-up


Dari tabel IX. diketahui kesalahan random paling besar berasal dari

proses clean-up dilihat dari nilai varians proses clean-up yang lebih besar dari

nilai varians keseluruhan proses dan dari tabel X diketahui kesalahan sistematik

paling besar juga berasal dari proses clean-up yang dilihat dari nilai % recovery

clean-up yang lebih besar dari % recovery keseluruhan proses.


48

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Kadar kuersetin total dalam teh hijau dan teh hitam yakni 1431,8863

µg/g dan 2201,1904 µg/g sedangkan kadar kuersetin total dalam daun teh segar

tidak dapat ditetapkan karena kadar kuersetin total lebih kecil dari nilai LOQ.

B. Saran

Perlu dilakukan perbaikan terhadap preparasi sampel pada tahap clean-up

sehingga dapat diperoleh kuersetin lebih banyak dengan jumlah pengotor yang

sedikit.


49

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2003, Guidelines On Good laboratiry practice in residue analysis,pp. 21.

Ahmad, M.M., 2006, Anti Inflammatory Activities of Nigella sativa Linn (Kalongi, black seed), http://lailanurhayati.multiply.com/journal, diakses 22 april 2012

Arifin, S. 1994. Petunjuk Teknis Pengolahan Teh. Pusat Penelitian Teh dan Kina Gambung. Bandung.

Bisset, G. N., dan Wichth, M., 2001, Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals, second ed, CRC Press, Boca Raton, 490 – 492.

Dharma, S.P., 2012, Optimasi Proses Ekstraksi Kuersetin Total dalam Teh Hijau dengan Metode KLT-Densitometri, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1989, Materia Medika Indonesia, jilid V, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 537.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 299, 1009-1010.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 1-12.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2010, Acuan Sediaan Herbal, volume kelima, edisi I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 299, 64-65.

Dwiyoga, A.R.H., 2012, Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Kuersetin menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik dalam Teh Hijau (Camellia sinensis O.K.), Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Erlund, Iris., 2002, Chemical Analysis and Pharmacokinetics Of The Flavonoids Quercetin, Hesperitin And Naringenin In Humans, University of Helsinki, Helsinki, 21


50

Escribano-Bailon, M.T., Santos-Buelga, C.,M, 2010, Polyphenol Extraction from Food, 8.

Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan kedua, Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 378, 389-390.

Gruenwald, J., Brendler, T., Jaenicke, C., 2007, PDR®For Herbal Medicines Fourth Edition, Thompson Healthcare Inc, 414 – 419.

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan¸ ITB, Bandung, 7-8

Hartoyo, A.,2003, Teh dan Khasiatnya Bagi Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta, 9-13, 23-35.

Haryanto, 2012, Pengolahan Teh Hitam , PT. PAGILARAN, Batang.

Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan ElektroforesisModern, PT. Remaja Rosdakarya, Bandung, 21-25.

Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta, 177-181,211.

List, P.H., dan Schmidt, P.C., 1989, Phytopharmaceutical Technology, 99-105, CRC Press, Boca Raton.

Makasheva NE, Makashev YA, Sharonov BP,Grachev SA, Mironov VE. 1976. The kinetics of complex formation of some transition metals in quercetin and morin. Russian Chemical Bulletin 25:885-886.

Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Terjemahan Kosasih Padmawinata, Bandung: Penerbit ITB

Miean, K.H., Mohamed, S., 2000, Flavonoid (Myricetin, Quercetin, Kaempferol, Luteolin, andApigenin) Content of Edible Tropical Plants, University Putra Malaysia, Malaysia.

Mumper, R. J., dan Dai, J., 2010, Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties, Molecules

Munson, J. W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan oleh Harjana, Parwa B., Volume II, hal. 13-5, Airlangga University Press, Surabaya.

Nazaruddin, Paimin FB. 1993. Pembudidayaan dan Pengolahan Teh. Cetakan I. Jakarta: Penebar Swadaya.

Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM, Yogyakarta, pp. 6-17.


51

Paulsen, Susan., 2003, Quercetin Monograph, diakses tanggal 11 Oktober 2011

Pertiwi, M.V., 2006, Penetapan Kadar Flavonoid Total Terhitung Sebagai Kuersetin dengan Menggunakan Metode Kolorimetri dalam Teh Hijau dan Teh Hitam [Merk X], Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Rahardian, Dimas, 2011, Teknologi Pengolahan Teh Hitam, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, edisi pertama, cetakan pertama, Penerbit Graha Ilmu, Yogyakarta, pp. 217-230.Syah, Andi., 2006, Taklukkan Penyakit Dengan Teh Hijau, AgroMedia Pustaka, Jakarta, 46, 69.

Septianingrum, E.,Faradilla, R., Ekafitri, R., Murtini, S., dan Perwatasari, D., 2009, Kadar Fenol Aktivitas Antioksidan Pada Daun Teh Hijau dan Teh Hitam Komersial, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Steenis, Dr. C.G.G.J. Van, et al., 1992, Flora Untuk Sekolah di Indonesia, Cetakan Keenam, PT. Pradnya Paramita, Jakarta.

The Merck Index, 1989, The Merck Index An Encyclopedia Of Chemicals Drugs and Biological, Eleventh edition, Merck & Co., Inc., USA, pp.1278.

Tokusoglu, O., Unal, M.K., Yildirim, Z., 2003, HPLC-UV and GC-MS Characterization of Flavonol Aglycons Quercetin, Kaempferol and Myricetin In Tomato Pastes and Other Tomato-Based Products, Acta Chromatographica

Traverniers, I., Loose, M.D., Bockstaele, E.V 2004, Trends In Quality In The Analytical Laboratory. II. Analytical Method Validation And Quality Assurance, Trends in Analytical Chemistry volume III

Tuminah, S., 2004, Teh (Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast) Sebagai Salah Satu Sumber Antioksidan, Cermin Dunia Kedokteran No. 144, pp. 52 -53.

Wirasaputra, A., 2012, Optimasi Clean-up Esktrak Metanol-air Teh Hijau dengan Menggunakan Metode Solid Phase Extraction (SPE) untuk Mendukung Penetapan Kadar Kuersetin dalam Teh Hijau dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.


52

LAMPIRAN


53

Lampiran 1. Sertifikat analisis kuersetin


54

Lampiran 2. Surat Determinasi


55

Lampiran 3. Penimbangan sampel teh Segar

a. Penimbangan sampel teh segar tanpa adisi

Penimbangan Replikasi I

Replikasi II

Replikasi III

Replikasi IV

Replikasi V

Berat beker glass 61,281 61,412 61,611 61,506 61,564 Berat beker glass + zat 69,557 69,579 69,745 69,746 689,708 Berat beker glass + sisa 61,468 61,564 61,639 61,591 61,591 Berat zat 8,089 8,015 8,106 8,200 8,117

b. Penimbangan sampel teh segar dengan adisi 5mg kuersetin baku

Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 61,521 61,386 Berat beker glass + zat 69,608 69,572 Berat beker glass + sisa 61,553 61,404 Berat zat 8,055 8,168

c. Penimbangan sampel teh segar dengan adisi 10mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II

Berat beker glass 61,368 61,475 Berat beker glass + zat 69,534 69,534 Berat beker glass + sisa 61,416 61,416 Berat zat 8,118 8,118

d. Penimbangan sampel teh segar dengan adisi 15mg Kuersetin baku


e. Penimbangan sampel teh segar dengan adisi 5mg Kuersetin baku



56

Lampiran 4. Penimbangan sampel teh hijau

a. Penimbangan sampel teh hijau tanpa adisi

b. Penimbangan sampel hijau dengan adisi 5mg kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II


c. Penimbangan sampel teh hijau dengan adisi 10mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II


d. Penimbangan sampel teh hijau dengan adisi 15mg Kuersetin baku

Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 64,1046 64,1050 Berat beker glass + zat 72,1189 72,1290 Berat beker glass + sisa 64, 1217 64,1220 Berat zat 7,9972 8,0070

e. Penimbangan sampel teh hijau dengan adisi 20 mg Kuersetin baku



Replikasi II

Replikasi III

Replikasi IV

Replikasi V



57

Lampiran 5. Penimbangan sampel teh hitam

a. Penimbangan sampel teh hitam tanpa adisi

b. Penimbangan sampel hitam dengan adisi 5mg kuersetin baku


c. Penimbangan sampel teh hitam dengan adisi 10mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II


d. Penimbangan sampel teh hitam dengan adisi 15mg Kuersetin baku


e. Penimbangan sampel teh hitam dengan adisi20 mg Kuersetin baku



Replikasi II

Replikasi III

Replikasi IV

Replikasi V



58

Lampiran 6. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh segar dari awal proses

a. Penambahan kuersetin 5mg Penimbangan Replikasi I Replikasi II

Berat kertas 0,2064 0,2118 Berat kertas + zat 0,2118 0,2172 Berat kertas + sisa 0,2065 0,2120 Berat zat 0,0053 0,0052

b. Penambahan kuersetin 10mg Penimbangan Replikasi I Replikasi II


c. Penambahan kuersetin 15mg Penimbangan Replikasi I Replikasi II


d. Penambahan kuersetin 20mg Penimbangan Replikasi I Replikasi II


Lampiran 7. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hijau dari awal proses




59







Lampiran 8. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hitam dari awal proses






60




Berat kertas 0,2100 0,2046 Berat kertas + zat 0,2302 0,2246 Berat kertas + sisa 0,2100 0,2046 Berat zat 0,0202 0, 0200

Lampiran 9. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh segar dari proses clean-up








Berat kertas 0,2082 0,2015


61

Berat kertas + zat 0,2290 0,2246 Berat kertas + sisa 0,2095 0,2049 Berat zat 0,0195 0, 0197

Lampiran 10. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hijau dari proses clean-up






Berat kertas 0,1990 0,2087 Berat kertas + zat 0,2144 0,2238 Berat kertas + sisa 0,1992 0,2089 Berat zat 0, 0152 0, 0149



Lampiran 11. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hitam dari proses SPE


Berat kertas 0,2061 0,2097


62

Berat kertas + zat 0,2113 0,2148 Berat kertas + sisa 0,2061 0,2097 Berat zat 0,0052 0, 0051




Berat kertas 0,2094 0,2123 Berat kertas + zat 0,2246 0,2276 Berat kertas + sisa 0,2094 0,2127 Berat zat 0, 0152 0, 0149



Lampiran 12. Data kadar air

Lampiran 13. Data Kadar abu teh segar

1. Penimbangan daun teh segar

Replikasi I II III Berat krus 26,7110 gram 29,3075 gram 30,9079 gram Berat krus + zat 29,6577 gram 32,3236 gram 33,8572 gram Berat zat 2,9467 gram 3,0161 gram 2,9493 gram

Sampel Daun teh segar Teh hijau Teh hitam

Replikasi I II III I II III I II III Kadar air (%) 78,42 77,27 78,45 5,84 6,00 6,37 7,87 7,23 8,54 Rata-rata (%) 78,04 6,07 7,88


63

2. Penimbangan abu

Replikasi I II III Berat krus 26,7110 gram 29,3075 gram 30,9079 gram Berat krus + abu 26,7337 gram 29,3791 gram 30,9929 gram Berat abu 0,0227 gram 0,0716 gram 0,0856 gram

3. Kadar abu = ୠୣ୰ୟ୲ ୟୠ୳ୠୣ୰ୟ୲ ୟ୲

x 100%

Replikasi I II III Kadar abu 0,77 % 2,37 % 2,90 % Kadar abu rata-rata 2,01 %

Lampiran 14. Data Kadar abu teh hijau

1. Penimbangan daun teh hijau

Replikasi I II III Berat kertas 0,5808 gram 0,5811 gram 0,5802 gram Berat kertas + zat 3,6078 gram 3,5882 gram 3,6679 gram Berat kertas + sisa 0,5808 gram 0,5813 gram 0,5802 gram Berat zat 3,027 gram 3,0069 gram 3,0877 gram

2. Penimbangan abu



x 100%

Replikasi I II III Kadar abu 2,99 % 2,80 % 3,05 % Kadar abu rata-rata 2,95 %


64

Lampiran 15. Data kadar abu teh hitam

1. Penimbangan teh hitam

Replikasi I II III Berat kertas 0,5847 gram 0,5834 gram 0,5884 gram Berat kertas + zat 3,5891 gram 3,5876 gram 3,6112 gram Berat kertas + sisa 0,5848 gram 0,5839 gram 0,5890 gram Berat zat 3,0043 gram 3,0037 gram 3,0222 gram

2. Penimbangan abu



x 100%

Replikasi I II III Kadar abu 2,16 % 0,24 % 0,08 % Kadar abu total 0,83 %

Lampiran 16. Kromatogram sampel teh segar tanpa adisi

Replikasi I


65

Parameter KCKT:

Kolom : C-18, ukuran partikel 5 µm

Fase gerak : Metanol : akuabides : asam fosfat 5% (45:54:1)

Kecepatan alir : 0,8 mL/menit

Detektor Vis : 370nm

Volume injeksi : 20µL

Replikasi II


66

Replikasi III

Replikasi IV


67

Replikasi V

Lampiran 17. Kromatogram sampel teh segar dengan adisi kuersetin baku dari awal proses

Adisi kuersetin 5 mg replikasi I


68


Adisi kuersetin 10 mg Replikasi I


69

Adisi kuersetin 10mg replikasi II

Adisi kuersetin 15mg replikasi I


70




71


Lampiran 18. Kromatogram sampel teh segar dengan adisi kuersetin dari proses clean-up

adisi kuersetin 5mg replikasi I


72

adisi kuersetin 5 mg replikasi II



73




74




75


Lampiran 19. Kromatogram sampel teh hijau tanpa adisi

Replikasi I


76

Replikasi II

Replikasi III


77

Replikasi IV

Replikasi V


78

Lampiran 20. Kromatogram sampel teh hijau dengan adisi kuersetin dari awal proses


Adisi kuersetin 5 mg replikasi II


79




80




81




82

Lampiran 21. Kromatogram sampel teh hijau dengan adisi kuersetin dari proses clean-up




83




84




85




86

Lampiran 22. Kromatogram sampel teh hitam tanpa adisi

Replikasi I

Replikasi II


87

Replikasi III

Replikasi IV


88

Replikasi V

Lampiran 23. Kromatogram sampel teh hitam dengan adisi kuersetin dari awal proses



89




90




91




92


Lampiran 24. Kromatogram sampel teh hitam dengan adisi kuersetin dari proses clean-up



93




94




95




96


Lampiran 25. Data kadar kuersetin teh segar dan contoh perhitungan kadar kuersetin

Sampel AUC Kuersetin

Konsentrasi kuersetin

(ppm)

Berat sampel

(g)


SD CV (%)

Replikasi 1 100284 1,7116 8,089 1361,4924

7,1959 0,4943

Replikasi 2 100230 1,7106 8,015 1373,2426 Replikasi 3 101215 1,7304 8,106 1372,6168 Replikasi 4 101913 1,7445 8,200 1367,2428 Replikasi 5 101726 1,7407 8,117 1378,4194 Rata-rata 101704 1.7276 8,1054 1370,6028

1. Contoh perhitungan kadar kuersetin teh segar

Seluruh hasil clean-up dengan SPE diuapkan, kemudian dilarutkan dalam

3mL pelarut metanol. Sebanyak 20 µL sampel diinjeksikan kedalam sistem

KCKT.


97

a. Kadar kuersetin dalam daun teh segar replikasi 1 = 100284, kemudian

dimasukkan kedalam persamaan kurva baku

y = 15390,57648 + 49597,53525 x

100284 = 15390,57648 + 49597,53525 x

49597,53525 x = 100284 – 15390,57648

49597,53525 x = 84893,42352

x = = 1,7116 µg/mL

i. Volume ekstrak = 250 mL

Kadar kuersetin dalam ekstrak = 1,7116 µg x 3 mL x ହ ୫,ଵ ୫

x ଶହ ୫ଶହ ୫

= 2418,45 µg

ii. Berat sampel = 8,089 g

Kadar air = 78,04 %

Berat kering sampel = 8,089 x 21,96% = 1,7763 gram

Kadar kuersetin dalam berat kering sampel = ଶସଵ଼,ସହ ஜ ଵ,ଷ

= 1370,60 µg/g

Lampiran 26. Data kadar kuersetin teh hijau dan contoh perhitungan kadar kuersetin



(ppm)

Berat sampel (gram)


SD CV (%)

Replikasi 1 371396 7,1779 8,0042 1432,0742

1,2257 0,0856

Replikasi 2 370172 7,1532 7,9869 1430,2418 Replikasi 3 370711 7,1641 8,1081 1433,5993 Replikasi 4 372913 7,2085 8,0379 1432,1468 Replikasi 5 371532 7,1806 8,0112 1431,3695 Rata-rata 371345 7,1769 8,0041 1431,8863


98

1. Contoh perhitungan kadar kuersetin dalam teh hijau

Dari proses ekstraksi sampel di tambahkan dengan larutan penyari ke dalam

labu takar 250 mL. Diambil 25 mL dipekatkan hingga volume 5 mL.

selanjutnya diambil 0,1 mL dimasukkan kedalam SPE dan dielusi dengan 6 mL

metanol. Seluruh hasil clean-up dengan SPE diuapkan, kemudian dilarutkan

dalam 3mL pelarut metanol. Sebanyak 20 µL sampel diinjeksikan kedalam

sistem KCKT.

a. AUC kuersetin dalam teh hijau replikasi 1 = 371396 , kemudian

dimasukkan kedalam persamaan kurva baku

y = 15390,57648 + 49597,53525 x

371396 = 15390,57648 + 49597,53525 x

49597,53525 x = 371396 – 15390,57648

49597,53525 x = 356005,4235

x = 7,1779 ppm = 7,1779 µg/mL




= 10766,85 µg


Kadar air = 6,07 %

Berat kering sampel = 8,0042 g x 93,93 % = 7,5183 gram

Kadar kuersetin dalam berat kering sampel = ଵ,଼ହ ஜ ,ହଵ଼ଷ

= 1432,09 µg/g


99

Lampiran 27. Data kadar kuersetin teh hitam dan contoh perhitungan kadar kuersetin



(ppm)

Berat sampel (gram)


SD CV (%)

Replikasi 1 552378 14,9725 8,0292 2195,6801

3,7747 0,1715

Replikasi 2 553017 14,9828 8,0075 2203,4247 Replikasi 3 553222 14,9862 8,0106 2201,7638 Replikasi 4 553587 14,9921 8,0124 2205,5130 Replikasi 5 551219 14,9536 7,9977 2199,5704 Rata-rata 552685 14,9774 8,0137 2201,1904

1. Contoh perhitungan kadar kuersetin dalam teh hitam

a. AUC kuersetin dalam teh hijau replikasi 1 = 552378 , kemudian dimasukkan

kedalam persamaan kurva baku y = 61531,85173 x – 368905,21654

y = 61531,85173 x – 368905,21654

552378 = 61531,85173 x – 368905,21654

61531,85173 x = 552378 + 368905,21654

61531,85173 x = 921283,2165

x = 14,9725 ppm = 14,9725µg/mL




= 22458,75 µg


Kadar kuersetin = ଶଶସହ଼,ହ ஜ଼,ଶଽଶ ୶ ଽଶ,ଵଶ %

= 3036,39 µg/g


100

Lampiran 28. Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan kadar kuesetin dalam teh segar

adisi berat basah berat kering kuersetin

yang ditambahkan

AUC konsentrasi kuersetin (ug/mL)

konsentrasi kuersetin

(ug) %recovery rata-rata

0

8,089 1,7762

100284 1,7116 2567,4690

8,015 1,7601 100230 1,7106 2565,8359 8,106 1,7801 101215 1,7304 2595,6257 8,2 1,8007 101913 1,7445 2616,7356

8,117 1,7825 101726 1,7407 2611,0801

5 8,055 1,7689 5300 228219 4,2911 6436,6633 72,55%

157,09% 8,168 1,7937 5900 322200 11,2317 16847,4992 241,63%

10 8,118 1,7827 9200 231804 4,3634 6545,0860 42,98%

97,17% 8,118 1,7827 9600 333445 11,4144 17121,6256 151,36%

15 8,143 1,7882 14700 422594 12,8632 19294,8659 113,63%

113,47% 8,072 1,7726 13900 383461 12,2273 18340,8965 113,31%

20 8,03 1,7634 19200 630491 16,2419 24362,8996 113,39%

111,43% 8,047 1,7671 19900 630957 16,2495 24374,2596 109,46%


101

Lampiran 29. Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan kadar kuesetin dalam teh hijau


yang ditambahkan




0

8,0042 7,5183

371396 12,0312 18046,78055

7,9869 7,5021 370172 12,0113 18016,94234 7,9803 7,4959 370711 12,0201 18030,08188 8,0379 7,5500 372913 12,0558 18083,76139 8,0112 7,5249 371532 12,0334 18050,0959

5 8,0676 7,5779 5300 578330 15,3942 23091,33863 95,20%

107,83% 8,0018 7,5161 5300 633234 16,2865 24429,76739 120,46%

10 7,9972 7,5118 10100 688935 17,1918 25787,62511 76,65%

83,32% 7,9929 7,5077 10100 744189 18,0897 27134,58604 89,99%

15 7,9951 7,5098 15200 921628 20,9734 31460,12627 88,25%

94,03% 8,0172 7,5306 15200 993673 22,1443 33216,41178 99,81%

20 8,1061 7,6141 19900 1197134 25,4509 38176,3064 101,16%

109,10% 8,007 7,5210 20000 1331568 27,6357 41453,48715 117,04%


102

Lampiran 30. Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan kadar kuesetin dalam teh hitam


yang ditambahkan




0

8,0292 7,3965

552378 14,9725 22458,69068

8,0105 7,3793 553017 14,9828 22474,26798 8,0196 7,3877 553222 14,9862 22479,26539 8,0114 7,3801 553587 14,9921 22488,16322 7,9977 7,3675 551219 14,9536 22430,43702

5 7,9943 7,3643 5300 629800 16,2307 24346,05465 35,47%

88,63% 8,0124 7,3810 5300 860939 19,9871 29980,67298 141,78%

10 7,9943 7,3643 10200 860944 19,9872 29980,79487 73,67%

96,75% 8,0124 7,3810 10200 1054044 23,1254 34688,11298 119,82%

15 7,9943 7,3643 15100 1095425 23,7979 35696,88321 87,62%

105,71% 8,0124 7,3810 14900 1309389 27,2752 40912,81595 123,80%

20 7,9943 7,3643 20200 1490065 30,2115 45317,26653 113,12%

118,53% 8,0124 7,3810 20000 1569528 31,5029 47254,38522 123,94%


103

Lampiran 31. Data recovery untuk proses clean-up sampel teh segar

adisi kuersetin

yang ditambahkan


konsentrasi kuersetin (ug/3mL)


(ug) (5mL) kadar * fp %recovery rata-rata

0 100284 1,7116 5,134938 256,7469 1026,987608 101215 1,7304 5,1912513 259,5626 1038,250265 5 4200 284413 5,4241 16,272326 813,6163 3254,465233 52,90% 115,42% 4400 539925 14,7701 44,310232 2215,5116 8862,046478 177,94%

10 9100 1089407 23,7001 71,100357 3555,0179 14220,07148 144,92% 166,88% 9200 1518659 30,6762 92,02864 4601,4320 18405,72806 188,84%

15 14400 1879939 36,5476 109,64293 5482,1466 21928,58645 145,11% 143,22% 15100 1925574 37,2893 111,86788 5593,3939 22373,57549 141,33%

20 19300 2307309 43,4932 130,47946 6523,9729 26095,89155 129,86% 140,69% 19100 2704978 49,9560 149,8679 7493,3952 29973,58081 151,52%

Faktor pengenceran 5x.


104

Lampiran 32. Data recovery untuk proses clean-up sampel teh hijau

adisi kuersetin

yang ditambahkan





0 93598 1,5768 4,7305228 236,5261 709,5784177 552434 14,9734 44,920112 2246,0056 6738,016747 5 5200 495318 14,0451 42,135408 2106,7704 6320,311132 49,93% 123,19% 5100 1510224 30,5391 91,61739 4580,8695 13742,60848 196,45%

10 9900 1587859 31,8008 95,402503 4770,1251 14310,3754 106,94% 127,01% 10100 2171543 41,2867 123,86015 6193,0077 18579,02314 147,08%

15 15200 2028321 38,9591 116,87733 5843,8666 17531,59977 90,84% 98,66% 14900 2309507 43,5289 130,58662 6529,3311 19587,99327 106,47%

20 20100 2604379 48,3211 144,96318 7248,1588 21744,47639 89,66% 86,81% 20000 2436290 45,5893 136,76796 6838,3978 20515,19355 83,96%

faktor pengenceran 3x


105

Lampiran 33. Data recovery untuk proses clean-up sampel teh hitam

adisi kuersetin

yang ditambahkan





0 68313 1,0670 3,2011121 160,0556 800,2780267 206343 3,8500 11,550116 577,5058 2887,528925 5 5200 266386 5,0606 15,181929 759,0965 3795,48231 37,53% 110,12% 5100 546891 14,8833 44,649861 2232,4931 11162,46534 182,72%

10 9900 732972 17,9074 53,722285 2686,1142 13430,57115 117,04% 142,49% 9900 1146423 24,6267 73,880186 3694,0093 18470,0465 167,94%

15 15200 1181007 25,1888 75,566337 3778,3169 18891,58427 112,16% 150,15% 14900 2082260 39,8357 119,50714 5975,3570 29876,78512 188,14%

20 20200 1559513 31,3402 94,020487 4701,0243 23505,12168 107,23% 140,36% 19800 2600519 48,2583 144,77498 7238,7490 36193,74519 173,48%

Faktor pengenceran 5x


106

111

Lampiran 34. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh segar untuk keseluruhan proses

Persamaan regresi linier y = 24,91494x + 96488,43601

r = 0,97178

Sa = 1,90151 x 104

Sb = 1,82348

Variance = 2,2590 x 109

LOQ = ଷ,ଷ ௫ ଵ,ଽଵହଵ ௫ ଵర

ଶସ,ଽଵସଽସ = 2518,56 µg

LOQ dalam berat sampel kering = 2518,56 µg / 1,7784 g = 1416,1943 µg/g

Rata-rata kadar sampel kering = 1375, 3204 µg/g

Lampiran 35. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hijau untuk keseluruhan proses


107

Persamaan regresi linier y = 42,20372 x + 359893,78332

r = 0,98608

Sa = 2,31892 x 104

Sb = 2,14575

Variance = 3,3705 x 109

LOQ = ଷ,ଷ ௫ ଶ,ଷଵ଼ଽଶ ௫ ଵర

ସଶ,ଶଷଶ = 1813,2136 µg

LOQ dalam berat kering = 1813,2136 µg / 7,5292 g = 240,824 µg/g

Rata-rata kadar sampel kering = 1327,6654 µg/g

Lampiran 36. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hitam untuk keseluruhan proses


r = 0,97245

Sa = 3,58436 x 104

Sb = 3,31231

Variance = 8, 0587 x 109

LOQ = ଷ,ଷ ௫ ଷ,ହ଼ସଷ ௫ ଵర

ସ,ଽଵ = 2521,6298 µg

LOQ dalam berat kering = 2521,6298 µg / 7,3763 g = 341,8556 µg/g


108

Rata-rata kadar sampel kering = 1962,8358 µg/g

Lampiran 37. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh segar untuk proses clean-up


r = 0,98217

Sa = 1,02504 x 105

Sb = 8,73481

Variance = 3,6502 x 1010

Lampiran 38. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hijau untuk proses clean-up



109

r = 0,92047

Sa = 2,05322 x 105

Sb = 16,7082

Variance = 1,3961 x 1011

Lampiran 39. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hitam untuk proses clean-up


r = 0,89729

Sa = 2,17059 x 105

Sb = 17,6863

Variance = 1,5583 x 1011

Lampiran 40. Random error

sampel S2 total S2 SPE

Daun teh segar 2,2590 x 109 3,6502 x 1010

Teh hijau 3,3705 x 109 1,3961 x 1011

Teh hitam 8, 0587 x 109 1,5583 x 1011


110

Lampiran 41. Systematic error

sampel % Recovery

total

% Recovery

Clean-up



111

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Penetapan Kadar Kuersetin

Dalam Ekstrak Metanol-Air Daun Teh Segar, Teh

Hijau, dan Teh Hitam” memiliki nama lengkap

Anastasia Filipa Veritas da Silva. Penulis lahir di Bogor

tanggal 6 November 1990 sebagai anak ketiga dari

pasangan Gregorius da Silva dan Maria Anastasia Iing

Susilowati. Pendidikan formal yang telah ditempuh

penulis adalah TK Santa Maria Monica, Bekasi Timur

(1995-1996), SD Santa Maria Monica, Bekasi Timur

(1996-2002), SMP Santa Maria Monica, BekasiTimur (2002-2005), SMF Kristen

BPK Penabur, Jakarta Pusat (2005-2008), dan pada tahun 2008 penulis

melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Selama

kuliah penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi antara lainpanitia

pelepasan wisuda (2008), redaksi PHARMAHOLIC (2009), panitia seminar

POFASADHA “Memahami Anak Muda” (2009), anggota Paduan Suara Fakultas

Farmasi (2009), peserta Kampanye Informasi Obat “Health by herbal, herbal for

healthy” (2010), panitia Inisiasi Sanata Dharma (INSADHA) (2010), asisten

praktikum Farmakognosi-Fitokimia (2011) dan praktikum Formulasi Sedian Solid

(2012).


Documents

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI filedalam kehidupan penulis. Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penelitian ini. Oleh karena itu Penulis sangat mengharapkan