fPolifenoli kao antitrombocitni agensi u prevencijikardiovaskularnih bolesti – in vitro i ex vivo ispitivanja

Aleksandra Konić Ristić, Tatjana Srdić-Rajić, Nevena Kardum, S ć G ćIvan Stanković, Marija Glibetić

Kardiovaskularne i maligne bolesti predstavljaju najznačajniji uzrok obolevanja i umiranja u svetu

Prospektivne epidemiološke studije (NHS HPFS EPIC DASH ) i meta analize

j j

Prospektivne epidemiološke studije (NHS, HPFS, EPIC, DASH...) i meta-analize

Ishrana bogata voćem, povrćem i integralnim žitaricama povezana je sa smanjenim rizikom od nastanka hroničnih bolesti.j

FITOHEMIKALIJE

Trombociti kao ciljno mesto delovanja fitohemikalija

- krvne ćelije bez jedra j j k ć lij di k id blik i č ik 2 5 - najmanje krvne ćelije, diskoidnog oblika i prečnika 2-5 µm.

- prosečan životni vek :7-10 dana, - optimalan broj :150 - 450 x 109/L krvi

Fiziološki uslovi

- HEMOSTAZA

Patološki uslovi

- TROMBOZA

Aktivna uloga u patogenezi :

Ateroskleroze – interakcija sa monocitima Ateroskleroze interakcija sa monocitima Inflamacije –... neutrofilima Malignih bolesti – ...malignim ćelijama Imunskoj funkciji limfocitima Imunskoj funkciji – ...limfocitima Sekrecija hemokina, proinflamatornih činilaca i formiranje mikropartikula trombocitnog porekla

Struktura trombocita

- receptori za - adhezioni receptori

neaktivirani, “mirujući” trombociti

fiziološke agoniste - aktivacioni markeri

aktivirani trombociti

Povećana aktivacija i preosetljivost trombocita:

• hiperholesterolemija (Broijersen i sar. 1998), • hipertenzija (Nityanand i sar 1993) • hipertenzija (Nityanand i sar.1993), • pušenje (Nowak i sar. 1987), • dijabetes (Manduteanu i sar. 1992),

t b lički i d (V d th i 2008)• metabolički sindrom (Vaduganathan i sar., 2008)

Biomarker akutnih KV događaja Biomarker rizika za nastanak KVB

Racionalizuje evaluaciju antitrombocitnih agenasa u primarnj Racionalizuje evaluaciju antitrombocitnih agenasa u primarnj sekundarnoj i tercijarnoj prevenciji KVBsekundarnoj i tercijarnoj prevenciji KVB

Promena aktivacionog statusa trombocita u fiziološkim stanjima:- postprandijalna lipemija (Broijersen i sar., 1998)- postprandijalna glikemija (Hyson i sar., 2003)- stanja fizičkog i mentalnog stresa (Kratz i sar., 2006; Ledenborger i sar., 2004)

Povoljno delovanje sastojaka namirnica na funkciju tombocita:

- ekstrakt paradajza

EFSA Evropsko regulatorno telo za bezbednost hrane (eng European Food Safety Authority )

- masna riba- PNMK- MNMK

- vitamin C- dijetarni izvori

-polifenoli- dijetarni izvori

EFSA - Evropsko regulatorno telo za bezbednost hrane (eng. European Food Safety Authority )

„Smanjenjenje aktivacije i agregacije trombocita delovanjem namirnica ili njihovih sastojaka“

POTENCIJALNI MEHANIZAM DELOVANJA U OČUVANJU KARDIOVASKULANOG ZDRAVLJA (EFSA Journal ,2011)

Analiza većeg broja aktivacionih markera trombocita

Metoda: Protočna citometrija

g j

Procenat ćelija koje eksprimiraju aktivacioni marker

Gustina aktivacionog markera na ćelijama (MFI)

Analiza interakcije trombocita sa drugim ćelijama

Primena različitih agonista u različitim koncentracijama

A li k k i i i i i k t k l kti ij * Analizom uzoraka pune krvi minimizira se ekstrakorporalna aktivacija*

**Krueger LA, Barnard MR, Frelinger AL, 3rd, Furman MI, Michelson AD. Immunophenotypic analysis of platelets. Curr Protoc Cytom. 2002;Chapter 6:Unit 6 10.Barnard MR, Krueger LA, Frelinger AL, 3rd, Furman MI, Michelson AD. Whole blood analysis of leukocyte-platelet aggregates. Curr Protoc Cytom. 2003 ;Chapter 6:Unit 6 15.

Ptotočna citometrija (metoda)Ptotočna citometrija (metoda)Ćelijski markeri/korišćena mAt:1.Identifikacija populacije trombocita (pan-trombocitni marker)

- CD61 (integrin β 3, GPIIIa)/anti-CD61 mAt

2. Aktivacija trombocita (aktivacioni markeri) - CD62P (P-selektin)/anti-CD62 mAb ( )

-- agregacija trombocita sa leukocitimaagregacija trombocita sa leukocitima-- aterosklerozaateroskleroza- GPIIb-IIIa (integrin –Rc za fibrinogen)/PAC-1

- agregacija trombocita sa drugim trombocitimaagregacija trombocita sa drugim trombocitimatrombozatromboza- trombozatromboza

3. Agregacija sa monocitima i neutrofilima- CD11b+CD61+/MAC-1; anti-CD61 mAb –

identifikacija trombocit/neutrofil agregata- identifikacija trombocit/neutrofil agregata- CD14+CD61+/anti-CD14 mAb anti-CD61mAB-

- identifikacija trombocit/monocit agregataU bazalnom statusu– hiperhiper--aktivacija trombocitaaktivacija trombocitaU bazalnom statusu hiperhiper aktivacija trombocitaaktivacija trombocita

Nakon ex vivo delovanja agonsta funkcije trombocita (ADP i AA)– hiperhiper--reaktivnost trombocitareaktivnost trombocita

Polifenoli- najbrojnija i najzastupljenija grupa biološki aktivnih, sekundarnih metabolita biljaka- prisutni u većini namirnica biljnog porekla (voće, povrće, žitarice, leguminoze, pojedina biljna ulja, p su u eć a ca b j og po e a ( oće, po će, a ce, egu o e, pojed a b j a u ja,vina i biljni čajevi). -najznačajnija grupa nenutritivnih sastojaka namirnica i najznačajniji dijetarni antioksidansi

Fenolne kiseline

Derivati hidroksi benzojeve kiseline Derivati hidroksi cimetne kiseline

C6-C1Dijetarni polifenoli

FlavonoidiFlavonoli Flavoni Flavanoni Izoflavoni

C6-C3-C6

ProantocijanidiniKatehini

Flavanoli

O

OH

OH

HO

OH

O

OH

OH

HO

OH

Antocijani

KurkuminoidiStilbeniLignani C6-C3-C3-C6

C6-C2-C6C6-C3-C-C3-C6

Uticaj polifenola i njihovih dijetarnih izvora na funkciju trombocita

I faza : predklinička ispitivanja – skriningI faza : predklinička ispitivanja skrining

II faza: dijetarne interventne studije

III faza: ispitivanje potencijalnih mehanizama

Osnovne karakteristike polifenola: Definisani eksperimentalni uslovi (agensi) in vitro

- Intenzivan metabolizam

- Mala bioraspoloživost

... Definisani eksperimentalni uslovi (agensi) in vitro1. Skrining studije: aglikoni i ekstrakti2. Mehanizam delovanja: aglikoni i metaboliti

U fiziološkim koncentracijamaU fiziološkim koncentracijama

Najveći stepen naučne zasnovanostiRandomizovane, kontrolisane, duplo-slepe dijetarne interventne studije

- procena dijetarnog unosaprocena dijetarnog unosa- procena izloženosti dijetarnom sastojku (nivo metabolita u plazmi i urinu)

Uticaj polifenola na funkciju trombocita – dijetarne interventne studije (Ostertag i sar., 2010)

- čokolada, kakao i epikatehin (9/25)čokolada, kakao i epikatehin (9/25)- armanjak konjak

- mešavina jagodastog i bobičastog voća

- grožđe, vino i procijanidini

- kvercetin- dijetarni izvori kvercetina

- izoflavoni

“Skrining” antitrombocitnog delovanja suvih ekstrakata biljaka:

kopriva mirođija šarplaninski čaj kelj nar japanska jabukakopriva(Urtica dioica L.)

mirođija(Aenetum graveolens L.)

šarplaninski čaj(Sideritis scardica L.)

kelj(Brassica oleracea L.

var. acephala)

nar(Punica granatum L.)

japanska jabuka(Diospyros spp.)

Kriterijumi za odabir:i t i h i (t di i l i i )

Ispitivani uzorci Ukupni fenoli (mg GAE/g)Ekstrakt koprive 69 44 ± 0 03- prisutne u ishrani (tradicionalne namirnice)

- nedovoljno podataka o njihovom biološkom delovanju- sadrže polifenole kao bioaktivne sastojke

Ekstrakt koprive 69,44 ± 0,03Ekstrakt mirođije 58,07 ± 0,11Ekstrakt šarplaninskog čaja 156,66 ± 0,01Esktrakt kelja 42,60 ± 0,06

Eksperimentalni uslovi: Ekstrakt nara 45,50 ± 0,02Ekstrakt japanske jabuke 5,62 ± 0,45

Eksperimentalni uslovi:- konc. 200µg/ml- arahidonska kiselina kao agonist- kod zdravih ispitanika i ispitanika sa metaboličkim sindromomStatistička obrada:-Vilkoksonov test označenih rangova

Uticaj ispitivanih ekstrakata na ekspresiju P-selektina i GPIIb-IIIa

Uticaj ispitivanih ekstrakata na agregaciju trombocita sa monocitima i neutrofilima

Antitrombocitno delovanje metabolita kvercetina (i sulforafana):- kvercetin-3-glukuronida;- 3’-metil-kvercetin-3-glukuronida;- kvercetin-3’-sulfata; 20 µM

Uticaj ispitivanih metabolita na ekspresiju P-selektina i GPIIb-IIIa

kvercetin 3 sulfata;- sulforafan-cistein-glicina

Uticaj ispitivanih metabolita na ekspresiju P selektina i GPIIb IIIa

Uticaj ispitivanih metabolita na agregaciju trombocita sa monocitima i neutrofilima

--“Screening” “Screening” antitrombocitnog delovanja ekstrakata

Kopriva(Urtica dioica L )

Mirođija(A t l L )

Šarplaninski čaj(Sid iti di L )

Kelj(Brassica oleracea L

Nar(P i t L )

Japanska jabuka(Di )(Urtica dioica L.) (Aenetum graveolens L.) (Sideritis scardica L.) (Brassica oleracea L.

var. acephala)(Punica granatum L.) (Diospyros spp.)

--“Screening” “Screening” antitrombocitnog delovanja metabolita pojedinih bioaktivnih komponenata

//

- kvercetin-3-glukuronid;- 3’-metil-kvercetin-3-glukuronid;- kvercetin-3’-sulfat;- sulforafan-cistein-glicin

Humani metaboliti kvercetinakvercetinaFlavonoida prisutnog u svim svim ispitivanim ekstraktima

Humani metabolit sulforafanasulforafanaIzotiocijanata koji nastale iz glkozinolata pirstunog u ekstraktu

keljakelja

Biljke koje su odabrane za dalje ispitivanje u okviru RCT:Biljke koje su odabrane za dalje ispitivanje u okviru RCT:MMirođija, kopriva i šarplaninski čajirođija, kopriva i šarplaninski čaj

RezultatiMaterijal i metode

Ispitivanje uticaja jednokratne konzumacije čajeva od koprive, mirođije i šarplaninskog čaja na aktivaciju trombocita i njihovu agregaciju sa monocitima i neutrofilima eut o a

Dizajn: randomizirana, kontrolisana studija paralelnog dizajnaIspitanici: osobe sa metaboličkim sindromom (ATPIII); n=80I t ij 200 l č j (2 biljk )Intervencija: 200 ml čaja (2 g suve biljke)Kontrolna intervencija: 200 ml tople vode

Analizirani parametri:- ekspresija P-selektina- ekspresija GPIIb-IIIa-TMA (%)

u bazalnim uslovima nakon ex vivo delovanja agonista:- ADP (0,5µM)-TMA (%)

- TNA (%) - ADP (20µM)- arahidonska kiselina (250µg/ml)

Statistička obrada:Statistička obrada:-Vilkoksonov test označenih rangova (p≤0,05)-Man-Vitnijev U test (p≤0,0167)

Akutni efekat čajeva od koprive mirođije i šarplaninskog čaja na funkciju trombocitaAkutni efekat čajeva od koprive mirođije i šarplaninskog čaja na funkciju trombocita

- jednokratna konzumacija biljnih čajeva:-- utiče na utiče na ekspresiju P-selektinaut če aut če a e sp es ju se e t a- ne utiče na ekspresiju GPIIb-IIIa- ne utiče na agregaciju trombocita sa monocitima- ne utiče na agregaciju trombocita sa neutrofilima

- inhibira inhibira ekspresiju P-selektina- u bazalnim uslovima- nakon ex vivo delovanja ADP-aU optimalnim i suboptimalnim koncentracijama

MirođijaU optimalnim i suboptimalnim koncentracijama

--inhibira inhibira ekspresiju P-selektina - nakon ex vivo delovanja ADP-a

Kopriva

ju optimalnim koncentracijama

- ne utiča na nijedan od analiziranih parametara funkcije

Šarplaninski čajanaliziranih parametara funkcije trombocita

Rezultati Zaključak

Antitrombocitno delovanja ispitivanih biljnih ekstrakata ukazuje naAntitrombocitno delovanja ispitivanih biljnih ekstrakata ukazuje napotencijalni značaj ovih biljaka kao sastavnog dela optimalne dijete u

očuvanju kardiovaskularnog zdravlja i prevenciji nepovoljnog uticajafaktora sredine na trombocite uključujući i uticaj neodgovarajuće dijete ifaktora sredine na trombocite, uključujući i uticaj neodgovarajuće dijete i

nepravilnog režima ishrane.

HVALA NA PAŽNJI!HVALA NA PAŽNJI!