POLIMORFNI DNA MARKERI U EKOTOKSIKOLOGIJI I BIOMONITORINGU

• DNA marker: polimorfni DNA lokus koji se koristi u mapiranjugena, dijagnostici, taksonomiji, ekotoksikologiji i dr.

• Polimorfni lokus: dva ili više alela na istom DNA lokusu;frekvencija drugog alela u populaciji mora biti najmanje 5%

• Razlika u sekvenci lokusa homolognih kromosoma iste jedinke ilirazličitih jedinki je u prosjeku 1 na svakih 1000 pb. Akousporedimo 3x109 pb u DNA dva haploidna humana genomausporedimo 3x109 pb u DNA dva haploidna humana genoma(primjerice u spermijima ili jajnim stanicama) dobit ćemo 3milijuna različitih alela

• Ukupan broj polimorfnih humanih lokusa mogao bi biti 100milijuna i više što je ogromno spremište potencijalnih DNAmarkera

• Toksične tvari iz okoliša interferiraju s genetičkom strukturompopulacija bilo direktno (mutacijski dogañaji) ili indirektno prekopopulacijskih (evolucijskih) dogañaja (selekcija, efekt uskog grla)

• GENETIČKA TOKSIKOLOGIJA – detekcija genotoksičnogoštećenja na individualnoj razinioštećenja na individualnoj razini

• GENETIČKA EKOTOKSIKOLOGIJA – analiza genetičkih učinakana razini ekosistema preko analize genetičke strukturepopulacije (eko-genotoksikologija, evolucijska toksikologija)

• GENETIČKA PROMJENA KAO GENOTOKSIČNI SINDROM –promjena frekvencije genotipova i smanjenje genetičkevarijabilnosti populacije - rezultat izloženosti različitim tvarimakoje zagañuju okoliš (ne moraju biti samo genotoksične tvari)

Genetički efekti nakon izlaganja onečišćenju:Genetički efekti nakon izlaganja onečišćenju:- genetička adaptacija;- genetička promjena na razini alozima (enzima – proteina)- genetička promjena na razini molekularnih markera

DNA

DNAoštećena

genotoksično djelovanje popravak

• DNA adukti• lomovi DNA

apoptozaI/ili eliminacija od strane imunokompetentnih stanica

• Cjelovitost struktureDNA ostvaruje sedinamičkom ravnotežomizmeñu oštećivanja DNA ipopravka tih oštećenja

Citogenetička stabilnost je integralnidio homeostaze svake jedinke

nepotpun popravak

replikacija

mutacije

kromosomske mutacijeaktivacija onkogenadisfunkcija proteina

sindrom genotoksičnih bolesti(Kurelec 1993)

stanica

Genske mutacije

• Adaptacija – promjena frekvencije gena i genotipova u populacijite je na taj način populacija bolje prilagoñena štetnim učincimaokoliša

• Tolerancija – rezistentnost ili aklimatizacija: nije isto što iadaptacija (nema promjene frekvencije gena i genotipova) – do

• Tolerancija – rezistentnost ili aklimatizacija: nije isto što iadaptacija (nema promjene frekvencije gena i genotipova) – donje dolazi modifikacijom ekspresije gena ili promjenom strukturegena

Alozimi (izoenzimi) s različitom elektroforetskom mobilnošću kodirani s različitim alelima (nukleotidne varijacije) istoga gena (1965-1980tih: s različitim alelima (nukleotidne varijacije) istoga gena (1965-1980tih: analiza genetičke raznolikosti prirodnih populacija)-kodominantni marker

Ograničenja: - nedovoljno pogodnih tkiva za analizu- mala genetička varijabilnost- promjene na razini DNA koje ne rezultiraju promjenama na razini proteina se ne detektiraju- vrpce koje se smatraju produktom istog alela mogu biti produkt multiplih alela- rezultati mogu podcijeniti stvarnu DNA-varijabilnost

DNA markeri:

1. Jezgrin genom: jedinstvene sekvence i ponavljajuće sekvence

Jedinstvene sekvence – strukturni geniPonavljajuće ili repetitivne sekvence: kodirajući segmenti (rRNA geni) i nekodirajuće ponavljajuće sekvence – najvarijabilniji markeri u genomu eukariota (VNTR: mini i mikrosateliti)

2. Genom organela

Citoplazmatsko (najčešće majčinsko) nasljeñivanjeNajveću varijabilnost pokazuje mitohondrijska DNA (stopa supstitucije nukleotida u mtDNA je viša od one u jezgrinoj DNA)

• Većina molekularno-genetičkih metoda bazira se na tehniciumnažanja kratkih sekvenci nukleotida (PCR metoda) te njihovojanalizi

• Danas se koriste različite tehnike koje analiziraju DNA markere(DNA fingerprinting tehnike):

• RAPD (random amplified polymorphic DNA) i AFLP (amplifiedfragment lenght polymorhism) – koriste različite početnice(primer) koje umnažaju (amplificiraju) nasumično odabraneregije u genomu(primer) koje umnažaju (amplificiraju) nasumično odabraneregije u genomu

• RAPD i AFLP su dominantni markeri

• Varijacije u broju pruga ili prisutnost/odsutnost prugarezultat su točkastih mutacija, inverzija, delecija, adicija ilivećih kromosomskih rearanžmana koji utječu na mjestovezanja početnice

• Amplificirani fragmenti se vizualiziraju gel elektroforezom

RAPD*

• od 1995-2005 objavljeno više od 9000 znanstvenih radova• koristi se u genetičkom mapiranju, taksonomiji, filogeniji,istraživanjima genotoksičnosti i karcinogeneze• kratki (10 pb) oligonukleotidni “primeri” nasumično odabrane sekvence• alelna varijabilnost očituje se u prisustvu/odsustvu odreñenogamplificiranog produkta razdvojenog gel elektroforezom i vizualiziranogsa EtBrsa EtBr• rezultat: nekoliko polimorfnih genetičkih segmenata po “primeru”• stupanj varijabilnosti za mnoge “primere” ukazuje na mogućnostprimjene metode u različitim analizama (dokazivanje očinstva,identifikacija jedinki, identifikacija sojeva/linija, filogenetička analiza,ekotoksikologija)

*Williams et al 1990 Nucleic Acid Research 18: 6531-6535.Welsh & McClelland 1991 Nucleic Acid Research 18: 7213-7218.

Lančana reakcija polimerazom – Kary Mullis (1983): Nobelova nagrada za kemiju 1993.

Detekcija polimorfnih lokusa RAPD tehnikom. Lokus B je polimorfan.

RAPD amplifikacijski produkti

1 – normalni fenotip

2 - abnormalni fenotip

ANALIZA RAPD PROFILA:

Fenetička – najčešća u ekotoksikologiji; sličnost/raznolikost• Raznolikost/sličnost se procjenjuje na temelju

odsutnosti/prisutnosti RAPD vrpci u izloženih i ne-izloženihjedinki (analiza sličnosti) ili na temelju broja vrpci i njihovekoličine u izloženih i ne-izloženih jedinki (analiza raznolikosti)

• Postoji niz metoda za izračunavanje indeksa sličnosti i• Postoji niz metoda za izračunavanje indeksa sličnosti iraznolikosti

Genetička – bazirana na analizi genotipova• RAPD su dominantni markeri (genotip AA ili Aa prisutna vrpca; aa

nema vrpce – lokus koji nije fenotipski eksprimiran)

Prednosti RAPD:• Veliki broj lokusa se može analizirati, a nije potrebna prethodna

informacija o DNA sekvenci što se ujedno smatra i nedostatkom• Relativno jednostavna i brza metoda za preliminarni pregled

(screen) populacije izložene genotoksičnim zagañivačima• Primjenjiva na različite organizme• Ima potencijal za detekciju širokog raspona DNA oštećenja i

mutacija (točkaste mutacije, inverzije, delecije, adicije ilikromosomski rearanžmani)

Nedostaci:Nedostaci:• Ne daje nikakvu informaciju o sekvenci DNA• Reproducibilnost? – ovisi o uvjetima PCR metode• Dominantni marker pa se heterozigoti ne razlikuju od dominantnih

homozigota• Ne otkriva vrstu oštećenja; kvalitativna, semi-kvantitativna

metoda

• Idealno bi bilo koristiti markere povezane s fitnesom organizma jersu to dobri kandidati za ekotoksikološka istraživanje ali to je dostazahtjevan posao

PRIMJENA U GENETIČKOJ EKOTOKSIKOLOGIJI

• za detekciju genetičkih efekata koji se odnose na promjene strukture i funkcije DNA (DNA adukti, DNA lom i mutacije)

• promjene u genetičkoj strukturi populacije (genetička raznolikost, frekvencija gena)

Primjer 1

• Istraživanja u kojima su korišteni markeri vezani za lokuse kojisu važni za selekcijsku prednost kod riba (Gambusia affinis) nastaništima opterećenima radioaktivitetom (Theodorakis iShugart 1997)

• Pronañeno je da se neki RAPD markeri javljaju s većomfrekvencijom na kontaminiranim staništima – to su tzv. CIBs(contaminant-indicative bands): pruge povezane s fitnesom i(contaminant-indicative bands): pruge povezane s fitnesom iradiorezistencijom

• Usporedbom rezultata RAPD s testovima genotoksičnosti(komet) - nañena pozitivna korelacija – ribe na kontaminiranimstaništima s povećanom frekvencijom CIBs pruga imale su manjeoštećenja mjereno komet-testom

• Zaključak: radioaktivno zagañenje utjecalo je na genetičkustrukturu populacije riba preko prirodne selekcije induciranezagañenjem

Theodorakis & Shugart 1997. Environ Toxicol Chem 17(10): 1992-1998.

Primjer 2• Detekcija DNA oštećenja RAPD metodom na klijancima ječma

tretiranih teškim metalom Cd te usporedba promjena RAPD profilasa stopom rasta korjenčića i količinom ukupnih topivih proteina(Liu et al. 2009)

• Rezultati RAPD pokazali varijabilnost u intenzitetu pruga, gubitakpruga (linearno ovisan o koncentraciji Cd) i pojavu novih pruga uodnosu na kontrolne uzorke

• Modifikacije RAPD profila nastaju zbog: genomskih rearanžmanakoji utječu na mjesta vezanja početnica; strukturnih promjena

• Modifikacije RAPD profila nastaju zbog: genomskih rearanžmanakoji utječu na mjesta vezanja početnica; strukturnih promjenazbog različitih tipova DNA oštećenja; interakcije DNA polimerazesa oštećenom DNA što utječe na polimerizaciju DNA u PCR reakciji

• RAPD kao biomarker jednako osjetljiv kao test toksičnosti (rastkorijena)

• RAPD osjetljiviji od klasičnih genotoksičnih testova jer možedetektirati privremena DNA oštećenja koja neće završitimutacijom

VNTR – variable number tandem repeats:ANALIZA MIKROSATELITNE DNA: ISSR (intersimple sequence

repeat) polymorphisms

• Mikrosatelitna DNA - kratke sekvence (1-5 baza) koje seponavljaju serijski

• Kodominantni marker• Nekodirajuće DNA sekvence• Specifični i visoko polimorfni• Visoka frekvencija spontanih mutacija: 100 puta su češće nego u• Visoka frekvencija spontanih mutacija: 100 puta su češće nego u

kodirajućim genima• Zbog hipervarijabilnosti, gustoće i široke rasprostranjenosti u

genomu dobri su genetički markeri• Zbog velike varijabilnosti i brze evolucije pogodni su za analizu

razlika izmeñu srodnih populacija i nedavnih brzih promjenagenetičke strukture populacije, naročito onih uzrokovanihokolišnim mutagenima

• Metoda ISSR objedinjuje PCR amplifikaciju genomske DNAkorištenjem jedne početnice po ponavljajućoj jedinici

• Produkti se vizualiziraju gel elektroforezom

Genetička razlika različitih izolata gljivicePhytophthora capsici (metoda ISSR – korištenajedna početnica GTC)

• Iako se mikrosateliti koriste već dugo u populacijskoj geneticinedavno su se počeli koristiti i u ekotoksikološkim istraživanjima

Primjer 3:• Analiza dva visoko-varijabilna mikrosatelitna lokusa populacije

lastavica na području Černobila (Ellegren i sur. 1997)• Populacija u Ukrajini (Černobil) bila je izložena visokim dozama

radijacije u usporedbi s populacijama s referentnih postaja uUkrajini i Italiji

• Kod jedinki na zagañenom području uočen je veći broj alela nadva istraživana mikrosatelitna lokusa – čak su utvrdili da se radi

• Kod jedinki na zagañenom području uočen je veći broj alela nadva istraživana mikrosatelitna lokusa – čak su utvrdili da se radio nasljednim mutacijama jer je i u potomstvu nañen veći brojalela

• opažena morfološka promjena – parcijalni albinizam (mutacija ukodirajućoj regiji)

• Povećana mutacijska stopa u istraživanim mikrosatelitimapripisana je oštećenju gena koji su zaduženi za popravak DNAoštećenja uzrokovanog zračenjem

Ellegren et al 1997 Nature 389: 593-596.

Analiza kloroplastne mikrosatelitne DNA

• Varijabilnost kloroplastnih mikrosatelitnih regija (cpSSR –chloroplast simple sequence repeats) – korištena za filogeografskaistraživanja

Primjer 4• Mengoni i sur. 2001. – po prvi puta analiziran cpSSR polimorfizam u

svrhu karakterizacije tolerantnih i netolerantnih populacija biljakasvrhu karakterizacije tolerantnih i netolerantnih populacija biljaka(teški metali; vrsta Silene paradoxa L.)

• Adaptacija na tlo zagañeno bakrom je povezana sa smanjenjemgenetičke varijabilnosti

• Smanjenje genetičke varijabilnosti vjerojatno je posljedicaevolucijskih dogañaja poput efekta utemeljitelja (“founder effect”)i jake selekcije tolerancije na teške metale što je dovelo do “bottle-neck” efekta (učinak uskog grla)

Mengoni et al. 2001. Mol Ecol 10(8): 1909-1916.

Mitohondrijski genom• Haploidni genom; nema rekombinacijskih dogañaja, majčinsko

nasljeñivanje, veća akumulacija mutacija jer nema popravka• Sekvenciran genom mnogih vrsta (odreñen slijed nukleotida)• Do 1990. većinom se koristila metoda RFLP (restriction fragment

lenght polymorhism) – korištenjem 20-30 restrikcijskih enzimakoji prepoznaju sekvencu od 6 pb (restrikcijsko mjesto)omogućena je analiza fragmenata mitohondrijskog genoma –osnova za odreñivanje broja i raspodjele haplotipova (linije sosnova za odreñivanje broja i raspodjele haplotipova (linije sidentičnim RFLP profilom)

• Danas se uz RFLP koristi i sekvenciranje PCR produkata• Na taj se način može doći do ciljanih gena• RFLP je jeftinija metoda od sekvenciranja, omogućava detekciju

varijabilnosti dužina restrikcijskih fragmenata (raznolikost)• Najpogodnija je kombinacija obje metode PCR i RFLP

RFLP metoda

Literatura:

• Bickham i sur. 2000. Effects of chemical contaminants on genetic diversity innatural populations: implications for biomonitoring and ecotoxicology. MutationResearch 463: 33-51.

• Belfiore i Anderson 2001. Effects of contaminants on genetic patterns in aquaticorganisms: a review. Mutation Research 489: 97-122.

• Liu i Wendel 2001. Intersimple sequence repeat (ISSR) polymorhisms as agenetic marker system in cotton (technical note). Molecular Ecology Notes 1:205-208.

• Mengoni i sur. 2001. Genetic diversity of heavy metal-tolerant populations inSilene paradoxa L. (Caryophyllaceae): a chloroplast microsatellite analysis.Silene paradoxa L. (Caryophyllaceae): a chloroplast microsatellite analysis.Molecular Ecology 10: 1909-1916.

• Theodorakis 2001. Integration of Genotoxic and Population Genetic Endpoints inBiomonitoring and Risk Assessment. Ecotoxicology 10: 245-256.

• De Wolf i sur. 2004. The use of RAPD in ecotoxicology. Review. MutationResearch 566: 249-262.

• Atienzar i Jha 2006. The random amplified DNA (RAPD) assay and relatedtechniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies: A critical review.Mutation Research 613: 76-102.

• Liu i sur. 2009. Risk assessment of cadmium-contaminated soil on plant DNAdamage using RAPD and physiological indices. Journal of Hazardous Materials161: 878-883.